CN108349960B - 新念珠藻素化合物和缀合物、它们的制备以及它们的治疗用途 - Google Patents

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CN108349960B CN201680064372.8A CN201680064372A CN108349960B CN 108349960 B CN108349960 B CN 108349960B CN 201680064372 A CN201680064372 A CN 201680064372A CN 108349960 B CN108349960 B CN 108349960B
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Abstract

本发明涉及式(I)的念珠藻素化合物。本发明还涉及念珠藻素有效载荷、念珠藻素缀合物、含有它们的组合物以及它们的治疗用途，特别是作为抗癌剂的治疗用途。本发明还涉及制备这些缀合物的方法。

Description

新念珠藻素化合物和缀合物、它们的制备以及它们的治疗 用途
技术领域
本发明涉及新的念珠藻素(cryptophycin)化合物、新的念珠藻素有效载荷(cryptophycin payloads)、新的念珠藻素缀合物、含有它们的组合物以及它们的治疗用途，特别是作为抗癌剂的治疗用途。本发明还涉及制备这些缀合物的方法。
背景技术
念珠藻素类化合物作为次级代谢物属于由念珠藻属的蓝细菌产生的缩酚酸肽大环类。该类分子的第一种表示性化合物即念珠藻素-1(C-1)在1990年从蓝细菌念珠藻属种(ATCC 53789)中分离(参见Eiβler S.,et al.,Synthesis 2006,22,3747-3789)。以环氧化物官能团为特征的念珠藻素C-1和C-52在20世纪90年代早期就被发现具有体外和体内抗肿瘤活性。C-8和C-55这些念珠藻素显著更加活泼，但是并不能配制为稳定的溶液(BionpallyR.R.,et al.,Cancer Chemother Pharmacol 2003,52,25-33)。它们的更高的活性与它们推定的在细胞中产生相应环氧化物的能力相关。由于那时没有方法精确地稳定念珠藻素，念珠藻素C-52(LY355703)进入了临床研究，在具有30～40％稳定疾病的两个II期肺癌实验中产生了最低的抗肿瘤活性(30-40％的稳定疾病)，并且因此而中断(Edelman M.J.,etal.,Lung Cancer 2003,39,197-99和Sessa C.,et al.,Eur J Cancer 2002,38,2388-96)。
Figure BDA0001649098600000011
考虑到它们很高的潜能以及与美登醇(maytansinoids)和奥瑞他汀(auristatins)(这两个细胞毒性分子在抗体药物缀合物(ADC)的临床中是确认有效的)的共同的作用机制，该系列被认为对于ADC是有潜力的微管蛋白结合剂。因此，从大环的对位-苄基位置进行衍生开始开发了念珠藻素系列的缀合物(Al-Awar R.S.,et al.,J Med Chem2003,46,2985-3007)。
WO2011/001052记载了念珠藻素抗体药物缀合物，其中，细胞毒性部分使用多种连接基通过对-苄基位置连接至抗体。他们可能是可剪切的、二硫化物或者蛋白酶-敏感的，或者非可剪切的。
对WO2011/001052中描述的念珠藻素抗体-药物缀合物的进一步优化得到了显示有前景的抗肿瘤活性的潜在念珠藻素，但是却发现其在小鼠的血浆中不稳定，同时在非啮齿类的血浆中是稳定的。因此，对于显示改善稳定性的念珠藻素缀合物存在需求。
本发明的目的为，提出一种新的念珠藻素大环化合物，其在缀合至抗体后，在小鼠血浆中是稳定的，并且提出一种新的包含该稳定大环化合物的念珠藻素缀合物。
发明内容
在该方面中，本发明涉及式(I)的念珠藻素：
Figure BDA0001649098600000021
其中：
■R1表示(C1-C6)烷基；
■R2和R3彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基；
或者，R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基；
■R4和R5彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基-NH(R12)基团或(C1-C6)烷基-OH基团或(C1-C6)烷基-SH基团或(C1-C6)烷基-CO2H基团；
或者，R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基；
■R6表示氢原子或(C1-C6)烷基；
■R7和R8彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基-CO2H基团或(C1-C6)烷基-N(C1-C6)烷基2基团；
或者，R7和R8与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基；
■R9表示一个或多个彼此独立地选自以下的苯基核的取代基:氢原子、-OH、(C1-C4)烷氧基、卤素原子、-NH2、-NH(C1-C6)烷基、-N(C1-C6)烷基2、-NH(C1-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基；
■R10表示至少一个选自氢原子和(C1-C4)烷基的苯基核的取代基；
■W表示
●(C1-C6)烷基-NH(R11)，更具体为(CH2)nNHR11；
●(C1-C6)烷基-OH，更具体为(CH2)nOH；
●(C1-C6)烷基-SH，更具体为(CH2)nSH；
●CO2H或C(＝O)NH2；
●(C1-C6)烷基-CO2H或(C1-C6)烷基-C(＝O)NH2；或
●(C1-C6)烷基-N3。
W位于苯基核的邻位(o)、间位(m)或对位(p)；
■R11和R12彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基，更具体为甲基；
■n表示1至6之间的整数。
本发明进一步涉及式(II)的念珠菌素有效载荷：
Figure BDA0001649098600000031
其中：
■R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10如式(I)中所定义；
■Y表示(C1-C6)烷基-NR11或(C1-C6)烷基-O或(C1-C6)烷基-S；
或者，Y表示C(＝O)O、C(＝O)NH、(C1-C6)烷基-C(＝O)O或(C1-C6)烷基-C(＝O)NH；
或者，Y表示(C1-C6)烷基-三唑-，如
Figure BDA0001649098600000041
Y位于苯基核的邻位(o)、间位(m)或对位(p)；
■R11表示氢原子或(C1-C6)烷基；
■L表示连接基；
■RCG1表示存在于连接基端部的反应性化学基团，RCG1对抗体上存在的反应性化学基团呈反应性。
本发明还涉及式(III)的缀合物：
Figure BDA0001649098600000042
其中：
■R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10如式(I)中所定义；
■Y和L如式(II)中所定义；
■G表示RCG1与RCG2之间的反应产物，其中RCG1为存在于连接基端部的反应性化学基团，RCG2为存在于抗体(Ab)上的正交反应性化学基团；
■Ab表示抗体。
各取代基R1至R11还可以采用空间构型中的一种(例如，R或S，或者，Z或E)，如实施例中所描述的。
式(I)、(II)和(III)的化合物可以含有一个或多个不对称碳原子。因此它们能够以对映异构体、或非对映异构体的形式存在。这些对映异构体和非对映异构体及其混合物,包括外消旋混合物,形成本发明的一部分。
式(I)化合物，包括已经说明的那些，能够以碱或酸加成盐、特别是可药用盐的形式存在。
定义
在本发明的上下文中，一些术语具有以下定义：
●烯基：从烯烃中移除一个氢原子得到的烃基。烯基可以是直链的或支链的。可以提及的实例包括乙烯基(-CH＝CH2,也叫乙烯基(vinyl))和丙烯基(-CH2-CH＝CH2，也叫烯丙基)。
●烷氧基：-O-烷基，其中烷基如下文所定义；
●烷基：从烷烃除去氢原子得到的基于直链或支链饱和脂族烃的基团。可以提及的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、新戊基、2,2-二甲基丙基和己基；
●亚烷基：经验公式为-CnH2n-的饱和二价基团，从烷烃移除两个氢原子得到的。亚烷基可以为直链的或支链的。可以提及的实例包括亚甲基(-CH2-)、亚乙基(-CH2CH2-)、亚丙基(-CH2CH2CH2-)、亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)和亚己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH2-)，或以下支链基团
Figure BDA0001649098600000051
优选地，亚烷基具有式-(CH2)n-，n表示整数；在数值范围内，包括上下限(例如，“n从1至6”或“在1和6之间类型的范围包括限值1和6)；
●抗体：对生物靶标具有亲和性的抗体，更具体为单克隆抗体。抗体的功能是将作为细胞毒性化合物的生物活性化合物导向生物靶标。抗体可以为单克隆的、多克隆的或多特异性的；其还可以为抗体片段；其还可以为鼠类抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。“抗体”可以为天然的或常规的抗体，其中两个重链通过二硫键彼此连接，且每个重链通过二硫键连接至轻链(也成为“全长抗体”)。术语“常规(或全长)抗体”是指包含信号肽(或前肽，如果有的话)的抗体，以及在分泌时和蛋白水解各个链时得到的成熟形式。有两种类型的轻链，λ(l)和κ(k)。有五种主链类型(或异型)确定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。各链还有不同的序列结构域。轻链包括两个结构域或区域、可变域(VL)和恒定域(CL)。重链包括四个结构域，可变域(VH)和三个恒定域(CH1、CH2和CH3，集体称为CH)。轻链的可变域(VL)以及重链的可变域(VH)均确定了对抗原的结合识别和特异性。轻链恒定域(CL)和重链恒定域(CH)赋予了重要的生物性质，如抗体链结合、分泌、跨胎盘移动、补足性结合、和结合至Fc受体(FcR)。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-末端部分，并且由一根轻链和一根重链的可变部分构成。抗体的特异性位于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自可高度变异或互补性确定区域(CDR)的残基构成。偶尔地，来自非可高度变异或框架区域(FR)的残基影响整个结构域结构并因此影响结构位点。互补性确定区域或CDR是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区域的结合亲和性和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别称为CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。常规抗体抗原结合位点因此包括六个CDR，包含来自每个重链和轻链V区域的CDR组。
如本文所使用的，术语“抗体”表明常规的(全长)抗体及其片段，以及单结构域抗体及其片段、特别是单结构域抗体的可变重链。(常规)抗体的片段一般包括完整抗体的一部分，特别是完整抗体的抗原结合区域或可变区域，并保持常规抗体的生物功能。这种片段的实例包括Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、(dsFv)2、scFv、sc(Fv)2和双抗体。
抗体的功能为将作为细胞毒性化合物的生物活性化合物导向生物靶标。
●芳基：含有5至10个碳原子的环状芳香族基团。芳基的实例包括苯基、甲苯基、二甲苯基、萘基；
●生物靶标：优选位于癌细胞表面或与该肿瘤相关的基质细胞表面的抗原(或抗原族)；这些抗原可以是例如生长因子受体、癌基因产物、突变“肿瘤抑制剂”基因产物、血管发生相关分子或黏附分子；
●缀合物：抗体-药物缀合物或ADC，即，经由连接基共价连接至少一个细胞毒性化合物分子的抗体；
●环烷基：包含3至6个衔接在环状结构的碳原子的环状烷基。可以提及的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基；
●DAR(药剂-对-抗体的比例)：经由连接基连接至抗体的细胞毒性分子的平均数量；
●卤素：四种元素氟、氯、溴和碘中的任意；
●杂芳基：含有2至10个碳原子和1至5个连接在环中并连接碳原子形成该环的杂原子如氮、氧或硫的芳基。杂芳基的实例包括吡啶基、嘧啶基、噻吩基、咪唑基、三唑基、吲哚基、咪唑-吡啶基、吡唑基；
●杂环烷基：含有2至8个碳原子和1至3个连接在环中并连接碳原子形成该环的杂原子如氮、氧或硫的环烷基。实例包括吖丙啶基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫吗啉基、四氢呋喃基、四氢硫代呋喃基、四氢吡喃基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基和吡喃基；
●连接基：能将细胞毒性化合物共价连接至抗体从而形成缀合物的原子的基团或单键；
●片段：允许全部合成念珠藻素化合物的较简单的分子；
●有效载荷：共价连接连接基的细胞毒性化合物；
●反应性化学基团：能够促进或经历化学反应的原子的基团。
缩写
ADC:抗体-药物缀合物；AcOH:乙酸；AIBN:偶氮双异丁腈；ALK:(C1-C12)亚烷基基团，更具体地(C1-C6)亚烷基，更具体地为形式-(CH2)n-，n为1至12的整数、优选1至6的整数；aq.:水溶液；Ar:氩；AUC:曲线下面积；BEMP:2-叔丁基亚胺基-2-二乙基氨基-1,3-二甲基全氢-1,3,2-二氮杂磷；BF3:三氟化硼；Boc2O:二碳酸二叔丁基酯；BuLi:丁基锂；CAN:硝酸铈铵；Cbz:羧基苄基；CHCl3:氯仿；CH3CN:乙腈；CH3I:碘甲烷；CO2:二氧化碳；CL:清除率；m-CPBA:间-氯过氧苯甲酸；CR:完全响应；crypto表示式
Figure BDA0001649098600000071
的单元，crypto特别地表示稍后描述的D1-D19念珠藻素化合物中的一个或实施例中的念珠藻素化合物；D1是指DAR为1的ADC，D2是指DAR为2的ADC，等；d:天；DAR:药物对抗体比例；DBU:8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯；DCC:N,N’-二环己基碳二亚胺；DCE:二氯乙烷；DCM:二氯甲烷；DDQ:2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌；DIC:N,N'-二异丙基碳二亚胺；DIAD:二异丙基偶氮二羧酸酯；DIEA:N,N-二异丙基乙基胺；DMA:二甲基乙酰胺；DMAP:4-(二甲基氨基)吡啶；DME:二甲氧基乙烷；DMEM:Dulbecco的改良Eagle培养基；DMEM/F12:Dulbecco的改良Eagle培养基营养混合物F-12；DMF:二甲基甲酰胺；DMSO:二甲基亚砜；DPBS:Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水；DPPA:叠氮磷酸二苯基酯(PhO)2P(＝O)N3；DSC:N,N′-碳酸二琥珀酰亚胺基酯；EDA:乙二胺；EDC:1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺；EDTA:乙二胺四乙酸；EEDQ:N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉；ELSD:蒸发光散射检测器；eq.:当量；ES:电喷雾；EtOAc:乙酸乙酯；Et2O:二乙醚；EtOH:乙醇；Ex.:实施例；FCS:胎牛血清；Fmoc:9-芴基甲氧基羰基；FmocOSu:N-(9-芴基甲氧基羰基氧基)琥珀酰亚胺；GI:电子诱导基团；Grubbs I:亚苄基-双(三环己基膦)二氯钌；GrubbsII:(1,3-双(2,4,6-三甲基苯基)-2-咪唑烷基)二氯(苯基亚甲基)(三环己基膦)钌；h:小时；H2O:水；Hal:卤素；HATU:1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化六氟磷酸酯；HCl:盐酸；HEPES:4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸；HIC:疏水相互作用色谱；HOAt:1-羟基-7-氮杂苯并三唑；HOBt:1-羟基-苯并三唑；HPLC:高效液相色谱；HRMS:高分辨质谱；IC50:中位抑制浓度；i.e.:id est表示即；IEC:离子交换色谱；iPrOH:2-丙醇；iPr2O:二异丙基醚；i.v.:静脉内；K2CO3:碳酸钾；LDA:二异丙基氨基锂；LiOH:氢氧化锂；marg.:最低限度地；MeOH:甲醇；MeTHF:2-甲基-四氢呋喃；MgSO4:硫酸镁；min:分钟；MNBA:2-甲基-6-硝基苯甲酸酐；MTBE:甲基叔丁基醚；MTD:最大耐受剂量；NaH:氢化钠；NaHSO4:硫酸氢钠；Na2S2O3:硫代硫酸钠；NaCl:氯化钠；NaHCO3:碳酸氢钠；NaHSO3:亚硫酸氢钠；NaHSO4:硫酸氢钠；NaOH:氢氧化钠；NH4Cl:氯化铵；NHS:N-羟基琥珀酰亚胺；NMP:1-甲基-2-吡咯烷酮；NMR:核磁共振；P2-Et:1-乙基-2,2,4,4,4-五(二甲基氨基)-2λ5,4λ5-连二(磷氮基化合物)；PBS:磷酸盐缓冲的盐水；PEG:聚乙二醇；PK:药代动力学；PMB:对甲氧基苄基；PNGaseF:肽-N-糖苷酶F；PPh3:三苯基膦；ppm:份每百万；PR:部分响应；QS:quantum satis，表示所需的量；Q-Tof:四极杆飞行时间；quant.:定量收率；RCG:反应性化学基团；RT:室温；sat.:饱和；s.c.:皮下；SCID:重度联合免疫缺陷症；SEC:空间排阻色谱；TBAF:四丁基氟化铵；tBuOK:叔丁醇钾；TCEP:三(2-羧基乙基)膦盐酸盐；TEA:三乙胺；TEMPO:(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基；TFA:三氟乙酸；TFS:无肿瘤存活；THF:四氢呋喃；THP:四氢吡喃；TLC:薄层色谱；t1/2:半衰期；tR:保留时间；p-TsOH:对甲苯磺酸；UPLC:超高效液相色谱；UV:紫外线；Vss:稳态分布的明显体积。
【圖式簡單說明】
图1：实施例3的高分辨质谱
图2：实施例7的高分辨质谱
图3：实施例10的高分辨质谱
图4：实施例14的高分辨质谱
图5：实施例20的高分辨质谱
图6：实施例23的高分辨质谱
图7：实施例3针对在SCID小鼠中的MDA-MB-231异种移植物的体内功效
图8：实施例7针对在SCID小鼠中的MDA-MB-231异种移植物的体内功效
图9：实施例10针对在SCID小鼠中的MDA-MB-231异种移植物的体内功效
图10：实施例14针对在SCID小鼠中的MDA-MB-231异种移植物的体内功效
图11：实施例20针对在SCID小鼠中的MDA-MB-231异种移植物的体内功效
图12：实施例23针对在SCID小鼠中的MDA-MB-231异种移植物的体内功效
图13：在SCID小鼠中单次静脉注射给药后的ADC1体内药代动力学曲线
图14：在非啮齿类物种中单次静脉注射给药后的ADC1体内药代动力学曲线
图15：在SCID小鼠中单次静脉注射给药后的实施例3的体内药代动力学曲线
图16：在SCID小鼠中单次静脉注射给药后的实施例7的体内药代动力学曲线
图17：在SCID小鼠中单次静脉注射给药后96h的去糖基化ADC1的HRMS光谱
图18：在SCID小鼠中单次静脉注射给药后96h的ADC2轻链的HRMS光谱
图19：在非啮齿类物种中单次静脉注射给药后6天的去糖基化ADC1的HRMS光谱
图20：在SCID小鼠中单次静脉注射给药后96h的实施例3的HRMS光谱
图21：在SCID小鼠中单次静脉注射给药后96h的实施例7的HRMS光谱
图22：在SCID小鼠中单次静脉注射给药后96h的实施例10的HRMS光谱
图23：在SCID小鼠中单次静脉注射给药后96h的实施例14的HRMS光谱
图24：在SCID小鼠中单次静脉注射给药后96h的实施例20的HRMS光谱
图25：在SCID小鼠中单次静脉注射给药后96h的实施例23的HRMS光谱
具体实施方式
本发明涉及式(I)的念珠藻素:
Figure BDA0001649098600000101
其中：
■R1表示(C1-C6)烷基；
■R2和R3彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基；
或者，R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基；
■R4和R5彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基-NH(R12)基团或(C1-C6)烷基-OH基团或(C1-C6)烷基-SH基团或(C1-C6)烷基-CO2H基团；
或者，R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基；
■R6表示氢原子或(C1-C6)烷基；
■R7和R8彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基-CO2H基团或(C1-C6)烷基-N(C1-C6)烷基2基团；
或者，R7和R8与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基；
■R9表示彼此独立地选自以下的苯基核的一个或多个取代基：氢原子、-OH、(C1-C4)烷氧基、卤素原子、-NH2、-NH(C1-C6)烷基或-N(C1-C6)烷基2或-NH(C1-C6)环烷基或(C3-C6)杂环烷基；
■R10表示选自氢原子和(C1-C4)烷基的苯基核的至少一个取代基；
■W表示
●(C1-C6)烷基-NH(R11)，更具体为(CH2)nNHR11；
●(C1-C6)烷基-OH，更具体为(CH2)nOH；
●(C1-C6)烷基-SH，更具体为(CH2)nSH；
●CO2H或C(＝O)NH2；
●(C1-C6)烷基-CO2H或(C1-C6)烷基-C(＝O)NH2；或
●(C1-C6)烷基-N3。
W位于苯基核的邻位(o)、间位(m)或对位(p)；
■R11和R12彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基，更具体为甲基；
■n表示1至6之间的整数。
念珠菌素化合物可以为以下D1-D19中的一个：
Figure BDA0001649098600000111
Figure BDA0001649098600000121
Figure BDA0001649098600000131
其中：
■W和R12如式(I)中所定义；
或者，念珠菌素化合物可以为在一个实施例中描述的等同单位(equivalentunit)。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第一组化合物包括其中R1表示(C1-C6)烷基、特别是甲基的化合物。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第二组化合物包括其中R2和R3各自表示氢原子的化合物。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第三组化合物包括其中R2和R3中的一个表示(C1-C6)烷基、特别是甲基且另一个表示氢原子的化合物。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第四组化合物包括其中R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C6)环烷基、特别是环丙基的化合物。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第五组化合物包括其中R4和R5各自表示(C1-C6)烷基、特别是甲基的化合物。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第六组化合物包括其中R6表示氢原子的化合物。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第七组化合物包括其中R7和R8彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基的化合物。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第八组化合物包括其中R9表示选自甲氧基和氯原子的两个取代基的化合物。更具体地，苯基核在苯基核的3位和4位上包括两个取代基。优选地，其为3-Cl和4-甲氧基。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第九组化合物包括其中R10表示氢原子的化合物。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第十组化合物包括其中W位于苯基核对位的化合物。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第十一组化合物包括其中W选自(C1-C6)烷基-NHR11、特别是(C1-C3)烷基-NHR11、特别是CH2-NH2基团，(C1-C6)烷基-OH、特别是(C1-C3)烷基-OH、特别是CH2-OH基团，(C1-C6)烷基-SH、特别是(C1-C3)烷基-SH和(C1-C6)烷基-CO2H、特别是(C1-C3)烷基-CO2H的化合物。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第十二组化合物包括其中R1表示(C1-C6)烷基、特别是甲基，R2和R3各自表示氢原子，R6表示氢原子，R9表示选自甲氧基和氯原子的两个取代基，更具体地，苯基核在苯基核的3位和4位包括两个取代基，优选其为3-Cl和4-甲氧基且R10表示氢原子的化合物。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第十三组化合物包括其中R1表示(C1-C6)烷基、特别是甲基，R2和R3中的一个表示(C1-C6)烷基、特别是甲基且另一个表示氢原子，R6表示氢原子，R9表示选自甲氧基和氯原子的两个取代基，更具体地，苯基核在苯基核的3位和4位包括两个取代基，优选其为3-Cl和4-甲氧基且R10表示氢原子的化合物。
备选地，W选自(CH2)nNHR11、(CH2)nSH或(CH2)nOH，其中n表示1至6之间的整数。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第十四组化合物包括以下结构(β-环氧化物构型)的化合物：
Figure BDA0001649098600000141
所有这些子集，不论单独还是组合，均是本发明的一部分。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，可以特别提及以下化合物：
Figure BDA0001649098600000151
Figure BDA0001649098600000161
本发明进一步涉及式(II)的念珠菌素有效载荷：
Figure BDA0001649098600000162
其中：
■R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10如式(I)中所定义；
■Y表示(C1-C6)烷基-NR11或(C1-C6)烷基-O或(C1-C6)烷基-S；
或者，Y表示C(＝O)O、C(＝O)NH、(C1-C6)烷基-C(＝O)O或(C1-C6)烷基-C(＝O)NH；
或者，Y表示(C1-C6)烷基-三唑-，如
Figure BDA0001649098600000163
Y位于苯基核的邻位(o)、间位(m)或对位(p)；
■R11表示氢原子或(C1-C6)烷基；
■L表示连接基；
■RCG1表示存在于连接基端部的反应性化学基团，RCG1对抗体上存在的反应性化学基团呈反应性。
在作为本发明主题的式(II)化合物中，第一组化合物包括其中R1表示(C1-C6)烷基、特别是甲基的化合物。
在作为本发明主题的式(II)化合物中，第二组化合物包括其中R2和R3各自表示氢原子的化合物。
在作为本发明主题的式(II)化合物中，第三组化合物包括其中R2和R3中的一个表示(C1-C6)烷基、特别是甲基且另一个表示氢原子的化合物。
在作为本发明主题的式(II)化合物中，第四组化合物包括其中R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C6)环烷基、特别是环丙基的化合物。
在作为本发明主题的式(II)化合物中，第五组化合物包括其中R4和R5各自表示(C1-C6)烷基、特别是甲基的化合物。
在作为本发明主题的式(II)化合物中，第六组化合物包括其中R6表示氢原子的化合物。
在作为本发明主题的式(II)化合物中，第七组化合物包括其中R7和R8彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基的化合物。
在作为本发明主题的式(II)化合物中，第八组化合物包括其中R9表示选自甲氧基和氯原子的两个取代基的化合物。更具体地，苯基核在苯基核的3位和4位上包括两个取代基。优选地，其为3-Cl和4-甲氧基。
在作为本发明主题的式(II)化合物中，第九组化合物包括其中R10表示氢原子的化合物。.
在作为本发明主题的式(II)化合物中，第十组化合物包括其中Y位于苯基核对位的化合物。
在作为本发明主题的式(II)化合物中，第十一组化合物包括其中Y表示(C1-C6)烷基-NR11、特别是(C1-C3)烷基-NR11、更特别是CH2-NH的化合物。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第十二组化合物包括其中R1表示(C1-C6)烷基、特别是甲基，R2和R3各自表示氢原子，R6表示氢原子，R9表示选自甲氧基和氯原子的两个取代基，更具体地，苯基核在苯基核的3位和4位包括两个取代基，优选其为3-Cl和4-甲氧基且R10表示氢原子的化合物。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第十三组化合物包括其中R1表示(C1-C6)烷基、特别是甲基，R2和R3中的一个表示(C1-C6)烷基、特别是甲基且另一个表示氢原子，R6表示氢原子，R9表示选自甲氧基和氯原子的两个取代基，更具体地，苯基核在苯基核的3位和4位包括两个取代基，优选其为3-Cl和4-甲氧基且R10表示氢原子的化合物。
在作为本发明主题的式(II)化合物中，第十四组化合物包括以下结构(β-环氧化物构型)的化合物：
Figure BDA0001649098600000181
所有这些子集，不论单独还是组合，均是本发明的一部分。
在作为本发明主题的式(II)化合物中，可以特别提及以下化合物：
Figure BDA0001649098600000182
Figure BDA0001649098600000191
本发明还涉及式(III)的缀合物:
Figure BDA0001649098600000192
其中：
■R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10如式(I)中所定义；
■Y和L如式(II)中所定义；
■G表示RCG1与RCG2之间的反应产物，其中RCG1为存在于连接基端部的反应性化学基团，RCG2为存在于抗体(Ab)上的正交反应性化学基团；
■Ab表示抗体。
在作为本发明主题的式(III)化合物中，第一组化合物包括其中R1表示(C1-C6)烷基、特别是甲基的化合物。
在作为本发明主题的式(III)化合物中，第二组化合物包括其中R2和R3各自表示氢原子的化合物。
在作为本发明主题的式(III)化合物中，第三组化合物包括其中R2和R3中的一个表示(C1-C6)烷基、特别是甲基且另一个表示氢原子的化合物。
在作为本发明主题的式(III)化合物中，第四组化合物包括其中R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成(C3-C6)环烷基、特别是环丙基的化合物。
在作为本发明主题的式(III)化合物中，第五组化合物包括其中R4和R5各自表示(C1-C6)烷基、特别是甲基的化合物。
在作为本发明主题的式(III)化合物中，第六组化合物包括其中R6表示氢原子的化合物。
在作为本发明主题的式(III)化合物中，第七组化合物包括其中R7和R8彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基的化合物。
在作为本发明主题的式(III)化合物中，第八组化合物包括其中R9表示选自甲氧基和氯原子的两个取代基的化合物。更具体地，苯基核在苯基核的3位和4位上包括两个取代基。优选地，其为3-Cl和4-甲氧基。
在作为本发明主题的式(III)化合物中，第九组化合物包括其中R10表示氢原子的化合物。
在作为本发明主题的式(II)化合物中，第十组化合物包括其中Y位于苯基核对位的化合物。
在作为本发明主题的式(III)化合物中，第十一组化合物包括其中Y表示(C1-C6)烷基-NR11、特别是(C1-C3)烷基-NR11、更特别是CH2-NH的化合物。
在作为本发明主题的式(I)化合物中，第十二组化合物包括以下结构(β-环氧化物构型)的化合物：
Figure BDA0001649098600000211
所有这些子集，不论单独还是组合，均是本发明的一部分。
在作为本发明主题的式(III)化合物中，可以特别提及以下化合物：
Figure BDA0001649098600000212
Figure BDA0001649098600000221
式(II)的念珠藻素有效载荷与抗体之间为了得到式(III)的缀合物的连接通过在有效载荷上存在的对在抗体上存在的反应性基团RCG2具有反应性的反应性化学基团RCG1来制备。RCG1与RCG2之间的反应确保了式(II)化合物通过形成共价键连接至抗体。在式(III)的缀合物中，RCG1和RCG2的部分能够保持形成连接基和抗体之间的连接。
可以提及的RCG1的实例包括：
(i)-C(＝O)-ZaRa反应性基团，其中Za表示单键、O或NH，更具体为O，且Ra表示氢原子或(C1-C6)烷基、(C3-C7)环烷基、烯基芳基、杂芳基或(C3-C7)杂环烷基。芳基可以被选自卤素特别是F、烷基、烷氧基、硝基和氰基的1至5个基团取代；
(ii)以下反应性基团中的一个：马来酰亚胺基
Figure BDA0001649098600000222
基团：卤代乙酰胺基
Figure BDA0001649098600000223
基团，其中R13表示氢原子或(C1-C6)烷基、更具体为Me；-Cl；-N3；-OH；-SH；-NH2；-C≡CH或活化的C≡C，如环辛炔如
Figure BDA0001649098600000231
O-烷基羟基胺或Pictet-Spengler反应基质，如在Agarwal P.,et al.,Bioconjugate Chem 2013,24,846-851中描述的
Figure BDA0001649098600000232
更具体地，-ZaRa可以表示-OH、-OCH3、-OCH2CH＝CH2、
Figure BDA0001649098600000233
(O-NHS)或
Figure BDA0001649098600000234
其中阳离子表示例如钠、钾或铯
Figure BDA0001649098600000235
其中GI表示至少一个电诱导性基团如-NO2或-Hal，特别是-F。他们可以是例如以下基团：
Figure BDA0001649098600000236
Figure BDA0001649098600000237
另一类型的-C(＝O)ZaRa基团如下：
Figure BDA0001649098600000238
更具体地，RCG1可以选自实施例中描述的那些中的一个。
可以提到的RCG2的实施例包括(Garnett M.C.,et al.,Advanced Drug DeliveryReviews 2001,53,171-216)：
(i)赖氨酸中由赖氨酸残基的侧链所带有的存在于抗体表面的ε-氨基；
(ii)抗体重链和轻链的N-末端氨基酸的α-氨基；
(iii)铰链区的糖基；
(iv)半胱氨酸中通过还原链内二硫键而形成的巯基或者工程化半胱氨酸的巯基；
(v)一些谷氨酰胺残基的侧链所带有的存在于抗体表面的酰胺基团；
(vi)使用产生甲酰基甘氨酸的酶引入的醛基。
进来，可以考虑其他缀合方法，例如通过突变引入半胱氨酸(Junutula J.R.,etal.,Nature Biotechnology 2008,26,925-932)、引入允许其他化学类型的非天然氨基酸(Axup J.Y.,et al.,PNAS 2012,109,40,16101-16106)或在抗体聚糖上的缀合(Zhou Q.,et al.,Bioconjugate Chem.2014,25,510-520)。另一个位置特异性修饰抗体的方法为基于使用例如细菌转谷氨酰胺酶(Jeger S.,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2010,49,9995-9997；Strop P.,et al.,Chem.Biol.2013,20,161-167)或产生甲酰基甘氨酸的酶(HudakJ.E.,et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,4161-4165)进行酶标记。关于位点特异性缀合策略的综述，参见Agarwal P.and Bertozzi C.R.,Bioconjugate Chem 2015,26,176-192。这些缀合技术还可以应用于本发明中描述的念珠藻素有效载荷。
还可以化学修饰抗体从而引入新的反应性基团RCG2。因此，本领域技术人员熟知如何借助引入例如活化的二硫化物、巯基、马来酰亚胺基卤代乙酰胺基的修饰剂来修饰抗体(参见例如WO2005/077090，第14页和WO2011/001052)。修饰可以实现改善缀合反应以及使用范围更广的基团RCG1。
更具体地，在RCG1为上述类型(ii)的情况下，可以使用精确的修饰剂来化学修饰抗体或者引入一种或多种非天然氨基酸从而引入精确的官能团RCG2。例如：
-当RCG1表示N-羟基琥珀酰亚胺基酯时，RCG2表示-NH2基团；
-当RCG1表示马来酰亚胺基或卤代乙酰胺基官能团或-Cl时，RCG2可以为-SH；
-当RCG1表示-N3时，RCG2可以为-C≡CH或活化的C≡C如环辛炔基团；
-当RCG1表示-OH或-NH2时，RCG2可以为羧酸或酰胺官能团；
-当RCG1表示-SH时，RCG2可以为马来酰亚胺基或卤代乙酰胺基官能团；
-当RCG1表示-C≡CH官能团或活化的C≡C时，RCG2可以为-N3；
-当RCG1表示-O-烷基羟基胺官能团或Pictet-Spengler反应基质时，RCG2可以为醛或酮官能团。
可以提及的G的实例包括：
Figure BDA0001649098600000251
本发明涉及式(II)念珠藻素有效载荷和涉及式(III)的缀合物：
Figure BDA0001649098600000252
其中，连接基L为式(IV)：
Figure BDA0001649098600000253
其中：
■L1表示
■若Y＝(C1-C6)烷基-N(R11)，则为单键或NR16(杂)芳基-CR15R14-O-C(＝O)基团；
■若Y＝(C1-C6)烷基-O-或(C1-C6)烷基-S，则为NR18-(C2-C6)烷基-NR17-C(＝O)基团或NR16(杂)芳基-CR15R14-O-C(＝O)NR18-(C2-C6)烷基-NR17-C(＝O)基团；
■若Y＝C(＝O)O、C(＝O)NH、(C1-C6)烷基-C(＝O)O或(C1-C6)烷基-C(＝O)NH，则为NR16(杂)芳基-CR15R14基团；
■R11、R14、R15、R16、R17和R18彼此独立地表示H或(C1-C6)烷基；
■(AA)w表示经由肽键连接的w氨基酸AA的序列；
■w表示1至12的整数，优选1至6的整数，更特别为2或3；
■L2表示单键或(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基或(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基或CH(SO3H)-(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基-CH(SO3H)基团或(C1-C6)烷基-环己基基团或NR19-(C1-C6)烷基或NR20-(CH2CH2O)i(C1-C6)烷基或NR21-芳基基团或NR21-杂芳基基团或(C1-C6)烷基-NR22C(＝O)-(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基-NR22C(＝O)-(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团。更具体地，L2表示(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或CH(SO3H)-(C1-C6)烷基；
■R19、R20、R21和R22彼此独立地表示H或(C1-C6)烷基；
■i表示1至50之间的整数，优选1至10之间的整数(i可以采纳1和50之间的任何数值)。
AA表示构型为D或L的天然或非天然氨基酸，更具体地选自：丙氨酸(Ala)、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、2-氨基-2-环己基乙酸、2-氨基-2-苯基乙酸、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、瓜氨酸(Cit)、半胱氨酸(Cys)、α,α-二甲基-γ-氨基丁酸、β,β-二甲基-γ-氨基丁酸、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、ε-乙酰基-赖氨酸(AcLys)、甲硫氨酸(Met)、鸟氨酸(Orn)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)。更具体地，AA选自丙氨酸(Ala)、瓜氨酸(Cit)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、ε-乙酰基-赖氨酸(AcLys)、缬氨酸(Val)。
序列(AA)w具有式：
Figure BDA0001649098600000261
其中R23表示上述的氨基酸中的一种的侧链。序列的实例如下：Gly-Gly、Phe-Lys、Val-Lys、Val-AcLys、Val-Cit、Phe-Phe-Lys、D-Phe-Phe-Lys、Gly-Phe-Lys、Ala-Lys、Val-Ala、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Ala、Ala-Phe、Gly-Gly-Gly、Gly-Ala-Phe、Gly-Val-Cit、Gly-Phe-Leu-Cit、Gly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu。
对于Y＝(C1-C6)烷基-N(R11)，更具体地CH2NH，RCG1-L可以为以下中(IV1-17)的一个：
Figure BDA0001649098600000271
Figure BDA0001649098600000281
其中:
■(AA)w表示经由肽键连接在一起的w氨基酸AA的序列，如上所述；
■w表示1至12、优选1至6之间的范围的整数，且更具体地2或3；
■i表示1至50之间、优选1至10之间的整数(i可以采纳1至50之间的所有数值)；
■M1、M2、M3和M4彼此独立地选自CR24和N；
■R19、R20、R21、R22和R24彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基，更具体为氢原子或甲基。
对于Y＝(C1-C6)烷基-O或(C1-C6)烷基-S，更具体地CH2O或CH2S，RCG1-L可以为以下(IV18-34)中的一个：
Figure BDA0001649098600000282
Figure BDA0001649098600000291
Figure BDA0001649098600000301
其中：
■(AA)w表示经由肽键连接在一起的w氨基酸AA的序列，如上所述；
■w表示1至12、优选1至6之间的范围的整数，且更具体地2或3；
■i表示1至50之间、优选1至10之间的整数(i可以采纳1至50之间的所有数值)；
■M1、M2、M3和M4彼此独立地选自CR24和N；
■R17,R18,R19、R20、R21、R22和R24彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基，更具体为氢原子或甲基。
对于Y＝(C1-C6)烷基-N(R11)，更具体地CH2NH，RCG1-L还可以为以下(IV35-51)中的一个：
Figure BDA0001649098600000302
Figure BDA0001649098600000311
Figure BDA0001649098600000321
其中：
■(AA)w表示经由肽键连接在一起的w氨基酸AA的序列，如上所述；
■w表示1至12、优选1至6之间的范围的整数，且更具体地2或3；
■i表示1至50之间、优选1至10之间的整数(i可以采纳1至50之间的所有数值)；
■J1、J2、J3和J4彼此独立地选自CR24和N；
■M1、M2、M3和M4彼此独立地选自CR24和N；
■R14、R15、R16、R19、R20、R21、R22和R24彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基，更具体为氢原子或甲基。
对于Y＝(C1-C6)烷基-O或(C1-C6)烷基-S，更具体地CH2O或CH2S，RCG1-L还可以为以下(IV52-68)中的一个：
Figure BDA0001649098600000322
Figure BDA0001649098600000331
Figure BDA0001649098600000341
其中：
■(AA)w表示经由肽键连接在一起的w氨基酸AA的序列，如上所述；
■w表示1至12、优选1至6之间的范围的整数，且更具体地2或3；
■i表示1至50之间、优选1至10之间的整数(i可以采纳1至50之间的所有数值)；
■J1、J2、J3和J4彼此独立地选自CR24和N；
■M1、M2、M3和M4彼此独立地选自CR24和N；
■R14、R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22和R24彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基，更具体为氢原子或甲基。
对于Y＝C(＝O)O、C(＝O)NH、(C1-C6)烷基-C(＝O)O或(C1-C6)烷基-C(＝O)NH，更具体地C(＝O)O或CH2-C(＝O)O，RCG1-L可以为以下(IV69-85)中的一个：
Figure BDA0001649098600000342
Figure BDA0001649098600000351
Figure BDA0001649098600000361
其中：
■(AA)w表示经由肽键连接在一起的w氨基酸AA的序列，如上所述；
■w表示1至12、优选1至6之间的范围的整数，且更具体地2或3；
■i表示1至50之间、优选1至10之间的整数(i可以采纳1至50之间的所有数值)；
■J1、J2、J3和J4彼此独立地选自CR24和N；
■M1、M2、M3和M4彼此独立地选自CR24和N；
■R14、R15、R16、R19、R20、R21、R22和R24彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基，更具体为氢原子或甲基。
对于Y＝C(＝O)或(C1-C6)烷基-C(＝O)，本发明还涉及式(II)的念珠藻素有效载荷和涉及式(III)的缀合物；
Figure BDA0001649098600000371
其中，连接基L为式(V)：
Figure BDA0001649098600000372
其中：
■(AA)’w表示经由肽键连接在一起的w氨基酸AA的序列；
■w表示1至12、优选1至6之间的范围的整数，且更具体地2或3；
■R25表示氢原子或(C1-C6)烷基；
■L3表示(C1-C6)烷基或(CH2CH2O)i-(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i基团或CH(SO3H)-(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基-(OCH2CH2)i-O(C1-C6)烷基或NR19-(C1-C6)烷基或NR20-(CH2CH2O)iCH2CH2基团或(C1-C6)烷基-环己基-C(＝O)NR19-(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基-环己基-C(＝O)NR20-(CH2CH2O)i-CH2CH2基团或NR21-芳基-C(＝O)NR19-(C1-C6)烷基或NR21-杂芳基-C(＝O)NR19-(C1-C6)烷基或(C1-C6)烷基-NR22C(＝O)(CH2CH2O)i-(C1-C6)烷基；
■R19、R20、R21、R22和R25表示氢原子或(C1-C6)烷基；
■RCG1表示对抗体上存在的反应性化学基团呈反应性的反应性化学基团，如上文所定义；
■R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10如本文所定义。
AA表示构型为D或L的天然或非天然氨基酸，更具体地选自：丙氨酸(Ala)、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、2-氨基-2-环己基乙酸、2-氨基-2-苯基乙酸、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、瓜氨酸(Cit)、半胱氨酸(Cys)、α,α-二甲基-γ-氨基丁酸、β,β-二甲基-γ-氨基丁酸、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、ε-乙酰基-赖氨酸(AcLys)、甲硫氨酸(Met)、鸟氨酸(Orn)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)。更具体地，AA选自丙氨酸(Ala)、瓜氨酸(Cit)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、ε-乙酰基-赖氨酸(AcLys)、缬氨酸(Val)
序列(AA)’w具有式：
Figure BDA0001649098600000381
其中R26表示如上所述的氨基酸的一种的侧链。序列的实例如下：Gly-Gly、Lys-Phe、Lys-Val、AcLys-Val、Cit-Val、Lys-Phe-Phe、Lys-Phe-DPhe、Lys-Phe-Gly、Lys-Ala、Ala-Val、Cit-Phe、Cit-Leu、Cit-Ile、Cit-Trp、Ala-Phe、Phe-Ala、Gly-Gly-Gly、Phe-Ala-Gly、Cit-Val-Gly、Cit-Leu-Phe-Gly、Gly-Leu-Phe-Gly、Leu-Ala-Leu-Ala.
对于Y＝C(＝O)或(C1-C6)烷基-C(＝O)，更具体地C(＝O)或CH2-C(＝O)，RCG1-L可以为以下(V86-101)中的一个：
Figure BDA0001649098600000382
Figure BDA0001649098600000391
其中：
■(AA)’w表示经肽键连接在一起的w氨基酸AA的序列，如上所述；
■w表示1至12、优选1至6之间的范围的整数，且更具体地2或3；
■i表示1至50之间、优选1至10之间的整数(i可以采纳1至50之间的所有数值)；
■M1、M2、M3和M4彼此独立地选自CR24和N；
■R19、R20、R21、R22、R24和R25彼此独立地表示氢原子或(C1-C6)烷基，更具体为氢原子或甲基。
连接基L还可以选自所说明的化合物。
根据本发明，通式(I)、(II)和(III)的化合物可以通过以下方法制备。
念珠藻素化合物的制备方法
在W＝CH2N3或CH2NH2的情况下，制备式(I)化合物的一般途径A
Figure BDA0001649098600000401
方案1
片段A、B、C和D允许借助下面详细的步骤制备念珠藻素化合物P1至P3:
步骤(i)：片段AD1和BC之间在偶联剂如HOAt和HATU的存在下的肽偶联；
步骤(ii)：在酸性条件下使用例如TFA进行脱保护并在偶联剂如HOAt和HATU的存在下大环化；
步骤(iii)：使用例如m-CPBA将烯烃氧化形成环氧化物；
步骤(v)：使用例如TCEP还原叠氮基。
片段A和B根据下文描述的合成制备。作为甲基酯保护的片段C对于以下市售可得R4＝H,R5＝Me(R),R2＝R3＝H(CAS号[92535-26-7])；R4＝H,R5＝Me(S),R2＝R3＝H(CAS号[118138-56-0])；R4＝R5＝Me,R2＝R3＝H(CAS号[25307-82-8])；R2＝H,R3＝Me(R),R4＝H,R5＝Me(R)(CAS号[86544-92-5])；R2＝H,R3＝Me(S),R4＝H,R5＝Me(R)(CAS号[86544-93-6])；R2＝H,R3＝Me(R),R4＝R5＝Me(CAS号[1315052-25-5])；R2＝H,R3＝Me(S),R4＝R5＝Me(CAS号[1315050-96-4])；R2＝H,R3＝iPr(R),R4＝R5＝Me(CAS号[1314999-06-8])；R2＝H,R3＝iPr(S),R4＝R5＝Me(CAS号[1315054-33-1])；R2＝R3＝R4＝R5＝Me(CAS号[90886-53-6])；R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成环丙基(CAS号[914226-26-9])。它们还可以如实施例中描述的进行制备。非市售可得的片段C如实施例中描述的制备。所有的片段D均市售可得：L-Fmoc-Ala-OH(CAS号[35661-39-3])；L-Fmoc-Val-OH(CAS号[68858-20-8])；L-Fmoc-叔-Leu-OH(CAS号[132684-60-7])；L-Fmoc-Leu-OH(CAS号[35661-60-0])；L-Fmoc-NMe-Leu-OH(CAS号[103478-62-2])；L-Fmoc-3-二甲基氨基-Ala-OH(CAS号[587880-86-2])；L-Fmoc-(O烯丙基)Asp-OH(CAS号[146982-24-3])；L-Fmoc-4-甲基-Leu-OH(CAS号[139551-74-9])。构造块AD1和BC根据下面描述的合成制备。
在W＝CH2OH或CH2N3或CH2NH2的情况下，制备式(I)化合物的一般途径B
Figure BDA0001649098600000421
方案2
片段A、B、C和D允许借助下面详述的步骤制备念珠藻素化合物P2至P4：
步骤(i)：片段AD1和BC之间在偶联剂如HOAt和HATU的存在下肽偶联；
步骤(ii)：在酸性条件下使用例如TFA进行脱保护，在偶联剂如HOAt和HATU的存在下大环化，并在pH 6-7使用例如在水和AcOEt的混合物中的NaOH乙酸酯水解；
步骤(iii)：使用例如氯三异丙基硅烷在碱如咪唑的存在下苄醇保护为甲硅烷基醚；使用例如m-CPBA将烯烃氧化形成环氧化物；使用例如TBAF溶液脱保护甲硅烷基醚。
步骤(iv)：在DPPA和碱如DBU的存在下叠氮化；
步骤(v)：使用例如TCEP还原叠氮基。
片段A和B根据下文描述的合成制备。片段C要么如前文中报道的市售可得或如实施例中描述的进行制备。所有的片段D如前文中报道的市售可得。构造块AD2和BC根据下面描述的合成制备。
在W＝CH2OH或CH2N3或CH2NH2的情况下，制备式(I)化合物的一般途径C
Figure BDA0001649098600000431
方案3
Sakurai醇和片段B、C和D允许借助下面详述的步骤制备念珠藻素化合物P2至P4：
步骤(i)：片段AD3和可选的BC之间在偶联剂如HOAt和HATU的存在下的肽偶联；
步骤(ii)：在催化剂如Grubbs I催化剂的存在下通过环闭合置换进行大环化；
步骤(iii)：p-甲氧基苄基醚在酸性条件如10％TFA中脱保护；
步骤(iv)：使用氧化剂如TEMPO在次氯酸钠存在下将醇氧化；
步骤(v)：通过不对称Corey-Chaykovsky反应使用适当取代的异硫代桉树脑(isothiocineole)衍生的手性鋶在碱如磷腈碱P2-Et的存在下引入环氧化物；
步骤(vi)：使用例如TCEP还原叠氮基。
Sakurai醇和片段B根据下文描述的合成制备。片段C要么如前文中报道的市售可得或如实施例中描述的进行制备。所有的片段D如前文中报道的市售可得。构造块AD3和可选的BC根据下面描述的合成制备。
在W＝CH2SH的情况下，制备式(I)化合物
Figure BDA0001649098600000441
方案4
P4允许借助下面详述的步骤制备其他念珠藻素化合物P5和P6：
步骤(i)：使用甲磺酰氯在碱如DIEA的存在下引入氯基团；
步骤(ii)：使用从TBAF和六甲基二硅硫烷原位制备的四丁基铵三甲基甲硅烷基硫醇酯进行官能化，根据Hu J.,et al.,J.Org.Chem.1999,64,4959-496：在该反应的过程中，通常形成在方案3中描述的中间体二聚物；
步骤(iii)：使用膦如TCEP还原二聚体。
方案1、2、3和4描述了n＝1的情况，但是也可适用于制备n>1的情况从P2、P3或P4开始的式(I)化合物，借助于下文详述的步骤并描述于WO2011/001052的方案2中：
Figure BDA0001649098600000451
方案5
步骤(i)：在酸性介质中打开环氧化物的环，从而得到二醇官能团；例如，可以使用浓高氯酸；
步骤(ii)：使用例如高碘酸钠氧化解离该二醇；
步骤(iii)：Wittig反应，使用合适的卤化鏻例如溴化鏻和强碱如BuLi；
步骤(iv)：将烯烃氧化形成环氧化物，使用例如m-CPBA；
步骤(v)：甲硅烷基醚的脱保护，使用例如TBAF溶液。
在W＝CO2H的情况下，制备式(I)化合物
Figure BDA0001649098600000461
方案6
P4允许借助下面详述的步骤制备其他念珠藻素化合物P7和P8：
步骤(i)：使用戴斯-马丁试剂氧化；
步骤(ii)：在2-甲基-2-丁烯的存在下的Pinnick类型的氧化(Pinnick H.W.,Tetrahedron 1981,37,2091-2096)。
方案6描述了n＝0的情形，但是也可适用于制备以下情况下的式(I)化合物：W＝(CH2)nCO2H，起始于承载(CH2)n+1OH基团的P4的类似物。方案1、2、3、4、5和6针对对位的连接基给出，但是可以一致地适用于邻位或间位位置。类似地，它们针对念珠藻素化合物给出，但是也可以适用于制备其他式(I)化合物，特别是D1-D19。
念珠藻素有效载荷的制备方法
式(II)化合物可以根据方案7制备，起始于式(I)的念珠藻素化合物和连接基前体(LP)：
Figure BDA0001649098600000462
方案7
W表示
●(C1-C6)烷基-NH(R11)，更具体为(CH2)nNHR11；
●(C1-C6)烷基-OH，更具体为(CH2)nOH；
●(C1-C6)烷基-SH，更具体为(CH2)nSH；
●CO2H；
●(C1-C6)烷基-CO2H，更具体为(CH2)nCO2H；或
●(C1-C6)烷基-N3。
其中R11表示氢原子或(C1-C6)烷基，更具体为甲基。
连接基前体LP具有在基团W和存在于LP上的化学官能团之碱的反应后将连接基L的前体引入念珠藻素化合物的功能。
在方案7中，一些步骤和/或反应对于从念珠藻素化合物(I)制备念珠藻素有效载荷(II)是必要的。例如，在ZaRa＝-O-NHS的情况下，连接基L(其中ZaRa＝-O-烯丙基)可以使用相应的连接基前体、接着将酯官能团脱保护并引入-O-NHS来引入。脱保护可以通过以钯催化剂处理来进行，例如在清除剂胺例如吗啉的存在下的Pd(PPh3)4；活化可以使用DSC在碱如DIEA的存在下进行，或者使用NHS在偶联剂如DCC的存在下进行。基团ZaRa转化至另一基团ZaRa(例如-O-烯丙基→-O-NHS)可以适用于得到其他基团ZaRa，特别是上述描述的那些。
方案7’类似地说明了制备包含分别承载以下基团的连接基的念珠藻素化合物：马来酰亚胺基、卤代乙酰氨基、氨基或叠氮基(L*表示连接基的片段使得L＝-L*-马来酰亚胺基或L＝-L*-卤代乙酰胺基或L＝-L*-NH2-或L＝-L*-N3)。
Figure BDA0001649098600000471
方案7’
这些化合物通过包括含氨基的连接基L’的念珠菌素化合物与修饰剂之间的反应分别引入马来酰亚胺基、卤代乙酰氨基、氨基或叠氮基来得到。
式(II)化合物可以备选地根据方案8起始于相同的式(I)的念珠藻素化合物和另一连接基前体(LP’)来制备：
Figure BDA0001649098600000481
方案8
在方案8中，一些步骤和/或反应对于起始于念珠菌素化合物(I)实现念珠菌素有效载荷(II)是必要的。例如，在ZaRa＝-O-NHS的情况下，受保护的连接基前体L’可以引入，接着脱保护并偶联至连接基前体L”从而引入羧酸官能团，其可直接活化为ZaRa＝-O-NHS，或者首先脱保护并接着活化(L’和L”表示连接基的片段，使得L＝L’-L”)。脱保护可以以碱如哌啶进行处理；偶联至连接基L”可以通过环状酸酐如戊二酸酐的打开来处理；活化可以使用DSC在碱如DIEA的存在下进行或者在偶联剂如DCC的存在下以使用NHS进行。
基团W和LP上存在的化学官能团之间的反应的实例为携带羧酸官能团的连接基前体LP和W＝(CH2)nNH2之间或者携带胺官能团的连接基前体LP和W＝CO2H或(CH2)nCO2H之间的酰胺化：反应可以在偶联剂如EDCI或HOBt的存在下进行。也可根据下文的方案(R17＝H或(C1-C6)烷基)，使带有胺官能团连接基前体LP与从W＝(CH2)nOH和对硝基苯基氯甲酸酯(活化碳酸酯形式的醇)得到的W’＝(CH2)nO-C(＝O)-O-(4-硝基苯基)反应：
-NHR17+crypto-(CH2)nO-C(＝O)-O-(4-硝基苯基)→crypto-(CH2)nO-C(＝O)-NR17-
相同类型的反应还能在带有活化为碳酸酯的醇官能团的连接基前体LP和W＝(CH2)nNH2之间进行。反应的另一实例为带有醇官能团的连接基和W＝CO2H或(CH2)nCO2H之间的酯化反应：该反应可以在偶联剂如MNBA的存在下进行。反应的另一实例为带有炔官能团的连接基前体和W＝(CH2)N3之间的铜催化的叠氮化物-炔环加成：该反应可以在硫酸铜和抗坏血酸钠的存在下进行。
在W＝(CH2)nNH2和L＝(IV1)，其中n＝1,R15＝H且ALK＝(CH2)3的情况下，基于方案 7，制备式(II)化合物
Figure BDA0001649098600000491
方案9
步骤(i)：在偶联剂如EDC和HOBt以及碱如DIEA的存在下进行肽偶联；
步骤(ii)：在催化剂如四-(三苯基膦)钯的存在下对烯丙基酯脱保护；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯，通过在碱如DIEA的存在下的DSC处理。
在W＝(CH2)nNH2和L＝(IV1)，其中n＝1,R11＝H且ALK＝(CH2)3的情况下，基于方案 8，制备式(II)化合物
Figure BDA0001649098600000501
方案10
步骤(i)：在偶联剂如EDC和HOBt以及碱如DIEA的存在下的肽偶联；
步骤(ii)：在碱如哌啶的存在下对Fmoc胺进行脱保护；
步骤(iii)：偶联至戊二酸酐；
步骤(iv)：羧酸活化为NHS酯，通过在碱如DIEA的存在下的DSC处理。
方案9和10描述了以下情况：L(IV1)，其中n＝1，R11＝H和ALK＝(CH2)3，但是它们也可适用于其他连接基L，其中RCG1＝C(＝O)ONHS，即L(IV1)，其中n≠1和/或R11≠H和/或ALK≠(CH2)3的情况以及L(IV2)和L(IV3)的情况。它们针对对位的连接基给出，但是可以一致地适用于邻位或间位位置。类似地，它们针对念珠藻素化合物给出，但是也可适用于制备其他式(I)化合物，特别是D1-D19。
在W＝(CH2)nNH2，其中n＝1,R11＝和RCG1＝马来酰亚胺基、卤代乙酰氨基、NH2、N3或 环辛炔剂即连接基L(IV4)至L(IV17)的情况下，制备式(II)化合物
Figure BDA0001649098600000511
方案11
步骤(i)：在偶联剂如EDC和HOBt以及碱如DIEA的存在下的肽偶联；
步骤(ii)：在碱如哌啶的存在下对Fmoc胺进行脱保护。
方案11描述了如下情形：L(IV4)，其中n＝1，R11＝H和ALK＝(CH2)5，L(IV8)，其中n＝1和R11＝H，L(IV12)，其中n＝1，R11＝H和ALK＝(CH2)4，L(IV14)，其中n＝1，R11＝H和ALK＝(CH2)3和L(IV16)，其中n＝1，R11＝H，ALK＝(CH2)3和ALK’＝(CH2)2，但是其也适用于其他连接基L(IV4)至L(IV17)，其中RCG1＝马来酰亚胺基、碘代乙酰氨基、NH2、N3或环辛炔。对于碘代乙酰氨基反应性基团进行了描述，但是对于溴乙酰氨基反应性基团一致地适用。其针对对位的连接基给出，但是可以一致地适用于邻位或间位位置。类似地，其针对念珠藻素化合物给出，但是还可以适用于制备其他式(I)化合物，特别是D1-D19。
在W＝(CH2)nX，其中X＝O或S和L＝(IV18)，其中n＝1，R17和R18＝H且ALK＝(CH2)3情 况下，基于方案7，制备式(II)化合物
Figure BDA0001649098600000521
方案12
步骤(i)：将苄醇或苄硫醇活化为对-硝基苯基-(硫代)碳酸酯，通过利用对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下的处理；
步骤(ii)：通过与胺在碱如DIEA的存在下反应形成(硫代)氨基甲酸酯；
步骤(iii)：在催化剂如四(三苯基膦)钯的存在下对烯丙基酯脱保护；
步骤(iv)：通过在碱如DIEA的存在下的DSC处理将羧酸活化为NHS酯。
在W＝(CH2)nX，其中X＝O或S和L＝(IV18)，其中n＝1,R17和R18＝H和ALK＝(CH2)3的 情况下，基于方案8，制备式(II)化合物
Figure BDA0001649098600000531
方案13
步骤(i)：通过与胺在碱如DIEA的存在下反应形成(硫代)氨基甲酸酯；
步骤(ii)：在碱如哌啶的存在下对Fmoc胺进行脱保护；
步骤(iii)：偶联至戊二酸酐；
步骤(iv)：通过在碱如DIEA的存在下的DSC处理将羧酸活化为NHS酯。
方案12和13描述了以下情况：L(IV18)，其中n＝1，R17和R18＝H和ALK＝(CH2)3，但是它们也可适用于其他连接基L，其中RCG1＝C(＝O)ONHS，即L(IV18)，其中n≠1和/或R17，R18≠H和/或ALK≠(CH2)3的情况以及L(IV19)和L(IV20)的情况。它们针对对位的连接基给出，但是也可一致地适用于邻位或间位。类似地，它们针对念珠藻素化合物给出，但是也可适用于制备其他式(I)化合物，特别是D1-D19。
在W＝(CH2)nX，其中X＝O或S且RCG1＝马来酰亚胺基、卤代乙酰氨基、NH2、N3或环辛 炔，即连接基L(IV21)至(IV34)的情况下，制备式(II)化合物
Figure BDA0001649098600000541
方案14
步骤(i)：(硫代)氨基甲酸酯的形成，反应在碱如DIEA的存在下进行；
步骤(ii)：在碱如哌啶的存在下对Fmoc胺进行脱保护。
方案14描述了以下情形：L(IV21)，其中n＝1、R17和R18＝H和ALK＝(CH2)5的情形，L(IV25)，其中n＝1和R17及R18＝H的情形，L(IV29)，其中n＝1，R17和R18＝H和ALK＝(CH2)4的情形，L(IV31)，其中n＝1，R17和R18＝H和ALK＝(CH2)3的情形，以及L(IV33)，其中n＝1、R17、R18和R22＝H，ALK＝(CH2)3和ALK’＝(CH2)2的情形，但是其也适用于其他连接基L(IV21至34)，其中RCG1＝马来酰亚胺基、碘代乙酰氨基、NH2,、N3或环辛炔。对于碘代乙酰氨基反应性基团进行了描述，但是一致地适用于溴乙酰氨基反应性基团。其针对对位的连接基给出，但是一致地适用于邻位或间位。类似地，其针对念珠藻素化合物给出，但是也可适用于制备其他式(I)化合物，特别是D1-D19。
在W＝(CH2)nNH2和L＝(IV35)，其中n＝1，R11＝R14＝R15＝R16＝H，J1＝J2＝J3＝J4＝ CH和ALK＝(CH2)3的情况下，基于方案7，制备式(II)化合物
Figure BDA0001649098600000551
方案15
步骤(i)：氨基甲酸酯的形成，反应在碱如DIEA的存在下进行；
步骤(ii)：在催化剂如四-(三苯基膦)钯的存在下对烯丙基酯脱保护；
步骤(iii)：通过在碱如DIEA的存在下的DSC处理将羧酸活化为NHS酯。
在W＝(CH2)nNH2和L＝(IV35)，其中n＝1，R11＝R14＝R15＝R16＝H，J1＝J2＝J3＝J4＝ CH和ALK＝(CH2)3的情况下，基于方案8，制备式(II)化合物
Figure BDA0001649098600000561
方案16
步骤(i)：氨基甲酸酯的形成，反应在碱如DIEA的存在下在合适的对硝基苯基碳酸酯试剂的存在下进行；
步骤(ii)：在碱如哌啶的存在下对Fmoc胺进行脱保护；
步骤(iii)：偶联至戊二酸酐；
步骤(iv)：通过在碱如DIEA的存在下的DSC处理将羧酸活化为NHS酯。
方案15和16描述了以下情况：L(IV35)，其中n＝1，R11＝R14＝R15＝R16＝H，J1＝J2＝J3＝J4＝CH，对-苄醇和ALK＝(CH2)3，但是它们也可适用于其他连接基L，其中RCG1＝C(＝O)ONHS，即L(IV35)，其中n≠1和/或R11，R14，R15，R16≠H和/或J1，J2，J3，J4≠CH和/或邻-苄醇和/或ALK≠(CH2)的情形，以及L(IV36)和L(IV37)的情形。它们针对对位的连接基给出，但是一致地适用于邻位或间位。类似地，它们针对念珠藻素化合物给出，但是也可适用于制备其他式(I)化合物，特别是D1-D19。
在W＝(CH2)nNH2，其中n＝1，R11＝R14＝R15＝R16＝H，J1＝J2＝J3＝J4＝CH和RCG1＝马 来酰亚胺基、卤代乙酰氨基、NH2、N3或环辛炔即连接基L(IV38)至L(IV151)的情况下，制备式 (II)化合物
Figure BDA0001649098600000571
方案17
步骤(i)：氨基甲酸酯的形成，反应在碱如DIEA的存在下在合适的对硝基苯基碳酸酯试剂的存在下进行；
步骤(ii)：在碱如哌啶的存在下对Fmoc胺进行脱保护。
方案17描述了以下情形：L(IV38)，其中n＝1，R11＝R14＝R15＝R16＝H，J1＝J2＝J3＝J4＝CH，对苄醇和ALK＝(CH2)5，L(IV42)，其中n＝1,R11＝R14＝R15＝R16＝H和J1＝J2＝J3＝J4＝CH和对-苄醇，L(IV46)，其中n＝1,R11＝R14＝R15＝R16＝H,J1＝J2＝J3＝J4＝CH,对苄醇和ALK＝(CH2)4,L(IV48)，其中n＝1,R11＝R14＝R15＝R16＝H,J1＝J2＝J3＝J4＝CH,对苄醇和ALK＝(CH2)3，以及L(IV50)，其中n＝1,R11＝R14＝R15＝R16＝R22＝H,J1＝J2＝J3＝J4＝CH,对-苄醇,ALK＝(CH2)3和ALK’＝(CH2)2，但是其也适用于其他连接基L(IV38)至L(IV51)，其中RCG1＝马来酰亚胺基、碘代乙酰氨基、NH2、N3或环辛炔。其针对对苄醇给出，但是也可适用于邻-苄醇。其针对碘代乙酰氨基反应性基团描述，但是可以一致地适用于溴乙酰氨基反应性基团。其针对对位连接基给出，但是一致地适用于邻位或间位。类似地，其针对念珠藻素化合物给出，但是也可适用于制备其他式(I)化合物，特别是D1-D19.
在W＝(CH2)nX，其中X＝O或S和L＝(IV52)，其中n＝1,R14＝R15＝R16＝R17＝R18＝H, J1＝J2＝J3＝J4＝CH和ALK＝(CH2)3的情况下，基于方案7，制备式(II)化合物
Figure BDA0001649098600000581
方案18
步骤(i)：通过与胺在碱如DIEA的存在下反应形成(硫代)氨基甲酸酯；
步骤(ii)：在催化剂如四(三苯基膦)钯的存在下对烯丙基酯脱保护；
步骤(iii)：通过在碱如DIEA的存在下的DSC处理将羧酸活化为NHS酯。
在W＝(CH2)nX，其中X＝O或S和L＝(IV52)，其中n＝1，R14＝R15＝R16＝R17＝R18＝H， J1＝J2＝J3＝J4＝CH和ALK＝(CH2)3的情况下，基于方案8，制备式(II)化合物
Figure BDA0001649098600000591
方案19
步骤(i)：通过与胺在碱如DIEA的存在下反应形成(硫代)氨基甲酸酯；
步骤(ii)：在碱如哌啶的存在下对Fmoc胺进行脱保护；
步骤(iii)：偶联至戊二酸酐；
步骤(iv)：通过在碱如DIEA的存在下的DSC处理将羧酸活化为NHS酯。
方案18和19描述了以下情况：L(IV52)，其中n＝1,R14＝R15＝R16＝R17＝R18＝H,J1＝J2＝J3＝J4＝CH,对苄醇和ALK＝(CH2)3，但是它们也可适用于其他连接基L，其中RCG1＝C(＝O)ONHS，即L(IV52)，其中n≠1和/或R14,R15,R16,R17,R18≠H和/或J1,J2,J3,J4≠CH和/或邻-苄醇和/或ALK≠(CH2)3的情形以及L(IV53)和L(IV54)的情形。它们针对对位的连接基给出，但是一致地适用于邻位或间位。类似地，它们针对念珠藻素化合物给出，但是也可适用于制备其他式(I)化合物，特别是D1-D19。
在W＝(CH2)nX，其中X＝O或S和RCG1＝马来酰亚胺基、卤代乙酰氨基、NH2、N3或环辛 炔即连接基L(IV55)至(IV68)的情况下，制备式(II)化合物
Figure BDA0001649098600000601
方案20
步骤(i)：通过与胺在碱如DIEA的存在下反应形成(硫代)氨基甲酸酯；
步骤(ii)：在碱如哌啶的存在下对Fmoc胺进行脱保护。
方案20描述了L(IV55)，其中n＝1,R14＝R15＝R16＝R17＝R18＝H,J1＝J2＝J3＝J4＝CH,对-苄醇,ALK＝(CH2)2和ALK’＝(CH2)5的情况，L(IV59)，其中n＝1,R14＝R15＝R16＝R17＝R18＝H,J1＝J2＝J3＝J4＝CH,对苄醇和ALK＝(CH2)2的情况，L(IV63)，其中n＝1,R14＝R15＝R16＝R17＝R18＝H,J1＝J2＝J3＝J4＝CH,对-苄醇,ALK＝(CH2)2和ALK’＝(CH2)4的情况，L(IV65)，其中n＝1,R14＝R15＝R16＝R17＝R18＝H,J1＝J2＝J3＝J4＝CH,对-苄醇,ALK＝(CH2)2和ALK’＝(CH2)3的情况，以及L(IV67)，其中n＝1,R14＝R15＝R16＝R17＝R18＝R22＝H,J1＝J2＝J3＝J4＝CH,对-苄醇,ALK＝(CH2)2,ALK’＝(CH2)5和ALK”＝(CH2)2的情况，但是其也适用于其他连接基L(IV55至68)，其中RCG1＝马来酰亚胺基,碘代乙酰氨基,NH2,N3或环辛炔。其针对碘代乙酰氨基反应性基团进行描述，但是可一致地适用于溴乙酰氨基反应性基团。其针对对位连接基给出，但是一致地适用于邻位或间位。类似地，其针对念珠藻素化合物给出，但是也可适用于制备其他式(I)化合物，特别是D1-D19.
在W＝C(＝O)O和L＝(IV69)，其中R14＝R15＝R16＝H，J1＝J2＝J3＝J4＝CH和ALK＝ (CH2)3的情况下，基于方案7，制备式(II)化合物
Figure BDA0001649098600000611
方案21
步骤(i)：在偶联剂如MNBA和碱如DMAP和DIEA的存在下酯化；
步骤(ii)：在催化剂如四-(三苯基膦)钯的存在下对烯丙基酯脱保护；
步骤(iii)：通过在碱如DIEA的存在下的DSC处理将羧酸活化为NHS酯。
在W＝C(＝O)O和L＝(IV69)，其中R14＝R15＝R16＝H,J1＝J2＝J3＝J4＝CH和ALK＝ (CH2)3的情况下，基于方案8，制备式(II)化合物
Figure BDA0001649098600000621
方案22
步骤(i)：在偶联剂如MNBA和碱如DMAP和DIEA的存在下酯化；
步骤(ii)：在碱如哌啶的存在下对Fmoc胺进行脱保护；
步骤(iii)：偶联至戊二酸酐；
步骤(iv)：通过在碱如DIEA的存在下的DSC处理将羧酸活化为NHS酯。
方案21和22描述了以下情况：L(IV69)，其中R14＝R15＝R16＝H，J1＝J2＝J3＝J4＝CH,对苄醇和ALK＝(CH2)3，但是它们也可适用于其他连接基L，其中RCG1＝C(＝O)ONHS，即L(IV69)，其中R14,R15,R16≠H和/或J1,J2,J3,J4≠CH和/或邻-苄醇和/或ALK≠(CH2)3的情况以及L(IV70)和L(IV71)的情况。它们针对对位的连接基给出，但是一致地适用于邻位或间位。类似地，它们针对念珠藻素化合物给出，但是也可适用于制备其他式(I)化合物，特别是D1-D19。
在W＝C(＝O)O，其中R14＝R15＝R16＝H,J1＝J2＝J3＝J4＝CH和RCG1＝马来酰亚胺 基，卤代乙酰氨基,NH2,N3或环辛炔即连接基L(IV72)至L(IV85)的情况下，制备式(II)化合 物
Figure BDA0001649098600000641
方案23
步骤(i)：在偶联剂如MNBA和碱如DMAP和DIEA的存在下酯化；
步骤(ii)：在碱如哌啶的存在下对Fmoc胺进行脱保护。
方案23描述了以下情形：L(IV72)，其中n＝1,R14＝R15＝R16＝H,J1＝J2＝J3＝J4＝CH,对苄醇和ALK＝(CH2)5，L(IV76)，其中n＝1,R14＝R15＝R16＝H和J1＝J2＝J3＝J4＝CH和对-苄醇，L(IV80)，其中n＝1,R14＝R15＝R16＝H,J1＝J2＝J3＝J4＝CH,对苄醇和ALK＝(CH2)4,L(IV82)，其中n＝1,R14＝R15＝R16＝H,J1＝J2＝J3＝J4＝CH,对苄醇和ALK＝(CH2)3以及L(IV84)，其中n＝1,R14＝R15＝R16＝R22＝H,J1＝J2＝J3＝J4＝CH,对-苄醇,ALK＝(CH2)3和ALK’＝(CH2)2，但是其也适用于其他连接基L(IV72)至L(IV85)，其中RCG1＝马来酰亚胺基,碘代乙酰氨基,NH2,N3或环辛炔。其针对对苄醇给出，但是也可适用于邻-苄醇。其针对碘代乙酰氨基反应性基团进行描述，但是可一致地适用于溴乙酰氨基反应性基团。其针对对位连接基给出，但是一致地适用于邻位或间位。类似地，其针对念珠藻素化合物给出，但是也可适用于制备其他式(I)化合物，特别是D1-D19。
在W＝C(＝O)O和L＝(V86)，其中R25＝H和ALK＝(CH2)7的情况下，制备式(II)化合 物
Figure BDA0001649098600000651
方案24
步骤(i)：通过在碱如DIEA的存在下的DSC处理将羧酸活化为NHS酯；
步骤(ii)：肽偶联在碱如DIEA的存在下；
步骤(iii)：通过在碱如DIEA的存在下的DSC处理将羧酸活化为NHS酯。
方案24描述了L(V86)，其中R25＝H和ALK＝(CH2)7的情况，但是它们也可适用于其他连接基L，其中RCG1＝C(＝O)ONHS，即L(V86)，其中R25≠H和/或ALK≠(CH2)7的情形以及L(V87)和L(V88)的情形。它们针对对位的连接基给出，但是一致地适用于邻位或间位。类似地，它们针对念珠藻素化合物给出，但是也可适用于制备其他式(I)化合物，特别是D1-D19。
在W＝C(＝O)O，其中R30＝H和RCG1＝马来酰亚胺基、卤代乙酰氨基、NH2、N3或环辛 炔即连接基L(V89)至L(V101)的情况下，制备式(II)化合物
Figure BDA0001649098600000661
方案25
步骤(i)：在碱如DIEA的存在下肽偶联；
步骤(ii)：通过利用还原剂如TCEP处理还原叠氮基。
方案25描述以下情况：L(V89)，其中R25＝H和ALK＝(CH2)5,L(V93)，其中R25＝H和ALK＝(CH2)3，L(V96)，其中R25＝H和ALK＝(CH2)4，L(V98)，其中R25＝H和ALK＝(CH2)3，以及L(V100)，其中R22＝R25＝H，ALK＝(CH2)3和ALK’＝(CH2)2，但是其也适用于其他连接基L(V89)至L(V101)，其中RCG1＝马来酰亚胺基、碘代乙酰氨基、NH2、N3或环辛炔。其针对碘代乙酰氨基反应性基团进行描述，但是可一致地适用于溴乙酰氨基反应性基团。其针对对位连接基给出，但是一致地适用于邻位或间位。类似地，其针对念珠藻素化合物给出，但是也可适用于制备其他式(I)化合物，特别是D1-D19。
念珠藻素缀合物的制备方法
式(III)化合物可以根据方案26从式(II)的念珠藻素有效载荷和抗体(Ab)开始制备：
Figure BDA0001649098600000671
方案26
其中：
■Y表示(C1-C6)烷基-NR11或(C1-C6)烷基-O或(C1-C6)烷基-S；
或者，Y表示C(＝O)O或O(C1-C6)烷基-C(＝O)O；
或者，Y表示(C1-C6)烷基-三唑-，如
Figure BDA0001649098600000672
Y位于苯基核的邻位(o)、间位(m)或对位(p)；
■R11表示氢原子或(C1-C6)烷基；
■L表示定位在苯基核的邻位(o)、间位(m)或对位(p)的连接基，如上文所定义的；
■RCG1表示对抗体上存在的反应性化学基团呈反应性的反应性化学基团，如上所定义；
■Ab表示抗体。
用于合成式(I)的念珠藻素化合物的构造块的制备方法
片段A的一般合成
Figure BDA0001649098600000681
方案27
可以借助下面详述的步骤起始于合适的羟基酯以12步来制备片段A：
步骤(i)：使用活化为三氯乙酰亚胺酯的p-甲氧基苄基醇在催化量的酸如p-TsOH的存在下将醇保护为p-甲氧基苄基醚；
步骤(ii)：使用还原剂如硼氢化锂将酯还原；
步骤(iii)：使用氧化剂如TEMPO在次氯酸钠的存在下将醇氧化；
步骤(iv)：使用烯丙基三丁基锡在四氯化锡的存在下进行非对映立体选择的烯丙基化；
步骤(v)：使用丙烯酸叔丁基酯在催化剂如Grubbs II催化剂的存在下进行交叉复分解；
步骤(vi)：使用CAN和接着以乙二硫醇处理在催化量的酸如p-TsOH的存在下对p-甲氧基苄基醚进行脱保护；
步骤(vii)：使用氯三乙基硅烷在碱如咪唑的存在下将醇保护为甲硅烷基醚；
步骤(viii)：使用DMSO和草酰氯在碱如DIEA的存在下进行Swern氧化；
步骤(ix)：使用合适的卤化鏻例如溴化鏻和强碱如BuLi进行Wittig反应；
步骤(x)：使用例如TBAF溶液将甲硅烷基醚脱保护。
步骤(xi)：使用氧化剂如氧化锰将苄醇进行氧化；
步骤(xii)：使用AIBN在苯硫醇的存在下对双键进行异构化。
羟基酯对于R1＝Me(CAS号[72657-23-9])、Et(CAS号[72604-81-0])和iPr(CAS号[72604-82-1])市售可得。卤化鏻的制备描述于WO2011/001052中。
片段B的一般合成
Figure BDA0001649098600000691
方案28
可以借助下面详述的步骤从合适的氨基酸以2步来制备片段B：
步骤(i)：通过以Boc2O在碱如TEA的存在下的处理来保护胺；
步骤(ii)：使用碱例如LiOH来进行甲基酯的皂化。
保护为甲基酯的氨基酸对于以下市售可得：R9＝3-Cl,4-OMe(CAS号[704870-54-2])；3-Cl,4-OEt(CAS号[1256963-00-9])；3-Cl,4-OPr(CAS号[1259709-59-9])；3-Cl,4-OMe,5-F(CAS号[1213670-98-4])；3-Cl,4-OMe,5-Cl(CAS号[1259701-42-2])；3-Cl,4-OMe,5-OMe(CAS号[1212820-34-2])；3-Cl,4-OH,5-OMe(CAS号[1213426-93-7])；3-Cl,4-NH2(CAS号[1213672-64-0])；2-Cl,3-Cl,4-NH2(CAS号[1213607-49-8])；3-Cl,4-NH2,5-F(CAS号[1213400-66-8])；3-Cl,4-NH2,5-Cl(CAS号[1213480-30-8]).
构造块AD1的一般合成
Figure BDA0001649098600000701
方案29
片段A和D允许借助下面详述的步骤制备构造块AD1：
步骤(i)：片段D与片段A在偶联剂如MNBA和碱如DMAP和DIEA的存在下的酯化；
步骤(ii)：使用还原剂如三甲氧基硼氢化钠将醛还原成醇；
步骤(iii)：通过以甲磺酰氯处理在碱如TEA的存在下将醇活化为甲磺酸酯；通过以叠氮化钠处理以叠氮基取代甲磺酸酯基；
步骤(iv)：通过以碱如哌啶处理对胺进行脱保护。
构造块AD2的一般合成
Figure BDA0001649098600000702
方案30
片段A和D允许借助下面详述的步骤制备构造块AD2：
步骤(i)：片段D与片段A在偶联剂如MNBA和碱如DMAP和DIEA的存在下的酯化；
步骤(ii)：使用还原剂如三甲氧基硼氢化钠将醛还原成醇；
步骤(iii)：通过以碱如哌啶处理对胺进行脱保护。
构造块AD3的一般合成
Figure BDA0001649098600000711
方案31
步骤(i)：片段D与Sakurai醇在偶联剂如MNBA和碱如DMAP和DIEA的存在下的酯化；
步骤(ii)：通过以碱如哌啶处理对胺进行脱保护。
构造块BC的一般合成
Figure BDA0001649098600000712
方案32
片段B和C允许借助下面详述的步骤制备构造块BC：
步骤(i)：片段B与片段C在偶联剂如HOBt和EDC的存在下和碱如DIEA的肽偶联；
步骤(ii)：使用碱例如LiOH的甲基酯的皂化。
可选的构造块BC的一般合成
Figure BDA0001649098600000713
方案33
片段B和C允许借助下面详述的步骤制备可选的BC：
步骤(i)：片段B与片段C在偶联剂如HOBt和EDC和碱如DIEA的存在下的肽偶联；
步骤(ii)：在酸性条件下使用例如TFA对Boc基团进行脱保护；
步骤(iii)：通过以丙烯酰氯处理在碱如DIEA的存在下形成丙烯酰胺；
步骤(iv)：使用碱如tBuOK对甲基酯进行皂化。
制备连接基前体LP
LP可以为以下之一：LP1至LP101，使用L氨基酸描述，但是也可适用于D氨基酸。它们针对w＝2给出，但是类似地通过如所要求的重复多次肽偶联步骤而适用于w>2。
LP1
Figure BDA0001649098600000721
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000722
步骤(i)：Fmoc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过以在偶联剂如EDC的存在下的NHS处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在室温在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护为烯丙基酯的二酸对于n＝2(琥珀酸单烯丙基酯)市售可得，或者可以通过甲基或叔丁基单酯的酯交换来制备，其对于n＝2至6市售可得。
LP2
Figure BDA0001649098600000731
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000732
步骤(i)：Fmoc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过以在偶联剂如支撑DCC的存在下的NHS处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护为烯丙基酯的PEG二酸可以根据以下方案制备：
当ALK＝CH2CH2时
Figure BDA0001649098600000733
当ALK≠CH2CH2时
Figure BDA0001649098600000734
步骤(i)：PEG链的延长；反应在无水极性非质子溶剂如THF或DMF中通过以通过催化量钠的作用产生的醇盐处理不饱和的经保护的酸来进行；
步骤(ii)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。在后一种情况中，可以形成存在于结构上醇官能的三氟乙酸盐。该三氟乙酸盐在以下步骤(iii)中解离；
步骤(iii)：将羧酸保护为甲基酯；反应在极性非质子溶剂如MeOH中通过以三甲基甲硅烷基二偶氮甲烷处理来进行；
步骤(iv)：甲基酯的皂化；反应在极性溶剂的混合物如THF/H2O混合物中在LiOH的存在下进行；
步骤(v)：将羧酸保护为烯丙基酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中在烯丙醇、偶联剂如EDC和碱如DMAP的存在下进行；
步骤(vi)：PEG链的延长；反应在无水极性非质子溶剂如THF或DMF中通过以单保护为THP醚的PEG二醇的醇盐处理卤化的酯进行。这种类型的单保护的PEG二醇的制备详细地描述于文献中：参见例如，Richard A.,et al.,Chem.Eur.J.2005,11,7315-7321或Sakellariou E.G.,et al.,Tetrahedron 2003,59,9083-9090。
起始的PEG二醇类对于i＝3至12市售可得。
LP3
Figure BDA0001649098600000741
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000742
步骤(i)：Fmoc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性溶剂如混合物DMF/H2O中通过N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在碱如DIEA的存在下的处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在室温在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护为烯丙基酯的磺基二酸可以根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000751
备选地，当ALK＝CH2CH2时
Figure BDA0001649098600000752
步骤(i)：将羧酸保护为烯丙基酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中在烯丙醇、偶联剂如EDC和碱如DMAP的存在下进行；
步骤(ii)：羧酸的α-磺化；反应于75℃在极性非质子溶剂如DCE中通过以氯磺酸在碱如DIEA的存在下的处理来进行。
步骤(iii)：形成羧酸部分；反应通过以氢氧化钠处理进行；
步骤(iv)：由硫代乙酰基取代溴基(bromide)；反应于-20℃在极性非质子溶剂如THF中使用硫乙酸在碱如DIEA的存在下进行；
步骤(v)：形成磺酸部分；反应在室温通过以过氧化氢和乙酸处理来进行。
氰基羧酸对于n＝1至12市售可得。
LP4
Figure BDA0001649098600000753
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000754
步骤(i)：Fmoc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过以在偶联剂如EDC的存在下的NHS处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；马来酰亚胺基羧酸对于n＝1至12市售可得。
LP5
Figure BDA0001649098600000761
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000762
步骤(i)：Fmoc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中进行在碱如碳酸氢钠的存在下；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过以在偶联剂如支撑DCC的存在下的NHS处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；马来酰亚胺酸对于ALK＝ALK’＝CH2CH2和i＝1至7市售可得，并且可以根据以下方案制备：
当ALK＝ALK’＝CH2CH2且i>7时
Figure BDA0001649098600000771
当ALK≠CH2CH2且ALK’＝CH2CH2时
Figure BDA0001649098600000772
当ALK＝CH2CH2且ALK’≠CH2CH2时
Figure BDA0001649098600000773
当ALK且ALK’≠CH2CH2时
Figure BDA0001649098600000774
步骤(i)：PEG链的延长；反应在无水极性非质子溶剂如THF或DMF中通过以催化量钠的作用产生的醇盐处理不饱和的受保护的酸来进行；
步骤(ii)：在马来酰亚胺上进行Mitsunobu反应；反应在极性非质子溶剂如THF中通过在PPh3和DIAD的存在下以PEG羟酸处理马来酰亚胺来进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护；
步骤(iv)：PEG链的延长；反应在无水极性非质子溶剂如THF或DMF中通过以单保护为THP醚的PEG二醇的醇盐处理卤化的酯来进行。这种类型的单保护的PEG二醇的制备详细描述于文献中：参见，例如，Richard A.,et al.,Chem.Eur.J.2005,11,7315-7321或Sakellariou E.G.,et al.,Tetrahedron 2003,59,9083-9090；
步骤(v)：选择性脱保护THP醚；反应在极性质子溶剂如MeOH中使用催化量的乙酰氯进行；
步骤(vi)：将醇活化为甲磺酸酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过以甲磺酰氯在碱如TEA的存在下的处理来进行；
步骤(vii)：亲核取代；反应在极性非质子溶剂如DMF中在碱如氢化钠的存在下进行；
步骤(viii)：将醇保护为苄基醚；反应在极性非质子溶剂如THF中通过以苄基溴在碱如氢化钠的存在下的处理来进行；
步骤(ix)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)进行醇的脱保护；
步骤(x)：通过氢解在催化剂如钯/碳的存在下对醇进行脱保护。
起始的PEG二醇类对于i＝3至12市售可得。起始的ALK二醇类对于n＝1至12市售可得。
LP6
Figure BDA0001649098600000781
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000782
步骤(i)：Fmoc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性溶剂如混合物DMF/H2O中通过N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在碱如DIEA的存在下的处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；马来酰亚胺基环己烷羧酸对于ALK＝CH2市售可得，并且可以另外根据以下方案制备：
当n＝2至4时
Figure BDA0001649098600000791
当n>4时
Figure BDA0001649098600000792
步骤(i)：氢化；反应于60℃在乙酸在催化剂如氧化铂的存在下在氢气压力如60psi下进行；
步骤(ii)：胺的保护；反应在极性质子溶剂如二噁烷/H2O混合物中通过在碱如NaOH的存在下以氯甲酸苄基酯的处理来进行；
步骤(iii)：对羧酸进行保护；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如EDC和碱如DMAP的存在下以叔丁醇的处理来进行；
步骤(iv)：胺的脱保护；反应通过氢解在极性质子溶剂如MeOH中在催化剂如钯的存在下进行；
步骤(v)：引入马来酰亚胺基部分；反应在极性非质子溶剂如DMF中通过在NHS和偶联剂如EDC的存在下以马来酸酐的处理来进行；
步骤(vi)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护；
步骤(vii)：钯催化的偶联；反应在极性非质子溶剂如THF中通过在氯化锂、锌和三甲基氯硅烷和催化剂如四(三苯基膦)钯的存在下以溴-ALK-氰基衍生物的处理来进行。
合适的溴-ALK-氰基衍生物对于n＝1至12市售可得。
LP7
Figure BDA0001649098600000801
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000802
步骤(i)：Fmoc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸的α-磺化；反应于75℃在极性非质子溶剂如DCE中通过在碱如DIEA的存在下以氯磺酸的处理来进行；
步骤(iv)：羧酸活化为NHS酯；反应在室温在极性溶剂如混合物DMF/H2O中通过在碱如DIEA的存在下以N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯的处理来进行；
步骤(v)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在室温在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；马来酰亚胺酸对于n＝1至12市售可得。
LP8
Figure BDA0001649098600000803
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000811
步骤(i)：Fmoc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；N-琥珀酰亚胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得。
LP9
Figure BDA0001649098600000812
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000813
步骤(i)：Fmoc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：偶联和将羧酸活化为NHS酯；N-琥珀酰亚胺基溴-和碘-乙酸酯与氨基羧酸的偶联于室温在极性非质子溶剂如DCM/DMF混合物并随后添加N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和碱如DIEA中进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；N-琥珀酰亚胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得，氨基羧酸对于n＝1至12以及N-甲基化的氨基羧酸对于n＝1至7也是市售可得。
LP10
Figure BDA0001649098600000821
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000822
步骤(i)：Fmoc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：偶联和将羧酸活化为NHS酯；N-琥珀酰亚胺基溴-和碘-乙酸酯与氨基羧酸的偶联在极性非质子溶剂如DCM/DMF混合物并随后添加N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和碱如DIEA中进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；N-琥珀酰亚胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得；在ALK＝CH2CH2和R20＝H的情况下，氨基PEG羧酸对于i＝1至6市售可得，并且可以另外从丙烯酸叔丁基酯和对应的氨基-PEG-醇制备；在ALK≠CH2CH2的情况下，它们可以根据以下的方案制备：
在ALK＝CH2CH2和R20≠H的情况下
Figure BDA0001649098600000831
在ALK≠CH2CH2的情况下
在R20＝H的情况下
Figure BDA0001649098600000832
在R20≠H的情况下
Figure BDA0001649098600000833
步骤(i)：胺的保护；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在碱如TEA的存在下以二碳酸二叔丁基酯处理胺来进行；
步骤(ii)：对羧酸进行保护；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如EDC和碱如DMAP的存在下以叔丁醇处理来进行；
步骤(iii)：氮原子的烷基化；反应在无水极性非质子溶剂如THF中通过在带有离去基团如卤化物的试剂的存在下以碱如氢化钠的处理来进行；
步骤(iv)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护；
步骤(v)：PEG链的延长；反应在无水极性非质子溶剂如THF或DMF中通过以经由氢化钠或萘基钾(potassium naphthalenide)的作用产生的二苯甲酮-亚胺-PEG-醇的醇盐处理卤化的酯来进行，如WO2007/127440中描述的；
步骤(vi)：酯的皂化；反应通过使酯与LiOH在H2O的存在下反应来进行。
氨基-PEG-醇类对于例如i＝3,4,7,8市售可得，或者可以从PEG二醇类根据US7230101中描述的方法制备，其对于i＝3至12市售可得。二苯甲酮对胺官能团进行保护可以在路易斯酸如BF3乙醚合物的存在下通过共沸脱水来进行。
LP11
Figure BDA0001649098600000841
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000842
步骤(i)：在Fmoc-L-氨基酸-NHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：胺Fmoc的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：偶联和将羧酸活化为NHS酯；N-琥珀酰亚胺基溴-和碘-乙酸酯与氨基羧酸的偶联于室温在极性非质子溶剂如DCM/DMF混合物并接着添加N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和碱如DIEA中进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在室温在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；N-琥珀酰亚胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得；氨基-(杂)芳基-羧酸市售可得，例如4-氨基-2-苯甲酸、6-氨基-3-吡啶羧酸、5-氨基-2-吡嗪羧酸、2-氨基-5-嘧啶羧酸或6-氨基-1,2,4,5-四嗪羧酸。
LP12
Figure BDA0001649098600000843
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000851
步骤(i)：Fmoc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如EDC的存在下的以NHS处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；氨基羧酸对于n＝1至11市售可得。
LP13
Figure BDA0001649098600000852
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000853
步骤(i)：Fmoc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如支撑DCC的存在下以NHS的处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；在ALK＝CH2CH2的情况中，Fmoc-保护的氨基PEG羧酸对于i＝1至6市售可得并且另外可以从丙烯酸叔丁基酯和相应的氨基-PEG-醇制备；在ALK≠CH2CH2的情况下，它们可以根据对于连接基前体LP10描述的方案来制备。以Fmoc基团保护胺官能团了可以通过在碱如DIEA的存在下以FmocOSu(CAS号[82911-69-1])处理来实现。
LP14
Figure BDA0001649098600000861
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000862
步骤(i)：Fmoc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：引入叠氮基；反应在极性溶剂如丙酮/H2O化合物中通过以叠氮化钠处理来进行；
步骤(iv)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如EDC的存在下以NHS的处理来进行；
步骤(v)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；溴羧酸对于n＝1至11市售可得。
LP15
Figure BDA0001649098600000871
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000872
步骤(i)：Fmoc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如支撑DCC的存在下以NHS的处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；叠氮基PEG酸可以根据以下的方案制备：
当ALK＝CH2CH2时
Figure BDA0001649098600000873
当ALK≠CH2CH2时
Figure BDA0001649098600000874
步骤(i)：PEG链的延长；反应在无水极性非质子溶剂如THF或DMF中通过以催化量钠的作用产生的醇盐处理不饱和的受保护的酸来进行；
步骤(ii)：醇功能的活化；反应在极性溶剂如DCM中使用甲磺酰氯在碱如TEA的存在下进行；
步骤(iii)：以叠氮基取代甲磺酸酯；反应在极性溶剂如丙酮/H2O混合物中通过以叠氮化钠处理进行；
步骤(iv)：使用盐酸溶液(如在二噁烷中的溶液)脱保护；
步骤(v)：PEG链的延长；反应如下进行：在无水极性非质子溶剂如THF或DMF中通过以单保护为THP醚的PEG二醇的醇盐处理卤化的酯、例如以氢化钠处理产生的醇盐。这种类型的单保护的PEG二醇的制备详细描述于文献中：参见，例如Richard A.etal.Chem.Eur.J.2005,11,7315-7321或Sakellariou E.G.,et al.Tetrahedron 2003,59,9083-9090；
步骤(vi)：甲基酯的皂化；反应在室温在极性溶剂的混合物如THF/H2O混合物中在LiOH的存在下进行。
起始的PEG二醇类对于i＝3至12市售可得；溴甲基酯对于n＝1至12市售可得。
LP16
Figure BDA0001649098600000881
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000882
步骤(i)：Fmoc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：环辛炔偶联；反应在极性溶剂如DCM中进行；
步骤(iv)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如EDC的存在下以NHS的处理来进行；
步骤(v)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；环辛炔对于n’＝1,2,3和5市售可得；单活化为NHS酯的二酸对于n＝1至3以及对于n＝4至10市售可得，它们可以通过在偶联剂如DCC和碱如DMAP的存在下以NHS活化市售可得的二酸来制备。
LP17
Figure BDA0001649098600000891
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000892
步骤(i)：Fmoc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：环辛炔偶联；反应在极性溶剂如DCM中进行；
步骤(iv)：使用盐酸溶液(如在二噁烷中的溶液)脱保护；
步骤(v)：将环辛炔-PEG羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如EDC的存在下以NHS的处理来进行；
步骤(vi)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM中进行。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；环辛炔对于n’＝1、2、3和5市售可得；单活化为NHS酯的PEG二酸根据以下方案制备：
当ALK＝CH2CH2
Figure BDA0001649098600000901
当ALK≠CH2CH2
Figure BDA0001649098600000902
步骤(i)：PEG链的延长；反应在无水极性非质子溶剂如THF或DMF中通过以通过催化量的钠的作用产生的醇盐处理不饱和的受保护的酸来进行；
步骤(ii)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护；
步骤(iii)：将一个酸单活化为NHS酯；反应在极性溶剂如THF中使用NHS在偶联剂如DCC和碱如DMAP的存在下进行；
步骤(iv)：PEG链的延长；反应在无水极性非质子溶剂如THF或DMF中通过以单保护为THP醚的PEG二醇的醇盐处理卤化的酯进行。这种类型的单保护的PEG二醇的制备详细描述于文献中：参见，例如，Richard A.,et al.,Chem.Eur.J.2005,11,7315-7321 orSakellariou E.G.,et al.,Tetrahedron 2003,59,9083-9090；
步骤(v)：将羧酸保护为甲基酯；反应在极性非质子溶剂如MeOH中通过以三甲基甲硅烷基二叠氮甲烷处理进行；
步骤(vi)：甲基酯的皂化；反应在极性溶剂的混合物如THF/H2O混合物中在LiOH的存在下进行；
步骤(vii)：将酸活化为NHS酯；反应在极性溶剂如THF中使用NHS在偶联剂如DCC和碱如DMAP的存在下进行。
起始的PEG二醇类对于i＝3至12市售可得。
LP18
Figure BDA0001649098600000911
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000912
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如EDC的存在下以NHS的处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(v)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得。单保护为烯丙基酯的二酸对于n＝2(琥珀酸单烯丙基酯)市售可得，或者可以通过甲基或叔丁基单酯的酯交换来制备，其对于n’＝2至6市售可得。
LP19
Figure BDA0001649098600000913
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000921
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如EDC的存在下以NHS的处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(v)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得；单保护为烯丙基酯的PEG二酸根据对于连接基前体LP2描述的方案制备。
LP20
Figure BDA0001649098600000922
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000923
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如EDC的存在下以NHS的处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(v)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得；单保护为烯丙基酯的磺基二酸根据对连接基前体LP3描述的方案制备。
LP21
Figure BDA0001649098600000931
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000932
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行。
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如EDC的存在下以NHS的处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(v)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护.
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得；马来酰亚胺基羧酸对于n＝1至12市售可得。
LP22
Figure BDA0001649098600000941
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000942
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如支撑DCC的存在下以NHS的处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(v)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护.
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得；马来酰亚胺基PEG酸对于ALK＝ALK’＝CH2CH2和i＝1至7市售可得，并且另外根据对于连接基前体LP5描述的方案制备。
LP23
Figure BDA0001649098600000951
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000952
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如EDC的存在下以NHS的处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(v)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得；马来酰亚胺基环己烷羧酸对于ALK＝CH2市售可得并且可以另外根据对于连接基前体LP6描述的方案制备。
LP24
Figure BDA0001649098600000953
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000961
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸的α-磺化；反应于75℃在极性非质子溶剂如DCE中通过在碱如DIEA的存在下以氯磺酸的处理来进行；
步骤(iv)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如EDC的存在下以NHS的处理来进行；
步骤(v)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(vi)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护.
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得；马来酰亚胺基酸对于n＝1至12市售可得。
LP25
Figure BDA0001649098600000962
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000971
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(iv)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得；N-琥珀酰亚胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得。
LP26
Figure BDA0001649098600000972
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000973
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：偶联和将羧酸活化为NHS酯；N-琥珀酰亚胺基溴-和碘-乙酸酯与氨基羧酸的偶联在极性非质子溶剂如DCM/DMF混合物并接着添加N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和碱如DIEA中进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(v)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护.
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得；N-琥珀酰亚胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得；氨基羧酸对于n＝1至12市售可得，N-甲基化的氨基羧酸对于n＝1至7市售可得。
LP27
Figure BDA0001649098600000981
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000982
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：偶联和将羧酸活化为NHS酯；N-琥珀酰亚胺基溴-和碘-乙酸酯与氨基羧酸的偶联在极性非质子溶剂如DCM/DMF混合物并接着添加N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和碱如DIEA中进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(v)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得；N-琥珀酰亚胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得；在ALK＝CH2CH2和R20＝H的情况下，氨基PEG羧酸对于i＝1至6市售可得，并且另外可以从丙烯酸叔丁基酯和相应的氨基-PEG-醇制备；在ALK≠CH2CH2的情况下，它们可以根据对连接基前体LP10描述的方案制备。
LP28
Figure BDA0001649098600000991
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600000992
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：偶联和将羧酸活化为NHS酯；N-琥珀酰亚胺基溴-和碘-乙酸酯与氨基羧酸的偶联在极性非质子溶剂如DCM/DMF混合物并接着添加N,N’-二琥珀酰亚胺基碳酸酯和碱如DIEA中进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(v)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得；N-琥珀酰亚胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得；氨基-(杂)芳基-羧酸对于以下市售可得，例如4-氨基-2-苯甲酸,6-氨基-3-吡啶羧酸,5-氨基-2-吡嗪羧酸,2-氨基-5-嘧啶羧酸或6-氨基-1,2,4,5-四嗪羧酸。
LP29
Figure BDA0001649098600001001
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001002
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如EDC的存在下以NHS的处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(v)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得；氨基羧酸对于n＝1至12市售可得。
LP30
Figure BDA0001649098600001011
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001012
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如支撑DCC的存在下以NHS的处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(v)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得；Fmoc-保护的氨基PEG羧酸对于i＝1至6市售可得，并且另外可以由丙烯酸叔丁基酯和对应的氨基-PEG-醇制备；在ALK≠CH2CH2的情况下，它们可以根据对于连接基前体LP10的方案制备。以Fmoc基团保护胺官能团可以通过在碱如DIEA的存在下以FmocOSu(CAS号[82911-69-1])处理来实现。
LP31
Figure BDA0001649098600001021
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001022
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如EDC的存在下以NHS的处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(v)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得；叠氮基羧酸可以根据对于连接基前体LP14描述的方案制备。
LP32
Figure BDA0001649098600001023
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001031
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过在偶联剂如支撑DCC的存在下以NHS的处理来进行；
步骤(iv)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(v)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得；叠氮基PEG羧酸可以根据对于连接基前体LP15描述的方案制备。
LP33
Figure BDA0001649098600001032
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001041
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(iv)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得；环辛炔连接基活化为NHS酯可以根据对于连接基前体LP16描述的方案制备。
LP34
Figure BDA0001649098600001042
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001043
步骤(i)：肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下或在极性溶剂如DCM中在偶联剂如丙基膦酸酐和碱如TEA的存在下进行；
步骤(ii)：胺的脱保护；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在碱如哌啶的存在下进行；
步骤(iii)：在二肽和NHS酯之间的肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(iv)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
Fmoc-L-氨基酸的NHS酯市售可得；单保护的二胺对于n＝2至4以及R17和R18彼此独立地＝H或Me市售可得；活化为NHS酯的环辛炔连接基可以根据对于连接基前体LP17的描述制备。
LP35
Figure BDA0001649098600001051
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001052
步骤(i)：在连接基前体LP1和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
许多苯胺衍生物可以市售获得，例如4-(羟基甲基)-苯胺(CAS号[623-04-1])、4-(1-羟基乙基)-苯胺(外消旋(CAS号[14572-89-5])或对映异构体纯的(R)(CAS号[210754-25-9])或(S)(CAS号[500229-84-5]))、4-氨基-α,α-二甲基-苯-甲醇(CAS号[23243-04-1])、4-氨基-α-甲氧基-α-甲基-苯甲醇(CAS号[1379318-81-6])、4-氨基-α-甲基-α-三氟甲基-苯甲醇(CAS号[851652-56-7])、2-氨基-苯甲醇(CAS号[5344-90-1])、2-氨基-α-甲基-苯甲醇(外消旋(CAS号[10517-50-7])或对映异构体纯的(R)(CAS号[3205-21-8])或(S)(CAS号[3205-21-8]))、6-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[113293-71-3])、6-氨基-α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[1335054-83-5])、6-氨基-α-乙基-3-吡啶甲醇(CAS号[1355225-85-2])、6-氨基-α,α-二甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[843646-03-8])、5-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[873651-92-4])、2-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[23612-57-9])、2-氨基-α-甲基-3-吡啶甲醇(外消旋(CAS号[869567-91-9])或对映异构体纯的(R)(CAS号[936718-01-3])或(S)(CAS号[936718-00-2]))、2-氨基-α-乙基-3-吡啶甲醇(CAS号[914223-90-8])、2-氨基-α,α-二甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[213666-96-7])、3-氨基-4-吡啶甲醇(CAS号[152398-05-5])、3-氨基-α-甲基-4-吡啶甲醇(CAS号[1242470-88-7])、3-氨基-α,α-甲基-4-吡啶甲醇(CAS号[13357-81-8])、4-氨基-3-吡啶甲醇(CAS号[138116-34-4])、4-氨基-α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[741223-49-4])、4-氨基-α,α-甲基-3-吡啶甲醇(CAS号[1339013-26-1])、3-氨基-2-吡啶甲醇(CAS号[52378-63-9])、3-氨基-α-甲基-2-吡啶甲醇(CAS号[954240-54-1])、3-氨基-α,α-甲基-2-吡啶甲醇(CAS号[899438-57-4])。
LP36
Figure BDA0001649098600001061
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001062
步骤(i)：连接基前体LP2和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
许多苯胺衍生物市售可得，例如对于LP35列出的那些。
LP37
Figure BDA0001649098600001071
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001072
步骤(i)：连接基前体LP3和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
许多苯胺衍生物市售可得，例如对于LP35列出的那些。
LP38
Figure BDA0001649098600001073
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001074
步骤(i)：连接基前体LP4和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
许多苯胺衍生物市售可得，例如对于LP35列出的那些。
LP39
Figure BDA0001649098600001081
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001082
步骤(i)：连接基前体LP5和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
许多苯胺衍生物市售可得，例如对于LP35列出的那些。
LP40
Figure BDA0001649098600001083
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001084
步骤(i)：连接基前体LP6和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
许多苯胺衍生物市售可得，例如对于LP35列出的那些。
LP41
Figure BDA0001649098600001085
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001091
步骤(i)：连接基前体LP7和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
许多苯胺衍生物市售可得，例如对于LP35列出的那些。
LP42
Figure BDA0001649098600001092
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001093
步骤(i)：连接基前体LP8和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
许多苯胺衍生物市售可得，例如对于LP35列出的那些。
LP43
Figure BDA0001649098600001094
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001101
步骤(i)：连接基前体LP9和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
许多苯胺衍生物市售可得，例如对于LP35列出的那些。
LP44
Figure BDA0001649098600001102
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001103
步骤(i)：连接基前体LP10和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
许多苯胺衍生物市售可得，例如对于LP35列出的那些。
LP45
Figure BDA0001649098600001104
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001111
步骤(i)：连接基前体LP11和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
许多苯胺衍生物市售可得，例如对于LP35列出的那些。
LP46
Figure BDA0001649098600001112
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001113
步骤(i)：连接基前体LP12和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
许多苯胺衍生物市售可得，例如对于LP35列出的那些。
LP47
Figure BDA0001649098600001114
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001121
步骤(i)：连接基前体LP13和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
许多苯胺衍生物市售可得，例如对于LP35列出的那些。
LP48
Figure BDA0001649098600001122
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001123
步骤(i)：连接基前体LP14和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
许多苯胺衍生物市售可得，例如对于LP35列出的那些。
LP49
Figure BDA0001649098600001124
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001131
步骤(i)：连接基前体LP15和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
LP50
Figure BDA0001649098600001132
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001133
步骤(i)：连接基前体LP16和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
许多苯胺衍生物市售可得，例如对于LP35列出的那些。
LP51
Figure BDA0001649098600001134
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001141
步骤(i)：在连接基前体LP17和苯胺衍生物之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DCM/MeOH混合物中在偶联剂如EEDQ的存在下进行；
步骤(ii)：通过以对-硝基苯基-氯甲酸酯在碱如DIEA的存在下处理将苄醇活化为对硝基-苯基碳酸酯。
许多苯胺衍生物市售可得，例如对于LP35列出的那些。
LP52
Figure BDA0001649098600001142
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001143
步骤(i)：在连接基前体LP35和单保护的二胺之间形成氨基甲酸酯；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP53
Figure BDA0001649098600001144
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001145
步骤(i)：在连接基前体LP36和单保护的二胺之间形成氨基甲酸酯；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP54
Figure BDA0001649098600001151
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001152
步骤(i)：在连接基前体LP37和单保护的二胺之间形成氨基甲酸酯；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP55
Figure BDA0001649098600001153
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001154
步骤(i)：在连接基前体LP38和单保护的二胺之间形成氨基甲酸酯；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP56
Figure BDA0001649098600001155
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001156
步骤(i)：在连接基前体LP39和单保护的二胺之间形成氨基甲酸酯；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP57
Figure BDA0001649098600001161
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001162
步骤(i)：在连接基前体LP40和单保护的二胺之间形成氨基甲酸酯；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP58
Figure BDA0001649098600001163
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001164
步骤(i)：在连接基前体LP41和单保护的二胺之间形成氨基甲酸酯；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP59
Figure BDA0001649098600001165
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001166
步骤(i)：在连接基前体LP42和单保护的二胺之间形成氨基甲酸酯；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP60
Figure BDA0001649098600001171
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001172
步骤(i)：在连接基前体LP43和单保护的二胺之间形成氨基甲酸酯；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP61
Figure BDA0001649098600001173
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001174
步骤(i)：连接基前体LP44和单保护的二胺之间形成氨基甲酸酯；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP62
Figure BDA0001649098600001175
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001176
步骤(i)：连接基前体LP45和单保护的二胺之间形成氨基甲酸酯；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP63
Figure BDA0001649098600001181
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001182
步骤(i)：连接基前体LP46和单保护的二胺之间形成氨基甲酸酯；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP64
Figure BDA0001649098600001183
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001184
步骤(i)：在连接基前体LP47和单保护的二胺之间形成氨基甲酸酯；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP65
Figure BDA0001649098600001185
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001186
步骤(i)：在连接基前体LP48和单保护的二胺之间形成氨基甲酸酯；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP66
Figure BDA0001649098600001191
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001192
步骤(i)：在连接基前体LP49和单保护的二胺之间形成氨基甲酸酯；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP67
Figure BDA0001649098600001193
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001194
步骤(i)：在连接基前体LP50和单保护的二胺之间形成氨基甲酸酯；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP68
Figure BDA0001649098600001195
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001201
步骤(i)：氨基甲酸酯的形成；反应在极性溶剂如CH3CN中在碱如DIEA的存在下进行；使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护。
LP69
Figure BDA0001649098600001202
根据针对连接基前体LP35描述的第一步骤制备。
LP70
Figure BDA0001649098600001203
根据针对连接基前体LP36描述的第一步骤制备。
LP71
Figure BDA0001649098600001204
根据针对连接基前体LP37描述的第一步骤制备。
LP72
Figure BDA0001649098600001205
根据针对连接基前体LP38描述的第一步骤制备。
LP73
Figure BDA0001649098600001206
根据针对连接基前体LP39描述的第一步骤制备。
LP74
Figure BDA0001649098600001207
根据针对连接基前体LP40描述的第一步骤制备。
LP75
Figure BDA0001649098600001208
根据针对连接基前体LP41描述的第一步骤制备。
LP76
Figure BDA0001649098600001211
根据针对连接基前体LP42描述的第一步骤制备。
LP77
Figure BDA0001649098600001212
根据针对连接基前体LP43描述的第一步骤制备。
LP78
Figure BDA0001649098600001213
根据针对连接基前体LP44描述的第一步骤制备。
LP79
Figure BDA0001649098600001214
根据针对连接基前体LP45描述的第一步骤制备。
LP80
Figure BDA0001649098600001215
根据针对连接基前体LP46描述的第一步骤制备。
LP81
Figure BDA0001649098600001216
根据针对连接基前体LP47描述的第一步骤制备。
LP82
Figure BDA0001649098600001217
根据针对连接基前体LP48描述的第一步骤制备。
LP83
Figure BDA0001649098600001218
根据针对连接基前体LP49描述的第一步骤制备。
LP84
Figure BDA0001649098600001221
根据针对连接基前体LP50描述的第一步骤制备。
LP85
Figure BDA0001649098600001222
根据针对连接基前体LP51描述的第一步骤制备。
LP86
Figure BDA0001649098600001223
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001224
步骤(i)：通过酯化将酸偶联在Wang树脂(Wang resin)上；反应在极性溶剂如DCM中在偶联剂如DIC和碱如DMAP的存在下进行；
步骤(ii)：Fmoc基团的脱保护；反应在极性溶剂如DMF中通过以碱例如哌啶处理进行；
步骤(iii)：肽偶联；反应在极性溶剂如DMF中在偶联剂如HOBt和HATU和碱如DIEA的存在下进行；
步骤(iv)：解离树脂；反应在极性溶剂如DCM/H2O混合物中在酸如TFA的存在下进行。
Fmoc保护的烷基-氨基酸对于n＝1至9市售可得；Fmoc L-氨基酸市售可得。
LP87
Figure BDA0001649098600001225
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001231
步骤(i)：通过酯化将酸偶联在Wang树脂(Wang resin)上；反应在极性溶剂如DCM中进行在偶联剂如DIC和碱如DMAP的存在下进行；
步骤(ii)：Fmoc基团的脱保护；反应在极性溶剂如DMF中通过以碱例如哌啶处理进行；
步骤(iii)：肽偶联；反应在极性溶剂如DMF中在偶联剂如HOBt和HATU和碱如DIEA的存在下进行；
步骤(iv)：解离树脂；反应在极性溶剂如DCM/H2O混合物中在酸如TFA的存在下进行。
Fmoc-保护的氨基PEG羧酸对于i＝1至6市售可得，并且另外可以从丙烯酸叔丁基酯和对应的氨基-PEG-醇制备；在ALK≠CH2CH2的情况下，它们可以根据对于连接基前体LP10描述的方案制备。Fmoc基团保护胺官能团可以通过以FmocOSu(CAS号[82911-69-1])在碱如DIEA的存在下的处理来实现；Fmoc L-氨基酸市售可得。
LP88
Figure BDA0001649098600001232
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001233
步骤(i)：在Boc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：与磺基氨基酸肽偶联；反应在极性溶剂如CH3CN中在偶联剂如DCC和HOBt和碱如DIEA的存在下进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
L-氨基酸市售可得；Boc-保护的L-氨基酸的NHS酯市售可得；磺基氨基酸对于n＝1和2市售可得或者可以另外根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001241
步骤(i)：通过硫代乙酰基取代溴化物；反应在极性非质子溶剂如THF中使用硫代乙酸在碱如DIEA的存在下进行；
步骤(ii)：形成磺酸部分；反应通过以过氧化氢和乙酸处理进行；
步骤(iii)：通过叠氮基取代溴化物；反应在极性溶剂如DMA中通过以叠氮化钠处理来进行；
步骤(iv)：甲基酯脱保护；反应在酸性条件如HCl和AcOH的混合物中进行；
步骤(v)：还原叠氮基；反应通过在极性溶剂如H2O中在催化剂如钯/碳的存在下通过氢解进行来进行。
二溴衍生物对于n＝3,4和9市售可得。
LP89
Figure BDA0001649098600001242
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001243
步骤(i)：在Boc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：与马来酰亚胺基胺肽偶联；反应在极性溶剂如CH3CN中在偶联剂如DCC和HOBt和碱如DIEA的存在下进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
L-氨基酸市售可得；Boc-保护的L-氨基酸的NHS酯市售可得；马来酰亚胺基胺对于n＝2至6市售可得。
LP90
Figure BDA0001649098600001251
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001252
步骤(i)：在Boc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：与马来酰亚胺基PEG胺的肽偶联；反应在极性溶剂如CH3CN中在偶联剂如DCC和HOBt和碱如DIEA的存在下进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
L-氨基酸市售可得；Boc-保护的L-氨基酸的NHS酯市售可得；马来酰亚胺基PEG胺对于ALK＝ALK’＝CH2CH2和i＝0和1市售可得，或者可以另外根据以下方案制备：
当ALK＝ALK’＝CH2CH2和i>1时
Figure BDA0001649098600001253
当ALK≠CH2CH2和ALK’＝CH2CH2时
Figure BDA0001649098600001261
当ALK＝CH2CH2和ALK’≠CH2CH2时
Figure BDA0001649098600001262
当ALK和ALK’≠CH2CH2时
Figure BDA0001649098600001263
步骤(i)：在马来酰亚胺上的Mitsunobu反应；反应在极性非质子溶剂如THF中通过以PEG羟基酸处理马来酰亚胺(malemide)在PPh3和DIAD的存在下进行；
步骤(ii)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护；
步骤(iii)：将醇活化为甲苯磺酸酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过以甲苯磺酰氯在碱如TEA的存在下的处理来进行；
步骤(iv)：取代甲苯磺酰基；反应在极性非质子溶剂如THF中在碱如氢化钠的存在下进行。
步骤(v)：苄基的脱保护；反应在极性溶剂如MeOH中在催化量的催化剂如钯/碳的存在下通过氢解进行；
步骤(vi)：将醇活化为甲磺酸酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过以甲磺酰氯在碱如TEA的存在下的处理来进行；
步骤(vii)：亲核性取代；反应在极性非质子溶剂如DMF中在碱如氢化钠的存在下进行；
起始的Boc-保护的PEG氨基醇对于i＝2至4市售可得，或者对于i＝5至8能够通过Boc2O处理市售可得的PEG氨基醇而制备；起始的ALK氨基醇对于n＝1和3至10市售可得；起始的以苄基单保护的PEG二醇类对于i＝1至9市售可得；起始的ALK二醇类对于n＝1至12市售可得。
LP91
Figure BDA0001649098600001271
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001272
步骤(i)：在Boc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：与马来酰亚胺基胺的肽偶联；反应在极性溶剂如CH3CN中在偶联剂如DCC和HOBt和碱如DIEA的存在下进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
L-氨基酸市售可得；Boc-保护的L-氨基酸的NHS酯市售可得；马来酰亚胺基胺可以根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001273
步骤(i)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性溶剂如混合物DMF/H2O中通过N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在碱如DIEA的存在下的处理来进行；
步骤(ii)：肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
马来酰亚胺基环己烷羧酸对于ALK＝CH2市售可得，或者可以根据对于LP6描述的方案制备；以Boc单保护的二胺对于n＝1至10市售可得。
LP92
Figure BDA0001649098600001281
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001282
步骤(i)：在Boc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：与马来酰亚胺基PEG胺的肽偶联；反应在极性溶剂如CH3CN中在偶联剂如DCC和HOBt和碱如DIEA的存在下进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
L-氨基酸市售可得；Boc-保护的L-氨基酸的NHS酯市售可得；马来酰亚胺基PEG胺可以根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001283
步骤(i)：羧酸活化为NHS酯；反应在极性溶剂如混合物DMF/H2O中通过N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯在碱如DIEA的存在下的处理来进行；
步骤(ii)：肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
马来酰亚胺基环己烷羧酸对于ALK＝CH2市售可得，或者可以另外根据对于LP6描述的方案制备；以Boc基团单保护的PEG二胺对于i＝1至9市售可得。
LP93
Figure BDA0001649098600001291
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001292
步骤(i)：在Boc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：与卤代乙酰胺基PEG胺的肽偶联；反应在极性溶剂如CH3CN中在偶联剂如DCC和HOBt和碱如DIEA的存在下进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
L-氨基酸市售可得；Boc-保护的L-氨基酸的NHS酯市售可得；卤代乙酰胺基胺对于n＝2至4和8市售可得，或者可以根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001293
步骤(ii)：肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
N-琥珀酰亚胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得；以Boc基团单保护的二胺对于n＝1至10市售可得。
LP94
Figure BDA0001649098600001301
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001302
步骤(i)：在Boc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：与卤代乙酰胺基PEG胺的肽偶联；反应在极性溶剂如CH3CN中在偶联剂如DCC和HOBt和碱如DIEA的存在下进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
L-氨基酸市售可得；Boc-保护的L-氨基酸的NHS酯市售可得；卤代乙酰胺基胺对于n＝2至4和8市售可得，或者可得根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001303
步骤(ii)：肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
N-琥珀酰亚胺基溴-和碘-乙酸酯市售可得；以Boc基团单保护的PEG二胺对于i＝1至9市售可得。
LP95
Figure BDA0001649098600001304
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001311
步骤(i)：在Boc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：与卤代乙酰胺基胺的肽偶联；反应在极性溶剂如CH3CN中在偶联剂如DCC和HOBt和碱如DIEA的存在下进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
L-氨基酸市售可得；Boc-保护的L-氨基酸的NHS酯市售可得；卤代乙酰胺基胺可以根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001312
步骤(ii)：肽偶联；反应在极性非质子溶剂如DCM/CH3CN混合物中进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
卤代乙酰胺的NHS酯可以如对于连接基前体LP11所描述的来制备；以Boc基团单保护的二胺对于n＝1至10市售可得。
LP96和LP98
Figure BDA0001649098600001313
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001314
步骤(i)：在Boc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：与叠氮基胺的肽偶联；反应在极性溶剂如CH3CN中在偶联剂如DCC和HOBt和碱如DIEA的存在下进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
L-氨基酸市售可得；Boc-保护的L-氨基酸的NHS酯市售可得；叠氮基胺对于n＝2至8和10市售可得。
LP97和LP99
Figure BDA0001649098600001321
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001322
步骤(i)：在Boc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：与叠氮基PEG胺的肽偶联；反应在极性溶剂如CH3CN中在偶联剂如DCC和HOBt和碱如DIEA的存在下进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
L-氨基酸市售可得；Boc-保护的L-氨基酸的NHS酯市售可得；对于ALK＝CH2CH2，叠氮基PEG胺对于i＝1至8和10市售可得，对于ALK≠CH2CH2，叠氮基PEG胺可以根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001323
步骤(i)：将醇活化为甲磺酸酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过以甲磺酰氯在碱如TEA的存在下的处理来进行；
步骤(ii)：通过叠氮基基团取代甲磺酸酯；反应在极性溶剂如丙酮/H2O混合物中通过以叠氮化钠处理来进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
起始的PEG氨基醇可根据对于连接基前体LP90所描述的来制备。
LP100
Figure BDA0001649098600001331
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001332
步骤(i)：在Boc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：与环辛炔胺的肽偶联；反应在极性溶剂如CH3CN中在偶联剂如DCC和HOBt和碱如DIEA的存在下进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
环辛炔胺对于n＝1,2,3和5市售可得。
LP101
Figure BDA0001649098600001333
根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001341
步骤(i)：在Boc-L-氨基酸-ONHS和L-氨基酸之间的肽偶联；反应在极性溶剂如DME/THF/H2O混合物中在碱如碳酸氢钠的存在下进行；
步骤(ii)：与环辛炔PEG胺的肽偶联；反应在极性溶剂如CH3CN中在偶联剂如DCC和HOBt和碱如DIEA的存在下进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如在二噁烷中的溶液)对Boc基团进行脱保护。
环辛炔PEG胺可以根据以下方案制备：
Figure BDA0001649098600001342
步骤(i)：将醇活化为甲磺酸酯；反应在极性非质子溶剂如DCM中通过以甲磺酰氯在碱如TEA的存在下的处理来进行；
步骤(ii)：亲核性取代；反应在极性非质子溶剂如DMF中在碱如氢化钠的存在下进行；
步骤(iii)：使用盐酸的溶液(例如二噁烷中的溶液)或三氟乙酸的溶液进行脱保护；
步骤(iv)：以Boc基团保护胺；反应在极性溶剂如DCM中通过以Boc2O在碱如TEA的存在下的处理来进行；
步骤(v)：肽偶联；反应在极性溶剂如DCM中在偶联剂如HOBt和EDC的存在下进行。
起始的ALK氨基醇对于n＝1至10市售可得；环辛炔对于n＝1,2,3和5市售可得。
Figure BDA0001649098600001361
Figure BDA0001649098600001371
Figure BDA0001649098600001381
Figure BDA0001649098600001391
Figure BDA0001649098600001401
Figure BDA0001649098600001411
Figure BDA0001649098600001421
Figure BDA0001649098600001431
Figure BDA0001649098600001441
Figure BDA0001649098600001451
Figure BDA0001649098600001461
制备式(III)缀合物的方法
本发明的缀合物可以通过由以下步骤构成的方法得到：
(i)使任选经缓冲的抗体的水溶液与式(II)念珠藻素有效载荷的溶液接触且使它们发生反应，其中抗体任选首先通过修饰剂修饰，式(II)化合物的化学基团RCG1针对在抗体上存在的化学基团RCG2、特别是针对在抗体上存在的氨基基团具有反应性，所述化学基团RCG2在适当时已经通过修饰剂引入，从而使得式(II)化合物通过形成共价键连接至抗体；
(ii)然后任选使步骤(i)中形成的缀合物与念珠藻素有效载荷和/或未反应的抗体和/或所形成的任何聚集物分离。
根据一个变形以及更具体地，在步骤(ii)中仅使得自步骤(i)的缀合物与未反应的念珠藻素有效载荷和所形成的任何聚集物分离，而任何未反应的抗体被留在溶液中。
进行接触的作用是使化学基团RCG1与化学基团RCG2反应以确保通过形成共价键将念珠藻素有效载荷与抗体连接；优选地
■当RCG1表示–C(＝O)-ZaRa时，反应优选发生在抗体中的氨基官能团尤其是抗体中由赖氨酸(Lys)残基的侧链所带有的ε-氨基和由抗体重链和轻链的N-末端氨基酸的α-氨基上。在此情况中得到下式的缀合物：mAb-[NH-C(＝O)-L*-Crypto]d，其中L*＝包含RCG1＝-C(＝O)-ZaRa的连接基L的片段，并且使得L＝-L*C(＝O)-ZaRa，并且d表示药物对抗体的比例或DAR；
■当RCG1表示-Cl或马来酰亚胺基或卤代乙酰胺基时，抗体可以包含巯基化学基团；
■当RCG1表示叠氮基时，抗体可以包括-C≡CH部分或者活化的叁键如环辛炔；
■当RCG1表示-NH2时，反应使用酶催化剂发生在抗体的酰胺官能团上，特别是抗体的谷氨酰胺(Gln)残基的侧链带有的酰胺基团上。在这种情况下得到下式的缀合物：mAb-[C(＝O)-NH-L*-Crypto]d，其中L*＝包含RCG1＝-NH2的连接基L的片段并且使得L＝-L*NH2，且d表示药物对抗体的比例或DAR；
■当RCG1表示-C≡CH或活化的C≡C如环辛炔部分，抗体可以包含叠氮基。
术语“聚集物”是指可在两个或更多个抗体之间形成的缔合物，所述抗体可能已通过缀合来改性。聚集物在很多种参数的影响下是易于形成的，所述参数为诸如抗体在溶液中的高浓度、溶液的pH、高的剪切力、接枝药物的数目和它们的疏水性及温度(参见J.Membrane Sci.2008,318,311–316中引用的参考文献)，然而由于这些参数中的一些而引起的影响尚未被明确地阐明。在蛋白质或抗体的情况下，可参见AAPS Journal,“ProteinAggregation and Bioprocessing”2006,8(3),E572-E579。聚集物的含量可通过已知的技术诸如SEC来确定(相关事项参见Analytical Biochemistry 1993,212(2),469-480)。
抗体的水溶液可例如用缓冲液诸如磷酸钾或HEPES或或缓冲液的混合物诸如下述缓冲液A进行缓冲。缓冲液取决于抗体的性质。将念珠藻素有效载荷溶于极性有机溶剂例如DMSO或DMA中。
反应在通常为20至40℃的温度进行。反应时间可以在1至24小时变化，抗体与念珠藻素有效载荷之间的反应可通过带有折射和/或紫外检测器和/或HRMS的SEC来监测以确定反应的进度。若取代程度是不充分的，则反应可进行较长时间和/或可加入念珠藻素化合物。可以参考实施例章节中较详细的特定条件。具体的实施方案参见实施例3、7、10、14、20和23。
本领域技术人员知晓用于在步骤(ii)中进行分离的各种色谱技术：缀合物可例如通过以下方法来纯化：空间排阻色谱(SEC)、吸附色谱(例如离子交换色谱(IEC))、疏水性相互作用色谱(HIC)、亲和色谱、在混合性载体诸如陶瓷性羟基磷灰石上进行的色谱或HPLC。也可通过透析或渗滤来进行纯化。
在步骤(i)或(ii)后，可对缀合物的溶液进行超滤和/或渗滤步骤(iii)。在这些步骤后，由此得到呈水溶液形式的缀合物。
抗体
抗体可以为选自以下的单克隆抗体：鼠类抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。
在一个实施方案中，抗体为单克隆抗体，即特异性结合至一个单独的靶标的抗体。或者，其可以为多特异性抗体。
在一个实施方案中，抗体为IgG抗体，例如IgG1抗体、IgG2抗体、IgG3抗体或IgG4抗体。
根据本发明的抗体特异性结合至靶标，由此将作为细胞毒性化合物的生物活性化合物导向生物靶标。如本文所使用的，“特异性结合”或“特异性结合至”或“结合至”等，表示抗体或其抗原结合片段与在生理条件下相对稳定的抗原形成络合物。特异性结合可以由至少约1x10-8M或更小的平衡解离常数(KD)来表征(例如，更小的KD表示更紧的结合)。确定两个分子是否特异性结合的方法在本领域中是熟知的，例如平衡透析、表面等离子体共振，等。如本文所描述的，抗体已经使用表面等离子体共振例如BIACORETM通过它们特异性结合至靶标和/或靶标抗原进行表征。
靶标一般地对应于在细胞表面表达的蛋白质，例如在肿瘤细胞表面表达的蛋白质。
在一个实施方案中，靶标为EphA2受体。EphA2受体为Ephrin受体，并且也称为“EPH受体A2”或"上皮细胞受体蛋白-酪氨酸激酶"(参见例如，OMIM Entry*176946,可从omim.org/entry/176946万维网网页获得，版本更新于2016年7月21日)。特异性结合至EphA2受体的抗体可以例如对应于在WO2008/010101或WO2011/039724中描述的一种抗体。
在另一实施方案中，靶标为CD19。CD19为造血系统的B淋巴细胞和小结树突细胞特异性表达的细胞表面分子，并且也称为“B-淋巴细胞抗原CD19”(参加例如OMIM Entry*107265，可从omim.org/entry/107265万维网网页获得，版本最后更新于2015年5月11日)。特异性结合至CD19的抗体可以例如对应于Coltuximab，即Coltuximab Ravtansin的抗体部分。
抗体可以任选地以修饰剂修饰，从而促进与前文描述的念珠藻素有效载荷的连接。抗体尤其可以是单克隆、多克隆或多特异性的。其也可以是抗体片段。其也可以是鼠类抗体、人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在本发明实施例中使用的抗体为hu2H11_R3574，针对EphA2受体的拮抗剂抗体。hu2H11_R3574的序列描述于WO2011/039724中(重链的SEQID NO：18和轻链的SEQ ID NO：16)。
缀合物
缀合物通常包含与抗体共价连接的约1至10个念珠藻素化合物(其为接枝程度或“药物:抗体比例”或“DAR”)。该数目随抗体的性质和念珠藻素化合物的性质及缀合方法中使用的操作条件(例如念珠藻素化合物相对于抗体的当量数、反应时间、溶剂的性质和任何共溶剂的性质)而变化。使抗体与念珠藻素化合物接触，这得到包含以下物质的混合物：通过不同的DAR而彼此各自区分的几种缀合物；任选的未反应的抗体；和任选的聚集物。因此，针对最终溶液而确定的DAR相应于平均DAR。DAR可以从缀合物的SEC-HRMS光谱解卷积进行计算。DAR(HRMS)优选大于0.5，更具体为1至10，且甚至更具体为2至7。
缀合物可用作抗癌剂。由于抗体的存在，缀合物对肿瘤细胞而非健康细胞具有高度的选择性。这可在与其类似的环境中或直接在其中引导念珠藻素化合物(相关事项参见以下对单克隆抗体缀合物在治疗癌症中的用途进行描述的公开出版物：“Antibody-drugconjugates for cancer therapy”Carter P.J.,et al.,Cancer J.2008,14,154–169；“Targeted cancer therapy：conferring specificity to cytotoxic drugs”Chari R.,Acc.Chem.Res.2008,41,98–107)。其可治疗实体癌症或液体癌症。缀合物可单独使用或与至少一种其它抗癌剂联用。
将缀合物配制成经缓冲的水溶液形式，其浓度通常为1至10mg/ml。该溶液可按灌注形式本身来注射或可被重新稀释以形成灌注溶液。
【实施例】
下文的实施例描述了根据本发明的一些化合物的制备。这些实施例是非限制性的，并且仅用来说明本发明。
所使用的分析方法
高压液相色谱–质谱(LCMS)
方法A1
在Waters UPLC-SQD体系上得到光谱，以阳离子和/阴离子电喷雾模式(ES+/-)，使用ELSD和UV(210-400nm)探测。色谱条件如下：
柱：ACQUITY BEH C18–1.7μm–2.1 x 50mm；溶剂：A：H2O(0.1％甲酸),B：CH3CN(0.1％甲酸)；柱温度：50℃；流速：0.8mL/min；梯度(2.5min)：历时1.8min从5至100％的B；2.4min：100％的B；2.45min：历时0.05min从100至5％的B。
方法A2
在Waters XeVo-QTof体系上得到光谱，以阳离子电喷雾模式(ES+)，使用ELSD和UV(210-400nm)探测。色谱条件如下：
柱：ACQUITY BEH C18–1.7μm–2.1 x 100mm；溶剂：A：H2O(0.1％甲酸),B：CH3CN(0.1％甲酸)；柱温度：70℃；流速：0.55mL/min；梯度(11min)：历时8.3min从5至97％的B；8.6min：97％的B；9min：历时0.7min从97至5％的B和2min期间5％的B。
方法A3
在Waters XeVo-QTof体系上得到光谱，以阳离子电喷雾模式(ES+)。色谱条件如下：
柱：ACQUITY BEH C18–1.7μm–2.1 x 100mm；溶剂：A：H2O(0.1％甲酸),B：CH3CN(0.1％甲酸)；柱温度：45℃；流速：0.6mL/min；梯度(5.3min)：0.3min期间5％的B；历时3.7min从5至100％的B；4.6min：100％的B；5.3min 5％的B。
方法A4
在Waters UPLC-SQD体系上得到光谱，以阳离子和/阴离子电喷雾模式(ES+/-)，使用ELSD和UV(210-400nm)探测。色谱条件如下：
柱：ACQUITY BEH C18–1.7μm–2.1 x 50mm；溶剂：A：H2O(0.1％甲酸),B：CH3CN(0.1％甲酸)；柱温度：45℃；流速：0.8mL/min；梯度(10min)：历时8.6min从5至100％的B；9.6min：100％的B；9.8min：5％的B。
方法A5
在Waters UPLC-SQD体系上得到光谱，以阳离子和/阴离子电喷雾模式(ES+/-)，使用ELSD和UV(210-400nm)探测。色谱条件如下：
柱：ACQUITY CSH C18–1.7μm–2.1 x 50mm；溶剂：A：H2O(0.1％甲酸),B：CH3CN(0.1％甲酸)；柱温度：40℃；流速：0.85mL/min；梯度(2.5min)：历时1.8min从5至100％的B；2.4min：100％的B；2.45min：历时0.05min从100至5％的B。
1H核磁共振(NMR)
用Bruker Avance波谱仪(型号为DRX-300、DRX-400或DRX-500)得到1H NMR谱。化学位移(δ)以ppm给出。
空间排阻色谱–高分辨率质谱(SEC-HRMS)
色谱分析在Agilent HP1100设备和Waters BEH SEC 2001.7μm(2.1 x 150mm)柱上于30℃进行，以流速0.5mL/min和等度洗脱(A)25mM甲酸铵+1％甲酸/(B)CH3CN+0.1％甲酸70/30实施15分钟。质谱在Waters QTOF-II机器上以阳离子模式的电喷雾离子化(ES+)进行。质谱以Waters MaxEnt1软件进行解卷积。
分析性空间排阻色谱(SEC)
在配有光电二极管矩阵检测器和Tosoh Bioscience TSKgel G3000SWXL 5μm(7.8×300mm)柱的Waters Alliance HPLC系统或Hitachi Lachrom系统上进行分析，流速为0.5mL/min且以含有0.2M的KCl、0.052M的KH2PO4、0.107M的K2HPO4和20体积％的异丙醇的pH7缓冲液等度洗脱30分钟。
缓冲液
●缓冲液A(pH 6.5)：NaCl(50mM),磷酸钾(50mM),EDTA(2mM)
●缓冲液B(pH 6.5)：NaCl(140mM),磷酸钾和磷酸钠(9.6mM)
●PBS(pH 7.4)：KH2PO4(1.06mM),NaCl(155.17mM),Na2HPO4-7H2O(2.97mM)
●DPBS：KCl(2.67mM),KH2PO4(1.47mM),NaCl(136.9mM),Na2HPO4(8.10mM)，以HCl5N(每1000mL的缓冲液1mL)调节至pH 6.5
用来制备抗体-药物缀合物(ADC)的一般方法
抗体在缓冲水溶液中的溶液包含缓冲液A和1 N HEPES的96:4混合物，对其以过量的念珠藻素有效载荷在DMA中的大致10mM的溶液进行处理，使得最终的抗体浓度为3mg/mL且DMA在缓冲水溶液中的百分比为20％。搅拌2小时后，混合物通过SEC-HRMS分析以确定在单体抗体的种群上的DAR。如果DAR不充足，混合物以进一步过量(1至5当量)的念珠藻素在DMA中的溶液于室温在搅拌下再处理2小时。混合物通过凝胶过滤Superdex200pg基质(HiLoad 16/60或26/60脱盐柱，GEHealthcare)(在含10至20％的NMP的缓冲水溶液pH 6.5(缓冲液B或DPBS)中预平衡)纯化。含有单体缀合的抗体的各级分经收集并在AmiconUltra-15(10k或50k Ultracel membrane,Millipore)浓缩至浓度为2至5mg/mL。然后在适当的缓冲液中进行缓冲液交换或稀释以配制最终缓冲液中的缀合物。在缓冲液交换的情况下，通过凝胶过滤使用SephadexTM G25基质(NAP-5、NAP-10、NAP-25/PD-10或Hiprep 26/10脱盐柱，GEHealthcare)(以最终缓冲水溶液预平衡，其组成和pH适合每种缀合物)来实现。缀合物最终通过
Figure BDA0001649098600001532
过滤装置(0.22μm
Figure BDA0001649098600001533
PVDF膜，Millipore)过滤。最终的缀合物通过UV光谱测定法或SEC-HPLC分析来测量缀合物浓度，通过SEC-HPLC来确定单体纯度并通过SEC-HRMS来确定来自缀合物的质谱的解卷积的DAR。
片段A的合成：(2E,5S,6R,7E)-8-(4-甲酰基苯基)-5-羟基-6-甲基辛-2,7-二烯酸 叔丁基酯
Figure BDA0001649098600001531
化合物1：(2E,5S,6R)-5-羟基-7-((4-甲氧基苄基)氧基)-6-甲基庚-2-烯酸叔丁基酯
在氩气下，向(2R,3S)-1-[(4-甲氧基苯基)甲氧基]-2-甲基-5-己烯-3-醇或Sakurai醇(CAS号[203z926-55-0],100g,399.5mmol)在DCM(350mL)中的溶液添加丙烯酸叔丁基酯(354.7mL,2.435mol)和Grubbs催化剂(4.849g,2.435mol)。于室温搅拌17h后，反应混合物在230g的二氧化硅上过滤并以庚烷/AcOEt(50/50,6 x 300mL)的混合物洗脱。浓缩后，剩余物通过快速色谱在1.2kg的硅胶(梯度洗脱庚烷/EtOAc)上纯化得到140.8g的棕色油状物。油状物溶解在无水DCM(550mL)中，添加10g的quadraPureTM TU树脂以除去过量的催化剂。混合物于35℃搅拌3h。过滤树脂并以DCM洗涤，滤液经浓缩并真空干燥得到135.75g的化合物1，为棕色油状物(97％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.85(d,J＝7.0Hz,3H)；1.42(s,9H)；1.72(m,1H)；2.18(m,1H)；2.30(m,1H)；3.24(dd,J＝7.0和9.3Hz,1H)；3.46(dd,J＝7.7和9.3Hz,1H)；3.49(m,1H)；3.73(s,3H)；4.35(s,2H)；4.65(d,J＝5.8Hz,1H)；5.76(td,J＝1.5和15.6Hz,1H)；6.83(td,J＝7.4和15.6Hz,1H)；6.90(d,J＝8.8Hz,2H)；7.23(d,J＝8.8Hz,2H).
化合物2：(2E,5S,6R)-5,7-二羟基-6-甲基庚-2-烯酸叔丁基酯
向化合物1在CH3CN(910mL)中的溶液添加H2O(90mL)，并且混合物于12℃冷却，然后在25min内添加CAN(196.7g,358.9mmol)在H2O(300mL)中的溶液。在室温持续搅拌1h。添加额外的溶解在CH3CN(70mL)和H2O(30mL)的混合物中的CAN(18.83g,34.36mmol)并于室温搅拌1h以完成反应。混合物以NaCl淬灭直到水层饱和，然后添加MTBE(400mL)。倾析后，水层以MTBE萃取(2 x 80mL)。合并的有机层以5％NaHCO3/H2O(3 x 200mL)、饱和盐水(2 x 130mL)的3:1混合物洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。水层以2N HCl酸化直到pH 4，然后以NaCl饱和并以MTBE(2 x 150mL)萃取。该第二有机层以5％NaHCO3(60mL)、饱和盐水(60mL)洗涤，经MgSO4干燥，浓缩并与第一有机层合并得到棕色橙色油状物。
混合物溶解于MeTHF(300mL)中，然后添加1,2-乙二硫醇(22mL,0.260mol)和p-TsOH(1.651g,8.590mmol)。于60℃搅拌5h后，将MTBE(200mL)添加至反应混合物中并且其以5％NaHCO3(2 x 120mL)、饱和盐水(120mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在520g的硅胶(梯度洗脱DCM/MTBE)纯化得到29.48g的化合物2，为黄色油状物(75％)。
化合物3：(2E,5S,6R)-6-甲基-5,7-双((三乙基甲硅烷基)氧基)庚-2-烯酸叔丁基酯
在氩气下，向化合物2(39.38g,0.171mol)在无水DCM(500mL)中的溶液添加咪唑(51.540g,0.749mol)。黄色混合物于0℃冷却，然后添加三乙基氯硅烷(63.99mL,0.374mol)并允许溶液升温至室温过夜。反应混合物以饱和NH4Cl(400mL)、MTBE(300mL)和冰淬灭。pH以2M NaHSO4调节为4，剧烈搅拌后分离各层。水层以MTBE萃取(200mL)。合并的有机层以半饱和NH4Cl(2 x 250mL)、磷酸盐缓冲液pH 7(150mL)、饱和盐水(150mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在490g的硅胶(梯度洗脱庚烷/Et2O)上纯化得到74.52g的化合物3，为淡黄色油状物(95％)。
化合物4：(2E,5S,6S)-6-甲基-7-氧代-5-((三乙基甲硅烷基)氧基)庚-2-烯酸叔丁基酯
在氩气下，于-75℃在1h内向DMSO(102.400mL,1.427mol)在DCM(300mL)中的溶液滴加草酰氯(63mL,0.719mol)并持续搅拌15min，然后于-75℃添加化合物3在DCM(150mL)中的溶液，同时保持温度低于-70℃。反应混合物升温至-40℃并且持续搅拌2h。反应混合物再次于-75℃冷却，然后在75min内添加DIEA(425mL,2.432mol)，同时保持温度低于-65℃。反应混合物升温至室温，并且然后以MTBE(500mL)、冰、饱和NH4Cl(200mL)淬灭，并以2M NaHSO4达到pH 4。剧烈搅拌后分离各层。水层以MTBE(200mL)萃取。合并的有机层以NH4Cl(3 x300mL)、磷酸盐缓冲液pH 7(300mL)、饱和盐水(300mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在1.25kg的硅胶(梯度洗脱庚烷/Et2O)上纯化得到51.74g的化合物4，为橙色油状物(93％)。
化合物5：(2E,5S,6R,7E)-5-羟基-8-(4-(羟基甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸叔丁基酯
在氩气下，向溴化鏻(在WO2011/001052中描述的合成,147g,0.237mol)在无水THF(1.5L)中的混悬液于-50℃添加n-BuLi在己烷(90mL,0.225mol)中的2.5M溶液。允许温度升温至-40℃并且持续搅拌15min。加热至室温后，红色混合物搅拌1h。反应介质于-70℃冷却，然后添加化合物4(51.63g,126.6mmol)在THF(200mL)中的溶液，同时保持温度低于-65℃。当添加完成后，允许反应混合物升温至室温，并且持续搅拌过夜。反应混合物经过滤以除去不溶物，不溶物以MTBE(500mL)洗涤。滤液于42℃经部分浓缩(1/3)，然后以冰、NH4Cl(500mL)、MTBE(500mL)淬灭并以2M NaHSO4达到pH 4。分离各层，并且水层以MTBE(200mL)萃取。合并的有机层以半饱和NH4Cl(250mL)、磷酸盐缓冲液pH 7(250mL)、饱和盐水(250mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并半真空浓缩直到250mbar。悬浮液以50:50庚烷/MTBE(600mL)(以冰浴冷却)稀释，过滤并以50:50庚烷/MTBE洗涤。滤液经真空浓缩得到100.05g，为棕色油状物。
粗化合物溶解于无水THF(320mL)，然后添加TBAF三水合物(90g,282.40mmol)并且反应混合物搅拌3h。真空浓缩后，粗产物以10:1MTBE/THF(770mL)稀释，以半饱和NH4Cl(3 x200mL)、1M NaHSO4(200mL)、磷酸盐缓冲液pH 7(200mL)、饱和盐水(200mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。水层以MTBE萃取。倾析后，有机层以磷酸盐缓冲液pH 7(30mL)、饱和盐水(30mL)洗涤，经MgSO4干燥并过滤。浓缩后，合并的有机层通过硅胶色谱在1.25kg的硅胶(梯度洗脱庚烷/Et2O)上纯化得到36.91g的化合物5，为棕红的油状物(88％)。
片段A：(2E,5S,6R,7E)-8-(4-甲酰基苯基)-5-羟基-6-甲基辛-2,7-二烯酸叔丁基酯
在氩气下，于10℃向化合物5(30.3g,91.7mmol)在无水DCM(600mL)中的溶液添加氧化锰(175g,3.013mol)并且反应混合物于35℃搅拌4h。氧化剂经硅藻土塞过滤并以温的丙酮洗涤。滤液经浓缩得到30.43g的红橙色油状物。
在氩气下，油状物以苯(800mL)稀释并在AIBN(880mg,4.58mmol)和苯硫酚(2.81mL,27.51mmol)的存在下回流1h。添加额外的AIBN(530mg,0.03当量)和苯硫酚(1.03mL,10.087mmol)并再持续回流1h.添加额外的AIBN(530mg,0.03当量)和苯硫酚(1.03mL,10.087mmol)并持续回流3h。添加额外的AIBN(353mg,1.834mmol)和苯硫酚(468μL,4.58mmol)并且持续回流1h。转化率E/Z为92/8,添加352.6mg的AIBN并持续回流1h。反应混合物冷却至室温并真空浓缩得到28.03g的片段A，为橙色油状物(92％)，其中E/Z比率大于98/2。
片段B的合成：(R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基-苯基)丙酸
Figure BDA0001649098600001571
向(R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙酸甲基酯(CAS号[162465-44-3],30g,87.26mmol)在THF(225mL)中的溶液添加H2O(30mL)和LiOH一水合物(4.4g,104.85mmol)。反应介质于室温搅拌2h。此后，反应介质以H2O(200mL)稀释，然后以5NHCl(20mL)酸化在pH 2并以EtOAc(2 x 250mL)萃取。合并的有机相以H2O(500mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，以Et2O稀释并真空浓缩得到26.9g的片段B，为白色固体(94％)。
RMN 1H(300MHz,δin ppm,DMSO-d6)：1.21至1.37(m,9H)；2.74(dd,J＝11.0和14.3Hz,1H)；2.96(dd,J＝5.0和14.3Hz,1H)；3.81(s,3H)；4.04(m,1H)；6.99至7.09(m,2H)；7.18(dd,J＝2.3和8.7Hz,1H)；7.29(d,J＝2.3Hz,1H)；12.60(宽峰m,1H)。
片段C1的合成：3-氨基-2,2-二甲基丙酸甲基酯盐酸盐
Figure BDA0001649098600001572
化合物6：3-((叔-丁氧基羰基)氨基)-2,2-二甲基丙酸甲基酯
在氩气下，向3-([(叔-丁氧基)羰基]氨基)-2,2-二甲基丙酸(CAS号[180181-02-6],250mg,1.09mmol)在DCM(6mL)和MeOH(2mL)中的溶液于0℃滴加(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷(819.86μL,1.64mmol)直到恒定为黄色。然后添加AcOH直到完全脱色。反应混合物经真空浓缩，然后以H2O稀释并以DCM萃取两次。合并的有机相以饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到260mg的化合物6，为无色油状物(定量)。
片段C1：3-氨基-2,2-二甲基丙酸甲基酯盐酸盐
向化合物6(260mg,1.12mmol)在1,4-二噁烷(10mL)中的溶液添加在1,4-二噁烷中的4N HCl(2.81mL,11.24mmol)。反应混合物于室温搅拌过夜，然后真空浓缩得到200mg的片段C1(定量)。
片段C2的合成：3-氨基-2,2-二甲基丁酸甲基酯盐酸盐
Figure BDA0001649098600001581
化合物7：3-((叔-丁氧基羰基)氨基)丁酸
向DL-3-氨基丁酸(CAS号[541-48-02],18.72g,176.09mmol)在H2O(96mL)中的溶液添加在H2O(76mL)中的二碳酸二叔丁基酯(39.62g,176.09mmol)和NaOH(8.03g,200.74mmol)，然后添加叔丁基醇(132mL)。反应混合物于室温搅拌过夜。此后，反应介质经真空浓缩，然后以EtOAc(200mL)稀释并以稀HCl在pH 3酸化。静置后，水相以EtOAc(200mL)萃取。合并的有机相经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到34.5g的化合物7，为无色油状物(82％)。
RMN 1H(300MHz,δin ppm,CDCl3-d1)：1.25(d,J＝7.0Hz,3H)；1.45(s,9H)；2.55(m,2H)；4.04(m,1H)；4.93(宽峰m,1H)；8,41(宽峰m,1H).
化合物8：3-((叔-丁氧基羰基)氨基)丁酸甲基酯
在氩气下，化合物7(10g,49.20mmol)在甲苯(350mL)和MeOH(100mL)中的溶液于+5℃搅拌。在+5℃和+10℃之间，滴加(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷(73.81mL,147.61mmol)。反应混合物搅拌3h，然后真空蒸发得到10.8g的化合物8，为淡黄色油状物(定量)。
RMN 1H(300MHz,δin ppm,CDCl3-d1)：1.20(d,J＝7.0Hz,3H)；1.45(s,9H)；2.50(m,2H)；3.69(s,3H)；4.03(m,1H)；4.90(宽峰m,1H).
化合物9：3-((叔-丁氧基羰基)氨基)-2-甲基丁酸甲基酯
在氩气下，于-70℃向LDA(2M在THF中，25.32mL,50.63mmol)在THF(48mL)中的溶液滴加化合物8(5g,23.01mmol)在THF(62mL)中的溶液。反应混合物于-75℃搅拌，然后于-70℃滴加碘甲烷(5.79mL,92.05mmol)1h。反应混合物于-75℃搅拌3h，然后于室温搅拌过夜。此后，添加20％NH4Cl水溶液(100mL)和Et2O(125mL)。静置后，有机相以饱和NaHCO3(80mL)洗涤，然后以饱和NaCl(80mL)洗涤。合并的水相以Et2O(125mL)萃取。合并的有机相经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到5.49g的粗制油状物。以真空干燥后，戊烷结晶(15mL)得到2.65g的化合物9。该戊烷溶液经真空浓缩并通过快速色谱在100g的硅胶(梯度洗脱庚烷/Et2O)上纯化得到1.98g的化合物9。两个批次经收集(87％)并以其本身用于后续步骤。
化合物10：3-((叔-丁氧基羰基)氨基)-2-,2-二甲基丁酸甲基酯
在氩气下，THF(46mL)于-72℃冷却，然后添加LDA(2M在THF中,22mL,44.0mmol)并于-72℃(+/-2℃)滴加化合物9(4.60g,19.89mmol)在THF(64mL)中的溶液。反应混合物于-75℃搅拌1h15，然后于-72℃(+/-2℃)滴加碘甲烷(5mL,79.55mmol)。反应介质于-75℃搅拌3h，然后于室温搅拌过夜。此后，添加20％NH4Cl水溶液(50mL)和Et2O(80mL)。静置后，有机相以饱和NaHCO3(50mL)和饱和盐水(50mL)洗涤。合并的水相经Et2O(80mL)萃取。合并的有机相经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到6.5g的粗制油状物，其通过快速色谱在200g的硅胶(梯度洗脱庚烷/iPr2O)上纯化得到1.9g的化合物10，为无色油状物(39％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.92(d,J＝7.1Hz,3H)；1.02(s,3H)；1.04(s,3H)；1.48(s,9H)；3.58(s,3H)；3.88(m,1H)；6.62(宽峰d,J＝10.5Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝146,m/z＝246[M+H]+；tR＝1.2min.
片段C2：3-氨基-2,2-二甲基丁酸甲基酯盐酸盐
在圆底烧瓶中，在磁力搅拌下，引入化合物10(0.3g,1.22mmol)，接着引入在1,4-二噁烷(5mL)中的1,4-二噁烷(5mL)和4N HCl。反应混合物于室温搅拌过夜，然后真空浓缩。所得粗固体沉淀在iPr2O(15mL)中，过滤并干燥得到210mg的片段C2，为白色固体(95％)。
LCMS(A1)：ES m/z＝146[M+H]+；tR＝0.8min.
片段C3的合成：2-(1-氨基环丙基)-2,2-二甲基丙酸乙基酯
Figure BDA0001649098600001601
在氩气下，向2-氰基-2-甲基丙酸乙基酯(CAS号[1572-98-1],2g,13.88mmol)在Et2O(48mL)中的溶液添加异丙醇钛(IV)(4.63g,15.97mmol)。反应混合物于室温搅拌10min，然后于-5℃冷却。于-5℃-0℃在25min中内滴加乙基溴化镁3M在Et2O(9.72mL,29.16mmol)中的溶液，然后不使用冷却浴搅拌反应混合物40min。此时，TLC显示然后反应完成。反应介质于0℃冷却并于0℃滴加三氟化硼二乙基乙醚合物(3M在Et2O中，3.6mL,29.16mmol)。反应混合物不使用冷却浴搅拌30min。此后，于0℃添加1N HCl直到pH 1-2(8mL)，然后添加2N NaOH直到pH 8(28mL)，反应混合物以EtOAc萃取(3 x 150mL)。合并的有机相经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到2.4g的粗制黄色油状物，其通过快速色谱在70g的硅胶上(梯度洗脱DCM/MeOH)纯化得到915mg的片段C3，为淡黄色油状物(39％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,CDCl3-d1)：0.52(m,2H)；0.70(m,2H)；1.11(s,6H)；1.27(t,J＝7.2Hz,3H)；1.64(宽峰s,2H)；4.18(q,J＝7.2Hz,2H).
片段C4的合成：3-氨基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙酸甲基酯盐酸盐
Figure BDA0001649098600001611
化合物11：3-((叔-丁氧基羰基)氨基)-2-甲基丙酸
向DL-3-氨基异丁酸(CAS号[10569-72-9],5g,47.52mmol)在2N NaOH(24.7mL)中的溶液滴加Boc2O(11.73g,53.22mmol)在THF(75mL)中的溶液，同时以冷水浴保持反应介质的温度低于30℃。反应介质于室温搅拌18h，然后真空浓缩，在H2O(75mL)中稀释并且以MTBE(3 x 150mL)洗涤。水相通过添加100g/L(150mL的柠檬酸酸化至pH 3，并以EtOAc(3 x150mL)萃取。合并的有机相以H2O洗涤(3 x 45mL)，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到9.4g的化合物11，为无色油状物(97％).
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：1.01(d,J＝7.1Hz,3H)；1.38(s,9H)；2.48(m,1H)；2.91(dt,J＝6.1,6.5和13.5Hz,1H)；3.15(ddd,J＝6.1,7.4和13.5Hz,1H)；6.80(t,J＝6.1Hz,1H)；12.15(宽峰s,1H).
化合物12：3-((叔-丁氧基羰基)氨基)-2-甲基丙酸甲基酯
向化合物11(9.4g,46.25mmol)在丙酮(300mL)中的溶液添加K2CO3(16.14g,115.63mmol)和CH3I(13.26g,92.5mmol)。反应介质，黄色的悬浮液，于室温搅拌20h，然后经Clarcel过滤。由此得到的滤饼以丙酮洗涤，滤液经真空浓缩，以DCM(100mL)稀释，经Clarcel过滤，由此得到的滤饼以DCM洗涤且滤液经真空浓缩得到9.4g的化合物12，为黄色液体(93％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：1.01(d,J＝7.1Hz,3H)；1.37(s,9H)；2.54(m,1H)；2.91(dt,J＝6.2和13.5Hz,1H)；3.15(ddd,J＝6.2,6.9和13.5Hz,1H)；3.59(s,3H)；6.90(t,J＝6.2Hz,1H).
化合物13：3-((叔-丁氧基羰基)氨基)-2-(((4-甲氧基苄基)氧基)甲基)-2-甲基丙酸甲基酯
向DIEA(3.2mL,22.45mmol)在THF(10mL)中的冷却在-75℃的溶液滴加1.6M n-BuLi在THF(14mL,22.4mmol)中的溶液。反应介质于-75℃搅拌20min；然后于-75℃滴加化合物12(2g,9.21mmol)在THF(16mL)中的溶液，并且反应混合物于-75℃搅拌10min。1-((氯甲氧基)甲基)-4-甲氧基苯(1.72g,9.21mmol)在THF(16mL)中的溶液然后快速添加至反应混合物并且于-25℃持续搅拌4h。反应介质以DCM(100mL)稀释，然后添加100g/L的柠檬酸溶液(50mL)同时保持温度低于5℃。反应介质于室温RT搅拌15min。有机相以100g/L的柠檬酸溶液(2 x 50mL)、H2O(3 x 50mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到4.08g的黄橙色油状物，其通过快速色谱在150g的硅胶(梯度洗脱庚烷/EtOAc)上纯化，得到2.05g的化合物13，为无色油状物(60％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：1.03(s,3H)；1.37(s,9H)；3.14(d,J＝6.8Hz,2H)；3.31(d,J＝9.1Hz,1H)；3.48(d,J＝9.1Hz,1H)；3.58(s,3H)；3.73(s,3H)；4.38(s,2H)；6.76(t,J＝7.1Hz,1H)；6.90(d,J＝8.9Hz,2H)；7.20(m,2H).
片段C4：3-氨基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙酸甲基酯盐酸盐
化合物13(1.5g,4.08mmol)以在二噁烷(24mL)中的4M HCl溶液于室温处理1h。反应介质然后真空浓缩并在甲苯的存在下共蒸发得到794mg的片段C4，为粘稠油状物(定量)。
合成AD1：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-氨基-4-甲基戊酰基)氧基)-8-(4-(叠氮基 甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸叔丁基酯
Figure BDA0001649098600001631
化合物14：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-甲基戊酰基)氧基)-8-(4-甲酰基苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸叔丁基酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，在磁力搅拌下，引入Fmoc-Leu-OH(4.9g,13.86mmol)，接着引入在DCM(100mL)和DIEA(6.6mL,38.13mmol)中的片段A(3.5g,10.59mmol)。然后添加MNBA(5g,14.52mmol)和DMAP(620mg,5.07mmol)，并且反应混合物于室温搅拌过夜。此后，反应介质以H2O(100mL)和饱和盐水(100mL)洗涤。有机相经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到9.1g的粗的橙色油状物，其通过快速色谱在400g的硅胶(梯度洗脱庚烷/AcOEt)上纯化得到5g的化合物14，为淡黄色油状物(71％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.77(d,J＝6.8Hz,6H)；1.05(d,J＝7.0Hz,3H)；1.33至1.64(m,4H)；1.38(s,9H)；2.39至2.63(部分遮蔽的m,2H)；4.01(m,1H)；4.13至4.31(m,3H)；4.95(m,1H)；5.81(d,J＝15.9Hz,1H)；6.37(dd,J＝8.8和16.2Hz,1H)；6.52(d,J＝16.2Hz,1H)；6.70(td,J＝7.3和15.9Hz,1H)；7.29(t,J＝7.9Hz,2H)；7.40(t,J＝7.9Hz,2H)；7.56(d,J＝8.4Hz,2H)；7.67(dd,J＝7.9Hz,2H)；7.74至7.82(m,3H)；7.87(d,J＝7.9Hz,2H)；9.93(s,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝666[M+H]+,m/z＝689[M+Na]+；tR＝1.92min.
化合物15：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-甲基戊酰基)氧基)-8-(4-(羟基甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸叔丁基酯
在氩气下，向化合物14(5g,7.51mmol)在MeTHF(60mL)中的溶液分份添加三甲氧基硼氢化钠(1.2g,8.91mmol)。反应介质于室温搅拌5h。此后，添加饱和NH4Cl(100mL)和丙酮(20mL)。反应介质于室温搅拌1h。静置后，有机相以H2O洗涤，然后以饱和盐水(50mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到5.3g的粗黄色油状物，其通过快速色谱在300g的硅胶(梯度洗脱庚烷/AcOEt)上纯化得到3.15g的化合物15，为白色半固体(63％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.80(m,6H)；1.02(d,J＝7.0Hz,3H)；1.35至1.66(m,4H)；1.38(s,9H)；2.35至2.56(部分遮蔽的m,2H)；4.02(m,1H)；4.15至4.32(m,3H)；4.43(d,J＝5.5Hz,2H)；4.92(m,1H)；5.12(t,J＝5.5Hz,1H)；5.80(d,J＝15.9Hz,1H)；6.10(dd,J＝8.8et 16.2Hz,1H)；6.39(d,J＝16.2Hz,1H)；6.69(m,1H)；7.20(d,J＝8.4Hz,2H)；7.28至7.33(m,4H)；7.41(t,J＝7.9Hz,2H)；7.69(t,J＝7.9Hz,2H)；7.80(d,J＝8.2Hz,1H)；7.88(d,J＝7.9Hz,2H).LCMS(A1)：ES m/z＝668[M+H]+；m/z＝690[M+Na]+；m/z＝712[M-H+HCO2H]-；tR＝1.84min.
化合物16：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4-甲基戊酰基)氧基)-8-(4-(叠氮基甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸叔丁基酯
在氩气下，化合物15(3.15g,4.72mmol)和DCM(50mL)引入圆底烧瓶中。于0℃，添加TEA(987μL,7.08mmol)，接着添加甲磺酰氯(438μL,5.66mmol)，反应介质于0℃搅拌1h并于室温搅拌13h。此后，添加DCM(50mL)和水(50mL)。静置后，有机相以饱和盐水(3 x 25mL)洗涤，经MgSO4干燥并真空浓缩。在氩气下，由此得到的粗产物溶解于DMF(50mL)中并添加叠氮化钠(644mg,9.91mmol)。反应介质于室温搅拌过夜。此后，DMF经真空浓缩并添加AcOEt。所得混合物以0.1N HCl(25mL)、饱和NaHCO3(25mL)和饱和盐水(25mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到3.3g的粗产物，其通过快速色谱在200g的硅胶(梯度洗脱庚烷/AcOEt)上纯化得到1.8g的化合物16，为无色胶状物(55％)和740mg的化合物AD1(33％)。
LCMS(A2)：ES m/z＝715[M+Na]+；tR＝8.95min.
化合物AD1：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-氨基-4-甲基戊酰基)氧基)-8-(4-(叠氮基甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸叔丁基酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，在磁力搅拌下，引入化合物16(1.8g,2.6mmol)和DCM(50mL)，接着引入哌啶(1.6mL,16.2mmol)。反应介质于室温搅拌过夜。此后，其以1N HCl洗涤，然后以饱和NaHCO3、饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到2g的粗产物，其通过快速色谱在130g的硅胶(梯度洗脱庚烷/AcOEt)上纯化得到1.48g的化合物AD1，为淡黄色油状物(定量)。
LCMS(A3)：ES m/z＝471[M+H]+；tR＝2.65min.
合成AD2：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-氨基-4,4-二甲基戊酰基)氧基)-8-(4-(羟 基甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸叔丁基酯盐酸盐
Figure BDA0001649098600001651
化合物17：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4,4-二甲基戊酰基)氧基)-8-(4-甲酰基苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸叔丁基酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，向化合物A(1.633g,4.94mmol)在DCM(60mL)中的溶液添加L-Fmoc-叔-Leu-OH(1.82g,4.94mmol),DIEA(2.57mL,14.83mmol),MNBA(1.70g,4.94mmol)和DMAP(241.51mg,1.98mmol)。于室温搅拌2h，反应介质以H2O(50mL)稀释并以DCM萃取两次。合并的有机相以柠檬酸(2 x 50mL),饱和NaHCO3(50mL)和饱和盐水(50mL)洗涤,经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到3.24g的粗化合物17，其直接用于后续还原中(96％)。
化合物18：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4,4-二甲基戊酰基)氧基)-8-(4-(羟基甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸叔丁基酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，向化合物17(3.24g,4.77mmol)在MeTHF(60mL)中的溶液中于0℃添加三甲氧基硼氢化钠(670.56mg,5.24mmol)。于室温搅拌1h后，添加额外的三甲氧基硼氢化钠(304mg,2.38mmol)并搅拌2h。然后反应介质于0℃冷却，以丙酮(18mL)和饱和NH4Cl(36mL)稀释并以AcOEt萃取。合并的有机相以饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在100g的硅胶(梯度庚烷/AcOEt)上纯化得到2.61g的化合物18，为无色无定形固体(80％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.80(s,9H)；1.02(d,J＝7.0Hz,3H)；1.35至1.60(m,4H)；1.38(s,9H)；2.37至2.58(部分遮蔽的m,2H)；4.04(m,1H)；4.16至4.33(m,3H)；4.45(d,J＝5.7Hz,2H)；4.91(m,1H)；5.12(t,J＝5.7Hz,1H)；5.80(d,J＝16.0Hz,1H)；6.10(dd,J＝8.8和16.2Hz,1H)；6.39(d,J＝16.2Hz,1H)；6.69(m,1H)；7.21(d,J＝8.4Hz,2H)；7.25至7.33(m,4H)；7.40(t,J＝7.9Hz,2H)；7.68(t,J＝7.9Hz,2H)；7.78(d,J＝8.3Hz,1H)；7.88(d,J＝7.9Hz,2H).LCMS(A1)：ES m/z＝608；m/z＝682[M+H]+；m/z＝726[M-H+HCO2H]-；tR＝1.85min.
化合物AD2：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-氨基-4,4-二甲基戊酰基)氧基)-8-(4-(羟基甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸叔丁基酯盐酸盐
在氩气下，在圆底烧瓶中，向化合物18(2.61g,3.83mmol)在DCM(40mL)中的溶液添加哌啶(7.60mL,76.56mmol)并且反应介质于室温搅拌1h。然后其经浓缩并以AcOEt萃取。合并的有机层以1N HCl,H2O和饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。残余物以iPr2O(50mL)稀释并于室温搅拌40h。粗产物经过滤，以iPr2O洗涤并于40°真空干燥3h得到1.706g的化合物AD2，为无色无定形固体(90％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.88(s,9H)；1.10(d,J＝7.0Hz,3H)；1.39至1.49(m,1H)；1.42(s,9H)；1.75(dd,J＝6.1和15.1Hz,1H)；2.47至2.64(部分遮蔽的m,2H)；3.92(t,J＝5.5Hz,1H)；4.47(d,J＝5.7Hz,2H)；5.02(m,1H)；5.15(t,J＝5.7Hz,1H)；5.90(d,J＝15.9Hz,1H)；6.15(dd,J＝8.3和16.1Hz,1H)；6.44(d,J＝16.1Hz,1H)；6.77(td,J＝7.3和15.9Hz,1H)；7.26(d,J＝8.4Hz,2H)；7.34(d,J＝8.4Hz,2H)；8.10(宽峰m,3H).LCMS(A1)：ES m/z＝460[M+H]+；tR＝0.95min.
合成AD3：(S)-2-氨基-4,4-二甲基戊酸(2R,3S)-1-((4-甲氧基苄基)氧基)-2-甲 基己-5-烯-3-基酯
Figure BDA0001649098600001671
化合物19：(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4,4-二甲基戊酸(2R,3S)-1-((4-甲氧基苄基)氧基)-2-甲基己-5-烯-3-基酯
向Sakurai醇(1.02g,4.08mmol)和(S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-4,4-二甲基戊酸(1.5g,4.08mmol)在THF(15mL)中的溶液添加2,4,6-三氯苄酰氯(1.02g,4.08mmol)，滴加TEA(1.14mL,8.16mmol)和DMAP(126.0mg,1.02mmol)。反应介质于室温搅拌5h,然后使用冰浴冷却，然后添加1N HCl(60mL)同时保持温度低于10℃。所得介质于室温搅拌15min，并以EtOAc(3 x 50mL)萃取。合并的有机相以饱和NaHCO3(15mL),饱和盐水(3 x15mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过三次连续的快速色谱在硅胶柱(150g,梯度洗脱庚烷/EtOAc；150g和20g,梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到1.78g的化合物19，为无色油状物(72％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.85(d,J＝7.1Hz,3H)；0.89(s,9H)；1.51(dd,J＝2.8和14.3Hz,1H)；1.61(dd,J＝9.0和14.3Hz,1H)；1.95(m,1H)；2.21(m,1H)；2.31(m,1H)；3.20(dd,J＝6.5和9.6Hz,1H)；3.35(m,1H)；3.73(s,3H)；4.04(m,1H)；4.18至4.34(m,5H)；4.83(m,1H)；5.00(dq,J＝2.1和10.3Hz,1H)；5.05(dq,J＝2.1和7.3Hz,1H)；5.70(m,1H)；6.87(d,J＝8.7Hz,2H)；7.17(d,J＝8.7Hz,2H)；7.30(m,2H)；7.41(t,J＝7.8Hz,2H)；7.70(d,J＝7.8Hz,2H)；7.75(d,J＝8.3Hz,1H)；7.90(d,J＝7.8Hz,2H).LCMS(A5)：ESm/z＝600[M+H]+；m/z＝617[M+H+NH3]+；m/z＝644[M-H+HCO2H]-；tR＝1.86min.
化合物AD3：(S)-2-氨基-4,4-二甲基戊酸(2R,3S)-1-((4-甲氧基苄基)氧基)-2-甲基己-5-烯-3-基酯
向化合物19(1.78g,2.98mmol)在DCM(63mL)中的溶液滴加哌啶(1.77mL,17.9mmol)。反应介质于室温搅拌4h，以DCM(150mL)稀释，以1N HCl(2 x 20mL)，饱和NaHCO3(20mL),饱和盐水(3 x 20mL)洗涤,经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在50g的硅胶(梯度洗脱庚烷/EtOAc)上纯化得到644mg的化合物AD3，为无色油状物(57％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.88(s,9H)；0.89(d,J＝7.1Hz,3H)；1.21(dd,J＝6.9和13.9Hz,1H)；1.56(dd,J＝5.0和13.9Hz,1H)；1.66(宽峰s,2H)；2.00(m,1H)；2.24(m,1H)；2.33(m,1H)；3.26(m,2H)；3.38(dd,J＝5.5和9.4Hz,1H)；3.74(s,3H)；4.36(s,2H)；4.84(m,1H)；5.00至5.10(m,2H)；5.72(m,1H)；6.89(d,J＝8.8Hz,2H)；7.22(d,J＝8.8Hz,2H).LCMS(A5)：ES m/z＝378[M+H]+；tR＝0.88min.
合成BC1：3-((R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙酰胺 基)-2,2-二甲基丙酸
Figure BDA0001649098600001681
化合物20：3-((R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙酰胺基)-2,2-二甲基丙酸甲基酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，引入片段C1(981.45mg,4.00mmol)和DCM(50mL)，接着引入DIEA(1.84mL,10.92mmol),片段B(1.2g,3.64mmol),HOBt(563.40mg,4.00mmol)和EDC(1.45mL,8.01mmol)。反应介质于室温搅拌过夜。此后，反应介质以H2O(30mL)稀释并且以DCM萃取两次。合并的有机相以饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到2.5g的粗制油状物，其通过快速色谱在110g的硅胶(梯度洗脱庚烷/AcOEt)上纯化得到1.06g的化合物20，为白色蛋白霜状物(meringue)(66％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：1.06(s,3H)；1.07(s,3H)；1.30(s,9H)；2.65(dd,J＝11.6和13.9Hz,1H)；2.82(dd,J＝4.0和13.9Hz,1H)；3.18(dd,J＝6.1和13.4Hz,1H)；3.29(部分遮蔽的m,1H)；3.60(s,3H)；3.81(s,3H)；4.11(m,1H)；6.90(d,J＝8.7Hz,1H)；7.04(d,J＝8.6Hz,1H)；7.19(dd,J＝2.3和8.6Hz,1H)；7.33(宽峰s,1H)；7.75(larget,J＝6.1Hz,1H).
化合物BC1：3-((R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙酰胺基)-2,2-二甲基丙酸
在氩气下，在圆底烧瓶中，引入化合物20(1.06g,2.39mmol)和THF(25mL)，接着引入LiOH(70.18mg,2.87mmol)和H2O(1mL)。反应介质搅拌数小时，然后添加70mg的LiOH并于室温搅拌过夜。此后，添加Amberlit树脂直到pH 4，过滤然后以THF洗涤并真空浓缩得到1g的化合物BC1，为白色固体(97％)。
合成BC2：3-((R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙酰胺 基)-2,2-二甲基丁酸
Figure BDA0001649098600001691
化合物21：3-((R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙酰胺基)-2,2-二甲基丁酸甲基酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，引入片段B(1.02g,2.78mmol)和DCM(25mL)，接着引入EDC(592mg,3.03mmol)和HOBt(478mg,3.03mmol)。反应介质搅拌15min，然后添加片段C2(0.5g,2.75mmol)和DIEA(1.7mL,9.73mmol)。反应介质于室温搅拌过夜。此后，反应介质经真空浓缩，然后以AcOEt稀释。有机层以饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到1.45g的粗制油状物，其通过硅胶色谱在100g的硅胶(梯度洗脱庚烷/AcOEt)上纯化得到845mg的化合物21，为白色泡沫(67％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：非对映异构体混合物50:50；0.87(d,J＝6.8Hz,1.5H)；0.97(d,J＝6.8Hz,1.5H)；1.01(s,1.5H)；1.03(s,1.5H)；1.07(s,3H)；1.31(s,9H)；2.58至2.87(m,2H)；3.59(s,1.5H)；3,60(s,1.5H)；3.81(s,3H)；3.99至4.20(m,2H)；6.90(d,J＝9.0Hz,0.5H)；6.97(d,J＝9.0Hz,0.5H)；7.05(宽峰d,J＝8.6Hz,1H)；7.19(分裂dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.32(d,J＝2.4Hz,0.5H)；7.34(d,J＝2.4Hz,0.5H)；7.54(d,J＝10.1Hz,0.5H)；7.62(d,J＝10.1Hz,0.5H).LCMS(A3)：非对映异构体混合物50:50；ES m/z＝457[M+H]+；m/z＝479[M+Na]+；tR＝3.19-3.2min.
化合物21立体异构体1和2：3-((R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙酰胺基)-2,2-二甲基丁酸甲基酯立体异构体1和2
在氩气下，在圆底烧瓶中，向片段B(1.17g,3.55mmol)在DCM(30mL)中的溶液添加EDC(741.75mg,3.87mmol),HOBt(592.57mg,3.87mmol)。于室温搅拌15min后，添加片段C2(639mg,3.52mmol)和DIEA(2.17mL,12.31mmol)。反应介质搅拌4h，然后浓缩并以AcOEt(100mL)稀释。有机层以H2O(2 x 10mL)和饱和盐水(2 x 10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。粗产物通过快速色谱在50g的硅胶(梯度洗脱庚烷/AcOEt)上纯化得到1.306g的非对映异构体的混合物(81％)，其通过两次连续快速色谱分离，第一次100g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上得到376mg的化合物21立体异构体1(23％)，第二次在70g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上得到181mg的化合物21立体异构体1(11％),279mg的化合物21立体异构体2(17％)和476mg的非对映异构体的混合物。
化合物21立体异构体1
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.85(d,J＝6.8Hz,3H)；1.07(s,6H)；1.31(s,9H)；2.57(m,1H)；2.80(dd,J＝5.2和13.8Hz,1H)；3.60(s,3H)；3.81(s,3H)；4.05(m,1H)；4.16(m,1H)；6.99(d,J＝8.7Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.0和8.6Hz,1H)；7.34(d,J＝2.0Hz,1H)；7.57(d,J＝10.1Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝381；m/z＝401；m/z＝455[M-H]-；m/z＝457[M+H]+；tR＝1.29min.
化合物21立体异构体2
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.95(d,J＝6.8Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.03(s,3H)；1.31(s,9H)；2.55(m,1H)；2.80(dd,J＝5.0和14.3Hz,1H)；3.59(s,3H)；3.81(s,3H)；4.09至4.22(m,2H)；6.92(d,J＝8.8Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.0和8.6Hz,1H)；7.34(d,J＝2.0Hz,1H)；7.64(d,J＝10.1Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝381；m/z＝401；m/z＝455[M-H]-；m/z＝457[M+H]+；tR＝1.29min.
化合物BC2：3-((R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙酰胺基)-2,2-二甲基丁酸
化合物21(0.845g,1.85mmol)和MeOH(20mL)引入在圆底烧瓶中，接着引入1.8mL的10M NaOH。溶液经搅拌并于50℃加热过夜。反应介质真空蒸发，然后以H2O(20mL)稀释并以5N HCl中和。溶液AcOEt萃取两次。合并的有机层以饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到800mg的化合物BC2，为白色泡沫状物(97％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：非对映异构体混合物50:50；0.91(d,J＝6.8Hz,1.5H)；0.97(d,J＝6.8Hz,1.5H)；1.00(s,3H)；1.03(s,1.5H)；1.07(s,1.5H)；1.31(s,9H)；2.57(m,1H)；2.83(m,1H)；3.81(s,3H)；4.01至4.16(m,2H)；6.90(d,J＝9.0Hz,0.5H)；6.95(d,J＝9.0Hz,0.5H)；7.03(d,J＝8.6Hz,1H)；7.20(宽峰,J＝8.6Hz,1H)；7.31(宽峰s,1H)；7.49(d,J＝10.1Hz,0.5H)；7.54(d,J＝10.1Hz,0.5H)；11.94(宽峰m,1H).LCMS(A1)：非对映异构体混合物50:50；ES m/z＝387；m/z＝443[M+H]+；tR＝1.20-1.21min.
化合物BC2立体异构体1：3-((R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙酰胺基)-2,2-二甲基丁酸立体异构体1
化合物21立体异构体1(0.325g,1.85mmol)和MeOH(8mL)引入在圆底烧瓶中，接着引入0.692mL的10M NaOH。黄色溶液于50℃搅拌并加热过夜。反应介质真空蒸发然后H2O(20mL)稀释并且以AcOEt(3 x 5mL)萃取。水层以5N HCl酸化并以AcOEt(3x30mL)萃取。合并的有机相以饱和盐水洗涤(5mL),经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到303mg的化合物BC2立体异构体1，为白色泡沫(96％)，其直接用于后续反应。
化合物BC2立体异构体2：3-((R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙酰胺基)-2,2-二甲基丁酸立体异构体2
化合物21立体异构体2(1.094g,2.39mmol),THF(5mL)和H2O(5mL)引入在圆底烧瓶中，接着引入LiOH(301mg,7.18mmol)。溶液于室温搅拌44h。反应不完全，添加LiOH(301mg)。混合物搅拌48h，然后添加在THF(10mL)和H2O(5mL)中的301mg的LiOH，并且反应介质于60℃搅拌40h。反应介质真空蒸发。添加1M柠檬酸直到pH 2，并且混合物以AcOEt萃取(2 x20mL)。合并的有机层以H2O洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到1.096g的化合物BC2立体异构体2，为白色无定形固体(定量)，其直接用于后续反应。
BC3的合成：乙基2-((R)-1-(2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯 基)-丙酰胺基)环丙基)-2-甲基丙酸
Figure BDA0001649098600001731
化合物22：2-((R)-1-(2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙酰胺基)环丙基)-2-甲基丙酸乙基酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，引入片段C3(1.2g,7.01mmol)和THF(16.5mL),接着引入片段B(2.54g,7.71mmol),HOBt(1.77g,8.76mmol),EDC(1.23g,8.06mmol)和DIEA(1.35mL,7.71mmol)。反应介质于室温搅拌2h。此后，反应介质以H2O(25mL)稀释并以AcOEt(250mL)萃取。有机层以H2O(2 x 25mL),饱和盐水(2 x 25mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并通过快速色谱纯化，第一次在200g的硅胶(梯度洗脱庚烷/AcOEt)上得到2.16g的化合物22，为无色泡沫(64％)，和343mg的含有期望化合物的混合物，其进一步在30g的硅胶(梯度洗脱庚烷/AcOEt)上纯化得到160mg的化合物22，为无色泡沫(4.7％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.62(m,1H)；0.74至0.99(m,3H)；1.03(s,3H)；1.10(s,3H)；1.24(t,J＝7.2Hz,3H)；1.42(s,9H)；2.90(m,2H)；3.88(s,3H)；4.08(m,1H)；4.10(q,J＝7.2Hz,2H)；4.96(m,1H)；6.33(宽峰s,1H)；6.85(d,J＝8.5Hz,1H)；7.03(dd,J＝2.4和8.5Hz,1H)；7.17(d,J＝2.4Hz,1H).
化合物BC3：2-((R)-1-(2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙酰胺基)环丙基)-2-甲基丙酸
化合物22(2.09g,4.33mmol),THF(10mL)和H2O(8mL)引入在圆底烧瓶中，接着引入LiOH(726.33mg,17.31mmol)。溶液经搅拌并于65℃加热。16h后，反应未完全，添加726.33mg的在10mL H2O中的LiOH。混合物于65℃搅拌48h。冷却后，反应介质以H2O(20mL)稀释，然后以AcOEt(3 x 40mL)萃取。有机层以H2O(2 x 10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到1.29g的混合物酯/酸。水层以5N HCl酸化直到pH 3，然后以AcOEt(3x50mL)萃取。有机层以H2O(2 x 10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到787mg的化合物BC3，为米色泡沫(40％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.50至0.90(m,4H)；1.03(s,6H)；1.30(s,9H)；2.60(dd,J＝10.5和14.1Hz,1H)；2.78(dd,J＝5.0和14.1Hz,1H)；3.81(s,3H)；3.97(m,1H)；6.80(d,J＝8.7Hz,1H)；7.03(d,J＝8.5Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.0和8.5Hz,1H)；7.31(d,J＝2.0Hz,1H)；7.86(s,1H)；12.11(宽峰m,1H).
合成BC4：(S)-3-((R)-2-丙烯酰胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙酰胺基)-2,2-二 甲基丁酸
Figure BDA0001649098600001741
化合物23：(S)-3-((R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙酰胺基)-2,2-二甲基丁酸甲基酯
向片段B(2g,6.06mmol)在DCM(60mL)中的溶液添加EDC(1.13mL,7.06mmol)和HOBt(948mg,6.67mmol)。反应介质于室温搅拌15min，然后添加(S)-3-氨基-2,2-二甲基丁酸甲基酯(881mg,6.06mmol)和DIEA(1.53mL,9.10mmol)。反应介质于室温搅拌4h,真空浓缩并以EtOAc(100mL)和H2O(20mL)稀释。水相以EtOAc(20mL)萃取；合并的有机相以饱和盐水洗涤(2 x 20mL),经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱纯化在150g的硅胶(梯度洗脱庚烷/EtOAc)上得到2.21g的化合物23，为无色漆状物(79％).
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.88(d,J＝7.0Hz,3H)；1.08(s,6H)；1.32(s,9H)；2.67(dd,J＝9.9和13.6Hz,1H)；2.82(dd,J＝5.2和13.6Hz,1H)；3.62(s,3H)；3.83(s,3H)；4.06(m,1H)；4.77(m,1H)6.97(d,J＝8.6Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.33(d,J＝2.4Hz,1H)；7.55(d,J＝9.8Hz,1H).
化合物24：(S)-3-((R)-2-氨基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙酰胺基)-2,2-二甲基丁酸甲基酯2,2,2-三氟乙酸盐
向化合物23(2.2g,4.81mmol)在DCM(25mL)中溶液添加TFA(3.6mL,48.1mmol)。反应介质于室温搅拌过夜，真空浓缩并在甲苯存在下共蒸发得到2.0g的化合物24，为非对映异构体混合物(88％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.80(d,J＝6.9Hz,3H)；1.04(s,3H)；1.10(s,3H)；2.95(d,J＝7.0Hz,2H)；3.62(s,3H)；3.84(s,3H)；4.00(m,1H)；4.15(m,1H)；7.10至7.30(m,3H)；8.00(d,J＝9,5Hz,1H)；8.22(宽峰s,3H).
化合物25：(S)-3-((R)-2-丙烯酰胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙酰胺基)-2,2-二甲基丁酸甲基酯
向化合物24(2.0g,4.25mmol)在DCM(20mL)中的溶液添加丙烯酰氯(536μL,6.37mmol)和DIEA(2.5mL,12.74mmol)。反应介质于室温搅拌2h，然后以H2O(20mL)稀释。有机相以DCM萃取(2 x 20mL)，合并的有机相以饱和盐水洗涤(2 x 20mL),经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在100g的硅胶(梯度洗脱庚烷/EtOAc)上纯化得到850mg的化合物25，为85:15非对映异构体混合物(68％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.85(d,J＝6.9Hz,3H)；1.03(s,3H)；1.04(s,3H)；2.72(dd,J＝9.7和13.9Hz,1H)；2.86(dd,J＝5.8和13.9Hz,1H)；3.58(s,3H)；3.80(s,3H)；4.15(m,1H)；4.56(m,1H)；5.56(dd,J＝2.3和10.2Hz,1H)；6.03(dd,J＝2.3和17.2Hz,1H)；6.28(dd,J＝10.2和17.2Hz,1H)；7.02(d,J＝8.5Hz,1H)；7.17(dd,J＝2.2和8.5Hz,1H)；7.31(d,J＝2.2Hz,1H)；7.72(d,J＝9.8Hz,1H)；8.36(d,J＝8.6Hz,1H).
化合物BC4：(S)-3-((R)-2-丙烯酰胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙酰胺基)-2,2-二甲基丁酸
向tBuOK(1.11g,9.86mmol)在THF(4mL)中的于0℃冷却的溶液添加H2O(47μL)和化合物25(450mg,1.10mmol)。反应介质于室温搅拌3h，然后以1N HCl(5mL)酸化。水相以DCM萃取(2x20mL)；合并的有机相以H2O(30mL)、饱和盐水(20mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。两个非对映异构体通过超临界液相色谱在Chiralpak AS 10μm柱(在85/15CO2/[MeOH+0.1％TEA]等度洗脱)上分离得到385mg的化合物BC4，为无定形固体(89％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.88(d,J＝6.9Hz,3H)；0.99(s,3H)；1.00(s,3H)；2.71(dd,J＝9.4和13.7Hz,1H)；2.88(dd,J＝5.3和13.7Hz,1H)；3.80(s,3H)；4.10(m,1H)；4.54(m,1H)；5.55(dd,J＝2.3和10.2Hz,1H)；6.01(dd,J＝2.3和17.1Hz,1H)；6.28(dd,J＝10.2和17.1Hz,1H)；7.02(d,J＝8.7Hz,1H)；7.17(dd,J＝2.4和8.7Hz,1H)；7.32(d,J＝2.4Hz,1H)；7.80(d,J＝9.8Hz,1H)；8.39(d,J＝8.8Hz,1H)；12.00(宽峰s,1H).LCMS(A5)：ESm/z＝395[M-H]-；m/z＝397[M+H]+；tR＝0.92min.
合成BC5：(S)-3-((R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙酰 胺基)-2,2-二甲基丁酸
Figure BDA0001649098600001761
化合物BC5从(3S)-3-氨基-2,2-二甲基丁酸甲基酯(MFCD09256689)开始并根据在方案32中描绘的构造块BC和对于化合物BC1和BC2描述的一般合成制备。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.89(d,J＝7.0Hz,3H)；1.02(s,3H)；1.04(s,3H)；1.30(s,9H)；2.68(dd,J＝13.6和10.2Hz,1H)；2.82(dd,J＝5.2和13.6Hz,1H)；3.80(s,3H)；4.05(m,1H)；4.12(m,1H)；7.00(d,J＝8.7Hz,1H)；7.05(d,J＝8.7Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.2和8.7Hz,1H)；7.32(d,J＝2.2Hz,1H)；7.52(d,J＝9.9Hz,1H)；12.35(宽峰s,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝441[M-H]-；m/z＝443[M+H]+；m/z＝883[2M-H]-；tR＝1.16min.
合成BC6：3-((R)-2-丙烯酰胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙酰胺基)-2-(羟基甲 基)-2-甲基丙酸
Figure BDA0001649098600001771
化合物26：3-((R)-2-((叔-丁氧基羰基)氨基)-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙酰胺基)-2-(羟基甲基)-2-甲基丙酸甲基酯
向片段C4(1.059g,5.77mmol)在THF(60mL)中的溶液添加DIEA(2.06mL,11.76mmol)、片段B(1.90g,5.77mmol)、HOBt(935mg,6.92mmol)和EDC(1.23mL,6.92mmol)。反应介质于室温搅拌48h，真空浓缩并通过快速色谱在200g的硅胶(等度洗脱庚烷/EtOAc)上纯化得到1.05g的化合物26，为无色油状物(39％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.98(s,3H)；1.30(s,9H)；2.63(m,1H)；2.83(m,1H)；3.18至3.48(m,4H)；3.60(s,3H)；3.80(s,3H)；4.10(m,1H)；4.81(m,1H)；6.98(d,J＝8.9Hz,1H)；7.04(d,J＝8.7Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.1和8.7Hz,1H)；7.35(d,J＝2.1Hz,1H)；7.83(m,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝457[M-H]-；m/z＝459[M+H]+；m/z＝503[M-H+HCO2H]-；tR＝1.1min.
化合物27：3-((R)-2-氨基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙酰胺基)-2-(羟基甲基)-2-甲基丙酸甲基酯盐酸盐
化合物26(1.05g,2.29mmol)以在二噁烷(16mL,64mmol)中的HCl 4M于室温处理1h。反应介质经真空浓缩并在甲苯的存在下共蒸发两次。粗产物与iPr2O(10mL)一起研磨，过滤并以iPr2O(5mL)洗涤两次。然后将滤饼溶解在DCM中，过滤并真空浓缩得到809mg的化合物27，为白色泡沫(90％)，其不经纯化而使用。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.92(s,1.5H)；0.97(s,1.5H)；2.88(m,1H)；3.00(m,1H)；3.19至3.47(m,4H)；3.60(s,3H)；3.85(s,3H)；4.05(m,1H)；4.89(m,1H)；7.11(split d,J＝8.6Hz,1H)；7.19(split dd,J＝2.0和8.6Hz,1H)；7.38(split d,J＝2.0Hz,1H)；8.15(宽峰s,3H)；8.39(m,1H).
化合物28：3-((R)-2-氨基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙酰胺基)-2-甲基-2-(((三乙基甲硅烷基)氧基)甲基)丙酸甲基酯
向化合物27(809mg,2.05mmol)在DCM(4mL)(以冰浴冷却)中的溶液添加TEA(1.43mL,10.23mmol)和氯三乙基硅烷(1.37mL,8.19mmol)同时保持温度低于4℃。于4℃继续搅拌10min，然后反应介质于室温搅拌20h。将饱和盐水(20mL)和DCM添加至介质，其搅拌10min。有机相以饱和盐水(3 x 10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在70g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到706mg的化合物28，为淡黄色油状物(73％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.52(q,J＝8.0Hz,6H)；0.89(t,J＝8.0Hz,9H)；0.98(s,3H)；1.70(宽峰s,2H)；2.54(m,1H)；2.82(m,1H)；3.18至3.45(m,3H)；3.58(m,2H)；3.60(s,3H)；3.80(s,3H)；7.03(d,J＝8.7Hz,1H)；7.14(dd,J＝2.3和8.7Hz,1H)；7.28(split d,J＝2.3Hz,1H)；7.78(m,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝471[M-H]-；m/z＝473[M+H]+；m/z＝517[M-H+HCO2H]-；tR＝0.97min.
化合物29：3-((R)-2-丙烯酰胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙酰胺基)-2-甲基-2-(((三乙基甲硅烷基)氧基)甲基)丙酸甲基酯
向化合物28(704mg,1.49mmol)在DCM(19mL)(以冰/丙酮浴冷却)中的溶液添加DIEA(780μL,4.46mmol)并滴加丙烯酰氯(181μL,2.23mmol)。反应介质于0-5℃搅拌1h，然后添加EtOAc(38mL)并且介质以1N HCl(5mL)、饱和NaHCO3(5mL)、饱和盐水(3 x 15mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在30g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到742mg的化合物29，为无色油状物(94％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.52(split q,J＝8.0Hz,6H)；0.89(splitt,J＝8.0Hz,9H)；0.99(s,1.5H)；1.01(s,1.5H)；2.69(m,1H)；2.87(m,1H)；3.20(m,1H)；3.28(m,1H)；3.50(dd,J＝3.1和9.9Hz,1H)；3.58(s,3H)；3.68(d,J＝9.9Hz,1H)；3.80(s,3H)；4.59(m,1H)；5.55(d,J＝10.3Hz,1H)；6.00(d,J＝17.3Hz,1H)；6.25(split dd,J＝10.3和17.3Hz,1H)；7.02(d,J＝8.5Hz,1H)；7.18(split dd,J＝2.0和8.5Hz,1H)；7.31(split d,J＝2.0Hz,1H)；7.96(m,1H)；8.39(d,J＝8.9Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝525[M-H]-；m/z＝527[M+H]+；m/z＝571[M-H+HCO2H]-；tR＝1.54min.
化合物BC6：3-((R)-2-丙烯酰胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙酰胺基)-2-(羟基甲基)-2-甲基丙酸
向tBuOK(1.42g,12.65mmol)在THF(7mL)(以冰/丙酮浴冷却)的悬浮液中添加H2O(50μL)，搅拌介质10min，然后添加化合物29(741mg,1.41mmol)在THF(7mL)中的溶液。于0℃持续搅拌10min然后在室温搅拌1h。反应介质以冰浴冷却，然后添加1N HCl(16.9mL)。搅拌15min后，反应介质以DCM萃取(3 x 25mL)。合并的有机相以饱和盐水(2 x 15mL)、H2O(15mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩得到656mg的化合物BC6，为黄色泡沫(定量)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.91(s,3H)；2.69(m,1H)；2.90(dd,J＝4.8和13.6Hz,1H)；3.18至3.42(m,4H)；3.80(s,3H)；4.59(m,1H)；4.73(宽峰,1H)；5.55(d,J＝2.3和10.3Hz,1H)；6.00(dd,J＝2.3和17.2Hz,1H)；6.24(dd,J＝10.3和17.2Hz,1H)；7.03(d,J＝8.7Hz,1H)；7.19(dd,J＝2.0和8.7Hz,1H)；7.35(d,J＝2.0Hz,1H)；8.00(m,1H)；8.39(d,J＝8.8Hz,1H)；12.30(宽峰s,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝397[M-H]-；m/z＝399[M+H]+；tR＝0.77min.
合成实施例1至3：氮杂-C52的苄胺、戊二酰基-Val-Ala-氮杂-C52苄胺的NHS酯和 对应的ADC
Figure BDA0001649098600001801
化合物30：(6R,13S)-(1E,3R,4S,6E)-1-(4-(叠氮基甲基)苯基)-8-(叔-丁氧基)-3-甲基-8-氧代辛-1,6-二烯-4-基6-(3-氯-4-甲氧基苄基)-13-异丁基-2,2,10,10-四甲基-4,7,11-三氧代-3-氧杂-5,8,12-三氮杂十四烷-14-酸酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，引入在DMF(25mL)中的化合物BC1(899.55mg,2.10mmol)、HATU(861mg,2.20mmol)和HOAt(302mg,2.20mmol)。混合物于室温搅拌30分钟。此后，添加化合物AD1(940mg,2mmol)和DIEA(1.05mL,5.99mmol)。反应介质于室温搅拌4h。此后，反应介质以H2O(50mL)稀释并以AcOEt(2 x 40mL)萃取。有机层以饱和盐水洗涤(25mL),经MgSO4干燥，过滤，浓缩并通过快速色谱在80g的硅胶(梯度洗脱庚烷/AcOEt)上纯化得到1.011g的化合物30，为黄色半固体(57％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.76(d,J＝6.7Hz,3H)；0.78(d,J＝6.7Hz,3H)；1.03(d,J＝7.0Hz,3H)；1.07(s,6H)；1.39(s,9H)；1.37至1.63(m,3H)；1.41(s,9H)；2.36至2.60(部分遮蔽的m,3H)；2.64(dd,J＝9.5和14.1Hz,1H)；2.86(dd,J＝5.6和14.1Hz,1H)；3.18(dd,J＝6.1和13.5Hz,1H)；3.25(dd,J＝6.9和13.5Hz,1H)；3.79(s,3H)；4.09(m,1H)；4.26(m,1H)；4.40(s,2H)；4.92(m,1H)；5.81(d,J＝15.9Hz,1H)；6.17(dd,J＝8.4和16.1Hz,1H)；6.44(d,J＝15.9Hz,1H)；6.70(m,1H)；6.94(d,J＝8.9Hz,1H)；7.02(d,J＝8.7Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.3和8.9Hz,1H)；7.31(m,3H)；7.42(d,J＝8.5Hz,2H)；7.59(t,J＝6.3Hz,1H)；7.77(d,J＝7.9Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝879[M-H]-；m/z＝881[M+H]+；m/z＝925[M-H+HCO2H]-；tR＝1.89min.
化合物31：(3S,10R,16S,E)-16-((R,E)-4-(4-(叠氮基甲基)苯基)丁-3-烯-2-基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
化合物31分两步制备。
步骤1：在圆底烧瓶中，引入在DCM(10mL)中的化合物30(1.011g,1.15mmol)。冷却至0℃后，添加TFA(1.72mL,22.94mmol)和100μL的H2O。反应介质于室温搅拌72h。完成后，将甲苯添加至介质并且其经真空浓缩得到900mg的氨基/酸中间体(定量)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.76(d,J＝6.7Hz,3H)；0.78(d,J＝6.7Hz,3H)；1.03(d,J＝7.0Hz,3H)；1.07(s,3H)；1.08(s,3H)；1.38至1.62(m,3H)；2.35至2.58(部分遮蔽的m,3H)；2.79(dd,J＝11.0和13.8Hz,1H)；3.00(dd,J＝4.1和13.8Hz,1H)；3.16(dd,J＝5.9和13.5Hz,1H)；3.28至3.39(遮蔽的m,1H)；3.81(s,3H)；4.03(m,1H)；4.26(m,1H)；4.40(s,2H)；4.92(m,1H)；5.82(d,J＝16.1Hz,1H)；6.16(dd,J＝8.8和16.4Hz,1H)；6.42(d,J＝16.4Hz,1H)；6.73(m,1H)；7.09(d,J＝8.6Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.0和8.6Hz,1H)；7.32(d,J＝8.6Hz,2H)；7.37(d,J＝2.0Hz,1H)；7.41(d,J＝8.6Hz,2H)；7.84(d,J＝7.9Hz,1H)；8.01(大宽峰,3H)；8.10(t,J＝6.4Hz,1H)；12.2(宽峰s,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝723[M-H]-；m/z＝725[M+H]+；tR＝1.09min.
步骤2：在圆底烧瓶中，向氨基/酸中间体(840mg,1.16mmol)在200mL的CH3CN中的溶液添加DIEA(1.95mL,11.58mmol)、HOAt(159.23mg,1.16mmol)和HATU(499.40mg,1.27mmol)。反应介质于室温搅拌3h。真空浓缩后，粗产物以AcOEt(200mL)稀释，以0.5M柠檬酸(12mL)和1N HCl(6mL)中和。有机层经分离，以饱和NaHSO3、饱和NaHCO3、饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并通过快速色谱在40g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到558mg的化合物31，为白色固体(68％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.60(d,J＝6.7Hz,3H)；0.61(d,J＝6.7Hz,3H)；0.97(s,3H)；1.07(s,3H)；1.09(d,J＝7.0Hz,3H)；1.15(m,1H)；1.33至1.48(m,2H)；2.24(m,1H)；2.53至2.70(m,2H)；2.88(大d,J＝13.6Hz,1H)；3.01(dd,J＝3.5和14.5Hz,1H)；3.23至3.32(掩蔽的m,1H)；3.80(s,3H)；4.18(m,1H)；4.35(m,1H)；4.40(s,2H)；4.95(m,1H)；5.86(dd,J＝1.7和15.8Hz,1H)；6.13(dd,J＝8.8和16.1Hz,1H)；6.40(m,1H)；6.47(d,J＝16.1Hz,1H)；7.04(d,J＝8.6Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.0和8.6Hz,1H)；7.29(d,J＝2.0Hz,1H)；7.32(d,J＝8.6Hz,2H)；7.41(宽峰d,J＝8.6Hz,3H)；7.89(d,J＝8.9Hz,1H)；8.1(d,J＝8.2Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝705[M-H]-；m/z＝707[M+H]+；tR＝1.58min.
化合物32：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)氧杂环丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
在圆底烧瓶中，向化合物31(410mg,0.579mmol)在DCM(50mL)中的溶液于0℃添加m-CPBA(259mg,1.16mmol)。于室温搅拌16h，在24h两次添加m-CPBA(130mg)。一旦反应完成，粗混合物与饱和NaHCO3(15mL)和饱和Na2S2O3(15mL)一起搅拌1h，然后以DCM萃取(3 x15mL)。有机层以饱和盐水洗涤(15mL)，经MgSO4干燥，过滤并浓缩得到440mg的α-和β-环氧化物的混合物，为黄色半固体。α-和β-环氧化物通过手性液体色谱分离，其在76x350mm柱(装有1.1kg的10μm Chiralpak AD(直链淀粉三-3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯，涂覆在硅胶支承体上，Chiral Technologies Europe))上使用80:20庚烷/EtOH的等度洗脱进行。浓缩后，得到185mg的化合物32，为白色固体(44％)，和得到118mg的α-环氧化物，为白色固体(28％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.72(d,J＝6.7Hz,3H)；0.74(d,J＝6.7Hz,3H)；0.96(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.08(s,3H)；1.11(m,1H)；1.40至1.55(m,2H)；1.79(m,1H)；2.26(m,1H)；2.64(m,2H)；2.85(宽峰d,J＝13.2Hz,1H)；3.00(m,2H)；3.25(dd,J＝10.2和13.2Hz,1H)；3.80(s,3H)；3.90(d,J＝2.0Hz,1H)；4.17(m,1H)；4.35(m,1H)；4.46(s,2H)；5.12(m,1H)；5.80(dd,J＝1.7和16.0Hz,1H)；6.39(ddd,J＝3.8,11.6和16.0Hz,1H)；7.04(d,J＝8.6Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.0和8.6Hz,1H)；7.29(d,J＝2.0Hz,1H)；7.31至7.40(m,5H)；7.94(d,J＝9.1Hz,1H)；8.40(d,J＝8.1Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝723[M+H]+；tR＝1.48min.
实施例1：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(氨基甲基)苯基)氧杂环 丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-1-氧杂-4,8,11-三氮 杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
在圆底烧瓶中，向化合物32(185mg,255.79μmol)在DCM(6mL),MeOH(6mL)和H2O(0.8mL)中的溶液添加TCEP(81,47mg,281,37μmol)。溶液于室温搅拌16h。一旦反应完成，粗混合物以饱和NaHCO3(15mL)稀释并以DCM萃取(2 x 30mL)。有机层以饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并通过两个连续快速色谱在15g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到90mg的实施例1，为白色固体(51％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.72(d,J＝6.6Hz,3H)；0.75(d,J＝6.6Hz,3H)；0.97(s,3H)；1.03(d,J＝7.1Hz,3H)；1.07(s,3H)；1.14(m,1H)；1.42至1.57(m,2H)；1.77(m,1H)；1.92(宽峰m,2H)；2.26(m,1H)；2.64(m,2H)；2.86(宽峰d,J＝13.0Hz,1H)；2.94(dd,J＝2.0和8.0Hz,1H)；3.00(dd,J＝3.6和14.4Hz,1H)；3.27(dd,J＝10.2和13.0Hz,1H)；3.70(s,2H)；3.80(s,3H)；3.84(d,J＝2.0Hz,1H)；4.18(m,1H)；4.34(m,1H)；5.11(m,1H)；5.79(dd,J＝1.7和15.6Hz,1H)；6.38(ddd,J＝4.1,11.6和15.6Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.0和8.6Hz,1H)；7.22(d,J＝8.5Hz,2H)；7.28(d,J＝2.0Hz,1H)；7.31(d,J＝8.5Hz,2H)；7.35(d,J＝10.2Hz,1H)；7.91(d,J＝9.0Hz,1H)；8.38(d,J＝8.0Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝695[M-H]-；m/z＝697[M+H]+；tR＝0.83min.
化合物33：(S)-2-氨基-N-((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-3-甲基丁酰胺
在氩气下，在圆底烧瓶中，向实施例1(90mg,129.01μmol)在DCM(20mL)中的溶液添加(S)-2-((S)-2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰胺基)丙酸或FmocValAla(CAS号[150114-97-9],79.47mg,193.61μmol)、EDC(34.27μL,193.61μmol)和HOBt(20.93mg,154.9μmol)。反应介质于室温搅拌过夜。此后，哌啶(129μL,1.29mmol)添加并搅拌2h。除去溶剂并且粗剩余物通过快速色谱在15g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到50mg的化合物33(45％)，为白色固体。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.75(m,9H)；0.88(d,J＝7.1Hz,3H)；0.96(s,3H)；1.03(d,J＝7.1Hz,3H)；1.08(s,3H)；1.18(m,1H)；1.23(d,J＝7.0Hz,3H)；1.42至1.57(m,2H)；1.70(宽峰m,2H)；1.79(m,1H)；1.92(m,1H)；2.26(m,1H)；2.63(m,2H)；2.86(宽峰d,J＝13.0Hz,1H)；2.99(m,3H)；3.22至3.33(部分遮蔽的m,1H)；3.80(s,3H)；3.86(d,J＝2.0Hz,1H)；4.18(m,1H)；4.28(d,J＝6.3Hz,2H)；4.33(m,2H)；5.11(m,1H)；5.79(dd,J＝1.7和15.6Hz,1H)；6.39(ddd,J＝4.1,11.6和15.6Hz,1H)；7.03(d,J＝8.6Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.0和8.6Hz,1H)；7.24(s,4H)；7.28(d,J＝2.0Hz,1H)；7.37(d,J＝10.2Hz,1H)；7.92(d,J＝9.1Hz,1H)；8.07(宽峰d,J＝8.3Hz,1H)；8.38(d,J＝8.1Hz,1H)；8.42(t,J＝6.3Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝434[M+2H]2+；m/z＝865[M-H]-；m/z＝867[M+H]+；m/z＝911[M-H+HCO2H]-；tR＝0.88min.
化合物34：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-5-氧代戊酸
在氩气下，在圆底烧瓶中，向化合物33(54mg,57.64μmol)在DMF(5mL)中的溶液添加戊二酸酐(8mg,69.17μmol)。反应介质于室温搅拌3.5h。此后，除去溶剂并且粗剩余物通过快速色谱在1.8g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到51mg的化合物34，为白色固体(90％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.73(d,J＝6.7Hz,3H)；0.76(d,J＝6.7Hz,3H)；0.81(d,J＝7.0Hz,3H)；0.84(d,J＝7.0Hz,3H)；0.97(s,3H)；1.03(d,J＝7.2Hz,3H)；1.05(s,3H)；1.15(m,1H)；1.22(d,J＝7.2Hz,3H)；1.43至1.52(m,2H)；1.70(m,2H)；1.77(m,1H)；1.97(m,1H)；2.17(m,2H)；2.24(m,1H)；2.55至2.68(m,2H)；2.85(宽峰d,J＝12.7Hz,1H)；2.96(dd,J＝1.8和7.7Hz,1H)；2.99(dd,J＝3.0和14.6Hz,1H)；3.23至3.40(部分遮蔽的m,1H)；3.80(s,3H)；3.85(d,J＝1.8Hz,1H)；4.22至4.38(m,4H)；5.11(m,1H)；5.79(d,J＝14.9Hz,1H)；6.37(ddd,J＝4.1,11.3和14.9Hz,1H)；7.04(d,J＝8.7Hz,1H)；7.15(dd,J＝2.0et 8.7Hz,1H)；7.23(宽峰s,4H)；7.28(d,J＝2.0Hz,1H)；7.37(宽峰d,J＝10.7Hz,1H)；7.87(d,J＝8.7Hz,1H)；7.93(d,J＝9.2Hz,1H)；8.06(m大,1H)；8.37(宽峰m,1H)；8.41(宽峰m,1H)；12.03(宽峰m,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝979[M-H]-；m/z＝981[M+H]+；tR＝1.17min.
实施例2：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10- (3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂 环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲 基-1-氧代丁-2-基)氨基)-5-氧代戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，向化合物34(30mg,30.56μmol)在THF(5mL)中的溶液添加DIEA(5.34μL,30.56μmol)和DSC(16.31mg,61.13μmol)。反应介质于室温搅拌2h。此后，除去溶剂并且粗剩余物通过快速色谱在1.3g的硅胶(梯度洗脱DCM/iPrOH)上纯化得到9mg的实施例2，为白色固体。含有期望化合物和杂质的第二批次以MeTHF稀释，以H2O、饱和盐水洗涤两次，经MgSO4干燥，过滤并浓缩得到15mg的实施例2，为白色固体(整体收率为73％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.73(d,J＝6.7Hz,3H)；0.77(d,J＝6.7Hz,3H)；0.82(d,J＝7.0Hz,3H)；0.84(d,J＝7.0Hz,3H)；0.96(s,3H)；1.03(d,J＝7.2Hz,3H)；1.07(s,3H)；1.15(m,1H)；1.23(d,J＝7.2Hz,3H)；1.43至1.56(m,2H)；1.78(m,1H)；1.81(m,1H)；1.97(m,1H)；2.20至2.33(m,3H)；2.58至2.69(m,4H)；2.80(s,4H)；2.85(宽峰d,J＝12.7Hz,1H)；2.98(dd,J＝2.1和7.9Hz,1H)；3.00(dd,J＝3.2和14.7Hz,1H)；3.22至3.34(部分遮蔽的m,1H)；3.80(s,3H)；3.85(d,J＝2.1Hz,1H)；4.15(m,2H)；4.22至4.38(m,4H)；5.11(m,1H)；5.79(d,J＝15.1Hz,1H)；6.38(ddd,J＝3.9,11.2和15.1Hz,1H)；7.04(d,J＝8.7Hz,1H)；7.15(dd,J＝2.2和8.7Hz,1H)；7.22(宽峰s,4H)；7.29(d,J＝2.2Hz,1H)；7.36(宽峰d,J＝10.3Hz,1H)；7.89(d,J＝8.7Hz,1H)；7.92(d,J＝8.9Hz,1H)；8.04(d,J＝7.4Hz,1H)；8.32(t,J＝6.1Hz,1H)；8.39(d,J＝8.0Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝540；m/z＝1076[M-H]-；m/z＝1078[M+H]+；m/z＝1122[M-H+HCO2H]-；tR＝1.23min.
实施例3：mAb-Ex2
先前描述的一般方法用来制备实施例3。60mg的hu2H11_R35-74与161μL的实施例2在DMA(1.733mg,4eq.)中的9.96mM溶液反应2h。此时，添加121μL的实施例2(3当量)的溶液并且介质搅拌2h。此时，添加121μL的实施例2(3当量)的溶液并搅拌2h。在Superde x 200pg上在DPBS pH 6.5+20％NMP中纯化后,在Amicon Ultra-15中浓缩，在PD-10上在缓冲液BpH6.5+5％NMP中缓冲液交换并在Steriflip过滤，得到39.9mg的实施例3，为无色澄清溶液，浓度为2.28mg/mL，DAR为4.6(HRMS)，单体纯度为99％且整体收率为66％。
SEC-HRMS：图1中完整ADC的光谱；m/z＝150346(D1)；m/z＝151307(D2)；m/z＝152274(D3)；m/z＝153240(D4)；m/z＝154200(D5)；m/z＝155165(D6)；m/z＝156133(D7)；m/z＝157095(D8)。
合成实施例4至7：(S)-3-新戊基-氮杂-C52的苄胺,戊二酰基-Val-Ala-(S)-3-新 戊基-氮杂-C52苄胺的NHS酯和对应的ADC
Figure BDA0001649098600001871
Figure BDA0001649098600001881
化合物35：6-(3-氯-4-甲氧基苄基)-2,2,10,10-四甲基-13-新戊基-4,7,11-三氧代-3-氧杂-5,8,12-三氮杂十四烷-14-酸(6R,13S)-(1E,3R,4S,6E)-8-(叔-丁氧基)-1-(4-(羟基甲基)苯基)-3-甲基-8-氧代辛-1,6-二烯-4-基酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，向片段BC1(1.32g,3.08mmol)在DCM(60mL)中的溶液添加DIEA(1.53mL,9.25mmol)、HOAt(503.75mg,3.70mmol)和HATU(1.41g,3.70mmol)。黄色悬浮液于室温搅拌30min，然后添加片段AD2(1.7g,3.08mmol)。反应介质于室温搅拌2h。此后，添加1.53mL的DIEA并搅拌1h。混合物以1M柠檬酸(50mL)中和并以AcOEt(2 x 80mL)萃取。有机层以1M NaHSO4、H2O洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并通过快速色谱在100g的硅胶(梯度洗脱庚烷/AcOEt)上纯化得到1.475g的化合物35，为无色固体(57％)。
化合物36：(2E,5S,6R,7E)-5-(((S)-2-(3-((R)-2-氨基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙酰胺基)-2,2-二甲基丙酰胺基)-4,4-二甲基戊酰基)氧基)-8-(4-(羟基甲基)-苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸
在圆底烧瓶中，向化合物35(1.475g,1.69mmol)在DCM(20mL)中的溶液添加TFA(8mL,52.27mmol)和H2O(2mL)。反应介质于室温搅拌5h。除去溶剂。剩余物以H2O(20mL)和AcOEt(20mL)稀释并以2M NaOH(2mL)于室温处理2h。有机层经分离且水层以AcOEt(2 x10mL)萃取，经MgSO4干燥，过滤并浓缩得到1.24g的无色固体。固体溶解于AcOEt(10mL)和H2O(10mL)中并以2M NaOH(400μL)于室温处理2h。有机层经分离，水层以AcOEt(2 x 10mL)萃取，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并通过快速色谱在100g的硅胶(梯度洗脱庚烷/AcOEt)上纯化得到990mg的化合物36，为白色固体(82％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.80(s,9H)；0.99(s,3H)；1.02(d,J＝7.0Hz,3H)；1.05(s,3H)；1.52(dd,J＝2.0和14.8Hz,1H)；1.69(dd,J＝9.9和14.8Hz,1H)；2.36至2.61(部分遮蔽的m,4H)；2.84(dd,J＝5.0和13.9Hz,1H)；3.18(d,J＝7.5Hz,2H)；3.40(dd,J＝5.1和8.1Hz,1H)；3.80(s,3H)；4.29(m,1H)；4.45(s,2H)；4.90(m,1H)；5.12(宽峰m,1H)；5.81(d,J＝15.5Hz,1H)；6.10(dd,J＝8.4和15.9Hz,1H)；6.40(d,J＝15.9Hz,1H)；6.70(td,J＝7.5和15.5Hz,1H)；7.01(d,J＝8.7Hz,1H)；7.11(dd,J＝2.4和8.7Hz,1H)；7.25(m,3H)；7.32(d,J＝8.2Hz,2H)；7.72(t,J＝6.5Hz,1H)；7.79(d,J＝7.8Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝712[M-H]-；m/z＝714[M+H]+；tR＝0.94min.
化合物37：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((R,E)-4-(4-(羟基甲基)-苯基)丁-3-烯-2-基)-6,6-二甲基-3-新戊基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
在氩气下，在圆底烧瓶中，引入化合物36(990mg,1.39mmol)和CH3CN(150mL)，以水浴在50℃加热直到完全溶解并搅拌10min。此后，添加DIEA(687.20μL,4.16mmol),HOAt(207.51mg,1.52mmol)和HATU(579.7mg,1.52mmol)并于室温搅拌30min。反应介质以1M柠檬酸(30mL)中和。除去溶剂且水层以AcOEt(2x40mL)萃取。有机层以1M NaHSO4、H2O洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩。粗的固体以H2O(200mL)稀释并搅拌1h。固体经过滤，然后以AcOEt稀释，经MgSO4干燥，过滤并浓缩得到化合物37和HATU的混合物。固体以MeTHF(50mL)和H2O(50mL)搅拌。有机层经分离，以H2O(4 x 20mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并通过快速色谱在10g的硅胶(梯度洗脱庚烷/AcOEt)上纯化得到680mg的化合物37，为无色固体(70％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.68(s,9H)；0.98(s,3H)；1.03(s,3H)；1.09(d,J＝6.9Hz,3H)；1.19(宽峰d,J＝14.5Hz,1H)；1.58(dd,J＝10.3和14.5Hz,1H)；2.23(m,1H)；2.52至2.70(m,3H)；2.86(宽峰d,J＝12.7Hz,1H)；3.00(dd,J＝3.3和14.8Hz,1H)；3.22至3.33(部分遮蔽的m,1H)；3.80(s,3H)；4.18(m,1H)；4.42(m,1H)；4.46(d,J＝6.0Hz,2H)；4.91(m,1H)；5.13(t,J＝6.0Hz,1H)；5.85(宽峰d,J＝15.0Hz,1H)；6.05(dd,J＝8.4和15.9Hz,1H)；6.40(m,2H)；7.03(d,J＝8.7Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.2和8.7Hz,1H)；7.25(d,J＝8.5Hz,2H)；7.29(d,J＝2.2Hz,1H),7.31(d,J＝8.5Hz,2H)；7.42(d,J＝10.6Hz,1H)；7.94(d,J＝9.1Hz,1H)；8.41(d,J＝8.2Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝694[M-H]-；m/z＝696[M+H]+；tR＝1.36min.
化合物38：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6-二甲基-3-新戊基-16-((R,E)-4-(4-(((三异丙基甲硅烷基)氧基)甲基)苯基)丁-3-烯-2-基)-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
在氩气下，于0℃在圆底烧瓶中，向化合物37(680mg,0.976mmol)在CHCl3(10mL)中的溶液添加1H-咪唑(305.84mg,4.49mmol)和氯三异丙基硅烷(480.13μl,2.25mmol)。反应介质于室温搅拌5h，然后以饱和NH4Cl和MTBE(30mL)稀释。有机层以1M NaHSO4、饱和NaHCO3、饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩得到970mg的化合物38，为橙色无定型固体(定量)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.63(s,9H)；0.87à1.17(m,31H)；1.53(dd,J＝10.9和14.3Hz,1H)；2.22(m,1H)；2.51至2.70(m,3H)；2.86(宽峰d,J＝13.0Hz,1H)；3.00(dd,J＝3.2和14.9Hz,1H)；3.24至3.35(部分遮蔽的m,1H)；3.80(s,3H)；4.18(m,1H)；4.41(m,1H)；4.76(s,2H)；4.91(m,1H)；5.87(宽峰d,J＝15.4Hz,1H)；6.06(dd,J＝8.9和15.9Hz,1H)；6.40(m,2H)；7.03(d,J＝8.5Hz,1H)；7.18(宽峰d,J＝8.5Hz,1H)；7.25(d,J＝8.3Hz,2H)；7.28(d,J＝8.3Hz,2H)；7.30(宽峰s,1H)；7.42(d,J＝10.5Hz,1H)；7.93(d,J＝9.2Hz,1H)；8.42(d,J＝8.1Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝850[M-H]-；m/z＝852[M+H]+；m/z＝896[M-H+HCO2H]-；tR＝2.15min.
实施例4：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((S)-1-((2R,3R)-3- (4-(羟基-甲基)苯基)氧杂环丙烷-2-基)乙基)-6,6-二甲基-3-新戊基-1-氧杂-4,8,11-三 氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
实施例4以2步制备。
步骤1：在氩气下，在圆底烧瓶中，向化合物38(832mg,0.976mmol)在DCM(10mL)中的溶液分三次添加m-CPBA(339.15mg,1.51mmol)。反应混合物于室温搅拌50h，然后以DCM(10mL)稀释并与饱和NaHCO3(30mL)和Na2S2O3(30mL)搅拌15min。有机层经分离以饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩得到1.1g的α-和β-环氧化物的混合物，为无色泡沫(定量)。
步骤2：α-和β-环氧化物的混合物在THF(30mL)中稀释并添加1M TBAF(952.32μL)。搅拌2h后，添加952μL的TBAF。搅拌1h后，混合物以H2O(50mL)稀释并以AcOEt(3 x 50mL)萃取。有机层以饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩得到770mg的α-和β-环氧化物的混合物，为黄色固体(定量)。α-和β-环氧化物通过手性液体色谱分离，其在76 x 350mm柱(装有1.1kg的10μm Chiralpak AD(直链淀粉三-3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯，涂覆在硅胶支承体上，Chiral Technologies Europe)上使用75:25庚烷/EtOH的等度洗脱。浓缩后，得到190mg的实施例4，为白色固体(31％)和得到125mg的α-环氧化物，为白色固体(20％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.81(s,9H)；0.98(s,3H)；1.03(d,J＝7.0Hz,3H)；1.05(s,3H)；1.26(m,1H)；1.71(dd,J＝10.4和14.5Hz,1H)；1.82(m,1H)；2.26(m,1H)；2.52(m,2H)；2.84(d,J＝12.8Hz,1H)；2.92(dd,J＝2.1和7.8Hz,1H)；3.00(dd,J＝3.1和14.5Hz,1H)；3.24至3.36(部分遮蔽的m,1H)；3.81(s,3H)；3.90(d,J＝2.1Hz,1H)；4.17(ddd,J＝3.4,8.0和11.7Hz,1H)；4.42(m,1H)；4.50(d,J＝6.0Hz,2H)；5.10(m,1H)；5.20(t,J＝6.0Hz,1H)；5.79(dd,J＝1.8和15.4Hz,1H)；6.39(ddd,J＝3.8,11.5和15.4Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.1和8.6Hz,1H)；7.26(d,J＝8.3Hz,2H)；7.29(d,J＝2.1Hz,1H)；7.32(d,J＝8.3Hz,2H)；7.41(d,J＝10.3Hz,1H)；8.02(d,J＝9.2Hz,1H)；8.38(d,J＝8.2Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝710[M-H]-；m/z＝712[M+H]+；tR＝1.28min.
化合物39：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)氧杂环丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6-二甲基-3-新戊基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
在氩气下，在圆底烧瓶中，向实施例4(100mg,140μmol)在THF(5mL)中的溶液添加DPPA(156.82μl,701.98μmol)和DBU(110.22μl,701.98μmol)。溶液于室温搅拌6h，然后以H2O稀释并且以AcOEt(3 x 30mL)萃取。有机层经分离以饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并且在15g的硅胶(梯度洗脱DCM/iPrOH)上纯化得到100mg的化合物39，为白色固体(40％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.80(s,9H)；0.97(s,3H)；1.03(d,J＝7.0Hz,3H)；1.04(s,3H)；1.28(d,J＝14.5Hz,1H)；1.69(dd,J＝10.7和14.5Hz,1H)；1.84(m,1H)；2.28(m,1H)；2.62(m,2H)；2.84(d,J＝12.8Hz,1H)；2.93至3.03(m,2H)；3.22至3.34(部分遮蔽的m,1H)；3.80(s,3H)；3.92(宽峰s,1H)；4.17(m,1H)；4.40至4.49(m,3H)；5.10(m,1H)；5.80(d,J＝15.8Hz,1H)；6.39(ddd,J＝3.8,11.7和15.8Hz,1H)；7.03(d,J＝8.7Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.2和8.7Hz,1H)；7.28(d,J＝2.1Hz,1H)；7.32(d,J＝8.3Hz,2H)；7.39(d,J＝8.3Hz,2H)；7.41(m,1H)；8.00(d,J＝9.1Hz,1H)；8.36(d,J＝8.2Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝735[M-H]-；m/z＝737[M+H]+；tR＝1.54min.
实施例5：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(氨基甲基)苯基)氧杂环 丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6-二甲基-3-新戊基-1-氧杂-4,8,11-三氮 杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
在圆底烧瓶中，向化合物39(100mg,122.07μmol)在DCM(2.5mL)和MeOH(2.5mL)中的溶液滴加TCEP(38.88mg,134.28μmol)在H2O(500μL)中的溶液。反应介质于室温搅拌24h。反应混合物以H2O和饱和NaHCO3稀释，以DCM萃取(3 x 10mL)。有机层经分离以饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩得到73mg的实施例5，为白色固体(84％)，不经进一步纯化用于后续步骤。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.82(s,9H)；0.97(s,3H)；1.03(d,J＝7.0Hz,3H)；1.04(s,3H)；1.29(d,J＝14.4Hz,1H)；1.70(dd,J＝10.2和14.4Hz,1H)；1.80(m,1H)；2.02(宽峰m,2H)；2.25(m,1H)；2.62(m,2H)；2.83(d,J＝13.0Hz,1H)；2.93(dd,J＝2.2和7.8Hz,1H)；2.99(dd,J＝3.4和14.5Hz,1H)；3.23至3.35(部分遮蔽的m,1H)；3.71(s,2H)；3.80(s,3H)；3.88(d,J＝2.2Hz,1H)；4.17(ddd,J＝3.5,8.5和11.5Hz,1H)；4.41(m,1H)；5.09(m,1H)；5.79(d,J＝15.7Hz,1H)；6.39(ddd,J＝3.7,11.4和15.7Hz,1H)；7.05(d,J＝8.7Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.3和8.7Hz,1H)；7.22(d,J＝8.4Hz,2H)；7.28(d,J＝2.3Hz,1H)；7.34(d,J＝8.4Hz,2H)；7.40(d,J＝10.3,1H)；8.02(d,J＝8.9Hz,1H)；8.38(d,J＝8.2Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝709[M-H]-；m/z＝711[M+H]+；tR＝0.86min.
化合物40：(9H-芴-9-基)甲基((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6-二甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，引入实施例5(73mg,82.10μmol)和DMF(1mL)，接着引入FmocValAla(50.55mg,123.16μmol)、HOBt(17.75mg,131.37μmol)、DCM(10mL)和EDC(14.53μl,82.10μmol)。溶液于室温搅拌4h，然后以H2O(10mL)稀释并以DCM萃取(3 x 20mL)。有机层经分离以H2O洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并在15g的硅胶(梯度洗脱DCM/iPrOH)上纯化得到90mg的化合物40，为无色固体(99％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.80(s,9H)；0.84(d,J＝7.1Hz,3H)；0.86(d,J＝7.1Hz,3H)；0.93(s,3H)；1.02(d,J＝7.1Hz,3H)；1.04(s,3H)；1.24(d,J＝7.3Hz,3H)；1.29(d,J＝14.5Hz,1H)；1.70(dd,J＝10.5和14.5Hz,1H)；1.81(m,1H)；1.99(m,1H)；2.25(m,1H)；2.60(m,2H)；2.82(d,J＝13.0Hz,1H)；2.91(dd,J＝1.9和7.6Hz,1H)；2.99(dd,J＝3.4和14.5Hz,1H)；3.29(m,1H)；3.80(s,3H)；3.88(d,J＝1.9Hz,1H)；3.90(m,1H)；4.16(ddd,J＝3.4,8.0和11.8Hz,1H)；4.20至4.35(m,6H)；4.41(m,1H)；5.09(m,1H)；5.79(d,J＝15.7Hz,1H)；6.39(ddd,J＝3.7,11.6和15.7Hz,1H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.15(dd,J＝2.5和8.6Hz,1H)；7.21(d,J＝8.5Hz,2H)；7.24(d,J＝8.5Hz,2H)；7.28(d,J＝2.5Hz,1H)；7.32(t,J＝7.9Hz,2H)；7.38至7.47(m,4H)；7.73(t,J＝7.9Hz,2H)；7.89(d,J＝7.9Hz,2H)；8.03(d,J＝9.1Hz,1H)；8.05(d,J＝7.9Hz,1H)；8.39(m,2H).LCMS(A1)：ES m/z＝1103[M+H]+；m/z＝1147[M-H+HCO2H]-；tR＝1.71min.
化合物41：(S)-2-氨基-N-((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6-二甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-3-甲基丁酰胺
在氩气下，在圆底烧瓶中，引入在DCM(5mL)中的化合物40(104mg,76.65μmol)，接着引入哌啶(138.87μl,1.40mmol)。溶液于室温搅拌5h，然后浓缩并在10g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)上纯化得到50mg的化合物41，为无色固体(60％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.76(d,J＝7.0Hz,3H)；0.81(s,9H)；0.88(d,J＝7.0Hz,3H)；0.97(s,3H)；1.02(d,J＝7.1Hz,3H)；1.04(s,3H)；1.22(d,J＝7.3Hz,3H)；1.29(d,J＝14.6Hz,1H)；1.66(宽峰m,2H)；1.70(dd,J＝10.6和14.6Hz,1H)；1.81(m,1H)；1.92(m,1H)；2.25(m,1H)；2.60(m,2H)；2.83(d,J＝13.0Hz,1H)；2.93(dd,J＝1.9和7.4Hz,1H)；2.99(m,2H)；3.28(dd,J＝10.4和13.0Hz,1H)；3.80(s,3H)；3.89(d,J＝1.9Hz,1H)；4.16(ddd,J＝3.2和8.2et 11.8Hz,1H)；4.29(d,J＝6.0Hz,2H)；4.34(m,1H)；4.41(m,1H)；5.09(m,1H)；5.79(dd,J＝1.7和15.5Hz,1H)；6.38(ddd,J＝3.8,11.3和15.5Hz,1H)；7.04(d,J＝8.7Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.2和8.7Hz,1H)；7.25(m,4H)；7.29(d,J＝2.2Hz,1H)；7.40(d,J＝10.4Hz,1H)；8.02(d,J＝9.1Hz,1H)；8.08(大d,J＝7.7Hz,1H)；8.39(d,J＝8.2Hz,1H)；8.45(t,J＝6.0Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝441[M+2H]2+；m/z＝879[M-H]-；m/z＝881[M+H]+；m/z＝925[M-H+HCO2H]-；tR＝0.99min.
化合物42：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基-苄基)-6,6-二甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-5-氧代戊酸
在氩气下，在圆底烧瓶中，引入在DCM(10mL)中的化合物41(50mg,51.05μmol)，接着引入戊二酸酐(10.48mg,91.89μmol)。反应介质于室温搅拌2h，浓缩并在10g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)上纯化得到42mg的化合物42，为无色固体(82％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.80(s,9H)；0.82(d,J＝7.0Hz,3H)；0.85(d,J＝7.0Hz,3H)；0.97(s,3H)；1.02(d,J＝7.0Hz,3H)；1.04(s,3H)；1.23(d,J＝7.2Hz,3H)；1.29(d,J＝14.2Hz,1H)；1.70(m,3H)；1.81(m,1H)；1.96(m,1H)；2.18至2.25(m,5H)；2.61(m,2H)；2.83(d,J＝13.0Hz,1H)；2.93(dd,J＝2.0和7.4Hz,1H)；3.00(dd,J＝3.1和14.5Hz,1H)；3.29(dd,J＝10.4和13.0Hz,1H)；3.80(s,3H)；3.89(d,J＝2.0Hz,1H)；4.16(m,2H)；4.25至4.31(m,3H)；4.42(m,1H)；5.09(m,1H)；5.79(dd,J＝1.9和15.5Hz,1H)；6.39(ddd,J＝3.8,11.6et 15.5Hz,1H)；7.05(d,J＝8.7Hz,1H)；7.15(dd,J＝2.1和8.7Hz,1H)；7.23(m,4H)；7.28(d,J＝2.1Hz,1H)；7.40(d,J＝10.4Hz,1H)；7.83(d,J＝8.7Hz,1H)；8.02(m,2H)；8.35(t,J＝6.1Hz,1H)；8.39(d,J＝8.0Hz,1H)；12.04(宽峰m,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝498[M+2H]2+；m/z＝993[M-H]-；m/z＝995[M+H]+；tR＝1.27min.
实施例6：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10- (3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6-二甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂 环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲 基-1-氧代丁-2-基)氨基)-5-氧代戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，引入在DCM(5mL)中的化合物42(23mg,23.10μmol)，接着引入DSC(8.29mg,32.34μmol)和DIEA(5.63μL,32.34μmol)。反应介质于室温搅拌2h。此后，添加2mg的DSC,1μL的DIEA和DCM(2mL)并于室温搅拌1h。除去溶剂并且粗剩余物通过快速色谱在10g的硅胶(梯度洗脱DCM/iPrOH)上纯化得到20mg的实施例6，为无色固体(79％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.80(s,9H)；0.82(d,J＝7.0Hz,3H)；0.85(d,J＝7.0Hz,3H)；0.97(s,3H)；1.02(d,J＝7.0Hz,3H)；1.04(s,3H)；1.23(d,J＝7.2Hz,3H)；1.30(d,J＝14.2Hz,1H)；1.70(dd,J＝10.7和14.7Hz,1H)；1.81(m,3H)；1.97(m,1H)；2.21至2.32(m,3H)；2.61(m,2H)；2.68(t,J＝7.8Hz,2H)；2.80(宽峰s,4H)；2.83(d,J＝13.0Hz,1H)；2.94(dd,J＝2.0et 7.6Hz,1H)；3.00(dd,J＝3.4和14.9Hz,1H)；3.28(dd,J＝10.5和13.0Hz,1H)；3.80(s,3H)；3.88(d,J＝2.0Hz,1H)；4.16(m,2H)；4.23至4.31(m,3H)；4.42(m,1H)；5.10(m,1H)；5.79(dd,J＝1.9和15.3Hz,1H)；6.39(ddd,J＝3.8,11.4和15.3Hz,1H)；7.05(d,J＝8.8Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.2和8.8Hz,1H)；7.23(m,4H)；7.28(d,J＝2.2Hz,1H)；7.40(d,J＝10.5Hz,1H)；7.89(d,J＝8.7Hz,1H)；8.02(d,J＝9.1Hz,1H)；8.06(d,J＝7.5Hz,1H)；8.34(t,J＝6.1Hz,1H)；8.39(d,J＝8.1Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝546.5[M+2H]2+；m/z＝1090[M-H]-；m/z＝1092[M+H]+；m/z＝1136[M-H+HCO2H]-；tR＝1.34min.
实施例7：mAb-Ex6
先前描述的一般方法用来制备实施例7。60mg的hu2H11_R35-74与233μL的实施例6在DMA(5当量)中的10.6mM溶液反应2h。在Superde x 200pg上于DPBS pH 6.5+20％NMP中纯化后,在Amicon Ultra-15上浓缩，在NAP-25上在缓冲液B pH6.5+5％NMP中缓冲液交换并且在Steriflip过滤，得到39mg的实施例7，为无色澄清溶液，浓度为1.98mg/mL，DAR为4.1(HRMS)，单体纯度为100％和整体收率为66％。
SEC-HRMS：在图2中完整ADC的光谱；m/z＝149370(裸mAb)；m/z＝150357(D1)；m/z＝151330(D2)；m/z＝152307(D3)；m/z＝153285(D4)；m/z＝154262(D5)；m/z＝155238(D6)；m/z＝156222(D7)。
合成实施例8至10：7-Me-氮杂-C52的苄胺立体异构体1,戊二酰基-Val-Ala-7-Me- 氮杂-C52苄胺立体异构体1的NHS酯和对应的ADC
Figure BDA0001649098600001981
化合物43：6-(3-氯-4-甲氧基苄基)-13-异丁基-2,2,9,10,10-五甲基-4,7,11-三氧代-3-氧杂-5,8,12-三氮杂十四烷-14-酸(6R,13S)-(1E,3R,4S,6E)-1-(4-(叠氮基甲基)苯基)-8-(叔-丁氧基)-3-甲基-8-氧代辛-1,6-二烯-4-基酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，引入在DMF(5mL)中的片段BC2(1.10g,2.48mmol)，接着引入HATU(950mg,2.5mmol)和HOAt(340mg,2.5mmol)。混合物于室温搅拌30min，然后添加片段AD1(1.24g,2.18mmol)和DIEA(1.2mL,6.87mmol)。黄色溶液于室温搅拌16h，以H2O淬灭并以AcOEt(3 x 30mL)萃取，有机层以H2O、饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并在200g的硅胶(梯度洗脱庚烷/AcOEt)上纯化得到1.55g的化合物43，为白色蛋白霜(77％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：55/45非对映异构体混合物；0.82至0.89(m,6H)；0.85(d,J＝7.0Hz,1.65H)；0.91(d,J＝7.0Hz,1.35H)；0.99至1.09(m,9H)；1.30(s,9H)；1.40(s,10H)；1.50至1.70(m,2H)；2.38至2.59(部分遮蔽的m,3H)；2.68(m,1H)；2.84(m,1H)；3.79(s,1.35H)；3.81(s,1.65H)；4.00至4.18(m,2H)；4.30(m,1H)；4.40(宽峰s,2H)；4.92(m,1H)；5.81(d,J＝15.7Hz,1H)；6.18(dd,J＝8.3和16.1Hz,1H)；6.45(d,J＝16.1Hz,1H)；6.71(td,J＝7.3和15.7Hz,1H)；6.94(d,J＝8.1Hz,0.45H)；6.96(d,J＝8.1Hz,0.55H)；7.04(split d,J＝8.7Hz,1H)；7.19(宽峰d,J＝8.7Hz,1H)；7.30(d,J＝7.8Hz,2H)；7.32(宽峰s,1H)；7.41(d,J＝8.7Hz,2H)；7.52(d,J＝10.1Hz,0.45H)；7.59(d,J＝10.1Hz,0.55H)；7.74(m,1H).LCMS(A1)：55/45非对映异构体混合物；ES m/z＝895[M+H]+；m/z＝917[M+Na]+；tR＝6.94-6.98min.
化合物44&45：(3S,10R,16S,E)-16-((R,E)-4-(4-(叠氮基甲基)苯基)丁-3-烯-2-基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6,7-三甲基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
化合物44&45分两步得到。
步骤1：于0℃,在圆底烧瓶中，向化合物43(1.50g,1.67mmol)在11mL的DCM中的溶液添加TFA(2.6mL,34.65mmol)和100μL的H2O。混合物于0℃搅拌15min并于室温搅拌6.5h。反应介质然后真空蒸发并且在甲苯的存在下共蒸发，得到1.7g的脱保护的中间体，为橙色固体。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：55/45非对映异构体混合物；0.70至0.80(m,7.65H)；0.90(s,1.35H)；0.95(m,3H)；1.01至1.09(m,6H)；1.38至1.68(m,3H)；2.40至2.60(部分遮蔽的m,3H)；2.80至3.02(m,2H)；3.81(s,1.35H)；3.82(s,1.65H)；3.96至4.08(m,1H)；4.18(m,1H)；4.28(m,1H)；4.41(s,2H)；4.91(m,1H)；5.83(d,J＝15.7Hz,0.45H)；5.85(d,J＝15.7Hz,0.55H)；6.18(m,1H)；6.43(d,J＝16.1Hz,0.45H)；6.46(d,J＝16.1Hz,0.55H)；6.74(m,1H)；7.08至7.20(m,2H)；7.30(掩蔽的m,0.45H)；7.32(d,J＝7.8Hz,2H)；7.37(d,J＝2.0Hz,0.55H)；7.42(m,2H)；7.76(d,J＝8.00Hz,0.45H)；7.79(d,J＝8.00Hz,0.55H)；7.86(d,J＝10.1Hz,0.55H)；8.00(d,J＝10.1Hz,0.45H)；8.11(宽峰m,3H)；12.22(宽峰m,1H).LCMS(A1)：55/45非对映异构体混合物；ES m/z＝737[M-H]-；m/z＝739[M+H]+；tR＝1.07-1.09min.
步骤2：在圆底烧瓶中，向脱保护的中间体(1.43g,1.68mmol)在25mL的CH3CN中添加DIEA(3mL,16.23mmol)、HOAt(250.91mg,1.84mmol)和HATU(700.91mg,1.84mmol)。混合物于室温搅拌1h。然后除去溶剂，介质以AcOEt(200mL)稀释，以0.5M柠檬酸和HCl中和。有机层经分离以饱和NaHSO3、饱和NaHCO3、饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并在100g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到640mg的化合物44&45，为黄色固体(53％)。
通过手性液体色谱分离C7处的非对映异构体，其在76.5 x 350mm柱(装有1.1kg的10μm Whelk 01SS(4-(3,5-二硝基苯甲酰胺基)四氢菲,Regis Technologies)上使用50:50庚烷/EtOH的等度梯度进行。浓缩后，得到210mg的化合物44(立体异构体1)，为白色固体(17％)并得到236mg的化合物45(立体异构体2)，为白色固体(19％)。
化合物44(立体异构体1):
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.60(d,J＝6.7Hz,3H)；0.62(d,J＝6.7Hz,3H)；0.98(s,3H)；1.05(d,J＝7.0Hz,3H)；1.10(d,J＝7.0Hz,3H)；1.14(s,3H)；1.18(m,1H)；1.40至1.54(m,2H)；2.24(m,1H)；2.48至2.61(部分遮蔽的m,2H)；2.65(dd,J＝11.8和14.5Hz,1H)；3.04(dd,J＝3.2和14.5Hz,1H)；3.55(m,1H)；3.81(s,3H)；4.19(m,2H)；4.40(s,2H)；4.96(m,1H)；5.91(dd,J＝1.4和15.5Hz,1H)；6.13(dd,J＝8.9和16.1Hz,1H)；6.40(ddd,J＝3.9,11.3和15.5Hz,1H)；6.46(d,J＝16.1Hz,1H)；7.03(d,J＝8.7Hz,1H)；7.19(dd,J＝2.1和8.7Hz,1H)；7.30(d,J＝2.1Hz,1H)；7.32(d,J＝8.4Hz,2H)；7.41(d,J＝8.4Hz,2H)；7.87(d,J＝8.9Hz,1H)；8.36(d,J＝9.9Hz,1H)；8.40(d,J＝8.0Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝719[M-H]-；m/z＝721[M+H]+；tR＝1.61min
化合物45(立体异构体2)：
RMN 1H(δin ppm,DMSO-d6)：0.59(d,J＝6.7Hz,3H)；0.67(d,J＝6.7Hz,3H)；0.88(d,J＝6.7Hz,3H)；1.03(s,3H)；1.10(d,J＝7.0Hz,3H)；1.19(s,3H)；1.21(m,1H)；1.49至1.60(m,2H)；2.23(m,1H)；2.46至2.61(部分遮蔽的m,2H)；2.71(dd,J＝11.3和14.5Hz,1H)；2.98(dd,J＝3.7和14.5Hz,1H)；3.48(m,1H)；3.80(s,3H)；4.05(m,1H)；4.11(ddd,J＝3.7,7.6和11.3Hz,1H)；4.40(s,2H)；4.90(m,1H)；5.93(d,J＝15.7Hz,1H)；6.14(dd,J＝8.7和16.1Hz,1H)；6.47(d,J＝16.1Hz,1H)；6.51(ddd,J＝5.2,10.3和15.5Hz,1H)；7.02(d,J＝8.7Hz,1H)；7.21(dd,J＝2.4和8.7Hz,1H)；7.31(d,J＝8.4Hz,2H)；7.37(d,J＝2.4Hz,2H)；7.41(d,J＝8.4Hz,2H)；7.87(d,J＝6.9Hz,1H)；7.89(d,J＝9.0Hz,1H)；8.51(d,J＝7.6Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝719[M-H]-；m/z＝721[M+H]+；tR＝1.61min.
化合物46：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-(3-(4-(叠氮基甲基)苯基)氧杂环丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6,7-三甲基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
于0℃，在氩气下，在圆底烧瓶中，向化合物44(154mg,213.51μmol)在DCM(10mL)中的溶液添加m-CPBA(80mg,324.51μmol)。反应介质于室温搅拌5天。反应混合物以DCM(15mL)稀释并与饱和NaHCO3(6mL)和Na2S2O3(6mL)搅拌15min。有机层经分离以饱和盐水(2 x 3mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩得到150mg的化合物46，为白色固体(定量)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：60/40非对映异构体混合物；0.75(d,J＝6.8Hz,1.8H)；0.79(d,J＝6.8Hz,3H)；0.85(d,J＝6.8Hz,1.2H)；0.95至0.99(m,4.2H)；1.02至1.09(m,4.8H)；1.15(s,1.8H)；1.18(s,1.2H)；1.20(m,0.6H)；1.38(m,0.4H)；1.59至1.62(m,2H)；1.80(m,0.6H)；1.89(m,0.4H)；2.25(m,0.6H)；2.40至2.71(部分遮蔽的m,2.4H)；2.96至3.08(m,2H)；3.54(m,1H)；3.80(s,3H)；3.82(d,J＝1.9Hz,0.4H)；3.92(d,J＝1.9Hz,0.6H)；4.14至4.29(m,2H)；4.40至4.50(m,2H)；5.11(m,1H)；5.85(dd,J＝2.0和15.5Hz,0.6H)；5.95(dd,J＝2.0和15.5Hz,0.4H)；6.38(m,1H)；7.04(split d,J＝8.8Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.2和8.8Hz,0.6H)；7.19(dd,J＝2.2和8.8Hz,0.4H)；7.28(d,J＝2.2Hz,0.6H)；7.30(d,J＝2.2Hz,0.4H)；7.30至7.40(m,4H)；7.89(d,J＝8.1Hz,0.6H)；7.92(d,J＝8.1Hz,0.4H)；8.29(d,J＝10.0Hz,0.6H)；8.32(d,J＝8.1Hz,0.6H)；8.35(d,J＝10.0Hz,0.4H)；8.40(d,J＝8.1Hz,0.4H).LCMS(A1)：ES m/z＝735[M-H]-；m/z＝737[M+H]+；tR＝1.52min.
实施例8：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-(3-(4-(氨基甲基)苯基)氧杂环丙烷-2- 基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6,7-三甲基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环 十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
于0℃,在圆底烧瓶中，向化合物46(60mg,81.38μmol)在DCM(3mL)和MeOH(3mL)中的溶液滴加TCEP(38.9mg,134.3μmol)在1mL的H2O中的溶液。反应混合物于室温搅拌35h，然后以DCM(15mL)和饱和NaHCO3稀释。搅拌10min后，有机层经分离以饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并在5g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到23mg的实施例8，为白色固体(40％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：60/40非对映异构体混合物；0.77(d,J＝7.0Hz,1.8H)；0.81(split d,J＝7.0Hz,3H)；0.88(d,J＝7.0Hz,1.4H)；0.95(d,J＝7.0Hz,1.2H)；0.98(s,1.8H)；1.00(s,1.2H)；1.02至1.09(m,4.8H)；1.17(s,1.8H)；1.19(s,1.2H)；1.22(m,0.6H)；1.40(m,0.4H)；1.51至1.64(m,2H)；1.78(m,0.6H)；1.89(m,0.4H)；2.28(m,0.6H)；2.40至2.71(部分遮蔽的m,2.4H)；2.96(dd,J＝2.2和7.5Hz,0.6H)；2.99(dd,J＝2.2和7.5Hz,0.4H)；3.03(m,1H)；3.55(m,1H)；3.70(s,1.2H)；3.72(s,1.8H)；3.78(d,J＝2.2Hz,0.4H)；3.81(s,3H)；3.88(d,J＝2.2Hz,0.6H)；4.12至4.30(m,2H)；5.12(m,1H)；5.84(dd,J＝1.8和15.6Hz,0.6H)；5.96(dd,J＝1.8和15.6Hz,0.4H)；6.39(m,1H)；7.05(d,J＝8.7Hz,1H)；7.16至7.38(m,6H)；7.90(d,J＝8.1Hz,0.6H)；7.93(d,J＝8.1Hz,0.4H)；8.28(d,J＝10.0Hz,0.6H)；8.32(d,J＝8.1Hz,0.6H)；8.37(d,J＝10.0Hz,0.4H)；8.41(d,J＝8.1Hz,0.4H).LCMS(A1)：ES m/z＝709[M-H]-；m/z＝711[M+H]+；tR＝0.86min.
化合物47：(9H-芴-9-基)甲基((S)-1-(((S)-1-((4-(3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6,7-三甲基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，引入实施例8(110mg,154.65μmol)和DMF(2mL),接着引入FmocValAla(90mg,219μmol),HOBt(30mg,222μmol),DCM(10mL)和EDC(35μl,197.52μmol)。溶液于室温搅拌3h30，然后以H2O(10mL)淬灭并以DCM(3 x 10mL)萃取。有机层经分离以饱和NaHCO3、饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，在甲苯的存在下浓缩并在15g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到49mg的化合物47，为白色固体(46％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：60/40非对映异构体混合物；0.76(d,J＝7.0Hz,1.8H)；0.80(m,3H)；0.82至0.89(m,6.4H)；0.95(d,J＝7.0Hz,1.2H)；0.98(s,1.8H)；1.00(s,1.2H)；1.02至1.09(m,4.8H)；1.17(s,1.8H)；1.19(s,1.2H)；1.20至1.32(m,3.6H)；1.40(m,0.4H)；1.51至1.63(m,2H)；1.78(m,0.6H)；1.85(m,0.4H)；2.00(m,1H)；2.27(m,0.6H)；2.40至2.72(部分遮蔽的m,2.4H)；2.96(m,1H)；3.04(m,1H)；3.55(m,1H)；3.77(d,J＝2.2Hz,0.4H)；3.81(s,3H)；3.88(d,J＝2.2Hz,0.6H)；3.90(m,1H)；4.15至4.38(m,6H)；5.12(m,1H)；5.85(dd,J＝1.8和15.6Hz,0.6H)；5.95(dd,J＝1.8和15.6Hz,0.4H)；6.39(m,1H)；7.05(split d,J＝8.7Hz,1H)；7.15至7.48(m,19H)；7.73(t,J＝8.1Hz,2H)；7.90(d,J＝8.1Hz,2.6H)；7.92(d,J＝8.1Hz,0.4H)；8.05(d,J＝8.1Hz,1H)；8.25至8.45(m,3H).LCMS(A1)：ES m/z＝552[M+2H]2+；m/z＝1103[M+H]+；m/z＝1147[M-H+HCO2H]-；tR＝1.55-1.57min.
化合物48：(2S)-2-氨基-N-((2S)-1-((4-((2R,3R)-3-((1S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6,7-三甲基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-3-甲基丁酰胺
在圆底烧瓶中，哌啶(60μL,600.6μmol)添加至化合物47(50mg,45.30μmol)在DCM(5mL)中的溶液。所得混合物于室温搅拌24h，真空浓缩并在5g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到70mg的α-和β-环氧化物。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：60/40非对映异构体混合物；0.75(d,J＝7.0Hz,1.8H)；0.80(m,3H)；0.82至0.92(m,6.4H)；0.96(d,J＝7.0Hz,1.2H)；0.98(s,1.8H)；1.00(s,1.2H)；1.02至1.09(m,4.8H)；1.15(s,1.8H)；1.19(s,1.2H)；1.20至1.42(m,4H)；1.50至1.70(掩蔽的m,2H)；1.78(m,0.6H)；1.85(m,0.4H)；2.00(m,1H)；2.25(m,0.6H)；2.40至2.72(部分遮蔽的m,2.4H)；2.92至3.08(m,3H)；3.54(m,1H)；3.79(d,J＝2.1Hz,0.4H)；3.81(s,3H)；3.88(d,J＝2.1Hz,0.6H)；4.13至4.41(m,6H)；5.12(m,1H)；5.85(d,J＝15.4Hz,0.6H)；5.93(d,J＝15.4Hz,0.4H)；6.38(m,1H)；7.05(d,J＝8.7Hz,1H)；7.15至7.32(m,6H)；7.90(d,J＝8.3Hz,0.6H)；7.93(d,J＝8.3Hz,0.4H)；8.10至8.55(m,7H).LCMS(A1)：ES m/z＝441[M+2H]2+；m/z＝879[M-H]-；m/z＝881[M+H]+；m/z＝925[M-H+HCO2H]-；tR＝0.92min.
α-和β-环氧化物通过手性液体色谱分离，其在76 x 350mm柱(装有1.1kg的10μmChiralpak AD(直链淀粉三-3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯，涂覆在硅胶支承体上，ChiralTechnologies Europe))上使用70:30庚烷/EtOH的等度洗脱进行。浓缩后，得到28mg的化合物48，为白色固体(70％)并得到19mg的α-环氧化物，为白色固体。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.75(d,J＝7.0Hz,6H)；0.80(d,J＝7.0Hz,3H)；0.88(d,J＝7.0Hz,3H)；0.98(s,3H)；1.03(d,J＝7.0Hz,6H)；1.17(s,3H)；1.23(d,J＝7.0Hz,3H)；1.35(m,1H)；1.50至1.68(m,2H)；1.78(m,1H)；1.91(m,1H)；2.26(m,1H)；2.58至2.70(m,2H)；2.96(dd,J＝1.9和7.7Hz,1H)；2.99(d,J＝4.8Hz,1H)；3.02(dd,J＝3.3和14.8Hz,1H)；3.53(m,1H)；3.80(s,3H)；3.89(d,J＝1.9Hz,1H)；4.10至4.23(m,3H)；4.28(d,J＝6.1Hz,2H)；4.35(m,1H)；5.11(m,1H)；5.83(dd,J＝1.9和15.2Hz,1H)；6.37(ddd,J＝4.0,11.2和15.2Hz,1H)；7.03(d,J＝8.8Hz,1H)；7.18(dd,J＝2.4和8.8Hz,1H)；7.26(s,4H)；7.29(d,J＝2.4Hz,1H)；7.90(d,J＝8.2Hz,1H)；8.08(宽峰d,J＝7.7Hz,1H)；8.29(d,J＝10.1Hz,1H)；8.33(d,J＝8.2Hz,1H)；8.46(t,J＝6.7Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝441[M+2H]2+；m/z＝879[M-H]-；m/z＝881[M+H]+；m/z＝925[M-H+HCO2H]-；tR＝0.92min.
化合物49：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6,7-三甲基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-5-氧代戊酸
在氩气下，在圆底烧瓶中，将戊二酸酐(3.78mg,32.44μmol)DCM(4mL)中的溶液添加至化合物48(26mg,29.5μmol)在DCM(9mL)中的溶液。所得混合物于室温搅拌2h，真空浓缩并在2.5g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)上纯化得到18mg的化合物49，为白色固体(61％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.78(d,J＝7.0Hz,3H)；0.80(d,J＝7.0Hz,3H)；0.82(d,J＝7.0Hz,3H)；0.84(d,J＝7.0Hz,3H)；0.97(s,3H)；1.03(d,J＝7.0Hz,6H)；1.15(s,3H)；1.23(宽峰d,J＝7.0Hz,4H)；1.49至1.61(m,2H)；1.70(m,2H)；1.78(m,1H)；1.97(m,1H)；2.20(m,4H)；2.25(m,1H)；2.62(m,2H)；2.95(m,1H)；3.02(m,1H)；3.53(m,1H)；3.80(s,3H)；3.88(s,1H)；4.10至4.22(m,3H)；4.24至4.31(m,3H)；5.11(m,1H)；5.83(d,J＝15.7Hz,1H)；6.36(m,1H)；7.03(d,J＝8.7Hz,1H)；7.19(宽峰d,J＝8.7Hz,1H)；7.23(m,4H)；7.29(宽峰s,1H)；7.87(d,J＝8.9Hz,1H)；7.90(d,J＝8.1Hz,1H)；8.06(d large,J＝7.3Hz,1H)；8.29(d,J＝10.1Hz,1H)；8.37(m,2H)；12.0(宽峰m,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝993[M-H]-；m/z＝995[M+H]+；tR＝1.21min.
实施例9：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10- (3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6,7-三甲基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮 杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲 基-1-氧代丁-2-基)氨基)-5-氧代戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，向化合物49(15mg,15.07μmol)在DCM(5mL)中的溶液添加DSC(5.63mg,21.09μmol)和DIEA(3.56μL,21.09μmol)。所得混合物于室温搅拌1h，真空浓缩并在2.5g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到7.7mg的实施例9，为白色固体(47％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.78(d,J＝6.7Hz,3H)；0.80(d,J＝6.7Hz,3H)；0.82(d,J＝7.0Hz,3H)；0.85(d,J＝7.0Hz,3H)；0.99(s,3H)；1.04(d,J＝7.2Hz,6H)；1.18(s,3H)；1.26(m,4H)；1.57(m,2H)；1.79(m,1H)；1.83(m,2H)；1.99(m,1H)；2.22至2.33(m,3H)；2.60à2.71(m,4H)；2.82(s,4H)；2.97(dd,J＝2.1和7.7Hz,1H)；3.04(dd,J＝3.4和14.7Hz,1H)；3.55(m,1H)；3.81(s,3H)；3.89(d,J＝2.1Hz,1H)；4.19(m,3H)；4.26至4.34(m,3H)；5.12(m,1H)；5.86(dd,J＝2.0和15.7Hz,1H)；6.38(ddd,J＝3.8,11.2和15.7Hz,1H)；7.05(d,J＝8.7Hz,1H)；7.19(dd,J＝2.2和8.7Hz,1H)；7.26(m,4H)；7.29(d,J＝2.2Hz,1H)；7.91(m,2H)；8.09(m,1H)；8.29(d,J＝9.9Hz,1H)；8.35(m,2H).LCMS(A1)：ES m/z＝1092[M+H]+；m/z＝1136[M-H+HCO2H]-；tR＝1.26min.
实施例10：mAb-Ex9
先前描述的一般方法用来制备实施例10。60mg的hu2H11_R35-74与198μL的实施例9在DMA(5eq.)中的10.78mM溶液反应2h。此时，添加120μL的实施例9(3当量)的溶液并且介质搅拌2h。在Superde x 200pg上于DPBS pH 6.5+20％NMP中纯化后，在Amicon Ultra-15上浓缩，在PD-10上于缓冲液B pH6.5+5％NMP中缓冲液交换并且在Steriflip上过滤，得到46mg的实施例10，为无色澄清溶液，浓度为2.23mg/mL，DAR为4.7(HRMS)，单体纯度为99.2％且整体收率为78％。
SEC-HRMS：图3中完整ADC的光谱；m/z＝150345(D1)；m/z＝151319(D2)；m/z＝152297(D3)；m/z＝153274(D4)；m/z＝154251(D5)；m/z＝155222(D6)；m/z＝156202(D7)；m/z＝157183(D8)。
合成实施例11至14：3-(S)-新戊基-7-Me-氮杂-C52的苄胺立体异构体1,戊二酰 基-Val-Ala-3-(S)-新戊基-7-Me-氮杂-C52苄胺立体异构体1的NHS酯和对应的ADC
Figure BDA0001649098600002081
化合物50：(6R,13S)-(1E,3R,4S,6E)-8-(叔-丁氧基)-1-(4-(羟基甲基)苯基)-3-甲基-8-氧代辛-1,6-二烯-4-基6-(3-氯-4-甲氧基苄基)-2,2,9,10,10-五甲基-13-新戊基-4,7,11-三氧代-3-氧杂-5,8,12-三氮杂十四烷-14-酸酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，向片段BC2(742mg,1.68mmol)在DMF(20mL)中的溶液添加HATU(716mg,1.83mmol)和HOAt(251mg,1.83mmol)。混合物于室温搅拌30min。然后添加在DMF(10mL)中的片段AD1(730mg,1.59mmol)和DIEA(981μL,5.56mmol)。反应介质于室温搅拌24h。此后，反应介质以冰稀释(200g)，以AcOEt(4 x 200mL)萃取。有机层以H2O(80mL)、饱和盐水(2x80mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并通过两个连续的快速色谱纯化，第一个在300g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上且第二个在70g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上得到428mg的化合物50，为无色泡沫(30％)。
化合物51：(2E,5S,6R,7E)-5-(((2S)-2-(3-((R)-2-氨基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)-丙酰胺基)-2,2-二甲基丁酰胺基)-4,4-二甲基戊酰基)氧基)-8-(4-(羟基甲基)苯基)-6-甲基辛-2,7-二烯酸
在圆底烧瓶中，引入化合物50(428mg,483.87μmol)和DCM(27mL)。溶液于0℃冷却然后添加TFA(8mL,106.62mmol)。混合物于室温搅拌1.5h。除去溶剂并在加压下于甲苯(3 x100mL)共蒸发。粗制油状物以1:1AcOEt/H2O(75mL)稀释并以2M NaOH(250μL)中和直至pH6-7。混合物于室温搅拌6h。分离各层，水层以AcOEt(3 x 50mL)萃取。有机层以饱和盐水洗涤(2 x 15mL)，经MgSO4干燥，过滤并浓缩得到374mg的化合物51，为无色泡沫(定量)。
化合物52：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((R,E)-4-(4-(羟基甲基)-苯基)丁-3-烯-2-基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
在氩气下，在圆底烧瓶中，向化合物51(352mg,483.31μmol)在CH3CN(60mL)中的溶液添加HATU(208mg,531.64mmol)、HOAt(73.09mg,531.64μmol)和DIEA(244.52μL,1.45mmol)。反应介质于室温搅拌45min。此后，反应介质以0.5N柠檬酸中和至pH 4,部分真空浓缩并以AcOEt(150mL)萃取。有机层以饱和NaHCO3(10mL)、饱和盐水(3 x 10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并通过快速色谱在15g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到188mg的化合物52，为无色泡沫(54％)。
化合物53：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-16-((R,E)-4-(4-(((三异丙基甲硅烷基)氧基)甲基)苯基)丁-3-烯-2-基)-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
于0℃,在氩气下，在圆底烧瓶中，向化合物52(188mg,264.68μmol)在DCM(7mL)中的溶液添加1H-咪唑(83.72mg,1.2mmol)和1M氯三异丙基硅烷(134.15μl)。反应介质于室温搅拌5h，然后以饱和NH4Cl淬灭并搅拌15min。分离各层，水层以DCM(3 x 25mL)萃取。有机层以1M NaHSO4(10mL)、饱和NaHCO3(10mL)、饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并通过快速色谱在10g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到137mg的化合物53，为无色泡沫(59％)。
实施例11：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((S)-1-((2R,3R)-3- (4-(羟基甲基)苯基)氧杂环丙烷-2-基)乙基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧杂-4,8,11- 三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
实施例11分两步制备。
步骤1：于0℃，在氩气下，在圆底烧瓶中，向化合物53(137mg,158.08μmol)在DCM(5.5mL)中的溶液添加m-CPBA(50.66mg,205.51μmol)在DCM(2mL)中的溶液并且反应介质搅拌2h。然后在搅拌2h后两次添加39mg的m-CPBA。搅拌16h后，混合物以饱和NaHCO3(30mL)和Na2S2O3(30mL)淬灭，搅拌15min并用DCM(40mL)稀释。分离各层。水层以DCM(2 x 20mL)萃取。有机层以饱和盐水洗涤(2 x 8mL)，经MgSO4干燥，过滤并浓缩得到160mg的α-和β-环氧化物，为无色固体(定量)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：60/40非对映异构体混合物；0.80至0.91(m,12H)；0.97至1.09(m,24H)；1.12至1.21(m,6H)；1.32(d,J＝14.7Hz,0.6H)；1.40(d,J＝14.7Hz,0.4H)；1.70至1.87(m,1H)；1.90(dd,J＝10.1和14.7Hz,0.4H)；1.97(dd,J＝10.1和14.7Hz,0.6H)；2.28(m,0.6H)；2.40(m,0.4H)；2.55至2.79(m,2H)；2.90至3.00(m,2H)；3.44(m,1H)；3.79(d,J＝2.1Hz,0.4H)；3.80(s,3H)；3.90(d,J＝2.1Hz,0.6H)；4.03至4.22(m,2H)；4.78(s,0.8H)；4.80(s,1.2H)；5.03(m,1H)；5.90(dd,J＝1.5和15.5Hz,0.6H)；5.99(dd,J＝1.5和15.5Hz,0.4H)；6.40至6.55(m,1H)；7.02至7.07(m,1H)；7.13至7.38(m,6H)；7.85至7.93(m,2H)；8.40(d,J＝7.3Hz,0.6H)；8.51(d,J＝7.3Hz,0.4H).LCMS(A1)：ES m/z＝880[M-H]-；m/z＝882[M+H]+；m/z＝926[M-H+HCO2H]-；tR＝2.05-2.06min.
步骤2：于0℃在氩气下，在圆底烧瓶中，向α-和β-环氧化物(177mg,200.53μmol)在THF(7.5mL)中的溶液滴加1M TBAF(221μL,221μmol)。于室温搅拌2h后，添加50μL的TBAF并搅拌3.5h。反应介质以H2O(9mL)稀释，搅拌10min并以DCM萃取(3 x 25mL)。合并的有机层以饱和盐水(3 x 8mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并浓缩得到210mg的α-和β-环氧化物，为无色固体(定量)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：60/40非对映异构体混合物；0.82至1.25(m,21H)；1.32(d,J＝14.5Hz,0.6H)；1.42(d,J＝14.5Hz,0.4H)；1.80(m,1H)；1.91(dd,J＝10.0和14.5Hz,0.4H)；1.98(dd,J＝10.0和14.5Hz,0.6H)；2.22至2.48(m,1H)；2.55至2.78(m,2H)；2.89至3.03(m,2H)；3.44(m,1H)；3.79(d,J＝2.2Hz,0.4H)；3.80(s,3H)；3.90(d,J＝2.2Hz,0.6H)；4.04至4.22(m,2H)；4.48(d,J＝5.8Hz,0.8H)；4.50(d,J＝5.8Hz,1.2H)；5.03(m,1H)；5.16(t,J＝5.8Hz,0.4H)；5.19(t,J＝5.8Hz,0.6H)；5.89(dd,J＝1.9和15.6Hz,0.6H)；5.99(dd,J＝1.9和15.6Hz,0.4H)；6.40至6.52(m,1H)；7.02(d,J＝8.7Hz,0.6H)；7.04(d,J＝8.7Hz,0.4H)；7.16至7.37(m,6H)；7.83至7.94(m,2H)；8.39(d,J＝7.4Hz,0.6H)；8.50(d,J＝7.4Hz,0.4H).LCMS(A1)：ES m/z＝724[M-H]-；m/z＝726[M+H]+；tR＝1.29min.
α-和β-环氧化物通过手性液体色谱分离，其在76 x 350mm柱(装有1.1kg的10μmChiralpak AD(直链淀粉三-3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯，涂覆在硅胶支承体上,ChiralTechnologies Europe))上使用75:25庚烷/EtOH的等度洗脱进行。浓缩后，得到66mg的实施例11，为白色固体(45％)和得到45mg的α-环氧化物，为白色固体(31％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.82至0.89(m,12H)；0.99(s,3H)；1.03(d,J＝6.9Hz,3H)；1.19(s,3H)；1.34(d,J＝14.6Hz,1H)；1.80(m,1H)；1.98(dd,J＝10.1和14.6Hz,1H)；2.26(m,1H)；2.61(m,1H)；2.69(dd,J＝11.1和14.6Hz,1H)；2.91(dd,J＝2.1和7.8Hz,1H)；2.94(dd,J＝3.7和14.6Hz,1H)；3.42(m,1H)；3.80(s,3H)；3.91(d,J＝2.1Hz,1H)；4.03至4.14(m,2H)；4.50(d,J＝5.8Hz,2H)；5.03(m,1H)；5.19(t,J＝5.8Hz,1H)；5.89(dd,J＝2.1和15.5Hz,1H)；6.43(ddd,J＝4.7,10.9和15.5Hz,1H)；7.03(d,J＝8.7Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.3和8.7Hz,1H)；7.23(d,J＝8.4Hz,2H)；7.30(d,J＝2.3Hz,1H)；7.33(d,J＝8.4Hz,2H)；7.86(d,J＝8.4Hz,1H)；7.92(d,J＝7.1Hz,1H)；8.39(d,J＝9.1Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝724[M-H]-；m/z＝726[M+H]+；tR＝1.29min.
化合物54：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)氧杂环丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
在氩气下，在圆底烧瓶中，向实施例11(66mg,90.87μmol)在THF(5mL)中的溶液于0℃添加DPPA(100.23μl,454.36μmol)和DBU(69.27μl,454.36μmol)。溶液于室温搅拌5h，然后以H2O稀释并以AcOEt(2 x 15mL)萃取。有机层经分离以饱和盐水(2 x 5mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并在15g的硅胶(梯度洗脱DCM/iPrOH)上纯化得到64mg的化合物54，为无色固体(94％)。
实施例12：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(氨基甲基)苯基)氧杂环 丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧杂-4,8,11-三 氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
在圆底烧瓶中，向化合物54(64mg,85.18μmol)在DCM(3mL),MeOH(3mL)和H2O(400μL)中的溶液添加TCEP(26.86mg,93.70μmol)。反应介质于室温搅拌24h。反应混合物以DCM(15mL)和饱和NaHCO3,稀释，搅拌10min并以DCM萃取(3 x 15mL)。合并的有机层以饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，浓缩并通过快速色谱在4.5g的氨基-丙基修饰的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到42mg的实施例12，为白色固体(68％)。
化合物55：((2S)-1-(((2S)-1-((4-((2R,3R)-3-((1S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，引入实施例12(42mg,57.91μmol)和DMF(1mL)，接着引入FmocValAla(34.44mg,86.86μmol)、HOBt(13.20mg,93.81μmol)、DCM(10mL)和EDC(10.36μl,57.91μmol)。反应介质于室温搅拌3h，并且然后以H2O(15mL)稀释，于室温搅拌10min并以DCM萃取(3 x 20mL)。合并的有机层经MgSO4干燥，过滤并浓缩得到83mg的化合物55，为白色固体(定量)。
化合物56：(2S)-2-氨基-N-((2S)-1-((4-((2R,3R)-3-((1S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)-3-甲基丁酰胺
在圆底烧瓶中，将哌啶(57.8μL,579.10μmol)添加至化合物55(64.73mg,57.91μmol)在DCM(10mL)中的溶液中。搅拌5h后，添加57.8μL的哌啶并且介质于室温搅拌过夜。反应介质经真空浓缩并在15g的硅胶(梯度DCM/MeOH/H2O)上纯化得到30mg的化合物56，为无色固体(58％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.86(d,J＝7.0Hz,3H)；0.82至0.90(m,15H)；1.00(s,3H)；1.03(d,J＝7.0Hz,3H)；1.19(s,3H)；1.24(d,J＝7.0Hz,3H)；1.34(d,J＝14.6Hz,1H)；1.66(宽峰m,2H)；1.80(m,1H)；1.91(m,1H)；1.98(dd,J＝10.2和14.6Hz,1H)；2.27(m,1H)；2.60(m,1H)；2.69(dd,J＝11.1和14.6Hz,1H)；2.91(dd,J＝2.0和7.7Hz,1H)；2.94(dd,J＝3.7和14.6Hz,1H)；2.99(d,J＝4.9Hz,1H)；3.43(m,1H)；3.80(s,3H)；3.91(d,J＝2.0Hz,1H)；4.03至4.12(m,2H)；4.29(d,J＝6.2Hz,2H)；4.34(m,1H)；5.03(m,1H)；5.89(dd,J＝1.8和15.6Hz,1H)；6.43(ddd,J＝4.8,10.9和15.6Hz,1H)；7.02(d,J＝8.6Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.2和8.6Hz,1H)；7.22(d,J＝8.4Hz,2H)；7.26(d,J＝8.4Hz,2H)；7.32(d,J＝2.2Hz,1H)；7.86(d,J＝8.4Hz,1H)；7.92(d,J＝7.2Hz,1H)；8.07(宽峰d,J＝7.9Hz,1H)；8.40(d,J＝7.3Hz,1H)；8.45(t,J＝6.2Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝448[M+2H]2+；m/z＝893[M-H]-；m/z＝895[M+H]+；m/z＝939[M-H+HCO2H]-；tR＝1.29min.
化合物57：5-(((2S)-1-(((2S)-1-((4-((2R,3R)-3-((1S)-1-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-5-氧代戊酸
在氩气下，在圆底烧瓶中，将戊二酸酐(4.29mg,36.85μmol)在DCM(2mL)中的溶液添加至化合物56(30mg,33.5μmol)在DCM(6mL)中的溶液。反应介质于室温搅拌2h，部分真空浓缩并在2.5g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)上纯化得到34mg的化合物57，为无色漆状物(定量)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.80至0.89(m,18H)；0.99(s,3H)；1.03(d,J＝7.0Hz,3H)；1.19(s,3H)；1.24(d,J＝7.0Hz,3H)；1.34(d,J＝14.6Hz,1H)；1.70(m,2H)；1.80(m,1H)；1.97(m,2H)；2.19(m,4H)；2.26(m,1H)；2.60(m,1H)；2.70(dd,J＝11.2和14.6Hz,1H)；2.90(dd,J＝2.2和7.8Hz,1H)；2.95(dd,J＝3.7和14.6Hz,1H)；3.43(m,1H)；3.80(s,3H)；3.91(d,J＝2.2Hz,1H)；4.03至4.18(m,3H)；4.22至4.33(m,3H)；5.03(m,1H)；5.90(d,J＝15.5Hz,1H)；6.43(ddd,J＝4.9,11.0和15.5Hz,1H)；7.02(d,J＝8.6Hz,1H)；7.19至7.28(m,5H)；7.32(d,J＝2.2Hz,1H)；7.85(宽峰d,J＝8.9Hz,2H)；7.91(d,J＝7.2Hz,1H)；8.06(宽峰d,J＝7.5Hz,1H)；8.36(宽峰t,J＝6.6Hz,1H)；8.42(d,J＝7.8Hz,1H)；12.10(宽峰m,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝1007[M-H]-；m/z＝1009[M+H]+；tR＝1.21min.
实施例13：5-(((2S)-1-(((2S)-1-((4-((2R,3R)-3-((1S)-1-((3S,10R,16S,E)- 10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三 氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3- 甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-5-氧代戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
在氩气下，在圆底烧瓶中，向化合物57(33mg,32.69μmol)在DCM(8mL)中的溶液添加DSC(11.72mg,45.76μmol)和DIEA(7.7μL,45.76μmol)。反应介质于室温搅拌1h，真空浓缩并通过两个连续的快速色谱在2.5g的硅胶(梯度洗脱DCM/iPrOH)上纯化得到17.9mg的实施例13，为无色固体(49％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.80至0.90(m,18H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.19(s,3H)；1.24(d,J＝7.0Hz,3H)；1.34(d,J＝14.6Hz,1H)；1.80(m,1H)；1.83(m,2H)；1.98(m,2H)；2.26(m,1H)；2.29(m,2H)；2.60(m,1H)；2.68(t,J＝7.5Hz,2H)；2.70(dd,J＝11.2和14.6Hz,1H)；2.80(s,4H)；2.91(dd,J＝2.2和7.6Hz,1H)；2.95(dd,J＝3.7和14.6Hz,1H)；3.43(m,1H)；3.80(s,3H)；3.90(d,J＝2.2Hz,1H)；4.06至4.15(m,2H)；4.18(dd,J＝6.9和8.7Hz,1H)；4.21至4.33(m,3H)；5.03(m,1H)；5.89(d,J＝15.5Hz,1H)；6.43(ddd,J＝4.9,10.9和15.5Hz,1H)；7.02(d,J＝8.7Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.3和8.7Hz,1H)；7.23(d,J＝8.4Hz,2H)；7.25(d,J＝8.4Hz,2H)；7.31(d,J＝2.3Hz,1H)；7.84(d,J＝8.6Hz,1H)；7.89(m,2H)；8.04(d,J＝7.5Hz,1H)；8.33(t,J＝6.5Hz,1H)；8.39(d,J＝7.6Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝796；m/z＝1104[M-H]-；m/z＝1106[M+H]+；m/z＝1150[M-H+HCO2H]-；tR＝1.26min.
实施例14：mAb-Ex13
先前描述的一般方法用来制备实施例14。60mg的hu2H11_R35-74与200μL的实施例13在DMA(5eq.)中的10.05mM溶液反应2h。此时，添加180μL的实施例13(4.5当量)的溶液并且介质搅拌2h。在Superdex 200pg上在缓冲液B pH 6.5+10％NMP中纯化后，在AmiconUltra-15上浓缩，在PD-10上在缓冲液B pH 6.5+5％NMP中缓冲液交换并在Steriflip过滤，得到46 mg的实施例14，为无色澄清溶液浓度为2 mg/mL，DAR为3.5(HRMS)，单体纯度为99.7％且整体收率为77％。
SEC-HRMS：图4中完整ADC的光谱；m/z＝149336(裸mAb)；m/z＝150328(D1)；m/z＝151319(D2)；m/z＝152311(D3)；m/z＝153302(D4)；m/z＝154295(D5)；m/z＝155290(D6)；m/z＝156282(D7)。
实施例15：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((S)-1-(3-(4-(羟基- 甲基)苯基)氧杂环丙烷-2-基)乙基)-3,6,6-三甲基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13- 烯-2,5,9,12-四酮
Figure BDA0001649098600002161
实施例15根据在方案2中描绘的并对于实施例4和11所描述的一般途径B进行制备。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：65/35非对映异构体混合物；0.93至1.26(m,12H)；1.75(m,0.65H)；1.83(m,0.35H)；2.22(m,0.65H)；2.41(m,0.35H)；2.55至2.70(m,2H)；2.81(d,J＝13.7Hz,0.65H)；2.88(d,J＝13.7Hz,0.35H)；2.93(dd,J＝2.1和8.2Hz,0.65H)；3.00(m,1.35H)；3.22至3.35(部分遮蔽的m,1H)；3.77(d,J＝2.1Hz,0.35H)；3.81(s,3H)；3.88(d,J＝2.1Hz,0.65H)；4.25至4.39(m,1.65H)；4.34(m,0.35H)；4.48(d,J＝6.0Hz,0.7H)；4.50(d,J＝6.0Hz,1.3H)；5.08(m,1H)；5.17(t,J＝6.0Hz,0.35H)；5.20(t,J＝6.0Hz,0.65H)；5.78(dd,J＝1.9和15.5Hz,0.65H)；5.89(dd,J＝1.9和15.5Hz,0.35H)；6.40(m,1H)；7.04(d,J＝8.7Hz,1H)；7.16(dd,J＝2.2和8.7Hz,0.65H)；7.19(dd,J＝2.2和8.7Hz,0.35H)；7.20至7.34(m,5H)；7.58(宽峰d,J＝10.2Hz,0.65H)；7.64(宽峰d,J＝10.2Hz,0.35H)；8.00(d,J＝8.4Hz,0.65H)；8.07(d,J＝8.4Hz,0.35H)；8.35(d,J＝8.3Hz,0.65H)；8.44(d,J＝8.3Hz,0.35H).LCMS(A1)：ES m/z＝654[M-H]-；m/z＝656[M+H]+；tR＝1.06min.
实施例16：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((S)-1-(3-(4-(羟基- 甲基)苯基)氧杂环丙烷-2-基)乙基)-6,6-二甲基-3-异丙基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十 六-13-烯-2,5,9,12-四酮
Figure BDA0001649098600002171
实施例16根据在方案2中描绘的并对于实施例4和11所描述的一般途径B进行制备。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：60/40非对映异构体混合物；0.72(d,J＝7.0Hz,1.8H)；0.82(d,J＝7.0Hz,1.2H)；0.84(d,J＝7.0Hz,1.8H)；0.87(d,J＝7.0Hz,1.2H)；0.98(s,1.8H)；0.99(d,J＝7.0Hz,1.8H)；1.01(s,1.2H)；1.05(d,J＝7.0Hz,1.2H)；1.09(s,1.8H)；1.11(s,1.2H)；1.82(m,1H)；1.91(m,0.6H)；2.01(m,0.4H)；2.30(m,1H)；2.52至2.72(m,2H)；2.88至3.04(m,3H)；3.25至3.35(掩蔽的m,1H)；3.79(d,J＝2.2Hz,0.4H)；3.80(s,3H)；3.88(d,J＝2.2Hz,0.6H)；4.09至4.21(m,2H)；4.48(d,J＝5.8Hz,0.8H)；4.50(d,J＝5.8Hz,1.2H)；5.14至5.29(m,2H)；5.79(dd,J＝1.7和15.4Hz,0.6H)；5.90(dd,J＝1.7和15.4Hz,0.4H)；6.40至6.52(m,1H)；7.05(d,J＝8.7Hz,1H)；7.10(dd,J＝2.0和10.2Hz,1H)；7.17(m,1H)；7.21至7.35(m,5H)；7.70(d,J＝9.3Hz,0.6H)；7.80(d,J＝9.3Hz,0.4H)；8.39(d,J＝8.0Hz,0.6H)；8.44(d,J＝8.0Hz,0.4H).LCMS(A1)：ES m/z＝682[M-H]-；m/z＝684[M+H]+；tR＝1.16min.
实施例17：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((S)-1-(3-(4-(羟基- 甲基)苯基)氧杂环丙烷-2-基)乙基)-3-叔丁基-6,6-二甲基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十 六-13-烯-2,5,9,12-四酮
Figure BDA0001649098600002181
实施例17根据在方案2中描绘的并对于实施例4和11所描述的一般途径B进行制备。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：50/50非对映异构体混合物；0.90(s,4.5H)；0.91(s,4.5H)；1.00(d,J＝7.0Hz,1.5H)；1.03(s,1.5H)；1.05(s,1.5H)；1.06(d,J＝7.0Hz,1.5H)；1.10(s,1.5H)；1.12(s,1.5H)；1.85(m,1H)；2.32(m,1H)；2.55至2.72(m,2H)；2.90至3.03(m,3H)；3.25至3.35(掩蔽的m,1H)；3.81(s,3H)；3.90(d,J＝2.2Hz,1H)；4.15(m,1H)；4.36(d,J＝10.0Hz,0.5H)；4.43(d,J＝10.0Hz,0.5H)；4.49(d,J＝5.9Hz,1H)；4.51(d,J＝5.9Hz,1H)；5.15(t,J＝5.9Hz,0,5H)；5.18(t,J＝5.9Hz,0.5H)；5.29(m,1H)；5.79(dd,J＝2.0和15.4Hz,0.5H)；5.90(d,J＝15.4Hz,0.5H)；6.39(m,1H)；6.91(dd,J＝2.5和10.4Hz,0.5H)；6.98(dd,J＝2.5和10.4Hz,0.5H)；7.05(split d,J＝8.7Hz,1H)；7.15(split dd,J＝2.4和8.7Hz,1H)；7.20至7.39(m,6H)；8.32(d,J＝7.9Hz,0.5H)；8.40(d,J＝7.9Hz,0.5H).LCMS(A4)：ES m/z＝696[M-H]-；m/z＝698[M+H]+；tR＝4.13-4.16min.
实施例18：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(氨基甲基)苯基)氧杂环 丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6,7-三甲基-1-氧杂-4,8,11-三 氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
Figure BDA0001649098600002182
实施例18根据在方案1中描绘的并对于实施例8描述的一般途径A制备。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.78(d,J＝7.0Hz,3H)；0.84(d,J＝7.0Hz,3H)；0.87(d,J＝7.0Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.03(d,J＝7.0Hz,3H)；1.19(s,3H)；1.30(m,1H)；1.50至1.90(m,5H)；2.28(m,1H)；2.55至2.76(m,2H)；2.90至3.00(m,2H)；3.48(m,1H)；3.70(s,2H)；3.80(s,3H)；3.89(s,1H)；4.02至4.15(m,2H)；5.06(m,1H)；5.88(d,J＝15.5Hz,1H)；6.47(m,1H)；7.03(d,J＝8.7Hz,1H)；7.20(m,3H)；7.31(m,3H)；7.80(d,J＝8.7Hz,1H)；7.89(d,J＝7.3Hz,1H)；8.41(d,J＝8.2Hz,1H).
实施例19：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10- (3-氯-4-甲氧基苄基)-3-异丁基-6,6,7-三甲基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮 杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲 基-1-氧代丁-2-基)氨基)-5-氧代戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0001649098600002191
实施例19如在方案3中描绘的以及对于实施例2,6,9和13所描述的制备。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.79(d,J＝7.0Hz,3H)；0.81至0.89(m,18H)；1.01(s,3H)；1.03(d,J＝7.0Hz,3H)；1.20(s,3H)；1.24(d,J＝7.0Hz,3H)；1.31(m,1H)；1.60至1.74(m,2H)；1.78至1.86(m,3H)；1.96(m,1H)；2.21至2.31(m,3H)；2.55至2.72(m,4H)；2.80(s,4H)；2.96(m,2H)；3.47(m,1H)；3.80(s,3H)；3.89(d,J＝2.2Hz,1H)；4.03至4.14(m,2H)；4.17(dd,J＝6.8和8.6Hz,1H)；4.21至4.33(m,3H)；5.06(m,1H)；5.89(d,J＝15.5Hz,1H)；6.47(ddd,J＝5.2,10.5和15.5Hz,1H)；7.02(d,J＝8.7Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.3和8.7Hz,1H)；7.23(m,4H)；7.32(d,J＝2.3Hz,1H)；7.80(d,J＝8.3Hz,1H)；7.89(m,2H)；8.04(d,J＝7.6Hz,1H)；8.32(t,J＝6.3Hz,1H)；8.42(d,J＝7.6Hz,1H).LCMS(A1)：ES m/z＝1092[M+H]+；m/z＝1136[M-H+HCO2H]-；tR＝1.23min.
实施例20：mAb-Ex19
Figure BDA0001649098600002201
实施例20以类似于实施例3,7,10和14的方式制备。得到45mg的实施例20，为无色澄清溶液，浓度为2.55mg/mL，DAR为4.4(HRMS)，单体纯度为99.1％和整体收率为78％。
SEC-HRMS：图5中完整ADC的光谱；m/z＝150368(D1)；m/z＝151350(D2)；m/z＝152327(D3)；m/z＝153304(D4)；m/z＝154281(D5)；m/z＝155255(D6)；m/z＝156237(D7)；m/z＝157217(D8)。
实施例21：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-(3-(4-(氨基甲基)苯基)氧杂环丙烷-2- 基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-7-环丙基-3-异丁基-6,6-二甲基-1-氧杂-4,8,11-三 氮杂环-十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
Figure BDA0001649098600002202
实施例21根据在方案1中描绘的和对实施例1和8描述的一般途径A来制备。
实施例22：5-(((S)-1-(((S)-1-((4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,10R,16S,E)-10- (3-氯-4-甲氧基苄基)-7-环丙基-3-异丁基-6,6-二甲基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8, 11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨 基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基)-5-氧代戊酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
Figure BDA0001649098600002211
实施例22如在方案3描述的和对实施例2,6,9和13所描述的制备。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.34(m,1H)；0.66(m,1H)；0.74(d,J＝7.0Hz,3H)；0.76(d,J＝7.0Hz,3H)；0.78(s,3H)；0.80(m,1H)；0.82(d,J＝7.0Hz,3H)；0.85(d,J＝7.0Hz,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.08(s,3H)；1.11(m,1H)；1.20(m,1H)；1.23(d,J＝7.0Hz,3H)；1.43至1.54(m,2H)；1.78(m,1H)；1.82(m,2H)；1.98(m,1H)；2.22(m,1H)；2.28(m,2H)；2.65(m,3H)；2.79(m,1H)；2.81(s,4H)；2.97(dd,J＝2.2和7.9Hz,1H)；3.80(s,3H)；3.89(d,J＝2.2Hz,1H)；4.02(m,1H)；4.17(dd,J＝6.7和8.7Hz,1H)；4.27(d,J＝6.3Hz,2H)；4.30(m,1H)；4.37(m,1H)；5.10(m,1H)；5.79(dd,J＝1.8和15.5Hz,1H)；6.39(ddd,J＝4.0,11.6和15.5Hz,1H)；7.02(d,J＝8.7Hz,1H)；7.11(dd,J＝2.3和8.7Hz,1H)；7.20(d,J＝2.3Hz,1H)；7.22(m,4H)；7.46(s,1H)；7.77(d,J＝9.0Hz,1H)；7.89(d,J＝8.6Hz,1H)；8.05(d,J＝7.5Hz,1H)；8.29(d,J＝7.6Hz,1H)；8.32(t,J＝6.3Hz,1H).
实施例23：mAb-Ex22
Figure BDA0001649098600002212
实施例23以类似于实施例3、7、10和14的方式制备。得到45mg的实施例23，为无色澄清溶液，浓度为2.14mg/mL，DAR为3.6(HRMS)，单体纯度为100％且整体收率为75％。
SEC-HRMS：图6中的完整ADC的光谱；m/z＝150341(D1)；m/z＝151329(D2)；m/z＝152317(D3)；m/z＝153308(D4)；m/z＝154296(D5)；m/z＝155287(D6)；m/z＝156279(D7)；m/z＝157267(D8)。
实施例24：(3S,7S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(叠氮基甲基)苯基) 氧杂环丙烷-2-基)-乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧杂-4, 8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
Figure BDA0001649098600002221
实施例24根据在方案3中描绘的和对实施例32描述的一般途径C制备。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.83(s,9H)；0.88(d,J＝6.8Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.03(d,J＝7,1Hz,3H)；1.19(s,3H)；1.33(d,J＝14.5Hz,1H)；1.84(m,1H)；1.97(dd,J＝9.8和14.5Hz,1H)；2.27(dd,J＝11.1和14.5Hz,1H)；2.61(m,1H)；2.69(dd,J＝11.1和14.2Hz,1H)；2.92(dd,J＝2.1和7.7Hz,1H)；2.96(dd,J＝3.6和14.2Hz,1H)；3.43(m,1H)；3.80(s,3H)；3.96(d,J＝2.1Hz,1H)；4.08(ddd,J＝3.6,7.1和11.1Hz,1H)；4.12(m,1H)；4.46(s,2H)；5.05(ddd,J＝1.3,3.9和11.3Hz,1H)；5.90(dd,J＝1.3和15.3Hz,1H)；6.45(ddd,J＝4.7,10.7和15.3Hz,1H)；7.02(d,J＝8.7Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.4和8.7Hz,1H)；7.32(m,3H)；7.40(d,J＝8.4Hz,2H)；7.88(d,J＝8.4Hz,1H)；7.92(d,J＝7.1Hz,1H)；8.40(d,J＝7.4Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝749[M-H]-；m/z＝751[M+H]+；m/z＝795[M-H+HCO2H]-；tR＝1.52min.
实施例25：(3S,7S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(氨基甲基)苯基)氧 杂环丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧杂-4,8, 11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
Figure BDA0001649098600002231
实施例25如对于实施例1,5,8和11中所描述的制备。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.86(s,9H)；0.88(d,J＝6.9Hz,3H)；0.98(s,3H)；1.02(d,J＝7.1Hz,3H)；1.18(s,3H)；1.34(d,J＝14.5Hz,1H)；1.80(m,1H)；1.98(dd,J＝9.8和14.5Hz,1H)；2.27(dd,J＝11.1和14.5Hz,1H)；2.40(宽峰m,2H)；2.62(m,1H)；2.68(dd,J＝11.1和14.2Hz,1H)；2.90(dd,J＝2.1和7.7Hz,1H)；2.96(dd,J＝3.6和14.2Hz,1H)；3.43(m,1H)；3.76(s,2H)；3.80(s,3H)；3.91(d,J＝2.1Hz,1H)；4.02至4.15(m,2H)；5.04(ddd,J＝1.3,3.9和11.3Hz,1H)；5.88(dd,J＝1.3和15.4Hz,1H)；6.45(ddd,J＝4.7,10.7和15.3Hz,1H)；7.03(d,J＝8.5Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.2和8.5Hz,1H)；7.23(d,J＝8.3Hz,2H)；7.32(d,J＝2.2Hz,2H)；7.36(d,J＝8.3Hz,2H)；7.86(d,J＝8.3Hz,1H)；7.93(d,J＝6.9Hz,1H)；8.40(d,J＝7.1Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝723[M-H]-；m/z＝725[M+H]+；m/z＝769[M-H+HCO2H]-；tR＝0.87min.
合成实施例26至28：3-(S)-新戊基-7-(S)-Me-氮杂-C52苄醇,戊二酰基-Val-Ala- EDA-3-(S)-新戊基-7-(S)-Me-氮杂-C52苄醇的NHS酯和对应的ADC
Figure BDA0001649098600002241
Figure BDA0001649098600002251
化合物58：(2R,3S)-1-((4-甲氧基苄基)氧基)-2-甲基己-5-烯-3-基(S)-2-((S)-3-((R)-2-丙烯酰胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙酰胺基)-2,2-二甲基丁酰胺基)-4,4-二甲基戊酸酯
向化合物BC4(365mg,919.7μmol)在DMF(12mL)中的溶液添加HATU(402mg,1.06mmol)和HOAt(144mg,1.06mmol)，反应介质于室温搅拌30min，然后添加化合物AD3(365mg,965.7μmol)在DMF(5mL)和DIEA(562μL,3.22mmol)中的溶液。反应介质于室温搅拌4h，然后以H2O(50mL)稀释并以EtOAc(3 x 50mL)萃取。合并的有机相以H2O(15mL)、饱和盐水(3 x 15mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过两个连续快速色谱在30g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH和庚烷/EtOAc)上纯化得到564mg的化合物58，为无色泡沫(81％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.83(d,J＝6.9Hz,3H)；0.85(s,9H)；0.87(d,J＝6.9Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.03(s,3H)；1.55(dd,J＝2.4和14.5Hz,1H)；1.78(dd,J＝9.5和14.5Hz,1H)；1.96(m,1H)；2.20(m,1H)；2.30(m,1H)；2.72(dd,J＝9.6和13.9Hz,1H)；2.87(dd,J＝5.3和13.9Hz,1H)；3.20(dd,J＝6.5和9.5Hz,1H)；3.37(dd,J＝5.4和9.5Hz,1H)；3.76(s,3H)；3.80(s,3H)；4.19(m,1H)；4.28(m,1H)；4.34(s,2H)；4.55(m,1H)；4.82(m,1H)；5.00(d,J＝10.2Hz,1H)；5.07(d,J＝17.4Hz,1H)；5.55(dd,J＝2.3和10.2Hz,1H)；5.71(m,1H)；6.01(dd,J＝2.3和17.1Hz,1H)；6.28(dd,J＝10.2和17.1Hz,1H)；6.90(d,J＝8.7Hz,2H)；7.02(d,J＝8.6Hz,1H)；7.17(dd,J＝2.3和8.6Hz,1H)；7.22(d,J＝8.7Hz,2H)；7.32(d,J＝2.3Hz,1H)；7.65(d,J＝9.5Hz,1H)；7.70(d,J＝7.9Hz,1H)；8.35(d,J＝8.4Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝754[M-H]-；m/z＝756[M+H]+；m/z＝800[M-H+HCO2H]-；tR＝1.62min.
化合物59：(3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((R)-1-((4-甲氧基-苄基)氧基)丙-2-基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
向化合物58(560mg,740.4μmol)在DCM(56mL)中的溶液在Ar下添加Grubbs I催化剂(31.0mg,37.02μmol)。反应介质于室温搅拌1h 30，然后添加31.0mg的催化剂。室温持续搅拌1h 30，然后添加31.0mg的催化剂。室温持续搅拌1h 30，然后添加31.0mg的催化剂，反应介质于室温搅拌1h 30，真空浓缩并通过快速色谱在25g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到330mg的化合物59(61％)，并且220mg通过快速色谱在15g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上进一步纯化得到204mg的化合物59(37％)，为与三环己基氧化膦的混合物。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.85(s,9H)；0.88(d,J＝6.9Hz,3H)；0.91(d,J＝7.1Hz,3H)；1.04(s,3H)；1.20(s,3H)；1.29(d,J＝14.5Hz,1H)；1.95(dd,J＝9.8和14.5Hz,1H)；1.99(m,1H)；2.26(m,1H)；2.43(m,1H)；2.72(dd,J＝10.1和14.3Hz,1H)；2.97(dd,J＝3.6和14.3Hz,1H)；3.27(dd,J＝6.1和9.3Hz,1H)；3.40(dd,J＝5.8和9.3Hz,1H)；3.46(m,1H)；3.72(s,3H)；3.80(s,3H)；4.10(m,1H)；4.13(m,1H)；4.38(s,2H)；4.97(m,1H)；5.93(d,J＝15.4Hz,1H)；6.43(ddd,J＝4.8,10.7和15.4Hz,1H)；6.90(d,J＝8.7Hz,2H)；7.02(d,J＝8.6Hz,1H)；7.17(d,J＝8.6Hz,3H)；7.36(d,J＝2.3Hz,1H)；7.88(m,2H)；8.48(d,J＝7.5Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝726[M-H]-；m/z＝728[M+H]+；m/z＝772[M-H+HCO2H]-；tR＝1.54min.
化合物60：(3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((R)-1-羟基丙-2-基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
化合物59(532mg,730.4μmol)以TFA(3.93mL)在DCM(36mL)中的溶液于室温处理30min。在磁力搅拌下，将反应介质倾倒至9％NaHCO3水溶液(130mL)。持续搅拌30min然后水相以以DCM萃取(2 x 70mL)。合并的有机相以H2O(3 x 20mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在30g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到299mg的化合物60，为白色泡沫(67％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.88(d,J＝6.9Hz,3H)；0.89(s,9H)；0.90(d,J＝7.0Hz,3H)1.03(s,3H)；1.20(s,3H)；1.36(dd,J＝1.8和14.5Hz,1H)；1.80(m,1H)；1.96(dd,J＝9.6和14.5Hz,1H)；2.25(m,1H)；2.43(m,1H)；2.72(dd,J＝11.1和14.3Hz,1H)；2.97(dd,J＝3.8和14.3Hz,1H)；3.25(m,1H)；3.45(m,2H)；3.80(s,3H)；4.10(m,1H)；4.16(m,1H)；4.57(t,J＝5.3Hz,1H)；4.98(m,1H)；5.93(dd,J＝1.3和15.3Hz,1H)；6.45(ddd,J＝4.9,10.7和15.3Hz,1H)；7.02(d,J＝8.6Hz,1H)；7.22(dd,J＝2.3和8.6Hz,1H)；7.36(d,J＝2.3Hz,1H)；7.89(m,2H)；8.48(d,J＝7.3Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝606[M-H]-；m/z＝608[M+H]+；tR＝1.2min.
化合物61：(S)-2-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)丙醛
向化合物60(297mg,488.4μmol)在DCM(6mL)(以冰/丙酮浴冷却)中的溶液于0℃添加KBr(58.11mg,488.4μmol)在H2O(1.18mL)中的溶液和TEMPO(1.57mg,9.8μmol)，并滴加1.56M次氯酸钠的水溶液pH 9.5(467.6μL,732.52μmol)。于0℃持续搅拌15min，然后于0℃添加饱和Na2S2O3(3.56mL)，除去冰浴并且反应介质搅拌10min。其然后以DCM萃取(3 x25mL)，合并的有机相以H2O(2 x 10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在15g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到139mg的化合物61，为白色漆状物(47％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.85(s,9H)；0.90(d,J＝7.0Hz,3H)；1.03(s,3H)；1.04(d,J＝6.9Hz,3H)；1.20(s,3H)；1.26(d,J＝15.3Hz,1H)；1.95(m,1H)；2.44(m,1H)；2.57(m,1H)；2.72(dd,J＝11.2和14.4Hz,1H)；2.80(m,1H)；2.98(dd,J＝3.1和14.4Hz,1H)；3.80(s,3H)；4.10(m,3H)；5.22(m,1H)；5.98(d,J＝15.3Hz,1H)；6.47(ddd,J＝4.9,10.8和15.3Hz,1H)；7.04(d,J＝8.7Hz,1H)；7.22(dd,J＝2.3和8.7Hz,1H)；7.37(s,1H)；7.90(m,1H)；7.92(d,J＝8.2Hz,1H)；8.53(d,J＝7.6Hz,1H)；9.68(s,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝604[M-H]-；m/z＝606[M+H]+；m/z＝650[M-H+HCO2H]-；tR＝1.28min.
化合物62：(4-(((三异丙基甲硅烷基)氧基)甲基)苯基)甲醇
向1,4-苯二甲醇(2g,14.33mmol)在THF(100mL)中的溶液添加咪唑(1.13g,16.48mmol)。反应介质于室温搅拌15min，然后添加三异丙基甲硅烷氯(3.14mL,14.33mmol)并于室温继续搅拌过夜。将Et2O(50mL)添加至反应混合物并有机相以饱和盐水(100mL)洗涤两次，经MgSO4过滤，真空浓缩，溶解在DCM中，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在200g的硅胶(等度洗脱8:2庚烷/EtOAc)上纯化得到1.9g的化合物62，为无色油状物(45％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：1.04(d,J＝6,7Hz,18H)；1.15(m,3H)；4.48(d,J＝5.7Hz,2H)；4.78(s,2H)；5.13(t,J＝5.7Hz,1H)；7.29(s,4H).
化合物63：((4-(溴甲基)苄基)氧基)三异丙基硅烷
向N-溴代琥珀酰亚胺(1.29g,7.16mmol)在DCM(65mL)(冷却在0℃)中的悬浮液滴加二甲基硫醚(953μL,12.9mmol)。于0℃持续搅拌10min然后反应介质于-20℃冷却并于-20℃搅拌10min。然后滴加化合物62(1.9g,6.45mmol)在DCM(30mL)(冷却在-20℃)中的溶液。于-20℃持续搅拌15min，然后于0℃搅拌15min并于室温搅拌过夜。反应介质以饱和盐水(100mL)洗涤两次，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过两个连续的快速色谱在40g的硅胶(梯度洗脱庚烷/EtOAc)上纯化。合并各含有期望化合物的各级分，真空浓缩并溶解在庚烷(8mL)中。过滤悬浮液，滤液经真空浓缩，溶解在Et2O(5mL)(冷却在-20℃)中，过滤，真空浓缩得到1.18g的化合物63，为淡黄色油状物(51％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：1.04(d,J＝6,8Hz,18H)；1.15(m,3H)；4.70(s,2H)；4.81(s,2H)；7.29(d,J＝8.4Hz,2H)；7.41(d,J＝8.4Hz,2H).LCMS(A5)：ES m/z＝104；m/z＝356[M]+；tR＝1.99min.
化合物64：(1R,4S,5R,6S)-4,7,7-三甲基-6-(4-(((三异丙基甲硅烷基)氧基)甲基)苄基)-6-硫杂双环[3.2.1]辛烷-6-三氟甲磺酸酯
向(1R,4R,5R)-4,7,7-三甲基-6-硫杂双环[3.2.1]辛烷(CAS号[5718-75-2],562.3mg,3.3mmol)中添加化合物63(1.18g,3.3mmol)在DCM(3.4mL)中的溶液。然后滴加三氟甲磺酸锂(2.63g,16.51mmol)在H2O(3mL)中的溶液并且反应介质于室温搅拌过夜。然后将H2O(15mL)和DCM(15mL)添加至反应介质并于室温持续搅拌10min。水相以DCM萃取(3 x20mL)，合并的有机相以饱和盐水洗涤(3 x 8mL)，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。淡黄色油状物在iPr2O(5mL)研磨，由此得到的固体经过滤，以iPr2O(2 x 5mL)洗涤并真空干燥得到1.125g的化合物64，为白色固体(57％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：1.04(m,21H)；1.15(m,3H)；1.45(m,1H)；1.60(m,2H)；1.68(s,3H)；1.71(m,1H)；1.74(s,3H)；1,98(m,1H)；2.40(d,J＝14.6Hz,1H)；2.45(m,1H)；2.58(宽峰d,J＝14.6Hz,1H)；3.85(m,1H)；4.56(d,J＝12.6Hz,1H)；4.83(s,2H)；4.90(d,J＝12.6Hz,1H)；7.44(d,J＝8.4Hz,2H)；7.57(d,J＝8.4Hz,2H).
化合物65：(3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(((三异丙基甲硅烷基)氧基)甲基)苯基)氧杂环丙烷-2-基)乙基)-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
向化合物61(138mg,227.7μmol)和64(149.5mg,250.4μmol)在DCM(4mL)(冷却在-70℃)中的溶液滴加BEMP(CAS号[98015-45-3],90.2μL,296.0μmol)。反应混合物于-70℃搅拌2h，将饱和盐水(7mL)添加至反应混合物，除去浴并持续剧烈搅拌直到室温。水相以DCM萃取(3 x 20mL)，合并的有机相经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在10g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到163mg的化合物65，为无色油状物(30％)和60mg的化合物61(43％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.84(s,9H)；0.88(d,J＝6.9Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.05(d,J＝7.3Hz,18H)；1.15(m,3H)；1.19(s,3H)；1.32(d,J＝14.8Hz,1H)；1.82(m,1H)；1.97(dd,J＝9.9和14.8Hz,1H)；2.28(dt,J＝11.1和14.9Hz,1H)；2.61(m,1H)；2.69(dd,J＝11.2和14.3Hz,1H)；2.91(dd,J＝2.2和7.6Hz,1H)；2.95(dd,J＝3.8和14.3Hz,1H)；3.43(m,1H)；3.80(s,3H)；3.91(d,J＝2.2Hz,1H)；4.08(ddd,J＝3.8,7.4和11.2Hz,1H)；4.12(m,1H)；4.81(s,2H)；5.04(ddd,J＝1.5,4.5和11.1Hz,1H)；5.89(dd,J＝1.5和15.2Hz,1H)；6.44(ddd,J＝4.5,10.6和15.2(d,J＝2.3Hz,1H)；7.36(d,J＝8.4Hz,2H)；7.88(d,J＝8.4Hz,1H)；7.91(d,J＝7.1Hz,1H)；8.39(d,J＝7.4Hz,1H).LCMS(A4)：ESm/z＝120；m/z＝882[M+H]+；tR＝7.65min.
实施例26：(3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(羟基甲基)苯基)氧杂环丙烷-2-基)乙基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
向化合物65在冷却在0℃的THF中的溶液添加TBAF。反应介质于0℃搅拌1h 30，然后添加H2O(5mL)并继续搅拌20min。反应介质以DCM萃取(3 x 20mL),合并的有机相以饱和盐水(3 x 5mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在15g的硅胶(梯度洗脱EtOAc/MeOH/H2O)上纯化得到69mg的实施例26，为白色漆状物(91％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.85(s,9H)；0.89(d,J＝6.9Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.19(s,3H)；1.35(d,J＝14.8Hz,1H)；1.80(m,1H)；1.99(dd,J＝9.9和14.8Hz,1H)；2.27(dt,J＝11.1和14.9Hz,1H)；2.61(m,1H)；2.69(dd,J＝11.2和14.3Hz,1H)；2.90(dd,J＝2.2和7.6Hz,1H)；2.95(dd,J＝3.8和14.3Hz,1H)；3.43(m,1H)；3.80(s,3H)；3.91(d,J＝2.2Hz,1H)；4.06至4.15(m,2H)；4.50(d,J＝5.9Hz,2H)；5.03(dd,J＝1.5,3.7和11.5Hz,1H)；5.20(t,J＝5.9Hz,1H)；5.89(dd,J＝1.5和15.3Hz,1H)；6.43(ddd,J＝4.6,10.7和15.3Hz,1H)；7.02(d,J＝8.6Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.2和8.6Hz,1H)；7.23(d,J＝8.3Hz,2H)；7.32(m,3H)；7.87(d,J＝8.3Hz,1H)；7.92(d,J＝7.0Hz,1H)；8.40(d,J＝7.4Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝724[M-H]-；m/z＝726[M+H]+；m/z＝770[M-H+HCO2H]-；tR＝1.29min.
化合物66：4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基(4-硝基苯基)碳酸酯
向实施例26(68mg,93.6μmol)在DCM(5mL)中的溶液添加双(4-硝基苯基)碳酸酯(118.7mg,374.5μmol)并滴加DIEA(49μL,281.0μmol)。反应介质于室温搅拌6天，然后添加饱和盐水，并且其以DCM萃取(3 x 10mL)。合并的有机相经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在5g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到79mg的化合物66，为白色漆状物(94％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.85(s,9H)；0.89(d,J＝6.9Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.05(d,J＝7.1Hz,3H)；1.19(s,3H)；1.34(d,J＝14.6Hz,1H)；1.83(m,1H)；1.97(dd,J＝9.9和14.6Hz,1H)；2.28(dt,J＝11.1和14.9Hz,1H)；2.61(m,1H)；2.69(dd,J＝11.2和14.3Hz,1H)；2.93(m,2H)；3.42(m,1H)；3.79(s,3H)；3.99(d,J＝2.2Hz,1H)；4.09(m,2H)；5.05(dd,J＝1.3,4.0和11.1Hz,1H)；5.31(s,2H)；5.89(dd,J＝1.3和15.3Hz,1H)；6.47(ddd,J＝4.8,10.8和15.3Hz,1H)；7.01(d,J＝8.6Hz,1H)；7.21(dd,J＝2.2和8.6Hz,1H)；7.31(d,J＝2.2Hz,1H)；7.36(d,J＝8.5Hz,2H)；7.50(d,J＝8.5Hz,2H)；7.59(d,J＝9.3Hz,2H)；7.87(d,J＝8.3Hz,1H)；7.92(d,J＝7.0Hz,1H)；8.32(d,J＝9.3Hz,2H)；8.39(d,J＝7.4Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝889[M-H]-；m/z＝891[M+H]+；m/z＝935[M-H+HCO2H]-；tR＝1.55min.
化合物67：((S)-1-(((S)-1-((2-NBoc-氨基乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯盐酸盐
向Fmoc-Val-Ala-OH(3.5g,8.53mmol)在DCM(100mL)中的悬浮液添加TEA(3.6mL,25.58mL)(导致原料的完全溶解)、N-Boc-EDA(1.62mL,10.23mmol)和丙基膦酸酐(6.51g,10.23mmol)50％在DCM中的溶液。反应介质于室温搅拌3h，然后添加1N NaOH(50mL)，并且过滤悬浮液，以H2O和DCM洗涤。滤液的有机相以H2O洗涤。滤饼和有机相合并，部分真空浓缩，过滤，以DCM洗涤并干燥得到3.952g的化合物67，为白色粉末(84％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.84(d,J＝7.0Hz,3H)；0.86(d,J＝7.0Hz,3H)；1.19(d,J＝7.1Hz,3H)；1.37(s,9H)；1.99(m,1H)；2.92至3.14(m,4H)；3.88(dd,J＝6.9和9.1Hz,1H)；4.19至4.35(m,4H)；6.71(m,1H)；7.32(m,2H)；7.38(m,1H)；7.42(m,2H)；7.73(m,2H)；7.84(t,J＝6.8Hz,1H)；7.89(d,J＝7.8Hz,2H)；7.92(d,J＝7.8Hz,1H).
化合物68：((S)-1-(((S)-1-((2-氨基乙基)氨基)-1-氧代丙-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸(9H-芴-9-基)甲基酯盐酸盐
向化合物67(100mg,159.5μmol)在二噁烷(3mL)中的悬浮液添加在二噁烷(905μL,3.62mmol)中的HCl 4N。反应介质于室温搅拌20h，然后真空浓缩。粗产物重悬于iPr2O(3mL)，浸没在超声浴中并过滤。由此得到的滤饼以iPr2O(2 x 3mL)洗涤并真空干燥得到78mg的化合物68，为白色固体(88％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.85(d,J＝6.9Hz,3H)；0.87(d,J＝6.9Hz,3H)；1.23(d,J＝7.1Hz,3H)；1.99(m,1H)；2,83(m,2H)；3.29(m,2H)；3.89(dd,J＝6.9和8.9Hz,1H)；4.19至4.38(m,4H)；7.33(m,2H)；7.42(m,3H)；7.75(m,2H)；7.88(宽峰s,3H)；7.90(d,J＝7.6Hz,2H)；8.08(d,J＝7.3Hz,1H)；8.14(d,J＝5.9Hz,1H).
化合物69：(2-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)丙酰胺基)乙基)氨基甲酸4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基酯
向化合物66(78mg,87.5μmol)和68(51.4mg,105.0μmol)在DCM中的悬浮液添加DIEA(44.0μL,262.5μmol)。反应介质于室温搅拌过夜，然后添加化合物68(24mg,49μoml)和DIEA(15μL)并于室温继续搅拌1天。添加哌啶(87.0μL,875.0μmol)并于室温持续搅拌过夜。反应介质经真空浓缩并通过两个连续的快速色谱在5g的硅胶(梯度洗脱EtOAc/MeOH/H2O)上纯化得到57mg的化合物69，为白色漆状物(66％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.75(d,J＝7.0Hz,3H)；0.85(s,9H)；0.86(d,J＝7.0Hz,3H)；0.87(d,J＝6.7Hz,3H)；0.99(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.18(m,6H)；1.33(d,J＝14.5Hz,1H)；1.75(宽峰s,2H)；1.81(m,1H)；1.92(m,1H)；1.98(dd,J＝10.0和14.5Hz,1H)；2.28(m,1H)；2.61(m,1H)；2.69(dd,J＝11.3和14.7Hz,1H)；2.90(dd,J＝2.0和7.5Hz,1H)；2.96(m,1H)；2.98(d,J＝4.7Hz,1H)；3.05(m,2H)；3.12(m,2H)；3.43(m,1H)；3.81(s,3H)；3.93(d,J＝2.0Hz,1H)；4.09(m,2H)；4.26(m,1H)；5.01(s,2H)；5.04(m,1H)；5.89(dd,J＝1.5和15.2Hz,1H)；6.45(ddd,J＝4.5,10.4和15.2Hz,1H)；7.02(d,J＝8.8Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.4和8.8Hz,1H)；7.26(t,J＝6.0Hz,1H)；7.29(d,J＝8.4Hz,2H)；7.32(d,J＝2.5Hz,1H)；7.37(d,J＝8.4Hz,2H)；7.88(d,J＝8.4Hz,1H)；7.93(d,J＝7.1Hz,1H)；8.00(t,J＝6.0Hz,1H)；8.03(d,J＝8.1Hz,1H)；8.41(d,J＝7.2Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝492[M+2H]2+；m/z＝980[M-H]-；m/z＝982[M+H]+；m/z＝1026[M-H+HCO2H]-；tR＝0.91min.
化合物70：(9S,12S)-1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基-苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苯基)-12-异丙基-9-甲基-3,8,11,14-四氧代-2-氧杂-4,7,10,13-四氮杂十八烷-18-酸
向化合物69(56.0mg,56.8μL)在DCM(8mL)中的溶液添加戊二酸酐(7.27mg,62.5μmol)在DCM(4mL)中的溶液。反应介质于室温搅拌2h，真空浓缩并通过快速色谱在5g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)上纯化得到35.5mg的化合物70，为白色漆状物(56％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.81(d,J＝7.0Hz,3H)；0.83(d,J＝7.0Hz,3H)；0.85(s,9H)；0.87(d,J＝6.5Hz,3H)；0.99(s,3H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.19(m,6H)；1.32(d,J＝14.3Hz,1H)；1.70(m,2H)；1.81(m,1H)；1.92(m,1H)；1.98(m,2H)；2.15(m,2H)；2.19(t,J＝7.5Hz,2H)；2.27(m,1H)；2.61(m,1H)；2.69(dd,J＝11.1和14.1Hz,1H)；2.91(d,J＝7.6Hz,1H)；2.95(m,1H)；3.04(m,2H)；3.10(m,2H)；3.41(m,1H)；3.80(s,3H)；3.93(s,1H)；4.03至4.16(m,3H)；4.19(m,1H)；5.01(s,2H)；5.04(m,1H)；5.89(d,J＝15.6Hz,1H)；6.43(ddd,J＝5.3,11.0和15.6Hz,1H)；7.02(d,J＝8.7Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.3和8.7Hz,1H)；7.28(d,J＝8.4Hz,2H)；7.30(m,1H)；7,32(d,J＝2.3Hz,1H)；7.36(d,J＝8.4Hz,2H)；7.88(m,2H)；7.93(d,J＝7.4Hz,1H)；7.98(宽峰s,1H)；8.06(宽峰s,1H)；8.42(d,J＝7.4Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝549[M+2H]2+；m/z＝1094[M-H]-；m/z＝1096[M+H]+；tR＝1.21min.
实施例27：(9S,12S)-1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环-十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苯基)-12-异丙基-9-甲基-3,8,11,14-四氧代-2-氧杂-4,7,10,13-四氮杂十八烷-18-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
向化合物70(14.6mg,13.3μmol)在DCM(5mL)中的溶液在Ar下添加DSC(4.3mg,16.0μmol)和DIEA(2.8μL,16.0μmol)。反应介质于室温搅拌3h，然后添加DSC(1.5mg,5.6μmol)和DIEA(1μL,5.7μmol)并于室温继续搅拌1h。反应介质经真空浓缩并通过快速色谱在16.4g的二醇修饰的硅胶(梯度洗脱DCM/iPrOH)上纯化得到11.4mg的实施例27，为白色漆状物(72％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.81(d,J＝7.0Hz,3H)；0.83(d,J＝7.0Hz,3H)；0.85(s,9H)；0.88(d,J＝6.5Hz,3H)；0.99(s,3H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.19(m,6H)；1.34(d,J＝14.4Hz,1H)；1.83(m,3H)；1.98(m,2H)；2.26(m,1H)；2.29(m,2H)；2.60(m,1H)；2.68(t,J＝7.6Hz,2H)；2.70(dd,J＝11.2和14.3Hz,1H)；2.80(s,4H)；2.91(dd,J＝2.3和7.6Hz,1H)；2.95(dd,J＝3.7和14.3Hz,1H)；2.99至3.20(m,4H)；3.43(m,1H)；3.80(s,3H)；3.93(d,J＝2.2Hz,1H)；4.05至4.25(m,4H)；5.01(m,2H)；5.03(m,1H)；5.89(dd,J＝1.6和15.4Hz,1H)；6.44(ddd,J＝4.6,10.9和15.4Hz,1H)；7.02(d,J＝8.5Hz,1H)；7.20(m,2H)；7.28(d,J＝8.5Hz,2H)；7.31(d,J＝2.3Hz,1H)；7.37(d,J＝8.5Hz,2H)；7.86(m,3H)；7.91(d,J＝7.1Hz,1H)；7.95(d,J＝7.6Hz,1H)；8.39(d,J＝7.3Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝311；m/z＝1191[M-H]-；m/z＝1193[M+H]+；m/z＝1237[M-H+HCO2H]-；tR＝1.26min.
实施例28：mAb-Ex27
实施例28以类似于实施例3,7,10和14的方式制备。得到1.56mg的实施例28，为无色清澈溶液，浓度为0.78mg/mL，DAR为4(HRMS)，单聚体纯度为100％，整体收率为13％。
SEC-HRMS：m/z＝149405(裸mAb)；m/z＝150486(D1)；m/z＝151568(D2)；m/z＝152645(D3)；m/z＝153725(D4)；m/z＝154802(D5)；m/z＝155882(D6)；m/z＝156961(D7)；m/z＝158039(D8)。
合成实施例29：马来酰亚胺基-mc-vc-PABA-3-(S)-新戊基-7-(S)-Me-氮杂-C52苄 胺
Figure BDA0001649098600002361
化合物71：(4-硝基苯基)碳酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基酯
化合物72如Verma V.A.,et al.,in Bioorg Med Chem Lett 2015,25,864-868描述的制备。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.83(d,J＝7.0Hz,3H)；0.87(d,J＝7.0Hz,3H)；1.18(m,2H)；1.31至1.75(m,8H)；1.96(m,1H)；2.10(m,1H)；2.18(m,1H)；2.96(m,1H)；3.01(m,1H)；3.37(t,J＝7.2Hz,2H)；4.19(dd,J＝7.0和8.6Hz,1H)；4.38(m,1H)；5.24(s,2H)；5.42(s,2H)；5.98(t,J＝6.0Hz,1H)；7.00(s,2H)；7.40(d,J＝8.7Hz,2H)；7.57(d,J＝9.2Hz,2H)；7.66(d,J＝8.7Hz,2H)；7.81(d,J＝8.6Hz,1H)；8.12(d,J＝7.9Hz,1H)；8.31(d,J＝9.2Hz,2H)；10.08(s,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝738[M+H]+；m/z＝782[M-H+HCO2H]-；tR＝1.1min.
实施例29：(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)氨基甲酸4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰胺基)-3-甲基-丁酰胺基)-5-脲基戊酰胺基)苄基酯
向化合物71(16.0mg,21.7μmol)中添加实施例25(14.3mg,19.7μmol)在DCM(2.5mL)和DIEA(3.4μL,19.7μmol)中的溶液。反应介质于室温搅拌过夜，然后添加DMF(1mL)并于室温继续搅拌1天。H2O(8mL)添加至反应介质，继续搅拌15min，然后水相以DCM萃取(3x 10mL)。合并的有机相经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，与甲苯共蒸发两次并通过快速色谱在5g硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到15.8mg的实施例29，为白色固体(60％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.81(d,J＝7.0Hz,3H)；0.85(d,J＝7.0Hz,3H)；0.86(s,9H)；0.89(d,J＝6.8Hz,3H)；0.99(s,3H)；1.04(d,J＝7.0Hz,3H)；1.18(s,3H)；1.19(m,2H)；1.31至1.75(m,9H)；1.80(m,1H)；1,96(m,2H)2.10(m,1H)；2.18(m,1H)；2,27(m,1H)；2.61(m,1H)；2,69(dd,J＝10.8和14.3Hz,1H)；2,90(dd,J＝2.1和7.6Hz,1H)；2.96(m,2H)；3.01(m,1H)；3.37(t,J＝7.2Hz,2H)；3.42(m,1H)；3.80(s,3H)；3.90(d,J＝2.1Hz,1H)；4.08(m,1H)；4.11(m,1H)；4.20(m,3H)；4.39(m,1H)；4.97(s,2H)；5.04(m,1H)；5.40(s,2H)；5.89(dd,J＝1.7和15.5Hz,1H)；5.97(t,J＝6.2Hz,1H)；6.45(ddd,J＝4.8,10.7和15.5Hz,1H)；6.99(s,2H)；7.01(d,J＝8.7Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.2和8.7Hz,1H)；7.21至7.30(m,6H)；7.31(d,J＝2.2Hz,1H)；7.59(d,J＝8.7Hz,2H)；7.78(m,2H)；7.85(d,J＝8.5Hz,1H)；7.90(d,J＝6.9Hz,1H)；8.07(d,J＝7.8Hz,1H)；8.39(d,J＝7.3Hz,1H)；9.97(s,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝662[M+2H]2+；m/z＝1322[M-H]-；m/z＝1324[M+H]+；m/z＝1368[M-H+HCO2H]-；tR＝1.3min.
合成实施例30和31：非解离的三唑-3-(S)-新戊基-7-(S)-Me-氮杂-C52的NHS酯和 对应的ADC
Figure BDA0001649098600002381
化合物72：3-(丙-2-炔-1-基氧基)丙酸叔丁基酯
向炔丙基醇(1.362mL,23.4mmol)在THF(23mL)中的溶液添加钠(20.08mg,0.874mmol)，反应介质于60℃加热直至钠完全溶解，然后于室温冷却，然后添加丙烯酸叔丁基酯(2.286mL,15.6mmol)。反应介质于室温搅拌过夜，然后添加H2O(25mL)并且水相以EtOAc(3 x 25mL)萃取。合并的有机相经Na2SO4干燥，过滤并真空浓缩得到2g的化合物72，为无色油状物(70％)。
化合物73：3-(丙-2-炔-1-基氧基)丙酸
向化合物72(2.0g,10.86mmol)在DCM(50mL)中的溶液添加TFA(8.065mL,108.6mmol)。反应介质于室温搅拌过夜,真空浓缩，与甲苯共蒸发并通过快速色谱在80g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到1.1g的化合物73，为油状物(80％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：2.46(t,J＝6.4Hz,2H)；3.43(t,J＝2.4Hz,1H)；3.63(t,J＝6.4Hz,2H)；4.11(d,J＝2.4Hz,2H)；12.20(宽峰,1H).
化合物74：3-((1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)丙酸
向实施例24(50mg,66.6μmol)在THF(0.5mL)中的溶液添加化合物73(17.05mg,113.1μmol)、0.1M硫酸铜(II)水溶液(266μL,26.6μmol)和0.2M抗坏血酸钠水溶液(266μL,53.2μmol)。反应介质于室温搅拌1天，然后添加H2O(1mL)并且水相以EtOAc(3 x 1mL)萃取。合并的有机相以饱和盐水洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过过滤在Sephadex LH20(洗脱DCM)上纯化得到40mg的油状物，其通过快速色谱在5g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上进一步纯化得到20mg的化合物74(35％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.82(s,9H)；0.88(d,J＝6.7Hz,3H)；1.00(s,3H)；1.04(d,J＝7.1Hz,3H)；1.18(s,3H)；1.31(d,J＝14.6Hz,1H)；1.80(m,1H)；1.97(dd,J＝10.0和14.6Hz,1H)；2.25(m,1H)；2.42(t,J＝6.6Hz,2H)；2.60(m,1H)；2,70(dd,J＝10.9和14.4Hz,1H)；2.90(dd,J＝2.2和7.6Hz,1H)；2.95(dd,J＝3.6和14.4Hz,1H)；3.44(m,1H)；3.62(t,J＝6.62H)；3.80(s,3H)；3.94(d,J＝2.2Hz,1H)；4.08(m,2H)；4.49(s,2H)；5.03(m,1H)；5.59(s,2H)；5.89(dd,J＝1.7和15.3Hz,1H)；6.43(ddd,J＝4.8,10.8和15.3Hz,1H)；7.02(d,J＝8.7Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.4和8.7Hz,1H)；7.29(d,J＝8.4Hz,2H)；7.32(d,J＝2.4Hz,1H)；7.35(d,J＝8.4Hz,2H)；7.85(d,J＝8.4Hz,1H)；7.90(d,J＝7.0Hz,1H)；8.13(s,1H)；8.46(m,1H)；12.20(宽峰,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝440[M+2H]2+；m/z＝877[M-H]-；m/z＝879[M+H]+；tR＝1.24min.
实施例30：3-((1-(4-((2R,3R)-3-((S)-1-((3S,7S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6,6,7-三甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-1-氧杂-4,8,11-三氮杂-环十六-13-烯-16-基)乙基)氧杂环丙烷-2-基)苄基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲氧基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯
向化合物74(20mg,22.7μmol)在DCM(5mL)中的溶液添加DIEA(5.0μL,28.5μmol)和DSC(6.34mg,23.8μmol)。反应介质于室温搅拌3h，然后添加DSC(3mg,11.3μmol)和DIEA(5μL,28.5μmol)并于室温继续搅拌2h。反应介质，然后真空浓缩并通过两个连续的快速色谱在1.5g的二醇修饰的硅胶(梯度洗脱DCM/iPrOH)上纯化得到11.5mg的实施例30(50％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.83(s,9H)；0.87(d,J＝6.6Hz,3H)；0.99(s,3H)；1.03(d,J＝7.1Hz,3H)；1.04(d,J＝6.6Hz,3H)；1.19(s,3H)；1.32(d,J＝14.5Hz,1H)；1.81(m,1H)；1.96(dd,J＝10.2和14.5Hz,1H)；2.25(m,1H)；2.60(m,1H)；2.70(dd,J＝11.2和14.5Hz,1H)；2.80(s,4H)；2.90(dd,J＝2.0和7.4Hz,1H)；2.94(t,J＝6.1Hz,2H)；2.97(dd,J＝3.6和14.1Hz,1H)；3.42(m,1H)；3.74(t,J＝6.1Hz,2H)；3.80(s,3H)；3.92(d,J＝2.0Hz,1H)；4.09(m,2H)；4.55(s,2H)；5.03(m,1H)；5.59(s,2H)；5.89(dd,J＝1.6和15.2Hz,1H)；6.44(ddd,J＝4.7,10.6和15.2Hz,1H)；7.02(d,J＝8.6Hz,1H)；7.20(dd,J＝2.4和8.6Hz,1H)；7.29(d,J＝8.3Hz,2H)；7.32(m,3H)；7.86(d,J＝8.4Hz,1H)；7.90(d,J＝6.9Hz,1H)；8.14(s,1H)；8.39(d,J＝7.5Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝120；m/z＝974[M-H]-；m/z＝976[M+H]+；m/z＝1020[M-H+HCO2H]-；tR＝1.29min.
实施例31：mAb-实施例30
实施例31以类似于实施例3,7,10和14的方式制备。得到5.4mg的实施例31，为无色澄清溶液，浓度为1.8mg/mL，DAR为4(HRMS),单体纯度为98.1％且整体收率为45％。
SEC-HRMS：m/z＝149399(裸mAb)；m/z＝150245(D1)；m/z＝151101(D2)；m/z＝151965(D3)；m/z＝152831(D4)；m/z＝153679(D5)；m/z＝154546(D6)；m/z＝155408(D7)；m/z＝156273(D8)；m/z＝157284(D9)。
合成实施例32：3-(S)-新戊基-6-Me-6-CH2OH-氮杂-C52苄胺
Figure BDA0001649098600002411
化合物75:(2S)-2-((4-((R)-2-丙烯酰胺基-3-(3-氯-4-甲氧基苯基)丙酰胺基)-3-(羟基甲基)-3-甲基-2-氧代丁基)氨基)-4,4-二甲基戊酸(2R,3S)-1-((4-甲氧基苄基)氧基)-2-甲基己-5-烯-3-基酯
向化合物BC6(385.6mg,773.5μmol)在DMF(12mL)中的溶液添加HATU(348.7mg,889.5μmol)和HOAt(122.3mg,889.5μmol)。反应介质于室温搅拌30min，然后添加化合物AD3(292mg,773.5μmol)在DMF(5mL)和DIEA(475.2μL,2.71mmol)中的溶液并于室温继续搅拌4h。添加H2O(50mL)并且水相以EtOAc(3 x 50mL)萃取。合并的有机相以H2O(15mL)、饱和盐水(3 x 15mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在30g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到383mg的化合物75，为黄色油状物(65％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：55/45非对映异构体混合物；0.85至0.88(m,12H)；0.91(s,1.65H)；0.92(s,1.35H)；1.56(m,1H)；1.60(m,1H)；1.98(m,1H)；2.21(m,1H)；2.30(m,1H)；2.71(m,1H)；2.92(m,1H)；3.19至3.45(m,6H)；3.73(s,3H)；3.80(s,3H)；4.29(m,1H)；4.33(m,2H)；4.58(m,1H)；4.82(m,1H)；4.95至5.09(m,3H)；5.55(dd,J＝2.2和10.2Hz,1H)；5.71(m,1H)；6.01(dd,J＝2.2和17.2Hz,1H)；6.23(dd,J＝10.2和17.2Hz,1H)；6.89(m,2H)；7.01(d,J＝8.6Hz,1H)；7.17(dd,J＝2.2和8.6Hz,1H)；7.21(m,2H)；7.34(d,J＝2.2Hz,1H)；7.82(d,J＝8.0Hz,0.45H)；7.84(d,J＝8.0Hz,0.55H)；7.98(t,J＝6.5Hz,0.45H)；8.00(t,J＝6.5Hz,0.55H)；8.39(d,J＝8.6Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝756[M-H]-；m/z＝758[M+H]+；m/z＝802[M-H+HCO2H]-；tR＝1.54-1.56min.
化合物76：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6-(羟基甲基)-16-((R)-1-((4-甲氧基苄基)氧基)丙-2-基)-6-甲基-3-新戊基-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
向化合物75(380mg,501.1μmol)在DCM(38mL)中的溶液在Ar下添加Grubbs I催化剂(20.97mg,25.05μmol)。反应介质在Ar下于室温搅拌4h，然后添加Grubbs I催化剂(20.97mg,25.05μmol)。室温持续搅拌3h，然后添加Grubbs I催化剂(20.97mg,25.05μmol)并于室温持续搅拌。在反应24h后，添加Grubbs I催化剂(20.97mg,25.05μmol)并继续搅拌4h。反应介质经真空浓缩并通过快速色谱在20g的硅胶(等度洗脱庚烷/EtOAc)上纯化得到170mg的化合物76立体异构体1(56％)和138mg的化合物76立体异构体2(37％)。
化合物76立体异构体1
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.83(s,9H)；0.91(d,J＝7.1Hz,3H)；1.02(s,3H)；1.30(dd,J＝2.4和14.6Hz,1H)；1.53(dd,J＝9.9和14.6Hz,1H)；1.99(m,1H)；2.28(m,1H)；2.45(m,1H)；2.67(m,1H)；2.91(dd,J＝3.0和13.7Hz,1H)；2.97(dd,J＝4.0和14.5Hz,1H)；3.17至3.49(m,5H)；3.72(s,3H)；3.80(s,3H)；4.18(m,1H)；4.37(m,2H)；4.50(td,J＝2.4和9.6Hz,1H)；5.00(m,3H)；5.82(dd,J＝1.9和15.4Hz,1H)；6.39(ddd,J＝4.2,11.6和15.4Hz,1H)；6.90(d,J＝8.7Hz,2H)；7.04(d,J＝8.6Hz,1H)；7.12(m,1H)；7.15(dd,J＝2.3和8.6Hz,1H)；7.21(d,J＝8.7Hz,2H)；7.28(d,J＝2.3Hz,1H)；8.09(d,J＝9.6Hz,1H)；8.38(d,J＝8.0Hz,1H).LCMS(A4)：ES m/z＝728[M-H]-；m/z＝730[M+H]+；m/z＝774；tR＝5.15min.
化合物76立体异构体2
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.83(s,9H)；0.88(s,3H)；0.91(d,J＝7.1Hz,3H)；1.28(dd,J＝2.4和14.6Hz,1H)；1.67(dd,J＝9.9和14.6Hz,1H)；1.99(m,1H)；2.28(m,1H)；2.45(m,1H)；2.67(m,1H)；3.02(dd,J＝3.3和14.2Hz,1H)；3.08(dd,J＝1.9和13.5Hz,1H)；3.25至3.42(m,4H)；3.55(dd,J＝5.1和11.0Hz,1H)；3.73(s,3H)；3.81(s,3H)；4.17(m,1H)；4.37(m,2H)；4.44(td,J＝2.1和9.3Hz,1H)；4.80(t,J＝5.1Hz,1H)；5.00(m,2H)；5.86(dd,J＝1.6和15.1Hz,1H)；6.38(ddd,J＝4.0,11.4和15.3Hz,1H)；6.90(d,J＝8.8Hz,2H)；7.04(d,J＝8.7Hz,1H)；7.19(dd,J＝2.2和8.7Hz,1H)；7.22(d,J＝8.8Hz,2H)；7.30(d,J＝2.2Hz,1H)；7.42(d,J＝10.4Hz,1H)；7.92(d,J＝8.9Hz,1H)；8.45(d,J＝8.0Hz,1H).LCMS(A4)：ES m/z＝728[M-H]-；m/z＝730[M+H]+；m/z＝774；tR＝4.79min.
化合物77：(3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((R)-1-((4-甲氧基-苄基)氧基)丙-2-基)-6-甲基-3-新戊基-6-(((三乙基甲硅烷基)氧基)甲基)-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮向化合物76立体异构体1(170mg,232.8μmol)在DCM(3mL)(以冰浴冷却)中的溶液于4℃添加氯三乙基硅烷(159.3μL,931.1μmol)并滴加TEA(131.1μL,931.1μmol)。反应介质于4℃搅拌30min然后于室温搅拌20h。反应介质以DCM(50mL)和盐水(10mL)稀释，并继续搅拌10min。有机相以饱和盐水(2 x 10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。化合物76(138mg,189.0μmol)的另一非对映异构体类似地保护，收集两个批次，并通过快速色谱在20g的硅胶(等度洗脱庚烷/EtOAc)上纯化得到139mg的化合物77立体异构体1，为无色泡沫(39％)，和107mg的化合物77立体异构体2，为无色泡沫(30％)。
化合物77立体异构体1
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.62(q,J＝8.1Hz,6H)；0.83(s,9H)；0.91(d,J＝7.1Hz,3H)；0.96(t,J＝8.1Hz,9H)；1.04(s,3H)；1.66(dd,J＝3.4和14.4Hz,1H)；1.43(dd,J＝9.3和14.4Hz,1H)；1.99(m,1H)；2.28(m,1H)；2.47(m,1H)；2.68(m,1H)；2.92(dd,J＝3.0和13.5Hz,1H)；2.99(dd,J＝4.0和14.8Hz,1H)；3.21至3.40(m,3H)；3.48(m,1H)；3.63(d,J＝10.3Hz,1H)；3.73(s,3H)；3.81(s,3H)；4.17(m,1H)；4.36(m,2H)；4.51(td,J＝2.9和9.4Hz,1H)；5.02(m,1H)；5.82(dd,J＝1.8和15.4Hz,1H)；6.39(ddd,J＝4.3,11.6和15.4Hz,1H)；6.89(d,J＝8.7Hz,2H)；7.02(m,1H)；7.04(d,J＝8.7Hz,1H)；7.15(dd,J＝2.3和8.7Hz,1H)；7.21(d,J＝8.7Hz,2H)；7.29(d,J＝2.3Hz,1H)；7.96(d,J＝9.4Hz,1H)；8.31(d,J＝8.0Hz,1H).LCMS(A4)：ES m/z＝842[M-H]-；m/z＝844[M+H]+；m/z＝888[M-H+HCO2H]-；tR＝7.08min.
化合物77立体异构体2
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.52(q,J＝8.1Hz,6H)0.84(s,9H)；0.88至0.93(m,15H)；1.29(dd,J＝2.6和14.5Hz,1H)；1.68(dd,J＝10.1和14.5Hz,1H)；1.99(m,1H)；2.28(m,1H)；2.47(m,1H)；2.68(m,1H)；3.01(dd,J＝3.4和14.5Hz,1H)；3.15(d,J＝12.8Hz,1H)；3.33(m,1H)；3.48(d,J＝10.4Hz,1H)；3.73(s,3H)；3.81(s,3H)；3.83(d,J＝10.4Hz,1H)；4.17(m,1H)；4.36(m,2H)；4.45(td,J＝2.4和9.2Hz,1H)；5.01(m,1H)；5.84(dd,J＝1.8和15.3Hz,1H)；6.39(ddd,J＝3.9,11.4和15.3Hz,1H)；6.90(d,J＝8.8Hz,2H)；7.05(d,J＝8.6Hz,1H)；7.19(dd,J＝2.2和8.6Hz,1H)；7.22(d,J＝8.8Hz,2H)；7.30(d,J＝2.2Hz,1H)；7.47(d,J＝10.4Hz,1H)；8.01(d,J＝9.2Hz,1H)；8.41(d,J＝8.0Hz,1H).LCMS(A4)：ES m/z＝842[M-H]-；m/z＝844[M+H]+；m/z＝888[M-H+HCO2H]-；tR＝6.88min.
化合物78：3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-16-((R)-1-羟基丙-2-基)-6-甲基-3-新戊基-6-(((三乙基甲硅烷基)氧基)甲基)-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
向化合物77(245mg,290.1μmol)的两个非对映异构体在DCM(10mL)和H2O(2.5mL)(以冰/丙酮浴冷却)中的溶液添加DDQ(339.4mg,1.45mmol)和2,6-二-叔丁基吡啶(171.7mg,870.3μmol)。反应介质于0℃搅拌2h，然后以NaHCO3水溶液(10mL)和DCM(10mL)稀释并继续搅拌10min。水相以DCM萃取(3 x 20mL),合并的有机相以饱和盐水洗涤(3 x5mL),经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在20g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到155mg的化合物78，为白色泡沫(74％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.49至0.65(m,6H)；0.80至1.07(m,24H)；1.35至1.71(m,2H)；1.83(m,1H)；2.28(m,1H)；2.47(m,1H；2.68(m,1H)；2.90至3.50(m,5.96H)；3.65(d,J＝10.6Hz,0.52H)；3.80(s,3H)；3.82(d,J＝10.6Hz,0.52H)；4.18(m,1H)；4.29至4.70(m,2H)；5.02(m,1H)；5.80至5.89(m,1H)；6.05(m,0.11H)；6.39(m,0.89H)；6.98至7.31(m,3.48H)；7.47(d,J＝10.6Hz,0.52H)；7.87(d,J＝9.4Hz,0.11H)；7.96(d,J＝9,4Hz,0.52H)；8.00(d,J＝9.4Hz,0.37H)；8.31(d,J＝8.0Hz,0.63H)；8.42(d,J＝8.4Hz,0.37H).LCMS(A4)：ES m/z＝722[M-H]-；m/z＝724[M+H]+；m/z＝768[M-H+HCO2H]-；tR＝5.68-5.78min.
化合物79：2S)-2-((3S,10R,16S,E)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6-甲基-3-新戊基-2,5,9,12-四氧代-6-(((三乙基甲硅烷基)氧基)甲基)-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-16-基)丙醛
向化合物78(154mg,212.6μmol)在DCM(1.5mL)(以冰/丙酮浴冷却)中的溶液于0℃添加KBr(25.6mg,212.6μmol)在H2O(612μL)中的溶液、TEMPO以5mg/mL在DCM中的溶液(137μL,4.25μmol)，并滴加1.56M次氯酸钠水溶液pH 9.5(204μL,318.9μmol)。于0℃持续搅拌15min，然后于0℃添加饱和Na2S2O3(1.9mL)，除去冰浴并且反应介质搅拌10min。然后以DCM萃取(3 x 20mL)，合并的有机相以H2O(2 x 10mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在15g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到36mg的化合物61(23％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：72/28非对映异构体混合物：0.49至0.65(m,6H)；0.80至1.08(m,24H)；1.32至1.69(m,2H)；2.40(m,1H)；2.68(m,2H)；2.79(m,1H)；2.89至3.70(m,5H)；3.80(s,3H)；4.10至4.53(m,2H)；5.02(m,0.28H)；5.28(m,0.72H)；5.78至5.91(m,1H)；6.07(m,0.28H)；6.40(m,0.72H)；7.00至7.51(m,4H)；7.90(d,J＝9.4Hz,0.28H)；7.98(d,J＝9.4Hz,0.72H)；8.34(m,1H)；9.59(d,J＝2.5Hz,0.28H)；9.63(d,J＝1.8Hz,0.72H).LCMS(A5)：m/z＝722[M+H]+；tR＝1.71min.
化合物80：1-(叠氮基甲基)-4-(溴甲基)苯
向对二甲苯二溴化物(2.0g,7.2mmol)在DMF(20mL)中的溶液在20min内添加叠氮化钠(584.9mg,8.64mmol)在DMF(20mL)中的溶液。反应介质于室温搅拌20h，然后倾倒至冰(100g)上并且以EtOAc(3 x 50mL)萃取。合并的有机相以饱和盐水(3 x 15mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，与甲苯共蒸发并通过快速色谱在70g的硅胶(洗脱Et2O)上纯化得到773mg的化合物80，为无色油状物(47％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：4.45(s,2H)；4.71(s,2H)；7.35(d,J＝8.5Hz,2H)；7.47(d,J＝8.5Hz,2H).
化合物81：(1R,4S,5R,6S)-6-(4-(叠氮基甲基)苄基)-4,7,7-三甲基-6-硫杂双环[3.2.1]辛烷-6-三氟甲磺酸酯
向(1R,4R,5R)-4,7,7-三甲基-6-硫杂双环[3.2.1]辛烷(CAS号[5718-75-2],580.1mg,3.41mmol)添加化合物80(770mg,3.41mmol)在DCM(2.2mL)中的溶液。然后滴加三氟甲磺酸锂(2.71g,17.03mmol)在H2O 2mL中)的溶液并且反应介质于室温搅拌2天。然后添加H2O(15mL)和DCM(15mL)至反应介质并于室温持续搅拌10min。水相以DCM萃取(3 x15mL)，合并的有机相以饱和盐水洗涤(3 x 8mL)，经MgSO4干燥，过滤并真空浓缩。淡黄色油状物在iPr2O(5mL)中研磨，由此得到的固体经过滤，以iPr2O(2 x 5mL)洗涤并真空干燥得到1.266g的化合物81，为白色固体(79％)。
RMN 1H(400MHz,δin ppm,DMSO-d6)：1.08(d,J＝7.2Hz,3H)；1.45(m,1H)；1.55至1.80(m,3H)；1.69(s,3H)；1.75(s,3H)；1.99(m,1H)；2.40(d,J＝13.8Hz,1H)；2.45(m,1H)；2.59(dm,J＝13.8Hz,1H)；3.88(t,J＝4.6Hz,1H)；4.52(s,2H)；4.60(d,J＝12.8Hz,1H)；4.90(d,J＝12.8Hz,1H)；7.47(d,J＝8.5Hz,2H)；7.61(d,J＝8.5Hz,2H).
化合物82：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(叠氮基甲基)苯基)氧杂环丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6-甲基-3-新戊基-6-(((三乙基甲硅烷基)氧基)甲基)-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
向化合物79(35mg,48.5μmol)和81(24.8mg,53.3μmol)在DCM(1.5mL)(于-70℃冷却)中的溶液滴加BEMP(CAS号[98015-45-3],18.6μL,63.0μmol)。反应混合物于-70℃搅拌2h 30，将饱和盐水(1.5mL)添加至反应混合物，除去浴并剧烈搅拌至RT。水相以DCM(3 x10mL)萃取，合并的有机相经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在5g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH)上纯化得到10.2mg的化合物82，为无色漆状物(24％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.61(q,J＝8.1Hz,6H)；0.80(s,9H)；0.98(t,J＝8.1Hz,9H)；1.02(s,3H)；1.03(d,J＝7.1Hz,3H)；1.34(dd,J＝2.5和14.4Hz,1H)；1.44(dd,J＝10.0和14.4Hz,1H)；1.85(m,1H)；2.27(m,1H)；2.62(m,2H)；2.88(dd,J＝2.6和13.5Hz,1H)；2.97(dd,J＝3.7和14.2Hz,1H)；3.00(dd,J＝2.3和7.3Hz,1H)；3,35(m,1H)；3.48(dd,J＝9.5和14.2Hz,1H)；3.61(d,J＝10.3Hz,1H)；3.81(s,3H)；3.92(d,J＝2.3Hz,1H)；4.15(m,1H)；4.46(s,2H)；4.48(td,J＝2.5和9.7Hz,1H)；5.10(m,1H)；5.78(dd,J＝2.2和15.3Hz,1H)；6.40(ddd,J＝4.3,11.6和15.3Hz,1H)；7.04(m,2H)；7.14(dd,J＝2.3和8.6Hz,1H)；7.28(d,J＝2.3Hz,1H)；7.33(d,J＝8.4Hz,2H)；7.39(d,J＝8.4Hz,2H)；7.96(d,J＝9.7Hz,1H)；8.28(d,J＝8.0Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝120；m/z＝865[M-H]-；m/z＝867[M+H]+；m/z＝911[M-H+HCO2H]-；tR＝1.87min.
实施例32：(3S,10R,16S,E)-16-((S)-1-((2R,3R)-3-(4-(氨基甲基)苯基)氧杂环丙烷-2-基)乙基)-10-(3-氯-4-甲氧基苄基)-6-甲基-3-新戊基-6-(((三乙基甲硅烷基)氧基)甲基)-1-氧杂-4,8,11-三氮杂环十六-13-烯-2,5,9,12-四酮
向化合物82(9.4mg,10.84μmol)在DCM(1.3mL)和MeOH(0.7mL)中的溶液添加TCEP(3.45mg,11.9μmol)在H2O(0.7mL)中的溶液。反应介质于室温搅拌过夜，然后添加NaHCO3水溶液(2.5mL)并持续搅拌10min。水相以DCM(3 x 10mL)萃取，合并的有机相经MgSO4干燥，过滤，真空浓缩并通过快速色谱在5g的硅胶(梯度洗脱DCM/MeOH/H2O)上纯化得到4.55mg的实施例32，为白色漆状物(57％)。
RMN 1H(500MHz,δin ppm,DMSO-d6)：0.82(s,9H)；1.01(s,3H)；1.03(d,J＝7.1Hz,3H)；1.33(dd,J＝2.3和14.5Hz,1H)；1.56(dd,J＝10.1和14.5Hz,1H)；1.82(m,1H)；2.27(m,1H)；2.64(m,2H)；2.88(dd,J＝2.6和13.5Hz,1H)；2.92(dd,J＝2.2和7.3Hz,1H)；2.96(dd,J＝4.0和11.2Hz,1H)；3,19(dd,J＝4.3和10.9Hz,1H)；3.41(m,2H)；3.74(s,2H)；3.81(s,3H)；3.88(d,J＝2.2Hz,1H)；4.18(m,1H)；4.47(td,J＝2.1和9.4Hz,1H)；4.91(dd,J＝4.2和6.2Hz,1H)；5.08(m,1H)；5.76(dd,J＝2.3和15.5Hz,1H)；6.40(ddd,J＝3.7,11.5和15.5Hz,1H)；7.05(d,J＝8.8Hz,1H)；7.11(m,1H)；7.14(dd,J＝2.4和8.8Hz,1H)；7.22(d,J＝8.3Hz,2H)；7.25(d,J＝2.4Hz,1H)；7.35(d,J＝8.3Hz,2H)；8.08(d,J＝9.4Hz,1H)；8.31(d,J＝8.0Hz,1H).LCMS(A5)：ES m/z＝725[M-H]-；m/z＝727[M+H]+；tR＝0.79min.
药理学结果
本发明的化合物经历药理学测试用于确定它们的抗肿瘤作用。还评估了式(III)的ADC的血浆稳定性。
出于说明目的，还测试了下面描绘的两个衍生自WO2011/001052的两个缀合物ADC1和ADC2。
Figure BDA0001649098600002491
评价式(I)的念珠藻素化合物对HCT116和MDA-MB-231细胞系的增殖的抑制
处于其指数生长期的HCT116和MDA-MB-231细胞用胰蛋白酶处理且重新混悬在其各自的培养基(对于MDA-MB-231细胞，DMEM/F12Gibco#21331,10％FCS Gibco#10500-056,2nM谷氨酰胺Gibco#25030；对于HCT116细胞，DMEM Gibco#11960,10％FCS Gibco#10500-056,2mM谷氨酰胺Gibco#25030)。在Cytostar 96孔培养板(GE Healthcare Europe,#RPNQ0163)中将细胞混悬液以5000个细胞/孔的密度接种在含有血清的完全培养基中。孵育4小时后，将念珠藻素化合物的连续稀释液以由10-7M降至10-12M的浓度加到各孔中(每种浓度一式三份)。将细胞在37℃在含有5％CO2的气氛下在念珠藻素化合物存在下培养3天。第4天将10μl 14C-胸苷溶液(0.1μCi/孔,Perkin Elmer#NEC56825000)加到各孔中。实验开始后96小时使用Microbeta放射性计数器(Perkin Elmer)对14C-胸苷的引入进行测量。通过确定就用念珠藻素化合物处理的细胞而得到的减少计数和就对照孔中的细胞(仅用培养基处理)而得到的计数之间的比例将数据表示成存活百分比形式。
抑制活性通过抑制50％活性的浓度给出。
Figure BDA0001649098600002492
Figure BDA0001649098600002501
1式(I)的念珠藻素作为纯β环氧化物或作为α和β环氧化物的混合物测试，如标题“结构备注”的栏中所说明的。文献已知β环氧化物的能力通常是α环氧化物的50-100倍(参见例如Al-Awar R.S.,et al.,J Med Chem 2003,46,2985-3007)。
发现，式(I)的念珠藻素化合物抑制HCT116和MDA-MB-231细胞系增殖的IC50在50pM至2.815nM的范围。
评价式(III)的ADC对MDA-MB-231细胞系的增殖的抑制
处于其指数生长期的MDA-MB-231细胞用胰蛋白酶处理且重新混悬在其各自的培养基(DMEM/F12Gibco#21331,10％FCS Gibco#10500-056,2nM谷氨酰胺Gibco#25030)。在Cytostar 96孔培养板(GE Healthcare Europe,#RPNQ0163)中将细胞混悬液以5000个细胞/孔的密度接种在含有血清的完全培养基中。孵育4小时后，将念珠藻素化合物的连续稀释液以由10-7M降至10-12M的浓度加到各孔中(每种浓度一式三份)。将细胞在37℃在含有5％CO2的气氛下在ADC存在下培养3天。第4天将10μl14C-胸苷溶液(0.1μCi/孔,Perkin Elmer#NEC56825000)加到各孔中。实验开始后96小时使用Microbeta放射性计数器(PerkinElmer)对14C-胸苷的引入进行测量。通过确定就用ADC处理的细胞而得到的减少计数和就对照孔中的细胞(仅用培养基处理)而得到的计数之间的比例将数据表示成存活百分比形式。在一些实验中，在实验开始时将裸抗体以1μM的浓度添加至各孔中并如前所述测量增殖抑制。
Figure BDA0001649098600002502
Figure BDA0001649098600002511
发现，式(III)的ADC的念珠藻素，以及ADC1和ADC2，抑制MDA-MB-231细胞系的增殖IC50在20pM至130pM的范围，以及单独的ADC对ADC+裸抗体的选择性比例在185和500之间。
确定在SCID小鼠中单次静脉注射给药后式(III)的ADC的MTD
MTD确定为对于单独小鼠在连续3天期间不会诱导15％体重损失或者在1天内不会诱导20％体重损失或致死的最大剂量。在三只雌性SCID小鼠中单次静脉注射(i.v.)推注后并且在28天的处理后期间进行评估。
Figure BDA0001649098600002512
式(III)的念珠藻素ADC显示在SCID小鼠中的MTD在20mg/kg至≥50mg/kg的范围。
评价在SCID小鼠中单次静脉注射给药后式(III)的ADC针对MDA-MB-231的体内抗肿瘤活性
针对在雌性SCID小鼠中皮下种植的可测量乳房MDA-MB-231异种移植物在3个剂量水平上评价体内抗肿瘤活性。对照组保持未处理。缀合物通过单次静脉推注给予，治疗日在各图上以箭头(▼)指示。
为了评价缀合物的抗肿瘤活性，动物每周称重两次并且通过测径器每周两次检测肿瘤。动物体重包括肿瘤重量。肿瘤体积使用公式体积(mm3)＝[长度(mm)×宽度(mm)2]/2计算。主要疗效终点为ΔT/ΔC、百分比中位数消退、部分和完全消退(PR和CR)。各处理(T)和对照(C)的肿瘤体积变化对于各肿瘤通过从指定观察日的肿瘤体积减去首日(分期日)治疗的肿瘤体积来计算。计算治疗组的中位数ΔT，并计算对照组的中位数ΔC。然后，计算比例ΔT/ΔC，并表达为百分比ΔT/ΔC＝(delta T/delta C)×100。
肿瘤消退的百分比定义为在指定观察日(t)相比于首日的首先治疗(t0)的肿瘤体积的治疗组中的肿瘤体积的减少。在具体时间点以及对于各动物，计算％消退。然后计算各组的中位数％消退。％消退(在t日)＝((体积t0–体积t)/体积t0)×100。如果肿瘤体积减少至治疗开始时的肿瘤体积的50％，消退定义为部分(PR)，当不能测量肿瘤体积(0mm3)，消退定义为完全(CR)。无瘤生存(TFS)定义为在研究结束时(>最后治疗后100天)具有未检测到肿瘤的动物。
评价在SCID小鼠中单次静脉注射给药后实施例3针对MDA-MB-231体内抗肿瘤活性
Figure BDA0001649098600002521
评价在SCID小鼠中单次静脉注射给药后实施例7针对MDA-MB-231体内抗肿瘤活性
Figure BDA0001649098600002531
评价在SCID小鼠中单次静脉注射给药后实施例10针对MDA-MB-231体内抗肿瘤活性
Figure BDA0001649098600002532
评价在SCID小鼠中单次静脉注射给药后实施例14针对MDA-MB-231体内抗肿瘤活性
Figure BDA0001649098600002533
Figure BDA0001649098600002541
评价在SCID小鼠中单次静脉注射给药后实施例20针对MDA-MB-231体内抗肿瘤活性
Figure BDA0001649098600002542
评价在SCID小鼠中单次静脉注射给药后实施例23针对MDA-MB-231体内抗肿瘤活性
Figure BDA0001649098600002543
Figure BDA0001649098600002551
这些结果显示，所有测试的本发明的实施例，以及ADC2，在0.625mg/kg至5mg/kg的剂量范围显示抗肿瘤活性。
在SCID小鼠中单次静脉注射给予(5mg/kg)后确定实施例3和实施例7的PK参数
在雌性SCID小鼠中在通过单次静脉推注给予缀合物后评价ADC和全部抗体的体内药物动力学。雌性SCID小鼠(5-6周龄，平均重量20-25g)安置在层流罩中消毒条件下的灭菌室中，并且随意饲喂。静脉推注以一次剂量水平(10mL/kg)给予ADC(非系列设计，n＝3/取样时间)。对于各动物并且在各选择的时间点(即，0.083,0.25,24,72,96,168,240,336h)，经由心脏穿刺采集600μL的血并且血样然后离心(在4℃和3500tr/min进行15min)。ADC和全部抗体在血浆样品中的量化使用免疫测定进行。血浆浓度对时间的曲线和缀合物和全部抗体在小鼠中的PK参数使用非房室分析(Phoenix,WinNonLin，版本6.3)进行表征，并描绘在图15和16中。浓度-时间曲线下的面积，AUC(μg.天/mL)通过梯形法则计算。在t＝0的浓度C0(μg/mL)、获得清除率CL(L/(天.kg)和终端消除半衰期(terminal elimination half-life)t1/2(天)并计算自该曲线。
Figure BDA0001649098600002552
a：信息数据仅为AUCext>>30％(即42％)；b：信息数据仅为AUCext>>30％(即50％)。
在SCID小鼠中单次静脉注射给予(5mg/kg)后评价式(III)念珠藻素ADC的血浆稳定性的HRMS
来自PK研究的血浆样品还通过LC-HRMS进行分析。色谱分析在Waters Acquity IClass和Waters Mass Prep Micro Desalting 20μm(2.1 x 5mm)柱上进行，于80℃，梯度洗脱为(A)水+0.1％甲酸/(B)CH3CN+0.1％甲酸，如下所述。
时间(min) ％B 流量(ml/min)
0.00 5 0.5
0.50 5 0.5
0.51 5 0.2
2.00 90 0.2
2.10 5 0.5
2.70 90 0.5
2.80 5 0.5
3.40 90 0.5
3.50 5 0.5
4.00 5 0.5
质谱在Waters QTOF Synapt G2-S设备(具有电阳性模式的电喷雾离子化(ES+))上进行。质谱以Waters Biopharmalynx软件解卷积。得到所有测试实施例的HRMS光谱，并且描绘在图20至25中。
这些结果显示所有测试的本发明实施例不会显示参考ADC、ADC1和ADC2所观察到的代谢。
因此，显然的是，本发明的化合物具有抗癌活性并且本发明的缀合物显示出在小鼠血浆中的改善的稳定性。
因此，在其另一方面中，本发明还涉及式(I)的念珠藻素化合物或式(III)的缀合物作为抗癌剂的用途。
本发明，根据其另一方面，还提供了包含式(III)缀合物的药剂。
这些药剂在治疗上使用，特别是用于治疗癌症。
根据其另一方面，本发明涉及包含根据本发明的式(III)缀合物作为活性成份的药物组合物。这些药物组合物包含有效剂量的至少一种根据本发明的式(III)缀合物以及至少一种药用赋形剂。
所述赋形剂根据药用形式和所需的给药方法选自常见的赋形剂，这对于本领域技术人员是已知的。
本发明，根据其另一方面，还提供了治疗上述病理的方法，其包含向患者给予有效剂量的根据本发明的式(III)缀合物。

Claims (30)

1.式(I)的念珠藻素化合物：
Figure FDA0003489741490000011
其中
■R1表示-(C1-C6)烷基；
■R2和R3彼此独立地表示氢原子或-(C1-C6)烷基；
或者，R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成-(C3-C6)环烷基；
■R4和R5彼此独立地表示-(C1-C6)烷基、-(C1-C6)烷基-OH基团或-(C1-C6)烷基-SH基团；
或者，R4和R5与它们所连接的碳原子一起形成-(C3-C6)环烷基；
■R6表示氢原子；
■R7和R8彼此独立地表示氢原子或-(C1-C6)烷基；
■R9表示两个选自-(C1-C4)烷氧基和卤素原子的取代基；
■R10表示氢原子；
■W表示
●(C1-C6)烷基-NH(R11)、
●(C1-C6)烷基-OH、
●(C1-C6)烷基-SH或
●(C1-C6)烷基-N3；并且
■R11表示氢原子。
2.根据权利要求1的式(I)的念珠藻素化合物，具有以下结构：
Figure FDA0003489741490000012
3.根据权利要求1或2的式(I)的念珠藻素化合物，其中R1表示甲基。
4.根据权利要求1或2的式(I)的念珠藻素化合物，其中R2和R3各自表示氢原子。
5.根据权利要求1或2的式(I)的念珠藻素化合物，其中R2和R3中的一个表示甲基，另一个表示氢原子。
6.根据权利要求1或2的式(I)的念珠藻素化合物，其中R2和R3与它们所连接的碳原子一起形成环丙基。
7.根据权利要求1或2的式(I)的念珠藻素化合物，其中R4和R5各自表示甲基。
8.根据权利要求1或2的式(I)的念珠藻素化合物，其中R7表示氢原子，且R8表示-(C1-C6)烷基。
9.根据权利要求1或2的式(I)的念珠藻素化合物，其中R9表示两个选自甲氧基和氯原子的取代基。
10.根据权利要求1或2的式(I)的念珠藻素化合物，其中：
■R1表示-(C1-C6)烷基；
■R2和R3各自表示氢原子；
■R6表示氢原子；
■R9表示两个选自甲氧基和氯原子的取代基；和
■R10表示氢原子。
11.根据权利要求1或2的式(I)的念珠藻素化合物，其中：
■R1表示-(C1-C6)烷基；
■R2和R3中的一个表示-(C1-C6)烷基，且另一个表示氢原子；
■R6表示氢原子；
■R9表示两个选自甲氧基和氯原子的取代基；和
■R10表示氢原子。
12.根据权利要求1或2的式(I)的念珠藻素化合物，其中：
W选自(C1-C6)烷基-NHR11、(C1-C6)烷基-OH和(C1-C6)烷基-SH。
13.根据权利要求12的式(I)的念珠藻素化合物，其中：
W表示CH2-NH2基团或CH2-OH基团。
14.念珠藻素化合物，其选自：
Figure FDA0003489741490000031
Figure FDA0003489741490000041
15.式(II)的念珠藻素有效载荷：
Figure FDA0003489741490000042
其中
R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10如权利要求1至11中任一项所定义，和
■Y选自-(C1-C6)烷基-NR11-、-(C1-C6)烷基-O-或-(C1-C6)烷基-S-；
■R11表示氢原子；
■L表示连接基；
■RCG1表示存在于连接基端部的反应性化学基团，
其中L为式(IV)：
Figure FDA0003489741490000043
其中：
■L1表示
■若Y＝(C1-C6)烷基-N(R11)，则为单键或NR16杂芳基或芳基-CR15R14-O-C(＝O)基团；
■若Y＝(C1-C6)烷基-O或(C1-C6)烷基-S，则为NR18-(C2-C6)烷基-NR17-C(＝O)-基团；
■R14、R15、R16、R17和R18彼此独立地表示氢原子；
■(AA)w表示经由肽键连接在一起的w氨基酸AA的序列；
■w表示1至12的整数；
■L2表示-(C1-C6)烷基-；
AA表示构型为D或L的天然或非天然氨基酸，选自：丙氨酸、β-丙氨酸、γ-氨基丁酸、瓜氨酸、α,α-二甲基-γ-氨基丁酸、β,β-二甲基-γ-氨基丁酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸，
RCG1选自：
-C(＝O)-ZaRa基团，其中
■Za表示-O-或-NH-，和
■Ra表示氢原子、琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺基
Figure FDA0003489741490000051
基团。
16.根据权利要求15的式(II)的念珠藻素有效载荷，具有以下结构：
Figure FDA0003489741490000052
17.根据权利要求15或16的式(II)的念珠藻素有效载荷，其中Y表示-(C1-C6)烷基-NR11-。
18.根据权利要求15或16的式(II)的念珠藻素有效载荷，其中Y表示-(C1-C6)烷基-O-。
19.根据权利要求15的式(II)的念珠藻素有效载荷，其中序列AA表示丙氨酸、瓜氨酸、甘氨酸或缬氨酸。
20.根据权利要求15或16的式(II)的念珠藻素有效载荷，其中RCG1选自：
--C(＝O)-ZaRa基团，其中
■Za表示-O-或-NH-，和
■Ra表示琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺基
Figure FDA0003489741490000053
基团。
21.念珠藻素有效载荷，其选自以下：
Figure FDA0003489741490000061
Figure FDA0003489741490000071
22.式(III)的缀合物：
Figure FDA0003489741490000072
其中
■R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9和R10如在权利要求1至11中任一项所定义的；
■Y和L如在权利要求15至19中任一项所定义的；
■G表示
Figure FDA0003489741490000073
■Ab表示抗体。
23.根据权利要求22的式(III)的缀合物，具有以下结构：
Figure FDA0003489741490000074
24.缀合物，其选自：
Figure FDA0003489741490000075
Figure FDA0003489741490000081
25.制备式(I)的念珠藻素化合物的方法，包括以下步骤：
Figure FDA0003489741490000091
其中：
-步骤(i)为片段AD3和BC之间在偶联剂的存在下的肽的偶联；
-步骤(ii)为在催化剂的存在下通过闭环置换反应的大环化；
-步骤(iii)为p-甲氧基苄基醚在酸性条件下的脱保护；
-步骤(iv)为使用氧化剂氧化醇；
-步骤(v)为通过使用适当取代的异硫代桉树脑衍生的手性锍在碱的存在下的不对称Corey-Chaykovsky反应引入环氧化物；
-步骤(vi)为叠氮基的还原。
26.制备式(III)的缀合物的方法，包括以下步骤：
(i)将以下置于接触并让其反应：
-借助或不借助修饰剂进行修饰的抗体的缓冲的或非缓冲的水溶液，
和
-如权利要求15至20中任一项定义的式(II)的念珠藻素有效载荷的溶液，
式(II)的念珠藻素有效载荷的化学基团RCG1对于在抗体上存在的化学基团RCG2具有反应性，所述化学基团RCG2已经通过修饰剂引入，其中RCG2为存在于Ab上的正交反应性基团；
从而通过形成共价键将式(II)的念珠藻素有效载荷连接至抗体；
(ii)以及然后从式(II)的念珠藻素有效载荷和/或未反应的抗体和/或任何聚集体中分离在步骤(i)中形成的缀合物。
27.根据权利要求26的方法，其中式(II)的念珠藻素有效载荷的化学基团RCG1对于在抗体上存在的氨基具有反应性。
28.药物，其特征在于其包含根据权利要求22至23中任一项的式(III)的缀合物或根据权利要求24的缀合物。
29.药物组合物，其特征在于其包含根据权利要求22至23中任一项的式(III)的缀合物或根据权利要求24的缀合物、以及至少一种药用赋形剂。
30.根据权利要求22至23中任一项的式(III)的缀合物或根据权利要求24的缀合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
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