CN110831633A - 可用于治疗的肽类接头和念珠藻素缀合物及其制备 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及式(I)的化合物：RCG1‑L‑P(I)其中RCG1表示反应性化学基团，其对多肽(例如抗体)上存在的化学基团有反应性；P表示H、OH或经活化的O；且L表示特定接头。本申请还涉及念珠藻素有效载荷，以及涉及念珠藻素缀合物，涉及含有它们的组合物及其治疗用途，特别是用作抗癌剂。本申请还涉及制备这些缀合物的方法。

Description

可用于治疗的肽类接头和念珠藻素缀合物及其制备
技术领域
本申请涉及新型肽类接头，涉及新型念珠藻素有效载荷，涉及新型念珠藻素缀合物，涉及含有它们的组合物及其治疗用途，例如用作抗癌剂。本申请还涉及制备这些缀合物的方法。
背景技术
这些接头在细胞的溶酶体中被酶(例如组织蛋白酶B)酶切。组织蛋白酶B是一种半胱氨酸蛋白酶，其属于木瓜蛋白酶家族，是哺乳动物中主要的溶酶体蛋白酶之一。它参与蛋白质更新和细胞代谢的维持以及其它一些生理或病理过程，例如肿瘤进展。在肿瘤中已证明其在基因和蛋白质水平上的过度表达，蛋白质的增加也导致了酶活性的增加。这是化疗剂的几种前药方法的基础(Int J Oncology 2013,42,373-383)，也是抗体-药物缀合物(ADC)的可裂解接头概念的构想(Bioconj Chem 2002,13,855-869)。对于ADC，一种常用的肽类接头由序列缬氨酸-瓜氨酸(ValCit)构成，该序列与对氨基苄醇自毁性部分连接(JOrg Chem 2002,67,1866-1872)，如WO2011/001052的实施例23所示例。与细胞毒性药物相关的后续构建体具有很强的疏水性，这对于实现某些药物/抗体比率(DAR)、单体纯度和ADC稳定性可具有挑战性。实际上，尽管进行了广泛的缀合优化WO2011/00152的实施例23仍无法成功地缀合以提供具有令人满意的DAR和单体纯度(即DAR>2和>95％的单体)的ADC。
由于用于ADC的药物(例如微管蛋白或DNA结合剂)本质上是疏水的，因此需要更亲水的肽类接头，来改善有效载荷的溶解度(有效载荷是一种包含与接头缀合的细胞毒性药物的化合物)，以及因此有潜力改善其对抗体缀合的反应性以及后续ADC的稳定性。有效载荷溶解度的增加应允许增加所述DAR、单体纯度和ADC稳定性，尤其是在聚集倾向方面。
发明内容
本申请涉及新型肽类化合物，其选自式(I)的化合物：
RCG1-L-P (I)
其中
■RCG1表示反应性化学基团，其对多肽例如抗体上存在的化学基团为反应性的；
■P表示氢原子、-OH或经活化的O，其中经活化的O在下面定义。
■L表示式(II)的接头：
其中：
●L1具有式(III)：
Figure BDA0002354666740000022
其中：
■当P表示氢原子时，则x＝0或1且y＝1和z＝0；
■当P表示-OH时，则x＝y＝z＝0；
■当P表示经活化的O时，则x＝1且y＝z＝0或x＝y＝z＝1；
■J1、J2、J3和J4各自独立地选自CA1和N；
■ALK表示(C1-C12)亚烷基基团，比如(C1-C6)亚烷基，例如以-(CH2)n-的形式，n为1至12的整数，且例如1至6；
■A1、A2、A3、A4、A5和A6各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如氢原子或甲基基团。
●(AA)w表示w个经取代的AAs或未经取代的氨基酸AAns的序列，其通过肽键连接在一起，其中经取代的AAs或未经取代的AAns如下定义；
●w表示1至12的整数，比如1至6，例如2或3；
●若(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs，则L2表示单键、(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、CH(SO3H)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、(C1-C6)烷基-环己基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-CH(SO3H)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-环己基基团、NA8-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、NA8-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；
●若(AA)w表示w个未经取代的氨基酸AAns的序列，则L2表示NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；
■A7表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NHC(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-O-、-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-SO2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)；
■A8表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，比如氢原子或甲基基团；
■i表示1至50的整数，比如1至35。
本申请进一步涉及式(IV)的念珠藻素有效载荷：
Figure BDA0002354666740000051
其中：
■R1表示(C1-C6)烷基基团；
■R2和R3各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团；
或者R2和R3与它们所连接的碳原子一同形成(C3-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基基团；
■R4和R5各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团或(C1-C6)烷基-NH(R12)基团或(C1-C6)烷基-OH基团或(C1-C6)烷基-SH基团或(C1-C6)烷基-CO2H基团；
或者R4和R5与它们所连接的碳原子一同形成(C3-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基基团；
■X表示O或N(R6)；
■R6表示氢原子或(C1-C6)烷基基团；
■R7和R8各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团或(C1-C6)烷基-CO2H基团或(C1-C6)烷基-N(C1-C6)烷基2基团；
或者R7和R8与它们所连接的碳原子一同形成(C3-C6)环烷基基团或(C3-C6)杂环烷基基团；
■R9表示至少一个苯基核的取代基，其各自独立地选自：氢原子、-OH、(C1-C4)烷氧基、卤素原子、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基2、-NH(C1-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基；
■R10表示至少一个苯基核的取代基，其选自氢原子和(C1-C4)烷基基团；
■Y表示
●-NR11-(C1-C6)烷基-，例如-NR11-(CH2)n-如
Figure BDA0002354666740000061
●-O-(C1-C6)烷基-，例如-O-(CH2)n-如
Figure BDA0002354666740000062
●-S-(C1-C6)烷基-，例如-S-(CH2)n-如
Figure BDA0002354666740000063
Y位于苯基核的邻位(o)、间位(m)或对位(p)的位置上；
■R11和R12各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基，例如氢原子或甲基基团；■n表示整数1至6；
■L如在式(I)所定义且表示式(II)的接头；
■RCG1表示在所述接头的末端存在的反应性化学基团，RCG1对多肽(例如抗体)上存在的化学基团有反应性。
本申请进一步涉及式(V)的缀合物：
Figure BDA0002354666740000071
其中：
■R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12如在式(IV)中所定义；
■X、Y和L如在式(IV)中所定义；
■G表示RCG1(在接头的末端存在的反应性化学基团)与RCG2(在抗体(Ab)上存在的正交反应性化学基团)的反应产物；
■Ab表示抗体。
各个取代基R1至R12也可采用实施例中所述的空间构型(例如，R或S，或者Z或E)之一。
式(I)、(II)、(III)、(IV)和(V)的化合物可含有至少一个不对称碳原子。因此它们可以对映异构体或非对映异构体的形式存在。这些对映异构体和非对映异构体，以及它们的混合物，包括外消旋的异构体的混合物，构成本申请的一部分。
式(I)、(II)、(IV)的化合物，包括所示的那些，可以碱的形式或酸加成盐的形式，比如药学上可接受的酸的形式存在。例如，若这些化合物包含SO3H官能团，则它们可以SO3 -碱金属盐的形式，例如SO3 -钠盐(SO3 -+Na)的形式存在。
定义
在本申请的上下文中，某些术语具有下述定义：
●烯基基团：通过从烯烃除去1个氢原子所得的烃基团。烯基基团可为直链的或支链的。可提及的实例包括乙烯基(ethenyl)(-CH＝CH2，也称为乙烯基(vinyl))和丙烯基(-CH2-CH＝CH2，也称为烯丙基)。
●烷氧基基团：基团-O-烷基，其中烷基基团如下所定义；
●烷基基团：直链的或支链的饱和脂族烃基基团，其通过从烷烃除去氢原子获得。可提及的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基、2,2-二甲基丙基和己基基团；
●亚烷基基团：经验式-CnH2n-的饱和二价基团，其通过从烷烃除去2个氢原子获得。亚烷基基团可为直链的或支链的。可提及的实例包括亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)、亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)和亚己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)基团或以下支链的基团
Figure BDA0002354666740000081
Figure BDA0002354666740000082
比如，亚烷基基团具有式-(CH2)n-，n表示整数；在值的范围内，包括限值(例如，类型为“n为1至6”或“范围从1至6”的范围包括限值1和6)；
●抗体：与生物靶标具有亲和力的抗体，例如单克隆抗体。抗体的功能是将生物活性化合物作为细胞毒性化合物引向生物靶标。抗体可为单克隆抗体、多克隆抗体或多特异性抗体；其也可以是抗体片段；其也可为鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。“抗体”可为天然或常规抗体，其中两条重链通过二硫键彼此连接，并且每条重链通过二硫键连接至轻链(也称为“全长抗体”)。术语“常规(或全长)抗体”既是指包含信号肽(或肽原，若有的话)的抗体，也是指在链的分泌和蛋白水解加工后获得的成熟形式。轻链有两种型，λ(l)和κ(k)。有五种主要的重链类别(或同工型)，其决定了抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条链包含不同的序列域。轻链包括2个域或区域，可变域(VL)和恒定域(CL)。重链包括四个域，一个可变域(VH)和三个恒定域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链的可变域(VL)和重链的可变域(VH)决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链的恒定域(CL)和重链的恒定域(CH)赋予重要的生物学特性，例如，抗体链缔合、分泌、经胎盘活动性、补体结合以及与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-端部分，其由一条轻链和一条重链的可变部分构成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基构成。有时，来自非高变区或框架区(FR)的残基会影响整体域结构，从而影响结合位点。CDR是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别称为CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L以及CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。因此，常规的抗体抗原结合位点包括6个CDR，其包含来自各个重链和轻链V区的CDR组。
如本申请所用，术语“抗体”表示常规的(全长)抗体及其片段，以及单域抗体及其片段，例如单域抗体的可变重链。(常规)抗体的片段通常包含完整抗体的一部分，例如完整抗体的抗原结合区或可变区，并保留常规抗体的生物学功能。这种片段的实例包括Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2、纳米抗体和双抗体。
抗体的功能是将生物活性化合物作为一种细胞毒性化合物导向生物靶标。
●芳基基团：包含5至10个碳原子的环芳族基团。芳基基团的实例包括苯基、甲苯基、二甲苯基、萘基；
●生物靶标：抗原(或抗原组)，比如，位于与该肿瘤相关的癌细胞或基质细胞表面的抗原；例如，这些抗原可为生长因子受体、癌基因产物或突变的“肿瘤抑制因子”基因产物、与血管生成有关的分子或黏附分子；
●缀合物：抗体-药物缀合物或ADC，即多肽，例如抗体，其与至少一分子细胞毒性化合物通过接头共价连接；
●环烷基基团：环状烷基基团，其包含3至6个参与环结构的碳原子。可提及的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基基团；
●DAR(药物/抗体比率)：通过接头与抗体连接的细胞毒性分子的平均数量；
●卤素：氟、氯、溴和碘四种元素中的任何一种；
●杂芳基基团：含有2至10个碳原子和1至5个参与环且与成环碳原子相连的杂原子(例如氮、氧或硫)的芳基基团。杂芳基基团的实例包括吡啶基、嘧啶基、噻吩基、咪唑基、三唑基、吲哚基、咪唑并吡啶基、吡唑基；
●杂环烷基基团：含有2至8个碳原子和1至3个参与环且与成环碳原子相连的杂原子(例如氮、氧或硫)的环烷基基团。实例包括氮杂环丙烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基和吡喃基；
●接头：原子团或单键，其可将细胞毒性化合物共价连接至多肽(例如抗体)，从而形成缀合物；
●有效载荷：与接头共价连接的细胞毒性化合物；
●反应性化学基团：可促进或进行化学反应的原子团；
此外，如本申请的通篇所述，SO3H官能团可呈盐的形式，例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
缩写
ADC：抗体-药物缀合物；ALK：(C1-C12)亚烷基基团，比如(C1-C6)亚烷基，例如以-(CH2)n-的形式，n为1至12的整数，且例如1至6；aq.：水性；Ar：氩气；AUC：曲线下面积；BCN：(1α,8α,9β)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-甲醇；CHCl3：氯仿；CH3CN：乙腈；CO2：二氧化碳；CR：完全响应；crypto表示式
Figure BDA0002354666740000101
的单元，比如crypto表示实施例的念珠藻素化合物，WO2011/001052所描述的D1-D8念珠藻素化合物之一或如PCT/EP2016/076603中所述的以下D1-D19念珠藻素化合物之一：
Figure BDA0002354666740000102
Figure BDA0002354666740000111
■其中W表示
●(C1-C6)烷基-NH(R11)，例如(CH2)nNHR11；
●(C1-C6)烷基-OH，例如(CH2)nOH；
●(C1-C6)烷基-SH，例如(CH2)nSH；
●CO2H或C(＝O)NH2；
●(C1-C6)烷基-CO2H或(C1-C6)烷基-C(＝O)NH2；或
●(C1-C6)烷基-N3。
W位于苯基核的邻位(o)、间位(m)或对位(p)的位置；
■R11各自独立地表示氢原子或基团(C1-C6)烷基，比如氢原子或甲基基团；
■n表示整数1至6；
d：天；DAR：药物/抗体比率(D1指DAR为1的ADC，D2指DAR为2的ADC，等等)；DBCO：二苄基环辛炔；DCC：N,N’-二环己基碳二亚胺；DCM：二氯甲烷；DIEA：N,N-二异丙基乙胺；DMA：二甲基乙酰胺；DMAP：4-(二甲基氨基)吡啶；DMEM：Dulbecco改良的Eagle培养基；DMEM/F12：Dulbecco改良的Eagle培养基营养混合物F-12；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲基亚砜；DPBS：Dulbecco磷酸盐缓冲液；DSC：碳酸N,N′-二琥珀酰亚胺基酯；EDC：1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺；EDTA：乙二胺四乙酸；EEDQ：N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉；ELSD：蒸发光散射检测器；eq.：当量；ES：电喷射；EtOAc：乙酸乙酯；Et2O：乙醚；Ex.：实施例；FCS：胎牛血清；Fmoc：9-芴基甲氧基羰基；GI：电感应性基团；h：小时；H2O：水；Hal：卤素；HATU：1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐；HCl：盐酸；HEPES：4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸；HIC：疏水相互作用色谱；HOAt：1-羟基-7-氮杂苯并三唑；HOBt：1-羟基-苯并三唑；HPLC：高效液相色谱；HRMS：高分辨质谱；IC50：抑制浓度中位数；i.e.：即，就是，换言之；IEC：离子交换色谱；iPrOH：2-丙醇；iPr2O：二异丙基醚；i.v.：静脉内；MeCN：乙腈；MeOH：甲醇；MeTHF：2-甲基-四氢呋喃；MFCO：1-氟-2-环辛炔-1-羧酸；MgSO4：硫酸镁；min：分钟；MsCl：甲磺酰氯；MTBE：甲基叔丁基醚；MTD：最大耐受剂量；NaH：氢化钠；NaCl：氯化钠；NaHCO3：碳酸氢钠；n.d.：未测定；NHS：N-羟基琥珀酰亚胺；NMP：1-甲基-2-吡咯烷酮；NMR：核磁共振；PABA：对氨基苄基醇；PBS：磷酸盐缓冲溶液；PEG：聚乙二醇；PNGase F：肽-N-糖苷酶F；ppm：百万分之一；PR：部分响应；QS：量子饱和度，表示需要的数量；Q-Tof：四极杆飞行时间；quant.：定量产率；RCG：反应性化学基团；RT：室温；sat.：饱和的；s.c.：皮下；SCID：重症综合性免疫缺陷；SEC：尺寸排阻色谱；T3P：丙基膦酸酐；TBAF：四丁基氟化铵；TFA：三氟乙酸；TFS：无肿瘤生存者；THF：四氢呋喃；TLC：薄层色谱；t1/2：半衰期；tR：保留时间；UPLC：超高效液相色谱；UV：紫外。
附图说明
图1：实施例6对SCID小鼠中MDA-MB-231异种移植物的体内功效
图2：2.5mg/kg实施例16、实施例19、实施例23和实施例32对SCID小鼠中MDA-MB-231异种移植物的体内功效
图3：1.25mg/kg实施例16、实施例19、实施例23和实施例32对SCID小鼠中MDA-MB-231异种移植物的体内功效
图4：实施例26对SCID小鼠中MDA-MB-231异种移植物的体内功效
图5：实施例29对SCID小鼠中MDA-MB-231异种移植物的体内功效
图6：实施例35对SCID小鼠中MDA-MB-231异种移植物的体内功效
图7：实施例41对SCID小鼠中MDA-MB-231异种移植物的体内功效
具体实施方式
本申请涉及新型肽类化合物，其选自式(I)的化合物：
RCG1-L-P (I)
其中
■RCG1表示反应性化学基团，其对多肽例如抗体上存在的化学基团为反应性的；
■L表示如下所定义的式(II)的接头；
■P表示氢原子、-OH或经活化的O。
可提及的经活化的O的实例包括
Figure BDA0002354666740000131
(O-NHS)、
Figure BDA0002354666740000132
其中阳离子表示例如钠、钾或铯；
或
Figure BDA0002354666740000133
基团，其中GI表示至少一个电感应性基团，例如-NO2或卤素原子(-卤素)，比如氟原子(-F)。它们可为，例如，以下基团：
Figure BDA0002354666740000141
在式(I)中存在的接头L具有式(II)：
其中：
●L1具有式(III)：
其中：
■当P表示氢原子时，则x＝0或1且y＝1和z＝0；
■当P表示-OH时，则x＝y＝z＝0；
■当P表示经活化的O时，则x＝1且y＝z＝0或x＝y＝z＝1；
■J1、J2、J3和J4各自独立地选自CA1和N；
■ALK表示(C1-C12)亚烷基基团，比如(C1-C6)亚烷基，例如以-(CH2)n-的形式，n为1至12的整数，且例如1至6；
■A1、A2、A3、A4、A5和A6各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如氢原子或甲基基团。
●(AA)w表示w个经取代的AAs或未经取代的氨基酸AAns的序列，其通过肽键连接在一起，其中经取代的AAs或未经取代的AAns如下定义；
●w表示1至12的整数，比如1至6，例如2或3；
●若(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs，则L2表示：
单键、(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、CH(SO3H)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、(C1-C6)烷基-环己基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-CH(SO3H)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-环己基基团、NA8-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、NA8-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；
●若(AA)w表示w个未经取代的氨基酸AAns的序列，则L2表示：NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；
■A7表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NHCO-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-O-、-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2；应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
■A8表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，比如氢原子或甲基基团；
■i表示1至50的整数，例如1至35。
根据一个具体实施方案，本申请涉及式(I)的化合物：
RCG1-L-P (I)
其中
■RCG1表示反应性化学基团，其对多肽例如抗体上存在的化学基团为反应性的；
■P表示氢原子、-OH或经活化的O；
■L表示式(II)的接头：
Figure BDA0002354666740000171
其中：
●L1具有式(III)：
Figure BDA0002354666740000172
其中：
■当P表示氢原子时，则x＝0或1且y＝1和z＝0；
■当P表示-OH时，则x＝y＝z＝0；
■当P表示经活化的O时，则x＝1且y＝z＝0或x＝y＝z＝1；
■J1、J2、J3和J4各自独立地选自CA1和N；
■ALK表示(C1-C12)亚烷基基团，比如(C1-C6)亚烷基，例如以-(CH2)n-的形式，n为1至12的整数，且例如1至6；
■A1、A2、A3、A4、A5和A6各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如氢原子或甲基基团。
●(AA)w表示w个经取代的AAs或未经取代的氨基酸AAns的序列，其通过肽键连接在一起；
●w表示1至12的整数，比如1至6，例如2或3；
●若(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs，则L2表示单键、(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、CH(SO3H)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、(C1-C6)烷基-环己基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-CH(SO3H)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-环己基基团、NA8-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、NA8-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；
●若(AA)w表示w个未经取代的氨基酸AAns的序列，则L2表示NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；
■A7表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NHC(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-O-、-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2，应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)；
■A8表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，比如氢原子或甲基基团；
■i表示1至50的整数，比如1至35，
■未经取代的氨基酸AAns表示构型D或L的天然或非天然氨基酸，其与以下氨基酸相同或衍生自以下氨基酸：丙氨酸(Ala)、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、2-氨基-2-环己基乙酸、2-氨基-2-苯基乙酸、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、瓜氨酸(Cit)、半胱氨酸(Cys)、α,α-二甲基-γ-氨基丁酸、β,β-二甲基-γ-氨基丁酸、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、同型-半胱氨酸、硒代半胱氨酸、同型-硒代半胱氨酸、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、ε-乙酰基-赖氨酸(AcLys)、甲硫氨酸(Met)、鸟氨酸(Orn)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。
根据另一个具体实施方案，本申请涉及式(I)的化合物：
RCG1-L-P (I)
其中
■RCG1表示反应性化学基团，其对多肽例如抗体上存在的化学基团为反应性的；
■P表示氢原子、-OH或经活化的O；
■L表示式(II)的接头：
Figure BDA0002354666740000211
其中：
●L1具有式(III)：
Figure BDA0002354666740000212
其中：
■当P表示氢原子时，则x＝0或1且y＝1和z＝0；
■当P表示-OH时，则x＝y＝z＝0；
■当P表示经活化的O时，则x＝1且y＝z＝0或x＝y＝z＝1；
■J1、J2、J3和J4各自独立地选自CA1和N；
■ALK表示(C1-C12)亚烷基基团，比如(C1-C6)亚烷基，例如以-(CH2)n-的形式，n为1至12的整数，且例如1至6；
■A1、A2、A3、A4、A5和A6各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如氢原子或甲基基团。
●(AA)w表示w个经取代的AAs或未经取代的氨基酸AAns的序列，其通过肽键连接在一起；
●w表示1至12的整数，比如1至6，例如2或3；
●若(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs，则L2表示单键、(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、CH(SO3H)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、(C1-C6)烷基-环己基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-CH(SO3H)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-环己基基团、NA8-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、NA8-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；
●若(AA)w表示w个未经取代的氨基酸AAns的序列，则L2表示NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；
■A7表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NHC(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-O-、-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2，应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)；
■A8表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，比如氢原子或甲基基团；
■i表示1至50的整数，比如1至35，
其中所述经取代的氨基酸AAs具有式(VI)：
Figure BDA0002354666740000241
其中：
●T表示饱和或不饱和的、直链的或支链的(C1-C8)三价烷基基团，优选T为
Figure BDA0002354666740000242
●U基团表示单键、-NHC(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-NHC(＝O)NH-、-NHC(＝NH)NH-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-S-、-Se-、-O-、-NH-、-N(烷基)-、-C(＝O)-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-或-O-P(＝O)(OH)-O，例如U基团表示-NH-C(＝O)-或-C(＝O)NH-；
●A9表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NH-C(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-NHC(＝O)NH-、-NHC(＝NH)NH-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-CH(O烷基)-、-CHF-、-CF2-、-S-、-Se-、-O-、-NH-、-N(烷基)-、-N+H(烷基)-、-N+(烷基)2-、-C(＝O)-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2，比如A9为-[(CH2)2-O]4-CH3、-[(CH2)2-O]24-CH3、
Figure BDA0002354666740000251
Figure BDA0002354666740000252
或-[(CH2)2-O)]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A9可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
根据另一个具体实施方案，本申请涉及式(I)的化合物：
RCG1-L-P (I)
其中
■RCG1表示反应性化学基团，其对多肽例如抗体上存在的化学基团为反应性的；
■P表示氢原子、-OH或经活化的O；
■L表示式(II)的接头：
其中：
●L1具有式(III)：
其中：
■当P表示氢原子时，则x＝0或1且y＝1和z＝0；
■当P表示-OH时，则x＝y＝z＝0；
■当P表示经活化的O时，则x＝1且y＝z＝0或x＝y＝z＝1；
■J1、J2、J3和J4各自独立地选自CA1和N；
■ALK表示(C1-C12)亚烷基基团，比如(C1-C6)亚烷基，例如以-(CH2)n-的形式，n为1至12的整数，且例如1至6；
■A1、A2、A3、A4、A5和A6各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如氢原子或甲基基团。
●(AA)w表示w个经取代的AAs或未经取代的氨基酸AAns的序列，
其通过肽键连接在一起；
●w表示1至12的整数，比如1至6，例如2或3；
●若(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs，则L2表示单键、(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、CH(SO3H)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、(C1-C6)烷基-环己基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-CH(SO3H)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-环己基基团、NA8-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、NA8-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；
●若(AA)w表示w个未经取代的氨基酸AAns的序列，则L2表示NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；
■A7表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NHC(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-O-、-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2，应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)；
■A8表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，比如氢原子或甲基基团；
■i表示1至50的整数，比如1至35，
其中所述经取代的氨基酸AAs具有式(VI)：
Figure BDA0002354666740000291
其中：
●T表示饱和或不饱和的、直链的或支链的(C1-C8)三价烷基基团，优选T为
Figure BDA0002354666740000292
●U基团表示单键、-NHC(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-NHC(＝O)NH-、-NHC(＝NH)NH-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-S-、-Se-、-O-、-NH-、-N(烷基)-、-C(＝O)-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-或-O-P(＝O)(OH)-O，例如U基团表示-NH-C(＝O)-或-C(＝O)NH-；
●A9表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NH-C(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-NHC(＝NH)NH-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-CH(O烷基)-、-CHF-、-CF2-、-S-、-Se-、-O-、-NH-、-N(烷基)-、-N+H(烷基)-、-N+(烷基)2-、-C(＝O)-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2，比如A9为-[(CH2)2-O]4-CH3、-[(CH2)2-O]24-CH3、
Figure BDA0002354666740000301
或-[(CH2)2-O)]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A9可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
根据另一个具体实施方案，本申请涉及式(I)的化合物：
RCG1-L-P (I)
其中
■RCG1表示反应性化学基团，其对多肽例如抗体上存在的化学基团为反应性的；
■P表示氢原子、-OH或经活化的O；
■L表示式(II)的接头：
Figure BDA0002354666740000302
其中：
●L1具有式(III)：
Figure BDA0002354666740000311
其中：
■当P表示氢原子时，则x＝0或1且y＝1和z＝0；
■当P表示-OH时，则x＝y＝z＝0；
■当P表示经活化的O时，则x＝1且y＝z＝0或x＝y＝z＝1；
■J1、J2、J3和J4各自独立地选自CA1和N；
■ALK表示(C1-C12)亚烷基基团，比如(C1-C6)亚烷基，例如以-(CH2)n-的形式，n为1至12的整数，且例如1至6；
■A1、A2、A3、A4、A5和A6各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如氢原子或甲基基团。
●(AA)w表示w个经取代的AAs或未经取代的氨基酸AAns的序列，其通过肽键连接在一起；
●w表示1至12的整数，比如1至6，例如2或3；
●若(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs，则L2表示单键、(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、CH(SO3H)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、(C1-C6)烷基-环己基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-CH(SO3H)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-环己基基团、NA8-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、NA8-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；
●若(AA)w表示w个未经取代的氨基酸AAns的序列，则L2表示NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；
■A7表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NHC(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-O-、-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2，应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)
■A8表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，比如氢原子或甲基基团；
■i表示1至50的整数，比如1至35，
其中所述经取代的氨基酸AAs具有式(VI)：
Figure BDA0002354666740000341
其中：
●T表示饱和或不饱和的、直链的或支链的(C1-C8)三价烷基基团，优选T为
Figure BDA0002354666740000342
●U基团表示单键、-NHC(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-NHC(＝O)NH-、-NHC(＝NH)NH-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-S-、-Se-、-O-、-NH-、-N(烷基)-、-C(＝O)-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-或-O-P(＝O)(OH)-O，例如U基团表示-NH-C(＝O)-或-C(＝O)NH-；
●A9表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NH-C(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-NHC(＝NH)NH-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-CH(O烷基)-、-CHF-、-CF2-、-S-、-Se-、-O-、-N(烷基)-、-N+H(烷基)-、-N+(烷基)2-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2，比如A9为-[(CH2)2-O]4-CH3、-[(CH2)2-O]24-CH3、
Figure BDA0002354666740000351
Figure BDA0002354666740000352
或-[(CH2)2-O)]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A9可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
根据另一个具体实施方案，本申请涉及式(I)的化合物：
RCG1-L-P (I)
其中
■RCG1表示反应性化学基团，其对多肽例如抗体上存在的化学基团为反应性的；
■P表示氢原子、-OH或经活化的O；
■L表示式(II)的接头：
Figure BDA0002354666740000353
其中：
●L1具有式(III)：
其中：
■当P表示氢原子时，则x＝0或1且y＝1和z＝0；
■当P表示-OH时，则x＝y＝z＝0；
■当P表示经活化的O时，则x＝1且y＝z＝0或x＝y＝z＝1；
■J1、J2、J3和J4各自独立地选自CA1和N；
■ALK表示(C1-C12)亚烷基基团，比如(C1-C6)亚烷基，例如以-(CH2)n-的形式，n为1至12的整数，且例如1至6；
■A1、A2、A3、A4、A5和A6各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如氢原子或甲基基团。
●(AA)w表示w个经取代的AAs或未经取代的氨基酸AAns的序列，其通过肽键连接在一起；
●w表示1至12的整数，比如1至6，例如2或3；
●若(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs，则L2表示单键、(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、CH(SO3H)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、(C1-C6)烷基-环己基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-CH(SO3H)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-环己基基团、NA8-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、NA8-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；
●若(AA)w表示w个未经取代的氨基酸AAns的序列，则L2表示NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；
■A7表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NHC(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-O-、-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2，应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)
■A8表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，比如氢原子或甲基基团；
■i表示1至50的整数，比如1至35，
其中所述经取代的氨基酸AAs具有式(VI)：
Figure BDA0002354666740000381
其中：
●T表示饱和或不饱和的、直链的或支链的(C1-C8)三价烷基基团，优选T为
Figure BDA0002354666740000391
●U基团表示单键、-NHC(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-NHC(＝O)NH-、-NHC(＝NH)NH-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-S-、-Se-、-O-、-NH-、-N(烷基)-、-C(＝O)-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-或-O-P(＝O)(OH)-O，例如U基团表示-NH-C(＝O)-或-C(＝O)NH-；
●A9表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NH-C(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-CH(O烷基)-、-CHF-、-CF2-、-Se-、-O-、-N(烷基)-、-N+H(烷基)-、-N+(烷基)2-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2，比如A9为-[(CH2)2-O]4-CH3、-[(CH2)2-O]24-CH3、
Figure BDA0002354666740000392
或-[(CH2)2-O)]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A9可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
根据另一个具体实施方案，本申请涉及式(I)的化合物：
RCG1-L-P (I)
其中
■RCG1表示反应性化学基团，其对多肽例如抗体上存在的化学基团为反应性的；
■P表示氢原子、-OH或经活化的O；
■L表示式(II)的接头：
Figure BDA0002354666740000401
其中：
●L1具有式(III)：
Figure BDA0002354666740000402
其中：
■当P表示氢原子时，则x＝0或1且y＝1和z＝0；
■当P表示-OH时，则x＝y＝z＝0；
■当P表示经活化的O时，则x＝1且y＝z＝0或x＝y＝z＝1；
■J1、J2、J3和J4各自独立地选自CA1和N；
■ALK表示(C1-C12)亚烷基基团，比如(C1-C6)亚烷基，例如以-(CH2)n-的形式，n为1至12的整数，且例如1至6；
■A1、A2、A3、A4、A5和A6各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如氢原子或甲基基团。
●(AA)w表示w个经取代的AAs或未经取代的氨基酸AAns的序列，其通过肽键连接在一起；
●w表示1至12的整数，比如1至6，例如2或3；
●(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns且L2表示(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团；
●A7如上文所定义。
根据至少一个实施方案，(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs，且L2表示：
-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)3基团；
-C(＝O)-(C1-C6)烷基基团，例如C(＝O)-(CH2)3基团；或
-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)2-NA7-(CH2)2基团，其中A7如上文所定义。
根据至少一个实施方案，(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs，且L2表示：
-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)3基团；
-C(＝O)-(C1-C6)烷基基团，例如C(＝O)-(CH2)3基团；或
-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)2-NA7-(CH2)2基团，其中A7为-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
根据另一个实施方案，(AA)w含有w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)2-NA7-(CH2)2基团，其中A7如上文所定义。
根据另一个实施方案，(AA)w含有w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)2-NA7-(CH2)2基团，其中A7表示：
-C(＝O)-[(CH2)2-O]a-CH3基团，其中“a”表示1至50的整数，比如1至24，例如4、7和24，例如A7为C(＝O)-[(CH2)2-O]4-CH3基团、C(＝O)-[(CH2)2-O]7-CH3基团或C(＝O)-[(CH2)2-O]24-CH3基团；
--C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；或
-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-[(CH2)2-O]a-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团，其中“a”表示1至50的整数，例如1至24，对于实施例4，例如A7为-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-[(CH2)2-O]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)；
根据至少一个实施方案，(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；其中i、A7和A8如上文所定义。
根据另一个实施方案，(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团；其中i、A7和A8如上文所定义。
根据另一个实施方案，(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团；其中i、A7和A8如上文所定义。
根据另一个实施方案，(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团；其中A7和A8如上文所定义。
根据至少另一个实施方案，(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2包含A7，其表示为：
C(＝O)-[(CH2)2-O]4-CH3基团；C(＝O)-[(CH2)2-O]7-CH3基团；C(＝O)-[(CH2)2-O]24-CH3基团；C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-[(CH2)2-O]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
根据至少另一个实施方案，(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
Figure BDA0002354666740000451
Figure BDA0002354666740000461
L1可为下列之一(III1-5)：
Figure BDA0002354666740000462
Figure BDA0002354666740000471
其中：
●J1、J2、J3和J4各自独立地选自CA1和N；
●ALK表示(C1-C12)亚烷基基团，比如(C1-C6)亚烷基，例如以-(CH2)n-的形式，n为1至12的整数，且例如1至6；
●A1、A2、A3、A4、A5和A6各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如氢原子或甲基基团。
AA表示氨基酸。氨基酸为式NH2-CHA10-COOH的化合物，其中A10表示AA的侧链。AA可为经取代的AAs或未经取代的AAns氨基酸。
未经取代的氨基酸AAns表示构型D或L的天然或非天然氨基酸，其与以下氨基酸相同或衍生自以下氨基酸：丙氨酸(Ala)、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、2-氨基-2-环己基乙酸、2-氨基-2-苯基乙酸、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、瓜氨酸(Cit)、半胱氨酸(Cys)、α,α-二甲基-γ-氨基丁酸、β,β-二甲基-γ-氨基丁酸、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、同型-半胱氨酸、硒代半胱氨酸、同型-硒代半胱氨酸、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、ε-乙酰基-赖氨酸(AcLys)、甲硫氨酸(Met)、鸟氨酸(Orn)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。
例如，AAns表示丙氨酸(Ala)、瓜氨酸(Cit)、甘氨酸(Gly)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、ε-乙酰基-赖氨酸(AcLys)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)和缬氨酸(Val)。
所述经取代的氨基酸AAs具有式(VI)：
Figure BDA0002354666740000472
其中：
●T表示饱和或不饱和的、直链的或支链的(C1-C8)三价烷基基团，比如T为
Figure BDA0002354666740000481
●U基团表示单键、-NHC(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-NHC(＝O)NH-、-NHC(＝NH)NH-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-S-、-Se-、-O-、-NH-、-N(烷基)-、-C(＝O)-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-或-O-P(＝O)(OH)-O，例如U基团表示-NH-C(＝O)-或-C(＝O)NH-；
●A9表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NH-C(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-NHC(＝O)NH-、-NHC(＝NH)NH-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-CH(O烷基)-、-CHF-、-CF2-、-S-、-Se-、-O-、-NH-、-N(烷基)-、-N+H(烷基)-、-N+(烷基)2-、-C(＝O)-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2，比如A9为[(CH2)2-O]4-CH3、[(CH2)2-O]24-CH3、
Figure BDA0002354666740000482
或[(CH2)2-O)]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H；应理解的是，各个包含SO3H官能团的A9可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
根据一个具体实施方案，所述经取代的氨基酸AAs具有式(VI)：
Figure BDA0002354666740000491
其中：
●T表示饱和或不饱和的、直链的或支链的(C1-C8)三价烷基基团，比如T为
Figure BDA0002354666740000492
●U基团表示单键、-NHC(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-NHC(＝O)NH-、-NHC(＝NH)NH-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-S-、-Se-、-O-、-NH-、-N(烷基)-、-C(＝O)-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-或-O-P(＝O)(OH)-O，例如U基团表示-NH-C(＝O)-或-C(＝O)NH-；
●A9表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NH-C(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-NHC(＝NH)NH-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-CH(O烷基)-、-CHF-、-CF2-、-S-、-Se-、-O-、-NH-、-N(烷基)-、-N+H(烷基)-、-N+(烷基)2-、-C(＝O)-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2，比如A9为[(CH2)2-O]4-CH3、[(CH2)2-O]24-CH3、
Figure BDA0002354666740000501
或[(CH2)2-O)]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A9可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
根据另一个具体实施方案，所述经取代的氨基酸AAs具有式(VI)：
Figure BDA0002354666740000502
其中：
●T表示饱和或不饱和的、直链的或支链的(C1-C8)三价烷基基团，比如T为
Figure BDA0002354666740000503
●U基团表示单键、-NHC(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-NHC(＝O)NH-、-NHC(＝NH)NH-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-S-、-Se-、-O-、-NH-、-N(烷基)-、-C(＝O)-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-或-O-P(＝O)(OH)-O，例如U基团表示-NH-C(＝O)-或-C(＝O)NH-；
●A9表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NH-C(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-NHC(＝NH)NH-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-CH(O烷基)-、-CHF-、-CF2-、-S-、-Se-、-O-、-N(烷基)-、-N+H(烷基)-、-N+(烷基)2-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2，比如A9为[(CH2)2-O]4-CH3、[(CH2)2-O]24-CH3、
Figure BDA0002354666740000511
或[(CH2)2-O)]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A9可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
根据另一个具体实施方案，所述经取代的氨基酸AAs具有所述式(VI)：
Figure BDA0002354666740000513
其中：
●T表示饱和或不饱和的、直链的或支链的(C1-C8)三价烷基基团，比如T为
Figure BDA0002354666740000514
●U基团表示单键、-NHC(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-NHC(＝O)NH-、-NHC(＝NH)NH-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-S-、-Se-、-O-、-NH-、-N(烷基)-、-C(＝O)-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-或-O-P(＝O)(OH)-O，例如U基团表示-NH-C(＝O)-或-C(＝O)NH-；
●A9表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NH-C(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-CH(O烷基)-、-CHF-、-CF2-、-Se-、-O-、-N(烷基)-、-N+H(烷基)-、-N+(烷基)2-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2，比如A9为[(CH2)2-O]4-CH3、[(CH2)2-O]24-CH3、
Figure BDA0002354666740000521
或[(CH2)2-O)]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A9可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
可提及的T的实例包括：
Figure BDA0002354666740000522
Figure BDA0002354666740000531
根据至少一个实施方案，所述经取代的氨基酸AAs具有式(VI)，其中：
●T表示饱和或不饱和的、直链的或支链的(C1-C8)三价烷基基团，例如
Figure BDA0002354666740000532
●U基团表示-NH-C(＝O)-或-C(＝O)NH-；
●A9表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-C(＝O)NH-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-O-、-NH-或-C(＝O)-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基，例如A9为[(CH2)2-O]4-CH3、[(CH2)2-O)]24-CH3、或[(CH2)2-O]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A9可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
根据另一个实施方案，所述经取代的氨基酸AAs具有式(VI)，其中：
●T表示
Figure BDA0002354666740000534
●U基团表示-NH-C(＝O)-或-C(＝O)NH-；
●A9表示[(CH2)2-O]4-CH3、[(CH2)2-O]24-CH3、
Figure BDA0002354666740000542
或[(CH2)2-O]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A9可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
根据另一个实施方案，所述经取代的氨基酸AAs具有式(VI)，其中：
●T表示
Figure BDA0002354666740000543
●U基团表示-NH-C(＝O)-或-C(＝O)NH-；
●A9表示-[(CH2)2-O]b-CH3其中“b”表示1至50的整数，比如1至24，例如4、7和24(对于实施例4或24)。
所述序列(AA)w具有式：
Figure BDA0002354666740000544
其中A10表示上述经取代的AAs或未经取代的AAns氨基酸之一的侧链。
未经取代的氨基酸(AAns)w的序列的实例如下：Gly-Gly、Phe-Lys、Val-Lys、Val-AcLys、Val-Cit、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Ala-Lys、Val-Ala、Phe-Cit、Phe-Gly、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Phe、Gly-Gly-Gly、Gly-Ala-Phe、Gly-Phe-Gly、Gly-Val-Cit、Gly-Phe-Leu-Cit(SEQ ID No.3)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ IDNo.4)、Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID No.5)。
根据至少一个实施方案，所述未经取代的氨基酸AAns的序列(AAns)w选自以下列表：Gly-Gly、Phe-Lys、Val-Lys、Val-AcLys、Val-Cit、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Ala-Lys、Val-Ala、Phe-Cit、Phe-Gly、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Phe、Gly-Gly-Gly、Gly-Ala-Phe、Gly-Phe-Gly、Gly-Val-Cit、Gly-Phe-Leu-Cit(SEQ IDNo.3)、Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID No.4)以及Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID No.5)，例如Val-Ala和Val-Cit，比如Val-Ala。
根据至少另一个实施方案，含有至少一个经取代的氨基酸AAs的序列(AAs)w选自以下列表：
Figure BDA0002354666740000551
Figure BDA0002354666740000561
作为本申请主题的式(II)的接头L中可提及的例如以下化合物：
Figure BDA0002354666740000581
Figure BDA0002354666740000591
Figure BDA0002354666740000611
Figure BDA0002354666740000631
Figure BDA0002354666740000641
可提及的RCG1的实例包括：
(i)RaZa-C(＝O)-反应性基团，其中：
Za表示单键、-O-或-NH，例如-O-，且
Ra表示氢原子、(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、烯基、芳基、杂芳基或(C3-C7)杂环烷基基团。所述芳基基团、杂芳基基团和/或(C3-C7)杂环烷基基团可被1至5原子/基团取代，该原子/基团选自卤素原子，例如氟原子，烷基基团、烷氧基基团、羟基基团、氧代基团、硝基基团和氰基基团；
(ii)以下反应性基团之一：马来酰亚氨基
Figure BDA0002354666740000642
基团；卤乙酰氨基Cl、Br或基团，其中R21表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如Me；Cl-；N3-；HO-；HS-；经活化的二硫，例如H或
Figure BDA0002354666740000644
H2N-；HC≡C-或经活化的C≡C，例如环辛炔部分，比如DBCO-胺
Figure BDA0002354666740000645
或BCN
Figure BDA0002354666740000646
或MFCO
Figure BDA0002354666740000647
O-烷基羟基胺或Pictet-Spengler反应底物例如在Agarwal P.等,Bioconjugate Chem2013,24,846-851中描述的
Figure BDA0002354666740000651
根据具体实施方案，RCG1可为：
(i)RaZa-C(＝O)-反应性基团，其中：
Za表示单键、-O-或-NH，例如-O-，且
Ra表示氢原子、(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、烯基、芳基、杂芳基或(C3-C7)杂环烷基基团。所述芳基基团、杂芳基基团和/或(C3-C7)杂环烷基基团可被1至5原子/基团取代，该原子/基团选自卤素原子，例如氟原子，烷基基团、烷氧基基团、羟基基团、氧代基团、硝基基团和氰基基团；
(ii)以下反应性基团之一：卤乙酰氨基Cl、Br或
Figure BDA0002354666740000652
基团，其中R21表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如Me；Cl-；N3-；HO-；HS-；经活化的二硫，例如H或
Figure BDA0002354666740000653
H2N-；HC≡C-或经活化的C≡C，例如环辛炔部分，比如DBCO-胺或BCN
Figure BDA0002354666740000655
或MFCO
Figure BDA0002354666740000656
O-烷基羟基胺或Pictet-Spengler反应底物例如在Agarwal P.等,Bioconjugate Chem 2013,24,846-851中描述的
Figure BDA0002354666740000657
比如，RaZa-可表示HO-、CH3O-、CH2＝CH-CH2O-、
Figure BDA0002354666740000661
(O-NHS)、
Figure BDA0002354666740000662
其中阳离子表示例如钠、钾或铯或
Figure BDA0002354666740000663
基团，其中GI表示至少一个电感应性基团，例如-NO2或卤素原子，例如氟原子(F)。例如，它们可为以下基团：另一类型的RaZa-C(＝O)-基团为以下：
Figure BDA0002354666740000665
比如，RCG1可选自在实施例中描述的那些之一，即选自以下基团：COOH、
Figure BDA0002354666740000666
本申请进一步涉及式(IV)的念珠藻素有效载荷：
Figure BDA0002354666740000667
其中：
■R1表示(C1-C6)烷基基团，
■R2和R3各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团；
或者R2和R3与它们所连接的碳原子一同形成(C3-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基基团；
■R4和R5各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团或(C1-C6)烷基-NH(R12)基团或(C1-C6)烷基-OH基团或(C1-C6)烷基-SH基团或(C1-C6)烷基-C(＝O)2H基团；
或者R4和R5与它们所连接的碳原子一同形成(C3-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基基团；
■X表示O或N(R6)；
■R6表示氢原子或(C1-C6)烷基基团；
■R7和R8各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团或(C1-C6)烷基-C(＝O)2H基团或(C1-C6)烷基-N(C1-C6)烷基2基团；
或者R7和R8与它们所连接的碳原子一同形成(C3-C6)环烷基基团或(C3-C6)杂环烷基基团；
■R9表示至少一个苯基核的取代基，其各自独立地选自：氢原子、-OH、(C1-C4)烷氧基、卤素原子、-NH2、-NH(C1-C6)烷基或-N(C1-C6)烷基2或-NH(C1-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基基团；
■R10表示至少一个苯基核的取代基，其选自氢原子和(C1-C4)烷基基团；
■Y表示
●-NR11-(C1-C6)烷基-，例如-NR11-(CH2)n-如
Figure BDA0002354666740000671
●-O-(C1-C6)烷基-，例如-O-(CH2)n-如
●-S-(C1-C6)烷基-，例如-S-(CH2)n-如
Figure BDA0002354666740000673
Y位于苯基核的邻位(o)、间位(m)或对位(p)；
■R11和R12各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基，比如氢原子或甲基基团；
■n表示整数1至6；
■L如在式(I)所定义且表示如在本申请中定义的式(II)的接头；
■RCG1表示存在于接头L的末端的反应性化学基团，RCG1对多肽(例如抗体)上存在的化学基团有反应性。RCG1如上文所定义。
各个取代基R1至R12也可采用实施例中所述的空间构型(例如，R或S，或者Z或E)之一。式(IV)的化合物可含有至少一个不对称碳原子。因此，它们可以对映异构体或非对映异构体的形式存在。这些对映异构体和非对映异构体，以及它们的混合物，包括外消旋混合物，构成了本申请的一部分。
作为一个例子，式(IV)的念珠藻素化合物可为在WO2011/001052中描述的(例如D1-D8之一)或在PCT/EP2016/076603中描述的(例如D1-D19之一)的念珠藻素式(I)的化合物之一，如上文所提及。
或所述念珠藻素化合物可为实施例之一中描述的等效单元。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由其中R1表示(C1-C6)烷基(例如甲基基团)的化合物构成。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由其中R2和R3各自表示氢原子的化合物构成。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由其中R2和R3之一表示(C1-C6)烷基(例如甲基基团)且另一个表示氢原子的化合物构成。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由其中R2和R3与它们所连接的碳原子一同形成(C3-C6)环烷基基团(例如环丙基基团)的化合物构成。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由其中R4和R5各自表示(C1-C6)烷基(例如甲基基团)的化合物构成。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由其中X表示氧原子(即O)的化合物构成。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由其中X表示NH的化合物构成。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由其中R7和R8各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团(例如异丁基基团或新戊基基团)的化合物构成。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由其中R9表示2个取代基(该取代基选自甲氧基基团和氯原子，例如2个R9取代基为3-Cl和4-甲氧基)的化合物构成。比如，苯基核在苯基核的3位和4位包含2个取代基。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由其中R10表示氢原子的化合物构成。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由其中Y位于苯基核的对位位置的化合物构成。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由其中Y表示NR11-(C1-C6)烷基，例如NR11-(C1-C3)烷基，比如NH-CH2的化合物构成。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由其中式(II)的L包含w个氨基酸(AA)w的序列中至少一个经取代的氨基酸AAs的化合物构成，L1和L2如在式(II)中所定义。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由其中式(II)的L包含w个未经取代的氨基酸AAns的序列的化合物构成，L1和L2如在式(II)中所定义。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs，且L2表示：
-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)3基团；
-C(＝O)-(C1-C6)烷基基团，例如C(＝O)-(CH2)3基团；或
-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)2-NA7-(CH2)2基团，其中A7如上文所定义。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs，且L2表示：
-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)3基团；
-C(＝O)-(C1-C6)烷基基团，例如C(＝O)-(CH2)3基团；或
-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)2-NA7-(CH2)2基团，其中A7为-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)2-NA7-(CH2)2基团，其中A7如上文所定义。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)2-NA7-(CH2)2基团，其中A7表示：
-C(＝O)-[(CH2)2-O]a-CH3基团，其中“a”表示1至50的整数，比如1至24，例如4、7和24，例如A7为C(＝O)-[(CH2)2-O]4-CH3基团、C(＝O)-[(CH2)2-O]7-CH3基团或C(＝O)-[(CH2)2-O]24-CH3基团；
--C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；或
-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-[(CH2)2-O]a-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团，其中“a”表示1至50的整数，例如1至24(对于实施例4)，例如A7为-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-[(CH2)2-O]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；其中i、A7和A8如上文所定义。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组优选的化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团；其中i、A7和A8如上文所定义。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组更优选的化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团；其中i、A7和A8如上文所定义。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组更优选的化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团；其中A7和A8如上文所定义。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组更优选的化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团；其中A7如上文所定义。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2包含A7，其表示为：
C(＝O)-[(CH2)2-O]4-CH3基团；C(＝O)-[(CH2)2-O]7-CH3基团；C(＝O)-[(CH2)2-O]24-CH3基团；C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-[(CH2)2-O]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
Figure BDA0002354666740000731
Figure BDA0002354666740000741
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，一组化合物由在L中包含序列(AAs)w的化合物构成，所述序列(AAs)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs(AAs)w选自以下列表：
Figure BDA0002354666740000751
Figure BDA0002354666740000761
Figure BDA0002354666740000771
在作为本申请主题的式(IV)化合物中，化合物的组由以下结构(β环氧化物构型)的化合物构成：
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、n、RCG1、X、Y和L如在式(IV)中所定义。
所有这些亚组，单独或组合，是本申请的一部分。
根据至少一个实施方案，本申请涉及式(IV)的化合物，其中：
-RCG1为COOH、
Figure BDA0002354666740000781
-L表示以下式(II)的化合物之一：
Figure BDA0002354666740000782
Figure BDA0002354666740000791
Figure BDA0002354666740000811
Figure BDA0002354666740000831
Figure BDA0002354666740000841
-Y为NR11-(C1-6)烷基，其中R11为氢原子，例如Y为NH-CH2；
-R1表示(C1-C6)烷基基团，例如甲基基团；
-R2和R3各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如甲基基团；
-R4和R5各自独立地表示(C1-C6)烷基基团，例如甲基基团；
-R7和R8各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如异丁基基团或新戊基基团，比如R7和R8之一表示(C1-C6)烷基基团，例如异丁基基团或新戊基基团，且R7和R8的另一个表示氢原子；
-X表示氧原子或NH；
-R9表示2个取代基，该取代基选自(C1-C4)烷氧基基团，例如甲氧基基团，以及卤素原子，比如氯原子，例如R9表示3-Cl和4-甲氧基；且
-R10表示氢原子。
作为本申请主题的式(IV)的化合物中，可特别提及以下化合物：
Figure BDA0002354666740000842
Figure BDA0002354666740000851
Figure BDA0002354666740000871
Figure BDA0002354666740000881
Figure BDA0002354666740000901
Figure BDA0002354666740000911
本申请进一步涉及式(V)的缀合物：
Figure BDA0002354666740000922
其中：
■R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12如在式(IV)中所定义；
■X、Y和L如在式(IV)中所定义；
■G表示在式(II)的接头L的末端存在的反应性化学基团RCG1与在多肽例如抗体(Ab)上存在的正交反应性化学基团RCG2的反应产物；
■Ab表示抗体。
为获得式(V)的缀合物，式(IV)的念珠藻素有效载荷与抗体之间的连接通过在有效载荷(如上文所定义的，为反应性的)上存在的反应性化学基团RCG1向在多肽例如抗体上存在的反应性基团RCG2反应来产生。RCG1与RCG2之间的反应通过形成共价键保证了式(IV)的化合物与抗体之间的连接。在式(V)的缀合物中，部分RCG1和RCG2可保持形成接头和抗体之间的连接。
可提及的RCG2的实施例包括(Garnett M.C.等,Advanced Drug DeliveryReviews 2001,53,171-216)：
(i)在抗体表面上存在的赖氨酸残基的侧链带有的赖氨酸的ε-氨基基团；
(ii)抗体重链和轻链的N-端氨基酸的α-氨基基团；
(iii)铰链区的糖类基团；
(iv)通过还原链内二硫键产生的半胱氨酸的硫醇或经工程化改造的半胱氨酸的硫醇；
(v)在抗体表面上存在的一些谷氨酰胺残基的侧链带有的酰胺基团；
(vi)使用甲酰基甘氨酸生成酶引入的醛基团。
最近，还考虑了其它缀合方法，例如通过突变引入半胱氨酸((Junutula J.R.等,Nature Biotechnology 2008,26,925-932)、引入非天然氨基酸以允许其它类型的化学反应((Axup J.Y.等,PNAS 2012,109,40,16101-16106)或抗体聚糖上的缀合(Zhou Q.等,Bioconjugates Chem.2014,25,510-520)。使用半胱氨酸桥接二溴马来酰亚胺(BehrensC.R.等,Mol.Pharmaceutics 2015 3986-3998)和双砜试剂((Bryant P.等,Mol.Pharmaceutics 2015 1872-1879)以交叉连接抗体也已有描述，并可应用于本申请。
抗体的位点特异性修饰的另一种方法是基于使用例如细菌谷氨酰胺转氨酶的酶缀合(Jeger S.等,Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,9995-9997；Strop P.等,Chem.Biol.2013,20,161-167)或甲酰基甘氨酸生成酶(Hudak J.E.等,Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,4161-4165)。有关位点特异性缀合策略的综述，请参见Agarwal P.&Bertozzi C.R.,Bioconjugates Chem 2015,26,176-192。这些缀合技术也可应用于本申请中描述的念珠藻素有效载荷。
还可以化学修饰多肽例如抗体，以引入新的反应性化学基团RCG2。因此，本领域技术人员公知如何借助改性剂来修饰抗体，例如，引入活化的二硫、硫醇、马来酰亚氨基，卤代乙酰氨基、叠氮基、炔或环炔基团(尤其参见WO2005/077090第14页和WO2011/001052)。所述修饰可改善缀合反应并且可使用更多种类的RCG1基团。
例如，在RCG1具有上述(ii)类型的情况下，可以使用适当的改性剂对抗体进行化学修饰，或者引入一个或多个非天然氨基酸以引入适当的官能团RCG2。例如：
-当RCG1表示N-羟基琥珀酰亚胺基酯时，RCG2表示-NH2基团；
-当RCG1表示马来酰亚氨基官能团、卤乙酰氨基官能团、氯原子或经活化的二硫时，RCG2可为SH基团；
-当RCG1表示N3基团时，RCG2可为C≡CH官能团或经活化的C≡C官能团，例如环辛炔部分；
-当RCG1表示OH基团或NH2基团时，RCG2可为羧酸或酰胺官能团；-当RCG1表示SH基团时，RCG2可为马来酰亚氨基官能团、卤乙酰氨基官能团或经活化的二硫官能团；
-当RCG1表示C≡CH官能团或经活化的C≡C官能团时，RCG2可为N3基团；
-当RCG1表示O-烷基羟基胺官能团或Pictet-Spengler反应底物时，RCG2可为酸酐或酮官能团。
可提及的G的实例包括
Figure BDA0002354666740000941
比如，G表示以下基团：
例如
Figure BDA0002354666740000943
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由其中R1表示(C1-C6)烷基，例如甲基基团的化合物构成。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由其中R2和R3各自表示氢原子的化合物构成.
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由其中R2和R3之一表示(C1-C6)烷基基团，例如甲基基团且另一个表示氢原子的化合物构成。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由其中R2和R3与它们所连接的碳原子一同形成(C3-C6)环烷基基团、例如环丙基基团的化合物构成。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由其中R4和R5各自表示(C1-C6)烷基基团尤其是甲基基团的化合物构成。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由其中X表示氧原子即O的化合物构成。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由其中X表示NH的化合物构成。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由其中R7和R8各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如异丁基基团或新戊基基团的化合物构成。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由其中R9表示2个选自甲氧基基团和氯原子的取代基的化合物构成。比如，苯基核在该苯基核的3位和4位包含2个取代基。例如，3-Cl和4-甲氧基。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由其中R10表示氢原子的化合物构成。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由其中Y位于苯基核的对位位置的化合物构成。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由其中Y为NR11-(C1-C6)烷基，例如NR11-(C1-C3)烷基，比如NH-CH2的化合物构成。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L在w个氨基酸(AA)w的序列中包含至少一个经取代的氨基酸AAs，L1和L2如在式(II)中所定义。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L包含w个未经取代的氨基酸AAns的序列，L1和L2如在式(II)中所定义。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs，且L2表示：-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)3基团；
-C(＝O)-(C1-C6)烷基基团，例如C(＝O)-(CH2)3基团；或
-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)2-NA7-(CH2)2基团，其中A7如上文所定义。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs，且L2表示：-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)3基团；
-C(＝O)-(C1-C6)烷基基团，例如C(＝O)-(CH2)3基团；或
-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)2-NA7-(CH2)2基团，其中A7为-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)2-NA7-(CH2)2基团，其中A7如上文所定义。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团，例如(CH2)2-NA7-(CH2)2基团，其中A7表示：
-C(＝O)-[(CH2)2-O]a-CH3基团，其中“a”表示1至50的整数，比如1至24，例如4、7和24，例如A7为C(＝O)-[(CH2)2-O]4-CH3基团、C(＝O)-[(CH2)2-O]7-CH3基团或C(＝O)-[(CH2)2-O]24-CH3基团；
--C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；或
-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-[(CH2)2-O]a-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团，其中“a”表示1至50的整数，例如1至24，对于实施例4，例如A7为-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-[(CH2)2-O]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)；
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；其中i、A7和A8如上文所定义。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组优选的化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团；其中i、A7和A8如上文所定义。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组更优选的化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团；其中i、A7和A8如上文所定义。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组更优选的化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团；其中A7和A8如上文所定义。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组最优选的化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团；其中A7如上文所定义。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns且L2包含A7，其表示为：
C(＝O)-[(CH2)2-O]4-CH3基团；C(＝O)-[(CH2)2-O]7-CH3基团；C(＝O)-[(CH2)2-O]24-CH3基团；C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-[(CH2)2-O]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由以下化合物构成，其中式(II)的L中的(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns，且L2表示：
Figure BDA0002354666740001001
Figure BDA0002354666740001011
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由在L中序列(AAs)w含有至少一个经取代的氨基酸AAsa的化合物构成，(AAs)w选自以下列表：
Figure BDA0002354666740001021
Figure BDA0002354666740001031
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由以下化合物构成：其中Ab为抗Epha2抗体，例如hu2H11_R35R74抗体，其表示为SEQ ID NO:1(抗体hu2H11_R35R74的轻链)和SEQ ID NO:2(抗体hu2H11_R35R74的重链)，它们分别对应于WO2011039724A1中表示的SEQ ID NO：16和SEQ ID NO:18。
根据至少一个实施方案，本申请涉及式(V)的化合物，其中：
-Ab表示抗体；
-G表示：
Figure BDA0002354666740001051
-Y为NR11-(C1-6)烷基基团，其中R11为氢原子，比如Y为NH-CH2基团；
-L表示：
Figure BDA0002354666740001052
Figure BDA0002354666740001061
Figure BDA0002354666740001071
-R1表示(C1-C6)烷基基团，例如甲基基团；
-R2和R3各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如甲基基团；
-R4和R5各自独立地表示(C1-C6)烷基基团，例如甲基基团；
-R7和R8各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如异丁基基团或新戊基基团，比如R7和R8之一表示(C1-C6)烷基基团，例如异丁基基团或新戊基基团且R7和R8的另一个表示氢原子；
-X表示氧原子或NH；
-R9表示2个取代基，该取代基选自(C1-C4)烷氧基基团，例如甲氧基基团，以及卤素原子，例如氯原子，比如R9表示3-Cl和4-甲氧基；和
-R10表示氢原子。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，一组化合物由以下结构(β环氧化物构型)的化合物构成：
Figure BDA0002354666740001082
其中：
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、n、RCG1、X、Y和L如在式(IV)中所定义。
所有这些单独或组合使用的子基团都是本申请的一部分。
在作为本申请主题的式(V)的化合物中，可提及以下化合物：
Figure BDA0002354666740001091
Figure BDA0002354666740001101
Figure BDA0002354666740001111
其中Ab如本申请的式(V)中所定义。
根据本申请，通式(I)、(II)、(III)、(IV)和(V)的化合物可以通过以下方法制备。
制备式(II)的接头
●制备具有改善的亲水性的间隔基
Figure BDA0002354666740001121
步骤(i)：使用烯丙基溴和碱(例如，碳酸铯)保护羧酸作为烯丙基酯；
步骤(ii)：使用HCl溶液(例如，在二噁烷中的溶液)或TFA溶液进行Boc胺的脱保护；
步骤(iii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，在丙烯酸叔丁基酯上加成胺；
步骤(iv)：在碱(例如，DIEA)的存在下，偶联胺和经活化的羧酸例如NHS酯或酰氯；
步骤(v)：使用HCl溶液(例如，在二噁烷中的溶液)或TFA溶液进行叔丁基酯的脱保护；
步骤(vi)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯；
步骤(vii)：偶联至琥珀酸酐；
步骤(viii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯，并与胺偶联。
方案1描述始于Boc-β-Ala-OH(CAS号[3303-84-2])的合成，但也可应用于n为3至10的可商购的其它经Boc保护的氨基-烷基酸。它描述使用琥珀酸酐的合成，但也可应用于n为3至10的可商购的戊二酸酐或烷基二酸。
●具有改善的亲水性的间隔基与典型二肽的结合
Figure BDA0002354666740001131
步骤(i)：使用偶联试剂(例如，EDC和HOBt)进行肽偶联，并在碱(例如，哌啶)的存在下，进行Fmoc胺的脱保护；
步骤(ii)：对于间隔基3，在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯，并晶型间隔基3和4与二肽的偶联；
步骤(iii)：使用HCl溶液(例如，在二噁烷中的溶液)或TFA溶液进行叔丁基酯的脱保护；
步骤(iv)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯，并与胺偶联；
步骤(v)：使用HCl溶液(例如，在二噁烷中的溶液)或TFA溶液进行Boc胺的脱保护。
方案2描绘了使用Val-Ala二肽合成接头，但也可应用于其它二肽；它描绘了使用间隔基3或4的合成，但也可应用于间隔基1或2；它描绘了使用Boc-单保护的亚乙二胺的合成，但也可应用于n为3至10的可商购的其它Boc-单保护的二胺。
●制备具有改善的亲水性的二肽
■制备具有改善的亲水性的二肽，基于在其侧链上携带羧酸基团的氨基酸
Figure BDA0002354666740001151
步骤(i)：使用偶联试剂(例如，EDC和HOBt)进行羧酸和胺的肽偶联；
步骤(ii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯；
步骤(iii)：在碱(例如，碳酸氢钠或DIEA)的存在下，进行NHS酯和胺的肽偶联；
步骤(iv)：使用HCl溶液(例如，在二噁烷中的溶液)或TFA溶液进行叔丁基酯的脱保护；
步骤(v)：使用偶联试剂(例如，T3P)，进行二肽与Boc-单保护的乙二胺的肽偶联；
步骤(vi)：使用HCl溶液(例如，在二噁烷中的溶液)或TFA溶液进行Boc胺的脱保护；
步骤(vii)：使用偶联试剂(例如，EEDQ)，进行二肽与对氨基苄基醇的肽偶联；
步骤(viii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过使用氯甲酸对硝基苯基酯处理，活化苄醇作为碳酸对硝基苯基酯；
步骤(ix)：在碱(例如，DIEA)的存在下，经活化的醇和胺形成氨基甲酸酯。
方案3描绘了始于Val的二肽的合成，但可应用于其它上述列举的氨基酸；它描绘了使用L-Glu叔丁基酯(CAS号[45120-30-7])的合成，但也可应用于其它侧链上携带羧酸的氨基酸，例如，L-Asp叔丁基酯(CAS号[4125-93-3])、D-Asp叔丁基酯(CAS号[148823-36-3])、D-Glu叔丁基酯(CAS号[25456-76-2])、2-氨基-己烷二酸1-叔丁基酯(CAS号[1245806-58-9])或2-氨基-庚烷二酸1-叔丁基酯(CAS号[1888498-03-0])。方案4描绘了使用对氨基苄基醇(CAS号[623-04-1])合成二肽，但也可应用于可商购的其它氨基苄基醇化合物，例如，4-(1-羟基乙基)-苯胺(外消旋的(CAS号[14572-89-5])或对映体纯的(R)(CAS号[210754-25-9])或(S)(CAS号[500229-84-5]))、4-氨基-α,α-二甲基-苯-甲醇(CAS号[23243-04-1])、4-氨基-α-甲氧基-α-甲基-苯甲醇(CAS号[1379318-81-6])、4-氨基-α-甲基-α-三氟甲基-苯甲醇(CAS号[851652-56-7])、2-氨基-苯甲醇(CAS号[5344-90-1])、2-氨基-α-甲基-苯甲醇(外消旋的(CAS号[10517-50-7])或对映体纯的(R)(CAS号[3205-21-8])或(S)(CAS号[3205-21-8]))、6-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[113293-71-3])、6-氨基-α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[1335054-83-5])、6-氨基-α-乙基-3-吡啶甲醇(CAS号[1355225-85-2])、6-氨基-α,α-二甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[843646-03-8])、5-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[873651-92-4])、2-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[23612-57-9])、2-氨基-α-甲基-3-吡啶甲醇(外消旋的(CAS号[869567-91-9])或对映体纯的(R)(CAS号[936718-01-3])或(S)(CAS号[936718-00-2]))、2-氨基-α-乙基-3-吡啶甲醇(CAS号[914223-90-8])、2-氨基-α,α-二甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[213666-96-7])、3-氨基-4-吡啶甲醇(CAS号[152398-05-5])、3-氨基-α-甲基-4-吡啶甲醇(CAS号[1242470-88-7])、3-氨基-α,α-甲基-4-吡啶甲醇(CAS号[13357-81-8])、4-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[138116-34-4])、4-氨基-α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[741223-49-4])、4-氨基-α,α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[1339013-26-1])、3-氨基-2-吡啶甲醇(CAS号[52378-63-9])、3-氨基-α-甲基-2-吡啶甲醇(CAS号[954240-54-1])、3-氨基-α,α-甲基-2-吡啶甲醇(CAS号[899438-57-4])；它描绘了使用Boc-单保护的亚乙二胺的合成，但也可应用于n为3至10的可商购的其它Boc-单保护的二胺。
■基于其侧链上携带氨基基团的氨基酸，制备具有改善的亲水性的二肽
Figure BDA0002354666740001171
或者二肽5可根据方案6中描述的合成来制备。
Figure BDA0002354666740001181
Figure BDA0002354666740001191
步骤(i)：使用偶联试剂(例如，EDC和HOBt)进行羧酸和胺的肽偶联；
步骤(ii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯；
步骤(iii)：在碱(例如，碳酸氢钠或DIEA)的存在下，进行NHS酯和胺之间的肽偶联；
步骤(iv)：使用HCl溶液(例如，在二噁烷中的溶液)或TFA溶液进行Boc胺的脱保护；
步骤(v)：使用偶联试剂(例如，T3P)进行二肽与Boc-单保护的乙二胺的肽偶联；
步骤(vi)：使用偶联试剂(例如，EEDQ)进行二肽与对氨基苄基醇的肽偶联；
步骤(vii)：通过用氯甲酸对硝基苯基酯的处理，在碱(例如，DIEA)的存在下，活化苄醇作为碳酸对硝基苯基酯；
步骤(viii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，经活化的醇和胺形成氨基甲酸酯。
方案5和6描绘了始于Val的二肽的合成，但可应用于其它上述列表的氨基酸。方案5描绘了使用在侧链经Boc-保护的L-Lys(CAS号[2418-95-3])的合成，但也可应用于其它在其侧链上携带氨基基团的氨基酸，例如，(S)-3-氨基-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸(CAS号[73259-81-1])、(S)-3-氨基-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酸(CAS号[76387-70-7])、(S)-4-氨基-2-(叔丁氧基羰基氨基)丁酸(CAS号[25691-37-6])、(R)-4-氨基-2-(叔丁氧基羰基氨基)丁酸(CAS号[80445-78-9])、在侧链Boc-保护的L-鸟氨酸(CAS号[21887-64-9])、在侧链Boc-保护的D-鸟氨酸(CAS号[159877-12-0])、在侧链Boc-保护的D-Lys(CAS号[106719-44-2])、(2S)-2-氨基-7-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]庚酸(CAS号[1142814-17-2])或(2R)-2-氨基-7-[[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基]庚酸(CAS号[117833-90-6])。方案7描绘了使用对氨基苄基醇(CAS号[623-04-1])合成二肽，但也可应用于可商购的其它氨基苄基醇化合物，例如，4-(1-羟基乙基)-苯胺(外消旋的(CAS号[14572-89-5])或对映体纯的(R)(CAS号[210754-25-9])或(S)(CAS号[500229-84-5]))、4-氨基-α,α-二甲基-苯-甲醇(CAS号[23243-04-1])、4-氨基-α-甲氧基-α-甲基-苯甲醇(CAS号[1379318-81-6])、4-氨基-α-甲基-α-三氟甲基-苯甲醇(CAS号[851652-56-7])、2-氨基-苯甲醇(CAS号[5344-90-1])、2-氨基-α-甲基-苯甲醇(外消旋的(CAS号[10517-50-7])或对映体纯的(R)(CAS号[3205-21-8])或(S)(CAS号[3205-21-8]))、6-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[113293-71-3])、6-氨基-α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[1335054-83-5])、6-氨基-α-乙基-3-吡啶甲醇(CAS号[1355225-85-2])、6-氨基-α,α-二甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[843646-03-8])、5-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[873651-92-4])、2-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[23612-57-9])、2-氨基-α-甲基-3-吡啶甲醇(外消旋的(CAS号[869567-91-9])或对映体纯的(R)(CAS号[936718-01-3])或(S)(CAS号[936718-00-2]))、2-氨基-α-乙基-3-吡啶甲醇(CAS号[914223-90-8])、2-氨基-α,α-二甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[213666-96-7])、3-氨基-4-吡啶甲醇(CAS号[152398-05-5])、3-氨基-α-甲基-4-吡啶甲醇(CAS号[1242470-88-7])、3-氨基-α,α-甲基-4-吡啶甲醇(CAS号[13357-81-8])、4-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[138116-34-4])、4-氨基-α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[741223-49-4])、4-氨基-α,α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[1339013-26-1])、3-氨基-2-吡啶甲醇(CAS号[52378-63-9])、3-氨基-α-甲基-2-吡啶甲醇(CAS号[954240-54-1])、3-氨基-α,α-甲基-2-吡啶甲醇(CAS号[899438-57-4])；它描绘了使用Boc-单保护的乙二胺的合成，但也可应用于n为3至10的可商购的其它Boc-单保护的二胺。
制备念珠藻素化合物
对于X＝O的念珠藻素化合物可如WO2011/001052中所述制备，且对于X＝NH的念珠藻素化合物可如PCT/EP2016/076603中所述制备。
制备新型式(IV)的念珠藻素有效载荷，其中Y＝NH-CH2
●制备携带具有改善的亲水性的间隔基的新型念珠藻素有效载荷
■不具有PABA部分
步骤(i)：使用偶联试剂(例如，EDC和HOBt)进行念珠藻素衍生物和二肽的肽偶联；
步骤(ii)：在碱(例如，哌啶)的存在下，进行Fmoc胺的脱保护；
步骤(iii)：使用偶联试剂(例如，EDC和HOBt)与间隔基1进行肽偶联，或在碱(例如，DIEA)的存在下，与间隔基2进行偶联；
步骤(iv)：在催化剂(例如，四-(三苯基膦)钯)的存在下，进行烯丙基酯的脱保护；
步骤(v)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯。
或者，携带具有改善的亲水性的间隔基的新型念珠藻素有效载荷也可如方案9所描述的制备。
Figure BDA0002354666740001231
步骤(i)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化接头1的羧酸作为NHS酯，并与念珠藻素胺进行偶联。
步骤(ii)：在催化剂(例如，四-(三苯基膦)钯)的存在下，进行烯丙基酯的脱保护；
步骤(iii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯。
方案8和9描绘了使用C52的对苄胺合成有效载荷，但也可应用于其它念珠藻素化合物；它描绘了使用Val-Ala二肽的合成，但也可应用于其它二肽；它描绘了使用间隔基1或2的合成，但也可应用于间隔基3或4。
■具有PABA部分
Figure BDA0002354666740001241
步骤(i)：在偶联试剂(例如，EEDQ)存在下，进行Fmoc-Val-Ala-OH和4-氨基苄基醇的肽偶联；
步骤(ii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用氯甲酸对硝基苯基酯的处理，活化苄醇作为碳酸对硝基苯基酯；
步骤(iii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，经活化的醇和念珠藻素胺形成氨基甲酸酯，并在碱(例如，哌啶)的存在下，进行Fmoc胺的脱保护；
步骤(iv)：使用偶联试剂(例如，EDC和HOBt)与间隔基1进行肽偶联，或在碱(例如，DIEA)的存在下，与间隔基2进行偶联；
步骤(v)：在催化剂(例如，四-(三苯基膦)钯)的存在下，进行烯丙基酯的脱保护；
步骤(vi)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯。
方案10描绘了使用Val-Ala二肽的有效载荷的合成，但也可应用于其它二肽；它描绘了使用对氨基苄基醇(CAS号[623-04-1])的合成，但也可应用于可商购的其它氨基苄基醇化合物，例如，4-(1-羟基乙基)-苯胺(外消旋的(CAS号[14572-89-5])或对映体纯的(R)(CAS号[210754-25-9])或(S)(CAS号[500229-84-5]))、4-氨基-α,α-二甲基-苯甲醇(CAS号[23243-04-1])、4-氨基-α-甲氧基-α-甲基-苯甲醇(CAS号[1379318-81-6])、4-氨基-α-甲基-α-三氟甲基-苯甲醇(CAS号[851652-56-7])、2-氨基-苯甲醇(CAS号[5344-90-1])、2-氨基-α-甲基-苯甲醇(外消旋的(CAS号[10517-50-7])或对映体纯的(R)(CAS号[3205-21-8])或(S)(CAS号[3205-21-8]))、6-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[113293-71-3])、6-氨基-α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[1335054-83-5])、6-氨基-α-乙基-3-吡啶甲醇(CAS号[1355225-85-2])、6-氨基-α,α-二甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[843646-03-8])、5-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[873651-92-4])、2-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[23612-57-9])、2-氨基-α-甲基-3-吡啶甲醇(外消旋的(CAS号[869567-91-9])或对映体纯的(R)(CAS号[936718-01-3])或(S)(CAS号[936718-00-2]))、2-氨基-α-乙基-3-吡啶甲醇(CAS号[914223-90-8])、2-氨基-α,α-二甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[213666-96-7])、3-氨基-4-吡啶甲醇(CAS号[152398-05-5])、3-氨基-α-甲基-4-吡啶甲醇(CAS号[1242470-88-7])、3-氨基-α,α-甲基-4-吡啶甲醇(CAS号[13357-81-8])、4-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[138116-34-4])、4-氨基-α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[741223-49-4])、4-氨基-α,α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[1339013-26-1])、3-氨基-2-吡啶甲醇(CAS号[52378-63-9])、3-氨基-α-甲基-2-吡啶甲醇(CAS号[954240-54-1])、3-氨基-α,α-甲基-2-吡啶甲醇(CAS号[899438-57-4])；它描绘了使用C52的对苄胺的合成，但也可应用于其它念珠藻素化合物；它描绘了使用间隔基1或2的合成，但也可应用于间隔基3或4。
●制备携带具有改善的亲水性的二肽的式(IV)的新型念珠藻素有效载荷
■不具有PABA部分
Figure BDA0002354666740001261
步骤(i)：使用偶联试剂(例如，EDC和HOBt)进行念珠藻素衍生物和二肽的肽偶联，并在碱(例如，哌啶)的存在下，进行Fmoc胺的脱保护；
步骤(ii)：与戊二酸酐进行偶联；可能需要在步骤(iii)之前进行经取代的氨基酸的侧链的另一个脱保护步骤；
步骤(iii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯。
方案11描绘了使用C52的对苄胺的有效载荷的合成，但也可应用于其它念珠藻素化合物；它描绘了使用二肽1的合成，但也可应用于二肽5；它描绘了使用戊二酸酐的合成，但也可应用于n为3至10的可商购的琥珀酸酐或烷基二酸。
■具有PABA部分
Figure BDA0002354666740001271
步骤(i)：在碱(例如，DIEA)的存在下，经活化的醇和念珠藻素胺形成氨基甲酸酯，并在碱(例如，哌啶)的存在下，进行Fmoc胺的脱保护；
步骤(ii)：与戊二酸酐进行偶联；可能需要在步骤(iii)之前进行经取代的氨基酸的侧链的另一个脱保护步骤；
步骤(iii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯。
方案12描绘了使用C52的对苄胺的有效载荷的合成，但也可应用于其它念珠藻素化合物；它描绘了使用二肽6的合成，但也可应用于二肽2。
●制备携带间隔基并具有改善的亲水性的二肽的新型式(IV)的念珠藻素有效载 荷
■不具有PABA部分
Figure BDA0002354666740001291
步骤(i)：使用偶联试剂(例如，EDC和HOBt)进行念珠藻素衍生物和二肽的的肽偶联，并在碱(例如，哌啶)的存在下进行Fmoc胺的脱保护；
步骤(ii)：使用偶联试剂(例如，EDC和HOBt)与间隔基3进行肽偶联，或在碱(例如，DIEA)的存在下，与间隔基4进行偶联；
步骤(iii)：在催化剂(例如，四-(三苯基膦)钯)的存在下，进行烯丙基酯的脱保护；可能需要在步骤(iv)之前进行经取代的氨基酸的侧链的另一个脱保护步骤；
步骤(iv)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯。
方案13描绘了使用C52的对苄胺的有效载荷的合成，但也可应用于其它念珠藻素化合物；它描绘了使用二肽5的合成，但也可应用于二肽1；它描绘了使用间隔基3或4的合成，但也可应用于间隔基1或2。
■具有PABA部分
Figure BDA0002354666740001311
步骤(i)：在碱(例如，DIEA)的存在下，经活化的醇和念珠藻素胺形成氨基甲酸酯，并在碱(例如，哌啶)的存在下，进行Fmoc胺的脱保护；
步骤(ii)：使用偶联试剂(例如，EDC和HOBt)与间隔基3进行肽偶联，或在碱(例如，DIEA)的存在下，与间隔基4进行偶联；
步骤(iii)：在催化剂(例如，四-(三苯基膦)钯)的存在下，进行烯丙基酯的脱保护；可能需要在步骤(iv)之前进行经取代的氨基酸的侧链的另一个脱保护步骤；
步骤(iv)：在碱(例如DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯。
方案14描绘了使用C52的对苄胺的有效载荷的合成，但也可应用于其它念珠藻素化合物；它描绘了使用二肽6的合成，但也可应用于二肽2；它描绘了使用间隔基3或4的合成，但也可应用于间隔基1或2。
制备新型式(IV)的念珠藻素有效载荷，其中Y＝O-CH2或S-CH2
●制备携带具有改善的亲水性的间隔基的新型念珠藻素有效载荷
■不具有PABA部分
Figure BDA0002354666740001331
步骤(i)：在碱(例如，DIEA)的存在下，念珠藻素活化的醇和胺形成氨基甲酸酯；
步骤(ii)：在碱(例如，哌啶)的存在下，进行Fmoc胺的脱保护；
步骤(iii)：使用偶联试剂(例如，EDC和HOBt)与间隔基1进行肽偶联，或在碱(例如，DIEA)的存在下，与间隔基2进行偶联；
步骤(iv)：在催化剂(例如，四-(三苯基膦)钯)的存在下，进行烯丙基酯的脱保护；
步骤(v)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯。
方案15描绘了使用C52的经活化的对苄醇的有效载荷的合成，但也可应用于其它念珠藻素化合物；它描绘了使用Val-Ala二肽的合成，但也可应用于其它二肽；它描绘了使用Boc-单保护的乙二胺的合成，但也可应用于n为3至10的可商购的其它Boc-单保护的二胺；它描绘了使用间隔基1或2的合成，但也可应用于间隔基3或4。
或者，携带具有改善的亲水性的间隔基的式(IV)的新型念珠藻素有效载荷可如方案16所描述的制备。
步骤(i)：在碱(例如，DIEA)的存在下，念珠藻素活化的醇和接头2形成氨基甲酸酯；
步骤(ii)：在催化剂(例如，四-(三苯基膦)钯)的存在下，进行烯丙基酯的脱保护；
步骤(iii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯。
方案16描绘了使用C52的经活化的对苄醇的有效载荷的合成，但也可应用于其它念珠藻素化合物。
■具有PABA部分
步骤(i)：在偶联试剂(例如，EEDQ)的存在下，进行Fmoc-Val-Ala-OH和4-氨基苄基醇的肽偶联；
步骤(ii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用氯甲酸对硝基苯基酯的处理，活化苄醇作为碳酸对硝基苯基酯；
步骤(iii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，经活化的醇和Boc-单保护的乙二胺形成氨基甲酸酯；
步骤(iv)：使用HCl溶液(例如，在二噁烷中的溶液)或TFA溶液进行Boc胺的脱保护；
步骤(v)：在碱(例如，DIEA)的存在下，念珠藻素活化的醇和胺形成氨基甲酸酯，并在碱(例如，哌啶)的存在下，进行Fmoc胺的脱保护；
步骤(vi)：使用偶联试剂(例如，EDC和HOBt)与间隔基1进行肽偶联，或在碱(例如，DIEA)的存在下，与间隔基2进行偶联；
步骤(vii)：在催化剂(例如，四-(三苯基膦)钯)的存在下，进行烯丙基酯的脱保护；
步骤(viii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯。
方案17描绘了使用Val-Ala二肽的有效载荷的合成，但也可应用于其它二肽；它描绘了使用对氨基苄基醇(CAS号[623-04-1])的合成，但也可应用于可商购的其它氨基苄基醇化合物，例如，4-(1-羟基乙基)-苯胺(外消旋的(CAS号[14572-89-5])或对映体纯的(R)(CAS号[210754-25-9])或(S)(CAS号[500229-84-5]))、4-氨基-α,α-二甲基-苯-甲醇(CAS号[23243-04-1])、4-氨基-α-甲氧基-α-甲基-苯甲醇(CAS号[1379318-81-6])、4-氨基-α-甲基-α-三氟甲基-苯甲醇(CAS号[851652-56-7])、2-氨基-苯甲醇(CAS号[5344-90-1])、2-氨基-α-甲基-苯甲醇(外消旋的(CAS号[10517-50-7])或对映体纯的(R)(CAS号[3205-21-8])或(S)(CAS号[3205-21-8]))、6-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[113293-71-3])、6-氨基-α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[1335054-83-5])、6-氨基-α-乙基-3-吡啶甲醇(CAS号[1355225-85-2])、6-氨基-α,α-二甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[843646-03-8])、5-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[873651-92-4])、2-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[23612-57-9])、2-氨基-α-甲基-3-吡啶甲醇(外消旋的(CAS号[869567-91-9])或对映体纯的(R)(CAS号[936718-01-3])或(S)(CAS号[936718-00-2]))、2-氨基-α-乙基-3-吡啶甲醇(CAS号[914223-90-8])、2-氨基-α,α-二甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[213666-96-7])、3-氨基-4-吡啶甲醇(CAS号[152398-05-5])、3-氨基-α-甲基-4-吡啶甲醇(CAS号[1242470-88-7])、3-氨基-α,α-甲基-4-吡啶甲醇(CAS号[13357-81-8])、4-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[138116-34-4])、4-氨基-α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[741223-49-4])、4-氨基-α,α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[1339013-26-1])、3-氨基-2-吡啶甲醇(CAS号[52378-63-9])、3-氨基-α-甲基-2-吡啶甲醇(CAS号[954240-54-1])、3-氨基-α,α-甲基-2-吡啶甲醇(CAS号[899438-57-4])；它描绘了使用Boc-单保护的亚乙二胺的合成，但也可应用于n为3至10的可商购的其它Boc-单保护的二胺；它描绘了使用C52的经活化的对苄醇的合成，但也可应用于其它念珠藻素化合物；它描绘了使用间隔基1或2的合成，但也可应用于间隔基3或4。
●制备携带具有改善的亲水性的二肽的新型式(IV)的念珠藻素有效载荷
■不具有PABA部分
步骤(i)：在碱(例如，DIEA)的存在下，念珠藻素活化的醇和二肽形成氨基甲酸酯，并在碱(例如，哌啶)的存在下，进行Fmoc胺的脱保护；
步骤(ii)：与戊二酸酐进行偶联；可能需要在步骤(iii)之前进行经取代的氨基酸的侧链的另一个脱保护步骤
步骤(iii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯。
方案18描绘了使用C52的经活化的对苄醇的有效载荷的合成，但也可应用于其它念珠藻素化合物；它描绘了使用二肽7的合成，但也可应用于二肽3；它描绘了使用戊二酸酐的合成，但也可应用于n为3至10的可商购的琥珀酸酐或烷基二酸。
■具有PABA部分
Figure BDA0002354666740001391
步骤(i)：在碱(例如，DIEA)的存在下，念珠藻素活化的醇和二肽形成氨基甲酸酯，并在碱(例如，哌啶)的存在下，进行Fmoc胺的脱保护；
步骤(ii)：与戊二酸酐进行偶联；可能需要在步骤(iii)之前进行经取代的氨基酸的侧链的另一个脱保护步骤
步骤(iii)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯。
方案19描绘了使用C52的经活化的对苄醇的有效载荷的合成，但也可应用于其它念珠藻素化合物；它描绘了使用二肽8的合成，但也可应用于二肽4；它描绘了使用戊二酸酐的合成，但也可应用于n为3至10的可商购的琥珀酸酐或烷基二酸。
●制备携带间隔基和具有改善的亲水性的二肽的新型式(IV)的念珠藻素有效载 荷
■不具有PABA部分
Figure BDA0002354666740001401
Figure BDA0002354666740001411
步骤(i)：在碱(例如，DIEA)的存在下，念珠藻素活化的醇和二肽形成氨基甲酸酯，并在碱(例如，哌啶)的存在下，进行Fmoc胺的脱保护；
步骤(ii)：使用偶联试剂(例如，EDC和HOBt)与间隔基3进行肽偶联，或在碱(例如，DIEA)的存在下，与间隔基4进行偶联；
步骤(iii)：在催化剂(例如，四-(三苯基膦)钯)的存在下，进行烯丙基酯的脱保护；可能需要在步骤(iv)之前进行经取代的氨基酸的侧链的另一个脱保护步骤
步骤(iv)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯。
方案20描绘了使用C52的对苄胺的有效载荷的合成，但也可应用于其它念珠藻素化合物；它描绘了使用二肽7的合成，但也可应用于二肽3；它描绘了使用间隔基3或4的合成，但也可应用于间隔基1或2。
■具有PABA部分
Figure BDA0002354666740001421
步骤(i)：在碱(例如，DIEA)的存在下，念珠藻素活化的醇和二肽形成氨基甲酸酯，并在碱(例如，哌啶)的存在下，进行Fmoc胺的脱保护；
步骤(ii)：使用偶联试剂(例如，EDC和HOBt)与间隔基3进行肽偶联，或在碱(例如，DIEA)的存在下，与间隔基4进行偶联；
步骤(iii)：在催化剂(例如，四-(三苯基膦)钯)的存在下，进行烯丙基酯的脱保护；可能需要在步骤(iv)之前进行经取代的氨基酸的侧链的另一个脱保护步骤；
步骤(iv)：在碱(例如，DIEA)的存在下，通过用DSC处理，活化羧酸作为NHS酯。
方案21描绘了使用C52的对苄胺的有效载荷的合成，但也可应用于其它念珠藻素化合物；它描绘了使用二肽8的合成，但也可应用于二肽4；它描绘了使用间隔基3或4的合成，但也可应用于间隔基1或2。
制备式(V)的缀合物
本发明的式(V)的缀合物可通过包括至少以下步骤的方法获得：
(i)接触放置并使其反应：
-抗体的任选的缓冲水溶液，其任选地通过改性剂改性，
和
-如在本发明中定义的式(IV)的念珠藻素有效载荷的溶液，
式(IV)的念珠藻素有效载荷的化学基团RCG1对多肽(例如抗体)上存在的化学基团RCG2有反应性，特别是对抗体上存在的氨基基团有反应性，适当时，所述化学基团RCG2通过改性剂引入，
从而，通过形成共价键，将式(IV)的念珠藻素有效载荷连接至抗体；
(ii)然后，任选地将式(V)的步骤(i)中形成的缀合物从式(IV)的念珠藻素有效载荷和/或从未反应的抗体和/或从任何可形成的聚集物中分离。
例如，根据一种变体，在步骤(ii)中，将步骤(i)的式(V)的缀合物仅与未反应的式(IV)的念珠藻素有效载荷和所形成的任何聚集物分离，并且将任何未反应的抗体留在溶液中。
接触放置的功能是使化学基团RCG1和RCG2反应，以确保通过形成共价键将式(IV)的念珠藻素有效载荷附着于多肽(例如抗体)上；例如，
■当RCG1表示RaZa-C(＝O)时，反应可能发生在抗体的氨基官能团上，例如抗体的赖氨酸(Lys)残基的侧链所携带的ε-氨基基团即抗体重链和轻链的N-端氨基酸的α-氨基基团。这种情况下，获得以下式的缀合物：mAb-[NH-C(＝O)-L*-Y-念珠藻素]d，其中L*表示包含作为RCG1的RaZa-C(＝O)基团的接头L的片段，且d表示药物/抗体比率或DAR；
■当RCG1表示氯原子或马来酰亚氨基或卤乙酰氨基基团时，所述抗体可包含硫醇化学基团；
■当RCG1表示叠氮基基团时，所述抗体可包含C≡CH部分或经活化的三键，例如环辛炔基团；
■当RCG1表示NH2基团时，使用酶催化，反应可发生在抗体的酰胺官能团上，例如抗体的谷氨酰胺(Gln)残基的侧链所携带的酰胺基团。这种情况下，获得下式的缀合物：mAb-[C(＝O)-NH-L*-念珠藻素]d，L*表示包含作为RCG1的NH2基团的接头L的片段，从而L表示L*NH2基团且d表示药物/抗体比率或DAR；
■当RCG1表示C≡CH基团或经活化的C≡C基团(例如环辛炔部分)时，所述抗体可包含叠氮基基团。
术语“聚集物”意指可在两种或更多种抗体之间形成的缔合，所述抗体可能已被缀合修饰。在多种参数的影响下，聚集物易于形成，例如溶液中抗体的高浓度、溶液的pH、高剪切力、接枝药物的数量及其疏水性、温度(请参见在J.Membrane Sci.2008,318,311-316的导言中引用的参考文献)，但是其中某些因素的影响尚未明确阐明。对于蛋白质或抗体，可参考AAPS Journal,“Protein Aggregation and Bioprocessing”2006,8(3),E572-E579。可通过诸如SEC的已知技术来确定聚集物含量(在这方面参见AnalyticalBiochemistry1993,212(2),469-480)。
抗体的水溶液可用缓冲液(例如磷酸钾或HEPES)或缓冲液的混合物(例如后述的缓冲液A)缓冲。缓冲液取决于抗体的性质。将式(IV)的念珠藻素有效载荷溶解在极性有机溶剂(例如DMSO或DMA)中。
反应通常在20℃至40℃的温度范围内进行。反应时间可为1至24小时。抗体和式(IV)的念珠藻素有效载荷之间的反应可通过具有折射计和/或紫外检测器和/或HRMS的SEC进行监测，以确定其进展程度。若取代度不足，则反应可保留更长的时间和/或可添加念珠藻素化合物。关于特定条件的更多细节可以参考实施例部分。实施例3、6、16、19、23、26、29、32、35和41中描述了具体的实施方案。
本领域技术人员可使用各种色谱技术进行步骤(ii)的分离：可通过例如空间排阻色谱(SEC)、通过吸附色谱(例如，离子交换和IEC)、通过疏水相互作用色谱(HIC)、通过亲和色谱、通过在混合载体(例如陶瓷羟基磷灰石)上的色谱或通过HPLC提纯缀合物。也可使用通过透析或渗滤来提纯。
在步骤(i)或(ii)之后，缀合物的溶液可进行超滤和/或渗滤步骤(iii)。在这些步骤之后，由此获得水溶液形式的缀合物。
抗体
所述抗体可为选自鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体的单克隆抗体。
在一个实施方案中，抗体是一种单特异性抗体，即与一个单一靶标特异性结合的抗体。或者，它可为多特异性抗体。
在一个实施方案中，抗体是IgG抗体，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
本发明的抗体特异性结合靶标，从而将生物活性化合物作为细胞毒性化合物导向所述靶标。如本申请所用，“特异性结合”或“特异性结合于”或“结合至”等，是指抗体或其抗原结合片段与在生理条件下相对稳定的抗原形成配合物。特异性结合的特征在于，至少约1x10-8 M或更小的平衡解离常数(KD)(例如，较小的KD表示更紧密的结合)。确定两个分子是否特异性结合的方法在本领域中是公知的，并且包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。如本申请所述，抗体的特征在于，例如使用表面等离振子体共振(例如BIACORETM)时，它们与靶标和/或靶标抗原的特异性结合。
靶标通常对应于在细胞表面表达的蛋白质，例如，在肿瘤细胞表面表达的蛋白质。
在一个实施方案中，靶标为EphA2受体。EphA2受体是Ephrin受体，也称为“Eph受体A2”或“上皮细胞受体蛋白-酪氨酸激酶”。例如，与EphA2受体特异性结合的抗体可对应于WO2008/010101或WO2011/039724中描述的抗体之一。
抗体可任选地用改性剂修饰，以促进如前所述的念珠藻素有效载荷的附着。抗体尤其可为单克隆抗体、多克隆抗体或多特异性抗体。它也可为抗体片段。它还可以是鼠抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在本发明的实施例中使用的抗体是hu2H11_R3574，一种针对EphA2受体的拮抗剂抗体。hu2H11_R3574的序列由SEQ ID NO:1(抗体hu2H11_R35R74的轻链)和SEQ ID NO:2(抗体hu2H11_R35R74的重链)表示，其分别对应于WO2011039724A1中表示的SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18。
缀合物
缀合物通常包含约1至10种共价结合至抗体的念珠藻素化合物(这是接枝度或“药物/抗体比率”或“DAR”)。该数目根据抗体和念珠藻素化合物的性质以及缀合过程中使用的操作条件(例如，念珠藻素化合物相对于抗体的当量数、反应时间、溶剂和任何助溶剂的性质)而变化。将抗体和念珠藻素化合物接触放置，可形成一种混合物，该混合物包含几种缀合物，这些缀合物通过不同的DAR彼此区别开来；任选地包含未反应的抗体；任选地包含聚集体。因此，针对最终溶液确定的DAR对应于平均DAR。可根据缀合物的SEC-HRMS光谱的解卷积来计算DAR。例如，DAR(HRMS)大于0.5，例如为1至10，例如为2到7。
缀合物可用作抗癌剂。由于抗体的存在，使得缀合物对肿瘤细胞而非健康细胞具有高度选择性。这使得可在与其相似的环境中或直接在其中导入念珠藻素化合物。可治疗实体或液体癌症。缀合物可单独使用或与至少一种其它抗癌剂组合使用。
缀合物以缓冲水溶液的形式配制，其浓度通常为1至10mg/mL。该溶液本身可以灌注形式注射，或者可重新稀释以形成灌注溶液。
实施例
以下实施例描述了本发明所述的某些化合物的制备。这些实施例不是限制性的，仅是说明本发明。
使用的分析方法
高压液相色谱-质谱(LCMS)
方法A
在Waters UPLC-SQD系统上、在正和/或负电喷雾模式(ES+/-)下获得光谱。
色谱条件如下：
柱：ACQUITY BEH C18-1.7μm-2.1x 50mm；溶剂：A：H2O(0.1％甲酸)，B：CH3CN(0.1％甲酸)；柱温：50℃；流速：0.8mL/min；梯度(2.5min)：在1.8min内，由5至100％的B；2.4min：100％的B；2.45min：在0.05min内由100至5％的B。
方法B
在Waters UPLC-SQD系统上、在正和/或负电喷雾模式(ES+/-)下获得光谱。
色谱条件如下：
柱：ACQUITY BEH C18-1.7μm-2.1x 50mm；溶剂：A：H2O(0.1％甲酸)，B：CH3CN(0.1％甲酸)；柱温：50℃；流速：0.6mL/min；梯度(2min)：在1min内由5至50％的B；在0.3min内由50至100％的B；在0.15min内，100％的B；在0.3min内由100至5％的B，以及在0.25min内5％的B。
方法C
在Waters UPLC-SQD系统上、在正和/或负电喷雾模式(ES+/-)下获得光谱。
色谱条件如下：
柱：ACQUITY BEH C18-1.7μm-2.1x 50mm；溶剂：A：H2O(0.1％甲酸)，B：CH3CN(0.1％甲酸)；柱温：50℃；流速：0.8mL/min；梯度(5min)：在4.2min内由5至100％的B；4.6min：100％的B；4.8min：5％的B。
方法D
在Waters XeVo-Qtof系统上、在正电喷雾模式(ES+)下获得光谱。色谱条件如下：
柱：ACQUITY BEH C18-1.7μm-2.1x 100mm；溶剂：A：H2O(0.1％甲酸)，B：CH3CN(0.1％甲酸)；柱温：45℃；流速：0.6mL/min；梯度(5.3min)：0至0.3min，5％的B，4min：100％的B；4.6min：100％的B；5.3min：5％的B。
方法E
在Waters UPLC-SQD系统上、在正和/或负电喷雾模式下获得光谱(ES+/-)。
色谱条件如下：
柱：ACQUITY BEH C18-1.7μm-2.1x 50mm；溶剂：A：H2O(0.1％甲酸)，B：CH3CN(0.1％甲酸)；柱温：45℃；流速：0.8mL/min；梯度(10min)：
在8.6min内，由5至100％的B；9.6min：100％的B；9.8min：5％的B。
1H核磁共振(NMR)
1H NMR光谱在Bruker Avance光谱仪上获得，型号为DRX-300、DRX-400或DRX-500。化学位移(δ)以ppm给出。
排阻色谱-高分辨质谱(SEC-HRMS)
色谱分析是在Agilent HP1100仪器和Waters BEH SEC 2001.7μm(2.1x150mm)柱上于30℃，以0.5mL/min的流速和(A)25mM甲酸铵+1％甲酸/(B)CH3CN+0.1％甲酸70/30持续15分钟的等度洗脱进行的。质谱在Waters QTOF-II机器上以正模式(ES+)电喷雾电离进行。使用Waters MaxEnt1软件对质谱进行解卷积。
分析型尺寸排阻色谱(SEC)
在配有光电二极管阵列检测器和Tosoh Bioscience TSKgel G3000 SWXL5μm柱(7.8×300mm)的Waters Alliance HPLC系统或Hitachi Lachrom HPLC系统上进行测试，流速为0.5mL/min且用含有0.2M KCl、0.052M KH2PO4、0.107M K2HPO4和20％体积的异丙醇的pH 7缓冲液等度洗脱30分钟。
缓冲液
Figure BDA0002354666740001481
缓冲液A(pH 6.5)：NaCl(50mM)、磷化钾缓冲液(50mM)、EDTA(2mM)
Figure BDA0002354666740001482
缓冲液B(pH 6.5)：NaCl(140mM)、磷化钠和磷化钾(9.6mM)
DPBS(pH 7.2)：KCl(2.7mM)、NaCl(137mM)、KH2PO4(1.47mM)、Na2HPO4(8.10mM)
Figure BDA0002354666740001484
PBS(pH 7.4)：KH2PO4(1.06mM)、NaCl(155.17mM)、Na2HPO4-7H2O(2.97mM)
制备抗体-药物缀合物(ADC)的一般方法
用过量(5至10当量)的溶液(以DMA中大约10mM的念珠霉素有效载荷)处理由缓冲液A和1N HEPES的96:4混合物组成的抗体的水性缓冲溶液，使得最终抗体浓度为3mg/mL，且水性缓冲液中DMA的百分比为20％。搅拌1-4小时后，通过SEC-HRMS分析混合物以确定单体抗体群体的DAR。若发现DAR不足(<3.5-4)，则在室温、在搅拌下将混合物进一步用过量(1-5当量)的念珠霉素DMA溶液额外处理2-4小时。通过使用在含有10％至20％NMP的液体缓冲液pH 6.5(缓冲液B或DPBS)中进行预平衡的Superdex200pg基质(HiHealth 16/60或26/60脱盐柱，GEHealthcare)，或使用在含有5％至10％NMP的缓冲液pH 6.5(缓冲液B或DPBS)中预平衡的SephadexTM G25基质(Hiprep 26/10脱盐柱，GEHealthcare)凝胶过滤提纯该混合物。合并含有单体缀合抗体的级分并在Amicon Ultra-15(10k或50k Ultracel膜，Millipore)上浓缩至2至5mg/mL的浓度。然后进行缓冲液交换或在适当缓冲液中的稀释，以在最终缓冲液中配制缀合物。在进行缓冲液交换的情况下，可通过使用在最终的水性缓冲液(其组成和pH值适合每种缀合物)中预平衡的SephadexTM G25基质(NAP-5、NAP-10、NAP-25/PD-10或Hiprep 26/10脱盐柱，GEHealthcare)进行凝胶过滤来实现。最后，将缀合物通过
Figure BDA0002354666740001491
过滤单元(0.22μm
Figure BDA0002354666740001492
PVDF膜，Millipore)过滤。通过UV光谱或SEC-HPLC测定最终的缀合物，以测量缀合物浓度，通过SEC-HPLC确定单体纯度，并通过SEC-HRMS测定，从缀合物的质谱的解卷积确定DAR。
合成实施例1至3：PEG4-Val-Ala-C52苄胺、PEG4-Val-Ala-C52苄胺的NHS酯及相应 的ADC
Figure BDA0002354666740001493
Figure BDA0002354666740001501
化合物1：3-((叔丁氧基羰基)氨基)丙酸烯丙基酯
向Boc-β-Ala-OH(CAS号[3303-84-2]，2g，10.04mmol)的DMF(50mL)溶液中添加碳酸铯(6.88g，21.09mmol)和烯丙基溴(965.52μL，11.05mmol)。在室温搅拌该反应介质过夜。此时，真空浓缩该反应介质，然后用甲苯稀释，并多次真空浓缩。粗产用水(100mL)稀释并用EtOAc(3x 300mL)萃取。用盐水洗涤合并的有机相，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并经快速色谱在90g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到1.5g的化合物1(65％)。
RMN 1H(400MHz，δ以ppm计，DMSO-d6)：1.37(s，9H)；2.45(t，J＝6.9Hz，2H)；3.17(q，J＝6.9Hz，2H)；4.54(m，2H)；5.20(qd，J＝1.5and 10.6Hz，1H)；5.29(qd，J＝1.9and17.3Hz，1H)；5.91(m，1H)；6.85(宽的t，J＝6.9Hz，1H)。
化合物2：3-氨基丙酸烯丙基酯2,2,2-三氟乙酸盐
向化合物1(1.5g，6.54mmol)的DCM(30mL)溶液中添加TFA(5.09mL，65.42mmol)。在室温搅拌该反应介质过夜。此时，真空浓缩该反应介质，然后用甲苯稀释，并真空浓缩两次，得到1.6g的化合物2(定量产率)。
化合物3：3-((3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)氨基)丙酸烯丙基酯
向化合物3(1.6g，6.58mmol)的DMSO(15mL)溶液中添加DIEA(2.30mL，13.16mmol)和丙烯酸叔丁酯(973.49μL，6.58mmol)。使用微波将该反应介质在60℃加热1小时。此时，该反应介质用H2O(10mL)稀释并用EtOAc萃取。用盐水洗涤合并的有机相，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并经快速色谱在80g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到678mg的
化合物3(40％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：1.39(s,9H)；1.73(宽的m,1H)；2.29(t,J＝6.9Hz,2H)；2.44(t,J＝6.9Hz,2H)；2.68(t,J＝6.9Hz,2H)；2.73(t,J＝6.9Hz,2H)；4.53(m,2H)；5.20(qd,J＝1.5和10.6Hz,1H)；5.30(qd,J＝1.9和17.3Hz,1H)；5.91(m,1H)。
化合物4：2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-酸叔丁基酯
在氩气中，将三甘醇单甲基醚(CAS号[112-35-6],3g,17.36mmol)和钠(3.99mg,173.57μmol)在THF(9mL)中的混合物在50℃搅拌2小时，然后在室温过夜。此时，添加丙烯酸叔丁酯(3.08ml,20.83mmol)，在40℃搅拌2小时，然后在室温过夜。之后，真空浓缩该反应介质，然后用H2O稀释并用EtOAc萃取。用盐水洗涤合并的有机相，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并经快速色谱在90g的硅胶上提纯(梯度洗脱庚烷/EtOAc)，得到3.3g的化合物4(65％)。
化合物5：2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-酸
向化合物4(2.5g,8.55mmol)的DCM(30mL)溶液中添加TFA(6.65mL,85.51mmol)。在室温搅拌该反应介质过夜。此时，真空浓缩该反应介质，然后用甲苯稀释并真空浓缩3次，得到3g的化合物5(定量产率)。
化合物6：2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-酰氯
向化合物5(800mg,3.39mmol)中添加亚硫酰氯(3.68mL,50.79mmol)。该反应介质在60℃加热3小时。在冷却后，真空浓缩该反应介质，用DCM稀释并真空浓缩两次，得到870mg的化合物6(定量产率)。
化合物7：15-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)-14-氧代-2,5,8,11-四氧杂-15-氮杂十八烷-18-酸烯丙基酯
在0℃，在氩气中，向化合物3(678mg,2.63mmol)和DIEA(533.21μL,3.16mmol)的DCM(10mL)溶液中添加化合物6(738.21mg,2.90mmol)的DCM(3mL)溶液。在2小时后，该反应介质用H2O(10mL)洗涤，然后用盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并经快速色谱在40g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到410mg的化合物7(33％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：50/50构象混合物；1.39(s,4.5H)；1.40(s,4.5H)；2.39(t,J＝7.2Hz,1H)；2.47至2.60(部分遮盖的m,4H)；2.66(t,J＝7.2Hz,1H)；3.23(s,1.5H)；3.24(s,1.5H)；3.38至3.65(m,18H)；4.54(m,2H)；5.19至5.34(m,2H)；5.85至5.97(m,1H)。
化合物8：15-(3-(烯丙基氧基)-3-氧代丙基)-14-氧代-2,5,8,11-四氧杂-15-氮杂十八烷-18-酸
将化合物7(150mg,315.41μmol)的DCM(3mL)溶液和TFA(236.66μL,3.15mmol)在室温搅拌过夜。此时，真空浓缩该反应介质，用甲苯稀释，并真空浓缩3次，得到130mg的化合物8(98％)。
化合物9：15-(3-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-3-氧代丙基)-14-氧代-2,5,8,11-四氧杂-15-氮杂十八烷-18-酸烯丙基酯
向化合物8(130mg,309.92μmol)的THF(5mL)溶液中添加DIEA(104.53μL,619.83μmol)和DSC(97.21mg,371.90μmol)。在室温搅拌该反应介质过夜。此时，真空浓缩该反应介质并经快速色谱在4g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/iPrOH)，得到107mg的化合物9(67％)。
化合物10：((2S)-1-(((2S)-1-((4-((2R,3S)-3-(1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯
向(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(氨基甲基)苯基)-氧杂环丙-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮(其合成如WO2011001052，化合物77中所述，150mg，214.82μmol)的DCM溶液中添加HOBt(31.93mg,236.31μmol)、EDC(41.83μL,236.31μmol)和Fmoc-Val-Ala-OH(CAS号[150114-97-9]，79.36mg，193.34μmol)。在室温搅拌该反应介质3小时。然后添加H2O(20mL)并用DCM(2x 15mL)萃取。用盐水洗涤合并的有机相，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并经快速色谱在5g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到200mg的化合物10(85％)。
化合物11：(2S)-2-氨基-N-((2S)-1-((4-((2R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-3-甲基丁酰胺
将化合物10(200mg,183.37μmol)在DCM(10mL)和哌啶(183.39μL,1.83mmol)中的混合物在室温搅拌2小时。真空浓缩该反应介质，溶于DCM，然后添加Et2O。滤出沉淀物，用Et2O洗涤并干燥，得到180mg的粗品，其经快速色谱在10g氨基-丙基改性的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到136mg的化合物11(85％)。
化合物12：15-(3-(((2S)-1-(((2S)-1-((4-((2R,3S)-3-(1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-氧代丙基)-14-氧代-2,5,8,11-四氧杂-15-氮杂十八烷-18-酸烯丙基酯
向化合物11(60mg,69.09μmol)的THF(5mL)溶液中添加化合物9(42.82mg,82.91μmol)和DIEA(17.48μL,103.63μmol)。在室温搅拌该反应介质3小时。此时，其经真空浓缩并经快速色谱在10g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到60mg的化合物12(68％)。
RMN 1H(MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：60/40构象混合物；0.78(d,J＝7.0Hz,6H)；0.80至0.87(m,6H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.24(裂分d,J＝7.0Hz,3H)；1.30(m,1H)；1.51至1.63(m,2H)；1.75至1.83(m,1H)；1.95(m,1H)；2.26(m,1H)；2.30至2.73(m,8H)；2.95至3.05(m,3H)；3.23(s,3H)；3.31(遮盖的m,1H)；3.40至3.64(m,18H)；3.81(s,3H)；3.87(d,J＝2.1Hz,1H)；4.12至4.33(m,5H)；4.53(m,1.2H)；4.55(m,0.8H)；4.91(m,1H)；5.11(m,1H)；5.21(m,1H)；5.28(qd,J＝1.9和17.3Hz,0.6H)；5.31(qd,J＝1.9和17.3Hz,0.4H)；5.78(裂分d,J＝15.7Hz,1H)；5.85至5.95(m,1H)；6.47(ddd,J＝4.2,11.5和15.7Hz,1H)；7.05(d,J＝8.7Hz,1H)；7.17(dd,J＝2.3和8.7Hz,1H)；7.19至7.26(m,5H)；7.28(d,J＝2.3Hz,1H)；7.94(d,J＝9.2Hz,0.4H)；8.04(m,1H)；8.10(d,J＝7.6Hz,0.6H)；8.32(m,1H)；8.35(d,J＝8.2Hz,1H)。
实施例1：15-(3-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-氧代丙基)-14-氧代-2,5,8,11-四氧杂-15-氮杂十八烷-18-酸
在氩气中，向化合物12(60mg,47.25μmol)的DCM(5mL)溶液中添加四(三苯基膦)钯(0)(2.76mg,2.36μmol)和1,3-二甲基巴比妥酸(22.58mg,141.74μmol)。在室温搅拌该反应介质1小时，并真空浓缩。粗产物经快速色谱在4g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到31mg的实施例1(53％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：0.79(d,J＝7.0Hz,6H)；0.80至0.88(m,6H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.23(m,3H)；1.31(m,1H)；1.51至1.62(m,2H)；1.80(m,1H)；1.95(m,1H)；2.27(m,1H)；2.35至2.60(部分遮盖的m,6H)；2.62至2.73(m,2H)；2.93至3.06(m,3H)；3.23(s,3H)；3.28至3.35(遮盖的m,1H)；3.36至3.65(m,18H)；3.81(s,3H)；3.87(d,J＝2.0Hz,1H)；4.11至4.34(m,5H)；4.91(m,1H)；5.10(m,1H)；5.79(d,J＝15.5Hz,1H)；6.48(ddd,J＝3.8,11.3和15.5Hz,1H)；7.05(d,J＝8.7Hz,1H)；7.17(dd,J＝2.0和8.7Hz,1H)；7.24(m,5H)；7.29(d,J＝2.0Hz,1H)；7.95至8.18(m,2H)；8.30至8.46(m,2H)；12.27(宽的m,1H)。LCMS(A)：ES m/z＝615[M+2H]2+；m/z＝1227[M-H]-；m/z＝1229[M+H]+；tR＝1.26min。
实施例2：15-(3-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-氧代丙基)-14-氧代-2,5,8,11-四氧杂-15-氮杂十八烷-18-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
向实施例1(30mg,24.39μmol)的THF(5mL)溶液中添加DSC(7.65mg,29.27μmol)和DIEA(9.88μL,58.54μmol)。在室温搅拌该反应介质过夜，然后真空浓缩并经快速色谱在5g二醇改性的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/iPrOH)，得到17mg的实施例2(53％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：70/30构象混合物；0.79(d,J＝7.0Hz,6H)；0.80至0.87(m,6H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.21至1.34(m,4H)；1.51至1.62(m,2H)；1.80(m,1H)；1.93(m,1H)；2.27(m,1H)；2.35至2.72(部分遮盖的m,6H)；2.81(s大,4H)；2.88至3.06(m,5H)；3.23(s,3H)；3.28至3.37(遮盖的m,1H)；3.40至3.79(m,18H)；3.81(s,3H)；3.88(s,1H)；4.13至4.33(m,5H)；4.90(m,1H)；5.10(m,1H)；5.79(d,J＝15.5Hz,1H)；6.46(ddd,J＝3.8,11.5和15.5Hz,1H)；7.05(d,J＝8.7Hz,1H)；7,17(宽的s,1H)；7,24(m,5H)；7,29(宽的s,1H)；7,94(d,J＝8.8Hz,0.3H)；8.06(m,1H)；8.12(d,J＝8.1Hz,0.7H)；8.32(m,1H)；8.36(d,J＝8.1Hz,1H)。LCMS(A)：ES m/z＝663.5[M+2H]2+；m/z＝1324[M-H]-；m/z＝1326[M+H]+；m/z＝1374[M-H+HCO2H]-；tR＝1.3min。
实施例3：hu2H11_R35-74-Ex2
使用前述的一般方法制备实施例3。将15mg hu2H11_R35-74与55.2μL9.1mM实施例2的DMA溶液(10当量)反应3小时30分钟。在缓冲液B pH6.5+10％NMP中于Superdex 200pg上提纯后，在Amicon Ultra-15上浓缩，在缓冲液B pH 6.5+5％NMP中在Nap-10上进行缓冲交换，并在0.22μm PVDF过滤器上过滤，得到3.36mg的实施例3，其为无色澄清溶液，浓度为2.24mg/mL，DAR为3.4(HRMS)，单体纯度为99.8％，总产率为22％。
SEC-HRMS:m/z＝149354(裸mAb)；m/z＝150563(D1)；m/z＝151774(D2)；m/z＝152966(D3)；m/z＝154169(D4)；m/z＝155410(D5)；m/z＝156623(D6)；m/z＝157835(D7)；m/z＝159051(D8)。
合成实施例4至6：磺基-Val-Ala-C52苄胺、磺基-Val-Ala-C52苄胺的NHS酯及相应 的ADC
Figure BDA0002354666740001561
Figure BDA0002354666740001571
化合物13：4-((3-(烯丙基氧基)-3-氧代丙基)(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)氨基)-4-氧代丁酸
将化合物3(958mg,3.72mmol)的DCM(5mL)溶液和琥珀酸酐(752.65mg,7.45mmol)在室温搅拌3小时。真空浓缩该反应介质并经快速色谱在24g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到1.3g的化合物13(98％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：50/50构象混合物；1.39(s,4.5H)；1.40(s,4.5H)；2.33至2.43(m,3H)；2.45至2.55(部分遮盖的m,4H)；2.69(t,J＝7.5Hz,1H)；3.40(t,J＝7.5Hz,1H)；3.45(t,J＝7.5Hz,1H)；3.53(t,J＝7.5Hz,1H)；3.59(t,J＝7.5Hz,1H)；4.53(m,1H)；4.59(m,1H)；5.19至5.35(m,2H)；5.91(m,1H)；12.06(宽的m,1H)。
化合物14：2-(4-((3-(烯丙基氧基)-3-氧代丙基)(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)氨基)-4-氧代丁酰氨基)乙磺酸
将化合物13(1.3g,3.64mmol)在THF(12mL)和DSC(1.14g,4.36mmol)及DIEA(1.84mL,10.91mmol)中的混合物在室温搅拌5小时。在此时间后，添加牛磺酸(718.75mg,5.46mmol)的水(9mL)溶液，并在室温搅拌该介质过夜。此时，添加DSC(1.14g,4.36mmol)和DIEA(1.84mL,10.91mmol)，并在室温搅拌该介质过夜。此时，添加牛磺酸(2.4g,18.2mmol)的水(5mL)溶液，并在室温搅拌该反应介质1小时，然后浓缩，并经快速色谱在70g的C18-接枝的硅胶上提纯(梯度洗脱CH3CN/H2O)，得到1.28g的化合物14(76％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：50/50构象混合物；1.39(s,4.5H)；1.40(s,4.5H)；2.26(t,J＝7.2Hz,2H)；2.38(t,J＝7.5Hz,1H)；2.47至2.55(部分遮盖的m,6H)；2.69(t,J＝7.5Hz,1H)；3.28(m,2H)；3.40(t,J＝7.5Hz,1H)；3.44(t,J＝7.5Hz,1H)；3.52(t,J＝7.5Hz,1H)；3.58(t,J＝7.5Hz,1H)；4.53(m,1H)；4.58(m,1H)；5.19至5.35(m,2H)；5.91(m,1H)；7.70(t大,J＝6.5Hz,1H)。
化合物15：3-(N-(3-(烯丙基氧基)-3-氧代丙基)-4-氧代-4-((2-磺酸基乙基)-氨基)丁酰氨基)丙酸
将化合物14(300mg,645.81μmol)在DCM(5mL)和TFA(484.57μL,6.46mmol)中的溶液在室温搅拌过夜。此时，添加TFA(250μL)。搅拌该反应介质数小时，并真空浓缩，然后用甲苯稀释，并真空浓缩两次，得到260mg的化合物15(99％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：50/50构象混合物；2.27(t,J＝7.2Hz,2H)；2.40(t,J＝7.6Hz,1H)；2.48至2.56(部分遮盖的m,6H)；2.68(t,J＝7.6Hz,1H)；3.28(m,2H)；3.40(t,J＝7.6Hz,1H)；3.46(t,J＝7.6Hz,1H)；3.50(t,J＝7.6Hz,1H)；3.59(t,J＝7.6Hz,1H)；4.54(m,1H)；4.57(m,1H)；5.18至5.35(m,2H)；5.91(m,1H)；7.65(宽的t,J＝6.5Hz,1H)。LCMS(D)：ES m/z＝409[M+H]+；tR＝1.49min。
化合物16：(4S,7S)-12-(3-(烯丙基氧基)-3-氧代丙基)-1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苯基)-7-异丙基-4-甲基-3,6,9,13,16-五氧代-2,5,8,12,17-五氮杂十九烷-19-磺酸
在氩气中，向化合物15(28.22mg,69.09μmol)的DMF(3mL)溶液中添加DIEA(23.30μL,138.18μmol)、HOBt(9.72mg,69.09μmol)、EDC(12.49μL,69.09μmol)及化合物11(60mg,69.09μmol)的DMF(2mL)溶液。在室温搅拌该反应介质过夜。为了完成反应，添加化合物15(28.22mg,69.09μmol)、DIEA(23.30μL,138.18μmol)、HOBt(9.72mg,69.09μmol)、EDC(12.49μL,69.09μmol)并在室温搅拌该反应介质1天。此时，真空浓缩该反应介质并经快速色谱在70g的C18-接枝的硅胶上提纯(梯度洗脱CH3CN/H2O)，得到24mg的化合物16(24％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：60/40构象混合物；0.79(d,J＝7.0Hz,6H)；0.80至0.87(m,6H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.23(d,J＝7.0Hz,3H)；1.30(m,1H)；1.52至1.63(m,2H)；1.80(m,1H)；1.95(m,1H)；2.27(m,3H)；2.34至2.58(部分遮盖的m,6H)；2.63至2.73(m,2H)；2.93至3.03(m,3H)；3.25至3.59(部分遮盖的m,9H)；3.81(s,3H)；3.88(d,J＝1.4Hz,1H)；4.10至4.33(m,5H)；4.53(m,1.2H)；4.56(m,0,8H)；4.91(m,1H)；5.10(m,1H)；5.20(m,1H)；5.29(qd,J＝1.8和17.3Hz,0.6H)；5.31(qd,J＝1.8和17.3Hz,0.4H)；5.79(dd,J＝1.8和15.4Hz,1H)；5.90(m,1H)；6.47(ddd,J＝3.8,11.8和15.4Hz,1H)；7.05(d,J＝8.7Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.4和8.7Hz,1H)；7.24(m,5H)；7.29(d,J＝2.4Hz,1H)；7.69(t,J＝5.8Hz,1H)；7.97(d,J＝8.8Hz,0.4H)；8.04(d,J＝7.7Hz,0.4H)；8.07(d,J＝8.8Hz,0.6H)；8.11(d,J＝7.7Hz,0.6H)；8.31(t,J＝6.3Hz,1H)；8.38(d,J＝8.3Hz,1H)；11.83(宽的m,1H)。LCMS(D)：ES m/z＝1256[M-H]-；tR＝2.58min。
实施例4：(4S,7S)-1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苯基)-7-异丙基-4-甲基-3,6,9-三氧代-12-(4-氧代-4-((2-磺酸基乙基)氨基)丁酰基)-2,5,8,12-四氮杂十五烷-15-酸
在氩气中，向化合物16(24mg,19.06μmol)的CH3CN(2mL)溶液中添加DMF(0.5mL)、1,3-二甲基巴比妥酸(9.11mg,57.19μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(1.11mg,0.953μmol)。在室温搅拌该反应介质1小时，然后真空浓缩并经快速色谱在10g的C18-接枝的硅胶上提纯(梯度洗脱CH3CN/H2O)，得到16mg的实施例4(70％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：60/40构象混合物；0.79(d,J＝7.0Hz,6H)；0.80至0.86(m,6H)；0.99(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.24(d,J＝7.0Hz,3H)；1.31(m,1H)；1.52至1.62(m,2H)；1.80(m,1H)；1.95(m,1H)；2.21至2.31(m,3H)；2.34至2.59(部分遮盖的m,8H)；2.62至2.75(m,2H)；2.94至3.05(m,3H)；3.25至3.58(部分遮盖的m,7H)；3.81(s,3H)；3.88(d,J＝1.9Hz,1H)；4.09至4.33(m,5H)；4.90(m,1H)；5.10(m,1H)；5.79(d,J＝15.5Hz,1H)；6.47(ddd,J＝4.0,11.4和15.5Hz,1H)；7.05(d,J＝8.7Hz,1H)；7.17(dd,J＝2.2和8.7Hz,1H)；7.21至7.26(m,5H)；7.29(d,J＝2.2Hz,1H)；7.69(m,1H)；7.97(d,J＝9.0Hz,0.4H)；8.04(d,J＝7.7Hz,0.4H)；8.08(d,J＝9.0Hz,0.6H)；8.12(d,J＝7.7Hz,0.6H)；8.31(t,J＝6.5Hz,1H)；8.38(d,J＝8.2Hz,1H)；12.2(宽的m,1H)。LCMS(A)：ESm/z＝609.5[M+2H]2+；m/z＝1216[M-H]-；m/z＝1218[M+H]+；tR＝1.72min。
实施例5：(4S,7S)-1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苯基)-12-(3-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-3-氧代丙基)-7-异丙基-4-甲基-3,6,9,13,16-五氧代-2,5,8,12,17-五氮杂十九烷-19-磺酸
在氩气中，将实施例4(16mg,13.13μmol)在DMF(1mL)、DSC(4.12mg,15.75μmol)和DIEA(2.66μL,15.75μmol)中的混合物在室温搅拌过夜。此时，真空浓缩该反应介质并经快速色谱在5g的C18-接枝的硅胶上提纯(梯度洗脱CH3CN/H2O)，得到12.5mg实施例5(73％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：60/40构象混合物；0.79(d,J＝7,0Hz,6H)；0.80至0.86(m,6H)；0.99(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.23(d,J＝7.0Hz,3H)；1.31(m,1H)；1.51至1.62(m,2H)；1.80(m,1H)；1.93(m,1H)；2.21至2.31(m,3H)；2.35至2.59(部分遮盖的m,6H)；2.62至2.74(m,2H)；2.81(宽的s,4H)；2.85至3.05(m,4H)；3.20至3.68(部分遮盖的m,8H)；3.81(s,3H)；3.88(d,J＝1.9Hz,1H)；4.10至4.33(m,5H)；4.90(m,1H)；5.10(m,1H)；5.79(d,J＝15.5Hz,1H)；6.46(ddd,J＝4.0,11.4和15.5Hz,1H)；7.05(d,J＝8.7Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.2和8.7Hz,1H)；7.21至7.26(m,5H)；7.29(d,J＝2.2Hz,1H)；7.69(m,1H)；7.97(d,J＝9.0Hz,0.4H)；8.05(d,J＝7.7Hz,0.4H)；8.08(d,J＝9.0Hz,0.6H)；8.12(d,J＝7.7Hz,0.6H)；8.31(t,J＝6.5Hz,1H)；8.38(d,J＝8.2Hz,1H)。LCMS(A)：ES m/z＝658[M+2H]2+；m/z＝1313[M-H]-；m/z＝1315[M+H]+；tR＝1.82min。
实施例6：hu2H11_R35-74-Ex5
使用前述的一般方法制备实施例6。15mg的hu2H11_R35-74与42μL的10mM实施例5在DMA(4当量)中的溶液反应1小时20分钟，然后依次添加42μL的10mM实施例5在DMA(4当量)中的溶液，持续1小时20分钟；添加53μL的10mM实施例5在DMA(5当量)中的溶液，持续1小时30分钟；最后添加42μL的10mM实施例5在DMA(4当量)中的溶液，持续1小时。在Superdex200pg上、在缓冲液B pH 6.5+20％NMP中提纯后，在Amicon Ultra-15上浓缩，在PD-10上、缓冲液B pH 6.5+5％NMP中缓冲交换，并在0.22μm PVDF过滤器上过滤，获得3.33mg的实施例6，其为无色澄清溶液，浓度为1.33mg/mL，DAR为4.05(HRMS)，单体纯度为99％且总产率为22％。
SEC-HRMS:m/z＝150568(D1)；m/z＝151768(D2)；m/z＝152971(D3)；m/z＝154172(D4)；m/z＝155375(D5)；m/z＝156574(D6)；m/z＝157944(D7)；m/z＝158984(D8)。
合成实施例7：磺基-Val-Ala-氮杂-念珠藻素苄胺
Figure BDA0002354666740001621
化合物17：L-缬氨酰基-L-丙氨酸叔丁基酯
在氩气中，向Fmoc-Val-OH(CAS号[68858-20-8],3g,8.66mmol)的DCM(60mL)溶液中添加EDC(2.02g,12.99mmol)、HOBt(1.46g,10.40mmol)和L-丙氨酸叔丁基酯盐酸盐(CAS号[13404-22-3],1.61g,8.66mmol)。在室温搅拌该反应介质1天，用H2O(30mL)淬灭并用DCM(3x 30mL)萃取。用盐水洗涤合并的有机相，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，得到5g Fmoc-保护的二肽，其为白色固体(定量产率)。向该中间体(5g,8.66mmol)的DCM(50mL)溶液中添加哌啶(8.64mL,86.63mmol)。在室温搅拌该反应介质1小时，并真空浓缩。粗产物用Et2O稀释并过滤，得到1.77g的固体，其进一步经两次连续的快速色谱在120和50g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到500mg的化合物17，其为白色固体(24％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：0.79(d,J＝6.9Hz,3H)；0.89(d,J＝6.9Hz,3H)；1.24(d,J＝7.3Hz,3H)；1.40(s,9H)；1.62(宽的s,2H)；1.86(m,1H)；2.95(d,J＝5.2Hz,1H)；4.15(m,1H)；8.09(宽的d,J＝7.3Hz,1H)。
化合物18：(5S,8S)-13-(3-(烯丙基氧基)-3-氧代丙基)-8-异丙基-2,2,5-三甲基-4,7,10,14,17-五氧代-3-氧杂-6,9,13,18-四氮杂二十碳烷-20-磺酸
在氩气中，向化合物15(250mg,612.1μmol)的DMF(6mL)溶液中添加DIEA(309.7μL,1.84mmol)和DSC(163.34mg,612.1μmol)。在室温搅拌该反应介质1小时，然后添加在DMF(1mL)中的化合物17(149.56mg,612.1μL)。在室温搅拌该反应介质2小时，并经反相色谱在5μm C1830x 100mm柱上提纯(梯度洗脱MeCN+0.07％TFA/H2O+0.07％TFA)，得到215mg的化合物18，其为白色泡沫(55％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：60/40构象混合物；0.84(d,J＝6.9Hz 3H)；0.87(d,J＝6.9Hz,3H)；1.12(d,J＝7.3Hz,3H)；1.39(s,9H)；1.92(m,1H)；2.20至2.70(部分遮盖的m,10H)；3.28(m,2H)；3.34至3.60(m,4H)；4.10(m,1H)；4.20(m,1H)；4.53(td,J＝1.6和5.5Hz,1.2H)；4.57(td,J＝1.6和5.5Hz,0.8H)；5.20(m,1H)；5.30(m,1H)；5.90(m,1H)；7.69(宽的t,J＝6.4Hz,1H)；7.91(d,J＝9.6Hz,0.4H)；8.04(d,J＝9.6Hz,0.6H)；8.23(d,J＝7.2Hz,0.4H)；8.30(d,J＝7.2Hz,0.6H)。
化合物19：(3-(N-(3-(烯丙基氧基)-3-氧代丙基)-4-氧代-4-((2-磺酸基乙基)氨基)-丁酰氨基)-丙酰基)-L-缬氨酰基-L-丙氨酸
向化合物18(215mg,338.72μmol)的DCM(5mL)溶液中添加TFA(508.3μL,6.77mmol)。在室温搅拌该反应介质1天，真空浓缩并与甲苯共蒸发(3x)，得到200mg的化合物19，其为白色泡沫(定量产率)。
化合物20：(4S,7S)-12-(3-(烯丙基氧基)-3-氧代丙基)-1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苯基)-7-异丙基-4-甲基-3,6,9,13,16-五氧代-2,5,8,12,17-五氮杂十九烷-19-磺酸
向化合物19(200mg,345.6μmol)的DMF(9mL)溶液中添加DSC(108mg,413.2μmol)和DIEA(200μL,1.185mmol)。在室温搅拌该反应介质6小时，然后添加DSC(108mg,413.2μmol)和DIEA(200μL,1.185mmol)。在室温搅拌该反应介质过夜，然后添加DSC(50mg,191.3μmol)和DIEA(100μL,592.5μmol)并在室温持续搅拌1小时。向3mL的活化的酯溶液添加(3S,7S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(氨基甲基)苯基)氧杂环丙-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环-十六烷-13-烯-2,5,9,12-四酮(其可如PCT/EP2016/076603中所述从(3S)-3-氨基-2,2-二甲基丁酸甲基酯开始制备，[MFCD09256689],70mg,96.51μmol)、EDC(17μL,77.8μmol)和HOBt(19mg,124μmol)。在室温搅拌该反应介质1小时，真空浓缩并经快速色谱在10g的C18-改性的硅胶上提纯(梯度洗脱MeCN/H2O)，得到30mg的化合物20，其为白色粘油(lacquer)(24％)。
RMN 1H(600MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：0.79至0.90(m,15H)；0.98(m,3H)；1.00(s,3H)；1.03(d,J＝7.3Hz,3H)；1.19(s,3H)；1.24(裂分d,J＝7.0Hz,3H)；1.34(d,J＝14.1Hz,1H)；1.81(m,1H)；1.91(m,1H)；1.98(dd,J＝9.3和14.1Hz,1H)；2.25(m,3H)；2.38(m,1H)；2.50(部分遮盖的m,5H)；2.60(m,1H)；2.68(m,1H)；2.91(m,1H)；2.96(m,2H)；3.25至3.58(部分遮盖的m,9H)；3.80(s,3H)；3.91(m,1H)；4.00至4.35(m,6H)；4.53(m,2H)；5.03(m,1H)；5.20(m,1H)；5.30(m,1H)；5.89(d,J＝16.1Hz,1H)；5.91(m,1H)；6.44(ddd,J＝5.0,10.5和16.1Hz,1H)；7.03(d,J＝8.7Hz,1H)；7.19至7.28(m,5H)；7.31(s,1H)；7.69(m,1H)；7.86(d,J＝8.2Hz,1H)；7.91(m,1H)；7.95至8.17(m,2H)；8.32(m,1H)；8.39(m,1H)。LCMS(A)：ES m/z＝1283[M-H]-；m/z＝1285[M+H]+；m/z＝1307[M+Na]+；tR＝1.93min。
实施例7：(4S,7S)-1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)-氧杂环丙-2-基)苯基)-7-异丙基-4-甲基-3,6,9-三氧代-12-(4-氧代-4-((2-磺酸基乙基)氨基)丁酰基)-2,5,8,12-四氮杂十五烷-15-酸
在氩气中，向化合物20(30mg,23.33μmol)的DCM(2mL)和DMF(0.3mL)溶液中添加四(三苯基膦)钯(0)(1.38mg,1.17μmol)和1,3-二甲基-巴比妥酸(11.15mg,69.99μmol)。在室温搅拌该反应介质1小时并经反相色谱在1g的C18-改性的硅胶上提纯(梯度洗脱MeCN/H2O)，得到15mg的白色粉末，其进一步在硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到7mg的实施例7，其为白色粘油(24％)。
合成实施例8和9：PEG4-Val-Ala-PABA-C52苄胺和PEG4-Val-Ala-PABA-C52苄胺的 NHS酯
Figure BDA0002354666740001661
化合物21：((S)-1-(((S)-1-((4-(羟基甲基)苯基)-氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯
向Fmoc-Val-Ala-OH(CAS号[150114-97-9],1g,2.44mmol)的DCM(30mL)和MeOH(15mL)溶液中添加4-氨基苄基醇(612mg,4.87mmol)和EEDQ(1.22g,4.87mmol)。在室温搅拌该反应介质24小时，然后添加额外的4-氨基苄基醇(612mg,4.87mmol)和EEDQ(1.22g,4.87mmol)并持续搅拌2小时。然后真空浓缩该反应介质；将Et2O添加至粗产物中，将混合物搅拌并过滤，得到棕色固体，其在Et2O中稀释并将混合物在室温搅拌过夜。然后过滤并干燥沉淀物，得到1.3g的化合物21，其为棕色固体(定量产率)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：0.86(d,J＝7.0Hz,3H)；0.89(d,J＝7.0Hz,3H)；1.30(d,J＝7.0Hz,3H)；2.00(m,1H)；3.91(m,1H)；4.19至4.34(m,4H)；4.43(d,J＝5.7Hz,2H)；5.08(t,J＝5.7Hz,1H)；7.23(d,J＝7.9Hz,2H)；7.31(t,J＝7.9Hz,2H)；7.40(m,3H)；7.53(d,J＝9.1Hz,2H)；7.73(t,J＝8.6Hz,2H)；7.89(d,J＝7.9Hz,2H)；8.16(d,J＝7.3Hz,1H)；9.91(s,1H)。LCMS(A)：ES m/z＝292；m/z＝393；m/z＝516[M+H]+；tR＝1.21min。
化合物22：((S)-3-甲基-1-(((S)-1-((4-((((4-硝基苯氧基)羰基)-氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯
在氩气中，向化合物21(1.3g,2.52mmol)的DMF(10mL)溶液中添加DIEA(2.55mL,15.13mmol)，在0℃冷却该溶液，然后添加氯甲酸4-硝基苯基酯(1.57g,7.56mmol)。在室温搅拌该反应介质2小时。添加20mL的H2O且该介质用EtOAc(10mL)萃取2次。用盐水洗涤合并的有机相，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并经快速色谱提纯在120g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到600mg的化合物22，其为固体(35％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：0.86(d,J＝7.0Hz,3H)；0.89(d,J＝7.0Hz,3H)；1.31(d,J＝7.0Hz,3H)；1.99(m,1H)；3.91(m,1H)；4.18至4.35(m,3H)；4.43(m,1H)；5.24(s,2H)；7.31(t,J＝7.9Hz,2H)；7.35至7.44(m,5H)；7.56(d,J＝9.1Hz,2H)；7.63(d,J＝8.6Hz,2H)；7.74(m,2H)；7.88(d,J＝7.9Hz,2H)；8.19(d,J＝7.3Hz,1H)；8.31(d,J＝9.1Hz,2H)；10.07(s,1H)。
化合物23：4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基酯
在氩气中，向(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(氨基甲基)苯基)氧杂环丙-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六烷-13-烯-2,5,9,12-四酮(其合成如WO2011001052,化合物77中所述,100mg,143.2μmol)的THF(5mL)溶液中添加化合物22(117mg,171.9μmol)和DIEA(60.4μL,358μmol)。在室温搅拌该反应介质在氩气中过夜。然后添加哌啶(142.9μL,1.43mmol)，且将该反应介质在室温搅拌1小时。真空浓缩后，该粗介质经快速色谱在5g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到100mg的化合物23，其为白色固体(73％)。
化合物24：15-(3-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环-十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)氧基)-甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-氧代丙基)-14-氧代-2,5,8,11-四氧杂-15-氮杂十八烷-18-酸烯丙基酯
在氩气中，向化合物23(100mg,98.3μmol)的THF(5mL)溶液中添加化合物9(50.8mg,98.3μmol)和DIEA(24.9μL,147.4μmol)。在室温搅拌该反应介质1小时，真空浓缩并经快速色谱在5g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到128mg的化合物24，其为白色固体(91％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：60:40构象混合物；0.78(d,J＝6.8Hz,6H)；0.82(d,J＝7.0Hz,1.8H)；0.84(d,J＝7.0Hz,1.2H)；0.86(d,J＝7.0Hz,1.8H)；0.88(d,J＝7.0Hz,1.2H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.30(m,4H)；1.57(m,2H)；1.80(m,1H)；1.95(m,1H)；2.26(m,1H)；2.40(m,2H)；2.52至2.72(m,6H)；2.95至3.04(m,3H)；3.22(s,3H)；3.30(m,1H)；3.38至3.63(m,18H)；3.80(s,3H)；3.87(d,J＝2.3Hz,1H)；4.15至4.28(m,4H)；4.40(m,1H)；4.51至4.57(m,2H)；4.90(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；4.98(s,2H)；5.10(m,1H)；5.20(m,1H)；5.30(m,1H)；5.80(d,J＝16.0Hz,1H)；5.91(m,1H)；6.47(ddd,J＝4.7,10.5和16.0Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.5和8.6Hz,1H)；7.29至7.32(m,8H)；7.58(m,2H)；7.76(t,J＝6.5Hz,1H)；7.92(d,J＝9.0Hz,0.4H)；8.04(d,J＝9.0Hz,0.6H)；8.15(d,J＝7.0Hz,0.4H)；8.21(d,J＝7.0Hz,0.6H)；8.32(d,J＝8.0Hz,1H)；9.88(s,0.4H)；9.93(s,0.6H)。LCMS(A)：ES m/z＝677；m/z＝1418[M+H]+；m/z＝1462[M-H+HCO2H]-；tR＝1.21min。
实施例8：15-(3-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-氧代丙基)-14-氧代-2,5,8,11-四氧杂-15-氮杂十八烷-18-酸
在氩气中，向化合物24(58mg,40.9μmol)的DCM(20mL)溶液中添加1,3-二甲基嘧啶-2,4,6(1H,3H,5H)-三酮(19.5mg,122.6μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(2.4mg,2.0μmol)。在室温搅拌该反应介质3小时，真空浓缩并经快速色谱在5g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到53mg的实施例8，其为白色固体(94％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：构象混合物；0.78(d,J＝6.8Hz,6H)；0.86(m,6H)；0.99(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.30(m,1H)；1.38(m,3H)；1.57(m,2H)；1.79(m,1H)；2.04(m,1H)；2.10至2.59(部分遮盖的m,7H)；2.69(m,2H)；2.93至3.03(m,3H)；3.22(s,3H)；3.30(遮盖的m,1H)；3.40至3.64(m,18H)；3.80(s,3H)；3.87(d,J＝2.3Hz,1H)；4.05至4.27(m,4H)；4.36(m,1H)；4.90(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；4,97(s,2H)；5.10(m,1H)；5.80(d,J＝16.0Hz,1H)；5.90(ddd,J＝4.7,10.5和16.0Hz,1H)；6.46(ddd,J＝4.7,10.5和16.0Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.5和8.6Hz,1H)；7.20至7.32(m,8H)；7.68(m,2H)；7.82(m,1H)；8.40至8.65(m,2H)；9.21(m,1H)；10.20(s,1H)。LCMS(A)：ES m/z＝637；m/z＝1376[M-H]-；m/z＝1378[M+H]+；tR＝1.3min。
实施例9：15-(3-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-氧代丙基)-14-氧代-2,5,8,11-四氧杂-15-氮杂十八烷-18-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
在氩气中，向实施例8(49mg,35.5μmol)的DMF(2mL)溶液中添加DSC(13.9mg,53.3μmol)和DIEA(9.0μL,53.3μmol)。在室温搅拌该反应介质过夜。添加额外的DSC(13.9mg,53.3μmol)和DIEA(9.0μL,53.3μmol)并持续搅拌8小时。真空浓缩该反应介质并经快速色谱在10g的二醇改性的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/iPrOH)，得到20mg的实施例9，其为白色固体(38％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：70:30构象混合物；0.78(d,J＝6.8Hz,6H)；0.,82(d,J＝7.0Hz,2.1H)；0.84(d,J＝7.0Hz,0.9H)；0.86(d,J＝7.0Hz,2.1H)；0.88(d,J＝7.0Hz,0.9H)；1.00(s,3H)；1.05(d,J＝7.0Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.27(m,1H)；1.30(m,3H)；1.57(m,2H)；1.80(m,1H)；1.95(m,1H)；2.25(m,1H)；2.40(m,1H)；2.52至2.75(m,7H)；2.80(s,4H)；2.87至3.08(m,3H)；3.22(s,3H)；3.32(遮盖的m,1H)；3.40至3.68(m,18H)；3.80(s,3H)；3.88(d,J＝2.3Hz,1H)；4.16至4.28(m,4H)；4.38(m,1H)；4.90(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；4.97(s,2H)；5.10(m,1H)；5.79(d,J＝16.0Hz,1H)；6.46(ddd,J＝4.7,10.5和16.0Hz,1H)；7,05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.5和8.6Hz,1H)；7.20至7.31(m,8H)；7.58(m,2H)；7.78(t,J＝6.0Hz,1H)；7.94(d,J＝9.0Hz,0.3H)；8.08(d,J＝9.0Hz,0.7H)；8.19(d,J＝7.0Hz,0.3H)；8.25(d,J＝7.0Hz,0.7H)；8.35(d,J＝8.0Hz,1H)；9.90(s,0.3H)；9.95(s,0.7H)。LCMS(A)：ES m/z＝698；m/z＝1475[M+H]+；tR＝1.35min。
合成实施例10：PEG7-Val-Ala-PABA-C52苄胺
Figure BDA0002354666740001711
化合物25：2,5,8,11,14,17,20-六氧杂二十三烷-23-酸叔丁基酯
在氩气中，向六乙二醇单甲基醚(926.0μL,3.24mmol)的THF(3mL)溶液中添加Na(0.7mg,32.4μmol)。在室温搅拌该反应介质1小时直至Na完全溶解，然后添加丙烯酸叔丁酯(570μL,3.89mmol)并在室温持续搅拌过夜。然后真空浓缩该反应介质，用H2O稀释，并用EtOAc萃取(3x)。用盐水洗涤合并的有机相，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩，得到1.04g的化合物25，其为无色油状物(76％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：1.40(s,9H)；2.40(t,J＝6.4Hz,2H)；3.23(s,3H)；3.43(m,2H)；3.47至3.54(m,22H)；3；59(t,J＝6.4Hz,2H)。
化合物26：2,5,8,11,14,17,20-六氧杂二十三烷-23-酸
向化合物25(1.04g,2.45mmol)的DCM(15mL)溶液中添加TFA(1.84mL,24.5mmol)。在室温搅拌该反应介质过夜，真空浓缩，用DCM稀释并与甲苯共蒸发(3x)，得到1g的化合物26，其为无色油状物(定量产率)。
化合物27：2,5,8,11,14,17,20-六氧杂二十三烷-23-酰氯
向化合物26(400mg,1.09mmol)中添加MsCl(1.27mL,16.3mmol)；将该反应介质在60℃加热3小时，真空浓缩，用DCM稀释，并真空浓缩(3x)，得到420mg的化合物27，其为无色油状物(定量产率)。
化合物28：24-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)-23-氧代-2,5,8,11,14,17,20-七氧杂-24-氮杂二十七烷-27-酸烯丙基酯
向化合物3(200mg,777.2μmol)的DCM(5mL)溶液中添加DIEA(262μL,1.55mmol)。该反应介质在0℃冷却，且在0℃逐滴添加化合物27(360.8mg,932.7μmol)的DCM(2mL)溶液。在室温搅拌该反应介质1小时，并真空浓缩。粗产物经两次连续的快速色谱在12g和10g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到72mg的化合物28(15％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：50:50构象混合物；1.39(s,4.5H)；1.40(s,4.5H)；2.22to 2.75(部分遮盖的m,6H)；3.23(s,3H)；3.38to 3.63(m,30H)；4.55(m,2H)；5.19至5.36(m,2H)；5.90(m,1H)。
化合物29：24-(3-(烯丙基氧基)-3-氧代丙基)-23-氧代-2,5,8,11,14,17,20-七氧杂-24-氮杂二十七烷-27-酸
向化合物28(72mg,118.5μmol)的DCM(3mL)溶液中添加TFA(100μL,1.33mmol)；在室温搅拌该反应介质过夜，然后添加额外的TFA(100μL,1.33mmol)并持续搅拌1天。真空浓缩该反应介质，用DCM稀释并与甲苯共蒸发(3x)，得到66mg的化合物29(定量产率)。
化合物30：24-(3-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-3-氧代丙基)-23-氧代-2,5,8,11,14,17,20-七氧杂-24-氮杂二十七烷-27-酸烯丙基酯
在氩气中，向化合物29(66mg,119.7μmol)的THF(2mL)溶液中添加DIEA(20.2μL,119.9μmol)和DSC(34.4mg,131.6μmol)；在室温搅拌该反应介质4天，真空浓缩并经快速色谱在900mg的二醇改性的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/iPrOH)，得到35mg的化合物30(45％)。
化合物31：24-(3-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环-十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)氧基)-甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-氧代丙基)-23-氧代-2,5,8,11,14,17,20-七氧杂-24-氮杂二十七烷-27-酸烯丙基酯
向化合物23(45mg,44.2μmol)的THF(5mL)溶液中添加化合物30(28.7mg,44.2μmol)和DIEA(11.2μL,66.3μmol)。在室温搅拌该反应介质过夜，用H2O(10mL)稀释，并用EtOAc(3x 10mL)萃取。用盐水洗涤合并的有机相，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并经快速色谱在5g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到35mg的化合物31，其为白色固体(51％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：60:40构象混合物；0.80(裂分d,J＝6.8Hz,6H)；0.82(d,J＝7.0Hz,1.8H)；0.84(d,J＝7.0Hz,1.2H)；0.86(d,J＝7.0Hz,1.8H)；0.88(d,J＝7.0Hz,1；2H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.28(m,1H)；1.30(m,3H)；1.56(m,2H)；1.79(m,1H)；1.95(m,1H)；2.27(m,1H)；2.35至2.60(部分遮盖的m,6H)；2.62至2.73(m,2H)；2.93至3.05(m,3H)；3.23(s,3H)；3.33(遮盖的m,1H)；3.38至3.64(m,30H)；3.80(s,3H)；3.87(d,J＝2.3Hz,1H)；4.15至4.27(m,4H)；4.38(m,1H)；4.52至4.58(m,2H)；4.90(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；4.97(s,2H)；5.10(m,1H)；5.50(m,1H)；5.30(m,1H)；5.80(d,J＝16.0Hz,1H)；5.90(m,1H)；6.47(ddd,J＝4.7,10.5和16.0Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.15(dd,J＝2.5和8.6Hz,1H)；7.20至7.32(m,8H)；7.59(m,2H)；7.78(t,J＝6.5Hz,1H)；7.95(d,J＝9.0Hz,0.4H)；8.07(d,J＝9.0Hz,0.6H)；8.18(d,J＝7.0Hz,0.4H)；8.27(d,J＝7.0Hz,0.6H)；8.36(d,J＝8.0Hz,1H)；9.90(s,0.4H)；9.95(s,0.6H)。LCMS(A)：ES m/z＝698；m/z＝1552[M+H]+；m/z＝1595[M-H+HCO2H]-；tR＝1.39min.
实施例10：24-(3-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-氧代丙基)-23-氧代-2,5,8,11,14,17,20-七氧杂-24-氮杂二十七烷-27-酸
在氩气中，向化合物31(30mg,19.3μmol)的DCM(5mL)溶液中添加二甲基巴比妥酸(9.24mg,58.0μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(1.13mg,0.97μmol)。在室温搅拌该反应介质3小时，然后真空浓缩，并经两次连续的快速色谱在5g和0.9g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到14mg的实施例10，其为白色固体(50％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：50:50构象混合物；0.78(裂分d,J＝6.8Hz,6H)；0.81至0.89(m,6H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.28(m,1H)；1.30(d,J＝7.0Hz,1.5H)；1.32(d,J＝7.0Hz,1.5H)；1.51至1.62(m,2H)；1.79(m,1H)；1.96(m,1H)；2.26(m,1H)；2.33至2.60(部分遮盖的m,6H)；2.61至2.73(m,2H)；2.93至3.03(m,3H)；3.22(s,3H)；3.30(遮盖的m,1H)；3.38至3.62(m,30H)；3.80(s,3H)；3.87(d,J＝2.3Hz,1H)；4.12至4.29(m,4H)；4.39(m,1H)；4.90(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；4.96(s,2H)；5.10(m,1H)；5.78(d,J＝16.0Hz,1H)；6.46(ddd,J＝4.7,10.5和16.0Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7,16(dd,J＝2.5和8,6Hz,1H)；7.20至7.32(m,8H)；7.59(m,2H)；7.79(m,1H)；8.04(m,0.5H)；8.10(d,J＝9.0Hz,0.5H)；8.25至8.41(m,2H)；9.95(s,0.5H)；9.98(s,0.5H)；12.20(m,1H)。LCMS(D)：ES m/z＝769；m/z＝1511[M+H]+；tR＝3.16min。
合成实施例11和12：PEG24-Val-Ala-PABA-C52苄胺和PEG24-Val-Ala-PABA-C52苄 胺的NHS酯
Figure BDA0002354666740001751
Figure BDA0002354666740001761
化合物32：75-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)-74-氧代
-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十八烷-78-酸烯丙基酯
在氩气中，向化合物3(45mg,174.9μmol)的THF(5mL)溶液中添加MEO-DPEG(24)-NHS(212.4mg,174.9μmol)和DIEA(44.2μL,262.3μmol)。在室温搅拌该反应介质过夜，然后真空浓缩并在20g的硅胶上经快速色谱提纯(梯度洗脱DMC/MeOH)，得到125mg的化合物32(60％)和MEO-DPEG(24)-NHS(40％)的混合物。将该混合物在THF(3mL)中稀释，添加15mg的化合物3和20μL的DIEA；在室温搅拌该反应介质过夜，然后真空浓缩并经快速色谱在12g的硅胶上提纯，得到105mg的化合物32(44％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：1.40(s,9H)；2.25至2.78(m,6H)；3.22(s,3H)；3.32至3.70(m,98H)；4.52(m,2H)；5.20(m,1H)；5.30(m,1H)；5.90(m,1H)。LCMS(A)：ESm/z＝679[M+2H]2+；m/z＝1356[M+H]+；m/z＝1400[M-H+HCO2H]-；tR＝1.15min。
化合物33：75-(3-(烯丙基氧基)-3-氧代丙基)-74-氧代
-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十八烷-78-酸
向化合物32(105mg,77.4μmol)的DCM(2mL)溶液中添加TFA(116.2μL,1.55mmol)；在室温搅拌该反应介质过夜，然后添加150μL的TFA，并再继续反应1天。然后真空浓缩该反应介质，用DCM稀释并与甲苯共蒸发(3x)，得到110mg的粗品，其经RP-HPLC在5μm C18SunFire柱(Waters,30x 100mm，梯度洗脱MeCN+0.07％TFA/H20+0.07％TFA)上提纯得到60mg的化合物33(60％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：50:50构象混合物；2.37至2.60(部分遮盖的m,6H)；3.23(s,3H)；3.32至3.44(部分遮盖的m,38H)；3.47至3.52(m,58H)；3.60(m,2H)；4.54(m,2H)；5.22(dm,J＝10.5Hz,1H)；5.30(dm,J＝17.3Hz,1H)；5,84至5,98(m,1H)；12.32(宽的m,1H)。
化合物34：
75-(3-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环-十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)氧基)-甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-氧代丙基)-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十八烷-78-酸烯丙基酯
在氩气中，向化合物33(30mg,23.1μmol)的THF(5mL)溶液中添加DIEA(11.7μL,69.2μmol)和DSC(6.03mg,23.1μmol)。在室温搅拌该反应介质3小时，然后添加化合物23(23.5mg,23.1μmol)，并持续搅拌1小时。真空浓缩该反应介质并经快速色谱在5g的硅胶上提纯，得到23mg的化合物34(40％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：60:40构象混合物：0.80(裂分d,J＝6.8Hz,6H)；0.82(d,J＝7.0Hz,1.8H)；0.84(d,J＝7.0Hz,1.2H)；0.86(d,J＝7.0Hz,1.8H)；0.88(d,J＝7.0Hz,1.2H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.28(m,1H)；1.30(d,J＝7.0Hz,3H)；1.51至1.62(m,2H)；1.80(m,1H)；1.96(m,1H)；2.26(m,1H)；2.38(m,1H)；2.45至2.61(部分遮盖的m,5H)；2.61至2.72(m,2H)；2.93至3.05(m,3H)；3.23(s,3H)；3.32(遮盖的m,1H)；3.40至3.77(m,98H)；3.80(s.3H)；3.88(d,J＝2.3Hz,1H；4.14至4.27(m,4H)；4.39(m,1H)；4.51至4.60(m,2H)；4.90(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；4.97(s,2H)；5.10(m,1H)；5.18至5.33(m,2H)；5.78(d,J＝16.0Hz,1H)；5.90(m,1H)；6.45(m,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.5和8.6Hz,1H)；7.20至7.32(m,8H)；7.59(m,2H)；7.77(t,J＝6.5Hz,1H)；7.95(d,J＝9.0Hz,0.4H)；8.07(d,J＝9.0Hz,0.6H)；8.19(d,J＝7.0Hz,0.4H)；8.25(d,J＝7.0Hz,0.6H)；8.36(d,J＝8.0Hz,1H)；9.90(s,0.4H)；9.96(s,0.6H)。
实施例11：
75-(3-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-氧代丙基)-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十八烷-78-酸
在氩气中，向化合物34(37mg,161μmol)的DCM溶液中添加1,3-二甲基巴比妥酸(5.13mg,32.2μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(0.94mg,0.80μmol)；在室温搅拌该反应介质2小时，然后真空浓缩并经快速色谱在5g的二醇改性的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到16mg的实施例11(44％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：0.77(d,J＝7.0Hz,6H)；0.80至0.90(m,6H)；0,99(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.28(m,1H)；1.30(d,J＝7.0Hz,1.5H)；1.32(d,J＝7.0Hz,1.5H)；1.52至1.61(m,2H)；1.79(m,1H)；1.98(m,1H)；2.22至2.58(部分遮盖的m,7H)；2.68(m,2H)；2.92至3.04(m,3H)；3.21(s,3H)；3.30(部分遮盖的m,1H)；3.37至3.67(m,98H)；3.81(s,3H)；3.88(s,1H)；4.08至4.28(m,4H)；4.39(m,1H)；4.90(m,1H)；4.98(s,2H)；5.10(m,1H)；5.80(d,J＝16.0Hz,1H)；6.48(ddd,J＝4.7,10.5和16.0Hz,1H)；7.04(d,J＝8.6Hz,1H)；7.16(宽的d,J＝8.6Hz,1H)；7.20至7.32(m,8H)；7.57至7.67(m,2H)；7.80(m,1H)；8.20(m,1H)；8.35至8.70(m,2H)；10.08(m,1H)；12.30(宽的m,1H)。LCMS(D)：ES m/z＝698；m/z＝2259[M+H]+；tR＝3.14min。
实施例12：
75-(3-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)-氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-氧代丙基)-74-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂七十八烷-78-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
向实施例11(16mg,7.1μmol)的DCM溶液中添加DIEA(1.2μL,7.1μmol)和DSC(1.8mg,7.1μmol)。在室温搅拌该反应介质3小时，然后真空浓缩并在1.3g的二醇改性的硅胶上经快速色谱提纯(梯度洗脱DCM/iPrOH)，得到5mg的实施例12(30％)和实施例11(70％)的混合物。
LCMS(D)：ES m/z＝698；m/z＝2356[M+H]+；tR＝3.2min。
合成实施例13：磺基-PEG4-Val-Ala-PABA-C52苄胺
Figure BDA0002354666740001801
Figure BDA0002354666740001811
化合物35：4-((3-(烯丙基氧基)-3-氧代丙基)(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)氨基)-4-氧代丁酸
向化合物3(100mg,388.6μmol)的DCM(5mL)溶液中添加琥珀酸酐(78.6mg,777.2μmol)。在室温搅拌该反应介质过夜，然后真空浓缩并在4g的硅胶上经快速色谱提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到102mg的化合物35，其为无色油状物(73％)。
化合物36：1-铵基-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十八烷-18-磺酸盐
在氩气中，向15-(Boc-氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷酸(500mg,1.3mmol)的THF(5mL)溶液中添加DIEA(438.4μL,2.6mmol)和DSC(381.6mg,1.43mmol)。在室温搅拌该反应介质6小时，然后添加50mg的DSC，并在室温持续搅拌过夜。此时，将牛磺酸(821.6mg,6.5mmol)和H2O(1mL)添加至该反应介质。在室温搅拌该反应介质过夜，真空浓缩并经制备型LCMS在5μm C18 SunFire柱(Waters,30x 100mm，梯度洗脱MeCN+0.07％TFA/H2O+0.07％TFA)上提纯，得到341mg的化合物36(70％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：2.28(t,J＝6.5Hz,2H)；2.60(m,2H)；2.99(m,2H)；3.32(m,2H)；3.45to 3.65(m,16H)；7.77(宽的m,4H)。作为KBr片的IR光谱；主要吸收峰(cm-1)：3000；1780；1648；1556；1200-1170；1200；1100；1040。
化合物37：24-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)-4,20,23,27-四氧代-7,10,13,16,28-五氧杂-3,19,24-三氮杂三十一-30-烯-1-磺酸盐
向化合物35(100mg,279.8μmol)的THF溶液中添加DIEA(141.6μL,839.4μmol)和DSC(73.1mg,279.8μmol)。将反应混合物在室温搅拌2小时，然后添加化合物36(104.2mg,279.8μmol)的DMF溶液和DIEA(141.6μL,839.4μmol)。在室温搅拌该反应介质2小时，真空浓缩并经制备型LCMS在5μm C18 SunFire柱(Waters,30x 100mm，梯度洗脱MeCN+0.07％TFA/H2O+0.07％TFA)上提纯，得到118mg的化合物37(60％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：50:50构象混合物；1.39(s,4.5H)；1.40(s,4.5H)；2.27(t,J＝6.5Hz,2H)；2.31(t,J＝7.0Hz,2H)；2.38(t,J＝7.0Hz,1H)；2.45至2.56(遮盖的m,6H)；2.68(m,1H)；3.18(q,J＝6.0Hz,2H)；3.29(m,2H)；3.36至3.60(m,20H)；4.51至4.59(m,2H)；5.17至5.25(m,2H)；5.85至5.95(m,1H)；7.75(t,J＝6.0Hz,1H)；7.88(t,J＝6.0Hz,1H)。
化合物38：24-(2-羧基乙基)-4,20,23,27-四氧代-7,10,13,16,28-五氧杂-3,19,24-三氮杂三十一-30-烯-1-磺酸盐
向化合物37(118mg,166.0μmol)的DCM(5mL)溶液中添加TFA(249μL,3.32mmol)。在室温搅拌该反应介质过夜，真空浓缩，用DCM稀释并与甲苯共蒸发(3x)，得到100mg的化合物38，其为无色油状物(92％)。
化合物39：(2S,5S)-10-(3-(烯丙基氧基)-3-氧代丙
基)-1-((4-((((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基)-5-异丙基-2-甲基-1,4,7,11,14,30-六氧代-18,21,24,27-四氧杂-3,6,10,15,31-五氮杂三十三烷-33-磺酸
向化合物38(100mg,152.7μmol)的THF(3mL)和DMF(1mL)溶液中添加DIEA(77μL,458.2μmol)和DSC(39.9mg,152.7μmol)。在室温搅拌该反应介质2小时，然后添加化合物23(124mg,121.9μmol)的THF(1mL)和DMF(0.5mL)溶液和DIEA(100μL)。在室温搅拌该反应介质2小时，真空浓缩并经反相快速色谱在75g的C18-改性的硅胶上提纯(梯度洗脱H2O/MeCN)，得到60mg的化合物39，其为白色固体(24％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：60:40构象混合物；0.78(d,J＝6.8Hz,6H)；0.82(d,J＝7.0Hz,1.8H)；0.84(d,J＝7.0Hz,1.2H)；0.86(d,J＝7.0Hz,1.8H)；0.88(d,J＝7.0Hz,1.2H)；0.99(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.28(m,1H)；1.30(d,J＝7.0Hz,3H)；1.50至1.62(m,2H)；1.80(m,1H)；1.96(m,1H)；2.20至2.55(部分遮盖的m,11H)；2.61至2.75(m,2H)；2.94至3.05(m,3H)；3.10至3.65(部分遮盖的,27H)；3.80(s,3H)；3.87(d,J＝2.3Hz,1H)；4.13至4.28(m,4H)；4.38(m,1H)；4.53(m,1.2H)；4.56(m,0.8H)；4.90(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；4.97(s,2H)；5.10(m,1H)；5.18至5.33(m,2H)；5.80(d,J＝16.0Hz,1H)；5.90(m,1H)；6.47(ddd,J＝4.7,10.5和16.0Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.5和8.6Hz,1H)；7.20至7.32(m,8H)；7.59(m,2H)；7.72(t,J＝6.5Hz,1H)；7.79(t,J＝6.0Hz,1H)；7.89(t,J＝6.5Hz,1H)；7.95(d,J＝9.0Hz,0.4H)；8.08(d,J＝9.0Hz,0.6H)；8.19(d,J＝7.0Hz,0.4H)；8.25(d,J＝7.0Hz,0.6H)；8.36(d,J＝8.0Hz,1H)；9.90(s,0.4H)；9.95(s,0.6H)。LCMS(D):ES m/z＝913；m/z＝1654[M+H]+；tR＝3.87min。
实施例13：
24-(3-(((S)-1-(((S)-1-((4-((((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-苯基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-3-氧代丙基)-4,20,23-三氧代-1-磺基-7,10,13,16-四氧杂-3,19,24-三氮杂二十七烷-27-酸
向化合物39(60mg,36.3μmol)的DMF(5mL)溶液中添加1,3-二甲基巴比妥酸(17.3mg,108.8μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(2.1mg,1.8μmol)。在室温搅拌该反应介质过夜，真空浓缩，并经两次快速色谱在30g和20g的C18-改性的硅胶上提纯，得到两批6mg的实施例13，其为白色固体(20％总产率)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):60:40构象混合物；0.78(d,J＝6.8Hz,6H)；0.81至0.89(m,6H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.28(m,1H)；1.30(d,J＝7.0Hz,3H)；1.58(m,2H)；1.80(m,1H)；1.96(m,1H)；2.21至2.58(部分遮盖的m,11H)；2.69(m,2H)；2.93至3.68(部分遮盖的m,28H)；3.80(s,3H)；3.88(d,J＝2.3Hz,1H)；4.11至4.28(m,4H)；4.38(m,1H)；4.90(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；4.98(s,2H)；5.10(m,1H)；5.79(d,J＝16.0Hz,1H)；6.47(ddd,J＝4.7,10.5和16.0Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.17(dd,J＝2.5和8.6Hz,1H)；7.20至7.32(m,8H)；7.59(m,2H)；7.72(t,J＝6.5Hz,1H)；7.79(t,J＝6.0Hz,1H)；7.89(t,J＝6.5Hz,1H)；7.97(d,J＝9.0Hz,0.4H)；8.08(d,J＝9.0Hz,0.6H)；8.19(d,J＝7.0Hz,0.4H)；8.25(d,J＝7.0Hz,0.6H)；8.36(d,J＝8.0Hz,1H)；9.90(s,0.4H)；9.94(s,0.6H)；12.15(宽的m,1H)。LCMS(A):ES m/z＝807.5[M+2H]2+；m/z＝1612[M-H]-；m/z＝1614[M+H]+；tR＝1.72min。
合成实施例14至16：戊二酰基-Val-PEG4Gln-C52苄胺、戊二酰基-Val-PEG4Gln- C52苄胺的NHS酯及相应的ADC
Figure BDA0002354666740001841
Figure BDA0002354666740001851
化合物40：(S)-4-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸
在磁力搅拌下，向H-Glu-OtBu(CAS号[45120-30-7],959mg,4.7mmol)和NaHCO3(400mg,4.77mmol)的H2O(80mL)溶液中逐滴添加2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)-羰基)氨基)-3-甲基丁酸(S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(2g,4.6mmol)的THF(80mL)溶液。在室温搅拌该反应介质过夜。真空浓缩该介质，然后添加饱和NaHCO3水溶液(1L)，随后用Et2O(2x 250mL)萃取，弃去有机相。水相用适量1N HCl水溶液酸化以达到pH 2，并用DCM萃取(3x 250mL)，合并的有机相经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩，得到2.05g的化合物40(85％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.87(d,J＝6.9Hz,3H)；0.90(d,J＝6.9Hz,3H)；1.38(s,9H)；1.73至2.02(m,3H)；2.24至2.30(m,2H)；3.90(dd,J＝7.3和9.0Hz,1H)；4.14(m,1H)；4.19至4.32(m,3H)；7.27至7.45(m,5H)；7.75(t,J＝7.6Hz,2H)；7.89(d,J＝7.6Hz,2H)；8.22(宽的d,J＝7.0Hz,1H)；12.05(宽的s,1H)。
化合物41：18-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-15-氧代-2,5,8,11-四氧杂-14-氮杂十九烷-19-酸(S)-叔丁基酯
在磁力搅拌下，向化合物40(200mg,381μmol)的DCM(6mL)溶液中添加PEG4-NH2(CAS号[85030-56-4],115mg,554.9μmol)、HOBt(82mg,606.8μmol)和EDC(100μL,565μmol)。在室温搅拌该反应介质过夜。该粗介质经快速色谱在硅胶上提纯两次(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到190mg的化合物41(70％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.87(d,J＝6.8Hz,3H)；0.90(d,J＝6.8Hz,3H)；1.38(s,9H)；1.72至1.93(m,2H)；1.99(m,1H)；2.14(t,J＝7.8Hz,2H)；3.18(m,2H)；3.23(s,3H)；3.37(t,J＝6.0Hz,2H)；3.41(m,2H)；3.46至3.53(m,10H)；3.92(dd,J＝7.1和8.8Hz,1H)；4.09(m,1H)；4.17至4.34(m,3H)；7.32(m,3H)；7.41(t,J＝7.6Hz,2H)；7.70至7.81(m,3H)；7.88(d,J＝7.6Hz,2H)；8.18(d,J＝7.3Hz,1H)。LCMS(A):ES m/z＝714[M+H]+；m/z＝758[M-H+HCO2H]-；tR＝1.41min。
化合物42：(S)-18-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-15-氧代-2,5,8,11-四氧杂-14-氮杂十九烷-19-酸
在磁力搅拌下，向化合物41(190mg,266μmol)添加4M HCl的1,4-二噁烷溶液(5mL)。在室温搅拌该反应介质4小时。此时，真空浓缩该反应介质并经快速色谱在15g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/NH4OH)，得到70mg的化合物42(40％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.84(d,J＝6.6Hz,3H)；0.86(d,J＝6.6Hz,3H)；1.70至1.90(m,2H)；2.01至2.15(m,3H)；3.15(m,2H)；3.23(s,3H)；3.36(t,J＝6.4Hz,2H)；3.42(m,2H)；3.45至3.53(m,10H)；3.80(宽的m,1H)；3.83(dd,J＝6.8和8.7Hz,1H)；4.19至4.34(m,3H)；7.33(m,2H)；7.41(t,J＝7.6Hz,2H)；7.59(宽的m,2H)；7.73(d,J＝7.6Hz,1H)；7.76(d,J＝7.6Hz,1H)；7.89(d,J＝7.6Hz,2H)；8.00(宽的m,1H)。LCMS(A):ESm/z＝656[M-H]-；m/z＝658[M+H]+；RT＝1.19min。
化合物43：(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨
基)-N1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)-N5-(2,5,8,11-四氧杂十三烷-13-基)戊二酰胺
向(E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-(4-氨基甲基-苯基)-环氧乙烷基]-乙基}-10-(3-氯-4-甲氧基-苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-1,4-二氧杂-8,11-二氮杂-环十六烷-13-烯-2,5,9,12-四酮(其合成如WO2011001052中化合物77所述，58mg，83μmol)的DMF(5mL)溶液中，在磁力搅拌下，添加化合物42(70mg,106μmol)、HOBt(20mg,148μmol)和EDC(23μL,130μmol)。在室温搅拌该反应介质24小时。此时，将哌啶(80μL,810μmol)添加至介质中，并保持搅拌1小时。然后，真空浓缩该反应介质并经快速色谱在20g硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到60mg的化合物43(65％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.77(d,J＝6.9Hz,3H)；0.79(d,J＝6.3Hz,6H)；0.87(d,J＝6.9Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝6.4Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.31(m,1H)；1.52至1.63(m,2H)；1.72至1.98(m,4H)；2.05至2.15(m,2H)；2.26(m,1H)；2.62至2.73(m,2H)；2.94至3.04(m,4H)；3.18(q,J＝5.9Hz,2H)；3.23(s,3H)；3.33(部分遮盖的m,1H)；3.39(t,J＝5.9Hz,2H)；3.42(m,2H)；3.47至3.52(m,10H)；3.81(s,3H)；3.87(d,J＝1.4Hz,1H)；4.21至4.36(m,4H)；4.91(dd,J＝3.6和9.6Hz,1H)；5.10(dd,J＝5.5和11.8Hz,1H)；5.79(d,J＝15.3Hz,1H)；6.46(ddd,J＝3.8,11.6和15.3Hz,1H)；7.05(d,J＝8.5Hz,1H)；7.17(dd,J＝1.9和8.5Hz,1H)；7.21至7.25(m,5H)；7.28(d,J＝1.9Hz,1H)；7.89(t,J＝5.5Hz,1H)；8.07(m大,1H)；8.37(d,J＝8.0Hz,1H)；8.45(t,J＝5.9Hz,1H)。LCMS(A):ES m/z＝558[M+2H]2+；m/z＝1115[M+H]+；m/z＝1159[M-H+HCO2H]-；tR＝0.96min。
实施例14：(18S,21S)-18-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)-21-异丙基-15,20,23-三氧代-2,5,8,11-四氧杂-14,19,22-三氮杂二十七烷-27-酸
向化合物43(55mg,49.3μmol)的DMF(3mL)溶液中添加戊二酸酐(9mg,79μmol)，在室温搅拌该反应介质2小时。此时，真空浓缩该介质并经快速色谱在10g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到38mg的实施例14(62％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.81(裂分d,J＝6.6Hz,6H)；0.85(d,J＝6.3Hz,3H)；0.87(d,J＝6.3Hz,3H)；0.98(s,3H)；1.03(d,J＝6.6Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.35(m,1H)；1.52至2.34(m,15H)；2.71(m,2H)；2.89至3.02(m,3H)；3.09至3.21(m,2H)；3.23(s,3H)；3.30至3.40(部分遮盖的m,3H)；3.42(m,2H)；3.46至3.51(m,10H)；3.81(s,3H)；3.87(s,1H)；4.03至4.24(m,4H)；4.37(m,1H)；4.96(m,1H)；5.11(m,1H)；5.81(d,J＝15.3Hz,1H)；6.46(ddd,J＝3.3,11.4和15.3Hz,1H)；7.04(d,J＝8.5Hz,1H)；7.19(dd,J＝1.9和8.5Hz,1H)；7.22(d,J＝8.3Hz,2H)；7.27(d,J＝8.3Hz,2H)；7.30(d,J＝1.9Hz,1H)；7.32(m,1H)；7.85至8.99(宽的m,5H)；12.12(宽的m,1H)。LCMS(A):ES m/z＝615[M+2H]2+；m/z＝1227[M-H]-；m/z＝1229[M+H]+；tR＝1.26min。
实施例15：18-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)-21-异丙基-15,20,23-三氧代-2,5,8,11-四氧杂-14,19,22-三氮杂二十七烷-27-酸(18S,21S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
在磁力搅拌下，向实施例14(32mg,26μmol)的DMF(3mL)溶液中添加DSC(8mg,31.2μmol)和DIEA(8.6μL,52μmol)。在室温搅拌该反应介质过夜。然后，添加4mg的DSC并在室温保持搅拌1小时。此时，该反应介质用MeTHF(10mL)稀释，用H2O(5mL)洗涤。水相用MeTHF(3x5mL)萃取。合并的有机相经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。该介质经快速色谱在4g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/iPrOH)，得到28mg的实施例15(81％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.78(d,J＝6.6Hz,6H)；0.83(d,J＝6.9Hz,3H)；0.85(d,J＝6.9Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝6.4Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.30(m,1H)；1.52至1.64(m,2H)；1.75至1.93(m,5H)；1.98(m,1H)；2.12(m,2H)；2.22至2.34(m,3H)；2.62至2.72(m,4H)；2.81(s,4H)；2.93至3.04(m,3H)；3.18(q,J＝6.0Hz,2H)；3.23(s,3H)；3.33(部分遮盖的m,1H)；3.39(t,J＝6.0Hz,2H)；3.42(m,2H)；3.47至3.52(m,10H)；3.81(s,3H)；3.87(d,J＝1.6Hz,1H)；4.15(dd,J＝6.6和8.2Hz,1H)；4.19至4.32(m,4H)；4.91(dd,J＝3.6和9.6Hz,1H)；5.10(m,1H)；5.79(d,J＝15.3Hz,1H)；6.47(ddd,J＝3.7,11.3和15.3Hz,1H)；7.05(d,J＝8.5Hz,1H)；7.17(dd,J＝2.2和8.5Hz,1H)；7.21至7.26(m,5H)；7.28(d,J＝2.2Hz,1H)；7.85(t,J＝6.0Hz,1H)；7.92(d,J＝8.2Hz,1H)；8.08(d,J＝7.7Hz,1H)；8.32(t,J＝6.0Hz,1H)；8.37(d,J＝8.0Hz,1H)。LCMS(A):ES m/z＝1326[M+H]+；m/z＝1348[M+Na]+；m/z＝1370[M-H+HCO2H]-；tR＝1.31min。
实施例16：hu2H11_R35-74-Ex15
使用前述的一般方法制备实施例16。28.8mg的hu2H11_R35-74与115.2μL的10.05mM实施例15的DMA(6当量)溶液反应2小时30分钟。在Superdex 200pg上、缓冲液B pH6.5+10％NMP中提纯后，在Amicon Ultra-15上浓缩，在缓冲液B pH 6.5中稀释，达到最终NMP浓度为5％，并在0.22μm PVDF过滤器上过滤，得到16.12mg的ADC，其含有2.2％剩余的实施例14。该批次在Amicon Ultra-15上浓缩并在Sephadex G25上提纯，得到13.16mg的实施例16，其为无色澄清溶液，浓度为1.4mg/mL，DAR为2.8(HRMS)，单体纯度为99.7％且总产率为43％。
SEC-HRMS:m/z＝149398(裸mAb)；m/z＝150610(D1)；m/z＝151822(D2)；m/z＝153035(D3)；m/z＝154248(D4)；m/z＝155458(D5)；m/z＝156672(D6)；m/z＝1578881(D7)。
合成实施例17至19：戊二酰基-Val-葡萄糖Gln-C52苄胺、戊二酰基-Val-葡萄糖 Gln-C52苄胺的NHS酯及相应的ADC
Figure BDA0002354666740001901
化合物44：(2S,3S,4S,5R,6R)-2-(碘甲基)-6-甲氧基四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇
向搅拌回流的甲基β-D-吡喃葡萄糖苷半水合物(CAS号[7000-27-3],1g,4.67mmol)、咪唑(642mg,9.34mmol)和三苯基膦(2.47g,9.33mmol)的THF(50mL)溶液中逐滴添加碘(2.37g,9.33mmol)的THF(10mL)溶液。保持回流3小时。在0℃冷却后，过滤该反应介质，真空浓缩滤液。混合物经快速色谱在150g的硅胶上提纯(梯度DCM/MeOH)，得到1g的化合物44(63％)。
化合物45：(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(叠氮基甲基)-6-甲氧基四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇
在磁力搅拌下，向化合物44(1g,3.29mmol)的DMF(10mL)溶液中添加NaN3(322mg,4.93mmol)。在50℃加热该反应介质16小时。此时，在室温冷却后，真空浓缩该介质并经快速色谱在80g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到550mg的化合物45(76％)。
化合物46：(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(氨基甲基)-6-甲氧基四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇盐酸盐
将化合物45(550mg,2.51mmol)和三苯基膦(1.33g,5.02mmol)的1,4-二噁烷(12mL)和MeOH(3mL)溶液在室温搅拌30分钟。此时，将水(1.5mL)添加至该反应介质并在室温保持搅拌过夜。真空浓缩该粗介质，然后用DCM(10mL)和1N HCl水溶液(5mL)稀释，水相用DCM(2x 10mL)萃取。真空浓缩水相，然后用MeOH稀释，并真空浓缩得到560mg的化合物46(97％)。
化合物47：2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)戊二酸(S)-1-叔丁基酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯
在磁力搅拌下，向化合物40(2g,3.81mmol)的THF(100mL)溶液中依次添加DIEA(1.29mL,7.62mmol)、DSC(1.95g,7.62mmol)和DMF(20mL)。在氩气中，在室温搅拌该反应介质过夜。真空浓缩后，该混合物经快速色谱在150g的硅胶上提纯(洗脱DCM/EtOAc)，得到1.67g的化合物47(71％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.89(d,J＝6.8Hz,3H)；0.91(d,J＝6.8Hz,3H)；1.39(s,9H)；1.84至2.10(m,3H)；2.65至2.77(m,2H)；2.80(s,4H)；3.88(dd,J＝7.2和8.7Hz,1H)；4.18至4.31(m,4H)；7.32(m,2H)；7.41(m,3H)；7.73(d,J＝7.6Hz,1H)；7.75(d,J＝7.6Hz,1H)；7.88(d,J＝7.6Hz,2H)；8.31(宽的d,J＝7.1Hz,1H)。LCMS(A):ES m/z＝566；m/z＝622[M+H]+；m/z＝666[M-H+HCO2H]-；tR＝1.49min。
化合物48：2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-氧代-5-((((2R,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基)氨基)戊酸(S)-叔丁基酯
在磁力搅拌下，向化合物47(500mg,804μmol)的DMF(10mL)溶液中添加化合物46(185mg,805μmol)和DIEA(165μL,978μmol)。在室温搅拌该反应介质4小时。此时，将37mg的化合物46和35μL的DIEA添加至该反应介质中，保持搅拌1小时。然后，真空浓缩该介质并经快速色谱在50g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到480mg的化合物48(85％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.87(d,J＝6.7Hz,3H)；0.89(d,J＝6.7Hz,3H)；1.38(s,9H)；1.70至2.04(m.3H)；2.19(t,J＝7.9Hz,2H)；2.86至2.98(m,2H)；3.01至3.16(m,3H)；3.35(s,3H)；3.52(m,1H)；3.92(dd,J＝7.2和8.4Hz,1H)；3.99(d,J＝7.6Hz,1H)；4.09(m,1H)；4.16至4.36(m,3H)；4.95(宽的d,J＝4.6Hz,1H)；4.99(d,J＝5.1Hz,1H)；5.03(d,J＝4.9Hz,1H)；7.27至7.37(m,3H)；7.41(t,J＝7.6Hz,2H)；7.75(裂分d,J＝7.0Hz,2H)；7.85(宽的m,1H)；7.89(d,J＝7.6Hz,2H)；8.23(宽的d,J＝7.1Hz,1H)。LCMS(A):ES m/z＝700[M+H]+；m/z＝744[M-H+HCO2H]-；tR＝1.22min。
化合物49：(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-氧代-5-((((2R,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基)氨基)戊酸
在磁力搅拌下，向化合物48(480mg,686μmol)中添加4M HCl的1,4-二噁烷溶液(30mL)。在室温搅拌该反应介质4小时。此时，真空浓缩该介质并经快速色谱在30g的硅胶上提纯(洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到260mg的化合物49(59％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.83(d,J＝6.6Hz,3H)；0.85(d,J＝6.6Hz,3H)；1.69至1.90(m,2H)；2.01至2.15(m,3H)；2.86至2.97(m,2H)；2.99至3.16(m,3H)；3.35(s,3H)；3.51(m,1H)；3.82(m,2H)；3.99(d,J＝7.8Hz,1H)；4.20至4.33(m,3H)；4.95(宽的d,J＝3.7Hz,1H)；5.03(d,J＝4.9Hz,1H)；5.06(宽的d,J＝4.6Hz,1H)；7.33(m,2H)；7.40(t,J＝7.6Hz,2H)；7.52(宽的d,J＝6.4Hz,1H)；7.61(宽的d,J＝9.3Hz,1H)；7.73(d,J＝7.6Hz,1H)；7.76(d,J＝7.6Hz,1H)；7.89(d,J＝7.6Hz,2H)；8.10(宽的m,1H)。LCMS(A):ES m/z＝642[M-H]-；m/z＝644[M+H]+；tR＝1.01min。
化合物50：(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨
基)-N1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)-N5-(((2R,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基)戊二酰胺
在磁力搅拌下，向(E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-(4-氨基甲基-苯基)-环氧乙烷基]-乙基}-10-(3-氯-4-甲氧基-苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-1,4-二氧杂-8,11-二氮杂-环十六烷-13-烯-2,5,9,12-四酮(其合成如WO2011001052中化合物77所述，110mg，157μmol)的DMF(6mL)溶液中添加化合物49(122mg,189μmol)、HOBt(34mg,252μmol)和EDC(43μL,236μmol)。在室温搅拌该反应介质过夜。然后，将25mg的化合物49和25μL的EDC添加至介质中，保持搅拌1小时。此时，将哌啶(160μL,1.58mmol)添加至介质中。在2小时后，真空浓缩该介质并经快速色谱在20g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到78mg的化合物50(45％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.76(d,J＝6.9Hz,3H)；0.79(d,J＝6.3Hz,6H)；0.87(d,J＝6.9Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝6.6Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.30(m,1H)；1.50至1.98(m,8H)；2.12(m,2H)；2.26(m,1H)；2.68(m,2H)；2.86至3.14(m,9H)；3.32(部分遮盖的m,1H)；3.38(s,3H)；3.52(m,1H)；3.81(s,3H)；3.87(s,1H)；4.01(d,J＝7.4Hz,1H)；4.20至4.36(m,4H)；4.90(m,1H)；4.98(宽的d,J＝3.6Hz,1H)；5.02(d,J＝4.9Hz,1H)；5.06(d,J＝4.7Hz,1H)；5.10(m,1H)；5.79(d,J＝15.6Hz,1H)；6.47(m,1H)；7.05(d,J＝8.5Hz,1H)；7.17(宽的d,J＝8.5Hz,1H)；7.21至7.26(m,5H)；7.29(宽的s,1H)；7.90(m,1H)；8.08(m大,1H)；8.37(d,J＝8.0Hz,1H)；8.48(m,1H)。LCMS(A):ES m/z＝551[M+2H]2+；m/z＝1099[M-H]-；m/z＝1101[M+H]+；m/z＝1145[M-H+HCO2H]-；tR＝0.9min。
实施例17：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基)-1,5-二氧代-5-((((2R,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基)氨基)戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-5-氧代戊酸
在磁力搅拌下，向化合物50(77mg,69.9μmol)的DMF(4mL)溶液中添加戊二酸酐(14mg,125.8μmol)。在室温搅拌该反应介质2小时。然后，真空浓缩该反应介质，并经快速色谱在10g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到54mg的实施例17(64％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.80(d,J＝6.0Hz,6H)；0.86(d,J＝6.6Hz,3H)；0.88(d,J＝6.6Hz,3H)；0.99(s,3H)；1.03(d,J＝6.6Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.34(m,1H)；1.53至1.85(m,6H)；1.90至2.33(m,9H)；2.65至2.76(m,2H)；2.87至3.14(m,8H)；3.32(部分遮盖的m,1H)；3.35(s,3H)；3.53(m,1H)；3.81(s,3H)；3.87(d,J＝1.9Hz,1H)；4.00(d,J＝7.9Hz,1H)；4.03至4.26(m,4H)；4.33(m,1H)；4.93(m,1H)；5.02(宽的m,3H)；5.10(m,1H)；5.80(d,J＝15.3Hz,1H)；6.46(ddd,J＝3.5,11.0和15.3Hz,1H)；7.05(d,J＝8.5Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.2和8.5Hz,1H)；7.22(d,J＝8.2Hz,2H)；7.26(d,J＝8.2Hz,2H)；7.30(m,2H)；7.98至8.65(宽的m,5H)。LCMS(A):ES m/z＝608[M+2H]2+；m/z＝1213[M-H]-；m/z＝1215[M+H]+；tR＝1.15min。
实施例18：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基)-1,5-二氧代-5-((((2R,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)甲基)氨基)戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-5-氧代戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
将实施例17(45mg,37μmol)在甲苯中稀释并真空浓缩。然后在磁力搅拌下，向实施例17的THF(5mL)、DCM(2mL)和DMF(1mL)溶液中添加DSC(11.4mg,44.4μmol)和DIEA(19μL,112.6μmol)。在室温搅拌该反应介质在氩气中3小时。然后，将DMF和DSC添加至介质中直至反应完成。3个小时后，该介质用水(5mL)稀释并用MeTHF(3x 10mL)萃取。合并的有机相经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。混合物经快速色谱在4g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/iPrOH)，得到21mg的实施例18(43％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.78(d,J＝6.0Hz,6H)；0.83(d,J＝6.9Hz,3H)；0.85(d,J＝6.9Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝6.3Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.30(m,1H)；1.52至1.63(m,2H)；1.75至2.02(m,6H)；2.09至2.34(m,5H)；2.68(m,4H)；2.81(s,4H)；2.88至3.18(m,7H)；3.32(部分遮盖的m,1H)；3.38(s,3H)；3.51(m,1H)；3.81(s,3H)；3.88(s,1H)；4.01(d,J＝7.7Hz,1H)；4.16(dd,J＝7.1和7.7Hz,1H)；4.19至4.35(m,5H)；4.90(m,1H)；4.97(d,J＝4.1Hz,1H)；5.01(d,J＝4.9Hz,1H)；5.06(d,J＝4.9Hz,1H)；5.10(m,1H)；5.79(d,J＝15.3Hz,1H)；6.47(m,1H)；7.05(d,J＝8.5Hz,1H)；7.17(d大,J＝8.5Hz,1H)；7.20至7.26(m,5H)；7.28(宽的s,1H)；7.86(宽的t,J＝5.6Hz,1H)；7.91(d,J＝7.9Hz,1H)；8.08(d,J＝7.4Hz,1H)；8.33(t,J＝5.8Hz,1H)；8.38(d,J＝8.2Hz,1H)。LCMS(A):ES m/z＝1310[M-H]-；m/z＝1356[M-H+HCO2H]-；m/z＝1312[M+H]+；m/z＝656.5[M+2H]2+；tR＝1.2min。
实施例19：hu2H11_R35-74-Ex18
使用前述的一般方法制备实施例19。29.02mg的hu2H11_R35-74与116.6μL的10mM实施例18的DMA(6当量)溶液反应2小时30分钟。在Superdex 200pg上、缓冲液B pH 6.5+10％NMP中提纯后，在Amicon Ultra-15上浓缩，在缓冲液B pH 6.5中稀释，达到最终NMP浓度为5％，并在0.22μm PVDF过滤器上过滤，获得23.1mg的实施例19，其为无色澄清溶液，浓度为2.2mg/mL，DAR为2.8(HRMS)，单体纯度为99.9％且总产率为78％。游离药物水平高于1％的阈值：所述ADC在Amicon Ultra-15上浓缩，在Sephadex G25上、在缓冲液B pH 6.5+5％NMP中提纯，并在0.22μm PVDF过滤器上过滤，得到17.25mg的实施例19，其为无色澄清溶液，浓度为1.50mg/mL，DAR为2.55(HRMS)，单体纯度为99.7％且总产率为59％。
SEC-HRMS:m/z＝149405(裸mAb)；m/z＝150602(D1)；m/z＝151800(D2)；m/z＝152997(D3)；m/z＝154196(D4)；m/z＝155393(D5)；m/z＝156589(D6)；m/z＝157791(D7)。
合成实施例20：戊二酰基-Val-葡糖胺Gln-C52苄胺
Figure BDA0002354666740001971
Figure BDA0002354666740001981
化合物51：2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酸(S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
向Fmoc-Val-OH(CAS号[68858-20-8],5g,14.44mmol)的THF(40mL)溶液中添加NHS(1.71g,14.44mmol)和DCC(2.98g,14.44mmol)。在室温搅拌该反应介质5小时，然后添加0.2当量的NHS和DCC，并在室温持续搅拌4小时。过滤该介质，用THF(2x 25mL)洗涤固体两次并真空浓缩滤液，得到6.5g的化合物51(定量产率)，其为白色蛋糖霜状物(meringue)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.03(d,J＝6.9Hz,6H)；2.20(m,1H)；2.81(s,4H)；4.18to 4.39(m,4H)；7.32(m,2H)；7.42(m,2H)；7,74(m,2H)；7.90(d,J＝7.6Hz,2H)；8.12(d,J＝8.5Hz,1H)。
化合物52：(S)-4-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-(叔丁氧基)-5-氧代戊酸
向H-Glu-OtBu(CAS号[45120-30-7],3.14g,15.16mmol)和碳酸氢钠(1.40g,16.46mmol)的H2O(60mL)溶液中添加化合物51(6.3g,14.43mmol)的THF(240mL)溶液。搅拌该反应介质16小时在室温，并真空浓缩。粗产物在H2O(700mL)中稀释形成胶体，搅拌15分钟后用Et2O(200mL)萃取2次。该水性悬浮液被5N HCl酸化至pH 3，并用DCM(4x 200mL)萃取。合并的有机相经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩，得到7.98g的化合物52(定量产率)，其为白色蛋糖霜状物。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.87(d,J＝6.9Hz,3H)；0.90(d,J＝6.9Hz,3H)；1.38(s,9H)；1.77(m,1H)；1.91(m,1H)；1.98(m,1H)；2.28(m,2H)；3.90(dd,J＝7.1和9.1Hz,1H)；4.10至4.37(m,4H)；7.32(m,2H)；7.38(d,J＝9.1Hz,1H)；7.41(m,2H)；7.73(m,2H)；7.89(d,J＝7.6Hz,2H)；8.20(d,J＝7.5Hz,1H)；12.21(宽的m,1H)。
化合物53：2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)戊二酸(S)-1-叔丁基酯5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯
向化合物52(500mg,953.1μmol)的THF(30mL)溶液中添加DIEA(320μL,1.9mmol)、DSC(498.3mg,1.91mmol)和DMF(6mL)。在室温搅拌该反应介质过夜，然后将30mg的DSC添加至介质中并持续搅拌24小时。真空浓缩该反应介质，与甲苯共蒸发两次，并经快速色谱在50g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/iPrOH)，得到506mg的化合物53(85％)，其为白色油状物。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.89(d,J＝6.9Hz,3H)；0.91(d,J＝6.9Hz,3H)；1.39(s,9H)；1.75至2.11(m,3H)；2.73(m,2H)；2.80(s,4H)；3.89(dd,J＝7.3和9.1Hz,1H)；4.20至4.38(m,4H)；7.32(m,2H)；7.42(m,3H)；7.75(m,2H)；7.80(m,2H)；8.31(d,J＝7.5Hz,1H)。
化合物54：(2S,3R,4R,5R)-1-氨基-6-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)己烷-2,3,4,5-四醇
将D-葡糖胺(CAS号[488-43-7],200mg,1.10mmol)在DMF(2mL)的悬浮液在0℃冷却，然后添加咪唑(82.0mg,1.19mmol)和叔丁基二苯基氯硅烷(334.4mg,1.19mmol)。在0℃搅拌该反应介质1小时，用H2O(20mL)淬灭并持续搅拌10分钟。该介质用EtOAc(3x 50mL)萃取，合并的有机相经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，与甲苯共蒸发两次，并经反相快速色谱在31g的C18-改性的硅胶上提纯(梯度洗脱H2O/MeCN)，得到218mg的化合物54(47％)，其为白色泡沫。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.00(s,9H)；2.62(dd,J＝6.3和12.7Hz,1H)；2.74(dd,J＝4.5和12.7Hz,1H)；3.40(部分遮盖的m,1H)；3.49(m,1H)；3.55至3.72(m,3H)；3.88(m,1H)；4.48(宽的m,4H)；7.42(m,6H)；7.69(m,4H)。
化合物55：2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-(((2S,3R,4R,5R)-6-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-2,3,4,5-四羟基己基)氨基)-5-氧代戊酸(S)-叔丁基酯
向化合物53(300mg,482.6μmol)的DMF(2mL)溶液中添加化合物54(214.6mg,511.5μmol)的DMF(3mL)溶液。在室温搅拌该反应介质1小时，真空浓缩，与甲苯共蒸发(3x)并经快速色谱在25g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到270mg的化合物55(60％)，其为白色泡沫。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.87(d,J＝6.9Hz,3H)；0.90(d,J＝6.9Hz,3H)；0.99(s,9H)；1.38(s,9H)；1.80(m,1H)；1.90(m,1H)；1.98(m,1H)；2.17(t,J＝7.7Hz,2H)；3.03(m,1H)；3.26(m,1H)；3.49(m,1H)；3.52至3.60(m,4H)；3.83(m,1H)；3.92(dd,J＝7.3和9.2Hz,1H)；4.08(m,1H)；4.18至4.31(m,4H)；4.33(d,J＝6.4Hz,1H)；4.63(d,J＝5.8Hz,1H)；4.78(d,J＝4.7Hz,1H)；7.31(m,2H)；7.36(d,J＝9.2Hz,1H)；7.41(m,8H)；7.67(m,4H)；7.69至7.76(m,3H)；7.89(m,2H)；8.23(d,J＝7.5Hz,1H)。
化合物56：(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-5-(((2S,3R,4R,5R)-6-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-2,3,4,5-四羟基己基)氨基)-5-氧代戊酸
化合物55在DCM中稀释形成胶体，将其在0℃冷却，然后在0℃添加的DCM/TFA的1:1混合物。在0℃搅拌该反应介质30分钟，然后室温搅拌5小时，真空浓缩并与甲苯共蒸发(3x)，得到白色固体，将其在iPr2O中研磨，过滤，用Et2O(5mL)洗涤两次，干燥并最终经快速色谱在15g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到149mg的化合物56，其为白色固体(59％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.84(d,J＝6.8Hz,3H)；0.86(d,J＝6.8Hz,3H)；0.99(s,9H)；1.82(m,1H)；1.90(m,1H)；2.03至2.14(m,3H)；3.00(m,1H)；3.25(m,1H)；3.48(m,1H)；3.65(m,4H)；3.82至3.92(m,3H)；4.20至4.37(m,3H)；4.40(d,J＝6.0Hz,1H)；4.45(d,J＝6.0Hz,1H)；4.80(m,1H)；5.12(m,1H)；7.32(m,2H)；7.41(m,8H)；7.55(m,2H)；7.65至7.82(m,7H)；7.89(d,J＝8.0Hz,2H)。LCMS(A):m/z＝868[M-H]-；m/z＝870[M+H]+；tR＝1.55min。
化合物57：(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)-N5-((2S,3R,4R,5R)-6-((叔丁基二苯基甲硅烷基)氧基)-2,3,4,5-四羟基己基)-N1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环-十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)-戊二酰胺
向化合物56(67.3mg,77.3μmol)和(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(氨基甲基)苯基)氧杂环丙-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六烷-13-烯-2,5,9,12-四酮(其合成如WO2011001052中化合物77所述，45mg,64.5μmol)的DMF和DCM(10mL)溶液中添加HOBt(11.5mg,85.1μmol)和EDC(11.4mg,70.9μmol)。在室温搅拌该反应介质3小时，然后用H2O淬灭(15mL)并持续搅拌10分钟。水相用DCM(3x 20mL)萃取，合并的有机相经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并经快速色谱在5g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到64mg的Fmoc-保护的二肽-念珠藻素中间体，其为白色固体(64％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.76(d,J＝6.8Hz,6H)；0.82(d,J＝7.0Hz,3H)；0.86(d,J＝7.0Hz,3H)；0.99(s,12H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.10(s,3H)；1.30(m,1H)；1.55(m,2H)；1.80(m,2H)；1.90(m,1H)；2.00(m,1H)；2.14(m,2H)；2.26(m,1H)；2.68(m,2H)；2.92至3.08(m,4H)；3.22至3.38(部分遮盖的m,2H)；3.49(m,1H)；3.58至3.69(m,4H)；3.81(s,3H)；3.82(m,1H)；3.87(d,J＝2.0Hz,1H)；3.91(m,1H)；4.18至4.38(m,9H)；4.68(m,1H)；4.82(m,1H)；4.90(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；5.10(m,1H)；5.79(宽的d,J＝16.0Hz,1H)；6.47(ddd,J＝4.7,10.5和16.0Hz,1H)；7.05(d,J＝8.0Hz,1H)；7.17(dd,J＝2.5和8.0Hz,1H)；7.20至7.27(m,5H)；7.29(d,J＝2.3Hz,1H)；7.31(t,J＝7.8Hz,2H)；7.34至7.48(m,7H)；7.65至7.79(m,9H)；7.90(d,J＝7.8Hz,2H)；8.10(d,J＝8.3Hz,1H)；8.38(d,J＝8.0Hz,1H)；8.41(t,J＝6.5Hz,1H)。LCMS(A):ES m/z＝775[M+2H]2+；m/z＝1549[M+H]+；m/z＝1593[M-H+HCO2H]-；tR＝1.78min。
向该中间体(62mg,40.0μmol)的DCM(8mL)溶液中添加哌啶(59.8μL,600.0μmol)。在室温搅拌该反应介质4小时，真空浓缩并经快速色谱在5g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到49mg的化合物57，其为白色粘油(92％)。
化合物58：
(6R,7R,8R,9S,15S,18S)-15-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)-6,7,8,9-四羟基-18-异丙基-2,2-二甲基-12,17,20-三氧代-3,3-二苯基-4-氧杂-11,16,19-三氮杂-3-硅二十四烷-24-酸
向化合物57(23mg,17.3μmol)的DCM(3mL)溶液中添加戊二酸酐(2.22mg,19.1μmol)的DCM(2mL)溶液。在室温搅拌该反应介质3小时，部分真空浓缩(低至2mL)并经快速色谱在5g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到17mg的化合物58，其为白色粘油(68％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.80(裂分d,J＝6.8Hz,6H)；0.6(裂分d,J＝7.0Hz,6H)；0.99(s,12H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.32(m,1H)；1.52至1.60(m,2H)；1.72至2.00(m,7H)；2.08(m,1H)；2.13(m,1H)；2.20至2.37(m,3H)；2.69(m,2H)；2.92至3.07(m,4H)；3.20(m,1H)；3.30(遮盖的m,1H)；3.45(m,1H)；3.55至3.70(m,4H)；3.80(s,3H)；3.83(m,1H)；3.87(d,J＝2.3Hz,1H)；4.07至5.00(m,11H)；5.10(m,1H)；5.80(dd,J＝2.0和15.8Hz,1H)；6.47(m,1H)；7.04(d,J＝8.6Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.20至7.28(m,5H)；7.29(d,J＝2.3Hz,1H)；7.41(m,6H)；7.68(m,4H)；8.05(d,J＝7.9Hz,1H；8.23(t,J＝6.5Hz,1H)；8.30至8.60(m,3H)。LCMS(A):ES m/z＝721[M+2H]2+；m/z＝1439[M-H]-；m/z＝1441[M+H]+；tR＝1.52min。
实施例20：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基-苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基)-1,5-二氧代-5-(((2S,3R,4R,5R)-2,3,4,5,6-五羟基己基)-氨基)戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-5-氧代戊酸
将化合物57(46mg,31.9μmol)的THF(3mL)溶液在0℃冷却，然后在0℃逐滴添加1MTBAF的THF溶液(35.1μL,35.1μmol)。在0℃搅拌该反应介质2小时，用H2O(100μL)淬灭，搅拌10分钟并用DCM(5mL)萃取。将有机相经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩：LCMS分析显示存在残余的起始材料。将粗产物溶于DCM(3mL)中，将该溶液在0℃冷却，然后在0℃逐滴添加1MTBAF的THF溶液(35.1μL,35.1μmol)。在0℃搅拌该反应介质3小时，用H2O(100μL)淬灭，搅拌10分钟并用DCM(20mL)萃取。将有机相经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并经快速色谱在5g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O至MeOH)，然后经反相快速色谱在3g的C18-改性的硅胶上提纯(梯度洗脱H2O/MeCN)，得到17mg的实施例20，其为白色粘油(44％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.80(裂分d,J＝6.8Hz,6H)；0.6(裂分d,J＝7.0Hz,6H)；0.99(s,12H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.32(m,1H)；1.52至1.60(m,2H)；1.72至2.00(m,7H)；2.08(m,1H)；2.13(m,1H)；2.20至2.37(m,3H)；2.69(m,2H)；2.92至3.07(m,4H)；3.20(m,1H)；3.30(遮盖的m,1H)；3.45(m,1H)；3.55至3.70(m,4H)；3.80(s,3H)；3.83(m,1H)；3.87(d,J＝2.3Hz,1H)；4.07至5.00(m,11H)；5.10(m,1H)；5.80(dd,J＝2.0和15.8Hz,1H)；6.47(m,1H)；7.04(d,J＝8.6Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.20至7.28(m,5H)；7.29(d,J＝2.3Hz,1H)；7.41(m,6H)；7.68(m,4H)；8.05(d,J＝7.9Hz,1H)；8.23(t,J＝6.5Hz,1H)；8.30至8.60(m,3H)。LCMS(A):ES m/z＝602[M+2H]2+；m/z＝1201[M-H]-；m/z＝1203[M+H]+；tR＝1.1min.
合成实施例21至23：戊二酰基-Val-PEG4Lys-C52苄胺、戊二酰基-Val-PEG4Lys- C52苄胺的NHS酯及相应的ADC
Figure BDA0002354666740002041
Figure BDA0002354666740002051
化合物59：(S)-20-((叔丁氧基羰基)氨基)-14-氧代-2,5,8,11-四氧杂-15-氮杂二十一烷-21-酸
在磁力搅拌下，向(S)-6-氨基-2-((叔丁氧基羰基)氨基)己酸(CAS号[13734-28-6],73.9mg,300μmol)的THF(300μL)溶液中添加2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(CAS号[622405-78-1],100mg,300μmol)、DIEA(53.3μL,300μmol)和H2O(100μL)。在室温搅拌该反应介质过夜，然后真空浓缩。该粗介质经快速色谱在5g的C18-接枝的硅胶上提纯(梯度洗脱H2O/CH3CN)，得到81mg的化合物59(58％)。LCMS(B):ES m/z＝463[M-H]-；m/z＝465[M+H]+；tR＝0.86min。
化合物60：(S)-20-氨基-14-氧代-2,5,8,11-四氧杂-15-氮杂二十一烷-21-酸盐酸盐
在磁力搅拌下，向化合物59(150.6mg,324.2μmol)添加4M HCl的1,4-二噁烷溶液(1mL)。在室温搅拌该反应介质过夜，然后真空浓缩。添加EtOAc且将混合物真空浓缩，得到156mg的化合物60(定量产率)。
LCMS(B):ES m/z＝508[M-H]-；m/z＝510[M+H]+；tR＝1.23min。
化合物61：(S)-20-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-14-氧代-2,5,8,11-四氧杂-15-氮杂二十一烷-21-酸
在磁力搅拌下，向化合物60(130mg,275μmol)的水(0.5mL)溶液中添加NaHCO3(55.6mg,661μmol)，然后添加THF(1.5mL)中的2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酸(S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(CAS号[130878-68-1],144.4mg,330.8μmol)。在室温搅拌该反应介质过夜。然后，将NaHCO3(30mg)、THF(500μL)、H2O(200μL)和2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-氨基)-3-甲基丁酸(S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(28mg)添加至该反应介质。3个小时后，真空浓缩该介质，然后用H2O(20mL)和约2-3mL的饱和Na2CO3水溶液稀释。水相用EtOAc(20mL)萃取2次。用盐水洗涤合并的有机相(20mL)，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。混合物经快速色谱在15g的硅胶上提纯(洗脱85:1:0.5v/v EtOAc/MeOH/H2O)。浓缩后，粗产物用甲苯稀释，并真空浓缩，得到75.6mg的化合物61(40％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.85(d,J＝7.1Hz,3H)；0.87(d,J＝7.1Hz,3H)；1.21至1.40(m,4H)；1.50至1.73(m,2H)；2.01(m,1H)；2.27(t,J＝6.6Hz,2H)；2.98(m,2H)；3.23(s,3H)；3.41(m,2H)；3.43至3.52(m,10H)；3.57(t,J＝6.6Hz,2H)；3.88(m,1H)；4.01(m,1H)；4.19至4.34(m,3H)；7.31(m,2H)；7.38至7.46(m,3H)；7.70至7.91(m,6H)；12.51(m,1H)。LCMS(A):ES m/z＝684[M-H]-；m/z＝686[M+H]+；tR＝1.2min。
化合物62：N-((S)-5-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨
基)-6-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基)-6-氧代己基)-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-酰胺
在磁力搅拌和Ar下，向化合物61(70mg,102.1μmol)中添加(E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-(4-氨基甲基-苯基)-环氧乙烷基]-乙基}-10-(3-氯-4-甲氧基-苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-1,4-二氧杂-8,11-二氮杂-环十六烷-13-烯-2,5,9,12-四酮(其合成如WO2011001052中化合物77所述，76.2mg,109.1μmol)的THF(3mL)溶液，然后添加HOBt(17.7mg,131μmol)和EDC(23μL,131μmol)。在室温搅拌该反应介质过夜。然后，将哌啶(32.8μL,327.4μmol)添加至介质中，并保持搅拌4小时30分钟。此时，真空浓缩该介质，用DMA稀释，并经快速色谱在15g的C18-接枝的硅胶上提纯(梯度洗脱H2O/CH3CN)，得到66mg的化合物62(53％)。
LCMS(B):ES m/z＝572；m/z＝1187[M-H+HCO2H]-；tR＝1.18min。
实施例21：(20S,23S)-20-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)-23-异丙基-14,22,25-三氧代-2,5,8,11-四氧杂-15,21,24-三氮杂二十九烷-29-酸
在磁力搅拌下，向化合物62(66mg,57.7μmol)的DMF(4mL)溶液中添加戊二酸酐(11.85mg,103.8μmol)。在室温搅拌该反应介质2小时。此时，真空浓缩该介质并经快速色谱在10g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到48.6mg的实施例21(80％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.81(m,6H)；0.85(d,J＝7.5Hz,3H)；0.87(d,J＝7.5Hz,3H)；0.98(s,3H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.10(s,3H)；1.16至1.44(m,5H)；1.55至1.79(m,7H)；1.90至2.10(m,3H)；2.14至2.29(m,3H)；2.31(t,J＝6.7Hz,2H)；2.66至2.78(m,2H)；2.85至2.99(m,4H)；3.05(m,1H)；3.23(s,3H)；3.32(部分遮盖的m,1H)；3.42(m,2H)；3.44至3.51(m,10H)；3.57(m,2H)；3.81(s,3H)；3.88(d,J＝1.6Hz,1H)；4.04至4.25(m,4H)；4.35(m,1H)；4.94(m,1H)；5.10(m,1H)；5.80(d,J＝15.0Hz,1H)；6.45(ddd,J＝4.0,11.2和15.0Hz,1H)；7.04(d,J＝8.6Hz,1H)；7.19(dd,J＝1.7和8.6Hz,1H)；7.22(d,J＝8.4Hz,2H)；7.28(d,J＝8.4Hz,2H)；7.30(d,J＝1.7Hz,1H)；7.32(宽的m,1H)；7.75至9.42(宽的m,5H)；12.06(宽的m,1H)。LCMS(A):ES m/z＝629[M+2H]2+；m/z＝1255[M-H]-；m/z＝1257[M+H]+；tR＝1.26min。
实施例22：20-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)-23-异丙基-14,22,25-三氧代-2,5,8,11-四氧杂-15,21,24-三氮杂二十九烷-29-酸(20S,23S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
将甲苯(10mL)添加至实施例21(46mg,36.6μmol)中，并真空浓缩，然后用THF(5mL)、DCM(2mL)和DMF(200μL)稀释。然后，添加DSC(11.5mg,43.9μmol)，随后添加DIEA(18.5μL,109.7μmol)。在室温搅拌该反应介质4小时。此时，添加MeTHF(7mL)和H2O(3mL)，水相用MeTHF(5mL)萃取2次。合并的有机相用H2O(3mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。该粗介质经快速色谱在4g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/iPrOH)，得到33.3mg的实施例22(67％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.78(d,J＝6.6Hz,6H)；0.83(d,J＝7.1Hz,3H)；0.84(d,J＝7.1Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝6.9Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.20至1.43(m,5H)；1.50至1.69(m,4H)；1.76至1.87(m,3H)；1.98(m,1H)；2.21至2.35(m,5H)；2.62至2.73(m,4H)；2.81(s,4H)；2.94至3.04(m,5H)；3.23(s,3H)；3.32(部分遮盖的m,1H)；3.42(m,2H)；3.44至3.51(m,10H)；3.58(t,J＝6.4Hz,2H)；3.81(s,3H)；3.87(d,J＝1.1Hz,1H)；4.17(dd,J＝7.3和7.8Hz,1H)；4.21至4.31(m,4H)；4.90(m,1H)；5.10(m,1H)；5.79(d,J＝15.1Hz,1H)；6.47(ddd,J＝3.5,11.5和15.1Hz,1H)；7.05(d,J＝8.5Hz,1H)；7.17(dd,J＝1.6和8.5Hz,1H)；7.20至7.25(m,5H)；7.28(d,J＝1.6Hz,1H)；7.79(t,J＝5.7Hz,1H)；7.91(d,J＝8.5Hz,1H)；7.95(d,J＝8.3Hz,1H)；8.37(m,2H)。LCMS(C):ES m/z＝677.5[M+2H]2+；m/z＝1354[M+H]+；m/z＝1399[M-H+HCO2H]-；tR＝4.41min。
实施例23：hu2H11_R35-74-Ex22
使用前述的一般方法制备实施例23。44.64mg的hu2H11_R35-74与209.2μL的10mM实施例22的DMA(7当量)溶液反应3小时30分钟。在Sephadex G25上、在缓冲液B pH 6.5+5％NMP中提纯且在Amicon Ultra-15上浓缩后，获得36.6mg的实施例23，其为无色澄清溶液，浓度为1.83mg/mL，DAR为3.6(HRMS)，单体纯度为98.8％且总产率为82％。游离药物水平高于1％的阈值：所述ADC在Amicon Ultra-15上浓缩，在Sephadex G25上、在缓冲液B pH 6.5+5％NMP中提纯，并在0.22μm PVDF过滤器上过滤，得到32.6mg的实施例23，其为无色澄清溶液，浓度为1.63mg/mL，DAR为3.3(HRMS)，单体纯度为98.3％且总产率为73％。
SEC-HRMS:m/z＝149411(裸mAb)；m/z＝150649(D1)；m/z＝151889(D2)；m/z＝153129(D3)；m/z＝154369(D4)；m/z＝155608(D5)；m/z＝156850(D6)；m/z＝158091(D7)；m/z＝159331(D8)；m/z＝160583(D9)。
合成实施例24至26：戊二酰基-Val-PEG24Lys-C52苄胺、戊二酰基-Val-PEG24Lys- C52苄胺的NHS酯及相应的ADC
Figure BDA0002354666740002101
化合物63：(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酸
在磁力搅拌下，向H-Lys(Boc)-OH(CAS号[2418-95-3],310mg,1.26mmol)和NaHCO3(105mg,1.25mmol)的水(5mL)和THF(5mL)溶液中逐滴添加2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酸(S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(CAS号[68858-20-8],310mg,1.15mmol)的THF(15mL)溶液。在室温搅拌该反应介质3小时。此时，真空浓缩该反应介质，然后用水(200mL)稀释，用适量5N HCl水溶液酸化，并用DCM(2x 200mL)萃取。合并的有机相经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到510mg的化合物63(53％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.85(d,J＝6.8Hz,3H)；0.87(d,J＝6.8Hz,3H)；1.20至1.39(m,4H)；1.34(s,9H)；1.48至1.73(m,2H)；1.99(m,1H)；2.86(m,2H)；3.89(dd,J＝7.7和8.4Hz,1H)；4.08(m,1H)；4.17至4.32(m,3H)；6.72(宽的m,1H)；7.32(m,2H)；7.38至7.46(m,3H)；7.74(m,2H)；7.89(d,J＝7.6Hz,2H)；8.00(宽的m,1H)；12.54(宽的s,1H)。LCMS(A):ES m/z＝344；m/z＝468；m/z＝566[M-H]-；m/z＝568[M+H]+；tR＝1.41min。
化合物64：(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-6-氨基己酸盐酸盐
向化合物63(340mg,599μmol)添加4M HCl的1,4-二噁烷溶液，在室温搅拌该反应介质1小时。此时，真空浓缩该反应介质，然后添加Et2O并过滤。所得白色固体经快速色谱在15g的硅胶上提纯(洗脱12:3:0.5v/v/v DCM/MeOH/NH4OH)，得到190mg的化合物64(63％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.83(d,J＝6.6Hz,3H)；0.85(d,J＝6.6Hz,3H)；1.21至1.70(m,6H)；2.04(m,1H)；2.71(t,J＝7.1Hz,2H)；3.84(dd,J＝6.7和8.7Hz,1H)；3.91(m,1H)；4.18至4.35(m,3H)；7.22(宽的m,3H)；7.33(m,2H)；7.42(t,J＝7.6Hz,2H)；7.54(d,J＝9.0Hz,1H)；7.69(宽的m,1H)；7.74(m,2H)；7.89(d,J＝7.6Hz,2H)。LCMS(A):ES m/z＝244；m/z＝466[M-H]-；m/z＝468[M+H]+；tR＝0.81min。
化合物65：(S)-80-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-74-氧代
-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂八十一烷-81-酸
向化合物64(130mg,258.0μmol)的THF(20mL)溶液中添加碳酸氢钠(50mg,589.2μmol)的H2O(8mL)溶液和MEO-DPEG(24)-NHS(CAS号[756525-94-7],400mg,329.4μmol)。在室温搅拌该反应介质20小时，部分真空浓缩然后用H2O(10mL)稀释，用IR-120(H)Amberlite树脂(CAS号[78922-04-0])酸化至pH 3，过滤，真空浓缩，并经3次连续的快速色谱在40g、25g和12g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到214mg的化合物65，其为白色粘油(53％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.86(d,J＝7.0Hz,3H)；0.89(d,J＝7.0Hz,3H)；1.22至1.40(m,4H)；1.58(m,1H)；1.67(m,1H)；1.99(m,1H)；2.28(t,J＝6.6Hz,2H)；2,99(m,2H)；3.23(s,3H)；3.40至3.70(m,92H)；3.56(t,J＝6.6Hz,2H)；3.90(m,1H)；4.08(宽的m,1H)；4.19至4.31(m,3H)；7.31(宽的t,J＝7.8Hz,2H)；7.41(宽的t,J＝7.8Hz,3H)；7.73(t,J＝7.8Hz,2H)；7.76(m,1H)；7.89(d,J＝7.8Hz,2H)；8.00(m,1H)；12.53(m,1H)。LCMS(D):ES m/z＝794[M+H+Na]2+；m/z＝1567[M+H]+；tR＝2.9min。
化合物66：N-((S)-5-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨
基)-6-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)-氨基)-6-氧代己
基)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂七十四烷-74-酰胺
向(E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-(4-氨基甲基-苯基)-环氧乙烷基]-乙基}-10-(3-氯-4-甲氧基-苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-1,4-二氧杂-8,11-二氮杂-环十六烷-13-烯-2,5,9,12-四酮(其合成如WO2011001052中化合物77所述，71mg,101.7μmol)的DMF(5mL)溶液中添加化合物65(214mg,136.6μmol)的DMF(5mL)溶液、HOBt(22mg,156.3μmol)和EDC(27μL,152.5μmol)。在室温搅拌该反应介质3小时，然后添加哌啶(91μL,915.3μmol)。在室温持续搅拌1小时30分钟，然后真空浓缩该反应介质，并经两次连续的快速色谱在25g和12g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到58mg的化合物66，其为无色粘油(28％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.76(d,J＝7.0Hz,3H)；0.78(d,J＝6.8Hz,6H)；0.88(d,J＝7.0Hz,3H)；0.99(s,3H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.25至1.41(m,5H)；1.51至1.70(m,4H)；1.80(m,1H)；1.93(m,1H)；2.25(m,1H)；2.28(t,J＝6.7Hz,2H)；2.55(宽的m,2H)；2.68(m,2H)；2.99(m,5H)；3.23(s,3H)；3.32(遮盖的m,1H)；3.40至3.55(m,92H)；3.58(t,J＝6.7Hz,2H)；3.80(s,3H)；3.88(d,J＝2.3Hz,1H)；4.20至4.35(m,4H)；4.91(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；5.10(m,1H)；5.80(dd,J＝2.0和15.8Hz,1H)；6.46(ddd,J＝4.7,10.5和15.8Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.17(dd,J＝2.4et 8.6Hz,1H)；7.22(m,5H)；7.29(d,J＝2.4Hz,1H)；7.79(t,J＝6.7Hz,1H)；8.00(d,J＝8.8Hz,1H)；8.36(d,J＝8.0Hz,1H)；8.47(t,J＝6.2Hz,1H)。LCMS(D):ES m/z＝1013[M+2H]2+；m/z＝2025[M+H]+；tR＝2.64/2.62min(85/15异构体混合物)。
实施例24：(80S,83S)-80-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)-83-异丙基-74,82,85-三氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,81,84-三氮杂八十九烷-89-酸
向化合物66(58mg,28.7μmol)的DCM(7mL)溶液中添加戊二酸酐(5.85mg,48.7μmol)。在室温搅拌该反应介质2小时，真空浓缩并经快速色谱在4g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到35mg的实施例24，其为白色粘油(57％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.78(d,J＝6.8Hz,6H)；0.82(d,J＝7.0Hz,3H)；0.84(d,J＝7.0Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.18至1.41(m,5H)；1.50至1.75(m,6H)；1.80(m,1H)；1.98(m,1H)；2.15至2.27(m,5H)；2.30(t,J＝6.7Hz,2H)；2.69(m,2H)；2.98(m,5H)；3.23(s,3H)；3.32(遮盖的m,1H)；3.40至3.65(m,94H)；3.80(s,3H)；3.87(d,J＝2,3Hz,1H)；4.14(m,1H)；4.20至4.33(m,4H)；4.90(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；5.10(m,1H)；5.79(d,J＝15.8Hz,1H)；6.47(ddd,J＝4.7,10.5和15.8Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.24(m,5H)；7.29(d,J＝2.4Hz,1H)；7.80(t,J＝6.0Hz,1H)；7.86(d,J＝8.8Hz,1H)；7.92(d,J＝8.0Hz,1H)；8.37(m,2H)；12.10(宽的m,1H)。LCMS(D):ES m/z＝1069.5[M+2H]2+；m/z＝2138[M+H]+；tR＝2.96/2.93min(85/15异构体混合物)。
实施例25：80-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环-十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)-83-异丙基-74,82,85-三氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,81,84-三氮杂八十九烷-89-酸(80S,83S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
向实施例24(35mg,16.4μmol)的THF(3mL)溶液中添加DSC(4.28mg,16.4μmol)和DIEA(2.7μL,16.4μmol)。在室温搅拌该反应介质20小时，真空浓缩并经快速色谱在4g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/iPrOH)，得到12.0mg的实施例25，其为白色粘油(33％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.78(d,J＝6.8Hz,6H)；0.82(d,J＝7.0Hz,3H)；0.84(d,J＝7.0Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.15至1.40(m,5H)；1.50至1.71(m,4H)；1.75至1.86(m,3H)；1.97(m,1H)；2.18至2.32(m,5H)；2.67(m,4H)；2.80(s,4H)；2.98(m,5H)；3.22(s,3H)；3.32(遮盖的m,1H)；3.40至3.77(m,94H)；3.80(s,3H)；3.88(d,J＝2.3Hz,1H)；4.16(m,1H)；4.20至4.32(m,4H)；4.90(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；5.10(m,1H)；5.78(dd,J＝2.0和15.8Hz,1H)；6.47(ddd,J＝4.7,10.5和15.8Hz,1H)；7,05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.24(m,5H)；7.29(d,J＝2.4Hz,1H)；7.79(t,J＝6.0Hz,1H)；7.90(d,J＝8.8Hz,1H)；7.94(d,J＝8.0Hz,1H)；8.36(m,2H)。LCMS(D):ES m/z＝746；m/z＝2235[M+H]+；tR＝3.08/3.06min(89/11异构体混合物)。
实施例26：hu2H11_R35-74-Ex25
使用前述的一般方法制备实施例26。55.8mg的hu2H11_R35-74与261.6μL的10mM实施例25的DMA(7当量)溶液反应3小时15分钟，然后添加131μL的10mM实施例25的DMA(3.5当量)溶液5小时30分钟。在4℃储存过夜后，在Superdex 200pg上、在缓冲液B pH 6.5+20％NMP中提纯，在Amicon Ultra-15上浓缩，在Sephadex G25上、在缓冲液B pH 6.5+5％NMP中缓冲交换，在Amicon Ultra-15上浓缩，并在0.22μm PVDF过滤器上过滤，获得33.35mg的实施例26，其为无色澄清溶液，浓度为2.9mg/mL，DAR为3.9(HRMS)，单体纯度为100％且总产率为60％。
SEC-HRMS:m/z＝151487(D1)；m/z＝153615(D2)；m/z＝155740(D3)；m/z＝157863(D4)；m/z＝159981(D5)；m/z＝162112(D6)；m/z＝164240(D7)；m/z＝166356(D8)。
合成实施例27至29：戊二酰基-Val-PEG24Lys-氮杂-念珠藻素苄胺、戊二酰基- Val-PEG24Lys-氮杂-念珠藻素苄胺的NHS酯及相应的ADC
Figure BDA0002354666740002161
化合物67：N-((S)-5-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨
基)-6-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基)-6-氧代己
基)-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂七十四烷-74-酰胺
向(3S,7S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(氨基甲基)苯基)-氧杂环丙-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环-十六烷-13-烯-2,5,9,12-四酮(其可如PCT/EP2016/076603中所述从(3S)-3-氨基-2,2-二甲基丁酸甲基酯开始制备，[MFCD09256689]，75mg,103.4μmol)的DMF(5mL)溶液中添加化合物65(211mg,134.7μmol)的DMF(5mL)溶液、HOBt(21mg,155.4μmol)和EDC(20μL 123.0μmol)。在室温搅拌该反应介质4小时，然后添加哌啶(95μL,961.9μmol)；在室温持续搅拌2小时，然后真空浓缩该反应介质并经快速色谱在25g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到132mg的化合物67，其为无色油状物(62％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.76(d,J＝7.0Hz,3H)；0.87(m,15H)；1.00(s,3H)；1.03(d,J＝7.1Hz,3H)；1.15至1.40(m,5H)；1.18(s,3H)；1.46至2.00(m,8H)；2.25(m,1H)；2.28(t,J＝6.7Hz,2H)；2.60(m,1H)；2.69(dd,J＝11.2和14,5Hz,1H)；2.91(dd,J＝2.3和7；5Hz,1H)；2.92至3.04(m,4H)；3.23(s,3H)；3.34至3.77(m,95H)；3.80(s,3H)；3.88(d,J＝2.3Hz,1H)；4.08(m,2H)；4.20至4.34(m,3H)；5.04(m,1H)；5.78(dd,J＝2.0和15,8Hz,1H)；6.44(ddd,J＝4.7,10.5和15.8Hz,1H)；7.02(d,J＝8.6Hz,1H)；7.17至7.25(m,5H)；7.32(d,J＝2.4Hz,1H)；7.78(t,J＝6.0Hz,1H)；7.85(d,J＝8.0Hz,1H)；7.92(d,J＝7.0Hz,1H)；8.00(d,J＝8.8Hz,1H)；8.40(t,J＝7.5Hz,1H)；8.46(t,J＝6.0Hz,1H)。LCMS(D):ES m/z＝2051[M+H]+；tR＝2.57/2.55min(异构体混合物95/5)。
实施例27：(80S,83S)-80-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)-83-异丙基-74,82,85-三氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,81,84-三氮杂八十九烷-89-酸
向化合物67(132mg,64.3μmol)的DCM(10mL)溶液中添加戊二酸酐(9mg,78.9μmol)。在室温搅拌该反应介质2小时，真空浓缩，并经两次连续的快速色谱在4g和12g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到71mg的实施例27，其为白色粘油(51％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.80至0.90(m,18H)；1.00(s,3H)；1.03(d,J＝7.1Hz,3H)；1.15至1.42(m,5H)；1.18(s,3H)；1.51至1.74(m,4H)；1.80(m,1H)；1.98(m,2H)；2.15至2.32(m,7H)；2.60(m,1H)；2.70(dd,J＝11.2和14.5Hz,1H)；2.91(dd,J＝2.3和7.5Hz,1H)；2.95(dd,J＝3.4和14.5Hz,1H)；3.00(m,2H)；3.24(s,3H)；3.40至3.67(m,95H)；3,80(s,3H)；3.90(d,J＝2.3Hz,1H)；4.00至4.34(m,6H)；5.04(m,1H)；5.80(dd,J＝2.0和15.8Hz,1H)；6.44(ddd,J＝4.7,10.5和15.8Hz,1H)；7.02(d,J＝8.6Hz,1H)；7,17至7,25(m,5H)；7.32(d,J＝2.4Hz,1H)；7.80(t,J＝6.0Hz,1H)；7.86(d,J＝8.6Hz,2H)；7.92(t,J＝6.5Hz,2H)；8.37(t,J＝6.0Hz,1H)；8.41(t,J＝7.5Hz,1H)；12,00(m,1H)。LCMS(D):ES m/z＝722；m/z＝2165[M+H]+；tR＝2.95/2.92min(异构体混合物95/5)。
实施例28：(80S,83S)-80-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂-环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)-83-异丙基
-74,82,85-三氧代
-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,81,84-三氮杂八十九烷-89-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
向实施例27(33mg,15.2μmol)的THF(3mL)溶液中添加DSC(4mg,15.6μmol)和DIEA(2.55μL,15.4μmol)。在室温搅拌该反应介质20小时，然后添加DSC(1mg,3.9μmol)和DIEA(1μL,6.0μmol)。在室温搅拌该反应介质2小时，真空浓缩并经快速色谱在4g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/iPrOH/MeCN)，得到11mg的实施例28，其为白色粘油(32％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.80至0.90(m,18H)；1.00(s,3H)；1.03(d,J＝7.1Hz,3H)；1.12至1.42(m,5H)；1.19(s,3H)；1.55(m,1H)；1.65(m,1H)；1.82(m,3H)；1.96(m,2H)；2.28(m,3H)；2.67(m,4H)；2.80(s,4H)；2.91(dd,J＝2.3和Hz,1H)；2.95(dd,J＝3.4和14.5Hz,1H)；3.00(m,2H)；3.23(s,3H)；3.35至3.67(m,95H)；3.80(s,3H)；3.90(d,J＝2.3Hz,1H)；4.03至4.32(m,6H)；5.03(m,1H)；5.90(dd,J＝2.0和15.8Hz,1H)；6.44(ddd,J＝4.7,10.5和15.8Hz,1H)；7.03(d,J＝8.6Hz,1H)；7.17至7.25(m,5H)；7.32(d,J＝2.4Hz,1H)；7.79(t,J＝6.0Hz,1H)；7.85(d,J＝8.7Hz,1H)；7.90(d,J＝8.7Hz,1H)；7.93(m,2H)；8.35(t,J＝6.5Hz,1H)；8.40(d,J＝7.1Hz,1H)。
实施例29：hu2H11_R35-74-Ex28
使用前述的一般方法制备实施例29。44.64mg的hu2H11_R35-74与210μL的10mM实施例28的DMA(7当量)溶液反应2小时，然后依次添加210μL的10mM实施例28的DMA(7当量)溶液2小时30分钟和90μL的10mM实施例28的DMA(3当量)溶液2小时。在4℃储存过夜后，在Superdex 200pg上、在缓冲液B pH 6.5+20％NMP中提纯，在Amicon Ultra-15上浓缩，在Sephadex G25上、在缓冲液B pH 6.5+5％NMP中缓冲交换，并在0.22μm PVDF过滤器上过滤，获得30.1mg的实施例29，其为无色澄清溶液，浓度为2.51mg/mL，DAR为4(HRMS)，单体纯度为98.4％且总产率为67％。
SEC-HRMS:m/z＝151502(D1)；m/z＝153649(D2)；m/z＝155798(D3)；m/z＝157939(D4)；m/z＝160100(D5)；m/z＝162262(D6)。
合成实施例30至32：戊二酰基-Val-葡萄糖醛的Lys-C52苄胺、戊二酰基-Val-葡萄 糖醛的Lys-C52苄胺的NHS酯及相应的ADC
Figure BDA0002354666740002191
Figure BDA0002354666740002201
化合物68：(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)-6-((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-羧酰氨基)己酸
在圆底烧瓶中，在磁力搅拌下引入1-O-甲基-β-D-葡萄糖醛酸钠盐(CAS号[58189-74-5],100mg,434μmol)，然后添加水(5mL)和适量Amberlite(CAS号[9037-24-5])以达到pH2，过滤该介质。
在圆底烧瓶中，在磁力搅拌下，将NaHCO3(43mg,511μmol)/水(5mL)添加至化合物64(50mg,99μmol)的THF(4mL)溶液中；在室温搅拌该反应介质5分钟。然后，将上述葡萄糖醛酸溶液添加至该反应介质中，然后添加4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化吗啉N-水合物(CAS号[3945-69-5],67mg,242μmol)。在室温搅拌该反应介质过夜，然后真空浓缩。该粗介质经快速色谱在5g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到23mg的化合物68(35％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.84(d,J＝6.7Hz,3H)；0.86(d,J＝6.7Hz,3H)；1.13至1.42(m,4H)；1.52至1.72(m,2H)；2.05(m,1H)；2.96至3.08(m,2H)；3.14(m,1H)；3.30(部分遮盖的m,1H)；3.38(s,3H)；3.53(m,1H)；3.78至3.97(m,2H)；4.09(dd,J＝2.3和7.8Hz,1H)；4.19至4.34(m,3H)；5.01至5.08(宽的m,1H)；5.13(宽的m,1H)；5.27(m,1H)；7.33(m,2H)；7.42(t,J＝7.6Hz,2H)；7.52至7.62(宽的m,2H)；7.75(m,2H)；7.89(d,J＝7.6Hz,2H)；7.93(宽的m,1H)；12.00(m,1H)。LCMS(A):ES m/z＝656[M-H]-；m/z＝658[M+H]+；tR＝1.05min。
化合物69：(2S,3S,4S,5R,6R)-N-((S)-5-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)-6-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)-氧杂环丙-2-基)苄基)氨基)-6-氧代己基)-3,4,5-三羟基-6-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-甲酰胺
在磁力搅拌下，向(E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-(4-氨基甲基-苯基)-环氧乙烷基]-乙基}-10-(3-氯-4-甲氧基-苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-1,4-二氧杂-8,11-二氮杂-环十六烷-13-烯-2,5,9,12-四酮(其合成如WO2011001052中化合物77所述，90mg,129μmol)的溶液中添加化合物68(135mg,205μmol)的DMF(5mL)溶液，然后添加HOBt(30mg,222μmol)和EDC(36μL,203μmol)。在室温搅拌该反应介质1小时。此时，添加DMA(1mL)，并保持搅拌过夜。然后，添加EDC(20μL)，并继续搅拌该反应介质2小时。然后添加哌啶(12.9μL,129μmol)至该介质中。搅拌1小时30分钟后，真空浓缩该反应介质，并经3次连续的快速色谱在硅胶上提纯(等度洗脱40:5:0.5v/v/v DCM/MeOH/H2O和12:3:0.5v/v/v DCM/MeOH/NH4OH)，得到47mg的化合物69(33％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.77至0.81(m,9H)；0.88(d,J＝6.6Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝6.6Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.20至1.71(m,9H)；1.80(m,1H)；1.93(m,1H)；2.28(m,1H)；2.62至2.73(m,2H)；2.93至3.14(m,9H)；3.28至3.36(部分遮盖的m,2H)；3.39(s,3H)；3.53(d,J＝9.5Hz,1H)；3.81(s,3H)；3.87(d,J＝1.7Hz,1H)；4.09(m,1H)；4.19至4.36(m,4H)；4.91(m,1H)；5.00至5.15(m,4H)；5.79(d,J＝15.9Hz,1H)；6.48(m,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.17(dd,J＝2.1和8.6Hz,1H)；7.20至7.25(m,5H)；7.28(d,J＝2.1Hz,1H)；7.92(宽的t,J＝5.9Hz,1H)；8.02(宽的m,1H)；8.35(d,J＝7.8Hz,1H)；8.46(宽的t,J＝6.2Hz,1H)。LCMS(A):ES m/z＝558[M+2H]2+；m/z＝1113[M-H]-；m/z＝1115[M+H]+；m/z＝1159[M-H+HCO2H]-；tR＝0.9min。
实施例30：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基)-1-氧代-6-((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-羧酰氨基)己-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-5-氧代戊酸
向化合物69(47mg,42.1μmol)中添加DMF(4mL)并在磁力搅拌下添加戊二酸酐(8.5mg,74.5μmol)；在室温搅拌该反应介质2小时。此时，真空浓缩该粗介质，并经2次连续的快速色谱在硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O和DCM/MeOH/NH4OH)，得到17mg的实施例30(33％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.81(裂分d,J＝6.4Hz,6H)；0.84(d,J＝6.6Hz,3H)；0.86(d,J＝6.6Hz,3H)；0.98(s,3H)；1.04(d,J＝6.6Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.17至2.32(宽的m,18H)；2.66至2.74(m,2H)；2.91至3.03(m,5H)；3.10(m大,1H)；3.18(t,J＝8.8Hz,1H)；3.28至3.36(部分遮盖的m,2H)；3.37(s,3H)；3.60(m,1H)；3.81(s,3H)；3.87(d,J＝1.6Hz,1H)；4.07(m,2H)；4.14至4.26(m,3H)；4.31(m,1H)；4.92(m,1H)；5.06至5.13(m,2H)；5.35(m,2H)；5.80(d,J＝15.3Hz,1H)；6.45(ddd,J＝3.6,11.1和15.3Hz,1H)；7.05(d,J＝8.5Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.1和8.5Hz,1H)；7.22(d,J＝8.4Hz,2H)；7.25(d,J＝8.4Hz,2H)；7.29(d,J＝2.1Hz,1H)；7.31(m,1H)；7.77至8.81(m,5H)。LCMS(A):ES m/z＝1227[M-H]-；m/z＝1229[M+H]+；m/z＝615；tR＝1.16min。
实施例31：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基)-1-氧代-6-((2S,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-羧酰氨基)己-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-5-氧代戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
在磁力搅拌下，向实施例30(14mg,11.4μmol)添加DMF(3mL)、DSC(4.2mg,15.6μmol)和DIEA(6μL,34.5μmol)。在室温搅拌该反应介质4小时。此时，用MeTHF(10mL)稀释该介质，并用H2O(5mL)洗涤。将水相用MeTHF(10mL)萃取，合并的有机相经MgSO4干燥，过滤真空浓缩并经快速色谱在4g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/iPrOH)，得到3.5mg的实施例31(23％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.78(d,J＝6.6Hz,6H)；0.82(d,J＝7.1Hz,3H)；0.84(d,J＝7.1Hz,3H)；0.99(s,3H)；1.04(d,J＝6.6Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.17至1.70(m,9H)；1.77至1.87(m,3H)；1.98(m,1H)；2.23至2.32(m,3H)；2.65至2.70(m,4H)；2.81(s,4H)；2.93至3.07(m,6H)；3.15(m,1H)；3.28至3.38(部分遮盖的m,2H)；3.40(s,3H)；3.53(d,J＝9.6Hz,1H)；3.81(s,3H)；3.87(d,J＝1.4Hz,1H)；4.09(d,J＝7.7Hz,1H)；4.17(dd,J＝6.9和8.2Hz,1H)；4.20至4.33(m,4H)；4.90(dd,J＝3.4和9.5Hz,1H)；5.04(m,2H)；5.10(m,1H)；5.14(d,J＝5.2Hz,1H)；5.79(dd,J＝0.8和15.3Hz,1H)；6.47(m,1H)；7.05(d,J＝8.8Hz,1H)；7.17(dd,J＝1.6和8.8Hz,1H)；7.20至7.25(m,5H)；7.28(d,J＝1.6Hz,1H)；7.86至7.99(m,3H)；8.37(m,2H)。LCMS(A):ES m/z＝1370[M-H+HCO2H]-；ES m/z＝1326[M+H]+；m/z＝663.5；tR＝1.21min。
实施例32：hu2H11_R35-74-Ex31
使用前述的一般方法制备实施例32。27.9mg的hu2H11_R35-74与107μL的10.5mM实施例31的DMA(6当量)溶液反应2小时30分钟，然后添加107μL的10.5mM实施例31的DMA(6当量)溶液4小时30分钟。在Superdex 200pg上、缓冲液B pH 6.5+10％NMP中提纯后，在AmiconUltra-15上浓缩，在缓冲液B pH 6.5中稀释，达到最终NMP浓度为5％，并在0.22μm PVDF过滤器上过滤，获得16.7mg的实施例32，其为无色澄清溶液，浓度为2.23mg/mL，DAR为3(HRMS)，单体纯度为100％且总产率为60％。
SEC-HRMS:m/z＝149407(裸mAb)；m/z＝150619(D1)；m/z＝151831(D2)；m/z＝153044(D3)；m/z＝154256(D4)；m/z＝155468(D5)；m/z＝156685(D6)；m/z＝157899(D7)；m/z＝159014(D8)。
合成实施例33至35：戊二酰基-Val-磺基PEG4Lys-C52苄胺、戊二酰基-Val-磺基 PEG4Lys-C52苄胺的NHS酯及相应的ADC
Figure BDA0002354666740002251
化合物70：4,7,10,13-四氧杂十六烷-1,16-二酸二-叔丁基酯
向三甘醇(5mL,37.5mmol)的THF(15mL)溶液中添加钠(18mg,783.0μmol)。在室温搅拌该反应介质2小时，然后在5分钟内逐滴添加丙烯酸叔丁酯(14mL,95.58mmol)。在室温搅拌该反应介质20小时，然后用盐水(300mL)淬灭并用EtOAc(300mL)萃取两次。合并的有机相经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并经快速色谱在200g的硅胶上提纯(梯度洗脱庚烷/EtOAc)，得到8.05g的化合物70，其为无色油状物(53％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.40(s,18H)；2.40(t,J＝6.5Hz,4H)；3.48(m,12H)；3.58(t,J＝6.5Hz,4H)。LCMS(A):ES m/z＝407[M+H]+；m/z＝429[M+Na]+；tR＝1.32min。
化合物71：4,7,10,13-四氧杂十六烷-1,16-二酸
向化合物70(8.05g,19.8mmmol)中添加甲酸(40mL,1.04mol)。在室温搅拌该反应介质1天，真空浓缩并与EtOAc(20mL)共蒸发，得到5.9g的化合物71，其为无色油状物(定量产率)。
RMN 1H(300MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):2.44(t,J＝6.5Hz,4H)；3.48(s,8H)；3.50(s,4H)；3.59(d,J＝6.5Hz,4H)；12.25(宽的m,2H)。
化合物72：3-氧代-1-苯基-2,6,9,12,15-五氧杂十八烷-18-酸
向化合物71(5.9g,20.05mmol)的DMF(50mL)溶液中添加DIEA(3.6mL,20.67mmol)，并在10分钟内滴加苄基溴(2.43mL,20.05mmol)的DMF(50mL)溶液。在室温搅拌该反应介质20小时，用1N HCl(500mL)淬灭并用EtOAc(200mL)萃取。合并的有机相经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，并经两次连续的快速色谱在400g和100g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到2.7g的化合物72(35％)，其为淡绿色油状物。
RMN 1H(300MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):2.42(m,2H)；2.60(t,J＝6.5Hz,2H)；3.47(s,6H)；3.49(s,6H)；3.59(m,2H)；3.66(d,J＝6.5Hz,2H)；5.10(s,2H)；7.29to 7.41(m,5H)。
化合物73：2-氨基乙磺酸钠
向牛磺酸(2g,15.98mmol)的H2O(30mL)溶液中添加碳酸氢钠(1.34g,15.98mmol)。在室温搅拌该反应介质2小时，然后真空浓缩。将粗产物溶于H2O(100mL)并冻干，得到2.5g的化合物73，其为白色粉末(定量产率)。
IR光谱(KBr窗片)；主要吸收峰(cm-1)：1458；1344；1212；1184；1046；1037；742；737；598；576；533和523。
化合物74：3,18-二氧代-1-苯基-2,6,9,12,15-五氧杂-19-氮杂二十一烷-21-磺酸钠
向化合物72(1g,2.69mmol)的DMF(40mL)溶液中添加NHS(367mg,3.13mmol)和EDC(565μL,3.12mmol)。在室温搅拌该反应介质20小时，然后添加化合物73(1.9g,12.91mmol)的H2O(20mL)溶液和碳酸氢钠(219mg,2.61mmol)。在室温搅拌该反应介质2小时，然后用Amberlite IR-120(H)(CAS号[78922-04-0]酸化至pH 3，过滤，真空浓缩并经快速色谱在150g的硅胶上提纯(DCM/MeOH/H2O)，得到824mg的化合物74(61％)，其为无色固体。
LCMS(A)：ES m/z＝490[M-H]-；m/z＝492[M+H]+；tR＝1.1min。
化合物75：1-羧基-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂-16-氮杂十八烷-18-磺酸钠
将化合物74(820mg,1.60mmol)的8:2MeOH/H2O(30mL)溶液在0.22μm上过滤，然后在20℃，在10％Pd/C筒上使用H-cube系统进行氢解。真空浓缩该反应介质，得到530mg的化合物75(78％)，其为黄色胶状物。
RMN 1H(300MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):2.27(t,J＝6.6Hz,2H)；2.40(t,J＝6.6Hz,2H)；2.52(部分遮盖的m,2H)；3.28(部分遮盖的m,2H)；3.49(m,12H)；3.59(m,4H)；7.72(宽的t,J＝6.4Hz,1H)；12.08(宽的m,1H)。
化合物76：(5S,8S)-8-羧基-1-(9H-芴-9-基)-5-异丙基-3,6,14,29-四氧代-2,17,20,23,26-五氧杂-4,7,13,30-四氮杂三十二烷-32-磺酸钠
向化合物75(300mg,708.5μmol)的DMF(15mL)溶液中添加NHS(98mg,851.5μmol)和EDC(150μL,855.1μmol)。在室温搅拌该反应介质20小时，然后添加化合物64(416mg,825.4μmol)的DMF(15mL)溶液和碳酸氢钠(180mg,2.13mmol)的H2O(10mL)溶液。在室温搅拌该反应介质1小时，用Amberlit IR-120(H)(CAS号[78922-04-0])酸化至pH 3，过滤，用DMF(5mL)洗涤，真空浓缩并经快速色谱在100g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/乙酸)，得到447mg的无色粘油。将该粘油溶于2:1THF/H2O(120mL)，用0.1N HCl(约4mL)酸化至pH 3.3，并真空浓缩，得到354mg的化合物76(57％)，其为白色半透明固体。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.86(d,J＝7.0Hz,3H)；0.89(d,J＝7.0Hz,3H)；1.20至1.41(m,4H)；1.50至1.74(m,2H)；1.98(m,1H)；2.26(t,J＝6.8Hz,2H)；2.28(t,J＝6.8Hz,2H)；2.52(遮盖的m,2H)；3.00(m,2H)；3.28(部分遮盖的m,2H)；3.45(m,12H)；3.58(t,J＝6.8Hz,4H)；3.91(dd,J＝7.0和9.2Hz,1H)；4.14(m,1H)；4.19至4.31(m,3H)；7.32(m,2H)；7,37(d,J＝9.2Hz,1H)；7.41(dt,J＝1.0和7.8Hz,2H)；7.75(m,3H)；7.80(t,J＝6.0Hz,1H)；7.89(d,J＝7.8Hz,2H)；8.07(d,J＝8.0Hz,1H)；12.49(m,1H)。LCMS(A):ES m/z＝849[M-H]-；m/z＝851[M+H]+；tR＝1.44min。
化合物77：(25S,28S)-28-氨基-25-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环-十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)-29-甲基-4,19,27-三氧代-7,10,13,16-四氧杂-3,20,26-三氮杂三十烷-1-磺酸钠
向(E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-(4-氨基甲基-苯基)-环氧乙烷基]-乙基}-10-(3-氯-4-甲氧基-苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-1,4-二氧杂-8,11-二氮杂-环十六烷-13-烯-2,5,9,12-四酮(其合成如WO2011001052中化合物77所述，106mg,151.8μmol)的DMF(5mL)溶液中添加化合物76(225mg,257.7μmol)的DMF(5mL)溶液、HOBt(30mg,213.1μmol)和EDC(40μL,226.0μmol)。在室温搅拌该反应介质2小时，然后添加哌啶(134μL,1.36mmol)并持续搅拌2小时。真空浓缩该反应介质，并经两次连续的快速色谱在50g和4g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到73mg的化合物77，其为白色固体(36％)。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.78(d,J＝6.8Hz,6H)；0.91(d,J＝7.0Hz,3H)；0.93(d,J＝7.0Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.18至1.45(m,5H)；1.51至1.72(m,4H)；1.80(m,1H)；2.05(m,1H)；2.23至2.35(m,5H)；2.56(m,2H)；2.68(m,2H)；2.95至3.04(m,5H)；3.32(m,3H)；3.48(m,12H)；3.57(t,J＝6.7Hz,2H)；3.59(t,J＝6.7Hz,2H)；3.66(d,J＝6.0Hz,1H)；3.80(s,3H)；3.87(d,J＝2.3Hz,1H)；4.20至4.36(m,4H)；4.90(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；5.12(m,1H)；5.80(dd,J＝2.0和15.2Hz,1H)；6.47(ddd,J＝3.8,11.3和15.2Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.24(m,5H)；7.29(d,J＝2.4Hz,1H)；7.76(t,J＝6.0Hz,1H)；7.86(t,J＝8.0Hz,1H)；7.93(宽的m,3H)；8.38(d,J＝8.0Hz,1H)；8.49(d,J＝8.0Hz,1H)；8.59(t,J＝6.0Hz,1H)。LCMS(A):ES m/z＝655[M+2H]2+；m/z＝1306[M-H]-；m/z＝1308[M+H]+；tR＝1.07min。
实施例33：(25S,28S)-33-羧基-25-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环-十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)-28-异丙基-4,19,27,30-四氧代-7,10,13,16-四氧杂-3,20,26,29-四氮杂三十三烷-1-磺酸钠
向化合物77(73mg,54.9μmol)的DMF溶液中添加戊二酸酐(11mg,96.4μmol)。在室温搅拌该反应介质20小时，真空浓缩并经快速色谱在4g的硅胶上提纯(DCM/MeOH/H2O)，得到40mg的实施例33，其为白色粘油(50％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.81(s,9H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.38(s,9H)；1.50(dd,J＝3.0和14.5Hz,1H)；1.58(dd,J＝9.1和14.5Hz,1H)；2.38至2.48(部分遮盖的m,3H)；4.04(m,1H)；4.19(m,2H)；4.30(m,1H)；4.49(s,2H)；4.91(m,1H)；5.80(d,J＝16.0Hz,1H)；6.17(dd,J＝8.4和16.0Hz,1H)；6.43(d,J＝16.0Hz,1H)；6.70(m,1H)；7.23至7.44(m,8H)；7.68(m,2H)；7.79(d,J＝8.3Hz,1H)；7.88(d,J＝7.8Hz,2H)。LCMS(A):ES m/z＝712[M+2H]2+；m/z＝1420[M-H]-；m/z＝1422[M+H]+；tR＝1.57min。
实施例34：(25S,28S)-25-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)-34-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-28-异丙基-4,19,27,30,34-五氧代-7,10,13,16-四氧杂-3,20,26,29-四氮杂三十四烷-1-磺酸钠
向实施例33(3.57mg,2.47μmol)的DMA(93μL)溶液中添加NHS(27.2μL,2.72μmol)和EDC(111μL,2.22μmol)。在室温搅拌该反应介质48小时：LCMS分析显示，存在95％期望的实施例34和5％的剩余实施例33。该溶液用于例如实施例35的缀合和制备。
实施例35：hu2H11_R35-74-Ex34
使用前述的一般方法制备实施例35。11.16mg的hu2H11_R35-74与53μL的10mM实施例34的DMA(7当量)溶液2小时30分钟反应，然后添加15μL的10mM实施例34的DMA(2当量)溶液2小时30分钟。在PD-10和Nap-10柱、在缓冲液B pH 6.5+5％NMP中提纯后，获得9.5mg的实施例34，其为无色澄清溶液，浓度为1.9mg/mL，DAR为3.8(HRMS)，单体纯度为97.5％且总产率为82％。
SEC-HRMS:m/z＝149330(裸mAb)；m/z＝150744(D1)；m/z＝152147(D2)；m/z＝153554(D3)；m/z＝154959(D4)；m/z＝156366(D5)；m/z＝157771(D6)；m/z＝159172(D7)；m/z＝160578(D8)。
合成实施例36和37：戊二酰基-Val-PEG4Lys-PABA-C52苄胺和戊二酰基-Val- PEG4Lys-PABA-C52苄胺的NHS酯
Figure BDA0002354666740002311
化合物78：((20S,23S)-20-((4-(羟基甲基)苯基)氨基甲酰基)-24-甲基-14,22-二氧代-2,5,8,11-四氧杂-15,21-二氮杂二十五烷-23-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯
在氩气中，向化合物61(180mg,257.2μmol)的MeCN(35mL)溶液中添加DIEA(130μL,771.7μmol)、4-氨基苄基醇(48mg,385.8μmol)、HOAt(41mg,295.8μmol)、HATU(147mg,385.8μmol)。在室温搅拌该反应介质17小时，然后添加MeOH(30mL)和二氧化硅，混合物真空浓缩并经快速色谱在30g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到94mg的作为米色固体的化合物78(46％)。
RMN 1H(300MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.85(d,J＝7.0Hz,3H)；0.88(d,J＝7.0Hz,3H)；1.18至1.45(m,4H)；1.52至1.70(m,2H)；1.99(m,1H)；2.27(m,2H)；3.00(m,2H)；3.22(s,3H)；3.35至3.51(m,12H)；3.55(t,J＝6.8Hz,2H)；3.90(dd,J＝7.2和9.1Hz,1H)；4.18至4.56(m,4H)；4.42(d,J＝5.9Hz,2H)；5.07(t,J＝5.9Hz,1H)；7.22(d,J＝8.9Hz,2H)；7.31(dt,J＝1.8和7.8Hz,2H)；7.40(m,3H)；7.53(d,J＝8.9Hz,2H)；7.73(m,3H)；7.88(d,J＝7.8Hz,2H)；8.02(d,J＝8.2Hz,1H)；9.92(s,1H)。
化合物79：((20S,23S)-24-甲基-20-((4-((((4-硝基苯氧基)-羰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-14,22-二氧代-2,5,8,11-四氧杂-15,21-二氮杂二十五烷-23-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯
向化合物78(94mg,118.9μmol)的DMF溶液中添加碳酸双(4-硝基苯基)酯(112mg,357.1μmol)和DIEA(40μL,237.2μmol)。在室温搅拌该反应介质20小时，真空浓缩，用DCM(10mL)稀释并用H2O(10mL)洗涤。将有机相经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并经快速色谱在12g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到55mg的为棕色固体的化合物79(48％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.86(d,J＝7.0Hz,3H)；0.88(d,J＝7.0Hz,3H)；1.18至1.45(m,4H)；1.55至1.77(m,2H)；1.99(m,1H)；2.27(t,J＝6.8Hz,2H)；3.00(m,2H)；3.21(s,3H)；3.40至3.52(m,12H)；3.57(t,J＝6.8Hz,2H)；3.91(m,1H)；4.20至4.41(m,4H)；5.24(s,2H)；7.31(t,J＝7.8Hz,2H)；7.35至7.48(m,5H)；7.58(d,J＝9.2Hz,2H)；7.63(d,J＝8.8Hz,2H)；7.74(m,2H)；7.80(t,J＝6.0Hz,1H)；7.90(d,J＝7.8Hz,2H)；8.10(d,J＝8.0Hz,1H)；8.32(d,J＝9.2Hz,2H)；10.12(s,1H)。LCMS(A):ES m/z＝956[M+H]+；m/z＝978[M+Na]+；m/z＝1000[M-H+HCO2H]-；tR＝1.45min。
化合物80：4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16yl)乙基)-氧杂环丙-2-基)苄基氨基甲酸4-((S)-20-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)-14-氧代-2,5,8,11-四氧杂-15-氮杂二十一烷酰氨基)苄基酯
向(E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-(4-氨基甲基-苯基)-环氧乙烷基]-乙基}-10-(3-氯-4-甲氧基-苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-1,4-二氧杂-8,11-二氮杂-环十六烷-13-烯-2,5,9,12-四酮(其合成如WO2011001052中化合物77所述，19mg,27.2μmol)的DCM(2.5mL)溶液中添加化合物79(58mg,60.7μmol)的DCM(2.5mL)溶液和DIEA(15μL,86.6μmol)。在室温搅拌该反应介质20小时，真空浓缩并经快速色谱在4g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到38mg的Fmoc-保护的中间体，其为无色粘油(92％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.79(d,J＝6.7Hz,6H)；0.86(d,J＝7.0Hz,3H)；0.88(d,J＝7.0Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.03(d,J＝7.0Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.20至1.45(m,5H)；1.50至1.75(m,4H)；1.80(m,1H)；2.00(m,1H)；2.27(m,3H)；2.69(m,2H)；2.92至3.04(m,5H)；3.21(s,3H)；3.32(遮盖的m,1H)；3.35至3.51(m,12H)；3.56(t,J＝6.6Hz,2H)；3.80(s,3H)；3.87(d,J＝2.2Hz,1H)；3.91(dd,J＝7.1和9.1Hz,1H)；4.15至4.42(m,7H)；4.90(dd,J＝3.7和9.8Hz,1H)；4.97(s,2H)；5.10(m,1H)；5.79(dd,J＝2.0和15.2Hz,1H)；6.48(ddd,J＝3.8,11.1和15.2Hz,1H)；7.04(d,J＝8.6Hz,1H)；7.17(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.20至7.34(m,10H)；7.41(m,3H)；7.58(d,J＝8.6Hz,2H)；7.70至7.80(m,4H)；7.89(d,J＝7.8Hz,2H)；8.06(d,J＝7.6Hz,1H)；8.35(d,J＝8.3Hz,1H)；10.03(s,1H)。LCMS(A):ESm/z＝698；m/z＝1514[M+H]+；m/z＝1558[M-H+HCO2H]-；tR＝1.56min。
向该中间体(35mg,23.1μmol)的DCM(5mL)溶液中添加哌啶(20μL,201.5μmol)。在室温搅拌该反应介质1小时30分钟，然后添加DMF(1mL)并持续搅拌1小时30分钟。然后添加哌啶(2μL)；在室温搅拌该反应介质1小时，真空浓缩并经快速色谱在4g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到25mg的化合物80(83％)，其为无色粘油。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.78(d,J＝6.7Hz,6H)；0.82(d,J＝7.0Hz,3H)；0.89(d,J＝7.0Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.22至1.48(m,5H)；1.51至1.75(m,6H)；1.80(m,1H)；1.98(m,1H)；2.28(m,3H)；2.69(m,2H)；2.92至3.05(m,7H)；3.15(m,1H)；3.21(s,3H)；3.32(遮盖的m,1H)；3.35至3.51(m,12H)；3.57(t,J＝6.7Hz,2H)；3.80(s,3H)；3.87(d,J＝2.2Hz,1H)；4.19(d,J＝6.4Hz,2H)；4.23(ddd,J＝3.9,8.3和11.8Hz,1H)；4.43(m,2H)；4.90(dd,J＝3.7和9.8Hz,1H)；4.98(s,2H)；5.10(m,1H)；5.80(dd,J＝2.0和15.2Hz,1H)；6.48(ddd,J＝3.9,11.3和15.2Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.20至7.32(m,8H)；7.59(d,J＝8.6Hz,2H)；7.79(t,J＝6.0Hz,1H)；7.82(t,J＝6.4Hz,1H)；8.21(m,1H)；8.39(d,J＝8.3Hz,1H)；10.13(s,1H)。LCMS(A):ES m/z＝646.5；m/z＝1292[M+H]+；tR＝1.05min。
实施例36：(20S,23S)-20-((4-((((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基-苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-苯基)氨基甲酰基)-23-异丙基-14,22,25-三氧代-2,5,8,11-四氧杂-15,21,24-三氮杂二十九烷-29-酸
向化合物80(25mg,19.3μmol)的DCM(5mL)溶液中添加戊二酸酐(4mg,19.3μmol)。在室温搅拌该反应介质2小时30分钟，然后添加戊二酸酐(4mg,19.3μmol)和DMF(0.5mL)并持续搅拌26小时。真空浓缩该反应介质并经快速色谱在4g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到10mg的实施例36(37％)，其为白色粘油。
实施例37：20-((4-((((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)-氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)-氨基甲酰基)-23-异丙基-14,22,25-三氧代-2,5,8,11-四氧杂-15,21,24-三氮杂二十九烷-29-酸(20S,23S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
向实施例36(10mg,7.11μmol)的THF(2mL)溶液中添加DSC(2mg,7.65μmol)和DIEA(1.2μL,7.26μmol)。在室温搅拌该反应介质20小时，真空浓缩，并经两次连续的快速色谱在0.6g和2g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/iPrOH)，得到3.3mg的实施例37(31％)，其为白色粘油。
合成实施例38和39：戊二酰基-Val-PEG24Lys-PABA-C52苄胺和戊二酰基-Val- PEG24Lys-PABA-C52苄胺的NHS酯
Figure BDA0002354666740002361
Figure BDA0002354666740002371
化合物81：((80S,83S)-80-((4-(羟基甲基)苯基)氨基甲酰基)-84-甲基-74,82-二氧代2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,81-二氮杂八十五烷-83-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯
向化合物65(360mg,229.8μmol)的MeCN(70mL)溶液中添加DIEA(77μL,456.6μmol)、4-氨基苄基醇(43mg,342.2μmol)、HOAt(36mg,264.5μmol)和HATU(109mg,278.1μmol)。在室温搅拌该反应介质2小时，真空浓缩并经快速色谱在25g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到307mg的化合物81(80％)，其为白色固体。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.85(d,J＝7.0Hz,3H)；0.88(d,J＝7.0Hz,3H)；1.21至1.42(m,4H)；1.54至1.78(m,2H)；1.99(m,1H)；2.27(t,J＝6.8Hz,2H)；3.00(m,2H)；3.22(s,3H)；3.40至3.52(m,92H)；3.54(t,J＝6.8Hz,2H)；3.91(dd,J＝6.9和9.0Hz,1H)；4.18至4.32(m,3H)；4.39(m,1H)；4.42(d,J＝5.9Hz,2H)；5.08(t,J＝5.9Hz,1H)；7.22(d,J＝8.9Hz,2H)；7.32(dt,J＝1.2和7.8Hz,2H)；7.41(m,3H)；7.53(d,J＝8.9Hz,2H)；7.75(m,3H)；7.89(d,J＝7.8Hz,2H)；8.02(d,J＝8.2Hz,1H)；9.92(s,1H)。LCMS(d):ES m/z＝827；m/z＝1671[M+H]+；tR＝2.94min。
化合物82：((80S,83S)-84-甲基-80-((4-((((4-硝基苯氧基)-羰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-74,82-二氧代-2,5,8,11,14,17,
20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,81-二氮杂八十五烷-83-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯
向化合物81(300mg,179.4μmol)的DCM(10mL)溶液中添加碳酸双(4-硝基苯基)酯(450mg,1.48mmol)和DIEA(60μL,361.2μmol)。在室温搅拌该反应介质过夜，然后添加碳酸双(4-硝基苯基)酯(80mg,263.1μmol)并持续搅拌4小时。此时，添加碳酸双(4-硝基苯基)酯(80mg,263.1μmol)并持续搅拌过夜。真空浓缩该反应介质并经快速色谱在80g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到325mg的化合物82(98％)，其为白色粘油。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.86(d,J＝7.0Hz,3H)；0.89(d,J＝7.0Hz,3H)；1.20至1.45(m,4H)；1.58至1.76(m,2H)；1.99(m,1H)；2.27(t,J＝6.8Hz,2H)；3.00(m,2H)；3.22(s,3H)；3.40至3.70(m,94H)；3.91(dd,J＝7.2和9.1Hz,1H)；4.19至4.32(m,3H)；4.39(m,1H)；5.24(s,2H)；7.31(dt,J＝1.2和7.8Hz,2H)；7.40(m,4H)；7.57(d,J＝9.2Hz,2H)；7,62(d,J＝8.6Hz,2H)；7.73(m,3H)；7.89(d,J＝7.8Hz,2H)；8.07(d,J＝7.8Hz,1H)；8.31(d,J＝9.2Hz,2H)；10.10(s,1H)。LCMS(d):ES m/z＝827；m/z＝1836[M+H]+；tR＝3.38min。
化合物83：4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基-氨基甲酸4-((S)-80-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)-74-氧代
-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75-氮杂八十一烷酰氨基)-苄基酯
向(E)-(3S,10R,16S)-16-{(S)-1-[(2R,3R)-3-(4-氨基甲基-苯基)-环氧乙烷基]-乙基}-10-(3-氯-4-甲氧基-苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-1,4-二氧杂-8,11-二氮杂-环十六烷-13-烯-2,5,9,12-四酮(其合成如WO2011001052中化合物77所述，79mg,113.1μmol)的DCM(5mL)溶液中添加化合物82(325mg,177.5μmol)的DCM(5mL)溶液和DIEA(63μL,365.6μmol)。在室温搅拌该反应介质20小时，然后添加化合物82(34mg,18.6μmol)并持续搅拌4小时。真空浓缩该反应介质，并经两次连续的快速色谱在25g的硅胶和15g的二醇改性的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到152mg的粗品，将其用反相色谱在10μm C18柱250x40mm上提纯(梯度洗脱MeCN/H2O)，得到78mg的含有16％化合物83的Fmoc-保护的中间体(29％)，其为白色粉末。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.78(d,J＝6.8Hz,6H)；0.85(d,J＝7.0Hz,3H)；0.88(d,J＝7.0Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.20至1.43(m,5H)；1.50至1.74(m,4H)；1.79(m,1H)；1.99(m,1H)；2.25(m,3H)；2.68(m,2H)；2.93至3.04(m,5H)；3.22(s,3H)；3.32(遮盖的m,2H)；3.40至3.76(m,94H)；3.80(s,3H)；3.87(d,J＝2.0Hz,1H)；3.90(dd,J＝7.5和9.1Hz,1H)；4.19(d,J＝6.5Hz,2H)；4.20至4.33(m,4H)；4.39(m,1H)；4.90(dd,J＝3.9和9.9Hz,1H)；4.93(s,2H)；5.11(m,1H)；5.79(dd,J＝1.8和15.2Hz,1H)；6.47(ddd,J＝3.8,11.4et 15.2Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.17(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.20至7.36(m,10H)；7.41(m,3H)；7.48(d,J＝8.6Hz,2H)；7.70至7.80(m,5H)；7.89(d,J＝7.8Hz,2H)；8.08(d,J＝8.0Hz,1H)；8.35(d,J＝8.0Hz,1H)；10.04(s,1H)。
向该中间体(75mg,31.3μmol)的DMF(5mL)溶液中添加哌啶(25μL,253.2μmol)。在室温搅拌该反应介质1小时30分钟，真空浓缩并在4g的硅胶上经快速色谱提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到58mg的化合物83(85％)，其为白色粘油。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.78(d,J＝6.9Hz,9H)；0.88(d,J＝7.0Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.05(d,J＝7.1Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.15至1.50(m,7H)；1.52至1.73(m,4H)；1.80(m,1H)；1.93(m,1H)；2.27(m,3H)；2.69(m,2H)；2.95至3.04(m,6H)；3.23(s,3H)；3.32(m,1H)；3.40至3.55(m,92H)；3.57(t,J＝6.8Hz,2H)；3.80(s,3H)；3.87(d,J＝2.2Hz,1H)；4.20(d,J＝6.5Hz,2H)；4.24(ddd,J＝3.9,8.2和12.0Hz,1H)；4.42(m,1H)；4.90(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；4.98(s,2H)；5.10(m,1H)；5.79(d,J＝15.8Hz,1H)；6.47(ddd,J＝3.8,6.0和11.5Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.20至7.31(m,8H)；7.58(d,J＝8.6Hz,2H)；7.78(m,2H)；8.10(d,J＝8.6Hz,1H)；8.36(d,J＝8.1Hz,1H)；10.10(s,1H)。LCMS(d):ES m/z＝725；m/z＝1087[M+2H]2+；tR＝1.07min。
实施例38：(80S,83S)-80-((4-((((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)氧基)甲基)-苯基)氨基甲酰基)-83-异丙基-74,82,85-三氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,81,84-三氮杂八十九烷-89-酸
向化合物83(58mg,26.7μmol)的DCM(2mL)溶液中添加戊二酸酐(5.5mg,48.2μmol)。在室温搅拌该反应介质3小时，真空浓缩，并经两次连续的快速色谱在4g和12g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到37mg的实施例38(61％)，其为白色粘油。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.79(d,J＝6.8Hz,6H)；0.93(d,J＝7.0Hz,3H)；0.97(d,J＝7.0Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.20至1.45(m,5H)；1.51至1.75(m,6H)；1.80(m,1H)；2.00(m,1H)；2.13至2.33(m,7H)；2.69(m,2H)；2.95至3.05(m,5H)；3.23(s,3H)；3.32(m,1H)；3.40至3.58(m,94H)；3.80(s,3H)；3.87(d,J＝2.2Hz,1H)；4.15至4.38(m,4H)；4.32(m,1H)；4.90(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；4.98(s,2H)；5.10(m,1H)；5.79(d,J＝15.2Hz,1H)；6.47(ddd,J＝3.8,11.4和15.2Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.20至7.32(m,8H)；7.60(d,J＝8.6Hz,2H)；7.78(t,J＝6.5Hz,1H)；7.90(宽的d,J＝8.6Hz,2H)；8.20(m,1H)；8.38(d,J＝8.6Hz,2H)；10.08(m,1H)；12.10(m,1H)。LCMS(d):ES m/z＝698；m/z＝2287[M+H]+；tR＝3.13min。
实施例39：80-((4-((((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮杂-环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)氧基)甲基)苯基)氨基甲酰基)-83-异丙基-74,82,85-三氧代
2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35,38,41,44,47,50,53,56,59,62,65,68,71-二十四氧杂-75,81,84-三氮杂八十九烷-89-酸(80S,83S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
向实施例38(29mg,12.7μmol)的THF(3mL)溶液中添加DSC(3.6mg,13.8μmol)和DIEA(2.1μL,12.9μmol)。在室温搅拌该反应介质20小时，真空浓缩并经快速色谱在4g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/iPrOH)，得到6.9mg的实施例39(23％)，其为无色粘油。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.79(d,J＝6.8Hz,6H)；0.93(d,J＝7.0Hz,3H)；0.97(d,J＝7.0Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7,1Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.13至1.42(m,5H)；1.52至1.88(m,7H)；1.98(m,1H)；2.28(m,5H)；2.53至2.72(m,4H)；2.80(s,4H)；2.96至3.05(m,5H)；3.23(s,3H)；3.32(m,1H)；3.60至3.65(m,94H)；3.80(s,3H)；3.87(d,J＝2.2Hz,1H)；4.15至4.28(m,4H)；4.33(m,1H)；4.90(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；4.98(s,2H)；5.10(m,1H)；5.79(d,J＝15.8Hz,1H)；6.47(ddd,J＝3.8,11.4和15.2Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.17(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.20至7.32(m,8H)；7.60(d,J＝8.6Hz,2H)；7.78(m,2H)；7.90(d,J＝8.5Hz,1H)；8.07(m,2H)；8.37(d,J＝8.5Hz,2H)；9.95(s,1H)。LCMS(D):ES m/z＝698；m/z＝2384[M+H]+；tR＝3.19min。
合成实施例40和41：DBCO-戊二酰基-Val-PEG24Lys-PABA-C52苄胺及相应的ADC
Figure BDA0002354666740002421
化合物84：5-[[3-(11,12-二脱氢二苯并[b,f]吖辛因-5(6H)-基)-3-氧代丙基]氨基]-5-氧代戊酸
向DBCO-胺(50mg,180.9μmol)的DCM(2mL)溶液中添加戊二酸酐(21.1mg,180.9μmol)。在室温搅拌该反应介质2小时，真空浓缩并经快速色谱在4g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH)，得到32.6mg的化合物84(45％)。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):1.59(m,2H)；1.81(m,1H)；1.94(t,J＝7.4Hz,2H)；2.11(t,J＝7.4Hz,2H)；2.40(m,1H)；2.91(m,1H)；3.09(m,1H)；3.62(d,J＝14.2Hz,1H)；5.13(d,J＝14.2Hz,1H)；7.38至7.53(m,6H)；7.56至7.67(m,3H)；12.05(宽的m,1H)。
实施例40：DBCO-戊二酰基-Val-PEG24Lys-PABA-C52苄胺
向化合物83(22mg,10.1μmol)的DCM(2mL)溶液中添加化合物84(5.14mg,13.2μmol)、EDC(1.8μL,10.1μmol)和HOBt(1.4mg,10.1μmol)。在室温搅拌该反应介质过夜，真空浓缩并经反相色谱在C18-改性的5μm柱150mm x30mm上提纯(梯度洗脱MeCN/0.2N乙酸铵pH5.6)，得到9.2mg的实施例40(36％)，其为白色粉末。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.78(d,J＝6.8Hz,6H)；0.80至0.90(m,6H)；1.00(s,3H)；1.05(d,J＝7.1Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.20至1.41(m,5H)；1.52至1.72(m,6H)；1.75至2.00(m,5H)；2.09(m,2H)；2.27(m,3H)；2.40(m,1H)；2.68(m,2H)；2.88至3.12(m,7H)；3.23(s,3H)；3.28至3.58(部分遮盖的m,95H)；3.60(d,J＝11.0Hz,1H)；3.80(s,3H)；3.88(d,J＝2.0Hz,1H)；4.11至4.28(m,4H)；4.33(m,1H)；4.90(dd,J＝3.8和9.8Hz,1H)；4.97(s,2H)；5.04(d,J＝11.0Hz,1H)；5.11(m,1H)；5.80(d,J＝15.2Hz,1H)；6.47(ddd,J＝3.8,11.4和15.2Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.17(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.20至7.31(m,6H)；7.32至7.50(m,6H)；7.53至7.70(m,4H)；7.80(m,3H)；8.08(d,J＝8.9Hz,1H)；8.36(d,J＝8.4Hz,1H)；9.95(s,1H)。LCMS(D):ES m/z＝849[M+3H]3+；m/z＝1273[M+2H]2+；tR＝5.29min。
实施例41：hu2H11_R35-74-Ex40
将缓冲液A中194mg的hu2H11_R35-74与627μL的22.0mM 4-叠氮基丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(CAS号[943858-70-6])的DMA(10当量)溶液反应，例如，最终抗体浓度为10.5mg/mL，DMA在缓冲液A中的百分比为5％。在室温搅拌2小时后，使用预先在缓冲液A中平衡的SephadexTM G25基质(Hiprep 26/10脱盐柱，GEHealthcare)通过凝胶过滤将其提纯。合并含有单修饰抗体的级分，并通过
Figure BDA0002354666740002432
过滤器单元(0.22μm
Figure BDA0002354666740002431
PVDF膜，Millipore)过滤，得到173mg修饰抗体，其浓度为5.75mg/mL，接头/抗体比率为5.2(HRMS)，单体纯度为97％且总产率为89％。
使用前述的一般方法制备实施例41。45mg的修饰的hu2H11_R35-74与604μL的6.89mM实施例40的DMA(14当量)溶液反应4小时30分钟，然后添加604μL的10mM实施例40的DMA(14当量)溶液，并且在室温继续搅拌过夜。在Superdex 200pg上、在缓冲液B pH 6.5+20％NMP中提纯后，在Amicon Ultra-15上浓缩，在PD-10上、在缓冲液B pH 6.5+5％NMP中凝胶过滤，并在0.22μm PVDF过滤器上过滤，获得28mg的实施例41，其为无色澄清溶液，浓度为1.6mg/mL，DAR为3.44(HRMS)，单体纯度为99.6％且产率为62％。
SEC-HRMS:m/z＝152041(D1)；m/z＝154678(D2)；m/z＝157332(D3)；m/z＝159992(D4)；m/z＝162648(D5)；m/z＝165303(D6)；m/z＝168004(D7)。
合成实施例42：磺基-Val-PEG4Lys-C52苄胺
Figure BDA0002354666740002441
化合物85：2-(4-((3-(烯丙基氧基)-3-氧代丙基)(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙基)氨基)-4-氧代丁酰氨基)乙烷-1-磺酸钠
向化合物13(0.958g,2.68mmol)的DMF(5mL)溶液中添加NHS(390.3mg,3.32mmol)和EDC(604.2μL,3.4mmol)。在室温搅拌该反应介质2小时，然后在-20℃储存2天。在回到室温以后，在室温搅拌该反应介质2小时，然后添加EDC(60μL,340μmol)和NHS(20mg,170.3μmol)的DMF(3mL)溶液。在室温搅拌该反应介质过夜，然后添加化合物73(1.96g,13.3mmol)的H2O(10mL)溶液和碳酸氢钠(225.2mg,2.68mmol)。在室温搅拌该反应介质1小时，用H2O(6mL)稀释，用Amberlite IR-120(H)(CAS号[78922-04-4])酸化至pH 3，过滤，真空浓缩并经快速色谱在硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到270mg的化合物85(21％)，其为无色泡沫。
RMN 1H(400MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):50:50构象混合物；1.39(s,4.5H)；1.40(s,4.5H)；2.27(t,J＝7.0Hz,4H)；2.38(t,J＝7.0Hz,2H)；3.53(m,3H)；2.68(t,J＝7.0Hz,1H)；3.25至3.61(m,6H)；4.55至4.58(m,2H)；5.18至5.36(m,2H)；5.90(m,1H)；7.70(t,J＝6.8Hz,1H)；10.53(宽的m,1H)。LCMS(A):ES m/z＝409；m/z＝463[M-H]-；m/z＝465[M+H]+；tR＝1.13min。
化合物86：2-(4-((3-(烯丙基氧基)-3-氧代丙基)(2-羧基乙基)氨基)-4-氧代丁酰氨基)-乙烷-1-磺酸钠
向化合物85(60mg,123.3μmol)的DCM(4mL)溶液中添加TFA(100μL,1.25mmol)。在室温搅拌该反应介质2小时，然后添加TFA(100μL,1.25mmol)并在室温持续搅拌2天。然后添加TFA(50μL,0.625mmol)，在室温搅拌该反应介质，真空浓缩并与甲苯共蒸发(3x)，得到60mg的化合物86(定量产率)，其为无色粘油。
化合物87：2-(4-((3-(烯丙基氧基)-3-氧代丙基)(3-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-3-氧代丙基)氨基)-4-氧代丁酰氨基)乙烷-1-磺酸钠
向化合物86(52.94mg,123μmol)的DCM(5mL)溶液中添加EDAC(26.0μL,147.6μmol)、NHS(14.75mg,123μmol)和DMF(0.5mL)。在室温搅拌反应混合物4小时，然后添加EDC(10μL,45.7μmol)并在室温持续搅拌过夜。将该反应介质在-20℃储存，并且例如用于合成化合物88。
化合物88：(20S,23S)-28-(2-烯丙基氧基-2-羧基乙
基)-20-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)-23-异丙基-14,22,25,29,32-五氧代-2,5,8,11-四氧杂-15,21,24,28,33-五氮杂三十五烷-35-磺酸钠
在氩气中，向化合物62(50mg,43.7μmol)的DCM(4mL)溶液中逐滴添加含化合物87(23.06mg,43.7μmol)的反应介质。在室温搅拌该反应介质15分钟，真空浓缩并经快速色谱在15g的硅胶上提纯(梯度洗脱DMC/MeOH/H2O)，得到26mg的化合物88(38％)，其为白色粘油。
实施例42：(20S,23S)-28-(2-羧基乙
基)-20-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)-23-异丙基-14,22,25,29,32-五氧代-2,5,8,11-四氧杂-15,21,24,28,33-五氮杂三十五烷-35-磺酸钠
向化合物88(14mg,9μmol)的THF溶液中添加双甲酮(2.57mg,18.0μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(5.3mg,4.5μmol)。在室温搅拌该反应介质1小时，然后添加双甲酮(2.57mg,18.0μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(5.3mg,4.5μmol)并在室温持续搅拌过夜。此时，添加双甲酮(2.57mg,18.0μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(5.3mg,4.5μmol)。在室温搅拌该反应介质4小时，过滤，真空浓缩并经快速色谱在4g的硅胶上提纯(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)，得到7mg的实施例42(51％)，其为白色粘油。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):50:50构象混合物；0.78(d,J＝6.8Hz,6H)；0.81(d,J＝6.8Hz,6H)；0.86(m,6H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.15至1.41(m,5H)；1.53至1.70(m,4H)；1.80(m,1H)；2.00(m,1H)；2.11至2.58(部分遮盖的m,13H)；2.70(m,2H)；2.92至3.05(m,5H)；3.23(s,3H)；3.25至3.58(部分遮盖的m,23H)；3.81(s,3H)；3.88(d,J＝2.0Hz,1H)；4.10至4.32(m,5H)；4.91(dd,J＝3.8和9.9Hz,1H)；5.10(m,1H)；5.80(d,J＝15.2Hz,1H)；6.47(ddd,J＝3.8,11.4和15.2Hz,1H)；7.06(d,J＝8.6Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.20至7.32(m,6H)；7.67至7.93(m,3H)；8.18至8.60(m,4H)。LCMS(E):ES m/z＝747.5[M+2H]2+；m/z＝1491[M-H]-；m/z＝1493[M+H]+；tR＝4.74min。
合成实施例43：磺基-Val-葡萄糖Gln-C52苄胺
Figure BDA0002354666740002471
化合物89：(6S,9S)-14-(3-(烯丙基氧基)-3-氧代丙
基)-6-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)-9-异丙基-3,8,11,15,18-五氧代-1-((2R,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)-2,7,10,14,19-五氮杂二十一烷-21-磺酸钠
向化合物50(55mg,49.9μmol)的DMF(3mL)溶液中添加化合物87的DMF溶液(1.66mLat 30mM,49.9μmol)。在室温搅拌该反应介质18小时，在0.45μm上过滤，用DMF(0.8mL)洗涤两次并经反相色谱在5μm C18柱30x150mm上提纯(梯度洗脱MeCN/0.2N乙酸铵pH 5.6)，得到19.8mg的化合物89(26％)，其为白色固体。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6)：60:40构象混合物；0.78(d,J＝6.8Hz,6H)；0.81(d,J＝6.8Hz,6H)；0.81至0.87(m,6H)；0.99(s,3H)；1.03(d,J＝7.1Hz,3H)；1.12(s,3H)；1.30(m,1H)；1.52至1.62(m,2H)；1.80(m,3H)；1.85至2.00(m,3H)；2.10至2.30(m,5H)；2.35至2.48(m,2H)；2.53(m,6H)；2.68(m,2H)；2.88至3.15(m,9H)；3.28(m,3H)；3.38(m,3H)；3.40至3.58(m,5H)；3.80(s,3H)；3.87(d,J＝2.3Hz,1H)；4.01(d,J＝8.0Hz,1H)；4.10至4.24(m,6H)；4.55(m,1.2H)；4.57(0.8H)；4.91(dd,J＝3.8et 9.9Hz,1H)；4.95(d,J＝5.0Hz,1H)；5.01(d,J＝5.0Hz,1H)；5.06(d,J＝5.0Hz,1H)；5.10(m,1H)；5.18至5.35(m,2H)；5.80(dd,J＝2.0和15.2Hz,1H)；5.92(m,1H)；6.47(ddd,J＝3.8,11.4和15.2Hz,1H)；7.06(d,J＝8.6Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.23(m,5H)；7.29(d,J＝2.4Hz,1H)；7,69(t,J＝6.8Hz,1H)；7.88(t,J＝6.8Hz,1H)；7.98(d,J＝9.0Hz,0.4H)；8.04(d,J＝7.0Hz,0.4H)；8.08(d,J＝9.0Hz,0.6H)；8.14(d,J＝7.0Hz,0.6H)；8.32(t,J＝7.0Hz,1H)；8.38(d,J＝8.0Hz,1H)。LCMS(A):ES m/z＝746.5[M+2H]2+；m/z＝1490[M-H]-；m/z＝1492[M+H]+；tR＝1.4min。
实施例43：(6S,9S)-14-(2-羧基乙
基)-6-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1,4-二氧杂-8,11-二氮环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙-2-基)苄基)氨基甲酰基)-9-异丙基-3,8,11,15,18-五氧代-1-((2R,3S,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-甲氧基四氢-2H-吡喃-2-基)-2,7,10,14,19-五氮杂二十一烷-21-磺酸钠
向化合物89(19mg,12.6μmol)的DMF(1mL)溶液中添加巴比妥酸(5.94mg,37.7μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(0.74mg,0.63μmol)的DMF(0.5mL)溶液。在室温搅拌该反应介质3小时，然后添加巴比妥酸(5.94mg,37.7μmol)和四(三苯基膦)钯(0)(0.74mg,0.63μmol)的DMF(0.5mL)溶液。在室温搅拌该反应介质过夜，经DMF稀释，在0.45μm上过滤，并经2次连续的反相色谱在5μm C18柱30x 150mm上提纯(梯度洗脱MeCN/0.2N乙酸铵pH 5.6)，得到4.7mg的实施例43(25％)，其为白色固体。
RMN 1H(500MHz,δ以ppm计,DMSO-d6):0.80(m,6H)；0.85(m,6H)；0.99(s,3H)；1.03(d,J＝7.3Hz,3H)；1.11(s,3H)；1.33(m,1H)；1.58(m,2H)；1.78(m,2H)；1.90(m,2H)；2.03至2.55(部分遮盖的m,11H)；2.70(m,2H)；2.90至3.58(部分遮盖的m,19H)；3.18(s,3H)；3.81(s,3H)；3.88(s,1H)；4.00至4.40(m,8H)；4.90(m,1H)；4.99(m,1H)；5.80(d,J＝15.2Hz,1H)；6.46(ddd,J＝3.8,11.4和15.2Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.22(m,4H)；7.29(d,J＝2.4Hz,1H)；7.31(m,1H)；8.30至8.70(m,5H)。LCMS(A):ES m/z＝1448[M-H]-；m/z＝1450[M+H]+；tR＝1.58min。
为了说明的目的，还测试了以下描绘的两种衍生自WO2011/001052的缀合物ADC1和ADC2，及一种PCT/EP2016/076603中所述的缀合物ADC3。
Figure BDA0002354666740002491
物理化学结果
在去除在制剂中所用的有机共溶剂之后以及加速应力的条件(在40℃加热10天)下，对式(V)的缀合物进行稳定性研究，评价聚集(看单体纯度)和DAR的损失。
不存在NMP时的稳定性
在SEC柱上过滤存储在10mM磷酸盐、140mM NaCl pH6.5 5％NMP中的ADC以去除NMP，将其配制在10mM磷酸盐、70mM NaCl、5％蔗糖pH6.5中，并通过HRMS和SEC HPLC分析以确定DAR和单体纯度。
Figure BDA0002354666740002501
*在4℃放置10个月后，观察到实施例16和实施例23的明显聚集(分别为-22％和-19％的单体纯度)，因此这两批在进行稳定性研究之前均通过Superdex 200pg凝胶过滤提纯。
在40℃、磷酸盐缓冲液中10天后的稳定性
将在10mM磷酸盐、70mM NaCl、5％蔗糖pH6.5中的ADC在40℃加热10天，并通过HRMS和SEC HPLC分析以确定DAR和单体纯度。
Figure BDA0002354666740002502
Figure BDA0002354666740002511
通过组织蛋白酶B评价在式(V)的缀合物治疗后的药物释放
在人组织蛋白酶B(Calbiochem#219362,40μg/mL)存在下，于37℃的乙酸酯缓冲液pH 5中温育ADC(1.5μg/mL)，并通过UPLC-MS-SIR-DAD-ELSD检测药物，体外评价组织蛋白酶B的药物释放。斜率是根据第1小时内的动力学，即24小时动力学的半衰期确定的。
Figure BDA0002354666740002512
式(V)的念珠藻素缀合物被人组织蛋白酶B切割，其动力学与参考ADC的动力学相似。
药理结果
对式(V)的缀合物进行药理测试，用于确定其抗肿瘤功效。
式(V)的缀合物对MDA-MB-231细胞系增殖的抑制的评价
将处于指数生长阶段的MDA-MB-231细胞胰蛋白酶消化，并将其重悬于其培养基中(DMEM/F12 Gibco#21331,10％FCS Gibco#10500-056,2nM谷氨酰胺Gibco#25030)。将细胞悬浮液以5000细胞/孔的密度接种在含有血清的整个培养基中的Cytostar 96孔培养板(GEHealthcare Europe,#RPNQ0163)中。温育4小时后，将ADC的连续稀释液添加至孔中，其浓度从10-7降低到10-12M(各个浓度一式三份)。在存在ADC的情况下，将细胞在含有5％CO2的气氛中在37℃培养3天。在第4天，将10μL 14C-胸苷溶液(0.1μCi/孔，Perkin Elmer#NEC56825000)添加至每个孔中。实验开始后96小时，使用microbeta放射性计数器(PerkinElmer)测量14C-胸苷的掺入。通过确定用ADC处理的细胞获得的减少计数与对照孔(仅用培养基处理)的细胞获得的计数之间的比率，以存活百分比的形式表示数据。在某些实验中，在实验开始时以1μM的浓度将裸抗体添加至孔中，并如前所述测量对增殖的抑制作用。
Figure BDA0002354666740002521
发现式(V)的念珠藻素缀合物以及ADC1和ADC2抑制MDA-MB-231细胞系的增殖，其中IC50为19pM至67pM，且单独的ADC与ADC+裸抗体的选择性比率介于109和＞1493之间。
在SCID小鼠中单次静脉内注射给药后确定式(V)的缀合物的MTD
MTD被确定为对单个小鼠不引起在连续3天内15％体重减轻或在1天内20％体重减轻或死亡的最大剂量。在3只雌性SCID小鼠中单次静脉内(i.v.)大剂量注射后和治疗后28天内对其进行评价。
Figure BDA0002354666740002531
测试的(V)的念珠藻素式缀合物在SCID小鼠中显示出30mg/kg至≥40mg/kg的MTD。
在SCID小鼠中单次静脉内注射给药后，评价式(V)的缀合物针对MDA-MB-231的体内抗肿瘤活性
针对在雌性SCID小鼠中对皮下植入的可测量乳腺MDA-MB-231异种移植物以3个剂量水平评价体内抗肿瘤活性。对照组未经治疗。通过单次静脉内大剂量注射给药缀合物，在每个图表上用箭头(▼)表示治疗日期。
为了评价缀合物的抗肿瘤活性，每周两次对动物称重，并每周两次通过卡尺对肿瘤进行测量。动物体重包括肿瘤重量。使用公式：质量(mm3)＝[长度(mm)×宽度(mm)2]/2计算肿瘤体积。主要功效终点为ΔT/ΔC、中位消退百分比、部分和完全消退(PR和CR)。通过从指定观察日的肿瘤体积中减去第一治疗日(分期日)的肿瘤体积，计算出各个治疗(T)和对照(C)的肿瘤体积变化。计算出治疗组的中位ΔT，并计算出对照组的中位ΔC。然后计算ΔT/ΔC比，且表示为百分比：ΔT/ΔC＝(ΔT/ΔC)×100。
肿瘤消退的百分比定义为与第一治疗的第一天(t0)相比，在指定观察日(t)治疗组的肿瘤体积减少的百分比。在特定时间点，对于每只动物，计算％消退。然后计算该组的中位％消退。消退百分比(在t处)＝((体积t0-体积t)/体积t0)×100。若肿瘤体积减小到开始治疗时的肿瘤体积的50％，则将消退定义为部分消退(PR)，若肿瘤体积(0mm3)无法测量，则将其定义为完全消退(CR)。无肿瘤幸存者(TFS)被定义为在研究结束时(末次治疗后>100天)具有检测不到的肿瘤的动物。
在SCID小鼠中单次静脉内注射给药后，评价实施例6针对MDA-MB-231的体内抗肿瘤活性
Figure BDA0002354666740002541
在SCID小鼠中以2.5mg/kg单次静脉内注射给药后，评价实施例16、实施例19、实施例23和实施例32针对MDA-MB-231的体内抗肿瘤活性
Figure BDA0002354666740002542
在SCID小鼠中以1.25mg/kg单次静脉内注射给药后，评价实施例16、实施例19、实施例23和实施例32针对MDA-MB-231的体内抗肿瘤活性
Figure BDA0002354666740002551
在SCID小鼠中单次静脉内注射给药后，评价实施例26针对MDA-MB-231的体内抗肿瘤活性
Figure BDA0002354666740002552
在SCID小鼠中单次静脉内注射给药后，评价实施例29针对MDA-MB-231的体内抗肿瘤活性
Figure BDA0002354666740002553
在SCID小鼠中单次静脉内注射给药后，评价实施例35针对MDA-MB-231的体内抗肿瘤活性
Figure BDA0002354666740002554
Figure BDA0002354666740002561
在SCID小鼠中单次静脉内注射给药后，评价实施例41针对MDA-MB-231的体内抗肿瘤活性
Figure BDA0002354666740002562
所有本发明测试的念珠藻素ADC以及ADC2在剂量范围为1mg/kg至5mg/kg显示出抗肿瘤活性。
因此，本发明的化合物(V)显然具有抗癌活性。
因此，在本发明的另一个方面，本发明还涉及式(V)的念珠藻素缀合物作为抗癌剂的用途。
因此，在本发明的另一个方面，本发明还涉及式(V)的念珠藻素缀合物在制备用于治疗癌症比如乳腺癌的药物中的用途。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供本发明的式(V)的缀合物，其用于治疗癌症。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供药物，其包含至少一种式(V)的缀合物。
这些药物用于治疗，尤其是用于癌症比如乳腺癌的治疗。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含作为主要活性成分的本发明的式(V)的缀合物。这些药物组合物包含有效剂量的至少一种本发明的式(V)的缀合物以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
因此，根据另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种本发明的式(V)的缀合物以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
根据所需的药物形式和给药方法，所述赋形剂选自本领域技术人员已知的常规赋形剂。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供治疗上述病理例如癌症(比如，乳腺癌)的方法，其包括向患者给药有效剂量的本发明的式(V)的缀合物。
序列表
<110> 赛诺菲
<120> 可用于治疗的肽类接头和念珠藻素缀合物及其制备
<130> PR80291
<150> EP17305531
<151> 2017-05-10
<160> 5
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 238
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 抗体hu2H11_R35R74的轻链
<220>
<223> 抗体hu2H11_R35R74的轻链
<400> 1
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val
20 25 30
Thr Leu Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Ile His Ser Asp Gly Arg Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Arg Leu Asp Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys
100 105 110
Trp Gln Gly Ser His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130 135 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145 150 155 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165 170 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180 185 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195 200 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210 215 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 2
<211> 467
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 抗体hu2H11_R35R74的重链
<220>
<223> 抗体hu2H11_R35R74的重链
<400> 2
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ala Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Ser Pro Val Gln Ser Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Leu Val Asn Pro Tyr Asn Gly Phe Ser Ser Tyr Asn
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Ser Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Phe Tyr Gly Tyr Arg Tyr Phe Asp Val Trp
115 120 125
Gly Gln Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
130 135 140
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
145 150 155 160
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
165 170 175
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
180 185 190
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
210 215 220
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
245 250 255
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260 265 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275 280 285
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290 295 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
305 310 315 320
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
325 330 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
340 345 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355 360 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
370 375 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385 390 395 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405 410 415
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420 425 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435 440 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450 455 460
Ser Pro Gly
465
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可能的AAns
<220>
<223> 可能的AAns
<220>
<221> SITE
<222> 4
<223> Xaa表示瓜氨酸
<400> 3
Gly Phe Leu Xaa
1
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可能的AAns
<220>
<223> 可能的AAns
<400> 4
Gly Phe Leu Gly
1
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 可能的AAns
<220>
<223> 可能的AAns
<400> 5
Ala Leu Ala Leu
1

Claims (27)

1.式(I)的化合物：
RCG1-L-P (I)
其中
■RCG1表示反应性化学基团，其对多肽例如抗体上存在的化学基团为反应性的；
■P表示氢原子、-OH或经活化的O；
■L表示式(II)的接头：
Figure FDA0002354666730000011
其中：
●L1具有式(III)：
Figure FDA0002354666730000012
其中：
■当P表示氢原子时，则x＝0或1且y＝1和z＝0；
■当P表示-OH时，则x＝y＝z＝0；
■当P表示经活化的O时，则x＝1且y＝z＝0，或x＝y＝z＝1；
■J1、J2、J3和J4各自独立地选自CA1和N；
■ALK表示(C1-C12)亚烷基基团，比如(C1-C6)亚烷基，例如以-(CH2)n-的形式，n为1至12的整数，且例如1至6；
■A1、A2、A3、A4、A5和A6各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如氢原子或甲基基团；
●(AA)w表示w个经取代的AAs或未经取代的氨基酸AAns的序列，其通过肽键连接在一起；
●w表示1至12的整数，比如1至6，例如2或3；
●若(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs，则L2表示单键、(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、CH(SO3H)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、(C1-C6)烷基-环己基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-CH(SO3H)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-环己基基团、NA8-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、NA8-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团、NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；
●若(AA)w表示w个未经取代的氨基酸AAns的序列，则L2表示NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团；
■A7表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NHC(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-O-、-C(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2，应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)；
■A8表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，比如氢原子或甲基基团；
■i表示1至50的整数，比如1至35。
2.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中未经取代的氨基酸AAns的所述序列(AA)w选自以下列表：Gly-Gly、Phe-Lys、Val-Lys、Val-AcLys、Val-Cit、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Ala-Lys、Val-Ala、Phe-Cit、Phe-Gly、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Phe、Gly-Gly-Gly、Gly-Ala-Phe、Gly-Phe-Gly、Gly-Val-Cit、Gly-Phe-Leu-Cit、Gly-Phe-Leu-Gly和Ala-Leu-Ala-Leu，例如Val-Ala和Val-Cit，比如Val-Ala。
3.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中所述经取代的氨基酸AAs具有式(VI)：
Figure FDA0002354666730000041
其中：
●T表示饱和或不饱和的、直链的或支链的(C1-C8)三价烷基基团，优选T为
Figure FDA0002354666730000051
●U基团表示单键、-NHC(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-NHC(＝O)NH-、-NHC(＝NH)NH-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-S-、-Se-、-O-、-NH-、-N(烷基)-、-C(＝O)-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-或-O-P(＝O)(OH)-O，例如U基团表示-NH-C(＝O)-或-C(＝O)NH-；
●A9表示直链的或支链的、饱和或不饱和的任选经取代的C1-C160烃链，其中任选地至少一个亚甲基单元独立地替代为-NH-C(＝O)-、-N(烷基)C(＝O)-、-C(＝O)NH-、-C(＝O)N(烷基)-、-NHC(＝O)NH-、-NHC(＝NH)NH-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-CH(OH)-、-CH(SO3H)-、-CH(O烷基)-、-CHF-、-CF2-、-S-、-Se-、-O-、-NH-、-N(烷基)-、-N+H(烷基)-、-N+(烷基)2-、-C(＝O)-、-OP(＝O)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-NHS(＝O)2-、-N(烷基)S(＝O)2-、-S(＝O)2NH-、-S(＝O)2N(烷基)-、-P(＝O)(OH)-、-P(＝O)(OH)O-、-O-P(＝O)(OH)-、-O-P(＝O)(OH)-O-或杂环烷基基团，该基团任选地经至少一个相同或不同的取代基取代，该取代基选自-OH、-O烷基、-烷基、卤素原子、-NH2、-NH烷基和-N(烷基)2，比如A9为-[(CH2)2-O]4-CH3、-[(CH2)2-O]24-CH3、
Figure FDA0002354666730000052
Figure FDA0002354666730000053
或-[(CH2)2-O)]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A9可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
4.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中所述经取代的氨基酸AAs具有如权利要求3所述的式(VI)，其中：
●T表示
Figure FDA0002354666730000061
●U基团表示-NH-C(＝O)-或-C(＝O)NH-；
●A9表示-[(CH2)2-O]b-CH3，其中b表示1至50的整数，比如1至24，例如4、7和24，比如4和24。
5.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中所述序列(AAs)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs，其选自以下列表：
Figure FDA0002354666730000071
Figure FDA0002354666730000081
6.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs且L2表示：
-(C1-C6)烷基基团，例如-(CH2)3-基团；
--C(＝O)-(C1-C6)烷基基团，例如-C(＝O)-(CH2)3-基团；或
-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团，例如-(CH2)2-NA7-(CH2)2-基团，其中A7为-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
7.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中(AA)w含有w个未经取代的氨基酸AAns且L2表示：
(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团，例如-(CH2)2-NA7-(CH2)2-基团，其中A7表示：
--C(＝O)-[(CH2)2-O]a-CH3基团，其中“a”表示1至50的整数，例如1至24，比如4、7和24，例如A7为-C(＝O)-[(CH2)2-O]4-CH3基团、-C(＝O)-[(CH2)2-O]7-CH3基团或-C(＝O)-[(CH2)2-O]24-CH3基团；
--C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；或
--C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-[(CH2)2-O]a-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团，其中“a”表示1至50的整数，例如1至24，比如4，例如A7为-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-[(CH2)2-O]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；
应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
8.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中A7表示-C(＝O)-[(CH2)2-O]4-CH3基团；-C(＝O)-[(CH2)2-O]7-CH3基团、-C(＝O)-[(CH2)2-O]24-CH3基团；-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；-C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-[(CH2)2-O-]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
9.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns且L2表示：
NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7基团、NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、NA7-芳基基团、NA7-杂芳基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA7-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA7-芳基基团、C(＝O)-NA7-杂芳基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-C(＝O)NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基基团、C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-NA7-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或C(＝O)-NA8-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-NA7-(C1-C6)烷基基团。
10.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns且L2表示：
Figure FDA0002354666730000111
Figure FDA0002354666730000121
11.根据权利要求1所述的式(I)的化合物，其中(AA)w含有至少一个经取代的氨基酸AAs和/或w个未经取代的氨基酸AAns且L2包含A7，其表示为：C(＝O)-[(CH2)2-O]4-CH3基团；C(＝O)-[(CH2)2-O]7-CH3基团；C(＝O)-[(CH2)2-O]24-CH3基团；C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；C(＝O)-(CH2)2-C(＝O)-NH-[(CH2)2-O]4-(CH2)2-C(＝O)-NH-(CH2)2-SO3H基团；应理解的是，各个包含SO3H官能团的A7可呈盐形式例如碱金属盐，比如钠盐(SO3 -+Na)。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的式(I)的化合物，其中所述接头L选自以下列表：
Figure FDA0002354666730000122
Figure FDA0002354666730000131
Figure FDA0002354666730000141
Figure FDA0002354666730000151
Figure FDA0002354666730000161
Figure FDA0002354666730000171
13.根据权利要求1至12中任一项所述的式(I)的化合物，其中RCG1选自以下列表：
(i)RaZa-C(＝O)反应性基团，其中Za表示单键、-O-或-NH-，比如-O-，且Ra表示氢原子、(C1-C6)烷基基团、(C3-C7)环烷基基团、烯基基团、芳基基团、杂芳基基团或(C3-C7)杂环烷基基团，所述芳基基团、杂芳基基团和/或(C3-C7)杂环烷基基团任选地经1至5个原子/基团取代，该原子/基团选自卤素原子，比如氟原子、烷基基团、烷氧基基团、羟基基团、氧代基团、硝基基团和氰基基团；
(ii)以下反应性基团之一：马来酰亚氨基
Figure FDA0002354666730000191
基团；卤乙酰氨基Cl、Br或
Figure FDA0002354666730000192
基团，其R21表示氢原子或(C1-C6)烷基基团，例如Me；Cl-；N3-；HO-；HS-；经活化的二硫，例如H或H2N-；HC≡C-基团或经活化的C≡C基团例如环辛炔部分，比如DBCO-胺
Figure FDA0002354666730000194
或BCN
Figure FDA0002354666730000195
或MFCOO-烷基羟基胺或Pictet-Spengler反应底物例如
Figure FDA0002354666730000197
比如RCG1选自以下列表：
-COOH、
Figure FDA0002354666730000198
14.式(IV)的念珠藻素有效载荷：
Figure FDA0002354666730000199
其中：
■R1表示(C1-C6)烷基基团；
■R2和R3各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团；
或者R2和R3与它们所连接的碳原子一同形成(C3-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基基团；
■R4和R5各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团或(C1-C6)烷基-NH(R12)基团或(C1-C6)烷基-OH基团或(C1-C6)烷基-SH基团或(C1-C6)烷基-CO2H基团；
或者R4和R5与它们所连接的碳原子一同形成(C3-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基基团；
■X表示O或N(R6)；
■R6表示氢原子或(C1-C6)烷基基团；
■R7和R8各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基基团或(C1-C6)烷基-CO2H基团或(C1-C6)烷基-N(C1-C6)烷基2基团；
或者R7和R8与它们所连接的碳原子一同形成(C3-C6)环烷基基团或(C3-C6)杂环烷基基团；
■R9表示至少一个苯基核的取代基，其各自独立地选自：氢原子、-OH、(C1-C4)烷氧基、卤素原子、-NH2、-NH(C1-C6)烷基或-N(C1-C6)烷基2或-NH(C1-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基基团；
■R10表示至少一个苯基核的取代基，其选自氢原子和(C1-C4)烷基基团；
■Y表示
●-NR11-(C1-C6)烷基-，例如-NR11-(CH2)n-如
Figure FDA0002354666730000201
●-O-(C1-C6)烷基-，例如-O-(CH2)n-如
●-S-(C1-C6)烷基-，例如-S-(CH2)n-如
Y位于苯基核的邻位(o)、间位(m)或对位(p)的位置；
■R11和R12各自独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基，例如氢原子或甲基基团；
■n表示整数1至6；
■L如在根据权利要求1所述的式(I)所定义且表示如在权利要求1-12中任一项中所定义的式(II)的接头；
■RCG1表示在所述接头L的末端存在的反应性化学基团，RCG1为对多肽例如抗体上存在的化学基团有反应性。
15.根据权利要求14所述的式(IV)的念珠藻素有效载荷，其具有以下结构：
Figure FDA0002354666730000211
其中：
■R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、n、RCG1、X、Y和L如在根据权利要求14所述的式(IV)中所定义。
16.根据权利要求14所述的式(IV)的念珠藻素有效载荷，其选自以下列表：
Figure FDA0002354666730000212
Figure FDA0002354666730000231
Figure FDA0002354666730000241
Figure FDA0002354666730000251
Figure FDA0002354666730000261
Figure FDA0002354666730000271
Figure FDA0002354666730000281
Figure FDA0002354666730000291
17.式(V)的缀合物：
Figure FDA0002354666730000292
其中：
■R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、n、X、Y和L如在根据权利要求14或15所述的式(IV)中所定义；
■G表示如在权利要求1-12中的任一项所定义的式(II)的接头L的末端存在的反应性化学基团即如在权利要求13中所定义的RCG1与在多肽例如抗体(Ab)上存在的正交反应性化学基团RCG2之间的反应产物；和
■Ab表示抗体。
18.根据权利要求17所述的式(V)的缀合物，其具有以下结构：
Figure FDA0002354666730000293
其中：
■R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、n、X、Y、L、G、RCG1、RCG2和Ab如根据权利要求17所述的式(V)中所定义。
19.根据权利要求17或18所述的式(V)的缀合物，其中RCG2选自：
(i)在抗体表面上存在的赖氨酸残基的侧链带有的赖氨酸的ε-氨基基团；
(ii)抗体重链和轻链的N-端氨基酸的α-氨基基团；
(iii)铰链区的糖类基团；
(iv)通过还原链内二硫键产生的半胱氨酸的硫醇或经工程化改造的半胱氨酸的硫醇；
(v)在抗体表面上存在的一些谷氨酰胺残基的侧链带有的酰胺基团；和
(vi)使用甲酰基甘氨酸生成酶引入的醛基团。
20.根据权利要求17或18所述的式(V)的缀合物，其中：
-当RCG1表示N-羟基琥珀酰亚胺基酯时，RCG2表示NH2基团；
-当RCG1表示马来酰亚氨基官能团、卤乙酰氨基官能团、氯原子或经活化的二硫时，RCG2表示-SH基团；
-当RCG1表示N3基团时，RCG2表示C≡CH基团或经活化的C≡C基团例如环辛炔部分；
-当RCG1表示OH或NH2基团时，RCG2表示羧酸或酰胺官能团；
-当RCG1表示SH基团时，RCG2表示马来酰亚氨基官能团、卤乙酰氨基官能团或经活化的二硫官能团；
-当RCG1表示C≡CH基团或经活化的C≡C基团时，RCG2表示N3基团；
-当RCG1表示O-烷基羟基胺官能团或Pictet-Spengler反应底物时，RCG2表示酸酐或酮官能团。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的式(V)的缀合物，其中G选自：
Figure FDA0002354666730000301
比如，G表示以下基团：
Figure FDA0002354666730000311
例如
Figure FDA0002354666730000312
22.根据权利要求17所述的式(V)的缀合物，其选自以下列表：
Figure FDA0002354666730000313
Figure FDA0002354666730000321
Figure FDA0002354666730000331
其中Ab表示抗体。
23.一种制备如在权利要求17至22中任一项所定义的式(V)的缀合物的方法，其包括至少以下步骤：
(i)接触放置并任其反应：
-抗体的任选的缓冲水溶液，其任选地通过改性剂改性，
和
-如在权利要求14至16中任一项所定义的式(IV)的念珠藻素有效载荷的溶液，
式(IV)的念珠藻素有效载荷的化学基团RCG1对所述多肽例如抗体上存在的化学基团RCG2有反应性，特别是对抗体上存在的氨基基团有反应性，适当时，所述化学基团RCG2通过改性剂引入，从而通过形成共价键将式(IV)的念珠藻素有效载荷连接至所述抗体；
(ii)然后，任选地从式(IV)的念珠藻素有效载荷和/或从未反应的抗体和/或从任何可形成的聚集物中分离步骤(i)形成的缀合物。
24.一种药物，其中该药物包含至少一种根据权利要求17至22中任一项所述的式(V)的缀合物。
25.一种药物组合物，其中所述药物组合物包含至少一种根据权利要求17至22中任一项所述的式(V)的缀合物，以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
26.根据权利要求17至22中任一项所述的式(V)的缀合物用作抗癌剂的用途。
27.根据权利要求17至22中任一项所述的式(V)的缀合物，其用于癌症的治疗。
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