KR20100054731A - 간엽 줄기세포 또는 이의 배양액을 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간엽 줄기세포, 간엽 줄기세포의 배양액, 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 신경질환의 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물 및 그를 위한 방법을 제공한다.

간엽 줄기세포, 알츠하이머 병, 네프릴리신, 아밀로이드 베타, 신경돌기

Description

간엽 줄기세포 또는 이의 배양액을 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising mesenchymal stem cells or culture solution of mesenchymal stem cells for the prevention or treatment of neural diseases}

본 발명은 간엽 줄기세포, 간엽 줄기세포의 배양액, 간엽 줄기세포 배양액에 함유된 단백질 및/또는 상기 단백질들의 발현을 유도하는 신호전달체계 자극인자를 포함하는, 알츠하이머 병의 예방 또는 치료에 관한 것이다.

또한 본 발명은 간엽 줄기세포, 간엽 줄기세포의 배양액, 간엽 줄기세포 배양액에 함유된 단백질 및/또는 상기 단백질들의 발현을 유도하는 신호전달체계 자극인자를 포함하는 신경돌기 손상과 관련된 질병의 예방 또는 치료에 관한 것이다.

알츠하이머 병은 아밀로이드 베타 단백질이 뇌에 축적되어 뇌세포가 파괴되어 생기는 질병으로 주로 노화와 같이 진행되어 언어 및 인지기능의 장애를 가져오는 심각한 질병이다. 알츠하이머 병은 단계별로 진행되어 점차 기억력, 추리, 판단력, 언어, 나아가 아주 단순한 업무능력까지도 점차적으로 파괴하고 결국 감정조차 조절할 수 없어 인간의 삶에서 동물의 삶으로 전락시키는 과정을 거친다. 아직 알츠하이머 병을 근본적으로 치료하는 방법은 없으며 관련 증상을 완화하는데 도움을 주는 약물들만 임상에 쓰이고 있다. 그러나 실제 환자들에게 이들 약물의 효과는 제한적이다. 환자의 절반 정도가 초기 약물 치료에 실패하고 있으며, 설사 치료가 성공적이라 하더라도 증상의 완만한 완화만을 보여줄 뿐이다. 따라서 현재의 약물 치료법으로는 충족되지 않는 의료수요를 만족시킬 새로운 획기적인 치료법이 절실한 상황이며, 알츠하이머 병 치료제의 개발에 따른 경제적 사회적 파급효과는 매우 클 것으로 예상할 수 있다. 알츠하이머 병은 병이 진행되면서 뇌의 피질(cortex)과 해마(hippocampus)가 소실되면 재생이 불가능하여 치료방법이 거의 없는 것으로 알려져 있다.

알츠하이머 병에 대한 연구는 두 개의 단백질, 즉 타우(tau)와 아밀로이드 전구체 단백질 (amyloid precursor protein; APP)에 초점이 맞추어져 왔다 (Stuart M. 및 Mark P. M, Nature Medicine, 제12권 제4호, 제392-393면, 2006). 이들은 알츠하이머 병에 걸린 환자들의 뇌에서 비정상적인 형태로 축적되는 것이 관찰되는데, 타우의 경우 과다인산화 (hyperphosphorylated)가 그 원인이며, APP는 세크리타제 (secretase)에 의해 아밀로이드-베타 (Aβ)를 생성하며 아밀로이드-베타는 뇌 내에 아밀로이드 플라크로 축적되는 것으로 알려져 있다. 플라크가 축적된 뇌 영역은 전형적으로 시냅스의 숫자가 감소되며, 신경돌기가 손상되는 것이 관찰되는데, 이는 아밀로이드-베타가 시냅스와 신경돌기를 손상시킨다는 것을 암시한다 (Mark P.M, Nature, 제430호, 제631-639면, 2004).

알츠하이머 병의 치료를 위해서 병인기전에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데 특히 아밀로이드 베타 단백질을 생성하는 베타-세크리타제 및/또는 감마-세크 리타제의 저해제를 개발하는 연구와 축적된 아밀로이드 베타 단백질을 분해하는 단백질 분해효소에 대한 연구, 그리고 아세틸콜린의 분해를 담당하는 아세틸콜린 에스터라제 (esterase)의 저해제를 개발하는 연구가 강도 높게 진행 되고 있다. 또한 알츠하이머 병이 노화에 따른 만성염증성 질환으로 밝혀지면서 염증 억제제를 이용한 치료연구 또한 진행되고 있다.

뇌 내의 아밀로이드-베타의 양은 이의 생성과 제거 반응 사이의 균형에 의해 결정되며 제거작용이 감소하면 아밀로이드-베타의 양이 증가하게 된다. 아밀로이드-베타를 분해하는 활성을 가진 효소인 네프릴리신 (neprilysin, NEP)의 결핍은 세포외 아밀로이드 축적을 가속화시킨다 (Kanae lijima-Ando 등, J. Biol. Chem., 제283호 제27권, 제19066-19076면, 2008).

신경세포의 세포체 (cell body)로부터 돌출 (projection)된 신경돌기 (neurite)의 이상은 신경질환과 연관이 있는데, 대표적인 질환으로는 알츠하이머 병과 파킨슨병 이외에 우울증 (depression), 간질 (epilepsy), 다발성경화증 (multiple sclerosis), 조증 (mania) 등을 들 수 있다. 특히 간질의 경우 사람의 뇌의 해마의 신경세포사와 신경아교증 (gliosis)에 의해서 생기는데 세포사에 의한 신경 돌기의 절단이 일어난다. 다발성경화증은 뇌에 생기는 자가면역질환의 하나로써 역시 Nogo A라는 신경돌기 과성장 (neurite outgrowth) 저해 단백질의 이상으로 발병한다는 보고가 있다. 우울증의 경우도 M6a라고 하는 신경돌기 과성장 관련 단백질의 이상으로 발병한다고 보고 되고 있으며 조증의 경우 랫트 실험에서 신경돌기 과성장을 촉진하는 신호전달 경로를 활성화하였을 때 증상이 호전된다는 보고가 있다.

간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cell, MSC)는 뼈, 연골, 지방, 근육세포를 포함한 여러 가지 중배엽성 세포 또는 신경세포와 같은 외배엽성 세포로도 분화하는 능력을 가진 다분화능 줄기세포 (multipotent stem cell)이다. 최근, 간엽 줄기세포가 뇌에서 신경교 세포로 분화하는 잠재력을 가진 것으로 알려지면서, 간엽 줄기세포를 신경세포로 분화되도록 하는 방법의 개발이 시도되고 있다 (공개특허공보 제10-2004-0016785호, 2004.2.25).

간엽 줄기세포 중, 골수 유래 간엽 줄기세포는 환자로부터 얻을 수 있으며, 자가이식 (autologous transplantation) 되면 면역거부반응에 대한 문제가 없으므로 임상적으로 사용하는데 이점을 갖는다. 그러나 골수 유래 간엽 줄기세포의 채취는 여러 단계의 시술이 필요하고 시술과정이 복잡하여 채취 대상자에게 시간적, 정신적 및 육체적 고통과 부담을 주는 문제점도 있다. 제대혈 유래 간엽 줄기세포는 분만과정에서 버려지는 제대 (umbilical cord)로부터 간단한 시술을 통해 얻을 수 있으며, 제대혈의 보관산업이 활성화되어 이미 구축된 인프라를 통하여 공여자를 구하는 것도 쉬우므로 간엽 줄기세포의 확보가 용이하고, 타가 유래의 제대혈로부터 얻은 간엽 줄기세포의 경우에도 이식 후 면역반응을 일으키지 않아 면역학적 안정성을 갖는다는 이점이 있다.

본 발명의 명세서에 인용되는 선행문헌의 내용은 모두 본 명세서에 참조에 의하여 도입된다.

종래의 줄기세포를 이용한 신경질환의 치료를 위해서는 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 단계가 선결되거나, 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 것을 촉진하는 물질을 줄기세포와 함께 투여하는 단계가 필요하였다.

본 발명의 일 구체예는 줄기세포를 신경세포로 분화시키는 단계를 포함하지 않는 신경질환의 세포 치료방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예는 세포 치료방법에 따른 제약을 해결할 수 있도록, 줄기세포를 직접적으로 사용하지 않는 알츠하이머 등의 신경질환의 새로운 치료방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구체에는 아밀로이드 베타에 의하여 유발된 신경세포 독성 억제, 신경세포 내 타우 단백질의 인산화 억제, 신경돌기의 손상 억제 및 신경세포 내의 네프릴리신의 발현유도 방법을 제공한다.

본 발명자들은 간엽 줄기세포, 이의 배양액 또는 상기 배양액 중에 포함되는 단백질을 아밀로이드 베타가 처리된 신경세포와 공동배양할 경우, 아밀로이드-베타에 의하여 유발된 신경세포 독성, 신경세포 내 타우 단백질의 인산화 및 신경돌기의 손상이 억제되고, 신경세포 내의 네프릴리신의 발현이 유도되는 것을 밝힘으로써 상기 과제를 해결하였다.

간엽 줄기세포, 이의 배양액, 상기 배양액 중의 단백질 및/또는 상기 단백질들의 발현을 유도하는 신호전달체계 자극인자를 신경세포와 공동배양하면, 아밀로이드 베타에 의하여 유발된 신경세포 독성의 억제, 신경세포 내 타우 단백질의 인산화 억제, 신경세포 내에 네프릴리신의 발현의 유도 및 신경돌기의 손상을 억제하는 효과를 나타낸다.

따라서 본 발명의 간엽 줄기세포, 이의 배양액, 상기 배양액 중의 단백질 및/또는 상기 단백질들의 발현을 유도하는 신호전달체계 자극인자를 포함하는 조성물은 알츠하이머 병의 예방 및 치료를 위한 효과적인 세포제제 조성물 및 신경돌기의 손상에 의한 신경질환의 예방 또는 치료제용 조성물로 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 간엽 줄기세포, 이의 배양액, 상기 배양액 중의 단백질 및/또는 상기 단백질들의 발현을 유도하는 신호전달체계 자극인자를 사용하여 아밀로이드 베타에 의하여 유발된 신경세포 독성의 억제, 신경세포 내 타우 단백질의 인산화 억제, 신경돌기의 손상 억제 및 신경세포 내의 네프릴리신의 발현유도 방법 및 이를 위한 키트를 제공한다.

본 발명은 간엽 줄기세포를 신경세포로 분화시키지 않고 그대로 아밀로이드-베타에 의하여 손상된 신경세포와 공동배양하면, 간엽 줄기세포와 신경세포의 직접적인 접촉없이 아밀로이드-베타에 의하여 유발되는 신경세포의 손상이 억제 또는 회복된다는 것을 발견한 것에 기초를 두고 있다. 또한 본 발명의 발명자들은 간엽 줄기세포의 배양액이나 상기 배양액 중에 포함된 특정 단백질을 신경세포와 배양하여도 아밀로이드-베타에 의한 신경세포의 손상이 억제 또는 회복된다는 것을 발견하였다.

본 발명자들은 아밀로이드 베타42 (Aβ42) 10μM를 24시간 신경세포에 처리 (도 1 및 도 3의 Ct+Aβ)한 경우와 처리하지 않은 세포 (도 3의 Ct)의 경우를 비교할 때, 아밀로이드 베타를 처리한 경우 대부분의 신경세포가 세포사하였다. 그러나 이렇게 손상받은 신경 줄기세포에 간엽 줄기세포를 공동배양하면 신경세포의 사멸이 저해되고 신경세포의 성숙이 더욱 증가되어 있는 것을 관찰할 수 있었다 (도 3의 Ct+Aβ+MSC 및 도 4). 상기와 같은 제대혈 유래 간엽 줄기세포의 아밀로이드-베타에 의한 신경세포 사멸억제 효과는 골수 유래 간엽 줄기세포에서도 관찰할 수 있었다 (도 5의 피질 (cortex)+Aβ+BM-MSC). 또한, Aβ42 존재하에서 대뇌 피질 신경세포와 간엽 줄기세포를 24시간 동안 동일한 배지에서 공동배양하더라도, 도 3의 Ct+Aβ+MSC에 나타낸 바와 동일한 결과가 얻어졌다. 이는 신경세포를 MSC와 공동배양하는 경우, Aβ42에 의하여 이미 손상된 신경세포를 손상되지 않은 상태로 복귀시킬 수 있을 뿐만 아니라, Aβ42에 의하여 신경세포가 손상되지 않도록 예방할 수 있다는 것을 나타낸다.

또한 본 발명에서는 Aβ42에 의해서 급격히 인산화되는 것으로 알려진 타우 단백질이 인간 제대혈 간엽 줄기세포의 공동배양으로 인하여 인산화가 억제된다는 것을 밝혔다 (도 6)

신경세포 표지인 튜불린β III 및 MAP2에 대한 항체를 사용하여 관찰한 결 과, Aβ42를 처리한 신경세포들에서는 독성이 유발되어 신경돌기가 손상되어 끊어지고 세포모양이 응축되어 있지만, 상기 신경세포와 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 공동배양하면 신경돌기가 유지되고 오히려 신경세포의 분화 성숙이 촉진되어 있음을 알 수 있었다 (도 7).

생체 내에서 Aβ42를 분해하여 제거할 수 있는 단백질로 알려진 네트릴리신 (NEP)의 발현을 관찰한 결과, NEP는 Aβ42를 처리하면 신경세포에서 그 발현이 오히려 줄어드는 양상을 보였으나 여기에 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 공동배양하면 NEP의 발현이 단백질과 mRNA 단계에서 증가됨을 확인하였다 (도 8의 A). 도 8의 B에서는 NEP 항체를 이용하여 세포를 염색한 결과인데, Aβ42를 처리하면 붉게 염색된 부분이 현저히 감소하여 NEP의 발현이 신경세포에서 줄어드는 것을 관찰할 수 있었다. 간엽 줄기세포를 공동배양하면 NEP의 발현이 다시 회복됨을 확인할 수 있었다. 이와 같은 실험결과는 제대혈 유래 간엽 줄기세포에서 뿐만 아니라 골수 유래 간엽 줄기세포에서도 동일하게 모두 관찰되었다 (도 8의 C). 신경세포를 간엽줄기세포와 공동배양하는 경우, 신경세포에서 NEP의 발현은 mRNA 수준 뿐만 아니라 단백질 수준에서 증가하였다. 이 경우, 상기 간엽줄기세포는 제대혈 유래 또는 골수 유래 간엽줄기세포가 포함된다. 또한, 공동배양하는 경우, Aβ로 처리되거나 처리되지 않은 신경세포 모두에서 NEP 발현이 증가하였다.

본 발명자들은 또한 제대혈 유래 간엽 줄기세포가 신경세포 (neuron) 뿐만 아니라 뇌의 대식세포로 불리며 뇌에 축적된 독성물질 예를 들어 알츠하이머 병의 Aβ을 제거하는 것으로 알려진 미세아교 세포 (microglial cell)에서도 NEP의 발현을 유도함을 확인하였다 (도 9).

간엽 줄기세포와 신경세포를 직접적인 접촉없이 공동배양함으로써 상기 효과가 나타났으므로 간엽 줄기세포에서 분비되는 물질에 의하여 상기 효과가 나타난 것으로 판단되어, 간엽 줄기세포를 단독으로 배양하는 경우 발현되지 않거나 거의 발현되지 않으나, 신경세포와 간엽 줄기세포를 공동배양하는 경우 간엽 줄기세포에서 발현이 증가된 분비된 단백질을 분석한 결과 총 14 단백질이 Aβ42 독성 억제효과와 신경세포 분화 성숙에 관여하고 있음을 확인하였다. 14개의 단백질은 악티빈A (activin A), PF4 (platelet factor 4), 데코린 (decorin), 갈렉틴3 (galectin 3), GDF15 (growth differentiation factor 15), 글리피칸3 (glypican 3), MFRP (membrane-type frizzled-related protein), ICAM5 (intercellular adhesion molecule 5), IGFBP7 (insulin-like growht factor binding protein 7), PDGF-AA (platelet-derived growth factor-AA), SPARCL1 (secreted protein acidic and rich in cysteine), 트롬보스폰딘1 (thrombospondin-1), WISP1 (wnt-1 induced secreted protein 1) 및 프로그라눌린 (progranulin)이었으며, 간엽 줄기세포를 대신하여 이들 단백질을 각각 신경세포에 Aβ42와 함께 처리한 결과 신경세포의 세포사 백분율이 현저히 감소하였으며, Aβ42만 처리한 신경세포에 비하여 신경돌기의 길이가 현저히 증가하였다 (도 10 및 도 11). 본 명세서에 있어서, 상기 14 종의 단배질은 아래 특성을 갖는 것일 수 있다.

악티빈(activin) A는 인히빈, 베타 A (inhibin βA : INHBA)로도 알려진 단 백질의 호모다이머이다. 인간에서는 INHBA는 INHBA 유전자에 의하여 코딩되는 것으로 알려진다. INHBA는 예를 들면, NCBI Reference Sequence: NP_002183 (서열번호 1)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

혈소판인자4 (platelet factor 4:PF4)는 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 4 (C-X-C motif ligand 4: CXCL4)로도 알려져 있는, CXC 케모카인 패밀리에 속하는 작은 사이토카인이다. 인간에서, PF4는 염색체 4번에 위치한다. PF4는 예를 들면, NCBI Reference Sequence: NP_002610 (서열번호 2)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

데코린 (decorin)은 크기 평균 90 내지 140kDa의 프로테오간엽 줄기세포이다. 데코린은 작은 루신-리치 프로테오간엽 줄기세포 (small leucine-rich proteoglycan : SLRP) 패밀리에 속하며, 콘드로이틴 설페이트 (chondroitin sulfate: CS) 또는 데르마탄 설페이트 (dermatan sulfate: DS)로 구성된 글리코스아미노글리칸 (glycosaminoglycan:GAG)을 갖는 루신 반복 (leucine repeats)을 포함하는 단백질 코어를 포함한다. 데코린은 예를 들면, NCBI accession NP_001911 (서열번호 3)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

갈렉틴3 (galectin 3)은 LGAL3 (lectin, galactoside-binding, soluble 3)로도 알려져 있으며, 베타-갈락토시드에 결합하는 렉틴의 일종이다. 갈렉틴3은 예를 들면, NCBI accession NP_919308 (서열번호 4)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

성장분화인자15 (growth differentiation factor 15: GDF15)는 마크로파지 저해 사이토카인1 (macrophage inhibitory cytokine 1: MIC1)으로도 알려져 있는, 상처 조직 및 질병 과정에서 염증성 및 세포사 경로를 조절하는 역할을 하는 형질전환 성장인자 베타 수퍼간엽 줄기세포 (transforming growth factor beta superfamily)에 속하는 단백질이다. GDF15는 예를 들면, NCBI accession NP_004855 (서열번호 5)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

글리피칸3(glypican 3)은 글리피칸 간엽 줄기세포에 속하는 단백질이며, GPC3로도 알려져 있다. 글리피칸3은 예를 들면, NCBI accession NP_004475 (서열번호 6)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 글리피칸(glypican)은 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (heparan sulfate proteoglycan)의 패밀리이며, 글리코실포스파티딜이노시톨 (glycosylphosphatidylinositol: GPI)에 공유 결합을 통하여 세포 표면에 부착된다.

막 프리즐 관련 단백질 (membrane frizzled-related protein: MFRP)는 예를 들면, NCBI accession NP_113621 (서열번호 7)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

세포간 부착 분자5 (intercellular adhesion molecule 5: ICAM5)는 텔렌세팔린 (telencephalin)으로도 알려진 ICAM 패밀리의 일원이다. ICAM은 타입 I 경피 당단백질 (transmembrane glycoprotein)이며, 2 내지 9개의 면역글로불린 유사 C2 타입 도메인을 포함하고 백혈구 부착 LFA-1 단백질에 결합한다. ICAM5는 예를 들면, NCBI accession NP_003250 (서열번호 8)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질7 (insulin-like growth factor binding protein 7: IGFBP7)은 IGF(insulin-like growth factor)에 특이적으로 결합하는 IGFBP 패밀리의 일원이다. IGFBP7은 IGFBP-rp1 (IGF-binding protein-related protein 1)로도 알려져 있다. IGFBP7은 예를 들면, NCBI accession NP_001544 (서열번호 9)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

혈소판 유래 성장인자 AA (platelet-derived growth factor AA: PDGF-AA)는 PDGF의 일원이다. PDGF-AA는 두개의 PDGFA로도 알려진 PDGF 알파 폴리펩티드를 포함하는 호모다이머 당단백질 (homodimer glycoprotein)이다. PDGF는 세포 성장 및 분열을 조절하는 단백질이다. PDGF는 또한 혈관 형성에 관여한다. PDGFA는 예를 들면, NCBI accession XP_001126441 (서열번호 10)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

분비된 산성 시스테인 리치 단백질-유사 단백질1 (secreted protein acidic and rich in cysteines-like 1:SPARCL1)은 예를 들면, NCBI accession NP_004675 (서열번호 11)의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

트롬보스폰딘1 (thrombospondin 1: TSP1)은 디술피드 결합에 의하여 연결된 호모트리머 단백질 (homotrimeric portein)이다. 트롬보스폰딘1은 세포와 세포 및 세포와 마트릭스 상호작용을 매개하는 부착성 당단백질이다. 트롬보스폰딘1은 피브리노겐, 피브로넥틴, 라미닌, 및 타입 V 콜라겐에 결합한다. 트롬보스폰딘1은 예를 들면, NCBI accession NP_003237 (서열번호 12)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

WNT1 유도성 신호전달 단백질1 (WNT1 inducible signaling pathway protein 1: WISP1)은 CCN4로도 알려져 있으며, WISP 단백질 서브패밀리의 일원이며 결합조직 성장인자 (connective tissue growth factor : CTGF) 패밀리에 속한다. WNT1은 다양한 발생과정을 매개하는 시스테인-리치, 글리코실화된 신호 단백질의 일원이다. CTGF 패밀리 구성은 4개의 보조된 시스테인-리치 도메인, IGF 결합 도메인, vWF 타입 C 모듈, 트롬보스폰딘 도메인 및 C-말단 시스틴 (cystine) 매듭 유사 도메인에 의하여 특징지워진다. WISP1은 예를 들면, NCBI accession NP_003873 (서열번호 13)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

프로그라눌린 (progranulin: PGN)은 그라눌린의 전구체이다. 프로그라눌린은 고도로 보존된 12-시스테인 그라눌린/에피텔린 모티프의 7.5 반복을 가진 단일 전구체 단백질 (single precursor protein)이며, 그라눌린 (granulin: GRN)은 상기 프로그라눌린으로부터 잘려져 나온 분비된, 글리코실화된 펩티드의 패밀리이다. 프로그라눌린은 프로에피텔린 (proepithelin) 및 PC 세포 유래 성장인자라고도 한다. 프로그라눌린은 예를 들면, NCBI accession NP_001012497 (서열번호 14)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 인터루킨-4 (IL-4)의 존재하에서 미세아교 세포 및 신경세포를 각각 배양하는 경우, 미세아교 세포 및 신경세포에서 각각 NEP의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 또한, 알츠하이머 병 형질전환 생쥐에 UCB-MSC 또는 IL-4를 투여하는 경우, 아밀로이드 단백질 플라크가 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 알츠하이머 병 형질전환 생쥐에 UCB-MSC 또는 IL-4를 투여하는 경우, 해마 및/또는 피질을 포함하는 뇌조직에서 NEP 발현이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 알츠하이머 병 형질전환 생쥐에 UCB-MSC 또는 IL-4를 투여하는 경우, 뇌조직의 미세아교 세포에서 NEP 발현이 증가하는 것을 확인하였다.

인터루킨-4 (interleukin-4:IL-4)는 나이브 헬퍼 T 세포 (Th0 세포)를 Th2 세포로의 분화를 유도하는 사이토카인이다. IL-4에 의하여 활성화되는 경우, Th2 세포는 추가적인 IL-4를 생산한다. IL-4는 NCBI accession No. NP_000580 (서열번호 30) 또는 NP_067258의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

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상기 14개의 단백질 및 IL-4 단백질은 인간 유래 뿐만 아니라 다른 포유동물 유래의 단백질도 포함한다. 예를 들면, 설치류가 포함한다. 상기 설치류에는 마우스가 포함된다.

최근 줄기세포를 이용한 조직 재생학적인 연구가 시작되면서 알츠하이머 병과 같은 퇴행성 뇌질환의 치료의 가능성이 제기되었으나 현재의 줄기세포의 기술은 알츠하이머 병과 같이 광범위하게 뇌가 소실된 경우에 적용하기에는 이른 감이 없지 않다. 그러나 간엽 줄기세포가 아밀로이드 베타에 의한 신경세포 독성을 감소시키는 활성이 있음이 본 발명자들에 의해서 밝혀졌고 동시에 뇌 속에 있는 신경 줄기세포의 분화 및 증식을 촉진할 수 있다는 사실이 추가되어 알츠하이머 병 및 기 타 다른 신경질환의 세포치료제 개발에 희망을 가지게 하였다. 또한 간엽 줄기세포가 분비하는 많은 단백질 중에 알츠하이머 병을 비롯한 신경질환의 치료효과를 가져오는 물질이 있음을 밝힘으로써 상기 질환의 예방 및 치료에 있어 새로운 장을 여는 계기가 되었다.

상기 결과를 바탕으로 본 발명은 간엽 줄기세포, 이의 배양액, 상기 배양액 중의 단백질 및/또는 상기 단백질들의 발현을 유도하는 신호전달체계 자극인자를 포함하는 신경질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다. 상기 신경질환은 신경돌기의 손상에 의하여 야기되는 신경질환일 수 있다. 상기 신경질환은 예를 들면, 알츠하이머 병, 파킨슨병, 우울증, 간질, 다발성경화증, 조증 및 이들 조합으로 구성되는 군으로부터 선택된 질환일 수 있다.

신경 심리검사를 통하여 경도인지장애 (mild cognitive impairment)를 가진 치매 전 단계 환자의 진단이 가능한데, 1년 동안 경도인지장애를 가진 환자의 평균 12%가 알츠하이머 병으로 발전한다는 보고가 있다. 또한 경도인지장애를 가진 환자가 그대로 6 년동안 방치되면 80%가 알츠하이머 병으로 진전한다는 충격적인 보고가 있다. 따라서 경도인지장애로 진단된 환자에게 본 발명의 의약 조성물을 투여하면 알츠하이머 병의 진행을 막거나 진행을 늦추는 효과를 볼 수 있을 것으로 생각된다.

또한 본 발명은 간엽 줄기세포, 이의 배양액, 상기 배양액 중의 단백질 또는 상기 단백질들의 발현을 유도하는 신호전달체계 자극인자를 이용하여 시험관내 (in vitro) 또는 생체 내 (in vivo)에서 아밀로이드 베타에 의한 신경세포 독성 억제, 신경세포 내 타우 단백질의 인산화 억제, 신경돌기의 손상 억제 및 신경세포 내의 네프릴리신의 발현유도 방법 및 이를 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 신경세포와의 배양을 위하여 필요한 성분들을 추가로 더 포함할 수 있다.

본 발명의 간엽 줄기세포, 이의 배양액, 상기 배양액 중의 단백질 또는 상기 단백질들의 발현을 유도하는 신호전달체계 자극인자를 포함하는 의약 조성물은 추가로 알츠하이머 병, 파킨슨병, 우울증, 간질, 다발성경화증, 조증 등의 예방 또는 치료 효과가 있는 다른 활성성분과 함께 투여할 수 있다.

본 발명의 간엽 줄기세포를 포함하는 질병의 예방 또는 치료용 의약 조성물은 유효성분 외에 약학적으로 허용되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있으며, 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사제 또는 국소 투여용 제제 등이 포함된다. 예를 들면, 필요에 따라서 물 혹은 그 이외의 약제학적으로 허용할 수 있는 용매를 사용한 무균성 용액 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체 혹은 매체, 예를 들어 멸균수, 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 부형체, 비히클 (vehicle), 방부제, 결합제 등과 적당히 조합하여, 일반적으로 인정되는 단위 용량 형태로 혼화하는 것에 의해 제제화할 수 있다.

상기 제제는 통상의 방법에 따라 비경구적으로 투여될 수 있다. 상기 비경구 투여는 국부적 또는 전신적 투여를 포함한다. 상기 국부적 투여는, 직접적으로 병변 또는 그 주변에 투여하는 것, 예를 들면 병변인 뇌 또는 척수, 그 주변 또는 그 반대쪽 부위에 직접 투여하는 것일 수 있다. 상기 전신적 투여는 척수액, 정맥 또는 동맥에 투여하는 것을 포함한다. 상기 척수액은 뇌척수액을 포함한다. 상기 동맥은 병변에 혈액을 공급하는 부위일 수 있다. 또한, 상기 투여는 예를 들어 더글라스 콘치올카 (Douglas Kondziolka, Pittsburgh, Neurology, vol. 55, pp. 565-569, 2000)에 기재된 방법에 따라 이루어질 수 있다. 즉, 먼저 대상의 두개골을 약 지름 1cm 정도의 완두콩 크기로 절개한 다음, HBSS (Hank's balanced salt solution)와 혼합된 간엽 줄기세포 용액을 주입하는 방법이 이용될 수 있다. 이 때, 세포용액의 주입은 긴 바늘이 달려 있는 주사기와, 뇌 내부에 목적하는 세포용액을 정좌표로 삽입하기 위한 틀 (stereotactic frame)을 이용하여 이루어질 수 있다.

상기 간엽 줄기세포의 1일 투여량은 1x10⁴ 내지 1x10⁷ 세포/kg 체중, 예를 들면 5x10⁵ 내지 5x10⁶ 세포/kg 체중일 수 있다. 투여회수는 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 간엽 줄기세포, 예를 들면 제대혈 유래 간엽 줄기세포의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여 경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 증감이 가능하다.

본 발명의 일 구체예는, 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상을 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 신경질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 투여는 국부 또는 전신 투여일 수 있다. 상기 투여는 상기 질환을 예방 또는 치료하기 위한 유효량을 투여하는 것일 수 있다. 이러한 유효한 양은 선택되는 질환의 조건에 따라 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.

상기 조성물에 대하여는 상기한 본 발명의 하나이상의 구체예에 따른 조성물에 대하여 설명한 바와 같다. 상기 방법에 있어서, 간엽 줄기세포는 환자 본인으로부터 채취된 것 뿐 아니라 타인 또는 다른 의료용 동물 유래의 세포를 이용하는 것도 가능하다. 세포는 냉동보존한 것이어도 된다. 본 발명의 치료방법은 반드시 사람에게만 한정되지 않는다. 통상, 사람 이외의 포유동물에 있어서도 간엽 줄기세포를 이용하여, 본 발명의 방법을 실시하는 것이 가능하다.

상기 방법에 있어서, 상기 신경질환은 아밀로이드 베타, 타우 단백질의 과인산화, 네프릴리신의 과소발현 및 신경돌기 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상에 의하여 유발되는 질환인 것일 수 있다. 상기 신경질환은 예를 들면, 알츠하이머 병, 파킨슨병, 우울증, 간질, 다발성경화증 및 조증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 명세서에 있어서, 아밀로이드 베타 (Aβ)란 알츠하이머 병을 가진 환자의 뇌에 존재하는 아밀로이드 플라크의 주요 성분을 의미한다. 상기 아밀로이드 베타 (Aβ)는 막통과 당단백질인 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 C-말단로부터 유래된 아미노산으로 구성된 펩티드일 수 있다. 상기 Aβ는 APP로부터 β- 및 γ-세트레타제의 연속 작용에 의하여 생성될 수 있다. 상기 Aβ는 39-43개, 예를 들면 40-42개 아미노산으로 구성된 것일 수 있다. 상기 Aβ는 예를 들면, 인간 유래 APP (amyloid beta A4 protein isoform precursor)인 NCBI accession No. NP_000475 (서열번호 19)의 아미노산 서열의 672-713 잔기 (Aβ42) 또는 672-711 잔기 (Aβ40)로 구성된 것일 수 있다. 상기 아밀로이드 베타 (Aβ)는 포유동물 유래의 것일 수 있다. 예를 들면, 인간 또는 마우스 유래의 것일 수 있다.

본 명세서에 있어서, "타우 단백질 (tau protein)"이란 중추신경계의 신경세포 (neuron)에 풍부한 마이크로튜뷸 연관 단백질 (microtubule-associated protein)을 나타낸다. 타우 단백질은 튜불린과 상호작용하여 마이크로튜뷸을 안정화시키고 마이크로튜뷸로의 튜불린 어셈블리를 촉진한다. 뇌 조직에는 6개의 타우 이소폼이 있는 것으로 알려져 있다. 타우 단백질의 과인산화는 알츠하이머 병의 발생과 연관된 것으로 알려져 있다. 타우 단백질은 높은 용해성을 갖는 마이크로튜뷸 연관 단백질이다. 인간에서는 비신경세포에 비하여 주로 신경세포 (neuron)에 존재한다. 타우 단백질의 기능 중 하나는 액손 마이크로튜불의 안정화를 조절하는 것이다. 타우 단백질은 예를 들면, NCBI accession No. NP_005901 (서열번호 20)의 아미노산 서열로 구성된 마이크로튜뷸 연관 단백질 타우 이소폼2일 수 있다. 상기 타우 단백질은 포유동물 유래의 것일 수 있다. 예를 들면, 인간 또는 마우스 유래의 것일 수 있다.

본 명세서에 있어서, 네프릴리신 (neprilysin)은 많은 작은 분비된 펩티드를 분해하는 아연 의존성 메탈로프로테아제 효소 (zinc-dependent metalloprotease enzyme)이다. 네프릴리신은 예를 들면, 신경조직에서 비정상적 미스폴딩 (misfolding) 및 응집 (aggregation)되는 경우 알츠하이머 병을 야기시키는 아밀로이드 베타 펩티드를 분해한다. 네프릴리신은 예를 들면, NCBI accession No. NP_000893 (서열번호 21)의 아미노산 서열로 구성된 것일 수 있다. 상기 네프릴리신은 포유동물 유래의 것일 수 있다. 예를 들면, 인간 또는 마우스 유래의 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 구체예는, 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 존재하에서 신경세포를 배양하여 신경세포 내의 아밀로이드 플라크의 양을 감소시키는 단계를 포함하는, 신경세포 내의 아밀로이드 플라크를 감소시키는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 배양은 인 비트로 또는 인 비보 배양일 수 있다. 상기 인 비트로 배양은 당업계에 알려진 간엽 줄기세포 및/또는 신경세포 배양 배지에서 알려진 조건에서 배양하는 것을 포함한다. 상기 배양은 또한 상기 간엽 줄기세포와 신경세포가 직접적인 접촉이 있거나 없는 상태에서 배양하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 배양은 상기 간엽 줄기세포와 신경세포가 포어를 갖는 막에 의하여 격리된 상태에서 배양되는 것일 수 있다. 상기 막은 상기 간엽 줄기세포의 배양액 중의 생리활성 물질이 투과할 수 있고 세포는 투과할 수 없는 포어 크기 및 배치를 갖는 것일 수 있다. 상기 생리활성 물질은 예를 들면, 단백질, 당 및 핵산일 수 있다. 상기 배치는 예를 들면, 상기 막의 상부에는 상기 간엽 줄기세포를 배 양하고 막의 하부에는 상기 신경세포를 배양하여 중력에 의하여 상기 생리활성 물질이 막을 투과하여 하부로 이동할 수 있는 것일 수 있다.

상기 인 비보 배양은 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상을 개체에 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 투여는 국부 또는 전신 투여일 수 있다. 상기 투여는 상기 플라크의 양을 감소시키기 위한 유효량을 투여하는 것일 수 있다. 이러한 유효한 양은 선택되는 질환의 조건에 따라 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.

상기 감소는 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 부재하에서 신경세포를 배양한 것에 비하여 신경세포 내의 아밀로이드 플라크의 양을 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 구체예는, 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 존재하에서 신경세포를 배양하여 신경세포 내의 타우 단백질의 인산화의 정도를 감소시키는 단계를 포함하는, 신경세포 내의 타우 단백질의 인산화의 정도를 감소시키는 방법을 제공한다.

상기 배양은 신경세포 내의 아밀로이드 플라크를 감소시키는 방법에서 설명한 바와 같다.

상기 감소는 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 부재하에서 신경세포를 배양한 것에 비하여 신경세포 내의 타우 단백질의 인산화의 정도를 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 구체예는, 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 존재하에서 신경세포 또는 미세아교 세포를 배양하여 신경세포 또는 미세아교 세포의 네프릴리신 발현을 증가시키는 단계를 포함하는, 신경세포 또는 미세아교 세포의 네프릴리신 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.

상기 배양은 신경세포 내의 아밀로이드 플라크를 감소시키는 방법에서 설명한 바와 같다. 상기 증가는 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 부재하에서 신경세포를 배양한 것에 비하여 신경세포의 네프릴리신 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 구체예는, 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 존재하에서 신경세포를 배양하여 신경세포의 신경돌기 성장을 증가시키는 단계를 포함하는, 신경세포의 신경돌기 성장을 증가시키는 방법을 제공한다.

상기 배양은 신경세포 내의 아밀로이드 플라크를 감소시키는 방법에서 설명한 바와 같다. 상기 신경세포는 정상 신경세포 또는 Aβ에 의하여 유도된 손상된 신경돌기를 갖고 있는 신경세포와 같은 신경돌기 이상을 포함하는 신경세포일 수 있다. 상기 증가는 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 부재하에서 신경세포를 배양하는 것에 비하여, 신경세포의 신경돌기 성 장을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는, 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 신경질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 투여는 국부 또는 전신 투여일 수 있다. 상기 투여는 상기 질환을 예방 또는 치료하기 위한 유효량을 투여하는 것일 수 있다. 이러한 유효한 양은 선택되는 질환의 조건에 따라 당업자가 용이하게 선택할 수 있다.

상기 조성물에 대하여는 상기한 본 발명의 하나이상의 구체예에 따른 조성물에 대하여 설명한 바와 같다.

상기 방법에 있어서, 상기 신경질환은 아밀로이드 베타, 타우 단백질의 과인산화, 네프릴리신의 과소발현 및 신경돌기 이상으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상에 의하여 유발되는 질환인 것일 수 있다. 상기 신경질환은 예를 들면, 알츠하이머 병, 파킨슨병, 우울증, 간질, 다발성경화증 및 조증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 구체예는, 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라 눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재하에서 신경세포를 배양하여 신경세포 내의 아밀로이드 플라크의 양을 감소시키는 단계를 포함하는, 신경세포 내의 아밀로이드 플라크를 감소시키는 방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 배양은 인 비트로 또는 인 비보 배양일 수 있다. 상기 인 비보 배양은 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 개체에 투여하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 투여는 국부 또는 전신 투여일 수 있다. 상기 투여는 상기 플라크의 양을 감소시키기 위한 유효량을 투여하는 것일 수 있다. 이러한 유효한 양은 선택되는 질환의 조건에 따라 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 투여되는 형태는 물, 배지, 버퍼 또는 부형제와 같은 적절한 보조제 더 포함될 수 있다.

상기 감소는 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 부재하에서 신경세포를 배양하는 것에 비하여, 신경세포 내의 아밀로이드 플라크의 양을 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 구체예는, 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리 피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재하에서 신경세포를 배양하여 신경세포 내의 타우 단백질의 인산화의 정도를 감소시키는 단계를 포함하는, 신경세포 내의 타우 단백질의 인산화의 정도를 감소시키는 방법을 제공한다.

상기 배양은 신경세포 내의 아밀로이드 플라크를 감소시키는 방법에서 설명한 바와 같다. 상기 감소는 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 부재하에서 신경세포를 배양하는 것에 비하여, 신경세포 내의 타우 단백질의 인산화의 정도를 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 구체예는, 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재하에서 신경세포 또는 미세아교 세포를 배양하여 신경세포 또는 미세아교 세포의 네프릴리신 발현을 증가시키는 단계를 포함하는, 신경세포 또는 미세아교 세포의 네프릴리신 발현을 증가시키는 방법을 제공한다.

상기 배양은 신경세포 내의 아밀로이드 플라크를 감소시키는 방법에서 설명 한 바와 같다. 상기 증가는 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 부재하에서 신경세포 또는 미세아교 세포를 배양하는 것에 비하여, 신경세포 또는 미세아교 세포의 네프릴리신 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 구체예는, 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재하에서 신경세포를 배양하여 신경세포의 신경돌기 성장을 증가시키는 단계를 포함하는, 신경세포의 신경돌기 성장을 증가시키는 방법을 제공한다.

상기 배양은 신경세포 내의 아밀로이드 플라크를 감소시키는 방법에서 설명한 바와 같다. 상기 신경세포는 정상 신경세포 또는 Aβ에 의하여 유도된 손상된 신경돌기를 갖고 있는 신경세포와 같은 신경돌기 이상을 포함하는 신경세포일 수 있다. 또한, 상기 신경세포는 뉴론 및 미세아교 세포를 포함한다. 상기 증가는 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 부재하 에서 신경세포를 배양하는 것에 비하여, 신경세포의 신경돌기 성장을 증가시키는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 “간엽 줄기세포 (mesenchymal stem cells)”는 포유동물, 예를 들면 인간의 배낭 (embryonic yolk sac), 태반, 제대 (umbilical cord), 제대혈 (umbilical cord blood), 피부, 말초혈액, 골수, 지방, 근육, 간, 신경조직, 골막 (periosteum), 태아막 (fetal membrane), 활액막 (synovial membrane), 활액 (synovial fluid), 양막 (amniotic membrane), 반월상 연골 (meniscus), 전십자 인대 (anterior cruciate ligament), 관절 연골세포 (articular chondrocytes), 유치 (decidous teeth), 혈관주위세포 (pericyte), 지주골 (trabecular bone), 슬개골하 지방괴 (infra patellar fat pad), 비장 (spleen), 흉선 (thymus) 및 기타 간엽 줄기세포가 존재하는 조직으로부터 분리 및/또는 배양된 간엽 줄기세포를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 “제대혈 (umbilical cord blood)”은 인간을 포함하는 모든 포유동물에서 태반과 태아를 연결하는 제대 정맥으로부터 채취된 혈액일 수 있다. 본 발명에서 사용되는“제대혈 유래 간엽 줄기세포 (umbilical cord blood derived mesenchymal stem cell)”는 포유동물, 예를 들면 인간의 제대혈로부터 분리 및 배양된 간엽 줄기세포를 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 “치료”는 1) 아직 질환을 보유하고 있다고 진단되지 않았으나 이러한 경향이 있는 동물, 예를 들면 인간을 포함한 포유동물의 질 병 또는 장애가 발생되는 것의 예방; 2) 질환의 진전의 억제; 및 3) 질환의 경감을 의미한다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는다.

제대혈로부터 간엽 줄기세포를 포함하는 단핵구 세포를 분리하기 위해서는 본 출원인에 의하여 등록된 한국등록특허 제489248호에 기재된 방법을 비롯한 가능한 모든 공지의 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 피콜-하이팩 밀도구배 분리법 (Ficoll-Hypaque density gradient method) 등을 사용할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 분만 후 태반이 박리되기 전에 제정맥 (umbilical vein)으로부터 채취한 제대혈을 피콜-하이팩 그라디언트 (Ficoll-Hypaque gradient)로 원심분리하여 단핵구 세포를 수득한 다음, 수차례 세척하여 불순물을 제거한다. 이와 같이 분리된 단핵구 세포는 간엽 줄기세포의 분리 및 배양에 바로 이용하거나 초저온 냉동시켜 장기간 보관 후 사용할 수 있다.

채취된 제대혈로부터 간엽 줄기세포를 분리ㆍ배양하는 방법으로는 대한민국 공개특허 제2003-0069115호의 방법을 비롯하여 당업계에 공지된 통상의 방법 (Pittinger MF 등 Science, 284: 143-7, 1999; 및 Lazarus HM 등 Bone Marrow Transplant, 16: 557-64, 1995)을 사용할 수 있으며, 그 중 한 예를 들면 다음과 같다.

먼저, 채취된 제대혈을, 예를 들어, 피콜-하이팩 농도구배를 이용하여 원심분리함으로써 조혈모세포 및 간엽 줄기세포를 포함하는 단핵구 세포들을 분리한 후, 여러 번 세척하여 이물질들을 제거한다. 세척 후 적절한 밀도로 단핵세포들을 배양용기에서 배양하면, 단일층을 이루면서 세포들이 증식하는데, 이 중 위상차 현미경으로 관찰되는 모양이 동질성 (homogeneous)이면서, 방추형 모양 (spindle shape)의 긴 형태의 세포들의 집락 (colony) 형태로 증식하는 세포가 간엽 줄기세포이다. 이후 세포가 배양되어 자라게 되면 계대배양을 실시하여, 필요한 만큼의 세포수가 될 때까지 증식시킨다.

본 발명의 조성물에 포함되는 세포는 냉동보관할 수 있으며, 이는 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다 (Campos 등, Cryobiology 35:921-924, 1995). 냉동시 사용되는 배지의 조성은 10~20% FBS (fetal bovine serum) 또는 인간 말초혈액 또는 제대혈의 혈장 또는 혈청 및 10% DMSO (dimethylsulfoxide)로 구성되며, 상기 배지 1 mL에 약 1×10⁶ ~ 5×10⁶개의 세포가 존재하도록 세포를 현탁할 수 있다.

상기 세포 현탁액을 저온 냉동용의 유리 또는 플라스틱 재질의 앰플에 분배하고, 이를 밀봉하여 미리 온도 조건이 맞춰진 프로그램 냉동기에 넣는다. 세포를 냉동시킬 때는, 예를 들면 -1℃/분의 온도 변화를 제공하는 냉동 프로그램을 이용하는 것이 이후 해동시 세포 손상을 줄일 수 있다. 일단 앰플의 온도가 -90℃ 이하에 도달하면, -150℃ 이하의 액체 질소 저장 탱크로 이동시킬 수 있다.

냉동 보관된 세포를 해동시킬 때는, 앰플을 액체 질소 저장 탱크로부터 신속하게 37℃로 조절된 수조로 이동시킨다. 앰플 안에 해동된 내용물은 멸균 상태 하에서 배양 배지가 들어 있는 배양 용기에 즉각 옮기는 것이 바람직하다.

본 발명에서 간엽 줄기세포의 분리·배양에 사용가능한 배양 배지로는 10% 내지 30% FBS 또는 인간 말초혈액 또는 제대혈의 혈장 또는 혈청을 포함하는 세포 배양용 배지를 사용할 수 있다. 세포 배양용 배지로는 DMEM, MEM 배지를 비롯하여 α-MEM, McCoys 5A 배지, 이글스 기본 배지 (eagle's basal medium), CMRL 배지, 글래스고우 (Glasgow) 최소 필수 배지, (Ham's) F-12 배지, IMDM (Iscove's modified Dulbecco's medium), 리보비츠 (Liebovitz') L-15 배지, RPMI 1640 배지 등 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포 배양용 배지는 모두 사용가능하며, 예를 들면 DMEM 배지를 사용할 수 있다. 배양시에는 상기 배지 1 mL에 약 5×10³ ~ 2×10⁴개의 세포가 존재하도록 세포를 현탁한다.

또한, 상기 세포 배양 배지에는 필요에 따라 한 가지 이상의 보조성분을 첨가할 수 있다. 이러한 보조성분으로는 태아 송아지, 말 또는 사람 등의 혈청을 비롯하여, 미생물의 오염을 막기 위한 페니실린 G (Penicillin G), 스트렙토마이신 설페이트 (streptomycin sulfate) 및 젠타마이신 (gentamycin) 등의 항생제, 암포테리신 B (amphotericin B) 및 니스타틴 (nystatin) 등의 항진균제 (antifungal agent) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 성분 중 하나 이상을 사용할 수 있다.

제대혈 유래 간엽 줄기세포는 조직이나 장기 이식에서 거부반응을 일으키는 가장 중요한 원인인 조직적합항원 HLA-DR (class II)이 발현되지 않는 세포이므로 (Le Blanc, KC, Exp Hematol, 31:890-896, 2003; 및 Tse WT 등, Transplantation, 75:389-397, 2003), 기존의 이식수술시 문제가 되었던 거부반응 등의 면역반응을 유발하지 않거나 최소화할 수 있기 때문에, 본 발명의 의약 조성물에 포함되는 제대혈 유래 간엽줄기 세포는 자가유래 제대혈은 물론 타가유래 제대혈 또한 사용할 수 있다. 세포는 냉동보존한 것이어도 된다.

본 발명의 간엽 줄기세포의 배양액에는 포유동물 예를 들면 인간의 골수 유래 간엽 줄기세포, 제대혈 유래 간엽 줄기세포, 지방유래 줄기세포, 배낭 유래 간엽 줄기세포, 태반유래 간엽 줄기세포, 피부유래 간엽 줄기세포, 말초혈액유래 간엽 줄기세포, 근육유래 간엽 줄기세포, 간유래 간엽 줄기세포, 신경조직유래 간엽 줄기세포, 골막 유래 간엽 줄기세포 및 제대 유래 간엽 줄기세포, 태아막 유래 간엽 줄기세포, 활액막 유래 간엽 줄기세포, 활액 유래 간엽 줄기세포, 양막 유래 간엽 줄기세포, 반월상연골 유래 간엽 줄기세포, 전십자 인대 유래 간엽 줄기세포, 관절 연골세포 유래 간엽 줄기세포, 유치 유래 간엽 줄기세포, 혈관주위세포 유래 간엽 줄기세포, 지주골 유래 간엽 줄기세포, 슬개골하 지방괴 유래 간엽 줄기세포, 비장 유래 간엽 줄기세포, 흉선 유래 간엽 줄기세포 및 간엽줄기 세포가 존재하는 기타 조직으로부터 분리 및/또는 배양된 간엽 줄기세포로 구성된 군으로부터 하나 이상 선택되는 간엽 줄기세포를 배양한 용액을 포함한다.

이 때 사용하는 배지로는 예를 들어 FBS 또는 인간 말초혈액 또는 제대혈의 혈장 또는 혈청을 포함하는 세포 배양용 배지를 사용할 수 있다. 세포 배양용 배지로는 DMEM, MEM 배지를 비롯하여 α-MEM, McCoys 5A 배지, 이글스 기본 배지 (eagle's basal medium), CMRL 배지, 글래스고우 (Glasgow) 최소 필수 배지, (Ham's) F-12 배지, IMDM (Iscove's modified Dulbecco's medium), 리보비츠 (Liebovitz') L-15 배지, RPMI 1640 배지 등 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포 배양용 배지를 들 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 간엽 줄기세포의 배양액은 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린 및 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 의약 조성물은 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 활성 성분으로 포함하는 것일 수 있다.

상기 유도 인자는 신호전달체계 자극인자일 수 있다. 상기 유도인자는 알려진 유도인자일 수 있다. 상기 유도인자는 예를 들어 다음과 같은 것이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 갈렉틴3의 발현을 유도하기 위한 인자에는 예를 들어, 12-미리스테이트 13-아세테이트 (phorbol 12-myristate 13-acetate: PMA) 및 변형된 리포단백질 (modified lipoprotein)로 구성된 군으로부터 선택된 하나이상이 포함될 수 있다. 상기 PMA 또는 상기 리포단백질은 단백질 키나제 C (protein kinase C: PKC), 미토겐 활성화된 단백질 키나제 1,2 (mitogen-activated protein kinase 1,2: MAPK-1,2) 및 p38 키나제를 경유하여 갈렉틴-3의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다. PDGF-AA의 유도인자에는 Ets-1 (avian erythroblastosis virus E26 (v ets) oncogene homolog 1) 및 리소포스파티딜콜린 (lysophosphatidylcholine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상이 포함된다. 리소포스파티딜콜린는 MAPK-1,2를 경유하여 PDGF-AA의 발현을 유도하는 것으로 알려져 있다.

본 명세서에서 인용된 모든 선행기술 문헌은 참조로서 본 명세서에 포함될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 신경 줄기세포의 분리 및 배양

본 발명의 실험에 사용된 신경 줄기세포는 다음과 같이 분리하였다. 태생 14일 (embryonic day 14, 이하 'E14'라고 약칭한다)이 되는 임신 중인 스프래그-다우리 (Sprague-Dawley) 랫트 (오리엔트 바이오 사, 한국)의 대뇌 피질 및 해마에서 분리한 신경 줄기세포를 사용하였다. 먼저, 임신 중인 랫트의 배를 가르고, 가위와 겸자 (forceps)를 이용하여 배아를 분리하고 미리 준비해 놓은 해부용 HBSS (Hank's balanced salt solution)로 세척한 후 HBSS가 담겨있는 접시에 넣어 얼음 위에 놓았다. 미세 현미경 하에서 주사 바늘과 겸자를 이용하여 E14 배아 대뇌 피질과 해마를 잘라내었고, 상기 분리해낸 조직을 무혈청 신경세포 배양액에서 피펫 으로 10~20회 정도 피펫팅하여 세포들을 단일세포로 분리하였다. 폴리-L-오르니틴 (poly-L-ornithine) (15㎍/ml, Sigma,St. Louis, MO)으로 37℃에서 16시간 동안 처리한 후 최소한 2시간 이상 동안 피브로넥틴 (1㎍/ml, Sigma)으로 미리 코팅한 커버슬립에 도말하였다. 20ng/ml의 bFGF (basic fibroblast growth factor)와 B27 무혈청 보강제 (B-27 serum-free supplement)가 포함된 무혈청 Neurobasal^TM (Gibco사) 배지 하에서 상기 세포를 증식시켰다. 배양 접시의 바닥의 70%를 세포가 채울 때까지 (70~80% confluence) 대략 2-4일 동안 세포를 증식시키고, 분화를 유도시키기 위해 bFGF만 제거하고 4 내지 6일 동안 신경세포 분화를 유도시켰다. 5% CO₂ 배양기에서 37℃에서 배양을 유지하고, 이틀에 한번씩 배지와 B27 보강제를 교환하였으며, bFGF는 매일 첨가하였다. 이렇게 분화된 신경세포를 이하의 실시예에서 사용하였다.

실시예 2: 제대혈 간엽 줄기세포의 분리 및 증폭

제대혈 샘플은 산모의 동의를 얻어 출산시 제정맥으로부터 수득하였다. 구체적으로, 44 mL의 CPDA-1 (citrate phosphate dextrose anticoagulant-1) 항응고제 (녹십자)를 포함하는 제대혈 (umbilical cord blood: UCB) 수집함 (collection bag)의 16-게이지의 주사바늘을 제정맥에 삽입하여 UCB가 중력에 의해 수집함으로 모이도록 하였다. 모든 제대혈 수득물은 채취 후 48시간 내에 처리하였으며, 전체 세포의 생존율은 90% 이상이었다. 제대혈 수득물을 피콜-하이팩 구배 (Ficoll- Hypaque gradient, 밀도: 1.077 g/mL, Sigma 사)로 원심분리하여 단핵구 세포를 수득한 다음, 수차례 세척하여 불순물을 제거하였다. 10% 내지 20% FBS (HyClone 사)를 함유한 최소 기본배지 (α-MEM, Gibco BRL 사)를 첨가하여 세포를 현탁시켰다. 상기 세포를 적당한 농도로 10% 내지 20% FBS를 함유한 최소 기본배지에 분주한 다음, 5% 이산화탄소가 공급되는 37℃ 세포 배양기에서 일주일에 두 번씩 배지를 교환해가며 배양하였다. 배양된 세포가 단일층을 형성하면, 위상차 현미경을 이용하여 방추 모양으로 증폭된 간엽 줄기세포를 확인한 다음, 상기 간엽 줄기세포가 충분히 증폭될 때까지 계대배양을 반복하였다. 확립된 제대혈 유래 간엽 줄기세포 (UCB-MSCs)는 10~20% FBS를 함유하는 α-MEM에서 배양하였다.

실시예 3: 아밀로이드 베타 단백질의 독성 실험

알츠하이머 병과 가장 흡사한 환경을 만들기 위해 알츠하이머 질환의 유력한 원인인 아밀로이드 베타 (Aβ; amyloid-beta protein fragment 1-42 (Sigma, A9810): 이하 Aβ42라고도 함) 10μM을 포함하는 bFGF와 B27이 없는 무혈청 Neurobasal^TM 배지 중에서 실시예 1에 기재된 바와 같이 시험관 내에서 분화시킨 신경세포를 배양하였다. Aβ 처리 시점은 신경 줄기세포를 3 내지 4일 정도 분화시킨 후 신경 줄기세포의 형태학적 특성을 현미경으로 관찰하여, 신경세포로 분화된 것이 확인되면 아밀로이드 베타를 24시간 동안 처리하였다.

도 1은 상기 신경세포를 아밀로이드-베타와 24시간 처리 후 신경세포의 형태 학적 변화를 광학 현미경으로 관찰한 결과이다. 아밀로이드-베타의 농도가 높을수록 신경세포의 사멸이 증가하였다. 도 1에서, 대조군은 아밀로이드-베타가 포함되지 않은 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 신경세포를 배양한 것이고, Aβ-1μM, Aβ-5μM 및 Aβ-10μM는 각각 아밀로이드-베타를 1μM, 5μM 및 10μM의 농도로 포함하는 배지에서 신경세포를 24시간 동안 배양한 결과를 나타내는 것이다.

실시예 4: 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 아밀로이드-베타를 처리한 신경세포와의 공동배양이 신경세포 사멸에 미치는 영향

아밀로이드-베타를 처리한 신경세포와 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 공동배양했을 때, 아밀로이드-베타와 같은 독성물질로 인해 손상된 신경세포의 변화를 확인하였다.

구체적으로 E14 배아 대뇌 피질 줄기세포 및 해마 줄기세포를 상기 실시예 1과 같이 분리하고 분리된 신경 줄기세포를 증식시키고 신경세포로 분화시키고, 실시예 3에 나타낸 바와 같이 아밀로이드-베타 10μM를 처리하였다. 아밀로이드-베타를 처리한지 12시간 후, 아밀로이드-베타가 처리된 신경세포를 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 12시간 공동배양하여 총 24시간 동안 배양하였다. 공동배양은 도 2에 나타낸 바와 같은, 공동배양 시스템에서 이루어졌다. 도 2는 아밀로이드-베타가 처리된 신경세포를 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 공동배양하기 위한 공동배양 시스템을 나타낸다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 공동배양 시스템 (100)은 상부 챔버 (upper chamber) (10)와 하부 챔버 (lower chamber) (40)를 포함하며, 상기 상부 챔버 (10)의 바닥은 공극이 약 1μm의 크기인 미세 막 (microporous membrane) (30)을 포함한다. 상부 챔버 (10)에는 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포 (20)를 배양하고, 하부 챔버 (40)에는 대뇌 피질 줄기세포 혹은 해마 줄기세포로부터 분화된 신경세포(50)를 배양하였다. 상기 상부 챔버 (10)와 하부 챔버 (40)는 분리가능하며, 상기 상부 챔버 (10)의 바닥의 하부면과 하부 챔버 (40)의 바닥의 상부면은 약 1 mm의 거리로 이격되어 있다. 공동배양하는 때에는, 먼저 하부 챔버 (40)와 상부 챔버 (10)에서 각각의 세포를 배양한 후, 상부 챔버 (10)를 하부 챔버 (40)의 배지에 첨가함으로써 공동배양 시스템을 구성한 후 배양하였다.

대뇌 피질 및 해마 유래 신경세포에 아밀로이드-베타 처리를 하지 않고 배양한 것, 대뇌 피질 및 해마 유래 신경세포에 아밀로이드-베타를 처리한 것, 아밀로이드-베타가 처리되지 않은 대뇌 피질 및 해마 유래 신경세포에 간엽 줄기세포를 공동배양한 것도 역시 배양 및 관찰하였다. 손상된 대뇌 피질 및 해마 유래 신경세포에 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포의 공동배양의 결과는 아밀로이드-베타를 처리하고 24시간이 지난 후 신경세포의 손상 정도를 현미경으로 관찰하여 확인하였다. 상기 배양은 bFGF와 B27이 없는 무혈청 Neurobasal^TM 배지 (GIBCO)를 사용하여 실시하였다.

신경세포에 아밀로이드-베타를 처리할 때 유도되는 세포사멸 정도를 정량적 으로 측정하기 위해서 형광염색 분석으로 살아있는 세포와 죽은 세포를 측정하였다. 세포독성 분석은 동물세포를 위한 LIVE/DEAD^TM 생존성/세포독성 (viability/cytotoxicity) 분석 키트 (Sigma, L3224)를 사용하였다. 상기 키트는 칼세인 AM (calcein AM)과 에티디움 호모다이머 (ethidium homodimer)를 포함하며, 칼세인 AM은 살아 있는 세포를 확인하는데 사용되고, 에티디움 호모다이머는 죽은 세포를 확인하기 위하여 사용된다. 칼세인 AM (calcein AM)은 비형광성 세포 투과성 염료이며, 살아있는 세포 안으로 들어가게 되면 세포 내의 에스테라제의 촉매 활성에 의한 아세톡시메틸 에스테르 (acetoxymethyl ester)의 가수분해 반응에 의하여 녹색 형광물질인 칼세인으로 전환된다. 에티디움 호모다이머는 살아있는 세포막은 통과하지 못하나 손상 받은 세포막은 투과하고 세포 내의 핵산에 결합하여 적색 형광을 발한다.

상기 공동배양 시스템의 하부 챔버 내에서 대뇌 피질 또는 해마 유래 신경세포를 Aβ42를 함유하는 배지 중에서 배양하여 Aβ42를 직접 신경세포에 처리하였다. 생존/사망 세포 염색 (live/dead staining)을 통하여 죽은 세포는 붉은 색으로 염색되고 살아있는 세포는 녹색으로 관찰한 결과, Aβ42를 10μM 농도로 24시간 처리한 세포 (도 3의 Ct+Aβ)와 처리하지 않은 세포(도 3의 Ct)를 비교할 때, Aβ42를 처리한 경우 녹색 형광이 현저히 줄고 붉은 형광 염색 부분이 광범위하게 관찰되었다. 이는 대부분의 신경세포가 Aβ42에 의하여 세포사하였다는 것을 나타낸다. 그러나, 이렇게 손상 받은 신경세포에 도 2에 나타낸 바와 같은 공동배양 시스템을 이용하여 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 공동배양하면 신경세포의 사멸이 방지되고 신경세포의 성숙이 더욱 증가되었다 (도 3의 Ct+Aβ+MSC). 이는 Aβ42에 의하여 이미 손상된 신경세포를 UCB-MSC와 공동배양하는 경우, 손상된 신경세포를 손상되지 않은 상태로 복귀시킬 수 있다는 것을 나타낸다. 또한, 도 3에서, Ct+Aβ+MSC는 Aβ42를 10μM 농도로 포함하는 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 대뇌 피질 신경세포를 12시간 동안 배양한 후 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 12시간 동안 공동배양한 결과이다. 또한, 하부 챔버에서 10μM 농도의 Aβ42 존재하에서 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 대뇌 피질 신경세포를 배양하는 동시에 상부 챔버에서 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 24시간 동안 동일한 배지에서 공동배양하더라도, 도 3의 Ct+Aβ+MSC에 나타낸 바와 동일한 결과가 얻어졌다. 이는 신경세포를 UCB-MSC와 공동배양하는 경우, Aβ42에 의하여 이미 손상된 신경세포를 손상되지 않은 상태로 복귀시킬 수 있을 뿐만 아니라, Aβ42에 의하여 신경세포가 손상되지 않도록 예방할 수 있다는 것을 나타낸다.

도 3에서, Ct는 Aβ42를 포함하지 않은 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 대뇌 피질 신경세포를 24시간 동안 배양한 결과이고, Ct+Aβ는 Aβ42를 10μM 농도로 포함하는 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 대뇌 피질 신경세포를 24시간 동안 배양한 결과이고, Ct+Aβ+MSC는 Aβ42를 10μM 농도로 포함하는 무혈청 Neurobasal^TM 배지에 서 대뇌 피질 신경세포를 12시간 동안 배양한 후 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 12시간 동안 공동배양한 결과이고, Ct+MSC는 Aβ42를 포함하지 않은 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 대뇌 피질 신경세포를 12시간 동안 배양한 후, 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 12시간 동안 공동배양한 결과를 나타낸다.

도 4는 도 3의 결과를 죽은 세포의 백분율로 표시한 것이다. 도 4에서, Cortex는 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 포함하지 않은 배지에서 배양한 대조군 결과를 나타내고, Cortex+Aβ는 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 10μM 농도로 포함하는 배지에서 24시간 동안 배양한 결과를 나타내고, Cortex+Aβ+MSC는 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 10μM 농도로 포함하는 배지에서 12시간 동안 배양한 다음, 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 12시간 더 배양한 결과를 나타내고, Cortex+MSC는 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 포함하지 않은 배지에서 12시간 동안 배양한 다음, 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 12시간 더 배양한 결과를 나타낸다.

실시예 5: 인간 골수 유래 간엽 줄기세포와 아밀로이드-베타를 처리한 신경세포와의 공동배양시 신경세포 사멸에 미치는 영향

기증받은 골수로부터 추출한 골수 유래 간엽 줄기세포 (BM-MSC)를 사용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 실험을 하였다. Aβ가 처리된 신경세포에 골수 유래 간엽 줄기세포를 공동배양하면, 실시예 4의 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 공동배양하였을 경우와 마찬가지로, 신경세포의 사멸을 억제하는 효과를 관찰 할 수 있었다 (도 5의 Ct+Aβ+BM-MSC).

도 5는 Aβ42에 의한 신경세포 사멸에 대한 인간 골수 유래 간엽 줄기세포의 공동배양의 효과를 보여주는 형광 염색 분석결과이다. 도 5에서, Ct는 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 포함하지 않은 배지에서 배양한 대조군 결과를 나타내고, Ct+Aβ는 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 10μM 농도로 포함하는 배지에서 24시간 동안 배양한 결과를 나타내고, Ct+Aβ+BM-MSC는 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 10μM 농도로 포함하는 배지에서 12시간 동안 배양한 다음, 인간 골수 유래 간엽 줄기세포와 12시간 더 배양한 결과를 나타내고, Ct+BM-MSC는 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 포함하지 않은 배지에서 12시간 동안 배양한 다음, 인간 골수 유래 간엽 줄기세포와 12시간 더 배양한 결과를 나타낸다.

실시예 6: 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 아밀로이드-베타를 처리한 신경세포와의 공동배양시 타우 단백질의 인산화에 미치는 영향

도 6은 Aβ42에 의하여 인산화되어 신경세포의 죽음을 유발하는 단백질로 알려진 Tau의 인산화된 형태인 phosphor-tau에 결합하는 항체인, 항-phosphor-tau 항체를 이용하여 신경세포를 염색한 결과이다. 항-phosphor-tau 항체와 phosphor-tau의 결합을 가시화하기 위하여, 항-phosphor-tau 항체는 붉은색 형광을 띄는 Cy3와 접합시켜 사용하였다.

도 6에서 상단열은 Cy3가 접합된 항-phos-tau 항체로 염색한 결과를 나타내고, 하단열은 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)로 염색한 결과를 나타낸다. 도 6의 상단열에서, Ct는 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 포함하지 않은 배지에서 배양한 대조군 결과를 나타내고, Aβ42는 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 10μM 농도로 포함하는 배지에서 24시간 동안 배양한 결과를 나타내고, Aβ42/MSC는 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 10μM 농도로 포함하는 배지에서 12시간 동안 배양한 다음, 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 12시간 더 배양한 결과를 나타내고, MSC는 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 포함하지 않은 배지에서 12시간 동안 배양한 다음, 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 12시간 더 배양한 결과를 나타낸다. 도 6의 상단열에 나타낸 바와 같이, 신경세포에서 tau 단백질은 Aβ42에 의하여 급격히 인산화되었으나, 인간 제대혈 간엽 줄기세포의 공동배양에 의하여 다시 탈인산화되었다 (Aβ42 및 Aβ42/MSC 참조).

도 6의 하단열에 나타낸 바와 같이, DAPI 염색은 상단열에서 항-phos-tau 항체로 염색되지 않은 것으로 나타난 실험군에서도 세포가 잘 유지되고 있음을 나타낸다. DAPI 염색은 VECTASHIELD^TM (VECTOR LABORATORIES사)를 사용하였으며, DAPI가 포함된 탑재 매질 (mounting medium)을 세포가 있는 슬라이드 글라스에 현미경 관찰 직전에 첨가하여 사용하였다.

실시예 7: 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 아밀로이드-베타를 처리한 신 경세포와의 공동배양시 면역 형광 염색법을 이용한 신경분화 세포 분석

신경세포의 분화 마커로 알려진 미크로튜불 연관 단백질 (microtubule-associated protein : MAP2)와 튜불린β III (tubulin β III)에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 대뇌 피질과 해마 줄기세포로부터 유래된 신경세포를 염색하였다.

면역형광 염색 분석방법을 수행한 구체적인 방법은 다음과 같다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 상온에서 20분 동안 12웰 플레이트의 웰에 고정하고 0.1% BSA/PBS로 5분씩 4회 세척한다. 세척 후 10% NGS (normal goat serum), 0.3% Triton X-100 및 0.1% BSA/PBS를 포함하는 용액을 첨가하고 상온에서 30분 내지 45분 동안 반응시켜 비특이 반응을 차단시켰다. 일차항체를 포함하는 10%NGS 및 0.1%BSA/PBS 용액을 상기 웰에 첨가하고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 0.1% BSA/PBS로 5분씩 3번 세척하고 이차 항체 및 이차 항체에 결합하는 시약을 포함하는 0.1% BSA/PBS 용액을 넣어 상온에서 4분 동안 반응시킨 후 0.1%BSA/PBS로 5분 동안 4회 세척하였다. 일차항체는 마우스에서 생산된 단일클론항체 항-튜불린β III (Monoclonal anti-Tubulin III antibody produced in mouse, Sigma) 및 토끼 다클론항체 항-MAP2 (rabbit anti-microtubule associated protein 2 polyclonal antibody, chemicon)을 각각 1:500 및 1:200로 완충용액 중에 희석하여 사용하였다. 이차항체는 비오틴화된 항-마우스 항체 (Biotinylated anti-mouse antibody) 및 비오틴화된 항-토끼 항체 (biotinylated anti-rabbit antibody)(Vector)를 각각 1:200로 완충용액 중에 희석하여 사용하였다. 2차 항체에 결합하는 시약으로는 스 트렙타빈 (streptavidin)에 접합된 디클로로트리아지닐 플루오레세인 (dichlorotriazinyl fluorescein: DTAF)(Jackson immuno Research)을 1:200로 완충용액 중에 희석하여 사용하였다.

Aβ42를 처리한 신경세포들 (대뇌 피질 및 해마 유래 세포 모두에서 동일)에서는 독성이 유발되어 신경돌기 (neurite)가 손상되어 끊어지고 세포 모양이 응축되어 있지만, 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 공동배양한 신경세포에서는 신경돌기가 유지되고 오히려 신경세포의 분화 성숙이 촉진되어 있음을 알 수 있었다 (도 7).

도 7은 Aβ42 처리된 신경세포를 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 공동배양하고, 배양된 신경세포를 항-튜불린β III 및 항-MAP2을 이용하여 면역 형광 염색법 및 웨스턴 블롯으로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.

도 7에서, A는 대뇌 피질 유래 신경세포에 관한 것이며, B는 해마 유래 신경세포에 관한 것으로서, MAP2 및 Tubulinβ III는 각각 항-MAP2 및 항-튜불린β III를 이용하여 면역 형광 염색한 결과를 나타낸다. 대조군(control)은 대뇌 피질 또는 해마 유래 신경세포를 Aβ를 포함하지 않은 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 24시간 동안 배양한 대조군 결과를 나타내고, Aβ42는 대뇌 피질 또는 해마 유래 신경세포를 Aβ를 10μM 농도로 포함하는 배지에서 24시간 동안 배양한 결과를 나타내고, Aβ42/MSC는 대뇌 피질 또는 해마 유래 신경세포를 Aβ를 10μM 농도로 포함하는 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 12시간 동안 배양한 다음, 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 12시간 더 배양한 결과를 나타내고, MSC는 대뇌 피질 또는 해마 유 래 신경세포를 Aβ를 포함하지 않은 배지에서 12시간 동안 배양한 다음, 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 12시간 더 배양한 결과를 나타낸다.

도 7에서, C는 Aβ42 처리된 대뇌 피질 유래 신경세포를 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 공동배양하고, 배양된 신경세포를 항-MAP2 항체를 이용하여 웨스턴 블롯한 결과를 나타내는 도면이다. 먼저, 배양된 신경세포를 SDS (sodium dodecyl sulfate)가 함유된 용해 버퍼 (lysis buffer)에서 초음파 파쇄기 (ultrasonicator)를 사용하여 세포막을 분쇄하고 단백질을 추출하였다. 추출된 단백질을 SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel)에 적용하고 전기영동하여 단백질 크기에 따라 분리하였다. 전기영동 후, 분리된 단백질을 전기적 성질을 이용하여 니트로셀룰로즈 막으로 옮기고 3% 탈지분유가 함유된 PBS에 희석된 토끼 유래 항-MAP2 항체 (Millipore chem 사)를 첨가하고 반응시켰다. 다음으로, 효소 스트렙타빈에 접합된 디클로로트리아지닐 플루오레세인 (dichlorotriazinyl fluorescein: DTAF)(Jackson immuno Research)이 접합된 항-토끼 항체 (Vector)를 첨가하여 반응시키고 효소의 기질인 ECL (Enhanced chemiluminescence) 용액을 처리하여 X-ray 필름으로 현상하였다. 도 7의 C에서, 대조군(control), Aβ, Aβ+MSC 및 MSC는 상기한 바와 같다. 도 7의 C에서, 200은 밴드에 해당하는 분자량 200 kDa을 나타낸다.

실시예 8: 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포에 의한 신경세포 및 미세아교 세포 내 네프릴리신 발현 유도

네프릴리신 (neprilysin: NEP)은 인슐린 분해 효소 (insulin degrading enzyme: IDE)와 더불어 생체 내에서 Aβ42를 분해하여 제거할 수 있는 단백질로 알려져 있다. 또한 쥐에서 NEP를 녹아웃(knockout)시키면 알츠하이머 병의 증상들이 관찰됨이 보고된 바 있다. 본 실시예에서는, 상기 실시예 4 내지 7에서 얻어진 신경세포들을 수확하여 용해(lysis)시킨 후 단백질을 추출하고 SDS-PAGE에서 전기영동하여 분리하고, 분리된 단백질을 항-네프릴리신 항체를 이용하여 웨스턴 블롯하여 NEP 단백질의 발현 정도를 측정하였다. 또한, NEP 특이 프라이머를 이용하여 NEP의 mRNA 발현 정도를 RT-PCR로 측정하였다. 또한, 항-NEP 항체로 배양된 세포를 염색하였다.

먼저, 세포를 4% 파라포름알데히드로 상온에서 20분 동안 12 웰 플레이트의 웰에 고정하고 0.1% BSA/PBS로 5분씩 4회 세척한다. 세척 후 10% NGS (normal goat serum), 0.3% Triton X-100 및 0.1% BSA/PBS을 포함하는 용액을 첨가하고 상온에서 30분 내지 45분 동안 반응시켜 비특이 반응을 차단시켰다. 일차항체를 포함하는 10%NGS 및 0.1%BSA/PBS 용액을 상기 웰에 첨가하고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 0.1% BSA/PBS로 5분씩 3번 세척하고 이차 항체 및 이차 항체에 결합하는 시약을 포함하는 0.1% BSA/PBS 용액을 넣어 상온에서 40분 동안 반응시킨 후 0.1%BSA/PBS로 5분간 4회 세척하였다 일차항체는 마우스에서 생산된 단일클론항체 항-NEP (Monoclonal anti-NEP antibody produced in mouse, Sigma)를 1:500로 완충용액 중에 희석하여 사용하였다. 이차항체는 비오틴화된 항-마우스 항체(Vector)를 1:200로 완충용액 중에 희석하여 사용하였다. 2차 항체에 결합하는 시약으로는 스트렙타빈에 접합된 디클로로트리아지닐 플루오레세인 (dichlorotriazinyl fluorescein: DTAF)(Jackson immuno Research)을 1:200로 완충용액 중에 희석하여 사용하였다.

도 8은 Aβ42 처리된 랫트 유래 신경세포와 인간 골수 유래 간엽 줄기세포 또는 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 공동배양할 때, 랫트 유래 신경세포에서 네프릴리신의 발현 정도를 관찰한 결과이다.

도 8의 A의 상단은 랫트 대뇌 피질 유래 신경세포를 배양하고 웨스턴 블롯한 결과를 나타낸다. Neuron은 랫트 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 포함하지 않은 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 24시간 동안 배양한 대조군 결과를 나타내고, Neuron + Aβ는 랫트 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 10μM 농도로 포함하는 배지에서 24시간 동안 배양한 결과를 나타내고, Neuron+Aβ+MSC는 랫트 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 10μM 농도로 포함하는 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 12시간 동안 배양한 다음, 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 12시간 더 공동배양한 결과를 나타내고, Neuron+MSC는 랫트 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 포함하지 않은 배지에서 12시간 동안 배양한 다음, 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 12시간 더 공동배양한 결과를 나타낸다.

도 8의 A의 하단은 배양된 랫트 신경세포로부터 분리된 mRNA를 주형으로 하여 RT-PCR한 결과를 나타낸다. 사용된 PCR 프라이머는 서열번호 15 및 16의 랫트 NEP 유전자 특이적 프라이머를 사용하고, β-actin 유전자 특이적 프라이머는 서열 번호 17 및 18의 프라이머를 사용하였다. PCR 결과, NEP 유전자에 대하여 422bp 및 β-actin 유전자에 대하여 300bp의 증폭산물이 얻어졌다. Neuron, Neuron+Aβ, Neuron+Aβ+MSC 및 Neuron+MSC는 위에서 설명한 바와 동일하다.

도 8의 A에 나타낸 바와 같이, 랫트 유래 신경세포에 Aβ42를 처리한 경우, NEP의 발현은 줄어들었으며, Aβ42를 처리된 랫트 유래 신경세포를 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 공동배양하는 경우, NEP의 발현이 단백질과 mRNA 단계에서 증가됨을 확인하였다. 이는 인간 간엽 줄기세포가 랫트 유래 신경세포를 자극하여 신경세포의 NEP의 생성을 증가시키고 Aβ42 독성 단백질을 제거할 수 있음을 증명하는 결과라 할 수 있다.

도 8의 B에서, Ct, Aβ,Aβ+MSC 및 MSC는 위에서 설명한 바 있는, Neuron, Neuron+Aβ, Neuron+Aβ+MSC 및 Neuron+MSC에 각각 대응된다.

염색 과정은 다음과 같다. 세포를 4% 파라포름알데히드로 상온에서 20분 동안 12웰 플레이트의 웰에 고정하고 0.1% BSA/PBS로 5분씩 4회 세척한다. 세척 후 10% NGS (normal goat serum), 0.3% Triton X-100 및 0.1% BSA/PBS을 포함하는 용액을 첨가하고 상온에서 30분 내지 45분 동안 반응시켜 비특이 반응을 차단시켰다. 일차항체를 포함하는 10% NGS 및 0.1%BSA/PBS 용액을 상기 웰에 첨가하고 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 0.1% BSA/PBS로 5분씩 3번 세척하고 이차 항체 및 이차 항체에 결합하는 시약을 포함하는 0.1% BSA/PBS 용액을 넣어 상온에서 40분 동안 반응시킨 후 0.1% BSA/PBS로 5분간 4회 세척하였다. 일차항체는 마우스에서 생산된 단일클론항체 항-NEP (Monoclonal anti-NEP antibody produced in mouse, Sigma)를 1:500로 완충용액 중에 희석하여 사용하였다. 이차항체는 비오틴화된 항-마우스 항체(Vector)를 1:200로 완충용액 중에 희석하여 사용하였다. 2차 항체에 결합하는 시약으로는 스트렙타빈에 접합된 디클로로트리아지닐 플루오레세인 (dichlorotriazinyl fluorescein: DTAF)(Jackson immuno Research)을 1:200로 완충용액 중에 희석하여 사용하였다.

도 8의 B에 나타낸 바와 같이, Aβ42를 처리하면 붉게 염색된 부분이 현저히 감소하여 NEP의 발현이 랫트 유래 신경세포에서 줄어들었다 (Aβ). 그 후 인간 유래 간엽 줄기세포를 공동배양하면 랫트 유래 신경세포에서 NEP의 발현이 다시 회복되었다(Aβ+MSC).

또한 도 8C는 인간 골수 유래 간엽 줄기세포(BM-MSC)를 이용하여 동일 실험을 수행하여 랫트 유래 신경세포 내 NEP의 발현이 증가됨을 RT-PCR로 확인한 것이다.

NEP와 β-actin의 RT-PCR은 도 8A에서 설명한 바와 동일한 프라이머를 사용하여 동일한 조건에서 수행하였다. 도 8C에서, 레인1은 랫트 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 포함하지 않은 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 24시간 동안 배양한 대조군 결과를 나타내고, 레인2와 3은 랫트 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 포함하지 않은 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 12시간 동안 배양한 다음, 인간 골수 유래 간엽 줄기세포 (BM-MSC1 및 BM-MSC2)와 12시간 더 공동배양한 결과를 나타낸다. RT-PCR에 의한 결과 뿐만 아니라, 웨스턴 블롯팅 및 면역 염색 결과, 단백질 수준 에서도 BM-MSC를 Aβ 처리되거나 처리되지 않은 랫트 유래 신경세포와 공동배양하는 경우, 상기 신경세포에서 NEP의 발현이 증가하였다.

뇌에는 신경세포 (neuron) 뿐만 아니라 미세아교 세포 (microglial cell)가 있는데 미세아교 세포는 뇌의 대식세포로 불리며 뇌에 축척된 독성물질을 제거하는 세포로 알려져 있다. 최근 보고에 의하면 알츠하이머 병에서 미세아교 세포가 Aβ를 제거하는 세포로써 작용하는데 미세아교 세포에서 네프릴리신의 발현이 감소하여 알츠하이머 병의 진행이 촉진된다는 보고가 있었다. 따라서, 인간 제대혈 세포에 의해서 발현이 회복되는 NEP 양상을 랫트 유래 신경세포와 미세아교 세포에서 면역 염색법으로 확인하였다 (도 9). 도 9는 Aβ42 처리된 신경세포와 간엽 줄기세포를 공동배양 후 네프릴리신의 발현 정도를 신경세포와 미세아교 세포에서 확인한 결과이다.

도 9의 상단은 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 10μM 농도로 포함하는 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 12시간 동안 배양한 다음, 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 12시간 더 공동배양한 후 신경세포 마커인 MAP2와 NEP에 각각 특이적으로 결합하는 항체로 이중 염색 (double staining)한 결과를 나타내는 도면이다. 염색과정은, MAP2에 대한 1차 항체로서 토기 유래 항-MAP2 항체, 상기 1차 항체에 결합하는 2차 항체로서 비오틴화된 항-토끼 항체 및 2차 항체에 결합하는 시약으로 스 트렙타빈에 접합된 디클로로트리아지닐 플루오레세인(dichlorotriazinyl fluorescein: DTAF)(Jackson immuno Research)을 사용하였고, NEP에 대한 1차 항체로서 마우스 단일클론항체 항-NEP (Monoclonal anti-NEP antibody produced in mouse, Sigma), 이차항체는 비오틴화된 항-마우스 항체(Vector) 및 2차 항체에 결합하는 시약으로 스트렙타빈에 접합된 디클로로트리아지닐 플루오레세인 (dichlorotriazinyl fluorescein: DTAF)(Jackson immuno Research)을 사용한 것을 제외하고는, 상기 도 8B와 동일한 과정에 의하여 염색하였다. 도 9의 상단에서, MAP2와 NEP는 동일한 세포를 항-MAP2와 항-NEP 항체로 각각 염색한 결과를 나타내고, MAP2+NEP는 동일한 세포를 항-MAP2와 항-NEP 항체로 각각 염색한 결과의 이미지를 중첩한 이미지를 나타낸다. DAPI는 도 6의 하단열과 동일한 과정에 의하여 DAPI 염색한 결과를 나타낸다.

도 9의 상단에 나타낸 바와 같이, MAP2 및 NEP 실험군 모두에서 염색이 되는 것으로 보아, 상기 세포는 MAP2 및 NEP 모두를 발현하는 것으로 확인되었다. 또한, 이미지 중첩 결과 (MAP2+NEP), MAP2 및 NEP는 모두 동일한 위치에서 발현되는 것으로 확인되었으며, 이는 상기 신경세포가 MAP2 및 NEP 모두 발현한다는 것을 나타낸다. DAPI 염색 결과, 신경세포에서 염색되었으며, 이는 상기 신경세포가 정상적으로 유지되고 있다는 것을 나타낸다.

도 9의 하단은 대뇌 피질 유래 뉴론 대신 미세아교 세포를 사용하고 MAP2 및 NEP에 대하여 염색하는 대신에 미세아교 세포 마커인 CD40과 NEP에 대하여 염색한 것을 제외하고는, 도 9의 상단과 동일하게 실험한 결과를 나타낸 도면이다. CD40에 대한 염색은, CD40에 대한 1차 항체로서 염소 유래 항-CD40 항체, 상기 1차 항체에 결합하는 2차 항체로서 비오틴이 접합된 항-염소 항체 및 2차 항체에 결합하는 시약으로 스트렙타빈에 접합된 디클로로트리아지닐 플루오레세인 (dichlorotriazinyl fluorescein: DTAF)(Jackson immuno Research)을 1:200으로 완충용액 중에 희석하여 사용하였다.

도 9의 하단에 나타낸 바와 같이, CD40 및 NEP 실험군 모두에서 염색이 되는 것으로 보아, 상기 미세아교 세포는 CD40 및 NEP 모두를 발현하는 것으로 확인되었다. 또한, 이미지 중첩 결과 (CD40+NEP), CD40 및 NEP는 모두 동일한 위치에서 발현되는 것으로 확인되었으며, 이는 상기 미세아교 세포가 CD40 및 NEP 모두 발현한다는 것을 나타낸다. DAPI 염색 결과, 미세아교 세포에서 염색되었으며, 이는 상기 미세아교 세포가 정상적으로 유지되고 있다는 것을 나타낸다.

도 9의 상단 및 하단의 결과로부터 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 공동배양하는 경우, Aβ로 처리된 신경세포와 미세아교 세포 모두에서 NEP의 발현이 유도된다는 것이 확인되었다.

실시예 9: 간엽 줄기세포가 분비하여 Aβ42의 독성을 억제하는 분비 단백질의 동정 및 효과 검증

실시예 4 내지 8의 결과, Aβ42 처리된 신경세포를 간엽 줄기세포와 직접적 인 접촉이 없는 상태에서 공동배양하는 경우, 상기 신경세포에서 Aβ42의 독성 활성이 억제된다는 것이 확인되었다. 이는 간엽 줄기세포로부터 분비된 물질이 상기 신경세포에 상호작용하여 Aβ42의 독성 활성을 억제하는 것으로 예측할 수 있다.

본 실시예에서는 간엽 줄기세포로부터 분비된 물질 중에서 Aβ42의 독성 활성을 억제하는 물질을 탐색하고, 확인하였다.

(1) 간엽 줄기세포 유래 Aβ42의 독성 활성을 억제하는 물질 탐색

먼저, 세포를 다음과 같은 여러 조건에서 배양하였다.

배양군1: 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 포함하지 않은 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 24시간 동안 배양하였다.

배양군2: 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 10μM 농도로 포함하는 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 24시간 동안 배양하였다.

배양군3: 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ를 10μM 농도로 포함하는 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 12시간 동안 배양한 다음, 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 12시간 더 공동배양하였다.

배양군4: 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 Aβ를 10μM 농도로 포함하는 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 24시간 동안 배양하였다.

배양군5 및 6: 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포를 무혈청 Neurobasal^TM 배지 중에서 24시간 배양하였다.

다음으로, 상기 배양군 1 내지 6으로부터 배지를 수확하고, 배지 중의 사이토카인 및 단백질을 분석 및 비교하여, 줄기세포를 단독으로 배양하는 경우 발현되지 않거나 거의 발현되지 않으나, 줄기세포와 신경세포를 공동배양하는 경우 발현이 증가된 사이토카인 또는 단백질을 선별하였다. 사이토카인 분석은 RayBio^TM Human Cytokine Antibody Array I G series (RayBiotech, Inc)를 제조사에 지침에 따라 사용하여 이루어졌고, 단백질 분석은 RayBio^TM Human Cytokine Antibody Array I G series/Biotin Label Based Antibody Array I G series (RayBiotech, Inc)를 제조사에 지침에 따라 사용하여 이루어졌다. 상기 2개의 어레이는 총 54,504 종류의 단백질을 분석할 수 있다.

분석 결과 얻어진 데이터를 비교하여, 줄기세포를 단독으로 배양하는 경우 발현되지 않거나 거의 발현되지 않으나, 줄기세포와 신경세포를 공동배양하는 경우 발현이 증가된 단백질을 선별하였다. 그 결과, 아래와 같은 14 종류의 단백질이 확인되었다:

악티빈A (activin A), 혈소판인자4 (platelet factor 4:PF4), 데코린 (decorin), 갈렉틴3 (galectin 3), 성장분화인자15 (growth differentiation factor 15: GDF15), 글리피칸3 (glypican 3), 막 프리즐 관련 단백질 (membrane frizzled-related protein: MFRP), 세포간 부착 분자5 (intercellular adhesion molecule 5: ICAM5), 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질7 (insulin-like growth factor binding protein 7: IGFBP7), 혈소판 유래 성장인자 AA (platelet-derived growth factor AA: PDGF-AA), 분비된 산성 시스테인 리치 단백질-유사 단백질1 (secreted protein acidic and rich in cysteines-like 1:SPARCL1), 트롬보스폰딘1 (thrombospondin 1: TSP1), WNT1 유도성 신호전달 단백질1 (WNT1 inducible signaling pathway protein 1: WISP1) 및 프로그라눌린 (progranulin: PGN)이었다.

상기 14 종류의 단백질이 Aβ처리된 신경세포에서 독성을 억제하고 신경세포의 분화와 성숙을 촉진하는 것으로 추정하였다.

(2) 탐색된 14종 단백질의 활성 확인

탐색된 14종 단백질의 재조합 단백질을 구입하였다 (R&D SYSTEMS 사). 다음으로, 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ 및 상기 14종 단백질의 각각을 악티빈 A 25 ng/ml, PF4 25 ng/ml, 갈렉틱3 3ng/ml, 데코린 100 ng/ml, GDF15 50 ng/ml, 글리피칸3 50 ng/ml, MFRP 50 ng/ml, ICAM5 50 ng/ml, IGFBP7 30 ng/ml, PDGF-AA 50 ng/ml, SPARCL1 50 ng/ml, TSP1 50 ng/ml, WISP1 50 ng/ml 및 프로그라눌린 50 ng/ml의 농도로 포함하는 무혈청 Neurobasal^TM 배지에 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 죽은 세포와 생존가능한 세포는 LIVE/DEAD^TM 생존성/세포독성 분석 키트 (Sigma, L3224)를 사용한 형광염색을 통하여 측정하였다. 측정된 죽은 세포와 생존가능한 세포의 수를 기초로 Aβ에 의하여 유도된 신경세포의 세포사 정도를 계산하였다. 세포사는 전체 세포 수에 대한 죽은 세포의 비율로 계산하였다.

도 10은 간엽 줄기세포 배양시 분비되는 단백질과 Aβ42 처리된 신경세포를 배양할 때, 백분율로 표시한 신경세포사를 나타낸 도면이다. 도 10에서, Cortex는 Aβ42를 포함하지 않은 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 대뇌 피질 신경세포를 24시간 동안 배양한 것이고, Cortex+Aβ는 Aβ42를 10μM 농도로 포함하는 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 대뇌 피질 신경세포를 24시간 동안 배양한 것이고, Cortex+Aβ+MSC는 Aβ42를 10μM 농도로 포함하는 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 대뇌 피질 신경세포를 12시간 동안 배양한 후 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 12시간 동안 공동배양한 것이고, Cortex+MSC는 Aβ42를 포함하지 않은 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 대뇌 피질 신경세포를 12시간 동안 배양한 후, 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 12시간 동안 공동배양한 결과를 나타낸다. Aβ는 대뇌 피질 유래 신경세포를 Aβ42 및 상기 14종 단백질의 각각을 상기한 농도로 포함하는 무혈청 Neurobasal^TM 배지에서 24시간 동안 배양한 것이다 (도 10에서 p<0.03, p<0.01은 t-test 결과 오차범위가 각각 3% 및 1% 미만이라는 것을 나타낸다).

도 10에 나타낸 바와 같이, 14개 단백질 각각은 Aβ42에 의한 신경세포의 세포사를 억제하였다. 세포사 억제 정도는 Cortex+Aβ+MSC, 갈렉틴3, WISP1 및 MFRP의 순서로 높았다. 이는 제대혈 유래 줄기세포의 공동배양 즉, 14개 단백질의 조합에서 가장 강한 억제효과 있다는 것을 암시한다.

또한, 14개 단백질이 신경세포의 성숙에 미치는 영향을 조사하기 위하여 배양된 신경세포의 신경돌기(neurite)의 길이를 측정하였다. 배양 조건은 도 10에 기술한 바와 동일하게 배양하였다. 신경돌기 길이 측정은, 100개의 세포를 각 배양군 당 무작위로 선택하고 i-solution 소프트웨어 (iMTechnology 사)를 이용하여 신경돌기의 길이를 측정하였다.

도 11은 간엽 줄기세포 배양시 분비되는 단백질과 Aβ42 처리된 신경세포를 배양할 때, 신경세포의 신경돌기의 길이를 측정한 결과이다. 도 11에서, 횡축의 배양군은 도 10에 나타낸 바와 동일하고, 종축의 길이는 평균 길이 (단위 : ㎛)를 나타낸다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 14개 단백질 각각은 단독 또는 조합하여 Aβ42 처리된 신경세포에 비하여 신경돌기의 길이를 현저히 증가시겼다.

실시예 10: 간엽줄기세포에서 분비되어 미세아교 세포에서 네프릴리신의 발현을 유도하는 사이토카인의 동정

본 실시예에서는 실시예 4에 설명된 바와 같은 공동배양 시스템의 하부 챔버에 미세아교 세포, BV2 세포를 배양하고 상부 챔버에는 제대혈 유래 간엽줄기 세포 (UCB-MSC)를 배양하였다. BV2 세포는 배양된 생쥐 미세아교 세포 (microglial cell)를 v-raf/v-myc 재조합 레트로바이러스로 감염시켜 불멸화시킨 것으로, 활성화된 미세아교 세포의 특성을 발현한다. 공동배양은 하부 챔버에서 5% FBS 함유 DMEM 배지에서 BV2 세포를 배양한 다음 5% FBS 함유 α-MEM 배지에서 배양된 제대혈 유래 간엽줄기 세포를 상부 챔버에 첨가하고 배지를 무혈청 DMEM 배지로 교환하 였다. 무혈청 DMEM 배지에서 24시간 동안 공동배양하였다. 그 후 상부챔버의 MSC를회수하여 트리졸 시약(trizol reagent)을 사용하여 총 RNA (total RNA)를 얻고, 얻어진 총 RNA를 주형으로 하여 RT-PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머는 IL-4 (서열번호 22 및 23), IL-6 (서열번호 24 및 25), IL-8 (서열번호 26 및 27) 및 MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1) (서열번호 28 및 29) 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하였다. PCR 대조군으로 서열번호 17 및 18의 프라이머를 사용하여 β-액틴을 증폭하였다. 대조군으로는 BV2 세포와 공동배양되지 않은 것을 제외하고 동일한 조건에서 배양된 UCB-MSC를 사용하였다.

도 12는 미세아교 세포와 UCB-MSC를 공동배양한 후 UCB-MSC로부터 분리된 총 RNA를 주형으로 하여 RT-PCR한 산물을 나타내는 도면이다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 미세아교 세포와 UCB-MSC를 공동배양하는 경우, UCB-MSC에서 IL-4, IL-6, IL-8 및 MCP-1의 발현이 증가하였다.

IL-4, IL-6, IL-8 및 MCP-1 각각의 존재하에서 미세아교 세포, BV2 세포 및 신경세포, SH-SY5Y 세포 (ATCC 사)를 배양하고, BV2 세포 및 SH-SY5Y 세포를 회수하고, 회수된 세포를 용해하고, 세포 용해물로부터 단백질을 크기별로 분리한 후, 항-NEP 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅하였다. 그 결과, IL-4의 존재하에서 BV2 세포 및 SHY-5Y 세포를 배양하는 경우, IL-4의 부존재하에서 배양하는 경우에 비하여 NEP의 발현이 시간에 따라 증가하였다. SH-SY5Y 세포는 SK-N-SH로부터 유래된 트리스 클론된 뉴로블라스토마 (thrice-cloned neurobastoma)이다.

도 13은 IL-4의 존재하에서 신경세포 및 미세아교 세포를 배양하는 경우, NEP 발현이 증가하는 것을 나타내는 도면이다. 도 13의 A는 미세아교 세포인 BV2 세포를 10ng/ml IL-4를 포함하는 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양한 결과이다. 도 13의 B는 신경세포인 SH-SY5Y 세포를 10ng/ml IL-4를 포함하는 α-MEM 배지에서 24시간 동안 배양한 결과이다.

실시예 11 : 알츠하이머 병 형질전환 생쥐의 해마 및 피질 내 제대혈 유래 간엽 줄기세포 투여에 의한 아밀로이드 단백질 플라크의 감소 (티오플라빈 (thioflavin) S 염색법 및 면역블롯팅)

치료효과의 증진을 위하여 알츠하이머 병 형질전환 생쥐 10 개월 령에 PBS와 PBS 중 1x10⁴의 제대혈 간엽 줄기세포 및 200㎍/kg 생쥐 체중의 물 중 인터루킨-4 (IL-4) (Peprotech 사) 각각을 정위틀 (stereotactic frame)을 이용하여 해마에 투여하고 10일이 경과한 다음 생쥐를 희생시킨 후 뇌조직을 해마와 피질에서 얻었다. 얻은 뇌조직을 절편으로 만들고 티오술판 (thiosulfate) (Sigma 사) 염색을 통하여 아밀로이드 베타 단백질의 침착 정도를 염색한 결과를 확인하였다. 플라크를 확인하기 위해서 50% 에탄올에 녹인 Sigma 사의 티오플라빈 (thioflavin) 용액에 조직을 5분간 반응시켰다. 반응 후 조직 절편을 50% 에탄올에 수세하고 다시 5분간 물로 수세하였다. 이 조직 절편을 형광 현미경하에 관찰하여 조직 내 아밀로이드 단백질 플라크를 확인하였다.

도 14는 해마와 피질을 포함하는 뇌조직에서 아밀로이드 베타 단백질 침착을 Thio-S 염색법을 이용하여 확인 결과를 나타내는 도면이다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 제대혈 간엽 줄기세포 투여군과 IL-4 투여군에서 아밀로이드 베타 단백질의 침착이 현저히 감소함을 알 수 있었다. 도 14에서, PBS, MSC, 및 IL-4는 각각 PBS, 제대혈 유래 간엽 줄기세포 및 인터루킨-4를 투여한 군을 나타낸다.

도 15는 도 14의 염색 사진에서 아밀로이드 침착의 총면적을 나타내는 도면이다. 침착 면적은 Metamorpho 소프트웨어 (Molecular devices 사)를 이용하여 측정하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, MSC 및 IL-4 투여군에서 대조군에 비하여 아밀로이드 침착이 현저하게 감소하였다.

도 16은 실험에 사용된 생쥐의 뇌에서 생성된 아밀로이드 베타 단백질의 양의 변화를 도면이다. 도 16의 결과는 다음과 같은 과정에 의하여 얻어졌다. 먼저, 상기한 같은 조건으로 실험된 생쥐의 해마 및 피질을 포함하는 뇌 조직들을 얻어 초음파 파쇄기 (sonicator) (Branson사)를 이용하여 단백질 추출물을 얻었다. 다음으로, 상기 추출물에 대하여 전기영동을 실시하여 단백질을 크기에 따라 분리하였다. 분리된 단백질을 전위차를 이용하여 니트로셀룰로즈 막으로 옮긴 후 Aβ42를 특이적으로 검출할 수 있는 항체를 사용하여 면역블롯팅을 수행하였다. 염색은 쿠마시 블루(coomassie blue)를 사용하여 염색하였다. 도 16에 나타낸 바와 같이, Aβ42 단백질은 PBS 투여군 비해 제대혈 간엽줄기세포 투여군과 IL-4 투여군에서 그 양이 현저하게 감소함을 알 수 있었다. 도 16에서, Litter는 littermate를 나타내 는 것으로, 형질전환 생쥐의 정상 한배 새끼를 나타내고, APP/PS1 mice는 알츠하이머 병 형질전환 생쥐를 나타낸다. 또한, PBS, MSC 및 IL-4는 각각 PBS, MSC 및 IL-4를 투여한 군을 나타낸다.

실시예 12 : 제대혈 간엽 줄기세포 및 IL-4 투여가 네프릴리신 발현에 미치는 영향

(1) 정상 및 알츠하이머 병 형질전환 동물의 뇌 조직에서 네프릴리신 단백질발현

각각 6, 9, 12 및 18개월 (month) 동안 사육된 정상 생쥐와 알츠하이머 병 형질전환 생쥐의 뇌 조직을 얻은 후 실시예 12와 동일한 방법으로 단백질 추출물을 얻어 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 니트로셀룰로즈 막에 옮긴 후 항-네프릴리신 항체 (R&D systems사)와 반응시켜 NEP 단백질의 발현 여부를 분석하였다.

도 17은 정상 및 알츠하이머 형질전환 생쥐에서 해마와 피질을 포함하는 뇌조직에서 NEP 발현 정도를 나타내는 도면이다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 네프릴리신의 발현은 알츠하이머 병 형질전환 생쥐의 뇌에서 감소하였다. 도 17에서, Litter 및 APP/PS1 mice는 도 16에 대한 것과 동일하다. 또한, 레인 6, 9, 12, 및 18은 각각 6, 9, 12, 및 18 개월 (M: month)을 사육한 군을 나타낸다.

도 18은 도 17의 NEP 밴드의 세기를 나타내는 도면이다. 세로 축의 NEP 밴드 세기는 Quantity One (Bio-RAD 사) 소프트웨어를 이용하여 측정하였으며, 상대적 밴드 세기를 나타낸다. 도 18에 나타낸 바와 같이, 네프릴리신의 발현은 정상 생쥐에 비하여, 알츠하이머 병 형질전환 생쥐의 뇌에서 감소하였다.

(2) 제대혈 간엽 줄기세포 및 IL-4 투여가 네프릴리신 발현에 미치는 영향

알츠하이머 병 형질전환 생쥐 10 개월 령에 PBS와 PBS 중 1x10⁴의 제대혈 간엽 줄기세포 및 200㎍/kg 생쥐 체중 물 중 인터루킨-4 (IL-4)를 해마에 투여하고 10일이 경과한 다음 생쥐를 희생시킨 후 해마 및 피질을 포함하는 뇌 조직을 얻었다. 얻어진 각 뇌 조직에서 단백질 추출물을 얻은 후 전기영동하여 면역 블롯팅으로 네프릴리신의 발현양을 분석하였다.

도 19는 간엽 줄기세포 및 IL-4 투여된 생쥐에서 해마 및 피질을 포함하는 뇌 조직에서 NEP 발현 정도를 나타내는 도면이다. 염색은 쿠마시 블루(coomassie blue)를 사용하여 염색하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, (1)에서 관찰한 결과와 같이 PBS 투여군의 네프릴리신의 발현은 정상 생쥐에 비해 감소하였으나, 제대혈 간엽 줄기세포와 IL-4 투여군에서는 그 발현양이 정상 생쥐에 비하여 유사하게 발현되었다.

실시예 13: 제대혈 간엽 줄기세포 및 IL-4 투여가 미세아교 세포에서의 네프릴리신에 미치는 영향

실시예 8에서, 간엽 줄기세포와 신경세포 및 미세아교 세포를 각각 공동배양하는 경우, 신경세포 및 미세아교 세포에서 각각 네프릴리신이 과발현되는 것을 확 인하였다.

본 실시예에서는 동물 모델에서 이러한 효과를 확인하였다. 실시예 12에 기재된 PBS 투여군, 제대혈 간엽 줄기세포 투여군 및 IL-4 투여군의 뇌의 해마 조직을 실시예 8에 기재된 도 8B의 염색 과정과 동일하게 염색하였다. 염색은 항-NEP 항체 및 미세아교세포의 마커인 항-CD40 항체 (Santacruz Biotechnology사)로 중복 염색하여 통합하였다 (merge). 항-NEP 항체 염색의 경우, 2차 항체 및 그에 결합하는 시약은 실시예8에 기재된 바와 동일하며, 항-CD40 항체 염색의 경우, 2차 항체 및 그에 결합하는 시약은 실시예8과 동일한 것을 사용하였다.

도 20은 제대혈 간엽 줄기세포 및 IL-4가 투여된 생쥐의 미세아교 세포에서 NEP 발현을 나타내는 도면이다. 도 20에 나타낸 바와 같이, 동물모델에 제대혈 간엽 줄기세포 및 IL-4를 투여하는 경우, 미세아교 세포에서 네프릴리신의 과발현이 유도되었다.

도 1은 신경세포를 아밀로이드-베타(Abeta)와 24시간 처리 후 광학현미경으로 생존한 신경세포를 관찰한 결과이다.

도 2는 아밀로이드-베타가 처리된 신경세포를 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포와 공동배양하기 위한 공동배양 시스템을 나타낸다.

도 3은 아밀로이드-베타 (Aβ42)에 의한 신경세포 사멸에 대한 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포 (MSC)의 공동배양의 효과를 보여주는 형광 염색 분석결과이다.

도 4는 Aβ42에 의한 신경세포 사멸에 대한 인간 제대혈 유래 간엽 줄기세포의 공동배양의 효과를 세포사멸 백분율로 나타낸 것이다.

도 5는 Aβ42에 의한 신경세포 사멸에 대한 인간 골수 유래 간엽 줄기세포의 공동배양의 효과를 보여주는 형광 염색 분석결과이다.

도 6은 Aβ42에 의하여 인산화되어 신경세포의 죽음을 유발하는 단백질로 알려진 Tau의 인산화된 phosphor-tau의 항체를 이용하여 신경세포를 염색한 결과이다.

도 7은 Aβ42 처리된 신경세포와 간엽 줄기세포를 공동배양할 때, 신경세포를 면역형광염색법으로 관찰한 결과이다.

도 8은 Aβ42 처리된 신경세포와 골수 유래간엽 줄기세포 또는 제대혈유래 간엽 줄기세포를 공동배양할 때, 네프릴리신의 발현정도를 관찰한 결과이다.

도 9는 Aβ42 처리된 뉴론과 간엽 줄기세포를 공동배양 후 네프릴리신의 발현정도를 신경세포과 미세아교 세포에서 확인한 결과이다.

도 10는 간엽 줄기세포 배양시 분비되는 단백질과 Aβ42 처리된 신경세포를 배양할 때, 백분율로 표시한 신경세포사를 나타낸 것이다.

도 11은 간엽 줄기세포 배양시 분비되는 단백질과 Aβ42 처리된 신경세포를 배양할 때, 신경세포의 신경돌기의 길이를 측정한 결과이다.

도 12는 미세아교 세포와 UCB-MSC를 공동배양한 후 UCB-MSC로부터 분리된 총 RNA를 주형으로 하여 RT-PCR한 산물을 나타내는 도면이다.

도 13은 IL-4의 존재하에서 신경세포 및 미세아교 세포를 배양하는 경우, NEP 발현이 증가하는 것을 나타내는 도면이다.

도 14는 해마와 피질을 포함하는 뇌조직에서 아밀로이드 베타 단백질 침착을 Thio-S 염색법을 이용하여 확인 결과를 나타내는 도면이다.

도 15는 도 14의 염색 사진에서 아밀로이드 침착의 총면적을 나타내는 도면이다.

도 16은 실험에 사용된 생쥐의 뇌에서 생성된 아밀로이드 베타 단백질의 양의 변화를 도면이다.

도 17은 정상 및 알츠하이머 형질전환 생쥐에서 해마와 피질을 포함하는 뇌조직에서 NEP 발현 정도를 나타내는 도면이다.

도 18은 도 17의 NEP 밴드의 세기를 나타내는 도면이다. NEP 밴드 세기는 Quantity One (Bio-RAD 사) 소프트웨어를 이용하여 측정하였다.

도 19는 간엽 줄기세포 및 IL-4 투여된 생쥐에서 해마 및 피질을 포함하는 뇌 조직에서 NEP 발현 정도를 나타내는 도면이다.

도 20은 제대혈 간엽 줄기세포 및 IL-4가 투여된 생쥐의 미세아교 세포에서 NEP 발현을 나타내는 도면이다.

<110> MEDIPOST CO., LTD. <120> Composition comprising mesenchymal stem cells or culture solution of mesenchymal stem cells for the prevention or treatment of neural diseases <130> PN086133 <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 426 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Leu Leu Trp Leu Arg Gly Phe Leu Leu Ala Ser Cys Trp Ile 1 5 10 15 Ile Val Arg Ser Ser Pro Thr Pro Gly Ser Glu Gly His Ser Ala Ala 20 25 30 Pro Asp Cys Pro Ser Cys Ala Leu Ala Ala Leu Pro Lys Asp Val Pro 35 40 45 Asn Ser Gln Pro Glu Met Val Glu Ala Val Lys Lys His Ile Leu Asn 50 55 60 Met Leu His Leu Lys Lys Arg Pro Asp Val Thr Gln Pro Val Pro Lys 65 70 75 80 Ala Ala Leu Leu Asn Ala Ile Arg Lys Leu His Val Gly Lys Val Gly 85 90 95 Glu Asn Gly Tyr Val Glu Ile Glu Asp Asp Ile Gly Arg Arg Ala Glu 100 105 110 Met Asn Glu Leu Met Glu Gln Thr Ser Glu Ile Ile Thr Phe Ala Glu 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Arg Lys Thr Leu His Phe Glu Ile Ser Lys Glu Gly 130 135 140 Ser Asp Leu Ser Val Val Glu Arg Ala Glu Val Trp Leu Phe Leu Lys 145 150 155 160 Val Pro Lys Ala Asn Arg Thr Arg Thr Lys Val Thr Ile Arg Leu Phe 165 170 175 Gln Gln Gln Lys His Pro Gln Gly Ser Leu Asp Thr Gly Glu Glu Ala 180 185 190 Glu Glu Val Gly Leu Lys Gly Glu Arg Ser Glu Leu Leu Leu Ser Glu 195 200 205 Lys Val Val Asp Ala Arg Lys Ser Thr Trp His Val Phe Pro Val Ser 210 215 220 Ser Ser Ile Gln Arg Leu Leu Asp Gln Gly Lys Ser Ser Leu Asp Val 225 230 235 240 Arg Ile Ala Cys Glu Gln Cys Gln Glu Ser Gly Ala Ser Leu Val Leu 245 250 255 Leu Gly Lys Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Lys Lys 260 265 270 Gly Gly Gly Glu Gly Gly Ala Gly Ala Asp Glu Glu Lys Glu Gln Ser 275 280 285 His Arg Pro Phe Leu Met Leu Gln Ala Arg Gln Ser Glu Asp His Pro 290 295 300 His Arg Arg Arg Arg Arg Gly Leu Glu Cys Asp Gly Lys Val Asn Ile 305 310 315 320 Cys Cys Lys Lys Gln Phe Phe Val Ser Phe Lys Asp Ile Gly Trp Asn 325 330 335 Asp Trp Ile Ile Ala Pro Ser Gly Tyr His Ala Asn Tyr Cys Glu Gly 340 345 350 Glu Cys Pro Ser His Ile Ala Gly Thr Ser Gly Ser Ser Leu 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Gln Ala Ala Arg Gly Arg 180 185 190 Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly 195 200 205 Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly 210 215 220 Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys 225 230 235 240 Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln 245 250 255 Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro 260 265 270 Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr 275 280 285 Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp 290 295 300 Cys His Cys Ile 305 <210> 6 <211> 580 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp 20 25 30 Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly 35 40 45 Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val 50 55 60 Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu 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PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Arg Trp Phe Leu Pro Trp Thr Leu Ala Ala Val Thr Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Ser Thr Val Leu Ala Thr Ala Leu Ser Pro Ala Pro Thr Thr Met 20 25 30 Asp Phe Thr Pro Ala Pro Leu Glu Asp Thr Ser Ser Arg Pro Gln Phe 35 40 45 Cys Lys Trp Pro Cys Glu Cys Pro Pro Ser Pro Pro Arg Cys Pro Leu 50 55 60 Gly Val Ser Leu Ile Thr Asp Gly Cys Glu Cys Cys Lys Met Cys Ala 65 70 75 80 Gln Gln Leu Gly Asp Asn Cys Thr Glu Ala Ala Ile Cys Asp Pro His 85 90 95 Arg Gly Leu Tyr Cys Asp Tyr Ser Gly Asp Arg Pro Arg Tyr Ala Ile 100 105 110 Gly Val Cys Ala Gln Val Val Gly Val Gly Cys Val Leu Asp Gly Val 115 120 125 Arg Tyr Asn Asn Gly Gln Ser Phe Gln Pro Asn Cys Lys Tyr Asn Cys 130 135 140 Thr Cys Ile Asp Gly Ala Val Gly Cys Thr Pro Leu Cys Leu Arg Val 145 150 155 160 Arg Pro Pro Arg Leu Trp Cys Pro His Pro Arg Arg Val Ser Ile Pro 165 170 175 Gly His Cys Cys Glu Gln Trp Val Cys Glu Asp Asp Ala Lys Arg Pro 180 185 190 Arg Lys Thr Ala Pro Arg Asp Thr Gly Ala Phe Asp Ala Val Gly Glu 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Ser Tyr Ser Cys Cys Arg Pro Leu Leu Asp Lys 35 40 45 Trp Pro Thr Thr Leu Ser Arg His Leu Gly Gly Pro Cys Gln Val Asp 50 55 60 Ala His Cys Ser Ala Gly His Ser Cys Ile Phe Thr Val Ser Gly Thr 65 70 75 80 Ser Ser Cys Cys Pro Phe Pro Glu Ala Val Ala Cys Gly Asp Gly His 85 90 95 His Cys Cys Pro Arg Gly Phe His Cys Ser Ala Asp Gly Arg Ser Cys 100 105 110 Phe Gln Arg Ser Gly Asn Asn Ser Val Gly Ala Ile Gln Cys Pro Asp 115 120 125 Ser Gln Phe Glu Cys Pro Asp Phe Ser Thr Cys Cys Val Met Val Asp 130 135 140 Gly Ser Trp Gly Cys Cys Pro Met Pro Gln Ala Ser Cys Cys Glu Asp 145 150 155 160 Arg Val His Cys Cys Pro His Gly Ala Phe Cys Asp Leu Val His Thr 165 170 175 Arg Cys Ile Thr Pro Thr Gly Thr His Pro Leu Ala Lys Lys Leu Pro 180 185 190 Ala Gln Arg Thr Asn Arg Ala Val Ala Leu Ser Ser Ser Val Met Cys 195 200 205 Pro Asp Ala Arg Ser Arg Cys Pro Asp Gly Ser Thr Cys Cys Glu Leu 210 215 220 Pro Ser Gly Lys Tyr Gly Cys Cys Pro Met Pro Asn Ala Thr Cys Cys 225 230 235 240 Ser Asp His Leu His Cys Cys Pro Gln Asp Thr Val Cys Asp Leu Ile 245 250 255 Gln Ser Lys Cys Leu Ser Lys Glu Asn Ala Thr Thr Asp Leu Leu Thr 260 265 270 Lys Leu Pro Ala His Thr Val Gly Asp Val Lys Cys Asp Met Glu Val 275 280 285 Ser Cys Pro Asp Gly Tyr Thr Cys Cys Arg Leu Gln Ser Gly Ala Trp 290 295 300 Gly Cys Cys Pro Phe Thr Gln Ala Val Cys Cys Glu Asp His Ile His 305 310 315 320 Cys Cys Pro Ala Gly Phe Thr Cys Asp Thr Gln Lys Gly Thr Cys Glu 325 330 335 Gln Gly Pro His Gln Val Pro Trp Met Glu Lys Ala Pro Ala His Leu 340 345 350 Ser Leu Pro Asp Pro Gln Ala Leu Lys Arg Asp Val Pro Cys Asp Asn 355 360 365 Val Ser Ser Cys Pro Ser Ser Asp Thr Cys Cys Arg Asp Asn Arg Gln 370 375 380 Gly Trp Ala Cys Cys Pro Tyr Arg Gln Gly Val Cys Cys Ala Asp Arg 385 390 395 400 Arg His Cys Cys Pro Ala Gly Phe Arg Cys Ala Ala Arg Gly Thr Lys 405 410 415 Cys Leu Arg Arg Glu Ala Pro Arg Trp Asp Ala Pro Leu Arg Asp Pro 420 425 430 Ala Leu Arg Gln Leu Leu 435 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NEP gene amplification (rat) <400> 15 tgctggagag agcaagcacg t 21 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NEP gene amplification (rat) <400> 16 atgagttgga ctgccgagca ct 22 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for beta-actin gene amplification (human, mouse and rat) <400> 17 tcctccctgg agaagagcta 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for beta-actin gene amplification (human, mouse and rat) <400> 18 aggaggagca atgatcttga tc 22 <210> 19 <211> 770 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn 85 90 95 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 165 170 175 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn 435 440 445 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys 485 490 495 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser 515 520 525 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser 530 535 540 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545 550 555 560 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val 565 570 575 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe 610 615 620 Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser 645 650 655 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp 660 665 670 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu 675 680 685 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 690 695 700 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705 710 715 720 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val 725 730 735 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745 750 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met 755 760 765 Gln Asn 770 <210> 20 <211> 441 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Ala Glu Pro Arg Gln Glu Phe Glu Val Met Glu Asp His Ala Gly 1 5 10 15 Thr Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Lys Asp Gln Gly Gly Tyr Thr Met His 20 25 30 Gln Asp Gln Glu Gly Asp Thr Asp Ala Gly Leu Lys Glu Ser Pro Leu 35 40 45 Gln Thr Pro Thr Glu Asp Gly Ser Glu Glu Pro Gly Ser Glu Thr Ser 50 55 60 Asp Ala Lys Ser Thr Pro Thr Ala Glu Asp Val Thr Ala Pro Leu Val 65 70 75 80 Asp Glu Gly Ala Pro Gly Lys Gln Ala Ala Ala Gln Pro His Thr Glu 85 90 95 Ile Pro Glu Gly Thr Thr Ala Glu Glu Ala Gly Ile Gly Asp Thr Pro 100 105 110 Ser Leu Glu Asp Glu Ala Ala Gly His Val Thr Gln Ala Arg Met Val 115 120 125 Ser Lys Ser Lys Asp Gly Thr Gly Ser Asp Asp Lys Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Ala Asp Gly Lys Thr Lys Ile Ala Thr Pro Arg Gly Ala Ala Pro Pro 145 150 155 160 Gly Gln Lys Gly Gln Ala Asn Ala Thr Arg Ile Pro Ala Lys Thr Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Lys Thr Pro Pro Ser Ser Gly Glu Pro Pro Lys Ser Gly 180 185 190 Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Ser Pro Gly Ser Pro Gly Thr Pro Gly Ser 195 200 205 Arg Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Thr Pro Pro Thr Arg Glu Pro Lys 210 215 220 Lys Val Ala Val Val Arg Thr Pro Pro Lys Ser Pro Ser Ser Ala Lys 225 230 235 240 Ser Arg Leu Gln Thr Ala Pro Val Pro Met Pro Asp Leu Lys Asn Val 245 250 255 Lys Ser Lys Ile Gly Ser Thr Glu Asn Leu Lys His Gln Pro Gly Gly 260 265 270 Gly Lys Val Gln Ile Ile Asn Lys Lys Leu Asp Leu Ser Asn Val Gln 275 280 285 Ser Lys Cys Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly 290 295 300 Ser Val Gln Ile Val Tyr Lys Pro Val Asp Leu Ser Lys Val Thr Ser 305 310 315 320 Lys Cys Gly Ser Leu Gly Asn Ile His His Lys Pro Gly Gly Gly Gln 325 330 335 Val Glu Val Lys Ser Glu Lys Leu Asp Phe Lys Asp Arg Val Gln Ser 340 345 350 Lys Ile Gly Ser Leu Asp Asn Ile Thr His Val Pro Gly Gly Gly Asn 355 360 365 Lys Lys Ile Glu Thr His Lys Leu Thr Phe Arg Glu Asn Ala Lys Ala 370 375 380 Lys Thr Asp His Gly Ala Glu Ile Val Tyr Lys Ser Pro Val Val Ser 385 390 395 400 Gly Asp Thr Ser Pro Arg His Leu Ser Asn Val Ser Ser Thr Gly Ser 405 410 415 Ile Asp Met Val Asp Ser Pro Gln Leu Ala Thr Leu Ala Asp Glu Val 420 425 430 Ser Ala Ser Leu Ala Lys Gln Gly Leu 435 440 <210> 21 <211> 750 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Gly Lys Ser Glu Ser Gln Met Asp Ile Thr Asp Ile Asn Thr Pro 1 5 10 15 Lys Pro Lys Lys Lys Gln Arg Trp Thr Pro Leu Glu Ile Ser Leu Ser 20 25 30 Val Leu Val Leu Leu Leu Thr Ile Ile Ala Val Thr Met Ile Ala Leu 35 40 45 Tyr Ala Thr Tyr Asp Asp Gly Ile Cys Lys Ser Ser Asp Cys Ile Lys 50 55 60 Ser Ala Ala Arg Leu Ile Gln Asn Met Asp Ala Thr Thr Glu Pro Cys 65 70 75 80 Thr Asp Phe Phe Lys Tyr Ala Cys Gly Gly Trp Leu Lys Arg Asn Val 85 90 95 Ile Pro Glu Thr Ser Ser Arg Tyr Gly Asn Phe Asp Ile Leu Arg Asp 100 105 110 Glu Leu Glu Val Val Leu Lys Asp Val Leu Gln Glu Pro Lys Thr Glu 115 120 125 Asp Ile Val Ala Val Gln Lys Ala Lys Ala Leu Tyr Arg Ser Cys Ile 130 135 140 Asn Glu Ser Ala Ile Asp Ser Arg Gly Gly Glu Pro Leu Leu Lys Leu 145 150 155 160 Leu Pro Asp Ile Tyr Gly Trp Pro Val Ala Thr Glu Asn Trp Glu Gln 165 170 175 Lys Tyr Gly Ala Ser Trp Thr Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gln Leu Asn 180 185 190 Ser Lys Tyr Gly Lys Lys Val Leu Ile Asn Leu Phe Val Gly Thr Asp 195 200 205 Asp Lys Asn Ser Val Asn His Val Ile His Ile Asp Gln Pro Arg Leu 210 215 220 Gly Leu Pro Ser Arg Asp Tyr Tyr Glu Cys Thr Gly Ile Tyr Lys Glu 225 230 235 240 Ala Cys Thr Ala Tyr Val Asp Phe Met Ile Ser Val Ala Arg Leu Ile 245 250 255 Arg Gln Glu Glu Arg Leu Pro Ile Asp Glu Asn Gln Leu Ala Leu Glu 260 265 270 Met Asn Lys Val Met Glu Leu Glu Lys Glu Ile Ala Asn Ala Thr Ala 275 280 285 Lys Pro Glu Asp Arg Asn Asp Pro Met Leu Leu Tyr Asn Lys Met Thr 290 295 300 Leu Ala Gln Ile Gln Asn Asn Phe Ser Leu Glu Ile Asn Gly Lys Pro 305 310 315 320 Phe Ser Trp Leu Asn Phe Thr Asn Glu Ile Met Ser Thr Val Asn Ile 325 330 335 Ser Ile Thr Asn Glu Glu Asp Val Val Val Tyr Ala Pro Glu Tyr Leu 340 345 350 Thr Lys Leu Lys Pro Ile Leu Thr Lys Tyr Ser Ala Arg Asp Leu Gln 355 360 365 Asn Leu Met Ser Trp Arg Phe Ile Met Asp Leu Val Ser Ser Leu Ser 370 375 380 Arg Thr Tyr Lys Glu Ser Arg Asn Ala Phe Arg Lys Ala Leu Tyr Gly 385 390 395 400 Thr Thr Ser Glu Thr Ala Thr Trp Arg Arg Cys Ala Asn Tyr Val Asn 405 410 415 Gly Asn Met Glu Asn Ala Val Gly Arg Leu Tyr Val Glu Ala Ala Phe 420 425 430 Ala Gly Glu Ser Lys His Val Val Glu Asp Leu Ile Ala Gln Ile Arg 435 440 445 Glu Val Phe Ile Gln Thr Leu Asp Asp Leu Thr Trp Met Asp Ala Glu 450 455 460 Thr Lys Lys Arg Ala Glu Glu Lys Ala Leu Ala Ile Lys Glu Arg Ile 465 470 475 480 Gly Tyr Pro Asp Asp Ile Val Ser Asn Asp Asn Lys Leu Asn Asn Glu 485 490 495 Tyr Leu Glu Leu Asn Tyr Lys Glu Asp Glu Tyr Phe Glu Asn Ile Ile 500 505 510 Gln Asn Leu Lys Phe Ser Gln Ser Lys Gln Leu Lys Lys Leu Arg Glu 515 520 525 Lys Val Asp Lys Asp Glu Trp Ile Ser Gly Ala Ala Val Val Asn Ala 530 535 540 Phe Tyr Ser Ser Gly Arg Asn Gln Ile Val Phe Pro Ala Gly Ile Leu 545 550 555 560 Gln Pro Pro Phe Phe Ser Ala Gln Gln Ser Asn Ser Leu Asn Tyr Gly 565 570 575 Gly Ile Gly Met Val Ile Gly His Glu Ile Thr His Gly Phe Asp Asp 580 585 590 Asn Gly Arg Asn Phe Asn Lys Asp Gly Asp Leu Val Asp Trp Trp Thr 595 600 605 Gln Gln Ser Ala Ser Asn Phe Lys Glu Gln Ser Gln Cys Met Val Tyr 610 615 620 Gln Tyr Gly Asn Phe Ser Trp Asp Leu Ala Gly Gly Gln His Leu Asn 625 630 635 640 Gly Ile Asn Thr Leu Gly Glu Asn Ile Ala Asp Asn Gly Gly Leu Gly 645 650 655 Gln Ala Tyr Arg Ala Tyr Gln Asn Tyr Ile Lys Lys Asn Gly Glu Glu 660 665 670 Lys Leu Leu Pro Gly Leu Asp Leu Asn His Lys Gln Leu Phe Phe Leu 675 680 685 Asn Phe Ala Gln Val Trp Cys Gly Thr Tyr Arg Pro Glu Tyr Ala Val 690 695 700 Asn Ser Ile Lys Thr Asp Val His Ser Pro Gly Asn Phe Arg Ile Ile 705 710 715 720 Gly Thr Leu Gln Asn Ser Ala Glu Phe Ser Glu Ala Phe His Cys Arg 725 730 735 Lys Asn Ser Tyr Met Asn Pro Glu Lys Lys Cys Arg Val Trp 740 745 750 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IL-4 <400> 22 actgcttccc cctctgttct 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL-4 <400> 23 agtgtccttc tcatggtggc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IL-6 <400> 24 agttcctgca gaaaaaggca 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL-6 <400> 25 aacaacaatc tgaggtgccc 20 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IL-8 <400> 26 tcctgatttc tgcagctctg tg 22 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IL-8 <400> 27 tgcttgaagt ttcactggca tc 22 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for MCP-1 (CCL2) <400> 28 ccccagtcac ctgctgttat 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for MCP-1 (CCL2) <400> 29 agatctcctt ggccacaatg 20 <210> 30 <211> 153 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Met Gly Leu Thr Ser Gln Leu Leu Pro Pro Leu Phe Phe Leu Leu Ala 1 5 10 15 Cys Ala Gly Asn Phe Val His Gly His Lys Cys Asp Ile Thr Leu Gln 20 25 30 Glu Ile Ile Lys Thr Leu Asn Ser Leu Thr Glu Gln Lys Thr Leu Cys 35 40 45 Thr Glu Leu Thr Val Thr Asp Ile Phe Ala Ala Ser Lys Asn Thr Thr 50 55 60 Glu Lys Glu Thr Phe Cys Arg Ala Ala Thr Val Leu Arg Gln Phe Tyr 65 70 75 80 Ser His His Glu Lys Asp Thr Arg Cys Leu Gly Ala Thr Ala Gln Gln 85 90 95 Phe His Arg His Lys Gln Leu Ile Arg Phe Leu Lys Arg Leu Asp Arg 100 105 110 Asn Leu Trp Gly Leu Ala Gly Leu Asn Ser Cys Pro Val Lys Glu Ala 115 120 125 Asn Gln Ser Thr Leu Glu Asn Phe Leu Glu Arg Leu Lys Thr Ile Met 130 135 140 Arg Glu Lys Tyr Ser Lys Cys Ser Ser 145 150

Claims (29)

1. 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
2. 제1항에 있어서, 간엽 줄기세포가 인간의 배낭, 태반, 제대, 제대혈, 피부, 말초혈액, 골수, 지방, 근육, 간, 신경조직, 골막, 태아막, 활액막, 활액, 양막, 반월상연골, 전십자 인대, 관절 연골세포, 유치, 혈관주위세포, 지주골, 슬개골하 지방괴, 비장 및 흉선을 포함한 간엽 줄기세포가 존재하는 조직으로부터 분리 및/또는 배양된 간엽 줄기세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 의약 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 간엽 줄기세포는 제대혈 유래 간엽줄기 세포 또는 골수 유래 간엽줄기 세포인 의약 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 배양액이 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 함유하는 것인 의약 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 신경질환은 신경세포 내 아밀로이드 베타 플라크 형성, 신경세포 내 타우 단백질의 인산화, 신경돌기의 이상, 신경세포 내의 네프릴리신의 발현 감소 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 의하여 유발되는 질환인 것인 의약 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 신경질환은 알츠하이머 병, 파킨슨병, 우울증, 간질, 다발성경화증 및 조증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 의약 조성물.
7. 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 신경질환의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
8. 제7항에 있어서, 상기 신경질환은 신경세포 내 아밀로이드 베타 플라크 형성, 신경세포 내 타우 단백질의 인산화, 신경돌기의 이상, 신경세포 내의 네프릴리신의 발현 감소 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 의하여 유발되는 질환인 것인 의약 조성물.
9. 제7항에 있어서, 상기 신경질환은 알츠하이머 병, 파킨슨병, 우울증, 간질, 다발성경화증 및 조증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 의약 조성물.
10. 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상을 포함하는, 아밀로이드 베타에 의한 신경세포 독성을 억제하기 위한 키트.
11. 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상을 포함하는, 신경세포 내 타우 단백질의 인산화를 억제하기 위한 키트.
12. 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상을 포함하는, 신경세포 및/또는 미세아교 세포 내에 네프릴리신의 발현을 유도하기 위한 키트.
13. 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 아밀로이드 베타에 의한 신경세포 독성을 억제하기 위한 키트.
14. 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 신경세포 내 타우 단백질의 인산화를 억제하기 위한 키트.
15. 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 신경세포 및/또는 미세아교 세포 내에 네프릴리신의 발현을 유도하기 위한 키트.
16. 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상을 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 신경질환을 예방 또는 치료하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 신경질환은 신경세포 내 아밀로이드 베타 플라크 형성, 신경세포 내 타우 단백질의 인산화, 신경돌기의 이상, 신경세포 내의 네프릴리신의 발현 감소 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상에 의하여 유발되는 질환인 것인 방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 신경질환은 알츠하이머 병, 파킨슨병, 우울증, 간질, 다발성경화증 및 조증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
19. 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 신경질환을 예방 또는 치료하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 신경질환은 신경세포 내 아밀로이드 베타 플라크 형성, 신경세포 내 타우 단백질의 인산화, 신경돌기의 이상, 신경세포 내의 네프릴리신의 발현 감소 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상에 의하여 유발되는 질환인 것인 방법.
21. 제19항에 있어서, 상기 신경질환은 알츠하이머 병, 파킨슨병, 우울증, 간질, 다발성경화증, 조증 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
22. 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 존재하에서 신경세포를 배양하여 신경세포 내의 아밀로이드 플라크의 양을 감소시키는 단계를 포함하는, 신경세포 내의 아밀로이드 플라크를 감소시키는 방법.
23. 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 존재하에서 신경세포를 배양하여 신경세포 내의 타우 단백질의 인산화의 정도를 감소시키는 단계를 포함하는, 신경세포 내의 타우 단백질의 인산화의 정도를 감소시 키는 방법.
24. 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 존재하에서 신경세포를 배양하여 신경세포의 네프릴리신 발현을 증가시키는 단계를 포함하는, 신경세포의 네프릴리신 발현을 증가시키는 방법.
25. 간엽 줄기세포 및 그의 배양액으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나이상의 존재하에서 신경세포를 배양하여 신경세포의 신경돌기 성장을 증가시키는 단계를 포함하는, 신경세포의 신경돌기 성장을 증가시키는 방법.
26. 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재하에서 신경세포를 배양하여 신경세포 내의 아밀로이드 플라크의 양을 감소시키는 단계를 포함하는, 신경세포 내의 아밀로이드 플라크를 감소시키는 방법.
27. 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재하에서 신경세포를 배양하여 신경세포 내의 타우 단백질의 인산화의 정도를 감소시키는 단계를 포함하는, 신경세포 내의 타우 단백질의 인산화의 정도를 감소시키는 방법.
28. 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재하에서 신경세포 또는 미세아교 세포를 배양하여 신경세포 또는 미세아교 세포의 네프릴리신 발현을 증가시키는 단계를 포함하는, 신경세포 또는 미세아교 세포의 네프릴리신 발현을 증가시키는 방법.
29. 악티빈A, PF4, 데코린, 갈렉틴3, GDF15, 글리피칸3, MFRP, ICAM5, IGFBP7, PDGF-AA, SPARCL1, 트롬보스폰딘1, WISP1, 프로그라눌린, IL-4, 이들 중 하나이상의 발현을 유도하는 인자 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 존재하에서 신경세포를 배양하여 신경세포의 신경돌기 성장을 증가시키는 단계를 포함하는, 신경세포의 신경돌기 성장을 증가시키는 방법.

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