CN116162589A - 干细胞及其制备方法和应用、及标记组合物及其应用 - Google Patents

干细胞及其制备方法和应用、及标记组合物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116162589A
CN116162589A CN202211737365.3A CN202211737365A CN116162589A CN 116162589 A CN116162589 A CN 116162589A CN 202211737365 A CN202211737365 A CN 202211737365A CN 116162589 A CN116162589 A CN 116162589A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cells
stem cell
bone
fgfr2
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211737365.3A
Other languages
English (en)
Inventor
邱强
黄景辉
秦涛
王文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Northwestern Polytechnical University
Original Assignee
Northwestern Polytechnical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Northwestern Polytechnical University filed Critical Northwestern Polytechnical University
Priority to CN202211737365.3A priority Critical patent/CN116162589A/zh
Publication of CN116162589A publication Critical patent/CN116162589A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3839—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3843—Connective tissue
    • A61L27/3847—Bones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5073—Stem cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1353—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/71—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for growth factors; for growth regulators

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)

Abstract

本申请公开了一种干细胞及其制备方法和应用、及标记组合物及其应用，所述干细胞表达的标记物包括CX43和FGFR2。本申请鉴定并分离出一种新的干细胞，所述干细胞具有较强的成骨及成软骨分化能力，且其成骨能力比传统的骨髓间充质干细胞(BMSCs)更强，能够用于动物或者人的骨缺损修复，利用本干细胞，能够有效且快速地治疗骨缺损，缩短骨修复时间，显著提高预后效果。

Description

干细胞及其制备方法和应用、及标记组合物及其应用
技术领域
本申请涉及干细胞领域，尤其涉及一种干细胞及其制备方法和应用、及标记组合物及其应用。
背景技术
由于外伤、先天性畸形或广泛的肿瘤手术导致的骨结构严重缺损通常需要手术重建。骨缺损一直是创伤骨科所关注的一大问题，同时骨缺损还会导致骨不连，使得患者预后更加不理想。这不仅会打击患者战胜疾病的信心，同时也使得骨缺损的修复关注程度越来越高。骨缺损的治疗目前的首选方法是自体骨或异体骨移植。自体骨移植虽然免疫源性低，但是取材有限，取骨有创，且取骨后并发症的出现，而异体骨移植由于免疫反应的频发限制了其广泛的临床应用。目前基于干细胞的再生医学治疗有望成为下一个治疗的重要方向。
发明内容
鉴于此，本申请提供一种干细胞及其制备方法和应用、及标记组合物及其应用，本申请旨在提供一种具有较强的骨修复能力的干细胞。
本申请实施例是这样实现的：
第一方面，本申请提供一种干细胞，所述干细胞表达的标记物包括CX43和FGFR2。
可选地，在本申请的一些实施例中，所述干细胞为CX43和FGFR2阳性。
可选地，在本申请的一些实施例中，所述干细胞包含以下基因标记中的至少一种：FKBP11、PTN、TNN、TNC、OMD、ACTA2以及MARCKS。
可选地，在本申请的一些实施例中，所述干细胞为间充质干细胞；和/或，
所述干细胞源自人源干细胞或动物干细胞。
第二方面，本申请提出一种干细胞的制备方法，包括以下步骤：
提供细胞群样品和抗体组合物，所述抗体组合物包括抗-CX43抗体和抗-FGFR2抗体；
利用所述抗体组合物对所述细胞群样品进行染色；
分离出所述细胞群样品中对CX43阳性及对FGFR2阳性的细胞，得到干细胞。
第三方面，本申请还提出一种标记组合物，用于筛选或鉴定干细胞，所述标记组合物包括CX43和FGFR2。
可选地，在本申请的一些实施例中，还包括FKBP11、PTN、TNN、TNC、OMD、ACTA2以及MARCKS中至少一种基因的表达产物。
第四方面，本申请还提出一种如上文所述的标记组合物在制备用于分离或鉴定干细胞的试剂盒上的应用。
第五方面，本申请还提出一种干细胞在制备治疗骨缺损用品中的应用，所述干细胞包括如上文所述的干细胞，或者，所述干细胞包括由上文所述的制备方法制得的干细胞，或者，所述干细胞包括表达如上文所述的标记组合物的干细胞；
所述治疗骨缺损用品包括治疗骨缺损的药物、治疗骨缺损的材料或治疗骨缺损的试剂盒。
可选地，在本申请的一些实施例中，所述治疗骨缺损的药物包括所述干细胞和药学上可接受的载体；和/或，
所述治疗骨缺损的材料包括组织工程骨材料、骨缺损支架材料、骨缺损复合修复材料中的任意一种；和/或，
所述治疗骨缺损用品的应用对象为人或动物。
有益效果：
本申请提供的技术方案中，鉴定并分离出一种新的干细胞，所述干细胞具有较强的成骨及成软骨分化能力，且其成骨能力比传统的骨髓间充质干细胞(BMSCs)更强，能够用于动物或者人的骨缺损修复，利用本干细胞，能够有效且快速地治疗骨缺损，缩短骨修复时间，显著提高预后效果。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提出的一种干细胞的形态效果图；
图2是本申请实施例提出的一种干细胞的基因标记表达的小提琴图；
图3是小鼠P3指尖再生组织和鹿茸芽基上的再生组织的10×单细胞转录组图谱；
图4是实验例1中成骨及成软骨诱导分化能力定性检测结果图；
图5是实验例1中成骨及成软骨诱导分化效率定量PCR检测结果图；
图6是实验例1中实施例、对比例2-4获得的干细胞的单克隆能力检测结果图；
图7是实验例2中肾囊膜下新生骨丽春红染色结果图；
图8是实验例2中新生骨面积统计结果对比图；
图9是实验例3中缺损组、对比例治疗组和实施例干细胞治疗组的外侧髁骨的micro-CT图；
图10是实验例3中缺损组、对比例治疗组和实施例干细胞治疗组在缺损处的新生骨骨体积分数统计图；
图11是实验例3中缺损组、对比例治疗组和实施例干细胞治疗组在缺损处的新生骨骨小梁数量统计图；
图12是实验例3中缺损组、对比例治疗组和实施例干细胞治疗组的外侧髁骨的HE染色图；
图13是实验例3中缺损组、对比例治疗组和实施例干细胞治疗组的外侧髁骨的番红固绿染色图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本申请保护的范围。此外，应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本申请，并不用于限制本申请。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅做示范之用，但不能限制本申请的内容。
另外，在本申请说明书的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。本发明的各种实施例可以以一个范围的形式存在；应当理解，以一范围形式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本发明范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所述范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。
在本申请中，“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。
在本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“至少一种”、“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
本申请中，所述骨缺损包括因创伤、手术或疾病所致的骨缺损。所述疾病所致的骨缺损包括因糖尿病、类风湿性关节炎、自身免疫性脑脊髓炎、全身性红斑狼疮、多发性硬化症、牙周炎、炎性肠病、粘膜炎、结肠炎或败血症引起的骨相关疾病。
本申请的技术方案如下：
第一方面，本申请实施例提出一种干细胞，所述干细胞为多能干细胞，其具有如下特性：本干细胞具有较强的成骨、成软骨分化能力，且其成骨能力比传统的骨髓间充质干细胞(BMSCs)更强，能够用于动物或者人的骨缺损修复，利用本干细胞，能够有效且快速地治疗骨缺损，缩短骨修复时间，显著提高预后效果。
本申请提出的干细胞，其表达标记物包括CX43和FGFR2。所述表达标记物可以是指干细胞表达特定标记物基因、或者表达特定标记物蛋白、或者表达标记物基因和蛋白。通过上述标记物组合即可鉴定并分离出所述干细胞，基于上述标记物组合分离出的干细胞具有较强的成骨及成软骨分化能力，且其成骨能力比传统的BMSCs更强。可以理解的是，对于干细胞是否表达了各标记物的判断，就基因表达而言例如可以通过基因芯片阵列、聚合酶链反应(逆转录酶PCR、实时PCR、现有的PCR)等现有公知的方法来进行。另外，就蛋白表达而言，例如可以通过使用了与各标记物蛋白特异性结合的抗体的FACS解析(流式细胞术)、酶联免疫吸附检测法(ELISA)等现有公知的方法来进行。在任意情况下，均将未表达各标记物基因或蛋白的细胞作为阴性对照，从而判断表达的有无、表达的高低。具体来说，细胞样品中，CX43和FGFR2均呈阳性的细胞为本申请提出的干细胞。
具体地：
CX43是指间隙连接蛋白43(Recombinant Connexin 43)，其位于本申请干细胞的细胞膜的外表面，该蛋白在胚胎发育中发挥重要的作用。该基因的突变会导致骨骼的发育畸形。
FGFR2是指成纤维生长因子受体2，FGFR2蛋白位于本申请干细胞的细胞膜的外表面，由位于10号染色体上的FGFR2基因编码得到，其在组织修复、骨骼和血管生成中具有重要作用。
在分离时，筛选出同时呈CX43阳性和FGFR2阳性的细胞，即可得到本申请所述的干细胞。而且，CX43和FGFR2位于细胞膜外表面，抗体染色时准确性更高、效果更好、速度更快。
进一步地，所述干细胞还包含有以下基因标记中的至少一种：FKBP11(FKBPProlyl Isomerase 11)、PTN(Pleiotrophin)、TNN(Tenascin N)、TNC(Tenascin C)、OMD(Osteomodulin)、ACTA2(Actin Alpha 2，Smooth Muscle)以及MARCKS(Myristoylatedalanine-rich C-kinase substrate)，对基于上述标记物分离出的干细胞，进一步鉴定其是否具有上述基因标记中的至少一种，有助于进一步鉴定干细胞；同时，基于上述特征，本干细胞能够分泌FKBP11、PTN、TNN、TNC、OMD、ACTA2以及MARCKS中至少一种基因的表达产物，因而具有这些表达产物所具有的功能。需要说明的是，上述基因标记包括人或动物的相应基因标记或者其核苷酸序列同源性不低于98％的基因标记，以MARCKS为例，其核苷酸序列包括但不限于人的MARCKS基因的核苷酸序列、与所述人的MARCKS基因的核苷酸序列的同源性不低于98％的核苷酸序列、动物的MARCKS基因的核苷酸序列、与所述动物的MARCKS基因的核苷酸序列的同源性不低于98％的核苷酸序列中的一种。其中，动物包括但不限于鹿、小鼠等。根据干细胞的来源不同，其包含的基因标记对应为来源生命体的相应基因标记或者与所述来源生命体的相应基因标记的核苷酸序列同源性不低于98％的基因标记，在知晓干细胞源自哪种生命体的情况下，本领域技术人员能够通过常规方法(例如，从NCBI上搜索得到)获取到其序列信息(以及同源性不低于98％的序列)及特性。
在一具体实施例中：
MARCKS的核苷酸序列包括在NCBI上的登录号为XM_043889887.1的序列以及与该序列同源性不低于98％的序列(例如，如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列)；
FKBP11的核苷酸序列包括在NCBI上的登录号为XM_006054550.3的序列以及与该序列同源性不低于98％的序列(例如，如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列)；
PTN的核苷酸序列包括在NCBI上的登录号为XM_043873485.1的序列以及与该序列同源性不低于98％的序列(例如，如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列)；
TNN的核苷酸序列包括在NCBI上的登录号为XM_043924613.1的序列以及与该序列同源性不低于98％的序列(例如，如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列)；
OMD的核苷酸序列包括在NCBI上的登录号为XM_043453757.1的序列以及与该序列同源性不低于98％的序列(例如，如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列)；
ACTA2的核苷酸序列包括在NCBI上的登录号为XM_043476084.1的序列以及与该序列同源性不低于98％的序列(例如，如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列)；
TNC的核苷酸序列包括在NCBI上的登录号为XM_005251975.5的序列以及与该序列同源性不低于98％的序列(例如，如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列)。
MARCKS表达的蛋白是豆蔻酰化的富含丙氨酸的C激酶底物，该蛋白被认为与细胞运动、吞噬作用、膜运输和有丝分裂发生有关，在四肢再生中发挥重要作用；MARCKS位于细胞内膜上，在本干细胞中高表达，实际应用时，也可作为鉴定本干细胞的标记物。FKBP11表达的蛋白是FKBP脯氨酰异构酶11，与骨骼发育相关；PTN表达的蛋白是肝素结合生长因子，该基因编码的蛋白质在细胞生长和生存、细胞迁移、血管生成和肿瘤发生中具有重要作用；TNN表达的蛋白是指腱糖蛋白-W，该蛋白参与多个生物学过程，包括神经元的生成、成骨细胞分化的经典Wnt信号通路的负调控和成骨细胞分化的负调节，与软骨的形成相关；TNC表达的蛋白是腱糖蛋白-C，该蛋白构成组织的细胞外基质，参与骨骼和神经发育等多个生物学过程；OMD表达的蛋白是骨调节蛋白，主要参与细胞间的基质形成，与骨矿化相关；ACTA2表达的蛋白是α-平滑肌肌动蛋白，是一种高度保守的蛋白，参与细胞的运动，结构组成和细胞间的信号传导。
在本申请的一些实施例中，所述干细胞为间充质干细胞。本申请中，所述间充质干细胞是指：具有向着骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、腱细胞、脂肪细胞等属于间充质的细胞分化的能力且能够在维持该分化能力的状态下增殖的细胞，例如，源自骨髓、脂肪、血液、骨膜、真皮、脐带、胎盘、羊膜、绒毛膜、蜕膜、肌肉、子宫内膜、真皮、牙囊、牙周组织、牙髓、牙胚等的间充质干细胞，优选为源自脐带、源自脂肪、源自骨髓的间充质干细胞。可以理解，“源自”表示上述细胞是由作为供给源的组织获得、生长或进行离体操作而得到的细胞。
在本申请的一些实施例中，所述干细胞源自人源干细胞或动物干细胞，具体来说，本申请提出的干细胞可以从人源干细胞或者动物干细胞中直接分离得到，或者经由人工诱导得到。作为示例，本干细胞的获取方式可以包括但不限于：在一些实施例中，从鹿茸芽基或生长点顶端的间充质组织中获得本干细胞，具体操作时，只需要有限的侵入手术即可获得组织，进而分离出本干细胞，操作简单，且从组织中获取的间充质干细胞无需分化即可培养和传代，因此经过简单的优化即可以在GMP条件下高效回收，来源稳定，显著降低了医疗负担；在另一些实施例中，从小鼠P3指尖再生组织中获得本干细胞，来源稳定易得；在又一些实施例中，本干细胞也可以由人源干细胞经由化学诱导方法或者基因编辑手段诱导得到，例如，利用CRISPER-Cas9技术改造人源的干细胞，使其具有与本干细胞相似的成软骨能力和成骨能力，相较动物来源，人源干细胞更适合人体骨缺损治疗，安全性更高。
需要说明的是，本文中，涉及到CRISPER-Cas9技术改造、获取组织、细胞染色等实施方式中，未说明具体实验方式、实验原材料者，均参照本领域的常规方法进行，在此不做详述。
第二方面，本申请还提出一种干细胞的制备方法，所述干细胞的制备方法包括以下步骤：
步骤S10，提供细胞群样品和抗体组合物，所述抗体组合物包括抗-CX43抗体和抗-FGFR2抗体；
步骤S20，利用所述抗体组合物对所述细胞群样品进行染色；
步骤S30，分离出所述细胞群样品中对CX43阳性及对FGFR2阳性的细胞，得到干细胞。
第三方面，本申请还提出一种如上所述的干细胞在制备治疗骨缺损用品中的应用。所述干细胞的特性和分离方法已在前文进行描述，在此不作赘述。
其中，所述治疗骨缺损用品包括治疗骨缺损的药物、治疗骨缺损的材料或治疗骨缺损的试剂盒。
所述治疗骨缺损的药物是指用于治疗、修复骨缺损的药物，具有治疗、修复骨缺损的作用。具体来说，所述药物包括促进骨再生的药物，所述治疗骨缺损药物包括所述干细胞。例如，用于骨缺损修复的复合生物凝胶，或者，促进骨髓间充质干细胞成骨分化的生物制剂等，具体地，所述复合生物凝胶由所述干细胞经体外扩增培养后种植于生物活性凝胶上得到，所述生物制剂包含本干细胞。所述药物的制备方法可参考本领域常见骨缺损药物的制备，在此不作详述。
所述治疗骨缺损药物还可以包括药学上可接受的载体，所述“药学上可接受的载体”是指稀释剂、辅剂、赋形剂或媒介物，所述“药学上可接受的载体”在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应，或者没有与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。
所述治疗骨缺损的材料是指用于治疗、修复骨缺损的材料，例如，所述材料可以是骨缺损再生修复组织工程骨材料、骨缺损支架材料、骨缺损复合修复材料、功能性复合支架材料等等。所述材料包括干细胞和种植材料，所述种植材料可以选自但不限于天然聚合物、合成聚合物、生物医用金属材料、无机材料中的至少一种。作为示例，骨缺损支架材料可以包括所述干细胞和医用骨材料，具体地，在每立方毫米的医用骨材料中均匀接种1×104-1×105个所述干细胞，即可得到所述骨缺损支架材料。
所述试剂盒是指能够制备出骨缺损治疗药物或材料的试剂盒。在本申请的一些实施例中，所述试剂盒包括所述干细胞和载体，所述载体可以是医用海绵、医用敷料、可制成凝胶的凝胶组合物等。例如，在一具体实施例中，所述试剂盒包括干细胞悬液(细胞浓度为104-106个/μL)2～10mL和明胶海绵，所述试剂盒的使用方法为，在使用前，将所述干细胞悬液加入到明胶海绵中，制成支架填充材料，将支架填充材料填充到骨缺损处，缝合骨缺损处肌肉、皮肤，即可。
本申请提出的干细胞可以应用于人或动物，相应地，所述治疗骨缺损用品的应用对象可以是人，也可以是动物，具有广阔的开发前景。
第五方面，本申请还提出一种标记组合物，所述标记组合物包括但不限于CX43和FGFR2，本标记组合物能够筛选和鉴定干细胞，基于本标记组合物筛选或鉴定出的干细胞具有较强的成骨及成软骨分化能力，且其成骨能力比传统的BMSCs更强，且利用该干细胞，能够有效且快速地治疗骨缺损，缩短骨修复时间，显著提高预后效果。
可以理解的是，所述CX43、FGFR2可以是对应的基因特征，也可以是表达蛋白。例如，在一些实施例中，所述FGFR2的核苷酸序列包括在NCBI上的登录号为XM_043926212.1的序列以及与该序列同源性不低于98％的序列(例如，如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列)；所述CX43的核苷酸序列包括在NCBI上的登录号为XM_OU343105.1的序列以及与该序列同源性不低于98％的序列(例如，如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列)。
此外，所述标记组合物还包括FKBP11、PTN、TNN、TNC、OMD、ACTA2以及MARCKS中至少一种基因的表达产物。基于上述标记物分离出的干细胞，进一步鉴定其是否具有上述基因标记中的至少一种，有助于进一步提升鉴定准确性。
第六方面，本申请还提出一种如上所述的标记组合物在制备用于分离或鉴定干细胞的试剂盒上的应用。
具体地，所述试剂盒包括：anti-Connexin 43(10μL)、anti-FGFR2(10μL)、荧光标记二抗FITC(10μL)及荧光标记二抗Cy3(10μL)。
本试剂盒的使用方法为：将鹿茸间充质干细胞从长出5天的鹿茸组织中分离出来，用一抗anti-Connexin 43和anti-FGFR2(1:200)将上述鹿茸间充质干细胞孵育1小时；PBS洗涤细胞3次，将两种荧光标记的二抗按照1:200的比例稀释后，混合孵育1h。使用流式细胞仪检测双荧光阳性细胞(发射荧光信号的细胞)的比例，并利用流式细胞仪将双阳性的细胞分离出来，得到初筛细胞。
下面通过具体实施例对本申请的技术方案及技术效果进行详细说明，以下实施例仅仅是本申请的部分实施例，并非对本申请作出具体限定。
实施例干细胞的制备
(1)鹿茸间充质干细胞的制备：取生长期5天的鹿茸，无菌纱布去除鹿茸表面的灰尘及血污，备皮后用75％酒精进行消毒处理；然后，用一次性无菌组织切片刀片切下3cm厚的鹿茸芽基上的再生组织，用刀片切碎，用胶原酶I(100μg/ml)/胶原酶II(100μg/ml)/胶原酶IV(30μg/ml)溶液(Gibco，17100017，17101015和17104019)在37℃下消化60分钟(或直到组织被完全消化)，并间歇地摇动。单个细胞悬浮液依次通过70微米和40微米的细胞过滤器(Corning Falcon，352350和352340)过滤，并在500xg下离心5分钟。用PBS重新悬浮细胞颗粒，并用RBC裂解缓冲液(Solarbio，R1010)处理以去除红细胞。然后用PBS洗两次，用0.04％的超纯BSA(Invitrogen)重新悬浮，用Countess自动细胞计数器(Bio-Rad)计数。
用0～4℃的流式分选缓冲液洗涤细胞，离心1000g、5分钟，重复两次，得到鹿茸间充质干细胞。
(2)干细胞的分离：
a、用一抗anti-Connexin 43(biorbyt,orb995524))对所述鹿茸间充质干细胞进行免疫荧光染色；然后用流式细胞仪检测阳性细胞(发射荧光信号的细胞)的比例，并利用流式细胞仪将CX43阳性的细胞分离出来，得到初筛细胞。
b、再用抗FGFR2(LSBio,LS-C214232-200)溶液对所述鹿茸间充质干细胞进行免疫荧光染色；然后用流式细胞仪检测阳性细胞(发射荧光信号的细胞)的比例，并利用流式细胞仪将FGFR2阳性的细胞分离出来，即得到CX43+FGFR2+干细胞。
(1)所述CX43+FGFR2+干细胞的形态效果图如图1所示，从图中可以看出细胞呈现典型的长梭形的形状。
(2)基因标记检测
利用10×genomic技术对实施例获得的CX43+FGFR2+干细胞进行单细胞转录组测序，测序数据量100g，并通过Cellranger软件将测序数据比对到梅花鹿参考基因组以定量关键基因的表达。
经检测，所述干细胞包含以下基因标记：具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的MARCKS、具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的FKBP11、具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的PTN、具有如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的TNN、具有如SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的OMD、具有如SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列的ACTA2、以及具有如SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列的TNC。
此外，上述基团标记的表达情况如图2所示，从图中可以看出，上述基因标记在CX43+FGFR2+干细胞中均具有高表达。
(3)收集小鼠P3指尖再生组织，采集小鼠P3指尖再生组织和实施例1步骤(1)中的鹿茸芽基上的再生组织的10×单细胞转录组图谱，通过Seurat软件中的CCA方法将两者的细胞图谱整合，随后进行数据的降维聚类，并使用UMAP方法展示。结果如图3所示，从图中可以看出，CX43+FGFR2+的细胞群在小鼠P3指尖再生组织和鹿茸再生组织均存在。
对比例1
将传统的BMSCs作为对比例1。
对比例2
本对比例方案与实施例1基本相同，区别仅在于，本对比例中：
步骤(2)中，用流式细胞仪将CX43阳性、FGFR2阴性的细胞分离出来，分离出的干细胞(CX43+FGFR2-干细胞)即作为产品以备后续实验。
对比例3
本对比例方案与实施例1基本相同，区别仅在于，本对比例中：
步骤(2)中，用流式细胞仪将CX43阴性、FGFR2阳性的细胞分离出来，分离出的干细胞(CX43-FGFR2-+干细胞)即作为产品以备后续实验。
对比例4
本对比例方案与实施例1基本相同，区别仅在于，本对比例中：
步骤(2)中，筛选出CX43和FGFR2均呈阴性的细胞，分离出的干细胞(CX43-FGFR2-干细胞)即作为产品以备后续实验。
实验例1
(1)测实施例分离出的干细胞、对比例1分离出的干细胞的成骨以及成软骨诱导分化能力。检测方法如下：
成骨分化能力检测：将干细胞接种在6孔板中，使用成骨分化诱导培养基(CyagenBiosciences,GUXMX-90021)分化28天(每2天更换一次培养基)。提取RNA，qPCR定量检测RUNX2和SP7基因；同时，对细胞进行茜素红染色。
成软骨分化能力检测：将2.5×105个干细胞加入15ml离心管中以1000rpm的速度离心，加入软骨分化诱导培养基(Cyagen Biosciences,GUXMX-90041)中进行培养，24小时后形成软骨球，继续分化3周(每2天更换一次培养基)。提取RNA，qPCR定量检测SOX9和COL2A1基因；同时，将软骨球包埋、冰冻切片，然后，对切片进行阿利新蓝染色。
结果如图4和图5所示，图4中，自上而下依次为成骨分化能力检测中细胞茜素红染色图和成软骨分化能力检测中软骨球阿新蓝染色图；自左向右依次对应为对比例1、实施例的干细胞。
从图4可以看出，与BMSCs相比，CX43+FGFR2+干细胞具有更强的成骨和成软骨分化能力。从图5中可以看出，通过成骨(RUNX2和SP7)和软骨生成(SOX9和COL2A1)标记基因的定量实时PCR(qPCR)分析来量化分化效率，其量化结果与图4所示的结果一致，即，与BMSCs相比，CX43+FGFR2+干细胞具有更强的成骨和软骨分化能力。说明实施例分离出的干细胞表现出优于对比例1的传统BMSCs干细胞的成骨和成软骨诱导分化能力。
(2)检测实施例分离出的干细胞、对比例2至4分离出的干细胞的单克隆能力。检测方法如下：
将干细胞接种在6孔板(4.5×103个细胞/孔)中，每孔加入2ml DMEM培养基(补充有10％ FBS、1％青霉素/链霉素溶液)，在37℃恒温条件，于5％ CO2细胞培养箱中孵育。每2天更换一次培养基。在第10天，将细胞固定并用结晶紫染色液染色。对超过50个细胞的贴壁菌落进行定量
结果如图6所示，与CX43-FGFR2-干细胞、CX43+FGFR2-干细胞、CX43-FGFR2+干细胞细胞相比，CX43+FGFR2+干细胞显示出更高的集落形成效率，具有更多更大尺寸的集落，说明了CX43+FGFR2+干细胞具有更强的克隆扩增的能力，用于骨损伤修复，具有更好的效果。
实验例2
取实施例分离出的干细胞和对比例1干细胞进行肾囊膜下移植成骨实验。
实验步骤如下：
提供基质胶(BD Matrigel,356234)0.05mL，加入5×106干细胞，重悬混匀，得到复合材料。
使用10只免疫缺陷小鼠(雄性，8-10周)，分为2组，BMSCs组和CX43+FGFR2+组。将免疫缺陷老鼠进行麻醉消毒，用手术刀在右侧背部切开1cm切口，取出右侧肾脏，在肾下级划开一个小切口，用移液枪将5μL的复合材料(含有5×105个细胞)植入肾囊膜下，用烧灼器封闭肾囊膜切口，缝合皮肤切口。8周后，将动物安乐死，取出肾脏，固定、脱水，进行冰冻切片并用丽春红进行染色。结果如图7和图8所示，其中，图7为肾囊膜下新生骨丽春红染色结果图，图8为新生骨面积统计结果对比图。
从图7和图8可以看出，不仅实施例分离出的干细胞能够在小鼠的肾囊膜下成功形成新生骨，而且，相较对比例1，实施例分离出的干细胞对应的实验组形成的新生骨面积更大，说明，相较传统的BMSCs，实施例分离出的干细胞具有更强的成骨能力。
实验例3
(1)提供治疗骨缺损的试剂盒，所述试剂盒包括含有实施例制得的干细胞的干细胞悬液2mL(细胞浓度为2×104个/μL)，明胶海绵(尺寸：2*2*0.2cm，4片)。使用前，将500μL干细胞悬液加入到一片明胶海绵，制成支架，支架中含有1×107个干细胞。
(2)用新西兰雄兔(15只，2月龄)构建股骨外侧髁骨缺损模型，具体方法为应用电钻在兔子右侧股骨外侧髁造成直径为8mm，深度为6mm的缺损。将15只新西兰雄兔随机分为三组(每组5只)：缺损组(defect)、对比例治疗组(BMSCs)和实施例干细胞治疗组(CX43+FGFR2+)。其中：缺损组为只造模不进行任何的治疗；对比例治疗组为在缺损填塞含有1×107个BMSCs细胞的明胶海绵；实施例干细胞治疗组为在缺损填塞步骤(1)制得的支架。8周后进行取材，然后进行micro-CT检测。结果如图9-13所示，其中：
图9为缺损组、对比例治疗组和实施例干细胞治疗组的外侧髁骨的micro-CT图，图10为缺损组、对比例治疗组和实施例干细胞治疗组在缺损处的新生骨骨体积分数统计图，图11为缺损组、对比例治疗组和实施例干细胞治疗组在缺损处的新生骨骨小梁数量统计图；图12为缺损组、对比例治疗组和实施例干细胞治疗组的外侧髁骨的HE染色图，图13为缺损组、对比例治疗组和实施例干细胞治疗组的外侧髁骨的番红固绿染色图。
结果分析：实施例CX43+FGFR2+干细胞治疗组成功在兔子右侧股骨外侧髁的缺损处形成新生骨；且，从图9-10中可以看出相同时间内，实施例CX43+FGFR2+干细胞治疗组在缺损处的新生骨体积分数明显多于BMSCs治疗组，而且，实施CX43+FGFR2+干细胞治疗组在缺损处的新生骨小梁的数目也显著高于BMSCs治疗组；从图12和13中可以看出新生骨与邻近的天然组织结合良好，形态正常。说明本申请提供的干细胞与传统的BMSCs相比具有更强的成骨能力，能够更有效地治疗骨缺损，缩短骨修复时间，显著提高预后效果。
以上对本申请实施例所提供的干细胞及其制备方法和应用、及标记组合物及其应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

Claims (10)

1.一种干细胞，其特征在于，所述干细胞表达的标记物包括CX43和FGFR2。
2.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，所述干细胞为CX43和FGFR2阳性。
3.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，所述干细胞包含以下基因标记中的至少一种：FKBP11、PTN、TNN、TNC、OMD、ACTA2以及MARCKS。
4.根据权利要求1所述的干细胞，其特征在于，所述干细胞为间充质干细胞；和/或，
所述干细胞源自人源干细胞或动物干细胞。
5.一种干细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供细胞群样品和抗体组合物，所述抗体组合物包括抗-CX43抗体和抗-FGFR2抗体；
利用所述抗体组合物对所述细胞群样品进行染色；
分离出所述细胞群样品中对CX43阳性及对FGFR2阳性的细胞，得到干细胞。
6.一种标记组合物，用于筛选或鉴定干细胞，其特征在于，包括CX43和FGFR2。
7.根据权利要求6所述的标记组合物，其特征在于，还包括FKBP11、PTN、TNN、TNC、OMD、ACTA2以及MARCKS中至少一种基因的表达产物。
8.一种如权利要求6或7所述的标记组合物在制备用于分离或鉴定干细胞的试剂盒上的应用。
9.一种干细胞在制备治疗骨缺损用品中的应用，其特征在于，所述干细胞包括权利要求1至4任一项所述的干细胞，或者，所述干细胞包括由权利要求5所述的制备方法制得的干细胞，或者，所述干细胞包括表达如权利要求6或7所述的标记组合物的干细胞；
所述治疗骨缺损用品包括治疗骨缺损的药物、治疗骨缺损的材料或治疗骨缺损的试剂盒。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述治疗骨缺损的药物包括所述干细胞和药学上可接受的载体；和/或，
所述治疗骨缺损的材料包括组织工程骨材料、骨缺损支架材料、骨缺损复合修复材料中的任意一种；和/或，
所述治疗骨缺损用品的应用对象为人或动物。
CN202211737365.3A 2022-12-30 2022-12-30 干细胞及其制备方法和应用、及标记组合物及其应用 Pending CN116162589A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211737365.3A CN116162589A (zh) 2022-12-30 2022-12-30 干细胞及其制备方法和应用、及标记组合物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211737365.3A CN116162589A (zh) 2022-12-30 2022-12-30 干细胞及其制备方法和应用、及标记组合物及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116162589A true CN116162589A (zh) 2023-05-26

Family

ID=86410710

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211737365.3A Pending CN116162589A (zh) 2022-12-30 2022-12-30 干细胞及其制备方法和应用、及标记组合物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116162589A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6687757B2 (ja) ３ｄ軟骨オルガノイドブロックを調製するための方法
KR100907248B1 (ko) 분화된 어린 지방 세포와 생분해성 중합체의 이식에 의한신체의 부피 대체 방법
KR101669009B1 (ko) 순수 영양막층으로부터 유래된 줄기세포 및 이를 포함하는 세포치료제
Fisher et al. Stem cells for bone regeneration: from cell-based therapies to decellularised engineered extracellular matrices
EA008619B1 (ru) Применение неограниченных соматических стволовых клеток (ussc) для получения лекарственного средства
Rumiński et al. Osteogenic differentiation of human adipose-derived stem cells in 3D conditions-comparison of spheroids and polystyrene scaffolds
CN103555655A (zh) 自脐带羊膜分离和培养干/祖细胞及其分化的细胞的应用
EP3719117A1 (en) Ectodermal mesenchymal stem cells and method for producing same
Sanjurjo-Rodriguez et al. Ovine mesenchymal stromal cells: morphologic, phenotypic and functional characterization for osteochondral tissue engineering
KR101178153B1 (ko) 신규한 줄기세포주, 이의 이용 및 배양 방법
LaNasa et al. Influence of ECM proteins and their analogs on cells cultured on 2-D hydrogels for cardiac muscle tissue engineering
KR101389851B1 (ko) 신경능선줄기세포의 배양방법 및 그 용도
CN111690686A (zh) 一种miRNA高表达在促进脐带间充质干细胞体外增殖和成骨分化方面的应用
CN116162589A (zh) 干细胞及其制备方法和应用、及标记组合物及其应用
CN113430171B (zh) 一种转染miRNA的细胞膜片及其应用
CN114480261B (zh) 一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法
KR20190141137A (ko) 근육 유래 전구체 세포로부터 분화된 세포를 수득하는 방법
US20210180018A1 (en) Composition for promoting stem cell differentiation, comprising progenitor cell culture solution and multilayer graphene film, and use thereof
WO2019189947A1 (ja) ヒト臍帯由来間葉系幹細胞から骨芽細胞の製造を目的としたアクチン重合阻害剤による分化誘導技術
CN115040693B (zh) 含cd56+亚细胞群来源外泌体的生物材料及其制备方法
US20230248776A1 (en) Osteoblasts differentiated from mesenchymal stem cells and composition for treating bone disease comprising same
CN115025288B (zh) 一种外泌体水凝胶混合体系及其制备方法
Liao et al. MSX1+ PDGFRAlow limb mesenchyme-like cells as an efficient stem cell source for human cartilage regeneration
Dabaghi et al. Allografts for partial meniscus repair: an in vitro and ex vivo meniscus culture study
Singh et al. Isolation and culture of porcine mesenchymal stem cells from adipose tissue

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination