CN105435242A - 人miR-23a在制备细胞生长和/或衰老调控剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了人微RNA(microRNAs)miR-23a在制备细胞生长和衰老调控剂中的应用。所述人微RNA(microRNAs)miR-23a在衰老的人成纤维细胞中高表达。miR-23a直接作用于人端粒蛋白TRF2的信使RNA(mRNA)的3’-非翻译区(3’UTR)，抑制TRF2的mRNA和蛋白表达。在人成纤维细胞MRC-5中，过表达miR-23a可降低细胞生长速度和加速细胞衰老。因此，miR-23a在细胞生长和衰老过程中有着重要的调控功能，可以针对miR-23a开发有效的细胞生长和衰老的调控剂，延缓细胞衰老过程。

Description

人miR-23a在制备细胞生长和/或衰老调控剂中的应用

技术领域

本发明涉及细胞衰老领域。更具体地，人微RNA(microRNAs)miR-23a在制备细胞生长和衰老调控剂中的应用。

背景技术

microRNAs(以下简称miRNAs)是一类长约20-24nt(少数小于20nt的)的单链小分子非编码RNA，由一段具有茎环结构的、长度为70-80nt的单链RNA前体(pre-miRNA)经剪切而生成。miRNAs通过与mRNA分子的3'非编码区域(3'-untranslatedregion,3'UTR)互补匹配导致该mRNA分子的翻译受到影响或被降解。miRNA的形成始于细胞核内由RNA聚合酶II或III转录得到片段较长的初级miRNA(pri-miRNA)，然后在核内由dsRNA特异性核酸酶Drosha剪切为约70nt，具有茎环结构的miRNA前体(pre-miRNA)。pre-miRNA在Ran-GTP依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin5的作用下，从核内运输到胞质中，再由Dicer酶(双链RNA专一性RNA内切酶)进一步加工成为～22nt的成熟双链miRNA(miRNA:miRNA*双螺旋)，随即双链中的一条链被整合到RNA沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)中，形成非对称RISC复合物(asymmetricRISCassembly，miRISC)。当miRISC识别互补或部分互补的目标mRNA分子的3'UTR后，就会阻止蛋白质的翻译或者降解mRNA，从而抑制基因的表达。microRNAs通过调控靶基因的表达，参与调控许多生物学过程，如细胞周期、肿瘤发生发展、肿瘤转移和干细胞多能性等。

端粒是真核生物染色体末端由高度重复DNA序列(TTAGGG)及其相互作用蛋白组成的高度有序的特殊结构。它起到保护染色体末端、维持基因组稳定性及参与细胞衰老调控等生物学过程。正常人细胞每分裂一次，由于末端复制问题，端粒长度将逐渐变短，当端粒缩短到一定界限时，细胞无法继续分裂，进入衰老和死亡过程。端粒结合蛋白是特异结合在端粒上的特殊蛋白，具有保护端粒，稳定端粒结构，防止端粒间融合，抑制DNA损伤发生等功能。人类端粒蛋白复合物由6个蛋白组成，分别是TRF1、TRF2、TIN2、RAP1、TPP1和POT1。在这六个蛋白中，TRF2处于核心地位。Telomererepeatbindingfactor2(TRF2)也称TERF2,TRF2主要由TRFH结构域、C端的SANT/Myb结构域和N端碱性的GAR结构域组成。TRF2是端粒复合物中的蛋白相互作用中心，沟通了不同的信号转导通路。TRF2能抑制ATM介导的DNA损伤修复通路，避免端粒被细胞内检测系统误认为是DNA损伤区。TRF2维持端粒的T-loop结构，防止端粒的同源重组和非同源末端结合的发生。TRF2还能与许多参与DNA损伤监测和DNA修复蛋白相互作用，如ERCC1/XPF、Apollo、MRN。

细胞衰老是一个复杂有序的生物学过程。体外培养的正常细胞经过有限次数分裂，端粒逐渐缩短，DNA损伤积累，细胞形态和生理代谢活动发生改变，表现出细胞生长减慢、β半乳糖苷酶活性升高和炎症因子分泌增多等。衰老可引起组织代谢减缓，器官机能衰退，诱发各种衰老相关的退行性疾病，如阿尔茨海默病亨廷顿病等。此外，由于上世纪80年代开始的计划生育的实施，人口数量得到控制，却导致现在的中国逐渐进入人口老年化社会，将引发各种社会保障的危机。因此，研发抗衰老或延缓衰老药物，不仅对衰老相关疾病的治疗有重要帮助，而且对解决人口老年化问题也有巨大意义。

在细胞衰老的过程中，衰老细胞的TRF2蛋白含量比年轻细胞的要显著降低，而在年轻细胞中下调TRF2将加速细胞衰老，提示了TRF2的表达量对控制细胞生长和衰老的重要作用。因此，寻找调控TRF2表达的因子，为我们研究细胞生长衰老过程和抗衰老药物的开发具有重要的指导意义。

发明内容

本发明目的提供了一种新的细胞生长调控剂/衰老调控剂。

首先，发明提供了miR-23a或miR-23a调控剂在制备细胞生长和/或衰老调控剂中的应用。

发明人首次发现，miR-23a在调控细胞生长和衰老过程中有重要作用。

在衰老的细胞中，miR-23a的表达量显著高于年轻细胞。

进一步的研究证明，miR-23a过表达将抑制细胞生长和加速细胞衰老。miR-23a或miR-23a表达正向调控剂可用于制备细胞生长延缓剂或加速细胞衰老制剂。

发明同时发现，抑制miR-23a的表达，将有利于抗衰老。miR-23a抑制剂可用于制备抗衰老制剂。miR-23a抑制剂可以是miR-23a的表达抑制剂或功能抑制剂，例如，可以是反义寡核酸抑制剂、包含多个miRNA结合位点的捕获转录本miRNA海绵体。

进一步地，本发明发现miR-23a可作为TRF2表达抑制剂。发明解析了miR-23a在调控细胞生长和衰老过程中的功能。miR-23a通过抑制TRF2的表达，进而抑制细胞生长和加速细胞衰老。

发明人发现，miR-23a与端粒蛋白TRF2的表达呈负相关。这样的机制不论是在年轻还是衰老的细胞中都是成立的。

TRF2端粒蛋白及其机制在人体细胞中普遍存在。本发明的研究过程以人成纤维细胞为代表，本领域技术人员可以合理预期，在具有TRF2端粒蛋白机制的细胞中，miR-23a将起到类似的作用。

人成纤维细胞是人体正常细胞的一种较为典型的代表。在人体多种组织器官中，存在人成纤维细胞。

本领域技术人员可以合理预期的是，miR-23a抑制剂可以起到抗衰老的作用，其作用对象包括人体多种组织、器官，包括但不限于人体皮肤器官。

进一步地，miR-23a可作为TRF2的3’UTR的结合制剂。研究发现，miR-23a通过直接作用于TRF2的3’UTR，抑制TRF2的表达，进而抑制细胞生长和加速细胞衰老。

具体地，miR-23a通过其第2-8位种子序列(seedregion)与TRF2的3’UTR的第687-693位碱基互补配对，降低TRF2的mRNA和蛋白水平，导致细胞生长速度减缓，加速细胞衰老。

因此，miR-23a在调控细胞生长和衰老过程中有着重要功能，可以针对其调控机制制备有效的细胞生长和衰老调控剂或抗衰老药物。

优选地，所述应用是miR-23a在制备以端粒蛋白TRF2为靶点的细胞生长和衰老调控剂方面的应用。

优选地，本发明提供了miR-23a的正向调控剂在制备细胞生长和衰老调控剂方面药物方面的应用。

另外，本发明还提供了一种细胞生长和衰老调控的药物制剂，包括有效量的miR-23a，还可进一步包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述药物制剂为注射制剂或口服制剂。

优选地，所述注射制剂为冻干粉针剂。

优选地，所述口服制剂为散片剂、胶囊剂或颗粒剂。

除此，如果需要检测或预测细胞生长速度/衰老速度，可以采用miR-23a检测试剂，检测miR-23a的表达量，以其来检测或预测细胞生长速度/衰老速度。

本发明克服了现有miRNAs关于细胞生长和衰老的问题和技术不足，提供了人微RNAmiR-23a在制备细胞生长和衰老调控剂上的应用。本发明发现在人成纤维细胞中miR-23a抑制端粒蛋白TRF2表达，抑制细胞生长和促进细胞衰老。因此，根据miR-23a的这种功能，开发应用抗衰老药物，对延缓衰老具有举足轻重的意义。

附图说明

图1为内源TRF2蛋白在年轻和衰老的人成纤维细胞MRC-5和BJ中的表达情况；GAPDH作为上样内参。

图2为内源miR-23a在年轻和衰老的人成纤维细胞MRC-5和BJ中的表达情况。

图3为miR-23a在TRF2的3’UTR作用碱基互补示意图及荧光素酶报告系统结果；wTRF2为野生型TRF23’UTR，mTRF2位作用位点突变型TRF23’UTR。

图4为内源TRF2在对照、TRF2敲低和miR-23a过表达的MRC-5细胞中mRNA表达情况。

图5为TRF2在对照、TRF2敲低、miR-23a过表达和挽救(rescue)细胞中的蛋白表达情况；GAPDH作为上样内参。GFP为挽救(rescue)实验的对照。

图6为对照、TRF2敲低、miR-23a过表达和挽救(rescue)细胞的生长曲线结果。

图7为对照、TRF2敲低、miR-23a过表达和挽救(rescue)细胞的衰老相关β半乳糖苷酶染色结果。

图8为miR-23a的作用机制示意图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备为本技术领域常规试剂和设备；未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。

本发明为了验证人微RNA(microRNAs)miR-23a对细胞生长和衰老的调控功能，具体实验设计如下：

S1.免疫印迹实验，检测细胞內源TRF2、GAPDH和外源TRF2、GFP水平；

S2.实时荧光定量PCR实验，检测细胞TRF2和miR-23a水平；

S3.双荧光素酶报告系统实验，研究miR23a与TRF2的3’UTR相互作用情况。

S4.构建miR-23a过表达细胞和TRF2挽救(rescue)细胞系。

S4.细胞生长曲线实验，研究miR-23a对细胞生长的影响。

S5.衰老相关β半乳糖苷酶染色实验，研究miR-23a对细胞衰老的影响。

实施例1免疫印迹实验

1、实验材料

试剂：本实验所用TRF2內源抗体(购于Merck公司，产品货号OP-129)，使用时用3％牛血清蛋白(BSA)按1:500稀释；GAPDH抗体(购于Abmart公司，产品货号3B3)，使用时用3％BSA按1:5000稀释；GFP抗体(购于Abcam公司，产品货号ab290)，使用时用3％BSA按1:5000稀释；Flag抗体(购于sigma公司，产品货号F7425)，使用时用3％BSA按1:5000稀释；二抗(羊抗鼠，购于LI-COR公司，产品货号926-68050，羊抗兔，购于LI-COR公司，产品货号926-32211)，使用时用3％BSA按1:10000稀释。

人成纤维细胞MRC-5和BJ，由中山大学生命科学学院赵勇教授惠赠。

2、实验方法

S1.细胞裂解液准备：按照常规人成纤维细胞培养方法进行培养，收集细胞，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗一次；用PBS悬浮，加5XSDS上样缓冲液裂解煮沸。

所述培养基的组成为：DMEM培养基、10％FBS。

S2.SDS聚丙烯酰胺电泳：将样品加入凝胶孔，设程序80V30分钟，1201小时，样品跑至凝胶底部。

S3.湿转膜：将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，设程序200mA2小时。

S4.封闭：用质量体积比5％的脱脂奶粉(用TBS配制)做封闭液，封闭一小时。

S5.一抗结合：孵一抗4℃过夜(12小时)，用TBST洗膜3遍，每次5分钟。

S6.二抗结合(该步骤需避光)：孵二抗，置于室温1小时后TBST洗三次，每次5分钟。

S7.检测：使用licorodyssey双色红外激光成像系统进行显色拍照。

3、实验结果

(1)实验结果如附图1所示，内源TRF2在衰老细胞的表达量比年轻的细胞中低，说明TRF2在衰老过程中受到调控。

(2)由附图5可知，内源TRF2在miR-23a过表达的细胞中表达比Neg对照组低，说明miR-23a可抑制内源TRF2的蛋白表达。在挽救(rescue)细胞(miR-23a+TRF2)中，TRF2的表达量比miR-23a过表达组高，说明TRF2的挽救(rescue)实验成功。其中，shTRF2组作为正对照，miR-23a+GFP组作为挽救(rescue)实验的负对照。

实施例2实时荧光定量PCR实验

1、实验方法

使用TRIzol(Invitrogen,货号15596-026)法提取细胞总RNA，用DNaseI(Invitrogen,货号18068015)处理样品，去除残余DNA，再用TAKARAPrimeScript^TMII1stStrandcDNASynthesisKit反转录成cDNA。以SYBRGreen(ABI,货号4309155)为染料，进行实时荧光定量PCR实验。设置PCR程序：第一步，95℃10分钟；第二步：95℃15秒，60℃1分钟，40个循环。溶解曲线程序：第一步，95℃10分钟；第二步：95℃10秒，55℃10秒，每循环将55℃提升0.5℃，升至95℃后结束。

2、实验结果

实验结果如附图2所示，miR-23a在衰老的人成纤维细胞的表达量比在年轻中的高，这与TRF2的表达(图1)呈负相关。附图4显示miR-23a过表达细胞中，TRF2的mRNA水平比对照组的低，说明了miR-23a可降解TRF2的mRNA。

实施例3构建miR-23a过表达细胞和挽救(rescue)实验

1、实验方法

合成含有shTRF2正反序列的oligo引物，通过梯度降温的方式将2条引物退火，将退火好的含有shTRF2正反序列的双链RNA连接于pLKO载体中。将表达miRNA或shTRF2的质粒转染HEK293T细胞，制备病毒。用病毒感染人成纤维细胞MRC-5，构建稳定转染细胞系。挽救(rescue)实验：全长的GFP或TRF2克隆到pBabe-CMV-DEST-SFB中，转染HEK293T细胞，制备病毒。用病毒感染miR-23a过表达细胞系，构建挽救(rescue)细胞系。对细胞系进行免疫印迹实验检测蛋白表达。

2、实验结果

如附图5所示，各组的TRF2和GFP表达情况说明细胞系构建成功。其中，Neg表示过表达阴性miRNA的对照组细胞系，其为不结合任何哺乳动物mRNA的阴性miRNA，作为实验的阴性对照组；shTRF2表示过表达shTRF2的细胞系，其为显著抑制TRF2表达的shRNA，作为实验的阳性对照组；miR-23a表示过表达miR-23a细胞系；miR-23a+GFP表示过表达GFP的过表达miR-23a细胞系；miR-23a+TRF2表示过表达TRF2的过表达miR-23a细胞系。实施例4双荧光素酶报告系统实验

1、实验方法

全长或miR-23a结合位点突变的TRF23’UTR克隆到psiCHECK-2双荧光素酶载体中。将miRNAs表达空载体或miR-23a表达载体和TRF23’UTR载体共转染到HEK293T细胞，48小时后，裂解细胞，使用Dual-LuciferaseReporterAssaySystemKit(Promega公司，货号E1910)和PerkinElmervictorX5分光光度计测定和计算荧光素酶活性。

2、实验结果

实验结果如附图3所示。

图3A显示了野生型TRF23’UTR第687-693位(SEQIDNO.1)、人miR-23a(has-miR-23a)(SEQIDNO.2)及突变型TRF23’UTR第687-693位(SEQIDNO.3)的序列。

SEQIDNO.1：5’CCUGUUAAAACCAGCAAUGUGAG3’

SEQIDNO.2：5’AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC3’

SEQIDNO.3：5’CCUGUUAAAACCAGCUUACACUG3’

图3B显示了miR-23a在TRF23’UTR上的结合位点及荧光素酶活性结果。miR-23a抑制野生型TRF23’UTR约70％的荧光素酶活性，将TRF23’UTR上的结合位点突变后，miR-23a无法结合TRF23’UTR，荧光素酶活性回复到对照组的水平，说明了miR-23a抑制TRF2的表达是通过直接作用于3’UTR上第687-693位。

实施例5细胞生长曲线实验

1、实验方法

将1000个细胞接种到6孔板中，种9个孔，在接下来的48小时(day2)，96小时(day4)和144小时(day6)分别消化3个孔的细胞，用血球计数板计数，取平均值，计算标准偏差和t检验。

2、实验结果

如附图6所示，miR-23a过表达细胞生长速度比Neg对照组慢，且这种效应可被过表达TRF2逆转(miR-23a+TRF2组)，而过表达GFP(miR-23a+GFP组)则无法逆转。shTRF2组作为正对照。这说明了miR-23a抑制TRF2表达，延缓细胞生长。

实施例6衰老相关β半乳糖苷酶染色实验

1、实验方法

将细胞接种到6孔板中，24小时后，使用衰老相关β半乳糖苷酶染色试剂盒(Cellsignalingtechnology，货号9860)进行染色。使用1Xfixationsolution室温固定细胞10分钟，1XPBS洗3次，每次5分钟，然后用1xstainingsolution在37℃染色过夜(12小时)。在显微镜下观察，拍照，阳性细胞计数。

2、实验结果

附图7显示，衰老的细胞β半乳糖苷酶活性高，细胞被染成蓝色。miR-23a过表达组的衰老阳性细胞数比Neg(Negative)对照组显著增多，且这种效应可被过表达TRF2逆转(miR-23a+TRF2组)，而过表达GFP(miR-23a+GFP组)则无法逆转。这说明了miR-23a抑制TRF2表达，加速细胞衰老。

Claims (10)

1.miR-23a或miR-23a调控剂在制备细胞生长和/或衰老调控剂中的应用。

2.miR-23a或miR-23a表达正向调控剂在制备细胞生长延缓剂或加速细胞衰老制剂中的应用。

3.miR-23a抑制剂在制备抗衰老制剂中的应用。

4.如权利要求1-3任一权利要求所述的应用，其特征在于所述的miR-23a为人miR-23a。

5.miR-23a抑制剂在制备皮肤抗衰老制剂中的应用。

6.miR-23a在制备TRF2表达抑制剂中的应用。

7.miR-23a在制备TRF23’UTR结合剂上的应用。

8.一种细胞生长和/或衰老调控剂，其特征在于，含有miR-23a。

9.如权利要求8所述的调控剂，其特征在于，还包括药学上可接受的辅料。

10.一种检测或预测细胞生长/衰老速度的试剂，其特征在于含有miR-23a检测试剂。