JP7101367B2 - シナプス形成剤 - Google Patents
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Description
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願2016-091286号(2016年4月28日出願)及び特願2016-091300号(2016年4月28日出願)の明細書に記載された内容を包含する。
[技術分野]
本発明は、間葉系幹細胞を含むシナプス形成剤及び脳可塑性促進剤に関する。より詳細には、患者自身の骨髄又は血液から調製されたCD24陰性の間葉系幹細胞を含むシナプス形成剤及び脳可塑性促進剤に関する。
(1)ヒト骨髄又は血液に由来するCD24陰性の間葉系幹細胞を含む、シナプス形成剤。
(2)細胞が、CD73、CD90、CD105、及びCD200から選ばれる少なくとも1以上が陽性、及び/又はCD19、CD34、CD45、CD74、CD79α、及びHLA-DRから選ばれる少なくとも1以上が陰性である、上記(1)に記載のシナプス形成剤。
(3)ヒト骨髄又は血液が、シナプス形成剤の投与を受ける患者の骨髄又は血液である、上記(1)又は(2)に記載のシナプス形成剤。
(4)細胞がヒト血清を含む培地中で増殖、富化されたものである、上記(1)~(3)のいずれかに記載のシナプス形成剤。
(5)ヒト血清が、シナプス形成剤の投与を受ける患者の自己血清である、上記(4)に記載のシナプス形成剤。
(6)静脈内投与製剤、腰椎穿刺投与製剤、脳内投与製剤、脳室内投与製剤、局所投与製剤、または動脈内投与製剤である、上記(1)~(5)のいずれかに記載のシナプス形成剤。
(7)静脈内投与製剤である、上記(1)~(6)のいずれかに記載のシナプス形成剤。
(8)認知症、慢性期の脳梗塞、慢性期の脊髄損傷、又は精神疾患の患者に投与される、上記(1)~(7)のいずれかに記載のシナプス形成剤。
(9)脳の可塑性を促進させる、上記(1)~(8)のいずれかに記載のシナプス形成剤。
(10)抗凝固剤が、ヘパリン、ヘパリン誘導体またはその塩である、上記(1)~(9)のいずれかに記載のシナプス形成剤。
(11)細胞が、抗凝固剤を含まない、あるいは抗凝固剤が0.02U/mL未満である培地中で増殖、富化されたものである、上記(9)に記載のシナプス形成剤。
(12)ヒト骨髄又は血液が、採取時に添加される抗凝固剤の量を該骨髄又は血液の容積に対して0.2U/mL未満として調製されたものである、上記(10)又は(11)に記載のシナプス形成剤。
(13)ヒト骨髄又は血液に由来するCD24陰性の間葉系幹細胞を含む、脳可塑性促進剤。
(14)複数回投与される、上記(1)~(12)のいずれかに記載のシナプス形成剤、又は(13)に記載の脳可塑性促進剤。
本発明の「シナプス形成剤」は、ヒト骨髄又は血液に由来するCD24陰性の間葉系幹細胞(MSC)を含む細胞製剤であり、投与されたMSCが患部に到達し、神経細胞に分化し、シナプスを形成することで、神経回路を再建する効果を有する医薬である。後述するように、本発明のシナプス形成剤は、脳可塑性を促進する効果も有する。
本発明は、ヒト骨髄又は血液に由来するCD24陰性の間葉系幹細胞(MSC)を含む脳可塑性促進剤も提供する。
本発明で使用される「間葉系幹細胞」とは、間葉系組織の間質細胞の中に微量に存在する多分化能および自己複製能を有する幹細胞であり、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞などの結合組織細胞に分化するだけでなく、神経細胞や心筋細胞への分化能を有することが知られている。
本発明のシナプス形成剤及び脳可塑性促進剤に含まれるMSCの細胞数は多い程好ましいが、対象への投与時期や、培養に要する時間を勘案すると、効果を示す最小量であることが実用的である。したがって、本発明のシナプス形成剤及び脳可塑性促進剤の好ましい態様において、間葉系幹細胞の細胞数は、107個以上、好ましくは5×107個以上、より好ましくは108個以上、さらに好ましくは5×108個以上である。投与回数は1回に限られず、2回以上投与されてもよい。
発明者らは、脳卒中易発性高血圧自然発症ラットにおいて、MSCの静脈投与により認知機能が改善され、血管性認知症がMSCにより治療できることを実証した。
血管性認知症では高血圧によって血液脳関門の破綻を生じ、ラクナ梗塞、脳白質病変、微小出血を生じることで、認知機能の低下(認知症)を発症する。アルツハイマー型認知症においても、脳血液関門の破綻が観察され、血管性認知症でもβアミロイドの沈着が見られる。一方、βアミロイドが蓄積してもアルツハイマー型認知症を発症するとは限らない。このように、アルツハイマー型認知症と血管性認知症は病態が似ており、両者の境界は明確ではない。よって、アルツハイマー型認知症においても、MSCによる認知機能の改善が期待できる。
脳梗塞は、脳動脈の閉塞または狭窄のために脳虚血を来たし、脳組織が壊死またはこれに近い状態になる病態を言う。MSCには脳(実質及び血管)の保護作用があり、急性期や亜急性期の脳梗塞においては、MSCの静脈投与は、梗塞体積を減らし、行動機能を改善する。
脊髄を含む中枢神経系は末梢神経と異なり、一度損傷すると修復・再生されることはない。とくに、瘢痕化の進んだ慢性期脊髄損傷に対する治療は難しく、ES細胞を用いた臨床試験も試みられたが成功に至っていない。しかし、本発明のシナプス形成剤や脳可塑性促進剤によれば、神経回路の再建と正常組織による代償を促進させることで、慢性期の脳梗塞においても、運動機能や神経機能の回復が可能になる。
本発明のシナプス形成剤及び脳可塑性促進剤は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、進行性核上性麻痺(PSP)、ハンチントン病、多系統萎縮症(MSA)、黒質線状体変性症(SND)、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症(OPCA)、脊髄小脳変性症(SCD)等の神経変性疾患にも有用である。
上記した疾患のほか、本発明のシナプス形成剤及び脳可塑性促進剤は、統合失調症、躁うつ病、人格障害、気分障害、心理発達障害、ストレス関連障害、自閉症、学習障害、行動・情緒障害、精神遅滞、睡眠障害、摂食障害、同一性障害、解離性障害、適応障害、アルコール性障害、依存症、等の精神疾患にも有用である。
本発明のシナプス形成剤及び脳可塑性促進剤は、運動機能や単純な認知機能の改善に加えて、注意障害、記憶障害、失語症、失念、失行、遂行機能、情緒障害等の高次機能を改善することもできる。
本発明のシナプス形成剤及び脳可塑性促進剤による治療は、リハビリテーションと併用することにより、各段にその効果が顕著に向上する。脳梗塞や脊髄損傷患者において、リハビリテーションが可塑性を向上させることは公知である。しかしながら、本発明のシナプス形成剤及び脳可塑性促進剤による治療に、リハビリテーションを併用することにより、両者の有する可塑性促進機能は相乗的に向上する。
1.材料・方法
(1)ラット骨髄由来間葉系幹細胞の調製
実験は札幌医科大学の動物実験管理規定にしたがって実施した。既報に従い、成熟SDラットの大腿骨から得た骨髄をダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)で25mlに希釈し、加熱不活化した10% FBS、2mM l-グルタミン、100U/ml ペニシリン、0.1mg/ml ストレプトマイシンを添加し、5%CO2雰囲気下37℃で3日間インキュベートした(Kim S.et al.,Brain Res.2006;1123:27-33.Ukai R.et al.,J.Neurotrauma.2007;24:508-520.)。コンフルエントになるまで培養し、接着細胞をトリプシン-EDTAで剥離し、1×104cells/mlの密度で3回継代培養して間葉系幹細胞(MSC)を得た。
脳梗塞モデルとして、ラット一過性中大脳動脈閉塞(tMCAO)モデルを使用した。既報にしたがい、成熟雌性SDラット(200-250g)をケタミン(75mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)で麻酔し、20.0-22.0mmの塞栓糸(MONOSOF)を外頸動脈から挿入して、一過性中大脳動脈閉塞を誘導した(Honma T.et al.,Exp.Neurol.2006;199:56-66.Sasaki M.et al.,Methods Mol.Biol.2009;549:187-195.)。
閉塞誘導後8週目のラットに、GFPでラベルしたMSC(各1.0 x 106cells)を含むDMEM1mlを静脈投与した。GFP-MSC投与6週目にケタミン(75mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)で麻酔を行い、リン酸緩衝液(PBS)200ml、4%PFAにて、潅流を行い、脳組織を摘出した。脳組織は4%PFAに4時間浸透させた後に、スクロース30%を含むPBSに24時間浸透させた。その後、凍結組織切片作製用包埋剤(Tissue-Tek,Torrance,CA)に浸漬後、使用まで-80℃で保存した。50μmの冠状断面を切り出し、DAPIで染色後、VECTASHIELD(Vector Laboratories,Burlingame,CA)で封入し、共焦点顕微鏡によりEx/Em(405;561:LSM780 ELYRA S.1 system)観察した。
ラットにMSC(各1.0 x 106cells)を含むDMEM 1mlを静脈投与した。また、サイクロスポリンA(10mg/kg)を毎日腹腔内投与した。MSC投与42日後、麻酔下でfMRIを測定した。fMRIは、ラットの左上肢に電気刺激針を留置し、Electric Pulse Generator:Master-8(A.M.P.I.)を用いて電気刺激を発生させることで(1mA,pulse;3 times/sec)、T2強調画像にて右体性皮質感覚野における信号の変化を解析した。
脳梗塞発症42日後に灌流固定し、固定脳を2週間以上4%PFAに浸した。2週間後、固定脳を遠沈管に入れ、フルオリナート(フッ素系不活性液体)で満たし、MRI撮像用の検体とした。
動物用MRI:
・空間分解能;200μm x 200μm(マトリクス数;256x256)
・スライス厚;350μm
・FOV(断面内);25.6mm x 25.6mm,FOV(吻尾方向);15.4mm
・スライス枚数;44枚
・シーケンス;Stejskal-Tanner spin-echo diffusion sequence
・diffusion sensitizing gradient軸数;6軸,vectors;[1,0,1],[-1,0,1],[0,1,1],[0,1,-1],[1,1,0],[1,-1,0]
・b-value;809sec/mm2(δ=8.5msec,Δ=12.5msec)
・TR/TE;5000/30ms
・No.of Averages;10
・撮像時間;12時間38分45秒
tractgraphy analysis:
・解析ソフト:Diffusion Toolkit(tensor画像計算),TrackVis(tract描画),いずれもhttp://trackvis.orgから無償ダウンロード
・解析方法:解剖学的指標として、b=0画像(T2強調像)を参照し、左右の皮質、外包、内包、合計6つのROIを描いた。次いで、10パターンの神経線維ネットワークを想定し任意のROIの組み合わせによって、tractographyを描画することで、神経ネットワークの解析を行った。
DAPI染色像から、静脈投与したGFP-MSCは海馬に到達し、ニューロンに分化して神経突起を伸ばしてシナプスを形成することが確認された(図1左)。
脳卒中易発症高血圧自然発症ラット(SHRSP(Stroke-prone spontaneously hypertensive rat))は、高血圧によってBBB(血液脳関門)の破綻を生じ、ラクナ梗塞等を生じることにより認知症を発症する。そこで、SHRSPラットを血管性認知症モデルとして、MSC投与の認知症に対する効果を3つの方法:MWM(水迷路試験)、NOR(新規対象認識試験)、NOP(新規対象位置試験)、により検証した。NOR、NOPは移植前1週間、移植後1週間、4週間目に行い、MWMは移植後5週目に行った。
(1)血管性認知症モデルラット(SHRSPラット)
SHRSPラットは、星野試験動物飼育所より購入した。このラットは、毎世代脳卒中で死亡した親からの仔を選抜・交配して確立された脳卒中易発性高血圧自然発症ラットで、高血圧によって血液脳関門の破綻を生じ、ラクナ梗塞等を生じることで認知症を発症する血管性認知症モデルラットである。本実施例では、16~20週の時点で、脳梗塞、または、脳出血を起こしていたラットを対象とし、治療前評価を行った後に、MSC投与群とビヒクル(DMEM)投与群の2群に分け、以下の検査を行った。
MWMは、水温24℃の白濁させた不透明水で、直径1.3mの円形のプールを深さ30cmでみたし、水面直下にゴールとなるプラットフォームを置きプールの端からラットを入れてゴールに到達するまでの時間(Latency to reach the platform[LRP])を測定した。
測定はビデオトラッキングにて実施し(Anymaze tracking software(Stoelting Co.;Wood Dale,IL,USA)、移植後5週目に連続6日間で行った。1日目は、1分間4サイクルの装置順化を行い、2日目から、連続5日間でLRPを測定した。1日4サイクルの測定を行い、平均値を測定値とした。
課題実施の前に、1被験体あたり、1日15分間の装置順化を3日間行った。4日目にNORを行った。
NORは(1)見本期(2)遅延期(3)テスト期から構成された。見本期では2つの同一物体をいずれもオープンフィールドの2つの壁から10cmの位置に設置し、被験体に自由に探索させた。見本期が終了すると、被験体をホームケージに戻した。5分後に再びオープンフィールドに戻し、テスト期へ移行した。テスト期では、一方では、見本期で用いた物を用いて(Familiar object:物体F)、もう一方を新たな物体(Novel object:物体N)を設置した。行動指標として、被験体が鼻を物体から2cm以内に近づける行動を物体探索行動と定義した。
テスト期における物体探索時間を用いて、物体N対する探索時間を2つの物体に対する総探索時間で割り、%に換算した値(N/N+F)で評価した。
NOPは5日目に施行した。NORと同様に3期から構成された。テスト期において、見本期と同じ物を使用したが、一方は見本期と同じ場所に(Familiar object:物体F)、もう一方は異なる場所に設置した(Novel object:物体N)。
NOR同様に、テスト期における物体探索時間を用いて、物体Nに対する探索時間を2つの物体に対する総探索時間で割り、%に換算した値(N/N+F)で評価した。
介入後1週間後のモデルラットに対して、ケタミン(75mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)にて麻酔を行い、大腿静脈より、FITC-lectin(1.6mg/kg,Sigma, Taufkirchen, Germany)とエバンスブルー(EvB)(EvB4% in saline,4mL/kg,Sigma)を投与した。
移植後6週目にケタミン(75mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)で麻酔を行い、リン酸緩衝液(PBS)200ml、4%PFAにて、潅流を行い、脳組織を摘出した。脳組織は4%PFAに4時間浸透させた後に、スクロース15%、30%に24時間浸透させた。その後凍結組織切片作製用包埋剤(Tissue-Tek,Torrance,CA)に浸漬後、イソペンタンにて急速冷凍を行い、-80度にて保存した。
定量的な測定を行うために、RECA陽性血管長を血管内皮の長さ、PDGFRβ陽性血管を周皮細胞陽性血管の長さとした。測定はImage Jを用いて行った。各々の長さを測定し、周皮細胞カバー率として、周皮細胞陽性血管の長さを血管内皮の長さで割り、%に換算した値を評価した。
ケタミン(75mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)で麻酔し、コイル内に頭部を固定し、撮影をおこなった。側脳室体積の経時的変化を追うために介入前、介入後1週間目、3週間目、4週間目にMRI撮影を行った。MRI撮影は、既報にしたがい、7-Teslar、18cmボア径の縦型超伝導磁石(Oxford Magnet Technologies)を備えたNMRスペクトロメーターUNITY-INOVA(Oxford Instruments)を用いて行った(Honma T.et al.,Exp.Neurol.2006;199:56-66.,Komatsu K.et al.,Brain Res.2010;1334:84-92.)。
大脳皮質と脳梁の厚さを検証するために、Nissl染色の標本を用いて測定を行った。移植後6週目にケタミン(75mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)で麻酔を行い、リン酸緩衝液(PBS)200ml、4%PFAにて、潅流を行い、脳組織を摘出した。
4%PFAに4時間浸透させたのちに、スクロース15%、30%に24時間浸透させた。その後、凍結組織切片作製用包埋剤(Tissue-Tek,Torrance,CA)に浸漬後、イソペンタンにて急速冷凍を行い、-80度にて保存した。
標本は30μmの冠状断でカットし、Nissl染色を施行した。ブレグマより後方3.3mmのスライスでM1~S1領域の大脳皮質、脳梁の厚さを偏光顕微鏡オリンパスBX51(4x objective)、Stereo Investigator software(MicroBrightField)を用いて、それぞれ3箇所を計測し、平均値を測定値とした。
海馬の神経細胞数を検証するために、Nissl染色の標本を用いて測定を行った。移植後6週目にケタミン(75mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)にて麻酔を行い、ン酸緩衝液(PBS)200ml、4%PFAにて、潅流を行い、脳組織を摘出した。
4%PFAに4時間浸透させたのちに、スクロース15%、30%に24時間浸透させた。その後凍結組織切片作製用包埋剤(Tissue-Tek,Torrance,CA)に浸漬後、イソペンタンにて急速冷凍を行い、-80℃にて保存した。
標本は30μmの冠状断でカットし、Nissl染色を行った。偏光顕微鏡オリンパスBX51、StereoInvestigator software(MicroBrightField)を用いて海馬全体の神経細胞数を測定した。
認知機能を見る3つのテストのいずれにおいても、MSC投与によってモデルマウスの認知機能が改善することが示された(図4)。
エバンスブルー染色の結果、コントロール(ビヒクル)群では、正常脳においては血管内にとどまるはずのエバンスブルー(赤色)が、血管から外の組織に染み出し、血液脳関門が破壊していることが確認されたが(図5左)、MSC投与群では改善していることが確認された(図5右)。
慢性期脳梗塞患者に、MSCを静脈投与し高次機能レベルの改善を評価した。
1.方法
脳梗塞患者の腸骨から局所麻酔下で骨髄液を採取した。細胞調製施設(CPC)にて骨髄液から目的の細胞を分離し、約2週間で約1万倍に培養した。GMP管理下で約1x108個の細胞を約40mlのバッグに封入し細胞製剤を製造した。この細胞製剤を30分~1時間かけて静脈内投与により移植した。
前半150日はプラセボを投与し(治験I)、150日目にMSC投与を行い、250日目まで高次機能を評価した(治験II)。
発症後40日目(転院時)、発症後76日目、発症後141日目(細胞投与前)、発症後187日目(細胞投与後34日)、発症後250日目(細胞投与後97日)において、WAB失語症検査を実施した。この検査は、自発話、話し言葉の理解、復唱、呼称、読み、書字、行為、構成の8つの主項目の下に38の検査項目があり、失語の分類とともに、失語症の重症度を表す失語指数が算定できる。
発症後40日目(転院時)、発症後141日目(細胞投与前)、発症後250日目(細胞投与後97日)において、WAIS-III検査を行い、処理速度を算定した。
(3)運動機能
患者の運動機能をmRS及びFUGL MEYERスコアにより評価した。150日を超えたところで(慢性期、治験II)、MSCを投与した。
前半(治験I)ではプラセボ投与のため低いレベルで安定化していた。しかし150日を超えたところで治験IIに移行し、MSCの投与を受けたところ、失語指数、処理速度のいずれについても顕著な改善が見られた(図10A、表1)。
FUGL MEYERスコアは、前半(治験I)ではプラセボ投与のため低いレベルで安定化していたが、後半(治験II)ではMSCの投与により、機能の顕著な改善が見られた。このように、運動機能についても顕著な改善がみられた(図10D)。
1.材料・方法
(1)ラット骨髄由来間葉系幹細胞の調製
実施例1の記載に従い、成熟SDラットの大腿骨から得た骨髄をダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)で25mlに希釈し、加熱不活化した10% FBS、2mM l-グルタミン、100U/ml ペニシリン、0.1mg/ml ストレプトマイシンを添加し、5%CO2雰囲気下37℃で3日間インキュベートした(前掲)。コンフルエントになるまで培養し、接着細胞をトリプシン-EDTAで剥離し、1×104cells/mlの密度で3回継代培養して間葉系幹細胞(MSC)を得た。
脳梗塞モデルとして、ラット一過性中大脳動脈閉塞(tMCAO)モデルを使用した。既報にしたがい、成熟雌性SDラット(200-250g)をケタミン(75mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)で麻酔し、20.0-22.0mmの塞栓糸(MONOSOF)を外頸動脈から挿入して、一過性中大脳動脈閉塞を誘導した(前掲)。
グループ1(培地;n=10)
グループ2(培地+運動(リハビリ);n=10)
グループ3(MSC;n=10)
グループ4(MSC+運動;n=10)
すべてのラットに毎日シクロスポリンA(10mg/kg)を腹腔内投与した。静脈投与はすべて左大腿静脈から行った。
脳梗塞誘導後、トレッドミル上を毎日20分間走らせた。運動は動脈閉塞1日後に開始し、最初の1週間は傾斜0°で3m/min、その後組織学的評価まで毎週3m/minスピードを増加させた。
ラットをケタミン(75mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)で麻酔し、MRI撮影を行った。MRI撮影は、既報にしたがい、7-Teslar、18cmボア径の縦型超伝導磁石(Oxford Magnet Technologies)を備えたNMRスペクトロメーターUNITY-INOVA(Oxford Instruments)を用いて行った(前掲)。
神経細胞数を検証するために、実施例2の(9)に記載にしたがい、Nissl染色の標本を用いて神経細胞数(シナプス密度)の測定を行った。
脳梁の厚さを検証するために、実施例2の(8)に記載にしたがい、Nissl染色の標本を用いて測定を行った。
ラットの以下の6項目により四肢機能を評価した。
・テスト1から4はラットを把持し、テスト5と6はラットを台の上に置いて評価した。
・前足は6項目すべて、後ろ足はテスト4と6の2項目で評価した。
・各項目、全く接地しない状態の0から完全に接地する2の4段階で評価した。
(1は遅れた不完全な接地)。
・合計点の最低が0、最高が16となる。
[テスト1 前足]
ラットをテーブルに向かってゆっくりと今にも降りそうな状態で近づける。テーブルの10cm上に近づくと、正常なラットは両前足をテーブルに伸ばしてつける。
[テスト2 前足]
ラットの両前足がテーブルの端に触れた状態で、鼻やヒゲがテーブルに触れるのを妨げるために顎を支えながら、ラットの頭を45度上に傾ける。脳卒中ラットは障害半球の反対側の前足をテーブルに設置させておくことが不可能。
[テスト3 前足]
テーブルの端に移動したときのラットの前足の接地を観察。正常なラットはテーブルの上に両前足を接地する。
[テスト4 前足・後ろ足]
ラットを側方からテーブルの端に移動したときの、前足・後ろ足の設置を観察。
[テスト5 前足]
ラットをテーブルの上において、テーブルの端に後からゆっくり押す。正常なラットはテーブルの端を掴む、障害ラットは障害半球の反対側の前足がテーブルから落ちる。
[テスト6 前足・後ろ足]
ラットをテーブルの上において、テーブルの端に側方から障害半球の反対側四肢側へゆっくり押す。
移植後6週目にケタミン(75mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)で麻酔を行い、リン酸緩衝液(PBS)200ml、4%PFAにて、潅流を行い、脳組織を摘出した。脳組織は4%PFAに4時間浸透させた後に、スクロース15%、30%に24時間浸透させた。その後凍結組織切片作製用包埋剤(Tissue-Tek,Torrance,CA)に浸漬後、イソペンタンにて急速冷凍を行い、-80度にて保存した。脳組織から、皮質及び線条体標本を切り出し、抗シナプトフィジン(Synaptophysin)抗体及び抗PSD-95抗体を用いて、シナプトフィジンとPSD-95の発現量を測定した。
MRI測定の結果、MSC投与のみ、もしくはMSC投与にリハビリテーションを併用することにより、高信号領域が減少することが確認された(図11)。また、MSC投与のみ、もしくはMSC投与にリハビリテーションを併用することにより、シナプス数(密度)は増加し(図12)、脳梁の厚さも増加することが確認された(図13)。
以上の結果から、MSC投与のみならず、リハビリテーションを併用することにより、脳可塑性が相乗的に向上することが確認された。
1.材料・方法
(1)ラット慢性期脊髄損傷モデル
慢性期脊髄損傷モデルとして、既報にしたがい、成熟雄性SDラット(250-300g)をケタミン(90mg/kg)及びキシラジン(4mg/kg)で麻酔し、T9-T10レベルの脊髄を、椎弓切除により露出し、脊髄損傷作製装置(Infinite Horizon Impactor、60-kilodyne)を用いて圧迫挫滅し、脊髄損傷モデルを作製した(Matsushita et al.,2015)。
脊髄損傷誘導後10週のラットに、GFPでラベルしたMSC(各1.0 x 106cells)を含むDMEM1mlを静脈投与した。GFP-MSC投与1後にケタミン(75mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)で麻酔を行い、リン酸緩衝液(PBS)200ml、4%PFAにて、潅流を行い、脊髄を摘出し、DAPIで染色後、VECTASHIELD(Vector Laboratories,Burlingame,CA)で封入し、共焦点顕微鏡によりEx/Em(405;561:LSM780 ELYRA S.1 system)観察した。
脊髄損傷誘導後10週後に、MSC(各1.0 x 106cells)を含むDMEM1mlを静脈投与した。移植一週間後、エバンスブルーをラットの大腿骨血管から投与し、6時間後にケタミン(75mg/kg)及びキシラジン(10mg/kg)で麻酔を行い、リン酸緩衝液(PBS)200ml、4%PFAにて、潅流を行い、脊髄を摘出した。脊髄標本を顕微鏡下で観察し、BSCB(血液脊髄関門)の状態を評価した。
脊髄損傷20週後の脊髄標本は10%ヤギ血清にて30分間のブロッキングを行い、5%ヤギ血清に溶解した一次抗体で4℃の冷蔵庫で一晩保存した。翌日にPBSで洗浄したのち、5%ヤギ血清に溶解した二次抗体にて2時間室温にて反応させた。周皮細胞に対する抗体は、抗PDGFRβ抗体、血管内皮に対する抗体は、抗RECA抗体を使用した。
定量的な測定を行うために、RECA陽性血管長を血管内皮の長さ、PDGFRβ陽性血管を周皮細胞陽性血管の長さとした。測定はImage Jを用いて行った。各々の長さを測定し、周皮細胞カバー率として、周皮細胞陽性血管の長さを血管内皮の長さで割り、%に換算した値を評価した。
脊髄損傷20週後にラット灌流固定し、2週間以上4%PFAに浸した。2週間後、固定脊髄を遠沈管に入れ、フルオリナート(フッ素系不活性液体)で満たし、MRI撮像用の検体とした。
MRI撮影は、既報にしたがい、7-Teslar、18cmボア径の縦型超伝導磁石(Oxford Magnet Technologies)を備えたNMRスペクトロメーターUNITY-INOVA(Oxford Instruments)を用いて行った(前掲)。
行動評価により、MSC投与を受けたラットはコントロールに比べて顕著な改善が認められた(図18)。投与したMSCの約8.6%が損傷部位に局在していることが確認された(図19)。
エバンスブルーを用いた評価により、MSC投与群ではBSCB透過性が減少していることが確認された(図20A)。
抗PDGFRβ抗体、抗RECA抗体を用いた解析により、MSC投与により血管内皮細胞数と周細胞数や長さの増加が確認され、さらに、周細胞が血管内皮細胞をカバーする率も上昇していることから、BSCBの顕著な回復が細胞レベルでも認められた(図20B)。
脊髄後索の皮質脊髄路(錐体路)をウサギ抗プロテインキナーゼC-γ(PKC-γ)で免疫染色した結果では、MSC群がVehicle群よりも軸索の再生が認められた(図22A)。また、脊髄前角のセロトニン線維(錐体外路)を5-HT免疫染色をした結果、同様に、MSC群がVehicle群よりも軸索の再生が認められた(図22B)。従って、MSCの投与により、錐体路、および錐体外路の、軸索再生ならびにSproutingが生じていると考えられる。
1.材料・方法
9週のSDラットにナイロン糸を用いて中大脳動脈永久閉塞(MCAO)を行った。200mm3以上の脳梗塞体積の個体のみMCAO後8週が経過した慢性期に移植を行った。
MSC群:MCAOの8週後のSDラットのMSC、P2 1.0×106個を1ml中に含むDMEMを大腿静脈より投与した。
DMEM群:1mlのDMEMを大腿静脈より投与した。
図24に示すとおり、MSC群では運動機能の改善を認めたが、DMEM群では変化は認められなかった。このことから、脳梗塞慢性期にMSCを投与すると運動機能の改善が見られることが確認された。これはMSC投与により、再生および可塑性が亢進したためと考えられる。
Claims (11)
- ヒト骨髄又は血液に由来するCD24陰性の間葉系幹細胞を含む、脳可塑性促進剤であって、慢性期の脳梗塞、又は慢性期の脊髄損傷の患者に投与される、脳可塑性促進剤。
- 細胞が、CD73、CD90、CD105、及びCD200から選ばれる少なくとも1以上が陽性、及び/又はCD19、CD34、CD45、CD74、CD79α、及びHLA-DRから選ばれる少なくとも1以上が陰性である、請求項1に記載の脳可塑性促進剤。
- ヒト骨髄又は血液が、脳可塑性促進剤の投与を受ける患者の骨髄又は血液である、請求項1又は2に記載の脳可塑性促進剤。
- 細胞がヒト血清を含む培地中で増殖、富化されたものである、請求項1~3のいずれか1項に記載の脳可塑性促進剤。
- ヒト血清が、脳可塑性促進剤の投与を受ける患者の自己血清である、請求項4に記載の脳可塑性促進剤。
- 静脈内投与製剤、腰椎穿刺投与製剤、脳内投与製剤、脳室内投与製剤、局所投与製剤、または動脈内投与製剤である、請求項1~5のいずれか1項に記載の脳可塑性促進剤。
- 静脈内投与製剤である、請求項1~5のいずれか1項に記載の脳可塑性促進剤。
- 慢性期の脳梗塞 、又は慢性期の脊髄損傷における高次機能障害を改善させる、請求項1~7のいずれか1項に記載の脳可塑性促進剤。
- 細胞が、抗凝固剤を含まない、あるいは抗凝固剤が0.02U/mL未満である培地中で増殖、富化されたものである、請求項1~8のいずれか1項に記載の脳可塑性促進剤。
- ヒト骨髄又は血液が、採取時に添加される抗凝固剤の量を該骨髄又は血液の容積に対して0.2U/mL未満として調製されたものである、請求項9に記載の脳可塑性促進剤。
- 抗凝固剤が、ヘパリン、ヘパリン誘導体またはその塩である、請求項9又は10に記載の脳可塑性促進剤。
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