CN115737835A - 特异性结合icam1的物质在制备甲状腺癌治疗或诊断产品中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药领域，特别是涉及特异性结合ICAM1的物质在制备甲状腺癌治疗或诊断产品中的用途，所述特异性结合ICAM1的物质选自抗体偶联药物或其药学上可接受的盐，或ICAM1抑制剂，所述抗体偶联药物为ICAM1‑MC‑VC‑PAB‑MMAE，ICAM1‑Maleimide GGFG peptide‑Dxd，所述特异性结合ICAM1的物质还可以为ICAM1抗体‑磁共振成像离子‑磁共振成像离子螯合分子偶联物，例如DTPAA‑Gd，所述甲状腺癌选自分化型甲状腺或甲状腺未分化癌。本发明的抗体偶联药物在体内及体外水平均对甲状腺癌有显著杀伤效果，为甲状腺癌的靶向治疗提供了靶向治疗候选药物及伴随诊断标记物。

Description

特异性结合ICAM1的物质在制备甲状腺癌治疗或诊断产品中 的用途

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及特异性结合ICAM1的物质在制备甲状腺癌治疗或诊断产品中的用途。

背景技术

甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，是近年来增长速度最快的恶性肿瘤，其病理分型分为分化型甲状腺(differentiated thyroid carcinoma,DTC)、甲状腺髓样癌和甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma,ATC)。DTC包括甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)，约占甲状腺癌的85％和滤泡性甲状腺癌。部分PTC患者在发病早期就已经出现局部器官侵犯，颈部淋巴转移或远处转移，严重影响患者生存。虽然大部分PTC患者通过传统的治疗方案可以得到良好的效果，但目前对于侵袭性强及晚期PTC和ATC仍缺少有效的治疗手段。分子靶向药物治疗是晚期甲状腺癌治疗的方向之一。其中包括，主要用于治疗晚期或碘131难治性分化型甲状腺癌仑伐替尼和索拉非尼。遗憾的是，上述两种药物仅有无进展生存的获益，而没有总生存的获益。ATC为一高度侵袭性的甲状腺恶性肿瘤，诊断时常伴有远处转移，患者预后差，中位生存期3-6个月。目前对于PTC后线以及ATC尚无统一的治疗方法。因此，提高甲状腺癌患者疗效是一个重要且未被满足的医学需求。

抗体偶联药物(antibody-drug conjugate，ADC)是一类由结合肿瘤特异靶点的单克隆抗体经由特定的连接子与小分子细胞毒素(ADC弹头)相连接而组成的新型抗肿瘤药物。ADC能够选择性地向肿瘤细胞递送小分子细胞毒素，被肿瘤细胞通过胞吞作用吞饮至细胞内，经溶酶体降解并释放出小分子细胞毒素，发挥杀伤肿瘤细胞的作用。基于靶向抗原特异性结合的特征，ADC药物可以对肿瘤进行选择性的杀伤，并显著减少对正常组织和器官的副作用，具有传统抗肿瘤药物无法实现的特异性和疗效。相比于传统小分子药物，ADC在提高靶向性、降低毒副作用等方面具有明显优势。近几年ADC药物在乳腺癌和胃癌在内的多种实体肿瘤中显示出良好的疗效。据统计，已有14种ADC被美国食品药品管理局批准用于治疗多种类型实体瘤，另有超过80种ADC正处在临床开发中。虽然ADC类药物的研发在抗肿瘤药物研究领域一直是热点，但迄今为止，现有的ADC药物仍无法满足临床所需，正如甲状腺癌，一线治疗失败的晚期患者，可供选择的二线药物极其缺乏，抗肿瘤血管药物仅有无进展生存获益而无总生存获益。现阶段临床上的甲状腺癌由于其分子分型相对缺失，相关分子标志物研究不够成熟，无法指导临床用药。因此，筛选新的肿瘤特异性靶点或突变抗原，研究开发新的ADC靶向药物，进行精准医学研究，提高晚期甲状腺癌患者预后至关重要。

细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)，属于免疫球蛋白超家族成员，为相对分子量90kD的单跨膜单链糖蛋白，其主要生物学功能包括促进机体炎症部位的黏连性，介导肿瘤的血行转移和淋巴结转移，调控肿瘤细胞免疫逃逸作用。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供特异性结合ICAM1的物质在制备甲状腺癌治疗或诊断产品中的用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供特异性结合ICAM1的物质在制备甲状腺癌治疗或诊断产品中的用途。

优选的，所述特异性结合ICAM1的物质选自抗体偶联药物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物。

优选的，所述抗体偶联药物的结构如下所示：Ab-(L-D)_n，其中Ab为抗ICAM1抗体，L为连接子，D为细胞毒剂，n为1-40的整数。

优选的，所述抗ICAM1抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。

优选的，所述抗体偶联药物为ICAM1-MC-VC-PAB-MMAE或ICAM1-Maleimide GGFGpeptide-Dxd，所述ICAM1为抗ICAM1抗体，所述抗ICAM1抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。

优选的，所述特异性结合ICAM1的物质为抗ICAM1抗体-磁共振成像离子螯合分子偶联物。所述抗ICAM1抗体-磁共振成像离子-磁共振成像离子螯合分子偶联物用于制备甲状腺癌诊断产品。

如上所述，本发明的特异性结合ICAM1的物质在制备甲状腺癌治疗或诊断产品中的用途，具有以下有益效果：ICAM1新靶点可以用于甲状腺癌中开发新型ADC，同时证明ICAM1-ADCs在体内及体外水平均对甲状腺癌有显著杀伤效果，为甲状腺癌的靶向治疗提供了一种有前途的靶向治疗候选药物。

附图说明

图1显示为甲状腺癌组织和癌旁组织典型IHC染色图像(A)及H评分(B)。

图2显示为TCGA数据库中ICAM1高表达甲状腺癌患者的无疾病进展生存期较差(P＝0.025)。

图3显示为ICAM1在甲状腺癌细胞系BCPAP(A)；IHH4(B)；8505C(C)；TCO1(D)中的表达情况。

图4显示为ICAM1在正常293T细胞中的表达情况。

图5显示为IF图像表明ICAM1在甲状腺癌细胞系高表达。

图6显示为甲状腺癌细胞的内化图像(A)和效率曲线(B)。

图7显示为ICAM1-Gd分子探针在甲状腺癌皮下肿瘤模型磁共振成像效果。(A)磁共振成像流程(B)ICAM1-Gd和IgG-Gd注射前后磁共振信噪比改变情况(C)T1加权和T2加权的磁共振代表性图像。

图8显示为抗ICAM1抗体两组连接子-弹头的化学结构(A)及ICAM1-ADCs在不同细胞系的杀伤效果(B-F)。

图9显示为ICAM1-ADCs在乳头状癌细胞系IHH4皮下肿瘤模型(A，B)及未分化癌细胞系8505C皮下肿瘤模型(E，F)的杀伤效果。ICAM1-ADC治疗组的肿瘤重量显著低于PBS组和化疗组(C[IHH4]，D[8505C])。不同组别间裸鼠重量在治疗期间无明显变化(G[IHH4]，H[8505C])。

具体实施方式

在本发明中，发明人在甲状腺癌细胞表面寻找肿瘤过表达膜蛋白分子ICAM1，作为抗体偶联药物靶点(细胞毒性弹头杀伤)，并找到一种能特异性地靶向治疗甲状腺癌的抗体偶联药物(ADC)。具体的，本发明验证一个新的分子靶点细胞间黏附因子1(ICAM1)在甲状腺癌的表达情况，从而开发靶向治疗甲状腺癌的抗体偶联药物(ADC)，具体通过以下方法实现：首先，通过免疫组织化学(IHC)法检测新靶点蛋白ICAM1在甲状腺癌和癌旁正常组织中表达水平。其次，应用免疫荧光(IF)染色、流式细胞术和单光子共聚焦显微镜，确定新靶点ICAM1在多种人甲状腺癌细胞(BCPAP,IHH4,TCO1,8505C)及正常肾上皮细胞(293T)上的位置和表达水平。随后，通过共聚焦成像观察甲状腺癌细胞对抗ICAM1抗体的内吞能力，并用流式细胞仪定量其内吞效率。随后，制备2个具有不同连接子和弹头的ADC候选药物。最后在体内及体外不同水平评估这2个ADC候选药物在甲状腺癌的治疗效果。组织芯片IHC显示新靶点ICAM1在甲状腺癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织，H评分差异具有统计学差异。4株甲状腺癌细胞均过表达ICAM1靶蛋白，并且ICAM1靶蛋白主要表达在细胞膜位置；高表达ICAM1的甲状腺癌细胞对抗ICAM1抗体显示显著的内吞活性，内化效率在4小时内达到30％以上。在体外实验中，测定两种ADC候选药物IC1-MMAE(ICAM1-MC-VC-PAB-MMAE)，IC1-Dxd(ICAM1-Maleimide GGFG peptide-Dxd)在细胞上的半数抑制浓度(IC50)。IC1-MMAE和IC1-Dxd在四种甲状腺癌细胞中均有显著杀伤，IC1-Dxd及IC1-MMAE对正常细胞基本没有杀伤效果。而在IHH4，BCPAP中，IC1-MMAE的IC50分别为0.11nM和74.6nM；IC1-Dxd的IC50分别为1.19nM和21.9nM；在IHH4，BCPAP中，IC1-MMAE的IC50分别为4.3nM和6.2nM，显示出良好的抗肿瘤活性。在体内试验中，IC1-MMAE和IC1-Dxd均可以有效地抑制IHH4和8505C皮下肿瘤生长，抑制效果显著优于化疗紫杉醇组，差异具有统计学意义。综上本发明确定ICAM1是治疗甲状腺癌的一个全新的ADC靶点。在此基础上制备并表征了2个ADC候选药物，体内试验及体外试验均验证了其抗肿瘤活性和生物安全性，为甲状腺癌的靶向治疗提供了一种有潜力的靶向治疗候选药物。

本发明首先提供ICAM1或其编码基因作为靶标在制备甲状腺癌治疗或诊断产品中的用途。

所述ICAM1或其编码基因作为靶标在制备甲状腺癌治疗或诊断产品具体是指：将ICAM1蛋白或其编码基因作为识别对象，能够降低ICAM1水平或杀伤甲状腺癌细胞的物质。

本发明还提供特异性结合ICAM1的物质在制备甲状腺癌治疗或诊断产品中的用途。

在一种实施方式中，所述特异性结合ICAM1的物质选自抗体偶联药物或其药学上可接受的盐或溶剂化合物。

在一种实施方式中，所述抗体偶联药物的结构如下所示：Ab-(L-D)n，其中Ab为抗ICAM1抗体，L为连接子，D为细胞毒剂(或称为弹头)，n为1-40的整数。

本发明中，抗ICAM1抗体选自单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及抗体片段(例如，Fab，F(ab’)2，Fv，scFv)。术语“免疫球蛋白”(Ig)和“抗体”可互换使用。

所述抗ICAM1抗体可以选自现有技术中任意能够与ICAM1结合的抗体或其抗原结合片段，例如MabPlex公司的ICAM1抗体。

在一种实施方式中，所述抗ICAM1抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1和2所示：

MGWSCIILFLVATATGVHSQVQLQQSGPELVRPGVSVKISCKGSGYTFIDYAIHWVKESHAKSLEWIGVISAYSGDTNYNQKFKGKATMTVDKSSNTAYLELARLTSEDSAIYYCARGGWLLLSFDYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：1)

MGWSCIILFLVATATGVHSDVVMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNNYLHWYLQKSGQAPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO：2)

所述抗ICAM1抗体经连接子偶联至细胞毒剂。连接子分为两类：不可断裂连接子和可断裂连接子。可断裂连接子可以在目标细胞内断裂并释放出药物毒剂。可断裂连接子可分为两个主要的类别：化学不稳定连接子和酶不稳定连接子。化学不稳定连接子可以由于血浆和细胞质性质的不同而选择性的断裂。这样的性质包括pH值、谷胱甘肽浓度等。对pH值敏感的连接子，通常又称为酸断裂连接子，这样的连接子在血液的中性环境下相对稳定(pH7.3-7.5)，但是在弱酸性的内涵体(pH5.0-6.5)和溶酶体(pH4.5-5.0)内将会被水解。对于谷胱甘肽敏感的连接子，又称二硫键连接子。酶不稳定连接子，如肽连接子，能够更好地控制药物释放。肽连接子能够被溶酶体内蛋白酶，如组织蛋白酶(Cathepsin B)或纤溶酶(在一些肿瘤组织中此类酶含量增加)有效地切断。这种肽连接在血浆循环中非常稳定，这是因为细胞外不合宜的pH值及血清蛋白酶抑制剂导致蛋白酶通常不具备活性。鉴于较高的血浆稳定性和良好的细胞内断裂选择性和有效性，酶不稳定连接子被广泛用做抗体药物偶联物的可断裂连接子。典型的酶不稳定连接子包括Val-Cit(vc)、Phe-Lys、Gly-Gly-Phe-Gly等。

连接子可以包含一种或多种连接子构件。例示性的连接子构件包括6-马来酰亚胺基己酰基、马来酰亚胺基丙酰基-缬氨酸-瓜氨酸、丙氨酸-苯丙氨酸、对氨基苯甲酰氧基羧基、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯、N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1羧酸酯和N-琥珀酰亚胺基(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸酯。其它示例性的连接子构件还可以是包含氨基酸单元以容许蛋白酶切割的连接子，由此便于在暴露于胞内蛋白酶(诸如溶酶体酶)后从抗体偶联药物释放细胞毒剂。示例性的氨基酸单元包括但不限于二肽、三肽、四肽和五肽。示例性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸；丙氨酸-苯丙氨酸；苯丙氨酸-赖氨酸；或N-甲基-缬氨酸-瓜氨酸。示例性的三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸或甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸。示例性的四肽包括：甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸。

所述细胞毒剂选自毒素、化疗药物、抗生素、放射性同位素、生长抑制剂、纳米抗体或多肽。

示例性的细胞毒剂包括：美登素；类美登素；拓扑异构酶Ⅰ抑制剂(如喜树碱衍生物：DX-8951衍生物Dxd)；微管蛋白抑制剂(如单甲基耳抑素肽E(MMAE)和单甲基耳抑素肽F(MMAF)；卡奇霉素类(如卡奇霉素)；阿霉素类(如阿霉素)；苯并二吡咯类抗生素(如duocarmycins、CC-1065等)和其它的环丙基吡咯吲哚-4-酮(cyclopropapyrroloind-4-one，CPI)衍生物，如环丙苯并吲哚-4-酮类似物，以及吡咯并苯二氮卓类(PBD)或者PBD二聚体类。

所述抗体偶联药物的结构Ab-(L-D)n中n为药物抗体比值(DAR值)，n的范围选自以下任一：1～5、5～10、10～15、15～20、20～25、25～30、30～35、35～40。

在一种实施方式中，所述抗体偶联药物选自anti-ICAM1 mAb-MC-VC-PAB-MMAE(简称为ICAM1-MMAE)或anti-ICAM1 mAb-MC-GGFG-Dxd(简称为ICAM1-Dxd)。

所述ICAM1-MMAE的DAR值为4。

所述ICAM1-Dxd的DAR值为8。

所述连接子中的马来酰亚胺基与抗ICAM1抗体中的半胱氨酸共价偶联。

在另一种实施方式中，所述特异性结合ICAM1的物质选自ICAM1抑制剂。

ICAM1抑制剂指对于ICAM1具有抑制效果的分子。对于ICAM1具有抑制效果包括但不限于：抑制ICAM1的水平或活性。

抑制ICAM1活性是指使ICAM1活力下降。优选地，相比抑制前，ICAM1活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。

抑制ICAM1水平可以是通过抑制ICAM1基因的转录或翻译，具体的，可以是指：使ICAM1基因不转录，或降低ICAM1基因的转录活性，或者使ICAM1基因不翻译，或降低ICAM1基因的翻译水平。

本领域技术人员可以使用常规方法对ICAM1基因表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰RNA等。

优选地，与野生型相比，ICAM1基因表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地ICAM1基因完全没有表达。

所述ICAM1抑制剂包括但不限于：核酸分子、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白、干扰慢病毒或腺相关病毒。所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶I II制备的小干扰RNA或者短发夹RNA(shRNA)。所述蛋白例如为单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)纳米抗体、以及抗体片段(例如，Fab，F(ab’)2，Fv，scFv)。

在一种实施方式中，所述特异性结合ICAM1的物质为抗ICAM1抗体-磁共振成像离子-磁共振成像离子螯合分子偶联物。

所述磁共振成像离子为顺磁性金属离子、荧光染料、近红外光免疫药物、免疫抑制剂、免疫激动剂；优选的，所述顺磁性金属离子选自Gd3+、Mn2+、Fe3+、Cu2+、Ni3+中的一种或多种。

所述磁共振成像离子螯合分子为顺磁性金属离子螯合分子；优选的，所述顺磁性金属离子螯合分子选自DOTA、NOTA、DTPAA、BOPTA、HPDO3A中的一种或几种。

所述甲状腺癌治疗或诊断产品必然包括特异性结合ICAM1的物质，并以特异性结合ICAM1的物质作为有效成分。

所述甲状腺癌治疗或诊断产品可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述甲状腺癌治疗或诊断产品的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述甲状腺癌治疗或诊断产品主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。

所述甲状腺癌治疗或诊断产品包括但不限于药物、保健品、食品等。

所述甲状腺癌治疗产品选自：靶向的ICAM1抗体或抗原结合片段，外泌体，脂质体，SLP纳米颗粒，CAR-T细胞，溶瘤病毒，ADC，小分子偶联药物，双特异性抗体，核酸分子、小分子化学药、多肽、蛋白、干扰慢病毒或腺相关病毒等等；所述甲状腺癌诊断产品选自：外泌体，CTC，CT DNA，血液/尿液蛋白或MRI/PET/超声等影像探针等。

所述甲状腺癌选自分化型甲状腺癌(differentiated thyroid carcinoma,DTC)、甲状腺髓样癌或甲状腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma,ATC)。DTC选自甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)或滤泡性甲状腺癌。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例中主要实验材料如下：

甲状腺癌组织芯片(阵列编号：HThy-Can060PT-01；HThyP120CS02)，购自上海芯超生物科技公司。培养基MEM、RPMI-1640和胎牛血清购自美国Gibco公司。CCK8试剂盒(货号：BS350B)，购自Bioshrp公司；PE anti-mouse IgG1(货号：406608)和Purified anti-humanCD54(货号：322702)，均购自美国Biolegend公司。抗体偶联药物Anti-ICAM1mAb-MC-VC-PAB-MMAE(IC1-MMAE)、Anti-ICAM1 mAb-Maleimide-GGFG-Dxd(IC1-Dxd)和Anti-ICAM1 mAb均委托第三方公司合成，Anti-ICAM1 mAb重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。

细胞培养及传代：甲状腺癌细胞采用含10％胎牛血清、青霉素100U/ml和链霉素100μg/ml的DMEM或RPMI-1640培养液置37℃、5％CO₂培养箱常规培养。2-3天换一次培养液，对细胞生长密度到达90％左右、处于对数生长期的细胞，用胰酶消化，进行传代和后续实验。

实施例1甲状腺癌高表达且表达位置主要在细胞膜

采用免疫组织化学(IHC)法检测了86组人甲状腺癌组织和癌旁组织中ICAM1靶蛋白表达水平的差异。根据H评分法评估ICAM1免疫染色密度。H评分＝染色弱的肿瘤细胞％+染色中等的肿瘤细胞％×2+染色强的肿瘤细胞％×3，H评分范围从0(100％阴性肿瘤细胞)到300分(100％强染色肿瘤细胞)。每个组织样本根据H评分进行半定量评分。

免疫组化结果表明ICAM1在甲状腺癌高表达且表达位置主要在细胞膜，而正常甲状腺组织低/不表达ICAM1。免疫组化IHC典型图像如图1中A。新靶点ICAM1在未分化甲状腺癌和乳头状甲状腺癌免疫组化H评分显著高于正常甲状腺组织，有统计学差异，P均＜0.0001(图1中B)。

而由此可知，在人甲状腺肿瘤组织中的ICAM1表达水平明显高于癌旁组织，癌旁组织不表达ICAM1靶蛋白。ICAM1靶蛋白在甲状腺癌组织中特异性表达，有作为ADC药物靶点的潜力。

同时在TCGA数据库中，通过对510例甲状腺癌患者的生存数据进行Kaplan-Meier法统计分析，ICAM1高表达的甲状腺癌患者无疾病进展生存期更短，预后更差，差异有统计学意义，P＜0.05(图2)。因此，研究开发一种针对ICAM1阳性的甲状腺癌患者的ADC药物，对改善临床甲状腺癌不良预后的有重要的意义。

实施例2流式细胞术(FACS)检测细胞株ICAM1表达强度

用流式细胞术分别检测体外培养的人甲状腺癌细胞株(BCPAP,IHH4,TCO1,8505C)中ICAM1的表达水平。收集1×10⁶细胞，用PBS冲洗两次。获得的细胞在冰浴中用PBS中的1％牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)封闭30分钟。BSA阻断后，细胞在室温下分别与藻红蛋白(Phycoerythrin,PE)结合的ICAM1抗体孵育1小时。PE结合的IgG作为对照。用1％BSA在PBS中冲洗细胞三次，在PBS中再悬浮，并使用流式细胞仪进行评估各细胞株中ICAM1的表达强度。

由流式结果可知，4株甲状腺癌细胞(BCPAP,IHH4,TCO1,8505C)均过表达ICAM1靶蛋白，ICAM1峰(蓝色)和非特异性lgG峰(橙色)显著分离，流式结果表明，ICAM1在人类甲状腺癌细胞(BCPAP,IHH4,TCO1,8505C)的高度表达(图3)，在正常293T细胞中低表达(图4)。这验证了ICAM1靶点的高度特异性，为成功研究开发一种靶向ICAM1靶蛋白的ADC药物提供了可能性。

实施例3免疫荧光染色(IF)验证ICAM1靶蛋白在细胞膜上

在单光子共聚焦显微镜下观察甲状腺癌细胞(BCPAP,IHH4,TCO1,8505C)中ICAM1靶蛋白的亚细胞位置。取1×10⁶细胞接种在共聚焦皿中，共3皿，各加1mL培养基，37℃过夜培养。去除培养基，PBS浸润洗涤1次。冰浴条件下，取1ml含1％BSA的PBS封闭细胞15-30min。封闭后，吸去液体，在37℃分两组孵育抗体:第①组取2ul的lgG-PE+1ml的PBS孵育细胞1h；第②组取2ul的ICAM1-PE+1ml的PBS孵育细胞1h；加1ml的PBS洗1次；加1ml的Hoechst细胞核染液，37℃静置染色20-30min；取1ml的PBS洗涤1-2次，单光子共聚焦显微镜下观察。

免疫荧光染色结果如图5，红色荧光圈为带PE的ICAM1抗体，蓝色荧光团为被hoechst染液染过的细胞核。可以看到，两株高表达ICAM1的甲状腺癌细胞(BCPAP,IHH4,TCO1,8505C)i细胞膜位置显示一圈红色荧光，验证了ICAM1靶蛋白定位在细胞膜上。

实施例4成像流式细胞术定量ICAM1抗体的细胞内化效率

结合ADC的靶向作用原理，抗ICAM1抗体能否被细胞膜上的抗原靶点介导内吞，是影响ADC疗效的另一个重要因素。因此用成像流式细胞术确定ICAM1 ADCs是否能选择性进入甲状腺癌细胞并快速转运至细胞内溶酶体。

将1×10⁶个细胞接种在共聚焦皿，种5皿，各加1ml培养基，37℃过夜；去除培养基，冰浴条件下，加2ul ICAM1-PE+1ml的PBS；置冰上染色30min后，用冷的PBS洗一遍；加1mlPBS，37℃中使其内吞0、30、60、120、240min。各组时间一到，即用PBS洗1-2次，随后用4％多聚甲醛固定10min，PBS洗1-2次。吸出PBS，加1ml的hoechst染液，37℃染色20-30min，吸去染液，PBS洗1-2次；最后在共聚焦仪器下拍照，分析，保存。

使用成像流式细胞术定量了甲状腺癌细胞(BCPAP,IHH4,TCO1,8505C)中ICAM1抗体的细胞内化率的结果如图6所示。ICAM1靶蛋白在BCPAP,IHH4,TCO1,8505C中高度过度表达。BCPAP,IHH4,TCO1,8505C对抗ICAM1抗体结合物有明显的内化趋势，并随时间变化，靶蛋白抗体结合物向肿瘤细胞内移动，如图6中A。观察的4株甲状腺癌细胞在4h内均能达到30％以上的内化率，如图6中B。

这些结果说明了该靶点ICAM1作为甲状腺癌的ADC靶点具有突出的潜在效用，可以进行ICAM1抗体偶联物的设计、制备和表征，并测定其ADC药物的体外、体内抗甲状腺癌活性。

实施例5ICAM1-Gd磁共振分子探针的制备

采用一种无侵入性的核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)分子影像学方法，将Gd(钆，广泛应用于临床的MRI增强对比剂)与ICAM1抗体偶联制备成MRI分子探针(ICAM1-Gd)，定量检测肿瘤内部ICAM1靶点表达水平以及肿瘤与ICAM1抗体的结合程度，提供解剖和功能信息，可用于评估肿瘤及其微环境、空间异质性特征和疾病演变的纵向评估，从而对ICAM1-ADC靶向治疗肿瘤进行疗效评价及预测患者是否获益。

将前述ICAM1单克隆抗体与临床使用的MRI造影剂Gd通过使用螯合方式进行偶联。制备流程包括把DTPA酸酐(DTPAA)与ICAM1抗体在NaHCO3缓冲体系中震荡过夜；然后DTPAA偶联的ICAM1抗体过滤纯化；提纯后的DTPAA偶联ICAM1抗体与GdCl3在柠檬酸缓冲缓冲体系中震荡过夜；过滤纯化后得到最终产物Gd标记的ICAM1抗体(ICAM1-Gd)。

ICAM1-Gd分子探针对裸鼠甲状腺癌皮下肿瘤模型的MRI成像如图7所示。经尾静脉注射ICAM1-Gd分子探针后荷瘤小鼠活体MRI提示ICAM1-Gd分子探针对肿瘤分辨率较高，信噪比提高显著高于IgG-Gd(50.24％vs.9.6％,p＝0.013)。表明ICAM1-Gd探针可以作为ICAM1-ADC药物的分子诊断标记物，并辅助预测ICAM1-ADC的疗效，实现精准治疗。

实施例6ADC药物的制备

药物是否能被肿瘤细胞吞噬，并在细胞内有效释放是研究ADC是否有效的重要因素。因此确定ADC药物能被表面抗原介导内化后，还需确定药物在细胞内被转运至溶酶体，在溶酶体内连接子被降解，药物受控释放进而杀伤肿瘤细胞。ADC药物的结构组成决定了其高靶向性，高肿瘤细胞杀伤力的特性。因此，在确定了靶蛋白ICAM1的基础上，选择ICAM1-MC-VC-PAB-MMAE和ICAM1-Maleimide GGFG peptide-Dxd两种ICAM1 ADCs，化学结构如图8中A，通过疏水相互作用色谱法(HIC)测定两种ICAM1 ADCs的药物/抗体比值(DAR)值，可知IC1-MMAE的DAR为4，IC1-Dxd的DAR为8。

实施例7CCK8实验评估ADC药物对细胞株的体外抑制活性IC50

CCK8实验测定4种人甲状腺癌细胞系和1种正常肾上皮细胞293T的IC50值。细胞以每孔5000个细胞的密度接种在96孔培养皿中,培养过夜，贴壁后加入两种不同的ICAM1 ADC(IC1-MMAE、IC1-Dxd)药物作用,药物浓度为0-10ug/mL，10倍连续稀释，共8个浓度，3个平行孔。细胞和药物培养72小时后，弃去原培养基，用新鲜细胞培养基将CCK8检测试剂10倍稀释，100PL/孔加入到96孔板中，37℃孵育，最后用酶标仪在450nm的吸收波长下读取吸光值(OD)。通过比较药物孵育的细胞与不加药物孵育的对照细胞的吸光度来确定细胞活力。

比较两种ADC候选药物IC1-MMAE、IC1-Dxd和临床用一线化疗药物Pac在四株甲状腺癌肿瘤细胞(BCPAP,IHH4,TCO1,8505C)和正常293T细胞(HcerEpic)的体外抑制活性IC50，结果图如图8中B-F，可以看出，IC1-MMAE和IC1-Dxd在四种甲状腺癌细胞中均有显著杀伤，且杀伤效果比在正常293T细胞更显著，IC1-Dxd及IC1-MMAE对正常细胞基本没有杀伤效果。而在IHH4，BCPAP中，IC1-MMAE的IC50分别为0.11nM和74.6nM；IC1-Dxd的IC50分别为1.19nM和21.9nM；在IHH4，BCPAP中，IC1-MMAE的IC50分别为4.3nM和6.2nM。IC1-MMAE的IC50显著低于临床上治疗甲状腺癌的一线标准化疗药物紫杉醇(Paclitaxel,Pac)，IC50相差300倍。

使用的统计学方法：

应用GraphPad Prism 9.0和FlowJo V10对实验数据进行统计分析，计量数据以均数±方差(SD)表示，两组间的差异性比较用t检验进行分析，P＜0.05被认为有统计学差异。对于生存分析，使用GraphPad Prism 8.0中Mantel-Cox测试显著性水平分为*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001和****p<0.0001。应用GraphPad Prism 9.0对实验数据进行相关图片的绘制。

实施例8体内试验评估ADC药物对甲状腺癌的体内抑制活性

在动物实验中构建了IHH4和8505C肿瘤细胞的两种皮下肿瘤模型，并在上述两种皮下肿瘤模型中测定了ICAM 1-ADC对甲状腺癌的靶向治疗效果(图9)。结果发现通过尾静脉注射的IC1-MMAE和IC1-Dxd都有效地抑制IHH4和8505C肿瘤生长(图9)。根据治疗后的肿瘤重量和生长曲线分析(图9)，IC1-Dxd(剂量5mg/kg/周)的治疗效果要更加优于相同剂量的IC1-MMAE及紫杉醇组，差异均有统计学意义。而治疗期间，小鼠的重量无明显变化。综上，ICAM 1-ADC药物对不同甲状腺癌细胞系动物肿瘤模型均有优良的靶向治疗效果。

本发明验证了ICAM1靶蛋白在甲状腺癌组织和细胞系表面的过表达水平，及在癌旁组织和正常宫颈细胞的低表达或不表达。结合ADC的靶向作用原理，抗ICAM1抗体能否被细胞膜上的抗原靶点介导内吞，是影响ADC疗效的另一个重要因素。内化、转运或再循环有关的干扰、抗原的脱落以及ADC的溶酶体降解缺陷都会导致药物释放的减少，从而影响ADCs的疗效，因此还测定了ICAM1 ADC在ICAM1+的甲状腺癌细胞介导的内吞作用下令人满意的内吞效率。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

本发明的ADC候选药物IC1-MMAE和IC1-Dxd用的是lgG1亚型的抗体，抗ICAM1抗体。连接子选用可裂解连接子，包括连接子MC-Val-Cit-PAB(MC-VC-PAB)，是一种蛋白酶裂解的连接子；接头为在体内循环更稳定的马来酰亚胺-GGFG接头(Maleimide GGFG peptide)，它在细胞内蛋白酶的裂解作用下，能更好地控制释放药物。选用的弹头MMAE、Dxd是临床上使用的ADC弹头，包括作用于细胞增殖分化过程，抗细胞有丝分裂的微管抑制剂一甲基奥瑞斯他汀E(monomethyl auristatin E，MMAE)，和拓扑异构酶I抑制剂，一种具有独特六环结构的喜树碱的水溶性结构类似物exatecan的高效衍生物deruxtecan(DXd)。抗体/药物比值DAR为4和8，在临床上现有的ADC合适范围内，能平衡有效性和毒性。这两种ADC候选药物IC1-MMAE和IC1-Dxd在体内水平和体外水平都有其优越之处，并且在特异性杀伤肿瘤细胞上比传统化疗药物紫杉醇效果更佳。

综上所述，本研究探索ICAM1新靶点在甲状腺癌中开发新型ADC的可能性，同时证明ICAM1-ADCs在体内及体外水平均对甲状腺癌有显著杀伤效果，为甲状腺癌的靶向治疗提供了一种有前途的靶向治疗候选药物。

Claims (13)

1.特异性结合ICAM1的物质在制备甲状腺癌治疗或诊断产品中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述特异性结合ICAM1的物质选自抗体偶联药物或其药学上可接受的盐。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述抗体偶联药物的结构如下所示：Ab-(L-D)_n，其中Ab为抗ICAM1抗体，L为连接子，D为细胞毒剂，n为1-40的整数。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，抗ICAM1抗体选自全长抗体或抗体片段；优选的，所述抗体片段选自Fab，F(ab’)2，Fv或scFv。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述抗ICAM1抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示；

和/或，

所述连接子选自不可断裂连接子或可断裂连接子；优选的，所述可断裂连接子选自化学不稳定连接子或酶不稳定连接子。

6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述连接子包含一种或多种连接子构件，所述连接子构件选自马来酰亚胺基丙酰基、马来酰亚胺基己酰基、对氨基苯甲酰氧基羧基、缬氨酸-瓜氨酸、丙氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸、甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸中的任一个或多个；优选的，所述连接子选自马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲酰氧基羧基或马来酰亚胺-GGFG四肽。

7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述细胞毒剂选自毒素、化疗药物、抗生素、放射性同位素、小分子抑制剂、纳米抗体或多肽。

8.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述细胞毒剂选自以下中的任一个或多个：美登素、类美登素、拓扑异构酶Ⅰ抑制剂、微管蛋白抑制剂、卡奇霉素及其衍生物、阿霉素及其衍生物；优选的，所述细胞毒剂选自DX-8951衍生物Dxd、MMAE或MMAF。

9.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述抗体偶联药物为ICAM1-MC-VC-PAB-MMAE或ICAM1-Maleimide GGFG peptide-Dxd，所述ICAM1为抗ICAM1抗体，所述抗ICAM1抗体的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。

10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述特异性结合ICAM1的物质为ICAM1抑制剂；优选的，所述ICAM1抑制剂选自核酸、小分子化学药、多肽、蛋白、干扰慢病毒或腺相关病毒。

11.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述特异性结合ICAM1的物质为抗ICAM1抗体-磁共振成像离子-磁共振成像离子螯合分子偶联物。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述磁共振成像离子为顺磁性金属离子、荧光染料、近红外光免疫药物、免疫抑制剂、免疫激动剂；优选的，所述顺磁性金属离子选自Gd3+、Mn2+、Fe3+、Cu2+、Ni3+中的一种或多种；

和/或，

所述磁共振成像离子螯合分子为顺磁性金属离子螯合分子；优选的，所述顺磁性金属离子螯合分子选自DOTA、NOTA、DTPAA、BOPTA、HPDO3A中的一种或几种。

13.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述甲状腺癌选自分化型甲状腺、甲状腺髓样癌或甲状腺未分化癌；优选的，所述分化型甲状腺癌选自乳头状甲状腺癌。

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