CN109104869B - 表达细胞表面标记物的间充质干细胞、包含该间充质干细胞的药物组合物及其制备方法 - Google Patents

表达细胞表面标记物的间充质干细胞、包含该间充质干细胞的药物组合物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明目的在于提供对各种疾病发挥优异的治疗效果的新型的间充质干细胞及包含该间充质干细胞的新型的药物组合物、以及它们的制备方法。本发明为表达选自由CD201、CD46、CD56、CD147和CD165组成的组中的至少1种细胞表面标记物的间充质干细胞。表达上述特定标记物的间充质干细胞为CD29、CD73、CD90、CD105和CD166阳性，维持了未分化性。

Description

表达细胞表面标记物的间充质干细胞、包含该间充质干细胞 的药物组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及表达选自由CD201、CD46、CD56、CD147和CD165组成的组中的至少1种细胞表面标记物的间充质干细胞及其制备方法、以及包含上述间充质干细胞的药物组合物及其制备方法。
背景技术
近年来，利用了生物体的细胞或组织的药品开发、再生医疗研究正在推进并受到关注。其中，ES细胞、iPS细胞作为脏器再生技术或药物发现筛选工具正在加速进行研究。另一方面，从骨髓、脂肪组织、脐带等分离出成体干细胞(间充质干细胞)而加以利用的细胞疗法在再生医疗中利用的是用于修复由于疾病等而受到损伤的组织的成体干细胞本来具有的功能，由于是实用性更高的方法而受到关注并进行了研究。已知成体干细胞(间充质干细胞)通常并不能分化成所有的脏器、组织而是分化成特定的组织、脏器。
另外还已知，成体干细胞(间充质干细胞)不仅具有上述那样的修复受到损伤组织的效果，而且对各种疾病具有治疗效果。已知例如，源自脐带组织的成体干细胞(间充质干细胞)具有抑制与移植供体在组织相容性方面不相容的移植受体的移植物抗宿主疾病反应(GVHD)的效果(参照专利文献1)；源自特定的脐带组织的间充质干细胞可以用于帕金森病的治疗(参照专利文献2)；还有源自特定的脐带组织的间充质干细胞对循环系统的疾病具有治疗效果 (参照专利文献3)。但是，这些间充质干细胞的治疗效果不能说充分。
专利文献4～6中公开了包含源自脐带组织的细胞的治疗用细胞组合物。这些治疗用细胞组合物所包含的源自脐带组织的细胞高表达了白细胞介素8、 Reticulon1、趋化因子受体(C-X-C基序)配体3，进而，分泌有MCP-1、MCP1β、 IL-6、GCP-2、HGF、KGF、FGF、HB-EGF、BDNF、TPO、RANTES和TIMP1。进而，还公开了从脐带或其羊膜分离出的干细胞表达了各种细胞因子的基因 (专利文献7和8)。另外，公开了将包含源自脐带血的间充质干细胞的组合物用于治疗神经疾病、这些间充质干细胞的培养液包含活化素A、PF4、核心蛋白聚糖(Decorin)、半乳糖凝集素(galectin)3、GDF15等(专利文献9)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2009-519978号公报
专利文献2：日本特表2008-525489号公报
专利文献3：日本特表2007-528705号公报
专利文献4：日本专利5425399号
专利文献5：日本专利5425400号
专利文献6：日本专利5148873号
专利文献7：日本特开2013-066473号公报
专利文献8：日本特开2015-504662号公报
专利文献9：日本特开2014-240388号公报
发明内容
发明要解决的问题
本发明是鉴于前述状况而作出的，目的在于提供一种对各种疾病发挥优异的治疗效果的新的间充质干细胞及包含该间充质干细胞的新的药物组合物、以及它们的制备方法。
用于解决问题的方案
本发明人们为了解决上述课题反复进行了深入研究，结果发现包含某种特定的间充质干细胞的药物组合物对各种疾病显示出优异的治疗效果，至此完成了本发明。即，本发明的主旨如下。
(1)一种间充质干细胞，其表达选自由CD201、CD46、CD56、CD147和 CD165组成的组中的至少1种细胞表面标记物。
(2)根据(1)所述的间充质干细胞，其为CD29、CD73、CD90、CD105和 CD166阳性。
(3)根据(1)或(2)所述的间充质干细胞，其分泌横脉缺失蛋白 -2(Crossveinless-2)和外胚层发育异常蛋白(Ectodysplasin-A2)。
(4)根据(1)～(3)中任一项所述的间充质干细胞，其进一步分泌选自由活化素A、Dkk-3、核心蛋白聚糖、HGF、Dkk-1、颗粒蛋白前体(progranulin)、 GDF-15、促血管生成素-1(angiopoietin-1)、CCL28(VIC)、潜在型TGF-β结合蛋白1(Latent TGF-beta bp1)、GDF1、VEGF-C、BTC(细胞素)、巢蛋白 -1(Nidogen-1)、GLO-1(乙二醛酶-1)、sgp130(可溶型gp130)、脊索发生素样 -2(Chordin-Like 2)和EMAP-II组成的组中的至少1种。
(5)根据(1)～(4)中任一项所述的间充质干细胞，其源自脐带、脂肪或骨髄。
(6)一种药物组合物，其包含(1)～(5)中任一项所述的间充质干细胞和/或其培养上清液。
(7)根据(6)所述的药物组合物，其中，药物组合物包含间充质干细胞时，表达选自由CD201、CD46、CD56、CD147和CD165组成的组中的至少1种细胞表面标记物的间充质干细胞的比率为药物组合物所含的全部间充质干细胞的70％以上。
(8)根据(7)所述的药物组合物，其中，药物组合物包含间充质干细胞时，表达选自由CD201、CD46、CD56、CD147和CD165组成的组中的至少1种细胞表面标记物的间充质干细胞的比率为药物组合物所含的全部间充质干细胞的90％以上。
(9)根据(6)～(8)中任一项所述的药物组合物，其用于预防或治疗选自由癌、癌前病变(precancerous lesion)、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、循环系统疾病、心脏疾病、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病、肾疾病和口腔疾病组成的组中的疾病。
(10)根据(9)所述的药物组合物，其用于预防或治疗选自由癌、癌前病变、炎症性疾病、循环系统疾病、心脏疾病、肺疾病、肝疾病和口腔疾病组成的组中的疾病。
(11)根据(10)所述的药物组合物，其用于预防或治疗选自由肺癌、心肌炎、心肌肥厚、动脉硬化、肺/呼吸道炎症、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝炎、肝硬化和牙周病组成的组中的疾病。
(12)根据(6)～(11)中任一项所述的药物组合物，其用于预防或治疗起因于上皮或内皮的屏障功能降低的疾病、或与IL-1相关的疾病。
(13)根据(12)所述的药物组合物，其中，屏障功能的降低起因于上皮或内皮细胞层中的紧密连接(tight junction)功能的降低。
(14)一种表达上述标记物的间充质干细胞的制备方法，其包括如下工序：对间充质干细胞进行诱导、浓缩或分离筛选，所述间充质干细胞表达选自由 CD201、CD46、CD56、CD147和CD165组成的组中的至少1种细胞表面标记物。
(15)一种用于疾病的预防或治疗的药物组合物的制备方法，其包括如下工序：对间充质干细胞进行诱导、浓缩或分离筛选，所述间充质干细胞表达选自由CD201、CD46、CD56、CD147和CD165组成的组中的至少1种细胞表面标记物。
(16)根据(15)所述的药物组合物的制备方法，其中，疾病选自由癌、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、循环系统疾病、心脏疾病、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病、肾疾病和口腔疾病组成的组。
(17)一种疾病的预防或治疗方法，其使用表达选自由CD201、CD46、 CD56、CD147和CD165组成的组中的至少1种细胞表面标记物的间充质干细胞和/或其培养上清液。
(18)根据(17)所述的方法，其中，间充质干细胞为CD29、CD73、CD90、 CD105和CD166阳性。
(19)根据(17)或(18)所述的方法，其中，间充质干细胞分泌横脉缺失蛋白 -2(Crossveinless-2)和外胚层发育异常蛋白-A2(Ectodysplasin-A2)。
(20)根据(19)所述的方法，其中，间充质干细胞进一步分泌选自由活化素A、Dkk-3、核心蛋白聚糖、HGF、Dkk-1、颗粒蛋白前体、GDF-15、促血管生成素-1、CCL28(VIC)、潜在型TGF-β结合蛋白1(Latent TGF-beta bp1)、 GDF1、VEGF-C、BTC(细胞素)、巢蛋白-1(Nidogen-1)、GLO-1(乙二醛酶-1)、 sgp130(可溶型gp130)、脊索发生素样-2(Chordin-Like 2)和EMAP-II组成的组中的至少1种。
(21)根据(17)～(20)中任一项所述的方法，其中，间充质干细胞源自脐带、脂肪或骨髄。
(22)根据(17)～(21)中任一项所述的方法，其中，疾病选自由癌、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、循环系统疾病、心脏疾病、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病、肾疾病和口腔疾病组成的组。
(23)根据(22)所述的方法，其中，疾病选自由癌、癌前病变、炎症性疾病、循环系统疾病、心脏疾病、肺疾病、肝疾病和口腔疾病组成的组。
(24)根据(23)所述的方法，其中，疾病选自由肺癌、心肌炎、心肌肥厚 (CardiacHypertrophy)、动脉硬化、肺/呼吸道炎症、慢性阻塞性肺疾病 (COPD)、肝炎、肝硬化和牙周病组成的组。
(25)根据(17)～(24)中任一项所述的方法，其中，疾病为起因于上皮或内皮的屏障功能降低的疾病、或为与IL-1相关的疾病。
(26)根据(25)所述的方法，其中，屏障功能的降低起因于上皮或内皮细胞层中的紧密连接功能的降低。
发明的效果
表达选自由CD201、CD46、CD56、CD147和CD165组成的组中的至少1 种细胞表面标记物的间充质干细胞具有如下特性：其是抑制由巨噬细胞等免疫细胞的产生炎症性细胞因子的作用、屏障功能亢进作用优异并且对氧化应激也具有耐性、不易受到损伤的细胞。另外，上述表达特定标记物的间充质干细胞的培养上清液还具有如下效果：对心肌细胞、血管内皮细胞、肺上皮癌细胞、肝星状细胞、牙龈成纤维细胞等起作用而适宜地调节与炎症、纤维化相关的基因的表达。因此，包含这些间充质干细胞和/或其培养上清液的本发明的药物组合物对癌、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、循环系统疾病、心脏疾病、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病、肾疾病、口腔疾病等各种疾病显示出优异的治疗效果。
附图说明
图1是示出本发明的间充质干细胞的细胞表面标记物表达的图。
图2是示出本发明的间充质干细胞的细胞表面标记物表达的图。
图3是示出本发明的间充质干细胞的培养上清液的屏障功能亢进活性的图。
图4是示出本发明的间充质干细胞的抑制炎性细胞因子产生效果的图。
图5是示出本发明的间充质干细胞的培养上清液对人血管内皮细胞的抗纤维化效果的图。
图6是示出本发明的间充质干细胞的培养上清液对人血管内皮细胞的抗纤维化效果的图。
图7是示出本发明的间充质干细胞的培养上清液对人肺上皮癌细胞的抗炎效果的图。
图8是示出本发明的间充质干细胞的培养上清液对人肺上皮癌细胞的抗纤维化效果的图。
图9是示出本发明的间充质干细胞的培养上清液对人肝星状细胞的抗炎效果的图。
图10是示出本发明的间充质干细胞的培养上清液对人肝星状细胞的抗炎效果的图。
图11是示出本发明的间充质干细胞的培养上清液对人肝星状细胞的抗炎效果的图。
图12是示出本发明的间充质干细胞的培养上清液对人肝星状细胞的抗纤维化效果的图。
图13是示出本发明的间充质干细胞的培养上清液对人心肌细胞的抗炎效果的图。
图14是示出本发明的间充质干细胞的培养上清液对人心肌细胞的抗炎效果的图。
图15是示出本发明的间充质干细胞的培养上清液对人心肌细胞的抗纤维化效果的图。
图16是示出本发明的间充质干细胞的培养上清液对人牙龈成纤维细胞的抗炎效果的图。
图17是示出本发明的间充质干细胞的培养上清液对人牙龈成纤维细胞的抑制牙龈减少效果的图。
图18是示出本发明的间充质干细胞的培养上清液对人牙龈成纤维细胞的抑制牙龈减少效果的图。
具体实施方式
本发明的表达选自由CD201、CD46、CD56、CD147和CD165组成的组中的至少1种细胞表面标记物(以下也称为“特定标记物”)的间充质干细胞具有如下特性：其是IL-6等炎性细胞因子的产生抑制作用、屏障功能亢进作用优异的细胞。另外还具有如下效果：对心肌细胞、血管内皮细胞、肺上皮癌细胞、肝星状细胞、牙龈成纤维细胞等起作用，从而适宜地调节与炎症、纤维化相关的基因的表达。进而，本发明的间充质干细胞分泌横脉缺失蛋白 -2(Crossveinless-2)和外胚层发育异常蛋白-A2(Ectodysplasin-A2)，还分泌选自活化素A、Dkk-3、核心蛋白聚糖、HGF、Dkk-1、颗粒蛋白前体、GDF-15、促血管生成素-1、CCL28(VIC)、潜在型TGF-β结合蛋白1(Latent TGF-beta bp1)、 GDF1、VEGF-C、BTC(细胞素)、巢蛋白-1(Nidogen-1)、GLO-1(乙二醛酶-1)、 sgp130(可溶型gp130)、脊索发生素样-2(Chordin-Like 2)、EMAP-II中的特定的细胞因子，因此除了上述特性以外还具有这些细胞因子所具有的功能。另外，本发明的间充质干细胞能够在维持了未分化性并且在分化条件下有效地分化为具有目标功能的细胞。包含这样的表达特定标记物的间充质干细胞和 /或其培养上清液的本发明的药物组合物具有对各种疾病优异的治疗效果。以下对表达本发明的特定标记物的间充质干细胞、其培养上清液、包含它们的药物组合物等进行说明。
[表达特定标记物的间充质干细胞]
在本发明中，间充质干细胞是指：具有向着骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、腱细胞、脂肪细胞等属于间充质的细胞分化的能力且能够在维持该分化能力的状态下增殖的细胞。例如可列举出：源自骨髓、脂肪、血液、骨膜、真皮、脐带、胎盘、羊膜、绒毛膜、蜕膜、肌肉、子宫内膜、真皮、牙囊、牙周组织、牙髓、牙胚等的间充质干细胞，优选为源自脐带、源自脂肪、源自骨髓的间充质干细胞、更优选为源自脐带的间充质干细胞。此处，“源自”表示上述细胞是由作为供给源的组织获得、生长或进行离体操作而得到的细胞。需要说明的是，本发明的表达特定标记物的间充质干细胞既可以作为上述间充质干细胞的集合体，还可以是包含彼此间具有不同特性的多种间充质干细胞的集合体，也可以是实质上均一的间充质干细胞的集合体。
本发明的间充质干细胞既可以是源自被检体的自体细胞，也可以是源自同种的其它对象的异体细胞。优选为异体细胞。
“表达特定标记物”是指间充质干细胞表达特定标记物基因、或表达特定标记物蛋白、或表达其两者。即，是指间充质干细胞表达选自由CD201、 CD46、CD56、CD147和CD165组成的组中的至少1种细胞表面标记物的基因和/或蛋白。此处，对于间充质干细胞是否表达了各标记物的判断，就基因表达而言例如可以通过基因芯片阵列、聚合酶链反应(逆转录酶PCR、实时PCR、现有的PCR)等现有公知的方法来进行。另外，就蛋白表达而言，例如可以通过使用了与各标记物蛋白特异性结合的抗体的FACS解析(流式细胞术)、酶联免疫吸附检测法(ELISA)等现有公知的方法来进行。在任意情况下均将未表达各标记物基因或蛋白的细胞作为阴性对照，从而判断表达的有无、表达的高低。
本发明的间充质干细胞表达选自由CD201、CD46、CD56、CD147和 CD165组成的组中的至少1种细胞表面标记物。即，本发明的间充质干细胞至少表达CD201、CD46、CD56、CD147和CD165中的任1种、优选表达任意 2种、更优选表达任意3种、进一步优选表达任意4种、特别优选表达全部。表达了上述特定标记物的间充质干细胞显示出更优异的抗炎作用、抗纤维化作用、屏障功能亢进作用、抗氧化能力等。
CD201还是作为内皮细胞蛋白C受体(Endothelial protein C receptor： EPCR)而为人所知的分子。CD201在心脏和肺的动脉和静脉的内皮细胞中较强地表达，在肺和皮肤的毛细血管中相对较弱地表达。还在树状细胞、单核细胞、白血球和几种肿瘤细胞中表达。CD201的主要作用是抗凝固。CD201 与蛋白C高亲和地结合，通过凝血酶-血栓调节蛋白复合物而增大蛋白C的活化。此外，CD201在如感染、外伤、造血、对自身免疫应答的炎症应答之类的众多病理生理学的过程中起到重要的作用。
CD46是由4个亚型构成的跨膜型糖蛋白。CD46几乎在所有有核细胞中表达，通过使补体成分C3b与C4b结合而作为补体功能的调节剂发挥作用，对来自自身补体攻击发挥宿主防卫作用。CD46称为病原体磁体(pathogen magnet)，已知参与包括麻疹病毒、人疱疹病毒6型、A群链球菌奈瑟氏菌在内的几种病原体的感染。
CD56是分子量140kDa的神经细胞粘着分子(Neural Cell Adhesion Molecule：N-CAM)的亚型，是作为NK细胞的标记物有用的抗原。在具有外周血的大颗粒淋巴细胞(LGL)亚群、自然杀伤活性的所有细胞中以中等程度的强度表达CD56。另外还在一部分T细胞的亚群、骨髄系细胞、骨髓瘤中表达。
CD147为I型1次跨膜蛋白，还作为Basigin或细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer：EMMPRIN)而为人所知。 CD147在上皮细胞、内皮细胞、白血球、癌细胞等多种细胞中表达。虽然在脑的非肿瘤区的血管上皮、癌细胞中表达，但在恶性神经胶质瘤的已增殖了的血管中并未表达。CD147已知具有各种生理学、病理学活性。其中最为熟知的是作为基质金属蛋白酶(MMP)的诱导因子的功能。此外，显示出参与淋巴细胞应答、单羧酸转运器的表达、精子形成的控制等。
CD165是37-42kDa的膜表面糖蛋白，几乎在胸腺细胞、胸腺上皮细胞、大部分血小板、成纤维细胞、T细胞性急性淋巴细胞性白血病(T-ALL)细胞、中枢神经组织的神经元、胰脏的胰岛细胞、肾脏的肾小球囊中表达。CD165 在细胞分化的过程中参与胸腺细胞与胸腺上皮细胞的结合。
本发明的间充质干细胞除了表达上述特定标记物这样的特征之外，例如还可以通过以下方法来表征：生长特征(例如，传代至老化为止的集团倍增能力、倍增时间)、核型分析(例如，正常核型、母体系统或新生儿系统)、利用流式细胞术(例如，FACS分析)的除上述以外的表面标记物表达、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如，表位检测)、基因表达谱(例如，基因芯片阵列；反转录PCR、实时PCR、以往类型PCR等聚合酶链反应)、miRNA表达谱、蛋白质阵列、细胞因子等蛋白质分泌(例如，血浆凝固分析、ELISA、细胞因子阵列)、代谢产物(代谢物组学分析)、本领域中已知的其它方法等。本发明的表达特定标记物的间充质干细胞例如具有以下这些特征。
(除了特定标记物之外的表面标记物的表达)
表达特定标记物的本发明的间充质干细胞表达成为未分化性的指标的 CD29、CD73、CD90、CD105和CD166。
(除了特定标记物之外的基因表达)
本发明的表达特定标记物的间充质干细胞除了特定标记物基因之外还可以通过其它基因表达的有无来表征。作为本发明的表达特定标记物的间充质干细胞所表达的基因，例如可列举出：MT1X、NID2、CPA4、DKK1、 ANKRD1、TIMP3、MMP1、护骨蛋白(Osteoprotegerin；TNFRSF11B)、IGFBP5、 SLC14A1等。表达特定标记物的本发明的间充质干细胞优选表达选自由 MT1X、NID2、CPA4、DKK1、ANKRD1、TIMP3、MMP1、护骨蛋白(Osteoprotegerin；TNFRSF11B)、IGFBP5和SLC14A1组成的组中的至少1种基因。更优选表达2种以上、3种以上、4种以上、5种以上、进一步优选表达6 种以上、7种以上、8种以上、9种以上的、特别优选表达上述全部基因。
需要说明的是，此时的各基因的表达可以通过本领域技术人员利用公知的方法来测定。例如，可以由细胞通过常规方法制备mRNA，对于想要确认有无表达、表达程度的基因进行qRT-PCR，分析各个基因的表达。
MT1X是富含半胱氨酸的低分子量蛋白(分子量500～14000Da)，定位在高尔基体膜上。MT1X的具体功能不清楚，但启示出有可能作为抗氧化蛋白参与防御氧化应激的机制。另外，还指出MT1X是成为细胞的未分化性指标的蛋白。作为本发明的表达特定标记物的间充质干细胞表达MT1X的效果，可列举出细胞获得氧化应激耐性这点，从在用于疾病治疗时为更耐损伤的细胞方面出发是优选的。
NID2是与层粘连蛋白γ1链结合从而将层粘连蛋白和IV型胶原蛋白连结、由此参与基底膜的形成和维持的蛋白。在中枢神经组织内的几乎所有基底膜中都表达。作为本发明的表达特定标记物的间充质干细胞表达NID2的效果，认为可能是提高向着肌肉细胞(特别是骨骼肌、心肌)分化的能力。
CPA4是切断蛋白质的C末端氨基酸的蛋白水解酶之一。另外，CPA4还是作为前列腺癌标记物而为人所知的蛋白，已知其表达与癌的恶性程度成比例地上升。有在活跃地增殖的未分化性高的细胞中表达上升的倾向，因此可以说，本发明的表达特定标记物的间充质干细胞表达CPA4这一点表明了本发明的表达特定标记物的间充质干细胞的未分化性及增殖性高。
ANKRD1是除了在间充质干细胞中以外还在心肌、平滑肌、成纤维细胞、肝星型细胞等中表达的蛋白，是参与和作用于分化过程、应激的转录因子。现已查明其参与多种心脏疾病。另外已知，在处于创伤愈合过程中的成纤维细胞和肝损伤时的肝星型细胞中表达上升、ANKRD1缺损小鼠的伤口愈合延迟等(Susan E.Samaras et al.The American Journal ofPathology，Vol.185，No. 1，January 2015，Inge Mannaerts et al，Journal ofHepatology 2015)。另外为控制MMP10、13等的细胞外基质分解酶的表达的核内因子(Karinna Almodovar-Garcia et al.MCB 2014)。因此，作为本发明的表达特定标记物的间充质干细胞表达ANKRD1的效果，可以认为可能是：提高向着心肌细胞分化的能力、创伤愈合效果亢进、参与纤维化组织的胞外基质的重建 (remodeling)等。
DKK1是作为Wnt信号抑制剂起作用的蛋白，被认为有助于抑制经典 (Canonical)通路。因此，关于骨分化，作用于促进骨分化的方向而提高骨分化能力。已知在骨质疏松症中表达减少。另一方面，被认为对细胞的未分化性维持及增殖带来良好影响，还已知也有助于胎儿发育。
金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP3：Tissue Inhibitor of Metalloproteinase 3)抑制MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、MMP13的活化。进而，MMP3参与此外的多种MMP的活化，因此TIMP3作为广谱的MMP的抑制因子起作用。另外已知，通过抑制VEGF与VEGFR2的结合来抑制血管新生、作为凋亡促进信号起作用。
基质金属蛋白酶(MMP1：Matrix metalloproteinase 1)是以I型、II型、III 型、V型胶原蛋白为对象并将其降解的蛋白质。已知以主要的ECM为对象而在细胞分裂、细胞迁移时起作用。已知会由于炎症反应而增加表达，参与炎症时的组织破坏、重建。
护骨蛋白(Osteoprotegerin；TNFRSF11B)是破骨细胞分化因子(RANKL) 的诱饵受体，抑制RANK介导的NF-κB信号活化。由成骨细胞、成纤维细胞、肝细胞等产生，抑制破骨前体细胞向破骨细胞的分化。有报道指出，通过护骨蛋白的局部给药可促进骨形成，或者相反地通过敲除而引发骨质疏松。
IGFBP-5是胰岛素样生长因子(IGF)结合蛋白，几乎所有的IGF都以与 IGFBP结合的状态存在。作为IGFBP的功能，可列举出增强IGF信号。另外已知，除了促进TNFR1的基因表达以外，还对TNFR1蛋白发挥拮抗剂样作用而抑制TNFα信号。另外，报道了在乳癌细胞中IGFBP-5会促进细胞粘附、增加生存率，抑制细胞迁移。
SLC14A1是尿素转运蛋白，在肾脏中高表达，进行细胞内的尿素浓度控制。有报道显示，也在间充质干细胞中表达，特别是在软骨分化时表达降低。
(微小RNA表达)
表达特定标记物的本发明的间充质干细胞可以通过有无表达miRNA来进一步表征。作为本发明的间充质干细胞所表达的miRNA，例如可列举出： hsa-miR-145-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34a-5p、 hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-503-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-132-3p、 hsa-miR-196a-5p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-382-5p、 hsa-let-7d-5p等。本发明的间充质干细胞优选表达选自由hsa-miR-145-5p、 hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34a-5p、hsa-miR-199b-5p、 hsa-miR-503-5p、hsa-let-7e-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-196a-5p、 hsa-miR-324-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-382-5p、和hsa-let-7d-5p组成的组中的至少1种微小RNA。更优选表达2种以上、3种以上、4种以上、5种以上、 6种以上、进一步优选表达7种以上、8种以上、9种以上、10种以上、11种以上、12种以上、特别优选表达上述全部微小RNA。
需要说明的是，此时的微小RNA的表达可以通过本领域技术人员利用公知的方法来测定。例如，可以由细胞通过常规方法制备mRNA，通过qRT-PCR 或市售的微小RNA阵列等分析细胞中的微小RNA表达。
(细胞因子分泌)
表达特定标记物的本发明的间充质干细胞可以通过有无以下特定的细胞因子分泌来进一步表征。本发明的间充质干细胞分泌横脉缺失蛋白 -2(Crossveinless-2)和外胚层发育异常蛋白-A2(Ectodysplasin-A2)。
本发明的间充质干细胞更优选进一步分泌选自由活化素A、Dkk-3、核心蛋白聚糖、HGF、Dkk-1、颗粒蛋白前体、GDF-15、促血管生成素-1、 CCL28(VIC)、潜在型TGF-β结合蛋白1(Latent TGF-beta bp1)、GDF1、VEGF-C、 BTC、巢蛋白-1(Nidogen-1)、GLO-1(乙二醛酶-1)、sgp130(可溶型gp130)、脊索发生素样-2(Chordin-Like 2)和EMAP-II组成的组中的至少1种，特别优选进一步分泌选自由活化素A、Dkk-3、核心蛋白聚糖、HGF、Dkk-1、颗粒蛋白前体、GDF-15、促血管生成素-1、CCL28(VIC)、潜在型TGF-β结合蛋白1(Latent TGF-beta bp1)、GDF1和VEGF-C组成的组中的至少1种，最优选进一步分泌选自由活化素A、Dkk-3、核心蛋白聚糖、HGF、Dkk-1、颗粒蛋白前体、GDF-15 和促血管生成素-1组成的组中的至少1种。
横脉缺失蛋白-2(Crossveinless-2，CV-2)还是作为结合内皮调节因子 (BMPER：BMP binding endothelial regulator)而为人所知的骨形成蛋白质 (BMP)结合蛋白。
外胚层发育异常蛋白-A2(Ectodysplasin-A2)(EDA-A2)是TNF受体超家族的配体，已知参与毛发、牙齿、汗腺等由外胚层分化的各种器官的发育。
促血管生成素-1是促进血管发生(vasculogenesis)或血管新生 (angiogenesis)的糖蛋白。
活化素A还是作为抑制素βA(抑制素βA：INHBA)而为人所知的蛋白质的同源二聚体。对于人，INHBA已知由INHBA基因编码而成。
据报道，Dkk-1通过与作为分泌蛋白质的LRP-5/-6结合而从细胞外将Wnt 信号控制为负。Dkk-3通过与Dkk-1不同的机理来进行细胞增殖抑制、凋亡诱导，可认为是控制癌化抑制/癌细胞死诱导的分子。
核心蛋白聚糖是平均分子量为约90至约140kDa的蛋白聚糖。核心蛋白聚糖属于富含亮氨酸的小蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycan：SLRP)家族，其包含蛋白核心，所述蛋白核心包含具有由硫酸软骨素(chondroitin sulfate： CS)或硫酸皮肤素(dermatan sulfate：DS)构成的粘多糖(glycosaminoglycan： GAG)的亮氨酸重复序列(leucine repeats)。已知在生物体内广泛表达，参与胶原蛋白纤维的缔合、细胞的增殖等。在本发明的表达特定标记物的间充质干细胞中，作为核心蛋白聚糖的分泌上升的效果，可以期待炎症部位、损伤部位中的组织修复效果、组织中的细胞增殖促进效果等。
HGF为肝细胞增殖因子。
颗粒蛋白前体(PGN)是颗粒体蛋白的前体。颗粒蛋白前体是经高度保存的具有7.5重复的12-半胱氨酸颗粒体蛋白/内皮素基序的单一前体蛋白，颗粒体蛋白(granulin：GRN)是从前述颗粒蛋白前体中剪切而分泌的、糖基化的肽的家族。颗粒蛋白前体也称为内皮素前体和源自PC细胞的生长因子。
GDF-15(生长分化因子15、growth differentiation factor 15)是属于作为巨噬细胞抑制因子1(macrophage inhibitory cytokine 1：MIC1)而为人所知的、发挥在损伤组织和疾病过程中调节炎症途径(inflammatory pathway)和细胞死途径的作用的转化生长因子β(transforming growth factor beta：TGF-β)超家族的蛋白质、。
作为本发明的间充质干细胞所分泌的除了上述以外的细胞因子，例如可列举出：护骨蛋白、MMP1等。本发明的间充质干细胞优选分泌护骨蛋白和 /或MMP1、进一步优选分泌两者的细胞因子。
护骨蛋白(Osteoprotegerin；TNFRSF11B)如基因表达部分的记载所述为破骨细胞分化因子(RANKL)的诱饵受体，抑制RANK介导的NF-κB信号活化。由成骨细胞、成纤维细胞、肝细胞等产生，抑制破骨前体细胞向破骨细胞的分化。有报道指出，通过护骨蛋白的局部给药可促进骨形成，相反地通过敲除会引发骨质疏松。
基质金属蛋白酶(MMP1：Matrix metalloproteinase 1)如基因表达部分的记载所述为间质胶原酶，是特异性切断I型、II型、III型、V型胶原蛋白的螺旋部位、参与组织破坏和组织再构建的酶。在本发明的表达特定标记物的间充质干细胞中，作为MMP1的分泌比特定标记物阴性细胞低的效果，可以期待炎症部位、损伤部位的组织修复效果等。
需要说明的是，细胞因子的分泌量(培养上清中的浓度)可以通过本领域技术人员利用公知的方法来测定。例如可列举出ELISA法等。
(分化的方向性)
表达特定标记物的本发明的间充质干细胞具有向着骨、脂肪、软骨分化的分化能力。关于各自的分化能力，可以通过本领域技术人员利用公知的分化诱导条件培养上述间充质干细胞群体来进行判断。
作为向着骨细胞分化的分化诱导法，可以使用以往使用的诱导方法，没有特别限定，典型的是，可以通过以下那样的方法进行诱导。即，将本发明的间充质干细胞培养数天后，悬浮于在培养基中含有FBS等血清、地塞米松、β-甘油磷酸酯(β-glycerol phosphate)、抗坏血酸-2-磷酸酯(ascorbic acid-2-phosphate)而成的分化培养液中并进行接种。需要说明的是，作为上述分化培养液，可以使用市售的骨细胞分化用培养基。作为这样的市售的骨分化用培养基，例如可列举出：成骨完全骨生长培养基(OsteoLife CompleteOsteogenesis Medium)(Lifeline，LM-0023)、间充质干细胞成骨分化培养基(Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation Medium)(宝生物公司， D12109)等。在用于骨分化的培养中，在从分化培养用接种起24小时～72小时左右之后进行培养基更换，以后每3～4天进行培养基更换，培养2周～1个月左右。
作为向着脂肪细胞分化的分化诱导方法，可以使用以往使用的诱导方法，没有特别限定，典型的是，在用添加有视黄酸的培养液悬浮培养数天之后，用添加有胰岛素及三碘甲状腺原氨酸(Triiodothyronine)(T3)的培养液进行培养。另外，可以利用以往用于培养这种细胞的培养条件，例如，对培养基的种类、组合物的内容、组合物的浓度及培养温度等没有特别限制。另外，就培养期而言，经典情况下优选在不超过21天的期间内进行培养，也可以持续培养30天～40天左右。具体而言，可以通过以下那样的方法诱导脂肪细胞。即，在将本发明的间充质干细胞培养数天后，悬浮于脂肪细胞分化用培养基，按照KURABO分化规程建议的细胞密度进行接种。作为上述分化用培养基，例如可列举出人间充质干细胞用脂肪细胞分化用培养基：AdipoLife DfKt-1(Lifeline，LL-0050)、AdipoLife DfKt-2(Lifeline，LL-0059)、间充质干细胞脂肪分化培养基(Mesenchymal Stem CellAdipogenic Differentiation Medium)(宝生物公司，D12107)等。在用于脂肪分化的培养中，在从分化培养用接种起24～72小时左右之后进行培养基更换，以后每3～4天进行培养基更换，培养2周～1个月左右。
作为向着软骨细胞分化的分化诱导法，可以使用以往使用的诱导方法，没有特别限定，典型的是，可以将本发明的间充质干细胞与胶原蛋白凝胶等混合而进行凝胶化，添加在DMEM等培养基中包含地塞米松、抗坏血酸-2- 磷酸酯、丙酮酸钠(sodium pyruvate)、TGF-β3(Transforming Growth Factor-β3，转化生长因子β3)、ITS预混合物(ITS pluspremix)(胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸的混合物)而成的分化培养液进行培养。1周进行2～3次左右培养液更换并培养3周左右。具体而言，可以通过以下那样的方法诱导软骨细胞。即，将本发明的间充质干细胞培养数天后，悬浮于软骨分化用培养基，按照 KURABO分化规程建议的细胞密度用微团培养(micromass culture)法进行接种。作为上述软骨分化用培养基，例如可列举出：软骨生物完全软骨形成培养基(ChondroLife Complete ChondrogenesisMedium)(Lifeline，LM-0023)、间充质干细胞软骨分化培养基w/o诱导物(MesenchymalStem Cell Chondrogenic Differentiation Medium w/o Inducers)(宝生物公司，D12110)等。然后，每3～4天进行培养基更换，培养2周～1个月左右。
利用上述分化诱导方法得到的细胞可以通过生化学途径或形态观察来确认已分化的细胞的种类。例如，可以通过利用显微镜的细胞观察、各种细胞染色法、使用杂交的RNA印迹法、RT-PCR法等各种确认方法来确定已分化的细胞的种类。
脂肪细胞、骨细胞及软骨细胞难以由其细胞形状来判定，但可以通过对细胞内脂质进行染色(例如可以通过油红O染色法染成红色。)来确认脂肪细胞的存在。另外，通过将细胞用茜素红(Alizarin red)进行染色，能够确认骨细胞的存在。另外，通过进行阿辛蓝(Alcian blue)染色、番红O染色、或甲苯胺蓝染色，能够确认软骨细胞的存在。
本发明的间充质干细胞具有向着脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞分化的分化能力，特别是，向着脂肪细胞、骨细胞分化的分化能力与用以往的培养基培养的间充质干细胞群体相比显著提高。
[表达特定标记物的间充质干细胞的制备]
表达特定标记物的间充质干细胞的制备方法没有特别限定，例如可以如下制备。即，从脐带、脂肪组织、骨髓等组织中按照本领域技术人员利用公知的方法分离间充质干细胞并进行培养，使用与特定标记物特异性结合的抗体(抗CD201抗体、抗CD46抗体、抗CD56抗体、抗CD147抗体和/或抗CD165 抗体)并利用细胞分选仪、磁珠等分离特定标记物阳性细胞，由此可以获得。在利用这些方法而得到的细胞群体中，优选细胞群体的70％以上为特定标记物阳性、更优选80％以上为特定标记物阳性、进一步优选90％以上为特定标记物阳性、特别优选95％以上为特定标记物阳性、最优选99％以上为特定标记物阳性。以下对表达特定标记物的间充质干细胞的制备方法进行详细说明。
作为本发明的表达特定标记物的间充质干细胞的制备方法，例如可以使用以下那样的方法。即，通过包含如下工序的方法可以获得间充质干细胞并进行培养，所述工序为：(A)将包含间充质干细胞的组织用酶等进行处理的工序；(B)将通过上述酶处理得到的细胞悬浮于适当培养基进行贴壁培养的工序；(C)去除悬浮细胞的工序；(D)对间充质干细胞进行传代培养的工序等。以下对各工序进行详细说明。
在(A)将包含间充质干细胞的组织用酶等进行处理的工序中，对于脐带、脂肪、骨髄等包含间充质干细胞的组织使用生理盐水(例如磷酸缓冲盐水 (PBS))等进行搅拌、使之沉淀等(还包括基于离心分离的方法)，从而进行清洗。通过该操作，可以从组织中去除上述组织中所含的夹杂物。残存的细胞以各种尺寸的块形式存在时，为了将细胞本身的损伤抑制到最低限度并使其解离，优选对于清洗后的细胞块用减弱细胞间的结合或破坏细胞间的结合的酶(例如胶原酶、分散酶、胰蛋白酶等)进行处理。使用的酶量及处理期间根据所使用的条件而改变，可以在本技术领域的技术常识的范围内进行。作为这样的酶处理的替代或与这样的酶处理组合使用，可以将细胞块用机械搅拌、超声波能量、热能等其它处理法分解，但为了将细胞的损伤抑制到最低限度，优选仅通过酶处理来进行。在使用酶时，为了将对细胞的有害作用抑制到最低限度，在酶处理后用培养基等使酶失活是理想的。
通过上述工序得到的细胞悬浮物包含聚集状的细胞浆或悬浮物、以及各种夹杂细胞，例如红血球、平滑肌细胞、内皮细胞、及成纤维细胞。因此，接下来可以对凝集状态的细胞和这些夹杂细胞进行分离、去除，由于通过后述的悬浮细胞等去除工序也可去除，因此也可以省略该分离、去除。在对夹杂细胞进行分离、去除的情况下，可以通过将细胞强制分为上清和沉淀的离心分离来达成。将得到的包含夹杂细胞的沉淀悬浮于适当溶剂中。悬浮状的细胞有可能包含红血球，但通过后述的利用向固体表面的粘附而进行的选择可排除红血球，因此溶解工序并不是必需的。作为选择性溶解红血球的方法，例如可以使用基于用氯化铵进行溶解的、在高渗培养基或低渗培养基中孵育等本技术领域中熟知的方法。溶解后，可以通过例如过滤、离心沉淀或密度分级从期望细胞中分离溶解物。
接着，在(B)将通过上述酶处理得到的细胞悬浮于适当培养基中并进行贴壁培养的工序中，为了提高悬浮状态的细胞中的间充质干细胞的纯度，可以清洗1次或连续清洗多次，离心分离并再次悬浮于培养基中。此外，也可以将细胞基于细胞表面标记物图谱或基于细胞的尺寸及颗粒性进行分离。在该工序中，可以通过使用细胞分选仪、磁珠等的免疫学方法仅选择性地分离表达特定标记物蛋白的细胞。
用于再次悬浮的培养基只要是能够培养间充质干细胞的培养基就没有特别限定，例如，可以向动物细胞用的基础培养基中添加血清和/或血清替代物等而制作。另外，也可以使用作为适合于培养间充质干细胞的培养基销售的培养基。需要说明的是，在本发明中，由于将间充质干细胞、其培养上清用于动物(包括人)的疾病治疗，因此优选尽量不含源自生物的原料的培养基 (例如，无血清培养基)。特别优选不含源自不同种成分的(xeno-free，无异源) 培养基。
上述基础培养基的组成可以根据要培养的细胞的种类进行适宜选择。例如可列举出：伊戈尔培养基之类的最小必需培养基(MEM)、杜尔贝科改良伊戈尔培养基(DMEM)、最小必需培养基α(MEM-α)、间充质细胞基础培养基 (MSCBM)、Ham’s F-12及F-10培养基、DMEM/F12培养基、Williams培养基E、 RPMI-1640培养基、MCDB培养基、199培养基、Fisher培养基、Iscove改良杜尔贝科培养基(IMDM)、McCoy改良培养基等。
血清例如有人血清、胎牛血清(FBS)、牛血清、仔牛血清、山羊血清、马血清、猪血清、绵羊血清、兔血清、大鼠血清等，但不限于这些。在使用血清的情况下，可以向基础培养基中添加0.5％～15％、优选5％～10％。作为向基础培养基中加入的上述血清替代物，例如可列举出：白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、亚硒酸钠、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’- 硫代甘油等。
上述基础培养基中可以根据需要进一步添加氨基酸、无机盐类、维生素类、生长因子、抗生素、微量金属类、干细胞分化诱导剂、抗氧化剂、碳源、盐、糖、糖前体、源自植物的水解物、表面活性剂、氨、脂质、激素、缓冲剂、指示剂、核苷、核苷酸、丁酸、有机物、DMSO、源自动物的产物、基因诱导剂、细胞内pH的调节剂、甜菜碱、渗透压保护剂、矿物等物质，但不限于这些物质。这些物质的使用浓度没有特别限定，可以以通常用于哺乳动物细胞用培养基的浓度来使用。
作为上述氨基酸，例如可列举出：甘氨酸、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L- 组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L- 脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等。
作为上述无机盐类，例如可列举出：氯化钙、硫酸铜、硝酸铁(III)、硫酸铁、氯化镁、硫酸镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等。
作为上述维生素类，例如可列举出：胆碱、维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B4、维生素B5、维生素B6、维生素B7、维生素B12、维生素B13、维生素B15、维生素B17、维生素Bh、维生素Bt、维生素Bx、维生素C、维生素D、维生素E、维生素F、维生素K、维生素M、维生素P等。
此外，作为可以添加于基础培养基的具体物质，可列举出：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、内皮细胞生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血管内皮细胞生长因子 (VEGF)、粒细胞集落形成刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、肝细胞生长因子(HGF)等生长因子；青霉素、链霉素、硫酸新霉素、两性霉素B、杀稻瘟素、氯霉素、阿莫西林、杆菌肽、博来霉素、头孢菌素、金霉素、盐酸博来霉素 (Zeocin)和嘌呤霉素等抗生素；葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖等碳源；镁、铁、锌、钙、钾、钠、铜、硒、钴、锡、钼、镍、硅等微量金属；β-甘油磷酸酯、地塞米松、罗格列酮、异丁基甲基黄嘌呤、5-氮杂胞苷等干细胞分化诱导剂；2-巯基乙醇、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、N-乙酰半胱氨酸等抗氧化剂；腺苷5'-单磷酸、皮质酮、乙醇胺、胰岛素、还原型谷胱甘肽、硫辛酸、褪黑激素、次黄嘌呤、酚红、孕酮、腐胺、丙酮酸、胸苷、三碘甲状腺原氨酸、转铁蛋白、乳铁蛋白等。
作为适于本发明的间充质干细胞的无血清培养基，可列举出市售的无血清培养基。例如可列举出：由PromoCell公司、Lonza公司、Biological Industries 公司、Veritas公司、R&D Systems公司、Corning公司及Rohto公司等提供的作为间充质干细胞用途预先制备的培养基等。
接着，在不使间充质干细胞分化而在培养容器等的固体表面上使用上述适当培养基以适当细胞密度及培养条件进行培养。对具有固体表面的培养容器的形状没有特别限定，可适当使用培养皿、烧瓶等。本发明的间充质干细胞的培养条件只要是适合于各间充质干细胞的方法就没有特别限定，可使用与以往相同的方法。通常在30℃～37℃的温度、2％～7％CO2环境下、5％～21％O2环境下进行。
在(C)去除悬浮细胞的工序中，去除培养容器的固体表面非附着状态的悬浮细胞及细胞的碎片等，用生理盐水(例如磷酸缓冲盐水；PBS)等清洗附着细胞。在本发明中，可以选择最终以附着于培养容器的固体表面的状态下残留的细胞作为间充质干细胞的细胞群体。
接着，进行(D)对间充质干细胞进行传代培养的工序。培养方法只要是适合于各细胞的方法就没有特别限定，可使用与以往相同的方法。通常在30℃～37℃的温度、2％～7％CO2环境下、5％～21％O2环境下进行。另外，间充质干细胞的传代时期及方法只要适合于各间充质干细胞就没有特别限定，可以边观察间充质干细胞的形态边与以往同样地进行。作为培养中使用的培养基，可以使用与工序(B)同样的培养基。需要说明的是，也可以在细胞的整个培养期内使用无血清培养基等进行。
优选进一步包括如下工序(E)：从通过上述(D)工序的培养而得到的间充质干细胞中，通过利用了细胞分选仪、磁珠等的免疫学方法仅选择性地分离表达特定标记物蛋白的细胞。通过(E)工序能够有效地获得表达特定标记物的间充质干细胞。
得到的间充质干细胞可以悬浮在输液制剂等中进行制备而用于治疗，针对患者来使用，还可以暂时冷冻保存。冷冻保存可以通过本领域技术人员利用现有公知的方法来进行。给患者使用冷冻的细胞时，可以在解冻后直接给药，还可以给药悬浮在输液制剂等中而成的制剂。
[药物组合物]
本发明的药物组合物的特征在于包含表达特定标记物的间充质干细胞和/或其培养上清液。如上所述，表达特定标记物的本发明的间充质干细胞具有：IL-6等炎性细胞因子的产生抑制作用等抗炎作用、屏障功能亢进作用、抗纤维化作用优异这样的特性。另外，在维持未分化性的同时，若处于分化条件下则能够有效地分化成具有目标功能的细胞。包含这样的表达特定标记物的间充质干细胞和/或其培养上清液的本发明的药物组合物对各种疾病发挥优异的治疗效果。在不损害本发明的效果的范围内，本发明的药物组合物除了表达特定标记物的间充质干细胞和/或其培养上清液之外还可以包含其它成分。
本发明的药物组合物包含间充质干细胞群体和/或其培养上清液，该间充质干细胞群体的一部分或全部是表达特定标记物的间充质干细胞。对于表达特定标记物的间充质干细胞的特性等，如在表达特定标记物的间充质干细胞部分说明所述。本发明的药物组合物所包含的间充质干细胞群体中表达特定标记物的间充质干细胞所占的比率越高越好。上述比率优选为50％以上、更优选为70％以上、进一步优选为90％以上、特别优选为95％以上、最优选为99％以上。
[药物组合物的制备方法]
本发明还包括用于疾病的预防或治疗的药物组合物的制备方法，所述方法包括诱导表达特定标记物的间充质干细胞并对其进行浓缩或分离筛选的工序。作为上述疾病，可列举出选自由癌、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、循环系统疾病、心脏疾病、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病、肾疾病和口腔疾病组成的组中的疾病。
本发明的药物组合物的制备方法包括诱导表达特定标记物的间充质干细胞并对其进行浓缩或分离筛选的工序。作为在上述诱导表达特定标记物的间充质干细胞的工序中采用的方法，只要是能够诱导、增强间充质干细胞中的特定标记物表达的方法就没有特别限定。
作为在对表达特定标记物的间充质干细胞进行浓缩、分离筛选的工序中采用的方法，例如可列举出使用特异性识别上述那样的特定标记物的抗体，使用细胞分选仪、磁珠等的方法。根据这些方法，能够对在细胞表面表达了特定标记物蛋白的间充质干细胞选择性地进行浓缩、分离筛选。
作为本发明的间充质干细胞的培养上清液，只要是培养间充质干细胞而得到的上清液就没有特别限定，但优选为利用在上述“表达特定标记物的间充质干细胞的制备”部分详细说明的培养方法而得到的培养上清液。即，是首先培养间充质干细胞、接着在更换培养基中培养间充质干细胞而得到的培养上清液。
需要说明的是，本说明书中的间充质干细胞的培养上清是指：从在间充质干细胞能增殖或生存的条件下用间充质干细胞能增殖或生存的培养液培养间充质干细胞而得到的培养液(培养后的培养液)中去除了间充质干细胞而得的液体；为了方便，从这样的培养上清中进一步去除了例如残存培养基成分(培养前的培养液成分中的、在培养后的培养液中仍残存的成分)、培养液的水分等无益于本发明效果的成分中的至少一部分而得的液体也包含在本说明书的间充质干细胞的培养上清中。需要说明的是，从简便性的观点出发，优选直接使用从培养后的培养液中去除了间充质干细胞而得的液体来作为培养上清。
本发明的间充质干细胞的培养上清液含有横脉缺失蛋白 -2(Crossveinless-2)和外胚层发育异常蛋白-A2(Ectodysplasin-A2)。优选进一步含有活化素A、Dkk-3、核心蛋白聚糖、HGF、Dkk-1、颗粒蛋白前体、GDF-15、促血管生成素-1、CCL28、潜在型TGF-β结合蛋白1、GDF1或VEGF-C、BTC、巢蛋白-1、GLO-1、sgp130、脊索发生素样-2或EMAP-II。更优选进一步含有护骨蛋白或MMP-1。本发明的间充质干细胞的培养上清液进一步优选含有上述全部细胞因子。
本发明的药物组合物除了含有通过上述“诱导表达特定标记物的间充质干细胞并对其进行浓缩或分离筛选的工序”取得的表达特定标记物的间充质干细胞以外，可以在不损害本发明的效果的范围内含有特定标记物阴性的间充质干细胞、其它细胞，根据其用途、形态可以利用常规方法使其含有药学上可接受的载体、添加物。作为这样的载体、添加物，例如可列举出：等渗剂、增粘剂、糖类、糖醇类、防腐剂(保存剂)、杀菌剂或抗菌剂、pH调节剂、稳定剂、螯合剂、油性基剂、凝胶基剂、表面活性剂、助悬剂、粘合剂、赋形剂、润滑剂、崩解剂、泡腾剂、流动剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧化剂、甜味剂、酸味剂、着色剂、呈味剂、香料或清凉化剂等，但不限于这些。作为代表性成分，例如可列举出以下的载体、添加物等。
[本发明的表达特定标记物的间充质干细胞和药物组合物的用途]
(培养上清液的屏障功能亢进作用)
表达特定标记物的本发明的间充质干细胞的培养上清液与特定标记物阴性的现有的间充质干细胞的培养上清液相比，显示更优异的细胞屏障功能亢进效果。即，本发明的表达特定标记物的间充质干细胞的培养上清液具有使由于炎症而受到损伤的细胞的屏障功能恢复的显著效果，因此本发明的表达特定标记物的间充质干细胞和包含其的药物组合物可以优选用于炎症相关疾病的治疗。另外，表达特定标记物的间充质干细胞或其培养上清液还可以作为化妆品用组合物、食品用组合物等使用。
(抗炎作用)
表达特定标记物的本发明的间充质干细胞具有抑制巨噬细胞在炎症状态下产生炎症性细胞因子的效果。该效果与特定标记物阴性的以往的间充质干细胞相比显著提高。因此，本发明的表达特定标记物的间充质干细胞及含有其的药物组合物可以优选用于炎症相关疾病的治疗。另外，表达特定标记物的间充质干细胞或其培养上清还可以作为化妆品用组合物、食品用组合物等使用。
(对血管内皮细胞的抗纤维化效果)
表达特定标记物的本发明的间充质干细胞对人血管内皮细胞(HUVEC) 发挥作用，显示出抑制作为纤维化相关基因的TGFβ和COL3A1的表达的效果。因此，本发明的间充质干细胞可以说对血管内皮细胞的纤维化相关动脉硬化等疾病是有效的。
(对肺上皮细胞的抗炎效果、抗纤维化效果)
本发明的间充质干细胞的培养上清液对人肺上皮癌细胞(A549等)发挥作用，显示出抑制作为炎症相关基因的LITAF、作为纤维化相关基因的 COL1A1的表达的效果。因此，本发明的间充质干细胞可以说对肺上皮细胞的炎症、纤维化相关肺/呼吸道炎症、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等疾病是有效的。进而，还可以期待对肺癌的效果。
(对肝星状细胞的抗炎效果、抗纤维化效果)
本发明的间充质干细胞的培养上清液对人肝星状细胞(Human Hepatic StellateCells；hHsteC)发挥作用，显示出抑制作为炎症相关基因的IL-1β、 LITAF、IL-8、作为纤维化相关基因的COL1A1的表达的效果。因此，本发明的间充质干细胞可以说对肝星状细胞的炎症、纤维化相关肺/呼吸道炎症、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等疾病是有效的。
(对心肌细胞的抗炎效果、抗纤维化效果)
本发明的间充质干细胞的培养上清液对人心肌细胞(Human Cardiac Myocytes；hCM)发挥作用，显示出抑制作为炎症相关基因的LITAF、TNFα、作为纤维化相关基因的TGFβ的表达的效果。因此，本发明的间充质干细胞可以说对心肌细胞的炎症、纤维化相关的心肌炎、心肌肥厚等疾病是有效的。
(对牙龈成纤维细胞的抗炎效果、抗纤维化效果)
本发明的间充质干细胞的培养上清液对人牙龈成纤维细胞(Human GingivalFibroblasts；hGF)发挥作用，显示出抑制作为炎症相关基因的LITAF 表达，增强作为纤维化相关基因的COL1A1、COL3A1的表达的效果。对于 hGF，可认为为了改善牙周病而优选促进纤维化。即，在增强COL1A1、 COL3A1的表达时，能判断其具有牙周病改善效果。因此，本发明的间充质干细胞可以说对牙龈成纤维细胞相关的牙周病等疾病是有效的。
对于能够使用表达特定标记物的本发明的间充质干细胞和包含其的药物组合物作为细胞药品的疾病而言，例如可列举出：癌、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、循环系统疾病、心脏疾病、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病、肾疾病和口腔疾病。具体而言，例如可列举出：肺癌、心肌炎、心肌肥厚、动脉硬化、静脉炎、肺/呼吸道炎症、支气管性哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝炎、肝纤维症、肝硬化、牙周病、软骨退化、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、脊椎关节炎、骨关节炎、痛风、银屑病、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化症、阿尔茨海默氏症、帕金森氏病、充血性心脏衰竭、中风、主动脉瓣狭窄、肾功能衰竭、红斑狼疮、胰腺炎、过敏症、纤维化、贫血、动脉粥样硬化、再狭窄、化疗/放疗相关并发症、I型糖尿病、II型糖尿病、自身免疫性肝炎、丙型肝炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、暴发性肝炎、乳糜泻、非特异性结肠炎、变应性结膜炎、糖尿病性视网膜病、干燥综合症、葡萄膜炎过敏性鼻炎、哮喘、石棉沉着病、矽肺、慢性肉芽肿性炎症、囊肿性纤维化、结节病、肾小球肾炎、脉管炎、皮炎、HIV相关恶病质、脑型疟疾、强直性脊柱炎、麻风病、肺纤维化、纤维肌痛、食道癌、胃食管反流病、Barrett食管、胃癌、十二指肠癌、小肠癌、阑尾癌、大肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、脾癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌等。
其中，对于能够使用本发明的间充质干细胞和包含其的药物组合物作为细胞药品的疾病而言，优选：癌、癌前病变、炎症性疾病、循环系统疾病、心脏疾病、肺疾病、肝疾病和口腔疾病，具体而言，优选：肺癌、心肌炎、心肌肥厚、动脉硬化、静脉炎、肺/呼吸道炎症、支气管性哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肝炎、肝纤维症、肝硬化、牙周病。
作为将本发明的药物组合物作为药品使用时的给药方法，没有特别限制，优选血管内给药(优选静脉内给药)、腹腔内给药、肠道内给药、皮下给药等，其中更优选血管内给药。
本发明的药物组合物的用量(给药量)可根据患者的状态(体重、年龄、症状、身体状况等)及本发明的药物组合物的剂型等而不同，有如下倾向：从发挥充分的预防或治疗效果的观点出发，优选其量多的方式；另一方面，从抑制副作用的观点出发，优选其量少的方式。通常，在对成人给药的情况下，以细胞数计为5×102～1×1012个/次，优选为1×104～1×1011个/次，更优选为 1×105～1×1010个/次。需要说明的是，可以将本用量作为1次的量并多次给药，也可以将本用量分成多次来给药。另外，通常在对成人给药的情况下，以每单位体重的细胞数计为1×10～5×1010个/kg，优选为1×102～5×109个/kg，更优选为1×103～5×108个/kg。需要说明的是，可以将本用量作为1次的量并多次给药，也可以将本用量分成多次来给药。
本发明包括疾病的预防或治疗方法，其特征在于，所述方法使用表达特定标记物的间充质干细胞、或包含表达特定标记物的间充质干细胞的药物组合物。作为上述疾病，例如可列举出癌症、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、循环系统疾病、心脏疾病、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病、肾疾病、口腔疾病等。
实施例
接着，通过实施例更具体地说明本发明，但本发明不受以下实施例限定。
＜表达特定标记物的间充质干细胞的制备＞
源自脐带的间充质干细胞(UC-MSC；Umbilical Cord derived Mesenchymal StemCells Wharton’s Jelly(HMSC-WJ)、FC-0020、LifeLine公司)、源自脂肪的间充质干细胞(AD-MSC；Adipose derived Mesenchymal Stem Cells、FC-0034、LifeLine公司)、或源自骨髄的间充质干细胞(BM-MSC；Bone Marrow derived Mesenchymal Stem Cells，LifeLine公司)在37℃、5％CO2的条件下用LifeLine公司推荐培养基(以下也简称为“推荐培养基”)进行驯化，然后每隔2～3天进行传代的同时继续进行培养。在培养过程中，根据需要用抗CD201抗体、抗CD46抗体、抗CD56抗体、抗CD147抗体或抗CD165抗体进行染色，然后利用细胞分选仪对各抗原阳性的细胞进行筛选。
＜表达特定标记物的间充质干细胞的确认和解析＞
(FACS解析)
对于得到的间充质干细胞(源自脐带、源自脂肪、源自骨髄)，通过FACS 对CD201、CD46、CD56、CD147和CD165的表达进行了解析。将结果示于图1。另外，为了确认细胞的未分化性，通过FACS对细胞表面标记物(CD29、 CD73、CD90、CD105和/或CD166)的表达进行了解析。将结果示于图2。
如图1所示，本发明的源自脐带的间充质干细胞高表达了CD201、CD46、 CD56、CD147和CD165。另外，本发明的源自脂肪的间充质干细胞和源自骨髄的间充质干细胞表达了CD201、CD46、CD147、CD165中的任一种，但几乎未发现CD56的表达。另外，如图2所示，本发明的源自脐带的间充质干细胞还表达了作为未分化标记物的CD29、CD73、CD90、CD105和CD166。源自骨髄的间充质干细胞表达了CD29、CD73、CD90和CD105。
(特定标记物表达间充质干细胞在细胞内的miRNA表达量)
利用常规方法由上述得到的表达特定标记物的源自脐带的间充质干细胞制备mRNA，通过miRNA阵列(miScript miRNA PCR array；MIHS-105Z和 MIHS-117Z(inflammatory response&autoimmunity和Fibrosis、QIAGEN公司制)对细胞中的miRNA表达进行了解析。进行了2次同样的实验。
对合计约150种miRNA进行了解析，结果是：表达特定标记物的源自脐带的间充质干细胞表达了hsa-let-7e-5p、hsa-miR-132-3p、hsa-miR-196a-5p、 hsa-miR-324-3p、hsa-miR-328-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-let-7d-5p、 hsa-miR-145-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-29b-3p、hsa-miR-34a-5p、 hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-503-5p。
(表达特定标记物的源自脐带的间充质干细胞向培养上清液中的细胞因子分泌)
将本发明的UC-MSC(第8次传代)以成为1.5×106个细胞/孔板的方式接种在100mm平板(plate)中。第二天，将培养基更换为含有0.2％FCS的 DMEM/F-12培养基(2ml/孔)。48小时后回收了培养上清液。
将上述得到的UC-MSC的培养上清液浓缩10倍后，使用细胞因子阵列 (RayBio公司制Biotin Label-Based(L-Series)Human Antibody Array 493 (L-493))并利用公知的方法进行了分析。作为阴性对照，使用在与细胞培养环境相同环境下放置了48小时的含有0.2％FCS的DMEM/F-12培养基。分析的结果是：横脉缺失蛋白-2(Crossveinless-2)、外胚层发育异常蛋白 -A2(Ectodysplasin-A2)、促血管生成素-1、活化素A、Dkk-3、核心蛋白聚糖、HGF、Dkk-1、颗粒蛋白前体和GDF-15的表达量与阴性对照相比增加32倍以上。另外，CCL28、潜在型TGF-β结合蛋白1、GDF1、VEGF-C、BTC、巢蛋白-1、GLO-1、sgp130、脊索发生素样-2、EMAP-II的表达量与阴性对照相比增加20～30倍。因此，前述源自脐带的间充质干细胞是可通过大量分泌这些细胞因子来表征的细胞。将阴性对照设为1并将各细胞因子分泌量示于下述表。
[表1]
细胞因子 相对表达量
肌动蛋白A 54.6
Dkk-3 49.1
核心蛋白聚糖 45.6
HGF 41.6
横脉缺失蛋白-2 41.1
Dkk-1 38.7
EDA-A2 36.4
颗粒体蛋白前体 35.9
GDF-15 35.4
促血管生成素-1 32.4
CCL28/VIC 30.0
潜在型TGF-β结合蛋白1 29.1
GDF1 28.3
VEGF-C 27.7
BTC 25.4
巢蛋白-1 25.1
GLO-1 23.8
sgp130 23.4
脊索发生素样-2 22.9
EMAP-II 22.6
对于上述得到的表达特定标记物的源自脐带的间充质干细胞(在推荐培养基中驯化后，进行了培养基更换的细胞)，8天后重新进行了接种。第二天更换为含0.2％FBS的DMEM/F12，2天后(48小时后)回收了培养上清液。通过 ELISA测定了回收的培养上清液中的核心蛋白聚糖(Decorin)、护骨蛋白 (Osteoprotegerin)、MMP1量。将结果示于以下的表2。
[表2]
Figure BDA0001843954150000311
如上述表2所示，可知在表达特定标记物的源自脐带的间充质干细胞的培养上清液中包含核心蛋白聚糖、护骨蛋白、MMP1。
(培养上清液的屏障功能亢进作用)
[表达特定标记物的源自脐带的间充质干细胞培养上清液的回收]
将由上述得到的表达特定标记物的源自脐带的间充质干细胞的第8次传代的细胞以成为1.5×105个细胞/孔的方式接种在6孔孔板(well plate)中。第二天，将培养基更换为非驯化培养基(含10％FCS的DMEM/F-12培养基、2ml/ 孔)。24小时后回收培养上清液(Sup-1)，注入新的培养基2ml/孔，继续进行培养。进而在24小时后再次回收了培养上清液(Sup-2)。
[通过肠道屏障模型进行的表达特定标记物的源自脐带的间充质干细胞培养上清液的效果的研究]
用含10％FCS的DMEM培养基对源自人结肠癌的细胞株Caco-2进行传代培养，将第3次传代的细胞用于本实验。将Caco-2以6×104个细胞/孔接种在 Transwell(CorningCostar#3460)中，第二天确认细胞附着在Transwell上，去除了培养基。用含有10％FCS的DMEM培养基将上述表达特定标记物的源自脐带的间充质干细胞的培养上清液(Sup-1)稀释10倍后添加至Transwell中。第二天去除培养基，添加了用含有10％FCS的DMEM培养基将上述表达特定标记物的源自脐带的间充质干细胞的培养上清液(Sup-2)稀释4倍而成的液体。进而，以成为1.5ng/ml的方式添加IL-1β，进而培养20小时后，测定了TER(经上皮电阻值)。通过细胞增殖测试试剂盒(WST-8、#343-07623、同仁化公司) 测定在相同条件下培养的Caco-2的细胞数(吸光度)，将得到的TER除以细胞数而得的值作为TER值(TER Value)并示于图3。将各实验例的条件示于下述表3。
[表3]
IL-1β刺激 处理
实验例1 -(赋形剂) 仅培养基
实验例2 -(赋形剂) UC-MSC培养上清液
实验例3 +(1.5ng/ml) 仅培养基
实验例4 +(1.5ng/ml) UC-MSC培养上清液
如图3所示，将实验例1和实验例3进行比较时，可知进行了IL-1β处理的实验例3的Caco-2细胞间屏障强度(TER值)低于未进行IL-1β处理的实验例1， Caco-2细胞间屏障强度(TER值)由于IL-1β处理而降低。另外，通过添加表达特定标记物的源自脐带的间充质干细胞的培养上清液，使该降低的Caco-2细胞间屏障强度(TER值)恢复至正常水平(实验例4)。由该结果可知，表达特定标记物的源自脐带的间充质干细胞的培养上清液具有使降低了的Caco-2细胞间屏障强度恢复的效果、即屏障功能亢进效果。
(抗炎效果)
将上述得到的表达特定标记物的源自脐带的间充质干细胞用于下述试验。
准备将染色试剂钙黄绿素-AM的0.5mM DMSO溶液用10％FCS DMEM 稀释了1000倍而成的溶液。向小鼠巨噬细胞细胞株Raw264.7添加含有钙黄绿素-AM的培养基，在5％CO2、37℃下进行3小时的前培养，然后以成为5×105个细胞/孔方式接种在48孔板中。
第二天，以成为5×103个细胞/孔的方式添加上述表达特定标记物的源自脐带的间充质干细胞，开始进行上述特定标记物表达间充质干细胞和 Raw264.7的共培养。在共培养开始起4小时后，以成为100ng/mL的量添加LPS。在17-18小时后回收培养上清。通过ELISA(mIL-6ELISA，R&D Duoset DY406-05)测定培养上清中的IL-6量。需要说明的是，在回收培养上清后，测定预先摄入至Raw264.7中的钙黄绿素-AM的荧光值并扣除，由此进行IL-6 量的细胞数校正。将结果示于图4。
如图4所示，通过与表达特定标记物的源自脐带的间充质干细胞的共培养，巨噬细胞细胞株Raw264.7所产生的作为炎症性细胞因子的IL-6的产生受到抑制。另外，该抑制效果与作为阴性对照的地塞米松(100nM DEX)为相同程度。
(对于骨分化能力)
对于上述得到的特定标记物表达间充质干细胞(源自脐带或源自脂肪)，按照KURABO分化规程建议的细胞密度用骨细胞分化用培养基(人间充质干细胞用骨细胞分化用培养基：成骨完全骨生长培养基(OsteoLife Complete Osteogenesis Medium)(Lifeline，LM-0023))接种在24孔板(cellbind，3337， Corning)中。在用于骨分化的培养中，在分化培养用接种起48小时后进行培养基更换，以后每隔3～4天进行培养基更换，直至28天为止。作为染色方法，在接种后第21天以后，将要染色的孔用PBS清洗1次后添加无水乙醇，在室温下放置30分钟，从而进行细胞的固定。将无水乙醇抽滤去除，在洁净室内静置约30分钟而使其干燥。添加2％茜素红溶液，在室温下静置15分钟后，用 DW(蒸馏水)清洗2次，使其干燥。染色照片使用显微镜(Olympus IX70)来拍摄。茜素红染色的结果是可知特定标记物表达间充质干细胞具有向着骨分化的分化能力。
(对于脂肪分化能力)
对于上述得到的特定标记物表达间充质干细胞(源自脐带的或源自脂肪的)，按照KURABO分化规程建议的细胞密度用分化培养基{人间充质干细胞用脂肪细胞分化用培养基：AdipoLife DfKt-1(Lifeline，LL-0050)或者 AdipoLife DfKt-2(Lifeline，LL-0059)接种在24孔板(cellbind，3337，Corning) 中。在用于脂肪分化的培养中，在分化培养用接种起48小时后进行培养基更换，以后每隔3～4天进行培养基更换，直至第28天为止。作为染色方法，在接种后第21天以后，将要染色的孔用PBS清洗1次后，用4％(v/v)多聚甲醛/磷酸缓冲液按照少量残留培养基的方式清洗2次。再次添加4％(v/v)多聚甲醛/ 磷酸缓冲液，在室温下静置20分钟。然后，用DW(蒸馏水)清洗2次、用100％异丙醇清洗1次以使培养基少量残留。添加用DW(蒸馏水)稀释为60％的油红 O染色原液，在37℃静置30分钟后，完全抽滤去除。然后添加60％异丙醇，等待约10秒，加入DW(蒸馏水)。用DW(蒸馏水)清洗2次后，用显微镜(Olympus IX70)拍摄照片。需要说明的是，向AdipoLife DfKt-2的AdipoLife BM(100ml)中加入DifFactor 3(10ml)，将其作为的分化培养基。油红O染色的结果可知特定标记物表达间充质干细胞具有向着脂肪细胞分化的分化能力。
(对于软骨分化能力)
对于上述得到的特定标记物表达间充质干细胞(源自脐带的或源自脂肪的)，按照KURABO分化规程建议的细胞密度用分化培养基(人间充质干细胞用软骨细胞分化用培养基：ChondroLife Complete Chondrogenesis Medium(Lifeline，LM-0023))接种在24孔板(3527，Corning)中。在用于软骨分化的培养中，通过微团培养法进行接种。具体而言，将回收的细胞在各维持培养基中浓缩为1.6×107个细胞/ml，向24孔板(3526，Corning)中以4滴/孔各滴加5ul，在37℃、5％CO2中静置2小时后，以500ul/孔添加软骨分化培养基。然后，每3天进行培养基更换，直至第21天为止。作为染色方法，在接种后第21天以后，将要染色的孔用PBS清洗1次后，添加10％中性缓冲福尔马林液，在室温下放置30分钟，从而进行细胞的固定。然后，用DW(蒸馏水)清洗1次，添加3％乙酸并静置1分钟。添加阿辛蓝染色液后在室温下静置20分钟，然后将染色液抽滤去除，添加3％乙酸等待3分钟。最后用DW(蒸馏水)清洗2次，用数码相机拍摄。其结果可知，特定标记物表达间充质干细胞具有向着软骨细胞分化的分化能力。
(培养上清液对人血管内皮细胞的纤维化抑制作用)
[特定标记物表达间充质干细胞的培养上清液的回收]
对上述表达特定标记物的源自脐带的间充质干细胞(在推荐培养基中驯化后，更换了培养基的细胞)的冷冻保存后的细胞进行解冻，在上述推荐培养基或配方培养基(在DMEM/F-12培养基中加入了L-谷氨酰胺、抗坏血酸、人重组型白蛋白、源自牛血清的胎球蛋白、碳酸氢钠、HEPES、Lipid混合液、 ITSE混合液、bFGF、黄体酮、氢化可的松、VO-OHPic、抑制素-α(Pifithrin-α)、 SB203580、氯化锂和Y-27632的培养基)中进行培养，3天后重新进行了接种。第二天将培养基更换为含有0.2％FBS、1％AB(抗菌-抗真菌剂， Antibiotic-Antimycotic(Gibco公司))的DMEM/F12，2天后(48小时后)回收了培养上清液。将由用上述推荐培养基培养的细胞得到的培养上清液作为 MSCsup1、由用上述配方培养基培养的细胞得到的培养上清液作为MSCsup2。作为用于以下实验的对照培养基，使用预先将含有0.2％FBS的DMEM/F-12 培养基(无细胞)加入培养器48小时而得到的培养基。
将人血管内皮细胞HUVEC以1×105个细胞/孔接种在6孔孔板中，第二天去除培养基，用培养用培养基将上述培养上清液(MSCsup1或MSCsup2)或上述对照培养基稀释至1/2后的培养液添加至各孔中。在24小时后或48小时后回收细胞，根据常规方法分离RNA，通过实时PCR确认了TGFβ、COL3A1的表达程度，将对照表达强度设为1时各自的强度示于图5、图6。
本发明的间充质干细胞的培养上清液对人血管内皮细胞HUVEC发挥作用，显示出抑制作为纤维化相关基因的TGFβ和COL3A1的表达的效果。该结果启示出：本发明的间充质干细胞的培养上清液对血管内皮细胞的纤维化相关动脉硬化等疾病是有效的。
(培养上清液对人肺上皮癌细胞的抗炎作用和纤维化抑制作用)
将人肺上皮癌细胞株A549以1×105个细胞/孔接种在6孔孔板中，第二天去除培养基，将上述培养上清液(MSCsup1或MSCsup2)或上述对照培养基或者用培养用培养基将它们稀释至1/2后的培养液、或者仅将上述培养培养基 (MSCsup1或MSCsup2)、或者仅将上述对照培养基添加至各孔中。24小时后回收细胞，根据常规方法分离RNA，通过实时PCR确认了LITAF、COL1A1 的表达程度，将对照表达强度设为1时各自的强度示于图7、图8。
本发明的间充质干细胞的培养上清液对人肺上皮癌细胞株A549发挥作用，显示出抑制作为炎症相关基因的LITAF、作为纤维化相关基因的COL1A1 的表达的效果。该结果启示出：本发明的间充质干细胞的培养上清液对肺上皮细胞的炎症、纤维化相关肺/呼吸道炎症、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等疾病是有效的。
(培养上清液对人肝星状细胞的抗炎作用和纤维化抑制作用)
将人肝星状细胞(Human Hepatic Stellate Cells；hHsteC)以1×105个细胞/ 孔接种在6孔孔板中，第二天去除培养基，将上述培养上清液(MSCsup1或 MSCsup2)或上述对照培养基添加至各孔中。24小时后以成为100ng/mL的方式添加LPS，添加24小时后回收细胞，根据常规方法分离RNA，通过实时PCR 确认了IL-1β、LITAF、IL-8、COL1A1的表达程度，将对照表达强度设为1时各自的强度示于图9～12。
本发明的间充质干细胞的培养上清液对人肝星状细胞hHsteC发挥作用，显示出抑制作为炎症相关基因的IL-1β、LITAF、IL-8、作为纤维化相关基因的COL1A1的表达的效果。该结果启示出：本发明的间充质干细胞的培养上清液对肝星状细胞的炎症、纤维化相关肺/呼吸道炎症、慢性阻塞性肺疾病 (COPD)等疾病是有效的。
(培养上清液对人心肌细胞的抗炎作用和纤维化抑制作用)
将人心肌细胞(Human Cardiac Myocytes；hCM)以1×105个细胞/孔接种在 6孔孔板中，第二天去除培养基，将上述培养上清液(MSCsup1)或上述对照培养基各孔添加至各孔中。48小时后回收细胞，根据常规方法分离RNA，通过实时PCR确认了LITAF、TNFα、TGFβ的表达程度，将对照表达强度设为1时各自的强度示于图13～15。
本发明的间充质干细胞的培养上清液对人心肌细胞hCM发挥作用，显示出抑制作为炎症相关基因的LITAF、TNFα、作为纤维化相关基因的TGFβ的表达的效果。该结果启示出：本发明的间充质干细胞的培养上清液对心肌细胞的炎症、纤维化相关的心肌炎、心肌肥厚等疾病是有效的。
(培养上清液对人牙龈成纤维细胞的抗炎作用和纤维化促进 作用)
将人牙龈成纤维细胞(Human Gingival Fibroblasts；hGF)以1×105个细胞/ 孔接种在6孔孔板中，第二天去除培养基，将上述培养上清液(MSCsup1、MSCsup2)或上述对照培养基添加至各孔中。48小时后回收细胞，根据常规方法分离RNA，通过实时PCR确认了LITAF、COL1A1、COL3A1的表达程度，将对照表达强度设为1时各自的强度示于图16～18。需要说明的是，对于hGF，可认为为了改善牙周病而优选促进纤维化。即，在COL1A1、COL3A1的表达增强时，可以判断其具有牙周病改善效果。
本发明的间充质干细胞的培养上清液对人牙龈成纤维细胞hGF发挥作用，显示出抑制作为炎症相关基因的LITAF的表达，增强作为纤维化相关基因的COL1A1、COL3A1的表达的效果。该结果启示出：本发明的间充质干细胞的培养上清液对牙周病的预防和/或治疗是有效的。
产业上的可利用性
表达选自由CD201、CD46、CD56、CD147和CD165组成的组中的至少1 种细胞表面标记物的间充质干细胞具有如下特性：抑制由巨噬细胞等免疫细胞的产生炎症性细胞因子的作用、屏障功能亢进作用，并且对氧化应激也具有耐性，是不易受到损伤的细胞。另外，上述表达特定标记物的间充质干细胞的培养上清液还具有对心肌细胞、血管内皮细胞、肺上皮癌细胞、肝星状细胞、牙龈成纤维细胞等起作用，从而适宜地调节与炎症、纤维化相关的基因表达的效果。因此，包含这些间充质干细胞的本发明的药物组合物对癌、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、循环系统疾病、心脏疾病、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病、肾疾病、口腔疾病等各种疾病显示出优异的治疗效果。

Claims (14)

1.一种源自脐带的间充质干细胞，其表达CD201、CD46、CD56、CD147和CD165的细胞表面标记物、并且分泌横脉缺失蛋白-2和外胚层发育异常蛋白-A2。
2.根据权利要求1所述的源自脐带的间充质干细胞，其为CD29、CD73、CD90、CD105和CD166阳性。
3.根据权利要求1或2所述的源自脐带的间充质干细胞，其进一步分泌选自由活化素A、Dkk-3、核心蛋白聚糖、HGF、Dkk-1、颗粒蛋白前体、GDF-15、促血管生成素-1、CCL28、潜在型TGF-β结合蛋白1、GDF1、VEGF-C、BTC、巢蛋白-1、GLO-1、sgp130、脊索发生素样-2和EMAP-II组成的组中的至少1种。
4.一种药物组合物，其包含权利要求1至3中任一项所述的源自脐带的间充质干细胞和/或其培养上清液，
所述培养上清液包含横脉缺失蛋白-2、外胚层发育异常蛋白-A2、活化素A、Dkk-3、核心蛋白聚糖、HGF、Dkk-1、颗粒蛋白前体、GDF-15、促血管生成素-1、CCL28、潜在型TGF-β结合蛋白1、GDF1、VEGF-C、BTC、巢蛋白-1、GLO-1、sgp130、脊索发生素样-2和EMAP-II。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其中，药物组合物包含间充质干细胞时，源自脐带的间充质干细胞的比率为药物组合物所含的全部间充质干细胞的70%以上，
所述源自脐带的间充质干细胞表达CD201、CD46、CD56、CD147和CD165的细胞表面标记物、并且分泌横脉缺失蛋白-2和外胚层发育异常蛋白-A2。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中，药物组合物包含间充质干细胞时，源自脐带的间充质干细胞的比率为药物组合物所含的全部间充质干细胞的90%以上，
所述源自脐带的间充质干细胞表达CD201、CD46、CD56、CD147和CD165的细胞表面标记物、并且分泌横脉缺失蛋白-2和外胚层发育异常蛋白-A2。
7.根据权利要求4所述的药物组合物，其用于预防或治疗选自由癌、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、循环系统疾病、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病、肾疾病和口腔疾病组成的组中的疾病。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其用于预防或治疗选自由癌、癌前病变、炎症性疾病、循环系统疾病、肺疾病、肝疾病和口腔疾病组成的组中的疾病。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其用于预防或治疗选自由肺癌、心肌炎、心肌肥厚、动脉硬化、呼吸道炎症、慢性阻塞性肺疾病、肝炎、肝硬化和牙周病组成的组中的疾病。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的药物组合物，其用于预防或治疗起因于上皮或内皮的屏障功能降低的疾病、或与IL-1相关的疾病。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，屏障功能的降低起因于上皮或内皮细胞层中的紧密连接功能的降低。
12.一种源自脐带的间充质干细胞的制备方法，所述源自脐带的间充质干细胞表达CD201、CD46、CD56、CD147和CD165的细胞表面标记物、并且分泌横脉缺失蛋白-2和外胚层发育异常蛋白-A2，
所述制备方法包括如下工序：对表达CD201、CD46、CD56、CD147和CD165的细胞表面标记物、并且分泌横脉缺失蛋白-2和外胚层发育异常蛋白-A2的源自脐带的间充质干细胞进行诱导、浓缩或分离筛选。
13.一种用于疾病的预防或治疗的药物组合物的制备方法，其包括如下工序：对表达CD201、CD46、CD56、CD147和CD165的细胞表面标记物、并且分泌横脉缺失蛋白-2和外胚层发育异常蛋白-A2的源自脐带的间充质干细胞进行诱导、浓缩或分离筛选。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其中，上述疾病选自由癌、癌前病变、炎症性疾病、免疫疾病、神经退行性疾病、代谢疾病、循环系统疾病、骨疾病、胃肠疾病、肺疾病、肝疾病、肾疾病和口腔疾病组成的组。
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