JP2012508733A - 間葉幹細胞またはその培養液を含む神経疾患の予防または治療用の組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、間葉幹細胞、間葉幹細胞の培養液、アクチビンA、PF4、デコリン、ガレクチン3、GDF15、グリピカン3、MFRP、ICAM5、IGFBP7、PDGF−AA、SPARCL1、トロンボスポンジン1、WISP1、プログラニュリン、IL−4、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含む、神経疾患の予防または治療のための医薬組成物及びそのための方法を提供する。
Description
また、本発明は、間葉幹細胞、間葉幹細胞の培養液、間葉幹細胞の培養液に含まれた蛋白質及び/または前記蛋白質の発現を誘導する信号伝達体系刺激因子を含む神経突起の損傷と関連した疾病の予防または治療に関する。
本発明の前記した特徴、他の特徴及び利点は、添付された図面を参照して、本発明の具体例として詳細に記述することで、さらに明確になるであろう。
前記培養は、神経組織内のアミロイドプラークを減少させる方法で説明した通りである。神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現の前記増加は、間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の不在下で神経細胞またはミクログリア細胞を培養したものに比べて、神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現を増加させるものでありうる。
実施例1:神経幹細胞の分離及び培養
本発明の実験に使われた神経幹細胞は、次のように分離した。 神経幹細胞は、胎生14日(以下、‘E14’と略称する)となるSprague−Dawleyラット(オリエントバイオ社製、韓国)の大脳皮質及び海馬体から分離した。まず、妊娠中であるラットの腹を切り、はさみと鉗子とを利用して胚芽を分離した。前記胚芽を切除用HBSS(Hank′s balanced salt solution)で洗浄した後、氷で冷たくなった(ice-cold)HBSSを含む皿に置いた。微細顕微鏡下で注射針と鉗子とを利用してE14胚芽の大脳皮質と海馬体とを分離した。前記分離した大脳皮質を無血清神経細胞培養液(serum free culture solution)で、ピペットで約10ないし20回ピペッティングして、細胞を単一細胞にした。前記単一細胞(single cells)をポリ−L−オルニチン(15μg/ml,Sigma,St.Louis,MO)で37℃で16時間処理した後、 2時間以上フィブロネクチン(1μg/ml,Sigma)でコーティングしたカバースリップに塗抹した。前記単一細胞(single cells)を20ng/mlのbFGF(basic fibroblast growth factor)とB27無血清補強剤(B−27 serum−free supplement)とが含まれた無血清NeurobasalTM(Gibco社製)培地下で、培養皿の底部の約70%を細胞が満たすまで(70ないし80%コンフルエンス(confluence))約2ないし4日間培養した。bFGFを除去し、4ないし6日間神経細胞分化を誘導させた。分化間に、前記細胞を5%のCO2培養器で37℃で培養しつつ、二日に一回ずつ培地とB27補強剤とを交換し、bFGFは毎日添加した。このように分化された神経細胞を以下の実施例で使用した。
臍帯血サンプルは、産婦の同意を得て出産時に臍静脈から収得した。具体的に、44mLのCPDA−1(citrate phosphate dextrose anticoagulant−1)抗凝固剤(緑十字社製、韓国)を含む臍帯血収集バッグの16−ゲージの注射針を臍静脈に挿入して、臍帯血を重力により収集バッグに集めた。前記収集された臍帯血(umbilical cord blood: UCB)は、採取後48時間内に処理し、 単核細胞細胞の生存率は、90%以上であった。臍帯血収得物をフィコール・ハイパック勾配(密度:1.077g/mL,Sigma社製)で遠心分離して、単核細胞を収得した後、数回洗浄して不純物を除去した。10%ないし20%のFBS(HyClone社製)を含有した最小基本培地(α−MEM、Gibco BRL社製)を添加して、細胞を懸濁させた。前記細胞を適当な濃度で10%ないし20%のFBSを含有した最小基本培地に分注した後、5%の二酸化炭素が供給される37℃で細胞培養器で一週間に二回ずつ培地を交換して培養した。培養された細胞が単一層を形成すれば、位相差顕微鏡を利用して紡錘状に増殖された間葉幹細胞を確認した後、前記間葉幹細胞が十分に増殖されるまで継代培養を反復した。 臍帯血由来の間葉幹細胞(UCB-MSCs)は、10ないし20%のFBSを含有するα−MEMで培養した。
アルツハイマー病の発病のための理想的な環境を作るために、アルツハイマー病を引き起こすものと知られたアミロイドベータ(Aβ;amyloid−beta protein fragment 1−42(Sigma、A9810):以下、Aβ42ともいう)10μMを含むbFGFとB27とがない無血清NeurobasalTM培地中で、実施例1に記載されたように 分化させた神経細胞を培養した。 神経幹細胞を約3ないし4日分化させた後、神経幹細胞の形態学的特性を顕微鏡で観察した。神経細胞に分化されたことが確認されれば、前記神経細胞にアミロイドベータを24時間処理した。
アミロイド・ベータを処理した神経細胞とヒト臍帯血由来の間葉幹細胞とを共同培養した時、アミロイド・ベータのような毒性物質により損傷した神経細胞を観察した。
寄贈された骨髄から採取した骨髄由来の間葉幹細胞(BM−MSC)を使用して、実施例4のような方法で実験を行った。Aβが処理された神経細胞に骨髄由来の間葉幹細胞を共同培養すれば、実施例4の臍帯血由来の間葉幹細胞を共同培養した場合と同様に、神経細胞の死滅が抑制された(図5のCt+Aβ+BM−MSC)。
図6は、Aβ42により燐酸化されたtauに結合する抗体である 抗−phosphor−tau抗体を利用して神経細胞を 表すものであって、 tau蛋白質は、神経細胞の死亡を誘発する蛋白質と知られた。前記抗−phosphor−tau抗体とphosphor−tauとの結合を可視化するために、抗−phosphor−tau抗体は、赤い蛍光を有するCy3と接合させた。
神経細胞の分化マーカーとして知られた微小管関連蛋白質(MAP2)とチューブリンβIIIとに特異的に結合する抗体を利用して、大脳皮質と海馬体幹細胞とから由来した神経細胞を染色した。
ネプリリシン(NEP)は、インシュリン分解酵素(IDE)と共に生体内でAβ42を分解して除去できる蛋白質と知られている。また、マウスでNEPをノックアウトさせれば、アルツハイマー病の症状が観察されることが報告された。本実施例では、前記実施例4ないし7で得られた神経細胞を収穫して溶解させた後、蛋白質を抽出した。蛋白質をSDS−PAGEで電気泳動して分離し、分離された蛋白質を抗ネプリリシン抗体を利用してウェスタンブロッティングして、NEP蛋白質の発現程度を測定した。また、NEP特異プライマーを利用して、NEPのmRNA発現程度をRT−PCRで測定した。また、抗NEP抗体で培養された細胞を染色した。
図8のAに示したように、ラット由来の神経細胞にAβ42を処理した場合、NEPの発現は減り、Aβ42が処理されたラット由来の神経細胞をヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と共同培養する場合、NEPの発現が蛋白質とmRNA段階で増加することを確認した。これは、ヒト間葉幹細胞がラット由来の神経細胞を刺激して神経細胞のNEPの生成を増加させ、Aβ42毒性蛋白質を除去できることを証明する結果といえる。
実施例4ないし8の結果、Aβ42で処理された神経細胞を間葉幹細胞と直接的な接触のない状態で共同培養する場合、前記神経細胞でAβ42の毒性活性が抑制されるということが確認された。これは、間葉幹細胞から分泌された物質が前記神経細胞に相互作用して、Aβ42の毒性活性を抑制するものと予測できる。
まず、細胞を次のような色々な条件で培養した。
培養群1:大脳皮質由来の神経細胞を、Aβを含まない無血清NeurobasalTM培地で24時間培養した。
培養群2:大脳皮質由来の神経細胞を、Aβを10μMの濃度に含む無血清NeurobasalTM培地で24時間培養した。
培養群3:大脳皮質由来の神経細胞を、Aβを10μMの濃度に含む無血清NeurobasalTM培地で12時間培養した後、ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞と10μMの濃度のAβ42存在下で12時間さらに共同培養した。
培養群4:ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞を、Aβを10μMの濃度に含む無血清NeurobasalTM培地で24時間培養した。
培養群5及び6:ヒト臍帯血由来の間葉幹細胞を無血清NeurobasalTM培地で24時間培養した。
アクチビンA、血小板因子4(PF4)、デコリン、ガレクチン3、成長分化因子15(GDF15)、グリピカン3、膜タイプのフリズル関連蛋白質(MFRP)、細胞間付着分子5(ICAM5)、インシュリン類似成長因子結合蛋白質7(IGFBP7)、血小板由来成長因子AA(PDGF−AA)、分泌された酸性システインリッチ蛋白質1(SPARCL1)、トロンボスポンジン1(TSP1)、WNT1誘導性分泌された蛋白質1(WISP1)及びプログラニュリン(PGN)であった。
前記14種類の蛋白質がAβ処理された神経細胞で毒性を抑制し、神経細胞の分化と成熟とを促進するものと推定した。
探索された14種の蛋白質の組み替え蛋白質を購入した(R&D SYSTEMS社製)。次いで、大脳皮質由来の神経細胞を、Aβ及び前記14種の蛋白質それぞれをアクチビンA 25ng/ml、PF4 25ng/ml、ガレクチン3 3ng/ml、デコリン100ng/ml、GDF15 50ng/ml、グリピカン3 50ng/ml、MFRP 50ng/ml、ICAM5 50ng/ml、IGFBP7 30ng/ml、PDGF−AA 50ng/ml、SPARCL1 50ng/ml、TSP1 50ng/ml、WISP1 50ng/ml及びプログラニュリン50ng/mlの濃度に含む無血清NeurobasalTM培地に添加し、24時間培養した。培養後、死んだ細胞と生存可能な細胞とは、LIVE/DEADTM生存性/細胞毒性分析キット(Sigma,L3224)を使用した蛍光染色を通じて測定した。測定された死んだ細胞と生存可能な細胞との数に基づいて、Aβにより誘導された神経細胞の細胞死程度を計算した。細胞死は、全体の細胞数に対する死んだ細胞の割合で計算した。
本実施例では、実施例4に説明されたような共同培養システム100を使用した。下部チャンバー40にミクログリア細胞、BV2細胞を培養し、上部チャンバー10には、臍帯血由来の間葉幹細胞(UCB−MSC)を培養した。BV2細胞は、培養されたマウスミクログリア細胞をv−raf/v−myc組み替えレトロウイルスで感染させて不滅化されたものであって、活性化されたミクログリア細胞の特性を発現する。共同培養は、下部チャンバー40で5%のFBS含有DMEM培地でBV2細胞を培養した後、5%のFBS含有α−MEM培地で培養された臍帯血由来の間葉幹細胞を上部チャンバー10に添加し、培地を無血清DMEM培地に交換した。無血清DMEM培地で24時間共同培養した。その後、上部チャンバー10のMSCを回収して、トリゾール試薬を使用して総RNAを得て、得られた総RNAをテンプレートにしてRT−PCRを行った。使われたプライマーは、IL−4(配列番号22及び23)、IL−6(配列番号24及び25)、IL−8(配列番号26及び27)及びMCP−1(monocyte chemoattractant protein−1)(配列番号28及び29)遺伝子を特異的に増幅させるプライマーを使用した。PCR対照群として、配列番号17及び18のプライマーを使用してβ−アクチンを増幅した。対照群としては、BV2細胞と共同培養されていないものを除いては、同じ条件で培養されたUCB−MSCを使用した。
治療効果の増進のために、アルツハイマー病の形質転換マウス10ヶ月齢にPBS、PBS中の1×104の臍帯血間葉幹細胞、及びPBS中のIL−4(Peprotech社製)200μg/kgそれぞれを、定位フレーム(stereotactic frame)を利用して海馬体に投与した。10日が経過してからマウスを犠牲にした後、脳組織を海馬体と皮質とから得た。得た脳組織を切片に作り、チオ硫酸塩(Sigma社製)の染色を通じてアミロイドベータ蛋白質の沈着程度を染色した結果を確認した。プラークを確認するために、50%のエタノールに溶かしたSigma社製のチオフラビン溶液に組織を5分間反応させた。反応後、組織の切片を50%のエタノール及び水で5分間洗浄した。この組織の切片を蛍光顕微鏡下で観察して、組織内のアミロイド蛋白質プラークを確認した。
(1)正常及びアルツハイマー病の形質転換動物の脳組織でのネプリリシン蛋白質の発現
それぞれ6,9,12及び18ヶ月間飼育された正常マウスと、アルツハイマー病の形質転換マウスとの脳組織を得た後、実施例11と同じ方法で蛋白質抽出物を得て電気泳動で分離した。分離された蛋白質をニトロセルロール膜に移した後、抗ネプリリシン抗体(R&D systems社製)と反応させてNEP蛋白質の発現如何を分析した。
アルツハイマー病の形質転換マウス10ヶ月齢に、PBS、PBS中の1×104の臍帯血間葉幹細胞、及びPBS中のIL−4200μg/kg体重を海馬体に投与し、10日が経過してからマウスを犠牲にした後、海馬体及び皮質を含む脳組織を得た。得られた各脳組織で蛋白質抽出物を得た後、電気泳動して免疫ブロッティングによりネプリリシンの発現量を分析した。
実施例8において、間葉幹細胞、神経細胞及びミクログリア細胞をそれぞれ共同培養する場合、神経細胞及びミクログリア細胞でそれぞれネプリリシンが過発現されることを確認した。
本実施例では、動物モデルでかかる効果を確認した。実施例12に記載のPBS投与群、臍帯血間葉幹細胞投与群及びIL−4投与群の脳の海馬体組織を実施例8に記載の図8のBの染色過程と同一に染色した。染色は、抗NEP抗体及びミクログリア細胞のマーカーである抗CD40抗体(Santacruz Biotechnology社製)に重複染色して統合した。抗NEP抗体の染色の場合、2次抗体及びそれに結合する試薬は、実施例8に記載された通りであり、抗CD40抗体の染色の場合、2次抗体及びそれに結合する試薬は、実施例8と同じものを使用した。
Claims (29)
- 間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む神経疾患の予防または治療用の医薬組成物。
- 前記間葉幹細胞は、人間の胚嚢、胎盤、臍帯、臍帯血、皮膚、末梢血液、骨髄、脂肪組織、筋肉、肝臓、神経組織、骨膜、胎児膜、滑液膜、滑液、羊膜、半月状軟骨、前十字靭帯、関節軟骨細胞、乳歯、血管周囲細胞、支柱骨、膝蓋骨下脂肪塊、脾臓及び胸腺を含む間葉幹細胞が存在する組織から分離された間葉幹細胞 及び/またはそれから増殖された間葉幹細胞からなる群から選択された一つ以上である請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記間葉幹細胞は、臍帯血由来の間葉幹細胞または骨髄由来の間葉幹細胞である請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記培養液は、アクチビンA、 PF4、デコリン、ガレクチン3、GDF15、グリピカン3、MFRP、ICAM5、IGFBP7、PDGF−AA、SPARCL1、トロンボスポンジン1、WISP1、プログラニュリン、IL−4、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含有する請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記神経疾患は、神経組織内のアミロイドベータプラークの形成、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化、神経突起の損傷、神経細胞内のネプリリシンの発現減少及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上により誘発される疾患である請求項1に記載の医薬組成物。
- 前記神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症及び躁病からなる群から選択される請求項1に記載の医薬組成物。
- アクチビンA、PF4、デコリン、ガレクチン3、GDF15、グリピカン3、MFRP、ICAM5、IGFBP7、PDGF−AA、SPARCL1、トロンボスポンジン1、WISP1、プログラニュリン、IL−4、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含む神経疾患の予防または治療用の医薬組成物。
- 前記神経疾患は、神経細胞内のアミロイドベータプラークの形成、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化、神経突起の異常、神経細胞内のネプリリシンの発現減少及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上により誘発される疾患である請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症及び躁病からなる群から選択される請求項7に記載の医薬組成物。
- 間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む、アミロイドベータによる神経細胞毒性を抑制するためのキット。
- 間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化を抑制するためのキット。
- 間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む、神経細胞及び/またはミクログリア細胞内にネプリリシンの発現を誘導するためのキット。
- アクチビンA、PF4、デコリン、ガレクチン3、GDF15、グリピカン3、MFRP、ICAM5、IGFBP7、PDGF−AA、SPARCL1、トロンボスポンジン1、WISP1、プログラニュリン、IL−4、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含む、アミロイドベータによる神経細胞毒性を抑制するためのキット。
- アクチビンA、PF4、デコリン、ガレクチン3、GDF15、グリピカン3、MFRP、ICAM5、IGFBP7、PDGF−AA、SPARCL1、トロンボスポンジン1、WISP1、プログラニュリン、IL−4、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含む、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化を抑制するためのキット。
- アクチビンA、PF4、デコリン、ガレクチン3、GDF15、グリピカン3、MFRP、ICAM5、IGFBP7、PDGF−AA、SPARCL1、トロンボスポンジン1、WISP1、プログラニュリン、IL−4、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上を含む、神経細胞及び/またはミクログリア細胞内にネプリリシンの発現を誘導するためのキット。
- 間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上を含む医薬組成物を個体に投与するステップを含む、個体の神経疾患を予防または治療する方法。
- 前記神経疾患は、神経細胞内のアミロイドベータプラークの形成、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化、神経突起の異常、神経細胞内のネプリリシンの発現減少及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上により誘発される疾患である請求項16に記載の方法。
- 前記神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症及び躁病からなる群から選択される請求項16に記載の方法。
- アクチビンA、PF4、デコリン、ガレクチン3、GDF15、グリピカン3、MFRP、ICAM5、IGFBP7、PDGF−AA、SPARCL1、トロンボスポンジン1、WISP1、プログラニュリン、IL−4、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせから構成された群から選択された一つ以上を含む医薬組成物を個体に投与するステップを含む、個体の神経疾患を予防または治療する方法。
- 前記神経疾患は、神経細胞内のアミロイドベータプラークの形成、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化、神経突起の異常、神経細胞内のネプリリシンの発現減少及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上により誘発される疾患である請求項19に記載の方法。
- 前記神経疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、うつ病、てんかん、多発性硬化症、躁病及びそれらの組み合わせからなる群から選択される請求項19に記載の方法。
- 間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞内のアミロイドプラークの量を減少させるステップを含む、神経細胞内のアミロイドプラークを減少させる方法。
- 間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の程度を減少させるステップを含む、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の程度を減少させる方法。
- 間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞のネプリリシンの発現を増加させるステップを含む、神経細胞のネプリリシン発現を増加させる方法。
- 間葉幹細胞及びその培養液からなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞の神経突起の成長を増加させるステップを含む、神経細胞の神経突起の成長を増加させる方法。
- アクチビンA、PF4、デコリン、ガレクチン3、GDF15、グリピカン3、MFRP、ICAM5、IGFBP7、PDGF−AA、SPARCL1、トロンボスポンジン1、WISP1、プログラニュリン、IL−4、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞内のアミロイドプラークの量を減少させるステップを含む、神経細胞内のアミロイドプラークを減少させる方法。
- アクチビンA、PF4、デコリン、ガレクチン3、GDF15、グリピカン3、MFRP、ICAM5、IGFBP7、PDGF−AA、SPARCL1、トロンボスポンジン1、WISP1、プログラニュリン、IL−4、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の程度を減少させるステップを含む、神経細胞内のタウ蛋白質の燐酸化の程度を減少させる方法。
- アクチビンA、PF4、デコリン、ガレクチン3、GDF15、グリピカン3、MFRP、ICAM5、IGFBP7、PDGF−AA、SPARCL1、トロンボスポンジン1、WISP1、プログラニュリン、IL−4、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞またはミクログリア細胞を培養して、神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現を増加させるステップを含む、神経細胞またはミクログリア細胞のネプリリシンの発現を増加させる方法。
- アクチビンA、PF4、デコリン、ガレクチン3、GDF15、グリピカン3、MFRP、ICAM5、IGFBP7、PDGF−AA、SPARCL1、トロンボスポンジン1、WISP1、プログラニュリン、IL−4、それらのうち一つ以上の発現を誘導する因子、及びそれらの組み合わせからなる群から選択された一つ以上の存在下で神経細胞を培養して、神経細胞の神経突起の成長を増加させるステップを含む、神経細胞の神経突起の成長を増加させる方法。
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