WO2016043286A1

WO2016043286A1 - スクリーニング方法、単離された間葉系幹細胞の調製方法及び間葉系幹細胞単離デバイス

Info

Publication number: WO2016043286A1
Application number: PCT/JP2015/076560
Authority: WO
Inventors: 一郎関矢; 宗田　大
Original assignee: 国立大学法人東京医科歯科大学
Priority date: 2014-09-18
Filing date: 2015-09-17
Publication date: 2016-03-24

Abstract

　間葉系幹細胞を含む組織から、外部への間葉系幹細胞の放出を調節する候補物質のスクリーニング方法、単離された間葉系幹細胞の調製方法、及び間葉系幹細胞単離デバイスを提供する。　間葉系幹細胞を含む組織から外部への前記間葉系幹細胞の生体内における放出を調節する候補物質のスクリーニング方法は、被験物質を含む、間葉系幹細胞の培養液が収容された培養容器において、間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部が培養液中に位置し、かつ、間葉系幹細胞を含む組織が培養容器の底面に接しないように位置した状態に、間葉系幹細胞を含む組織及び培養液を配置する工程と、間葉系幹細胞を含む組織から放出され得る間葉系幹細胞を、該組織の下方で回収する工程と、回収された間葉系幹細胞に基づき、候補物質を選択する工程と、を有する。

Description

スクリーニング方法、単離された間葉系幹細胞の調製方法及び間葉系幹細胞単離デバイス

　本発明は、スクリーニング方法、単離された間葉系幹細胞の調製方法及び間葉系幹細胞単離デバイスに関する。

　間葉系幹細胞は、滑膜、骨膜、脂肪組織、筋肉組織等の種々の生体の間葉系組織から単離可能な、優れた自己再生能と多分化能を有する幹細胞であることが知られており、細胞治療の細胞源として期待されている。

　特許文献１には、滑膜由来の間葉系幹細胞をｅｘ　ｖｉｖｏで培養し、培養した軟骨欠損部又は半月板欠損部に移植して、軟骨細胞に分化させることによって、軟骨欠損部又は半月板欠損部でｉｎ　ｓｉｔｕで軟骨組織を再生させる、軟骨欠損又は半月板欠損に関連する疾患の治療方法が開示されている。

　ところで、間葉系幹細胞は、関節内組織が損傷すると、間葉系幹細胞を含む組織から間葉系幹細胞が放出され、損傷した組織に接着されることが知られており、間葉系幹細胞はこのような作用により損傷した組織の修復に寄与するものと考えられている。すなわち、関節内の組織が損傷すると、放出された間葉系幹細胞によって自然治癒が行われると考えられている。

国際公開第２００８／０２３８２９号

　しかしながら、間葉系幹細胞を含む組織から放出され、損傷した組織に接着する間葉系幹細胞には限りがあるため、自然治癒のみでは、損傷した組織の治療としては十分でない。したがって、より多くの間葉系幹細胞を、組織から放出させる必要性がある。

　また、単離された間葉系幹細胞は、再生医療や、研究開発においてニーズがある。

　本発明は以上の実情に鑑みてなされたものであり、間葉系幹細胞を含む組織から、外部への間葉系幹細胞の放出を調節する候補物質のスクリーニング方法、単離された間葉系幹細胞の調製方法、及び間葉系幹細胞単離デバイスを提供することを目的とする。

　本発明者らは、間葉系幹細胞を含む組織を培養液に浮遊させることで、組織の外部に間葉系幹細胞が放出されることを見出し、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。

　（１）　間葉系幹細胞を含む組織から外部への前記間葉系幹細胞の生体内における放出を調節する候補物質のスクリーニング方法であって、
　被験物質を含む、間葉系幹細胞の培養液が収容された培養容器において、前記組織の少なくとも一部が前記培養液中に位置し、かつ、前記組織が前記容器の底面に接しないように位置した状態に、前記組織及び前記培養液を配置する工程と、
　前記組織から放出され得る前記間葉系幹細胞を、前記組織の下方で回収する工程と、
　回収された前記間葉系幹細胞に基づき、前記候補物質を選択する工程と、を有する、スクリーニング方法。

　（２）　前記組織が、繊維性組織である、（１）に記載のスクリーニング方法。

　（３）　前記候補物質が、組織修復剤である、（１）又は（２）に記載のスクリーニング方法。

　（４）　間葉系幹細胞の培養液が収容された培養容器において、間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部が前記培養液中に位置し、かつ、前記組織が前記容器の底面に接しないように位置した状態に、前記組織及び前記培養液を配置することで外部へ前記間葉系幹細胞を放出させる工程と、
　放出された前記間葉系幹細胞を、前記組織の下方で回収する工程と、を有する、単離された間葉系幹細胞の調製方法。

　（５）　間葉系幹細胞の培養液が収容される培養容器、及び／又は間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部を前記培養液中に配置可能でありかつ前記組織が前記容器の底面に接しないように配置可能な手段を含む、間葉系幹細胞単離デバイス。

　本発明によれば、間葉系幹細胞を含む組織から、外部への間葉系幹細胞の放出を調節する候補物質のスクリーニング方法、単離された間葉系幹細胞の調製方法、及び間葉系幹細胞単離デバイスを提供することができる。

本発明のスクリーニング方法において、間葉系幹細胞を含む組織から、外部へ間葉系幹細胞が放出される放出系の一態様を示す図である。本発明の一実施例に係る放出系から放出された間葉系幹細胞について、クリスタル・バイオレット染色を行った後の画像を示す図である。（ａ）は、実施例１に係る間葉系幹細胞の画像を示し、（ｂ）は実施例２に係る間葉系幹細胞の画像を示す。本発明の一実施例に係る放出系から放出された間葉系幹細胞について、クリスタル・バイオレット染色を行った後の画像を示す図である。（ａ）は、実施例３に係る間葉系幹細胞の画像を示す。（ｂ）は実施例４に係る間葉系幹細胞の画像を示す。（ｃ）は実施例５に係る間葉系幹細胞の画像を示す。（ｄ）は実施例６に係る間葉系幹細胞の画像を示す。（ｅ）は実施例７に係る間葉系幹細胞の画像を示す。（ｆ）は実施例８に係る間葉系幹細胞の画像を示す。（ｇ）は実施例９に係る間葉系幹細胞の画像を示す。本発明の一実施例に係る放出系から放出された間葉系幹細胞について、クリスタル・バイオレット染色を行った後の画像を示す図である。（ａ）は、実施例１０に係る間葉系幹細胞の画像を示す。（ｂ）は実施例１１に係る間葉系幹細胞の画像を示す。

　以下、本発明の具体的な実施形態について詳細に説明するが、本発明は以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、本発明の目的の範囲内において、適宜変更を加えて実施することができる。なお、説明が重複する箇所については、適宜説明を省略する場合があるが、発明の要旨を限定するものではない。

　＜スクリーニング方法＞
　本発明のスクリーニング方法は、間葉系幹細胞を含む組織から外部への間葉系幹細胞の生体内における放出を調節する候補物質のスクリーニング方法であって、被験物質を含む、間葉系幹細胞の培養液が収容された培養容器において、間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部が培養液中に位置し、かつ、間葉系幹細胞を含む組織が培養容器の底面に接しないように位置した状態に、間葉系幹細胞を含む組織及び培養液を配置する工程と、間葉系幹細胞を含む組織から放出され得る間葉系幹細胞を、該組織の下方で回収する工程と、回収された間葉系幹細胞に基づき、候補物質を選択する工程と、を有する。本発明は、これにより、間葉系幹細胞を含む組織から、外部への間葉系幹細胞の放出を調節する候補物質をスクリーニングすることができる。
　以下、各工程について詳細に説明する。

　（配置工程）
　配置工程は、被験物質を含む、間葉系幹細胞の培養液が収容された培養容器において、間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部が培養液中に位置し、かつ、間葉系幹細胞を含む組織が培養容器の底面に接しないように位置した状態に、間葉系幹細胞を含む組織及び培養液を配置する工程である。

　間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞の培養液が収容された培養容器において、間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部が培養液中に位置し、かつ、間葉系幹細胞を含む組織が容器の底面に接しないように位置した状態にあることで、該組織の外部へ放出される。その放出系について、図１に示す実施形態の放出系１を用いて説明する。

　図１に示す実施形態の放出系１では、培養容器１１と、培養液１２と、間葉系幹細胞を含む組織１３と、吊部１４と、受部１５と、蓋部１６と、を用いる。

　図１に示す放出系１では、培養容器１１に培養液１２が収容され、培養容器１１の底には、受部１５が培養液１２中に浸された状態で配置される。培養容器１１の上部には、蓋部１６が設けられ、蓋部１６の下面には、吊部１４が取り付けられる。吊部１４の下方には、間葉系幹細胞を含む組織１３が取り付けられ、間葉系幹細胞を含む組織１３の少なくとも一部は、培養液１２に接するように配置され、かつ、間葉系幹細胞を含む組織１３が受部１５の底面１５１に接しないように配置される。

　受部１５は、間葉系幹細胞を含む組織１３から放出された間葉系幹細胞１３１を回収するために用いられる部材であるが、受部１５を用いずに、培養容器１１で、間葉系幹細胞１３１を回収してもよい。受部１５を用いない場合、間葉系幹細胞を含む組織１３の少なくとも一部は、培養液１２に接するように配置され、かつ、間葉系幹細胞を含む組織１３が培養容器１１の底面１１１に接しないように配置される。

　以上で述べた図１で示す放出系１は、本発明の一態様である。間葉系幹細胞が放出させるために重要なことは、間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部が培養液に接するように位置し、かつ、間葉系幹細胞を含む組織が受部の底面又は培養容器の底面に接しないように位置した状態に、間葉系幹細胞を含む組織を配置することである。間葉系幹細胞を含む組織は、受部の底面又は培養容器の底面に接すると、間葉系幹細胞の組織からの放出がされにくい。実際、滑膜の組織を培養しても、間葉系幹細胞の細胞がほとんど得られないと考えられていた（Ｓｅｋｉｙａ　ｅｔ　ａｌ，．ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＯＲＴＨＯＰＡＥＤＩＣ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ，Ｖｏｌ．２６（１０）Ｏｃｔｏｂｅｒ　２００８，ｐｐ１４１３－１４１８）。これに対し、本発明は、間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部が培養液に接し、かつ、間葉系幹細胞を含む組織が受部の底面又は培養容器の底面に接しないように配置された状態に置くことで、間葉系幹細胞の放出が促進される。そのため、間葉系幹細胞を含む組織から、外部への間葉系幹細胞の放出を調節する候補物質のスクリーニングに用いることができる。間葉系幹細胞を含む組織は、少なくとも一部が培養液に接すればよいが、間葉系幹細胞を放出させやすいことから、全部が接することが好ましい。また、間葉系幹細胞を含む組織は、受部及び／又は培養容器の側壁に接してもよいが、間葉系幹細胞がより放出されやすくなることから、受部及び／又は培養容器の側壁に、少なくとも一部が接しないことが好ましく、全部が接しないことがより好ましい。

　培養容器は、特に限定されず、従来の公知の細胞培養に用いる培養容器を用いることができる。図１に示す実施形態での培養容器では、培養液を収容できる箇所を１つしか有さないが、培養容器に培養液を収容する箇所を複数設けてもよい。例えば、多数のウェルを備えるプレート（９６ウェルプレート等）を培養容器として用いることができる。これにより、複数の被験物質を同時にスクリーニングすることができる。

　培養液は、間葉系幹細胞を培養可能なものであれば、特に限定されず、従来の公知の培養液を用いることができる。培養液としては、例えば、αＭＥＭ（α‐Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＤＭＥＭ（Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＥＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）、Ｈａｍ　Ｆ１２、Ｈａｍ　Ｆ１０、Ｆ１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｏｆ　Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２）、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ　Ｌ－１５　ｍｅｄｉｕｍ、ＭｃＣｏｙ’ｓ　５Ａ、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９（１９９培地）等が挙げられるが、特にこれらに限定されない。

　間葉系幹細胞を含む組織は、特に限定されず、間葉系幹細胞を含む種々の間葉系の組織を使用可能であるが、例えば、滑膜、骨膜、筋肉、皮下脂肪、骨組織、靭帯、腱、半月板等が挙げられる。これらのうち、滑膜、膝蓋下脂肪体、半月板が、間葉系幹細胞の放出の促進に優れる点で、好ましく、滑膜を用いることが最も好ましい。また、間葉系幹細胞を含む組織は、繊維性組織又は脂肪性組織のいずれでも用いることができるが、間葉系幹細胞の放出の促進に優れる点で、繊維性組織を用いるのが好ましい。別の観点で、スクリーニングには大量の組織を用いる必要があるが、脂肪性組織は安価であるため、コストを安価に抑えれる観点からは、脂肪性組織を用いるのが好ましい。

　吊部は、特に限定されず、例えば、針金状の部材を用いてもよく、あるいは、糸状の部材を用いてもよい。

　図１に示す実施例形態では、吊部を用いたが、間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部を間葉系幹細胞の培養液に接し、かつ、間葉系幹細胞を含む組織が受部の底面又は培養容器の底面に接しないように配置可能な手段であれば、吊部に限定されず、いずれの手段を用いることができる。そのような手段としては、吊部の他に、例えば、培養液に浮く部材を用いることができる。培養液に浮く部材を、間葉系幹細胞を含む組織に取り付けることで、培養液の上部に浮遊させた状態を維持可能であるため、このような培養液に浮く部材によると、該組織の少なくとも一部を間葉系幹細胞の培養液に接し、かつ、間葉系幹細胞を含む組織が受部の底面又は培養容器の底面に接しないように配置可能である。培養液に浮く部材としては、例えば、発泡スチロール、ウレタン、木材等が挙げられる。

　受部は、放出された間葉系幹細胞を回収可能な部材であれば、特に限定されず、例えば、図１に示すようなディッシュ状の部材を使用することができる。ただし、上述のとおり、受部は使用しなくてもよい。

　図１に示す実施形態では、蓋部を培養容器の上部に設けたが、蓋部を設けなくてもよい。例えば、蓋部を設けない場合、吊部は、一端を培養容器のいずれかに固定することで、吊部の他端に取り付けられた間葉系幹細胞を含む組織を所望に位置に配置することができる。あるいは、蓋部を設けない場合、吊部を、培養容器の上方に配置された別の部材に取り付けてもよい。この場合、例えば、上述のように、多数のウェルを備えるプレートを培養容器として用い、該別の部材が各ウェルの上方を移動可能となるように構成し、各ウェル中の培養液に異なる被験物質を含めるように構成してもよい。放出系をこのような構成にすることで、ある間葉系幹細胞を含む組織を用いて、１つのウェルで被験物質について評価を行った後、該別の部材を用いて各ウェルの上方から、該ウェルとは異なる被験物質を含むウェルに間葉系幹細胞を含む組織を移動させることで、ハイスループットのスクリーニングが可能となる。

　被験物質は、特に限定されず、天然又は合成の有機又は無機の低分子又は高分子物質等の任意の物質であってよい。

　配置工程において、培養液の温度は、特に限定されないが、通常の間葉系幹細胞を培養する温度（例えば、３７℃）に設定することができる。また、配置工程の時間は、特に限定されず、例えば、０．５～１０日間、配置することができるが、本発明は、間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部が培養液中に位置し、かつ、間葉系幹細胞を含む組織が培養容器の底面に接しないように位置した状態に間葉系幹細胞を含む組織及び培養液を配置することで、１日以下で、間葉系幹細胞の放出を略完了させることができる。

　配置工程において、間葉系幹細胞を含む組織及び培養液を配置する際に、どのような順番で行ってもよい。例えば、培養容器に培養液を収容した後に、間葉系幹細胞を含む組織を上記状態においてもよく、あるいは、図１の実施形態の放出系１を用いた場合、間葉系幹細胞を含む組織を吊部１４に取り付け、吊部１４を図１のように培養容器１１、蓋部１６に取り付けた状態にした後に、培養液１２を培養容器１１に収容することで上記状態においてもよい。

　（回収工程）
　回収工程は、間葉系幹細胞を含む組織から得る間葉系幹細胞を、該組織の下方で回収する工程である。

　回収は、間葉系幹細胞を含む組織の下方で行えば、どのような方法で行ってもよく、例えば、図１に示す実施形態のように、間葉系幹細胞を含む組織の下方に放出された間葉系幹細胞を、受部で集めて回収してもよく、あるいは、受部を用いない場合、培養容器の底で間葉系幹細胞を集めて回収してもよい。

　受部又は培養容器の底の形状は、特に限定されないが、例えば、扁平状であると、回収した間葉系幹細胞が、所定の箇所に集まり、凝集しやすくなるため、平板状であることが好ましい。

　（選択工程）
　選択工程は、回収された間葉系幹細胞に基づき、候補物質を選択する工程である。

　候補物質の選択は、間葉系幹細胞の放出の程度を測定し、その結果に基づいて、行うことができる。間葉系幹細胞の放出の程度の測定方法は、特に限定されず、例えば、所要の時間、間葉系幹細胞を含む組織を、上記の放出工程のとおりに配置し、回収された間葉系幹細胞のコロニーの数、コロニーの大きさ、間葉系幹細胞の数等を測定することで、間葉系幹細胞の放出の程度を測定することができる。測定には、従来の公知の方法を用いることができ、例えば、（細胞コロニーに対して）クリスタル・バイオレット染色（石灰化に対して）アリザリン・レッド染色、（脂肪滴に対して）オイル・レッド－Ｏ等の染色等を用いることができる。偏光顕微鏡で未染色の状態でも細胞の観察は可能である。

　上記で述べた候補物質を用いた測定の結果が、ネガティブコントロールの測定結果より間葉系幹細胞の放出の程度が上昇又は減少していることを確認することで、候補物質として被験物質を選択することができる。候補物質を用いたものにおいて間葉系幹細胞の放出の程度が上昇した場合、その候補物質は、間葉系幹細胞の放出の促進剤の有効成分の候補物質であり、減少した場合、その候補物質は、間葉系幹細胞の放出の抑制剤の有効成分の候補物質である。選択は、比較対象より、間葉系幹細胞のコロニーの数、コロニーの大きさ、間葉系幹細胞の数等の数値の上昇又は減少していることを確認することで、候補物質として被験物質を選択してもよく、あるいは、所要の間葉系幹細胞のコロニーの数、コロニーの大きさ、間葉系幹細胞の数に達する時間が、比較対象より短いこと又は長いことを確認することで、候補物質として被験物質を選択してもよい。

　本発明のスクリーニング方法において、被験物質から選択された候補物質の用途は、特に限定されないが、候補物質が、間葉系幹細胞の放出を促進可能な候補物質であった場合（つまり、間葉系幹細胞の放出の促進剤の有効成分の候補物質である場合）、損傷した組織を修復することが可能であるため、組織修復剤として用いることができる。また、候補物質が、間葉系幹細胞の放出を抑制可能な候補物質であった場合（つまり、間葉系幹細胞の放出の抑制剤の有効成分の候補物質である場合）、その候補物質が生体内で産生される物質（例えば、タンパク質、核酸）であれば、その候補物質の活性を阻害する物質は、間葉系幹細胞の放出の促進剤として使用できる可能性がある。よって、その候補物質は、間葉系幹細胞の放出の促進剤のスクリーニングに用いることができる。その候補物質の活性を阻害する物質が公知であれば、その阻害物質が、間葉系幹細胞の放出の促進剤として使用できる可能性があることを示す。

　本発明において、候補物質のスクリーニングとは、選択された候補物質のいずれもが間葉系幹細胞の生体内での放出を調節する物質であることに限定されない。被験物質の群に比べ、選択された候補物質の群の方が、間葉系幹細胞の生体内での放出を調節する物質の存在比率が高ければよい。したがって、本発明において、選択された候補物質を、ｉｎ　ｖｉｖｏで間葉系幹細胞の生体内での放出を調節する機能を有するか否かを評価し、陽性評価に基づき生体内での放出を調節する物質を選抜する工程を更に行ってもよい。

　＜単離された間葉系幹細胞の調製方法＞
　本発明は、単離された間葉系幹細胞の調製方法を包含する。

　単離された間葉系幹細胞の調製方法は、間葉系幹細胞の培養液が収容された培養容器において、間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部が培養液中に位置し、かつ、間葉系幹細胞を含む組織が培養容器の底面に接しないように位置した状態に、間葉系幹細胞を含む組織及び培養液を配置することで外部へ間葉系幹細胞を放出させる工程と、放出された間葉系幹細胞を、間葉系幹細胞を含む組織の下方で回収する工程と、を有する。

　（放出工程）
　放出工程は、間葉系幹細胞の培養液が収容された培養容器において、間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部が培養液中に位置し、かつ、間葉系幹細胞を含む組織が培養容器の底面に接しないように位置した状態に、間葉系幹細胞を含む組織及び培養液を配置することで外部へ間葉系幹細胞を放出させる工程である。

　単離された間葉系幹細胞の調製方法において、放出工程は、上記スクリーニング方法の配置工程と同様の方法により、行うことができる。

　（回収工程）
　回収工程は、放出された間葉系幹細胞を、間葉系幹細胞を含む組織の下方で回収する工程である。

　間葉系幹細胞の調製方法において、回収工程は、上記スクリーニング方法の回収工程と同様の方法を用いることができる。

　回収した間葉系幹細胞の用途は、特に限定されないが、再生医療や、研究開発に好適に用いることができる。

　＜間葉系幹細胞単離デバイス＞
　本発明は、間葉系幹細胞単離デバイスを包含する。

　本発明の間葉系幹細胞単離デバイスは、間葉系幹細胞の培養液が収容される培養容器、及び／又は間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部を培養液中に配置可能でありかつ該組織が培養容器の底面に接しないように配置可能な手段を含む。間葉系幹細胞単離デバイスは、上記のスクリーニング方法、単離された間葉系幹細胞単離の調整方法に用いることができる。

　培養容器、間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部を培養液中に配置可能でありかつ該組織が培養容器の底面に接しないように配置可能な手段は、上記スクリーニング方法において用いられるものと、同様のものを用いることができる。

　間葉系幹細胞単離デバイスは、上記以外の部材を含んでもよく、含まなくてもよい。そのような部材としては、例えば、培養容器の蓋部、放出された間葉系幹細胞を回収するための受部、間葉系幹細胞を含む組織、培養液等が挙げられる。間葉系幹細胞を含む組織は、間葉系幹細胞が放出されない態様（例えば、液体に接さず、ラップ等で覆われ、外部の空気と接さないような態様）で、間葉系幹細胞単離デバイスに含まれるのが好ましい。本発明の間葉系幹細胞単離デバイスが、培養容器を含まない場合、上記のスクリーニング方法、単離された間葉系幹細胞単離の調整方法を行う際に、従来の公知の容器と併用することで、行ってもよい。

　＜単離された間葉系幹細胞の調製及び放出された間葉系幹細胞のコロニー数の測定＞
　（実施例１）
　図１に示す実施形態の放出系１を用い、単離された間葉系幹細胞の調製を行った。間葉系幹細胞を含む組織は、ヒト繊維性滑膜１ｇを用い、この滑膜をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。培養容器としては、１００ｍｌ容量の円柱状の容器を用いた。培養容中に、直径３ｃｍのディッシュを受部として配置し、培養液には、αＭＥＭ（１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ））４０ｍｌを用いた。蓋部には、１８Ｇで穴を２つ設けた。吊部には、４－０針付きナイロンを用いた。吊部の両末端を、それぞれ蓋部の穴に通し、吊部の両末端に滑膜を取り付け、滑膜の少なくとも一部が培養液に接し、かつ、間葉系幹細胞を含む組織が受部の底面接しないように配置されるように、吊部を固定し、間葉系幹細胞の放出系を構成した。放出系を構築した後、１週間、インキュベータで３７℃、５％ＣＯ_２の条件下に置いた。１週間後、ディッシュを取り出し、ＰＢＳで洗浄した後、ディッシュ中の間葉系細胞の固定を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて行った。その後、クリスタル・バイオレット染色を行い、間葉系幹細胞のコロニーの数を測定した。

　（実施例２）
　ヒト繊維性滑膜の代わりに、ヒト脂肪性滑膜を用いた以外は、実施例１と同様の方法で、間葉系幹細胞の放出系を構築し、実施例１と同様の方法により、間葉系幹細胞のコロニーの数を測定した。

　（評価結果１）
　図２は、クリスタル・バイオレット染色後の（ａ）実施例１に係る間葉系幹細胞の画像、（ｂ）実施例２に係る間葉系幹細胞の画像を示す。コロニー数は、実施例１に係る間葉系幹細胞は、１２０であり、実施例２に係る間葉系幹細胞は、１６であった。

　図２に示すように、実施例１、実施例２のいずれの放出系においても、間葉系幹細胞の放出が確認された。特に、繊維性滑膜の方が、間葉系幹細胞の放出量が多いことが確認された。なお、データは示さないが、滑膜をディッシュに直接載せ、振とうさせる方法によって間葉系幹細胞の放出を試みたが、間葉系幹細胞の放出はみられなかった。また、トランスウェルに直接、間葉系幹細胞を含む組織を載せた状態で、間葉系幹細胞の放出を試みても、間葉系幹細胞の放出はみられなかった。これにより、間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部が培養液に接し、かつ、間葉系幹細胞を含む組織が受部の底面又は培養容器の底面に接しないように配置された状態に置くことで、該組織から間葉系幹細胞が放出されることが示された。これらの結果から、この放出系は、生体内において、間葉系幹細胞を含む組織が間葉系幹細胞を放出する機序を模倣しているものと考えられる。したがって、この放出系中の培養液に被験物質を配合し、間葉系幹細胞の放出の促進の程度を測定することで、間葉系幹細胞の放出を調節する候補物質のスクリーニングが可能であることが示された。

　（実施例３）
　実施例２と同様の方法で放出系を構築した後、１日間、インキュベータで３７℃、５％ＣＯ_２の条件下に置いた。１日後、間葉系幹細胞が放出されたディッシュを取り出し、６日間、インキュベータ（３７℃、５％の条件下）で、ディッシュ中の間葉系幹細胞の培養を行った。６日後、インキュベータからディッシュを取り出し、ＰＢＳで洗浄した後、ディッシュ中の間葉系細胞の固定を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて行った。その後、クリスタル・バイオレット染色を行い、間葉系幹細胞のコロニーの数を測定した。

　（実施例４）
　実施例２と同様の方法で放出系を構築した後、２日間、インキュベータで３７℃、５％ＣＯ_２の条件下に置いた。２日後、間葉系幹細胞が放出されたディッシュを取り出し、５日間、インキュベータ（３７℃、５％の条件下）で、ディッシュ中の間葉系幹細胞の培養を行った。５日後、インキュベータからディッシュを取り出し、ＰＢＳで洗浄した後、ディッシュ中の間葉系細胞の固定を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて行った。その後、クリスタル・バイオレット染色を行い、間葉系幹細胞のコロニーの数を測定した。

　（実施例５）
　実施例２と同様の方法で放出系を構築した後、３日間、インキュベータで３７℃、５％ＣＯ_２の条件下に置いた。３日後、間葉系幹細胞が放出されたディッシュを取り出し、４日間、インキュベータ（３７℃、５％の条件下）で、ディッシュ中の間葉系幹細胞の培養を行った。４日後、インキュベータからディッシュを取り出し、ＰＢＳで洗浄した後、ディッシュ中の間葉系細胞の固定を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて行った。その後、クリスタル・バイオレット染色を行い、間葉系幹細胞のコロニーの数を測定した。

　（実施例６）
　実施例２と同様の方法で放出系を構築した後、４日間、インキュベータで３７℃、５％ＣＯ_２の条件下に置いた。４日後、間葉系幹細胞が放出されたディッシュを取り出し、３日間、インキュベータ（３７℃、５％の条件下）で、ディッシュ中の間葉系幹細胞の培養を行った。３日後、インキュベータからディッシュを取り出し、ＰＢＳで洗浄した後、ディッシュ中の間葉系細胞の固定を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて行った。その後、クリスタル・バイオレット染色を行い、間葉系幹細胞のコロニーの数を測定した。

　（実施例７）
　実施例２と同様の方法で放出系を構築した後、５日間、インキュベータで３７℃、５％ＣＯ_２の条件下に置いた。５日後、間葉系幹細胞が放出されたディッシュを取り出し、２日間、インキュベータ（３７℃、５％の条件下）で、ディッシュ中の間葉系幹細胞の培養を行った。２日後、インキュベータからディッシュを取り出し、ＰＢＳで洗浄した後、ディッシュ中の間葉系細胞の固定を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて行った。その後、クリスタル・バイオレット染色を行い、間葉系幹細胞のコロニーの数を測定した。

　（実施例８）
　実施例２と同様の方法で放出系を構築した後、６日間、インキュベータで、３７℃、５％ＣＯ_２の条件下に置いた。６日後、間葉系幹細胞が放出されたディッシュを取り出し、１日間、インキュベータ（３７℃、５％の条件下）で、ディッシュ中の間葉系幹細胞の培養を行った。１日後、インキュベータからディッシュを取り出し、ＰＢＳで洗浄した後、ディッシュ中の間葉系細胞の固定を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて行った。その後、クリスタル・バイオレット染色を行い、間葉系幹細胞のコロニーの数を測定した。

　（実施例９）
　実施例２と同様の方法で放出系を構築した後、７日間、インキュベータで３７℃、５％ＣＯ_２の条件下に置いた。７日後、間葉系幹細胞が放出されたディッシュを取り出し、ＰＢＳで洗浄した後、ディッシュ中の間葉系細胞の固定を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて行った。その後、クリスタル・バイオレット染色を行い、間葉系幹細胞のコロニーの数を測定した。

　（評価結果２）
　図３は、クリスタル・バイオレット染色後の（ａ）実施例３に係る間葉系幹細胞の画像、（ｂ）実施例４に係る間葉系幹細胞の画像を示す。（ｃ）実施例５に係る間葉系幹細胞の画像、（ｄ）実施例６に係る間葉系幹細胞の画像、（ｅ）実施例７に係る間葉系幹細胞の画像、（ｆ）実施例８に係る間葉系幹細胞の画像、（ｇ）実施例９に係る間葉系幹細胞の画像をそれぞれ示す。コロニー数は、実施例１に係る間葉系幹細胞は、１２０個であり、実施例２に係る間葉系幹細胞は、１６個であり、実施例３に係る間葉系幹細胞は、４３個であり、実施例４に係る間葉系幹細胞は、７６個であり、実施例５に係る間葉系幹細胞は、８０個であり、実施例６に係る間葉系幹細胞は、４５個であり、実施例７に係る間葉系幹細胞は、５７個であり、実施例８に係る間葉系幹細胞は、４９個であり、実施例９に係る間葉系幹細胞は、５９個であった。

　図３に示すように、実施例３～９のいずれの放出系においても、間葉系幹細胞の放出が同程度であることが確認された。このことは、放出系を構築してから、最初の１日（２４時間）で、間葉系幹細胞の放出は略完了していることを意味する。この結果より、本発明の間葉系幹細胞の放出系において、間葉系幹細胞の放出は短い時間で完了するため、間葉系幹細胞の放出を調節する候補物質のスクリーニングを迅速に行うことが可能であることが示された。

　（実施例１０）
　ヒト繊維性滑膜の代わりに、ヒト脂肪性滑膜のうちの膝蓋下脂肪体の部位を用いた以外は、実施例１と同様の方法で、間葉系幹細胞の放出系を構築した。放出系を構築した後、１週間、インキュベータで３７℃、５％ＣＯ_２の条件下に置いた。１週間後、ディッシュを取り出し、ＰＢＳで洗浄した後、ディッシュ中の間葉系細胞の固定を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて行った。その後、クリスタル・バイオレット染色を行い、間葉系幹細胞のコロニーの数を測定した。

　（実施例１１）
　ヒト繊維性滑膜の代わりに、ヒト半月板を用いた以外は、実施例１と同様の方法で、間葉系幹細胞の放出系を構築した。放出系を構築した後、１週間、インキュベータで３７℃、５％ＣＯ_２の条件下に置いた。１週間後、ディッシュを取り出し、ＰＢＳで洗浄した後、ディッシュ中の間葉系細胞の固定を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて行った。その後、クリスタル・バイオレット染色を行い、間葉系幹細胞のコロニーの数を測定した。

　（評価結果３）
　図４は、クリスタル・バイオレット染色後の（ａ）実施例１０に係る間葉系幹細胞の画像、及び（ｂ）実施例１１に係る間葉系幹細胞の画像をそれぞれ示す。コロニー数は、実施例１０に係る間葉系幹細胞は、４０個であり、実施例１１に係る間葉系幹細胞は、５０個であった。

　図４に示すように、実施例１０、１１のいずれの放出系においても、間葉系幹細胞が放出されたことが確認された。この結果より、本発明の間葉系幹細胞の放出系において、繊維性滑膜、脂肪性滑膜だけでなく、半月板の組織においても、間葉系幹細胞の放出が促進されることがわかった。

　また、図には、示さないが、ヒト繊維性滑膜の代わりに、ヒトの後十字靱帯又は骨を用いた以外は、実施例１と同様の方法で、間葉系幹細胞の放出系を構築し、実施例１０、１１と同様の方法で組織から間葉系幹細胞が放出されるかを検証したところ、後十字靱帯、、及び骨のいずれの組織においても、間葉系幹細胞が得られた。このことから、本発明の間葉系幹細胞の放出系において、後十字靱帯及び骨のいずれの組織においても、間葉系幹細胞の放出が促進されることがわかった。

　＜間葉系幹細胞の分化能の確認＞
　上記の実施例１に係る間葉系幹細胞を用い、骨分化能、脂肪分化能、軟骨分化能を有するか確認を行った。

　（骨分化能の確認）
　１つのディッシュに１００ｃｅｌｌとなるように間葉系幹細胞を加え、２週間培養した。その後、培養に使用する培地を骨分化用の培地に代え、３週間培養した。培地は、１週間に１回新しい培地に代えた。骨分化用の培地は、α－ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ添加培地５５０ｍｌに、βＧＰ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｇ９８９１　β－ＧＬＹＣＥＲＯ　ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ　Ｄｉｓｏｄｉｕｍ　Ｓａｌｔ，Ｈｙｄｒａｔｅ）が１０ｍＭになるように（１．１９ｇ）、Ａ２Ｐ（ＳＩＧＭＡ社製、Ａ８９６０　Ａｓｏｃｒｂａｔｅ－２－ｐｈｏｓｐｈｔｅ）が５０μｇ／ｍｌとなるように、ＤＥＸ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｄ８８９３　Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）が１０^－９Ｍとなるように、それぞれ溶解した培地を用いた。３週間後、骨分化の有無について、アリザリン・レッド染色により観察して行ったところ、骨に分化したことが確認された。

　（脂肪分化能の確認）
　１つのディッシュに１００ｃｅｌｌとなるように間葉系幹細胞を加え、２週間培養した。その後、培養に使用する培地を脂肪分化用の培地に代えて、３週間培養した。培地は、１週間に１回新しい培地に代えた。脂肪分化用の培地は、α－ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地／ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ添加５５０ｍｌに、ＩＢＭＸ（ＳＩＧＭＡ社製　Ｉ７０１８　１Ｇ）が０．５ｍＭになるように（１．１９ｇ）、Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ社製　Ｉ７３７８　５Ｇ）が１００μＭとなるように、ＤＥＸ（ＳＩＧＭＡ社製　Ｄ８８９３　）が１０^－７Ｍとなるように、それぞれ溶解した培地を用いた。３週間後、脂肪分化の有無について、オイル・レッド－Ｏにより観察して行ったところ、脂肪に分化したことが確認された。

　（軟骨分化能の確認）
　２５０ｘ１０^３ｃｅｌｌの間葉系幹細胞を、５０ｍｌＦＡＬＣＯＮチューブへ移し、１０～２０ｍｌのＰＢＳを加えて、血清を除き、１５００ｒｐｍ／５ｍｉｎで遠心した。遠心後、上清を吸引し、軟骨分化用の培地（ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ１％、ＤＥＸ（ＳＩＧＭＡ社製、Ｄ８８９３　Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）１０^－７ｍｏｌ、ＴＧＦ‐β３　１０ｎｇ／ｍｌ、ＯＰ－１（ＢＭＰ－７）１０００ｎｇ／ｍｌ、ＩＴＳ（Ｉｎｓｕｌｉｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　Ｓｅｌｅｎｉｔｅ）１％）を加え、１５００ｒｐｍ／１０ｍｉｎで遠心した。遠心後、細胞を沈殿させたまま、培養を行った。培養は、３週間行い、培地の交換は、週に２回行った。３週間後、軟骨分化の有無について、トルイジン・ブルー染色により観察して行ったところ、軟骨に分化したことが確認された。

　以上の結果より、本発明の放出系を用いて回収された間葉系幹細胞は、骨分化能、脂肪分化能、軟骨分化能を有することが確認された。

　＜間葉系幹細胞の石灰化能の確認＞
　１つのディッシュに１００ｃｅｌｌsとなるように実施例１に係る間葉系幹細胞を加え、１週間完全培地（α－ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ／ペニシリン－ストレプトマイシン－アンホテリシンＢ添加培地）で培養した。その後、培地を石灰化用培地（完全培地に１ｎＭデキサメタゾン、２０ｍＭβ－グリセロールホスフェート（和光純薬工業株式会社製）、及び５０μｇ／ｍＬアスコルビンン酸－２－ホスフェートを加えたもの）に交換し、更に１４日間培養を行った。その後、ディッシュを１０％ホルマリンで固定し、４０ｍＭアリザリンレッドソリューションにより染色した。その結果、間葉系幹細胞が石灰化したことが確認された。

　＜間葉系幹細胞の陽性マーカーを用いた特異性の試験＞
　間葉系幹細胞の陽性マーカーを用いて、実施例１に係る間葉系幹細胞に対する特異性を試験した。

　具体的には、実施例１に係る間葉系幹細胞１００万ｃｅｌｌを、２０μｇ／ｍＬの抗体を含有する５００μＬ　ＦＡＣＳ染色バッファー（０．２％　ＢＳＡ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　Ｖ及び０．０９％　Ｓｏｄｉｕｍ　ａｚｉｄｅ　ｉｎ　ＰＢＳ）に懸濁した。４℃で、６０分間インキュベートし、その後、細胞をＰＢＳで洗浄して、１ｍＬのフローサイトメトロー分析用のＦＡＣＳ染色バッファーに再び懸濁した。間葉系幹細胞の陽性マーカーとしては、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５に対する抗体、具体的には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）、ペリジニンクロロフィルプロテイン－Ｃｙ５．５（ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５）又はアレキサフロオ－ル（登録商標名：Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ）６４７－結合抗体（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いた。アイソタイプのコントロールとして、ＦＩＴＣ－、ＰＥ－、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５－、又はＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　６４７－結合非特異的ラット　イムノグロブリンＧ（ＩｇＧ：Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を上記の抗体と置き換えて使用した。細胞の蛍光は、ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ装置（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いて、フローサイトメトローにより評価した。データは、ＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）により分析した。その結果、実施例１に係る間葉系幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５について、陽性であることが確認された。

　１　　　放出系
　１１　　培養容器
　１１１　培養容器の底面
　１２　　培養液
　１３　　間葉系幹細胞を含む組織
　１３１　間葉系幹細胞
　１４　　吊部
　１５　　受部
　１５１　受部の底面
　１６　　蓋部

Claims

　間葉系幹細胞を含む組織から外部への前記間葉系幹細胞の生体内における放出を調節する候補物質のスクリーニング方法であって、
　被験物質を含む、間葉系幹細胞の培養液が収容された培養容器において、前記組織の少なくとも一部が前記培養液中に位置し、かつ、前記組織が前記容器の底面に接しないように位置した状態に、前記組織及び前記培養液を配置する工程と、
　前記組織から放出され得る前記間葉系幹細胞を、前記組織の下方で回収する工程と、
　回収された前記間葉系幹細胞に基づき、前記候補物質を選択する工程と、を有する、スクリーニング方法。
　前記組織が、繊維性組織である、請求項１に記載のスクリーニング方法。
　前記候補物質が、組織修復剤である、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
　間葉系幹細胞の培養液が収容された培養容器において、間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部が前記培養液中に位置し、かつ、前記組織が前記容器の底面に接しないように位置した状態に、前記組織及び前記培養液を配置することで外部へ前記間葉系幹細胞を放出させる工程と、
　放出された前記間葉系幹細胞を、前記組織の下方で回収する工程と、を有する、単離された間葉系幹細胞の調製方法。
　間葉系幹細胞の培養液が収容される培養容器、及び／又は間葉系幹細胞を含む組織の少なくとも一部を前記培養液中に配置可能でありかつ前記組織が前記容器の底面に接しないように配置可能な手段を含む、間葉系幹細胞単離デバイス。