IT202100031517A1 - Metodo per l’ottenimento di cellule anti-fibrosi e cellule ottenute con il metodo - Google Patents

Metodo per l’ottenimento di cellule anti-fibrosi e cellule ottenute con il metodo Download PDF

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Description

Descrizione dell'invenzione intitolata:
?METODO PER L?OTTENIMENTO DI CELLULE ANTI-FIBROSI E CELLULE OTTENUTE CON IL METODO?.
CAMPO DI APPLICAZIONE
L?invenzione riguarda un metodo per ottenere le cellule modificate, generalmente utilizzabili per il prevenire oppure trattare la formazione di fibrosi nel rene, e le cellule modificate ottenibili con il metodo.
STATO DELLA TECNICA
? noto che esistono molte cause della fibrosi e del malfunzionamento del rene che hanno in comune la limitata capacit? dell?organo stesso di rigenerarsi dopo ripetute e consistenti lesioni.
Queste lesioni causano la attivazione e la migrazione di f?broblasti renali portando alla deposizione di proteine di matrice extra-cellulare, principalmente collagene, e alla secrezione di citochine che fanno da intermediari con le cellule del sistema immunitario nel processo noto come fibrosi (
?Disease Models and mechanisms?; 2016.9.1419-1433).
Il TGF ? rappresenta una delle pi? importanti citochine coinvolte nel processo fibrotico.
Questa citochina provoca la trasformazione delle cellule epiteliali in cellule fibroblastoidi, attraverso il processo noto come ?transizione epiteliomesenchimale? che ha come risultato l?incremento del numero di f?broblasti e una notevole deposizione di collagene ( ; J Clin Inv. 2003).
Basandosi su questo stato della tecnica nota, l?uso di un recettore decoy, capace di riconoscere ed interagire specificamente con TGF ?, quindi evitando il suo legame con le cellule epiteliali target, potrebbe rappresentare una possibile strategia di contrasto del processo di fibrosi ( International Journal of Biological Sciences 2011), in particolare per il tessuto renale (Border WA et al. Nature. 1992)
Cellule mesenchimali (di seguito anche brevemente CM) rappresentano il veicolo cellulare ideale per portare e rilasciare il recettore decoy del TGF ? nel rene fibrotico.
Esse hanno la capacit? di muoversi ed attecchire nel sito di danno poich? sono state reclutate da molecole solubili rilasciate nel flusso sanguigno da leucociti e cellule danneggiate ( Front Immunol. 2013).
Grazie alla loro presenza in numerosi tessuti (compresi tessuto adiposo, midollo osseo, cordone ombelicale), al loro facile isolamento, alla possibilit? di una manipolazione genetica e alla loro capacit? di non indurre una risposta immunogenica, esse rappresentano il vettore ideale nel portare composti a scopo terapeutico, come il recettore decoy del TGF ?, in approcci terapeutici a base di cellule.
Questo stato della tecnica ha alcuni inconvenienti.
Un inconveniente ? che la fibrosi renale ? trattata con terapie invasive ed invalidanti come la dialisi.
? noto che la dialisi aiuta i reni nella filtrazione del sangue dai suoi prodotti di scarto, ma non costituisce una cura per i soggetti che la utilizzano.
Infatti, ? un trattamento non risolutivo ed a seconda della gravit? delle condizioni del paziente dializzato, deve essere eseguita settimanalmente oppure giornalmente.
Un altro inconveniente ? che la dialisi, oltre ad essere molto dolorosa per i pazienti, ? anche psicologicamente invalidante, poich? porta ad un disagio per la persona e malesseri fisici che generano ipotensione, prurito, insonnia, dolore e disturbi della sessualit?.
A quanto sopra si aggiunge anche l?ulteriore inconveniente che la dialisi ? una terapia eseguibile solo in ospedale, obbligando i pazienti a spostarsi dalle proprie abitazioni per poter eseguire i trattamenti periodici e questo implica un ulteriore inconveniente quando i pazienti hanno difficolt? di deambulazione. Infatti, trattandosi di una terapia complessa, la dialisi necessita di specifici macchinari e dell?assistenza di personale sanitario che sia esperto nel loro uso. Ancora un inconveniente ? che la dialisi, oltre ad essere l?unico trattamento ad oggi conosciuto per la fibrosi del rene, ? anche una terapia molto costosa che ? posta a carico dei sistemi sanitari della Comunit? Europea per importi compresi tra i 14 ed i 15 miliardi di euro, includendo i costi dei macchinari, i costi dei reagenti, il costo del personale e dei posti letto ospedalieri.
In aggiunta, pazienti con malattia renale grave vanno incontro a trapianto cosa non sempre possibile e gravata da effetti collaterali e importanti costi sociosanitari.
Infine, si deve anche sottolineare un altro inconveniente e cio? che, nei casi in cui lo stato di fibrosi del rene risulti molto avanzato, non ? possibile usufruire della dialisi, poich? questa non porterebbe alcun beneficio alla funzionalit? del rene.
ESPOSIZIONE DEL TROVATO
Scopo dell?invenzione ? quello di superare gli inconvenienti sopra riscontrati, mettendo a punto CM modificate per il trattamento della fibrosi renale ed un metodo per l?ottenimento delle cellule modificate che permettano di risolvere gli inconvenienti esposti, in particolare che permettano di trattare definitivamente la fibrosi del rene, portando ad una risoluzione della patologia. Un ulteriore compito tecnico dell?invenzione ? quello di mettere a punto un nuovo trattamento per la fibrosi renale che non sia doloroso e psicologicamente invalidante.
Ancora un ulteriore compito tecnico dell?invenzione ? quello di poter essere somministrata come un farmaco, evitando ai pazienti di spostarsi in ospedale, essendo facilmente accessibile anche per le persone che hanno difficolt? deambulatone.
Un ulteriore compito tecnico dell?invenzione ? quello di ridurre in modo sensibile i costi a carico dei Sistemi Sanitari, non richiedendo l?uso di macchinari specifici e costosi per eseguire la dialisi, di personale esperto presente 24 ore su 24 in ospedale e di reagenti specifici.
Un ulteriore compito tecnico dell?invenzione ? quello di permettere il trattamento di pazienti affetti da stati di fibrosi del rene particolarmente avanzati, non pi? trattabili con la dialisi.
Secondo un aspetto dell? invenzione ? previsto un metodo per la produzione di CM modificate con un agente modificante, in accordo con le caratteristiche della rivendicazione 1.
Secondo un altro aspetto dell?invenzione, detto agente modificante ? scelto tra Decorina isoforma A, Decorina isoforma B, Decorina isoforma C, Decorina isoforma D, Decorina isoforma E, in accordo con la rivendicazione 3.
Secondo un altro aspetto dell?invenzione ? previsto un metodo per la produzione di CM modificate con un agente modificante ed esprimenti la molecola detta HLA-G con effetto anti-fibrogenico ed immunosoppressore, in accordo con le caratteristiche della rivendicazione 6.
Secondo un ulteriore aspetto dell?invenzione ? previsto un medicamento, in particolare per la prevenzione di fibrosi renale, in accordo con le caratteristiche della rivendicazione 14.
L?invenzione permette di ottenere i seguenti vantaggi:
- trattare i pazienti affetti da fibrosi renale ottenendone la guarigione completa, anche in caso di patologia ad uno stato avanzato;
- permettere il trattamento dei pazienti senza necessitare di specifici macchinari, di personale esperto, di materiali reagenti, riducendo sensibilmente i costi di trattamento;
- evitare la necessit? di spostamenti dei pazienti casa-ospedale e viceversa; - riduzione delle procedure di trapianto di rene
- eliminare ogni disagio e dolore ai pazienti trattati.
ILLUSTRAZIONE DEI DISEGNI
Ulteriori caratteristiche e vantaggi dell?invenzione risulteranno maggiormente evidenti dalla descrizione dettagliata di forme di realizzazione preferite, ma non esclusive, di CM modificate con un agente modificante, di un metodo per la produzione di CM modificate con un agente modificante, di un medicamento, in particolare per la prevenzione di fibrosi renale, tutte illustrate a titolo di esempio non limitativo nelle unite tavole di disegno in cui:
la FIG. 1 ? una rappresentazione grafica del vettore virale utilizzato per modificare le CM con il gene codificante per Decorina;
la FIG. 2 ? una rappresentazione grafica della quantit? di Decorina secreta nel terreno di coltura da parte di tre differenti fonti di CM, due donatori per ogni fonte, a tre differenti tempistiche;
la FIG. 3A ? una analisi rappresentativa al citofluorimetro di un campione di cellule mesenchimali endometriali (CM-ET) controllo per valutare la positivit? alla sequenza segnale della Decorina;
la FIG. 3B ? una analisi rappresentativa al citofluorimetro di un campione di CM-ET infettate per valutare la positivit? alla sequenza segnale della Decorina. Il campione modificato geneticamente risulta positivo al 89,5 %;
la FIG. 4 ? una rappresentazione grafica della quantit? di m-RNA per la Decorina, normalizzata sull?espressione basale in CM-ET non over-esprimenti Decorina;
la FIG. 5 ? una rappresentazione grafica della quantit? di Decorina secreta nel terreno di coltura per cellule controllo contro le cellule modificate per overesprimere Decorina, rilevata in tre diversi tempi;
la FIG. 6A ? un?analisi rappresentativa al citofluorimetro di un campione di CM isolate da tessuto adiposo (CM-TA) ed usate come controllo per valutare la positivit? alla sequenza segnale della Decorina;
la FIG. 6B ? un?analisi rappresentativa al citoflurimetro di un campione di CM-TA di controllo per valutare la positivit? alla sequenza segnale della Decorina. Il campione modificato geneticamente risulta positivo nel 54,5 % delle cellule in coltura;
la FIG. 7 ? una rappresentazione grafica della quantit? di m-RNA per la Decorina, normalizzata sull?espressione basale in CM non over-esprimenti la proteina target;
la FIG. 8 ? una rappresentazione grafica della quantit? di Decorina secreta nel terreno di coltura per cellule CM-TA controllo nel confronto con CM-TA modificate per over-esprimere Decorina, a tre differenti tempistiche;
la FIG. 9 ? una rappresentazione grafica del numero di fibroblasti da fibrosi idiopatica CC-7231 migrati in presenza/assenza delle CM-ET vettore vuoto e CM-ET esperimenti Decorina dopo 48 ore di coltura, sulla base di un saggio condotto su cellule isolate da tre donatori;
la FIG. 10 ? una rappresentazione grafica dell?espressione del gene Ki-67 come marker di proliferazione dei fibroblasti in co-coltura per 48 ore con CM-ET vettore vuoto e CM-ET esprimenti Decorina, sulla base di un saggio condotto su due donatori;
la FIG. 11 ? una rappresentazione grafica dell?espressione del gene aSMA, marcatore dell?attivit? pro-fibrotica dei fibroblasti in co-coltura per 48 ore con CM-ET vettore vuoto e CM-ET esprimente Decorina;
la FIG. 12 ? una rappresentazione grafica riassumente l?analisi tramite microscopia a scansione (SEM) di modelli 3D biomimetici di fibrosi ottenuti tramite tecnologia bioprinting;
la FIG. 13 ? la valutazione dell?espressione della proteina fibronectina in modelli 3D biomimetici di fibrosi ottenuti tramite tecnologia bioprinting utilizzando fibroblasti da derma;
la FIG. 14 ? la valutazione dell?espressione della proteina fibronectina in modelli 3D biomimetici di fibrosi ottenuti tramite tecnologia bioprinting utilizzando fibroblasti da rene.
DESCRIZIONE DI FORME DI REALIZZAZIONE
In accordo con la presente invenzione, un metodo per la produzione di cellule mesenchimali CM modificate prevede di modificare le CM con un agente modificante, in particolare un agente modificante comprendente un vettore virale che codifica per una proteina. Tale proteina ? la Decorina e le cellule mesenchimali modificate esprimono tale Decorina.
Vantaggiosamente, la fase di modificare le CM comprende infettare le CM con il vettore virale.
La decorina ? scelta tra decorina isoforma A, oppure isoforma B, oppure isoforma C, oppure isoforma D, oppure isoforma E.
Il vettore virale ? preferibilmente scelto tra un lentivirus oppure un retro virus. Secondo l?invenzione sono anche previste CM modificate con un agente modificante ottenibili con il metodo di cui sopra. In particolare, l?agente modificante comprende un vettore retrovirale infettante le CM e le CM infettate con vettore retrovirale sono CM infettate esprimenti Decorina.
La Decorina ? scelta tra decorina isoforma A, oppure isoforma B, oppure isoforma C, oppure isoforma D oppure isoforma E, pi? preferibilmente ? la Decorina isoforma A.
Le CN possono essere scelte tra CM di origine umana o di origine animale. Le CM possono anche essere scelte tra le CM autologhe oppure CM allogeniche. ? anche possibile prevedere che le CM siano scelte tra CM provenienti da tessuto adiposo, oppure da midollo osseo, da tessuto endometriale, da tessuto placentare, da sangue periferico, da sangue da cordone ombelicale, da fluido amniotico e/o derivati. In una forma preferita le CM provengono da tessuto endometriale.
Vantaggiosamente, la Decorina espressa da dette cellule mesenchimali modificate ? Decorina espressa ripetitivamente.
Le CM modificate di cui sopra possono essere previste per un uso nel trattamento del processo fibrotico del rene. In particolare, l?invenzione prevede CM modificate con un vettore virale scelto tra lentivirale oppure retrovirale ed esprimenti Decorina come indicate sopra, per l?uso come medicamento per il trattamento della fibrosi del rene.
In particolare, la presente invenzione prevede anche un medicamento che comprende CM modificate con un agente modificante come sopra indicate, in cui l?agente modificante comprende un vettore virale scelto tra lentivirale oppure retrovirale infettante le CM modificate comprendendo cellule modificate esprimenti Decorina.
? stata selezionata una isoforma di Decorina convenzionalmente denominata Decorina isoforma A, e di seguito indicata con questa denominazione per comodit? di descrizione e nota anche con l?acronimo di DCN A.
La DCN A ? la pi? caratterizzata tra le isoforme di recettori decoy per il TGF ? ( , Aging, 2021).
Per la presente invenzione si ? fatto riferimento di preferenza alla DCN A, ossia quella maggiormente caratterizzata dal punto di vista biologico.
Materiali e metodi.
- Isolamento e coltura delle CM.
1.1.1 - CM da tessuto endometriale (ET): il sangue da tessuto endometriale (denominato sangue mestruale) ? stato collezionato da donatrici volontarie sane (n= 2, denominati come CM-ET CM-TE donor #1 e come CM-ET donor #2) durante i primi giorni del ciclo mestruale.
Ogni donatore ? stato dotato di una coppetta mestruale,
per collezionare il sangue, il quale successivamente ? stato trasferito in una soluzione salina
con 1% penicillina/streptomicina (10,0O0U/mL Penicillina, 10mg/mL Streptomicina 0.9%NaClsolution, PAALaboratories), 35mg/mL fluconazolo (Diflucan, NewYork, NY, USA) ed eparina (500U/mL, St. Louis, MO, USA).
I campioni sono stati mantenuti a 4?C per 24-48h dopo la raccolta, fino al raggiungimento del laboratorio dedicato al trattamento.
II tessuto endometriale, quando presente, ? stato scartato, e il sangue rimanente ? stato omogenato tramite 20 passaggi attraverso un ago da 19G e con l?utilizzo di una siringa da 10ml.
La sospensione cellulare ? stata coltivata come riportato di seguito.
1.1.2 - CM da tessuto adiposo (TA): le CM-TA sono state ottenute da campioni di lipoaspirato (n=2 denominati come CM-TA donor #1 e CM-TA donor #2) collezionati da tessuto sottocutaneo da donatori sani per mezzo di liposuzione. I campioni sono stati utilizzati in seguito a raccolta del consenso informato del paziente e in seguito ad approvazione dello studio da parte del Comitato Etico Locale (Azienda Universitario-Ospedaliera, Policlinico di Modena; nell? ambito del progetto con titolo: ?Sviluppo di nuove terapie anti-tumorali basate sull?uso di progenitori mesenchimali/stromali isolati da tessuto adiposo Protocollo Policlinico?, Nr. Protocollo: 0004827/20).
Il lipoaspirato (1 cc) ? stato trattato per l?ottenimento di precursori delle CM-TA tramite lavaggio estensivo con equivalenti volumi di soluzione salina (PBS Cod: 14190-094. GIBCO, Waltham, MA, USA) e successivamente digerito a 37?C per 30 minuti con 0.075% di collagenasi. L?attivit? enzimatica ? stata successivamente neutralizzata con DMEM (Cod:41966-029. GIBCO, Waltham, MA, USA), con 10% FBS inattivato con il calore (Cod:SH30070.03.
Logan, Utah, USA), e centrifugato a 1200 g per 10 minuti per ottenere un pellet cellulare.
Il pellet ? stato poi risospeso in 160 mM NH4C1 (Cod A9434,
USA) e incubato a temperatura ambiente per 10 minuti per Usare gli eritrociti contaminanti.
Le cellule ottenute sono state poi raccolte per centrifugazione e poi filtrate tramite un filtro da 100 pm per rimuovere i detriti cellulari e incubate per la notte a 37?C/5% C02 in terreno controllo (DMEM, 10% FBS).
Successivamente a questa incubazione, le piastre sono state lavate varie volte con PBS (Cod: 14190-094. GIBCO, , Waltham, MA, USA) per rimuovere gli eritrociti residui non aderenti.
1.1.3 - CM da Midollo osseo (MO): Campioni di MO sono stati raccolti dalla cresta iliaca posteriore.
I campioni (denominati come CM-MO donor #1 e CM-MO donor #2) sono stati aspirati con una siringa luer-lock da 10 mi contenente 0.5 - 1 mL Na citrato (38 mg/mL) (Cod PHR1416 Sigma Aldrich Ine, USA), e processati come segue. Il BM ? stato diluito 1:1 (v:v) con Ca 2/Mg2-libero PBS sterile (PBS Cod: 14190-094. GIBCO, Waltham, MA, USA) e fatto passare 20 volte attraverso una siringa sterile da 10-mL (Becton Dickinson Plastipak, , Ireland) con un ago da 19-G. La sospensione cellulare ? stata coltivata come riportato di seguito. I campioni sono stati utilizzati in seguito a raccolta del consenso informato del paziente e in seguito ad approvazione dello studio da parte del Comitato Etico Locale ( Universitario-Ospedaliera, nell?ambito dello studio con titolo ?Terapie cellulari per il cancro?, codice protocollo 335/CE).
1.2 - Metodo di colture cellulari
Le CM-TA e CM-TE sono state coltivate in aMEM (Cod:22561-021. GIBCO,
Waltham, MA, USA) con 2.5% PLP (Human Platelet Lysate. Cod: BC0190030 Milan, Italy), 2 mM L-Glutammina (Cod: ECB3000D. , Italy), 1 Unit? Intemazionali (UI)/mL eparina (Cod: H3 149. USA), e 10 pg/rnL ciprofloxacina (Cod: A15571/AIT. Fresenius Kabi Italia S.r.l., Verona Italy). Le CM-MO sono state coltivate in aMEM (Cod:22561-021. GIBCO,
Waltham, MA, USA) con 8% PLP (Human Platelet Lysate. Cod: BC0 190030 Milan, Italy), 2 mM L-Glutammina (Cod: ECB3000D. Italy), 1 UI/mL eparina (Cod: H3149.
USA), e 10 pg/mL ciprofloxacina (Cod: A15571/AIT.
, Verona Italy).
Le cellule umane da rene embrionale 293T, sono state coltivate in DMEM (Cod:41966-029. GIBCO, Waltham, MA, USA) con 10% siero definito inattivato con il calore FBS (Cod:SH30070.03.
Logan, Utah, USA), 2 mM L-Glutammina (Cod: ECB3000D. , Italy) and 1% penicillina/streptomicina (pen/strep, Cod: MS00581009. Comaredo, Italy). I fibroblasti umani isolati da rene non patologico sono stati acquistati (cod. H6016, USA) come cellule criopreservate. In seguito a scongelamento, le cellule sono state coltivate in Complete Fibroblast Medium (M2267- Kit, USA) che ? costituito oltre al terreno base dai seguenti supplementi: FGF 0.5ml di FGF; 0.5 mi di idrocortisone; 5 ml di L-Glutammina; 5 mi di soluzione di antibiotico antimicotico; 50 ML di FBS). I volumi sono rapportati a 500ml di terreno. Le cellule sono coltivate in fiasche pretrattate per 20-30 minuti a 37?C con una soluzione di condizionamento a base di gelatina (cod 6950, USA) in grado di potenziare la capacit? adesiva delle cellule.
I fibroblasti umani isolati da derma sono stati acquistati da ATCC come cellule criopreservate. Una volta scongelate, le cellule sono state mantenute in coltura con DMEM (Cod:4 1966-029. GIBCO, Waltham, MA, USA) con 10% FBS (Cod:SH30070.03. Logan, Utah, USA), 2 mM L-Glutammina (Cod: ECB3000D. Italy) and 1% penicillina/streptomicina (pen/strep, Cod: MS00581009.
Comaredo, Italy).
I fibroblasti da polmone umano, da fibrosi idiopatica polmonare sono stati acquistati a passaggio 2 in vial congelate (Cat:CC-7231; ), definite di seguito CC7231.
Fibroblasti ipertrofici, da fibrosi polmonare idiopatica, sono stati scelti come cellule target per lo studio, in quanto commercialmente disponibili, a differenza dei fibroblasti ipertrofici da rene, e in quanto hanno in comune con questi ultimi il meccanismo biologico alla base del processo fibrotico e il medesimo target per la Decorina (TGF?; European Journal of Pharmacology, 2021).
Appena ricevuti sono stati scongelati in DMEM (Cod:41966-029. GIBCO, Waltham, MA, USA) con 10% di FBS inattivato con il calore (Cod:SH30070.03. Logan, Utah, USA), 2 mM L-Glutammina (Cod: ECB3000D. , Italy) and 1% penicillina/streptomicina (pen/strep, Cod:MS00581009.
Comaredo, Italy) e seminate ad una densit? di 2500/cm<2 >e coltivati nel seguente terreno: Clonetics? FGM?-2 BulletKit? (Cat:CC-3132;
1.3 - Produzione del virus e infezione delle CM.
Cellule 293 T sono state transfettate usando il reagente di transfezione JetPEI DNA (Cod.l01-40N.Polyplus transfection, France) usando una combinazione di un vettore di espressione e plasmidi helper: il vettore virale (prodotto da ).
Imi di sumatante retrovirale prodotto dalle 293T transfettate addizionato con 6 pg/ml di polibrene (Cod. TR1003. USA) ? stato usato per transdurre 45000/cm<2 >di CM-TE ed CM-TA a passaggi precoci (p2/p4).
Le infezioni sono state ripetute due volte e susseguite da espansione cellulare e selezione in Puromicina 2 ?g/ml.
I sumatanti virali sono stati usati freschi e/o congelati a -80?C.
1.4 - Analisi al citofluorimetro.
La colorazione intracellulare per MYK su CM-TE e CM-TA wild type e transdotte ? stato effettuato con il Becton Dickinson Cytofix/Cytoperm Kit (Cod:554714. BD, NJ, USA).
Per valutare l?espressione di MYK, le CM sono state marcate con l anticorpo primario mouse anti-human MYK (Cod: TA150121,
) e dopo con l?anticorpo secondario APC goat anti-mouse Ig (APC Goat AntiMouse Ig polyclonal multiple adsorption; Cod:550826. BD, NJ, USA).
Per valutare l?espressione di HLA-G, le CM-TE sono state marcate con l?anticorpo primario anti-HLA-G FITC-conjugated monoclonal antibody (MoAb) (87G, Czech Republic) APC goat anti -mouse Ig (APC Goat AntiMouse Ig polyclonal multiple adsorption; Cod:550826. BD, NJ, USA).
1 dati sono stati collezionati usando il Citometro a flusso FACS Aria III (BD) e analizzati usando il FACS Diva software (BD).
2 - Biologia molecolare.
L?RNA totale ? stato isolato usando il TRIzol? (cod: 15596026. Invitrogen, Carlsbad, MN, USA) seguendo le istruzioni d?uso.
Il cDNA ? stato susseguentemente sintetizzato da 2pg totali di RNA usando il kit RevertAid H minus first-strand cDNA synthesis (cod. K1622.
Waltham, MA, USA).
Il cDNA ? stato quantificato usando uno spettrofotometro. (Beckman Coulter DU? 730, CA, USA).
La real-time PCR Quantitativa (qRT-PCR) ? stata effettuata usando l?Applied Biosystems StepOne? Real-Time PCR System e il reagente Fast SYBR? Green Master Mix.
La reazione di qRT-PCR (10?1) consiste di 50ng cDNA, Fast SYBR Green Master Mix (cod:4385612. Applied Biosystems, CA, USA), e 300nM dei primer forward e reverse.
Le sequenze dei rispettivi primer sono descritte nella Tavola 1.
I livelli di espressione relativi dei geni target sono stati calcolati tramite il metodo 2-??Ct usando i geni della human ?-actin e della GAPDH come geni controllo.
TAVOLA 1
2.1 - Saggio ELISA.
I livelli di DCN A nei campioni di CM-ET e CM-AT sono stati misurati usando il Duo Set Elisa kit (DY143.R&D Systems, 614 McKinley Place NE, Minneapolis, MN, USA) seguendo le istruzioni d?uso. Questo saggio ? basato sulla tecnica del saggio immunoassorbente legato ad un enzima (ELISA).
2.2 - Saggi di migrazione.
Al giorno 1 le CM-ET sono state seminate in pozzetti da 24 well ad una concentrazione di 10000/cm<2 >(3 pozzetti per ogni condizione) nel loro terreno di coltura.
Le CC-7231 ad una densit? di 10000/cm<2 >(3 pozzetti per ogni condizione) sono state seminate su Transwell Permeable Support (Cod. 3422,
USA) in DMEM (Cod:41966-029. GIBCO,
Waltham, MA, USA) con 2.5% di NuSerum? IV culture supplement (Cod.355104, BD Biosciences) inattivato con il calore, 2 mM L-Glutammina (Cod: ECB3000D. Italy) and 1% penicillina/streptomicina (pen/strep, Cod:MS00581009. , Comaredo, Italy). Al giorno 4 i supporti sono stati rimossi, lavati con DPBS IX (Cod.14190-094, Gibco) e successivamente fissati con Metanolo a freddo. Dopo fissazione sono stati ulteriormente lavati con acqua distillata, con un tampone ? stato rimosso lo strato di cellule non migrate e le rimanenti sono state colorate con Crystal Violet 0.4% (cod:C0075 Sigma Aldrich), e dopo ulteriori lavaggi in acqua distillata sono stati fatti asciugare prima della visualizzazione al microscopio e conta manuale.
2.3 - Saggio di Proliferazione.
Le CC-7231 ad una densit? di 10000/cm<2 >(6 pozzetti per ogni condizione) sono state seminate in piastre da 24 well in DMEM (Cod:41966-029. GIBCO,
Waltham, MA, USA) con 2.5% di NuSerum? IV culture supplement (Cod.355104, ) inattivato con il calore, 2 mM L-Glutammina (Cod: ECB3000D. , Italy) and 1% penicillina/streptomicina (pen/strep, Cod:MS00581009.
Comaredo, Italy).
? stata allestita una co-coltura con CM-TE e fibroblasti da fibrosi idiopatica in rapporto 1:1. Nel dettaglio, le CM-TE sono state seminate nel fondo dei pozzetti MW e i fibroblasti in un transwell alloggiato sopra alla coltura CM-TE, avente una porosit? pari a 3um in grado di consentire lo scambio del terreno e dei soluti in esso contenuti. La co-coltura cos? ottenuta si ? protratta per 48 ore e successivamente le cellule sono state lsate, estratto RNA con il trizol (cod: 15596026. Carlsbad, MN, USA) seguendo le istruzioni d?uso.
Il cDNA ? stato susseguentemente sintetizzato da 2pg totali di RNA usando il kit RevertAid H minus f?rst-strand cDNA synthesis (cod. K1622. Fermentas , Waltham, MA, USA).
Il cDNA ? stato quantificato usando uno spettrofotometro. (Beckman Coulter DU? 730, CA, USA).
La real-time PCR Quantitativa (qRT-PCR) ? stata effettuata usando l?Applied Biosystems StepOne? Real-Time PCR System e il reagente Fast SYBR? Green Master Mix.
La reazione di qRT-PCR (10?1) consiste di 50ng cDNA, Fast SYBR Green Master Mix (cod:4385612. , Foster City, CA, USA), e 300nM dei primer forward e reverse del gene Ki-67.
3 - Saggio di Valutazione dell?espressione di aSMA
Le CC-7231 ad una densit? di 10000/cm<2 >(6 pozzetti per ogni condizione) sono state seminate in piastre da 24 well in DMEM (Cod:4 1966-029. GIBCO, Waltham, MA, USA) con 2.5% di NuSerum? IV culture supplement (Cod.355104, BD Biosciences) inattivato con il calore, 2 mM L-Glutammina (Cod: ECB3000D. Italy) e 1% penicillina/streptomicina (pen/strep, Cod:MS00581009.
Italy).
? stata allestita una co-coltura con CM-TE e fibroblasti da fibrosi idiopatica in rapporto 1:1. Nel dettaglio, le CM-TE sono state seminate nel fondo dei pozzetti MW e i fibroblasti in un transwell alloggiato sopra alla coltura CM-TE, avente una porosit? pari a 3um in grado di consentire lo scambio del terreno e dei soluti in esso contenuti. Successivamente a 24 e 48 ore di coltura, le cellule sono state Usate ed ? stato estratto RNA con TRIZOL.
Il cDNA ? stato susseguentemente sintetizzato da 2?g totali di RNA usando il kit RevertAid H minus first-strand cDNA synthesis (cod. K1622. Fermentas Waltham, MA, USA).
Il cDNA ? stato quantificato usando uno spettrofotometro. (Beckman Coulter DU? 730, , CA, USA).
La real-time PCR Quantitativa (qRT-PCR) ? stata effettuata usando l?Applied Biosystems StepOne? Real-Time PCR System e il reagente Fast SYBR? Green Master Mix.
La reazione di qRT-PCR (10?1) consiste di 50ng cDNA, Fast SYBR Green Master Mix (cod:4385612. , Foster City, CA, USA), e 300nM dei primer forward e reverse del gene aSMA.
4 - Analisi tramite microscopia SEM di modelli 3D biomimetici di fibrosi tramite tecnologia bioprinting.
I modelli biomimetici sono stati ottenuti tramite bioprinting e si basano sulla crescita di fibroblasti isolati da derma o da rene in una matrice tridimensionale di origine naturale. L?analisi ? stata effettuata al SEM (TM4000 Plus II, Tabletop Microscope, , Japan). L?interazione tra un fascio di elettroni e gli atomi del campione in esame consentono di generare immagini con ingrandimenti molto elevati e di analizzare cambiamenti nella microarchitettura del tessuto. Le micrografie sono state ottenute con un?accelerazione del fascio di elettroni di lOkV, in condizioni di medio vuoto, e mediante l?uso di un detector di elettroni secondari a 1000X di ingrandimento.
5 - Reazione di immunofluorescenza (IF) per fibronectina
I modelli biomimetici inclusi in paraffina sono stati processati al microtomo (marca e specifiche) e tagliati in sezioni con spessore di 4 micron. In seguito ad asciugatura a 37 gradi Celsius, le sezioni sono state sparaffinate e reidratate attraverso un passaggio in scala di alcoli a concentrazioni crescenti. In seguito a smascheramento con Acido citrico (cod. 403727, Carlo Erba Reagente spa, Arese, Milano), le sezioni sono state incubate con anticorpo primario antifibronectin (Cod. ab2413, Abcam) alla concentrazione di 1:100 per 1 ora a temperatura ambiente e con anticorpo secondario Donkey anti-rabbit IgG-h+I Dylight 594 conjugated anti rabbit (Cod. A120-108D4, Bethyl) alla concentrazione di 1:700 per un?ora a temperatura ambiente. I nuclei sono stati colorati per 5 minuti con il colorante DAPI (Cod. 10236276001, Roche) alla concentrazione 1:200 per 5 minuti a temperatura ambiente. In seguito, le sezioni sono state montate in glicerina tamponata. L?analisi ? stata effettuata con microscopio AxioZoom VI 6 (Zeiss) con obiettivo IX (Pian NeoFluar Z lx/0.25 FWD 53. Imm, Zeiss) e ingrandimento digitale 180X.
La quantificazione del segnale ? stata ottenuta tramite plugin ImageAnalysis del software ZEN Pro Zeiss).
Il risultato dell?analisi espresso in ?m<2 >? stato riportato in percentuale, considerando il controllo negativo come il 100% dell?espressione.
6 - Risultati.
Il gene per DCN A ? stato clonato in un vettore virale bicistronico in cui ? stato inserito anche il gene per la Puromicina (OriGene Technologies Inc. NM_001920.
Il vettore virale (in questo caso preferibilmente, ma non esclusivamente, di tipo lentivirale), rappresentato in fig.l, con all?interno il gene ? stato amplificato in batteri in grado di produrre grandi quantit? del DNA di interesse ed il vettore vuoto (empty vector) ? stato usato come controllo negativo.
Il prodotto batterico ? stato purificato e successivamente sequenziato per caratterizzare la sequenza genica inserita nel vettore lentivirale. L?analisi di sequenza ha confermato che durante lo step di amplificazione non si sono verificate mutazioni.
Per identificare la corretta fonte di CM tramite cui veicolare il target terapeutico, abbiamo isolato le CM da tessuto adiposo (AT), Midollo osseo (MO) e dal tessuto endometriale (ET), di cui sono stati isolati due donatori per ogni fonte.
Dopo isolamento, l?ammontare di Decorina isoforma A fisiologicamente prodotta da cellule wild type CM-AT, CM-MO, CM-TE ? stata analizzata a passaggi precoci(P2) a diverse tempistiche (24h, 48h, 72h) nei sumatanti collezionati da due donatori per ogni tipo cellulare, come rappresentato in Fig.2.
Le CM-AT hanno dimostrato di secernere la maggiore quantit? di DCN A, comprese tra 22085 ed i 99774 ?g/ml.
Contrariamente, le CM-TE secernono una bassa quantit? di DCN A, variando da 206 a 688 pg/ml, pi? di 30 volte in meno rispetto alle CM-AT.
Le CM-MO hanno dimostrato di secernere una quantit? intermedia tra le fonti precedenti menzionate di DCN A, variando tra i valori di 19425 ed i 24863 pg/ml.
Questi dati sono risultati imprevedibili per la persona esperta per la ragione che fino alla presente invenzione non ? mai stata stimolata in modo evidente, e neppure ? mai stato suggerito n? dalla letteratura, n? da documenti anteriori, alla persona esperta, sia direttamente, sia indirettamente, la secrezione di DCN A nelle CM.
7 - Cellule Mesenchimali da Endometrio (CM-TE).
Partendo dalla conosciuta secrezione basale, la minore tra le fonti fin qui analizzate, di DCN A da parte delle CM e dal vettore bicistronico sequenziato, sono stati infettati tre donatori di CM-TE.
Per purificare le CM-TE dopo l?infezione e, per ottenere una popolazione completamente pura per DCN A, sono state selezionate le cellule con Puromicina per 96h.
La dose per selezionare le cellule ? stata ottimizzata in un range che varia da 0,5 ?g/ml a 5 ?g/ml di antibiotico.
Per verificare e quantificare Tefficienza di infezione con il vettore DCN A, le CM-TE sono state analizzate per la loro positivit? a MYK, una sequenza segnale inserita nel plasmide e correlata all?espressione del gene per la DCN A.
Questa sequenza segnale permette di valutare la quantit? di proteina indotta nelle cellule modificate, discostandola da quella endogena.
Il donatore di CM-TE indotto ad esprimere DCN A mostra una positivit? dell?89,5% raffrontata con il controllo esprimente un vettore vuoto (empty vector), indicando cos? una buona efficienza di infezione (Fig 3A, 3B).
Per quantificare l?espressione del gene per DCN A nelle CM-TE infettate, il loro m-RNA ? stato raccolto, retrotrascritto in cDNA e analizzato tramite RT-PCR.
Nella figura 4 ? mostrato come il gene per DCN A viene over-espresso nei campioni dopo infezione e la relativa espressione (RQ.CM-TE) ? di 32,38 ? 10,45 volte pi? alta rispetto al controllo vettore vuoto (empty vector).
Il saggio ELISA ? stato effettuato per confrontare la quantit? di proteina rilasciata nel mezzo dalle CM-TE vettore vuoto o infettate per DCN A.
La quantit? di isoforma A rilasciata nel terreno di coltura, come indicato nella figura 5, incrementa fino a raggiungere una differenza tra CM-TE infettate e vettore vuoto di 230 volte maggiore.
Inoltre, la simultanea produzione di HLA-G da parte di cellule CM-TE ? stata valutata tramite analisi al FACS. Dall?analisi effettuata si ? evinto che le cellule CM-TE modificate per Decorina esprimono livelli di HLA-G per una percentuale che ? nettamente superiore rispetto a CM-TE empty vector.
8 - Cellule Mesenchimali da Tessuto Adiposo (CM-TA).
Partendo dalla conosciuta secrezione basale, la pi? alta tra le fonti precedentemente analizzate, di DCN A da parte delle MSCs e dal vettore bicistronico sequenziato, sono stati infettati due donatori di CM-TA.
Per purificare le CM-TA dopo l?infezione e, per ottenere una popolazione completamente pura per DCN A, sono state selezionate le cellule con Puromicina per 96h.
La dose per selezionare le cellule ? stata ottimizzata in un range che varia da 0,5 ?g/ml a 5 ?g/ml di antibiotico.
Per verificare e quantificare l?efficienza di infezione con il vettore DCN A, le CM-TA sono state analizzate per la loro positivit? a MYK, una sequenza segnale inserita nel plasmide e correlata all?espressione del gene per la DCN A. Questa sequenza segnale permette di valutare la quantit? di proteina indotta nelle cellule modificate, discostandola da quella endogena.
Il donatore di CM-TA indotto ad esprimere DCN A mostra una positivit? del 54,5% raffrontata con il controllo esprimente un vettore vuoto (empty vector), indicando cosi una buona efficienza di infezione (Fig 6A-6B).
Per quantificare l?espressione del gene per Decorina isoforma A nelle CM-TA trasdotte, il loro m-RNA ? stato raccolto, retrotrascritto in cDNA e analizzato tramite RT-PCR.
Nella figura 7 ? mostrato come il gene per DCN A viene over-espresso nei campioni dopo infezione e la relativa espressione (RQ.CM-TA) ? di 3,05 ? 1,14 volte pi? alta rispetto al controllo vettore vuoto (empty vector).
Il saggio ELISA ? stato effettuato per confrontare la quantit? di proteina rilasciata nel mezzo dalle CM-TA vettore vuoto o infettate per DCN A.
La quantit? di questa Decorina isoforma A rilasciata nel terreno di coltura, come indicato nella figura 8, incrementa in maniera statisticamente significativa seppure non raggiungendo la quantit? assoluta che si raggiunge dopo modifica delle CM-TE di cui sopra. Questo fenomeno potrebbe essere causato dalla gi? alta secrezione basale delle CM-TA (rispetto alla secrezione basale di CM isolate da altre fonti) che va ad interferire con la produzione e/o la stabilit? della proteina indotta dal vettore di interesse.
Verificata la differenza in quantit? assoluta di proteina secreta, tra CM-TE e CM-TA modificate per la suddetta DCN A, e constatato come le CM-TE siano in grado di produrre una maggiore quantit? di DCN A, valore espresso in pg/ml, si ? proceduto alla valutazione dellefficacia della DCN A prodotta dalle CM-TE su cellule target, ossia su fibroblasti ipertrofici.
9 - Studi funzionali.
F?broblasti ipertrofici, da fibrosi polmonare idiopatica, sono stati scelti come cellule target per lo studio, in quanto commercialmente disponibili, a differenza dei f?broblasti ipertrofici da rene, e in quanto hanno in comune con questi ultimi il meccanismo biologico alla base del processo fibrotico e il medesimo target per la DCN A, ovvero il TGFp (Ong CH et al, European Journal of Pharmacology, 2021).
Successivamente ad espansione, i f?broblasti ipertrofici sono stati analizzati per la loro capacit? di migrare e proliferare in presenza delle CM-TE modificate per esprimere DCN A o il vettore vuoto.
Lo studio di migrazione effettuato seminando le CM-TE in piastra e i f?broblasti al di sopra di esse, in una griglia sviluppata per i suddetti studi, dopo un periodo di 48 ore mostra come le CC-7231 coltivate senza CM-TE abbiano una quasi nulla capacit? di migrare. Quando coltivate con CM-TE vettore vuoto incrementano la loro capacit? di migrare, per mezzo di fattori rilasciati nel terreno, mentre quando coltivate con CM-TE esprimenti DCN A, la capacit? di migrare si dimezza in tutti i donatori esaminati. Una ipotesi potrebbe essere che i fibroblasti vengono attratti verso le CM-TE, grazie al rilascio di queste ultime di fattori chemo-attrattivi tra cui l?attivazione da parte del TGF?, il quale ? uno dei maggiori attivatori della migrazione dei fibroblasti in un processo fibrotico ( J Exp Med. 2020). Questo fenomeno viene per? rallentato in presenza di CM-TE rilascianti DCN A, perch? quest?ultima legando il TGF? ne pu? prevenire a sua volta il legame con il suo recettore, diminuendo il numero di fibroblasti migrati, come mostrato in fig. 9.
Lo studio sulla proliferazione dei fibroblasti ipertrofici (CC-7231) ? stato eseguito allestendo la co-coltura con CM-TE vettore vuoto e CM-TE esprimenti Decorina, nel rapporto 1:1.
In figura 10, sono mostrati i livelli di espressione del gene Ki-67 normalizzati sulla coltura dei fibroblasti tal quali indicati come controllo. I dati hanno mostrato che, se confrontato con il controllo rappresentato dal solo terreno di coltura, si osserva un incremento statisticamente significativo del gene KI67 in co-coltura con CM-ET vettore vuoto, indicando uno stimolo proliferativo da parte di fattori rilasciati dalle CM. In co-coltura con CM-ET modificate con Decorina questo stimolo proliferativo ? stato considerevolmente ridotto. Questa risposta biologica pu? essere causata dalla diminuzione del TGF? disponibile nel terreno di coltura specifico utilizzato per il mantenimento delle colture cellulari, dovuto alla mancanza di legame con il suo recettore grazie al precedente legame con la Decorina secreta dalle CM-ET modificate. Il risultato ottenuto suggerisce il ruolo di Decorina nella riduzione della proliferazione e della migrazione.
Infine ? stata valutata l?espressione del gene aSMA, marcatore per eccellenza dell?attivazione da fibroblasti in mio fibroblasti, fenotipo tipico della fibrosi, dove le cellule con capacit? contrattili, secernono matrice extracellulare peggiorando il quadro patologico ( , Am J Pathol 1991; Flaherty et al. Am. J Respir. Crit. Care Med.2003; Pathol.2003 ; Hinz, Proc. Am. Thorac. Soc 2012).
Il risultato relativo all?espressione del gene aSMA riportato in figura 11 in seguito alla co-coltura nei nel rapporto 1:1 tra fibroblasti da fibrosi idiopatica CC-7231 e CM-ET vettore vuoto e CM-TE esprimente Decorina evidenzia il ruolo delle CM modificate. Sia a 24 ore che a 48 ore di co-coltura si osserva una riduzione statisticamente significativa dell?espressione di aSMA nei fibroblasti in co-coltura con CM-ET esprimenti Decorina.
Questo risultato dimostra una riduzione dello stato di attivazione dei fibroblasti ipetrofici dovuto al ruolo della Decorina.
Avendo raccolto evidenze in merito al ruolo di Decorina in fibroblasti commerciali isolati da fibrosi polmonare idiopatica, si ? voluto valutare l?effetto su matrici biomimetiche del derma sano e fibrotico e del tessuto stromale renale sano e fibrotico.
Attraverso la tecnologia di stampaggio, fibroblasti (isolati sia da derma sia da rene) sono stati immersi in una matrice tridimensionale in grado di mimare la patologia fibrotica (figura 12). I modelli non trattati (CNTRL) mostrano una superficie densa e compatta con incapsulazione delle fibrille di collagene da parte di abbondante matrice extracellulare (colonna di sinistra). Il sumatante ottenuto da CM-TE con vettore vuoto conferisce al modello una superficie solida caratterizzata da parziale rimodellamento delle fibrille di collagene e scarsa deposizione di matrice extracellulare. Invece, il sumatante ottenuto da CM-TE esprimenti Decorina riduce in maniera significativa la densit? del tessuto stampato privo di matrice extracellulare con fibrille che appaiono pi? sottili e frammentate.
La figura 13 riporta la rilevazione in immunofluorescenza della proteina fibronectina nel modello tridimensionale ottenuto con fibroblasti da derma, quale ulteriore indicatore di fibrosi ( Fibronectin: Current Concepts in Structure, Function and Pathology 2012).
L?intensit? e la localizzazione del segnale legate alla presenza della fibronectina sono particolarmente intense nel caso CNTRL. Al contrario, la proteina risulta scarsamente presente nei casi stimolati con i sumatanti delle CM.
In particolare, i livelli di espressione pi? bassi sono stati osservati in seguito alla stimolazione del modello con il sumatante di CM-TE overesprimenti Decorina.
La quantificazione della colorazione conferma una riduzione statisticamente significativa dei livelli di espressione della fibronectina nei casi trattati con sumatante ottenuto da CM-ET e CM-ET esprimenti Decorina, in maniera statisticamente significativa rispetto al caso controllo (p value < 0.05). I modelli biomimetici trattati con sumatante raccolto da CM-TE esprimente Decorina presentano livelli di espressione notevolmente inferiori non solo rispetto al caso controllo ma anche in rapporto a ET-MC.
La stessa analisi ? stata condotta su modelli tridimensionali ottenuti con fibroblasti da rene.
In figura 14, la fluorescenza (rossa) indica la presenza della proteina fibronectina nel modello.
L?intensit? e la localizzazione del segnale legate alla presenza della fibronectina sono particolarmente intense nel caso CNTRL. Al contrario, la proteina risulta scarsamente presente nei casi trattati con il sunatante di CM-TE con vettore vuoto e CM-TE overesprimenti Decorina. La quantificazione della colorazione tramite plugin Image Analysis (ZEN PRO, Zeiss) conferma una riduzione statisticamente significativa dei livelli di espressione della fibronectina nei casi trattati con i sumatanti di CM-TE con vettore vuoto e con CM-TE overesprimenti Decorina (p-value < 0.05). Nel dettaglio, il caso trattato con il sumatante di CM-TE overesprimente Decorina presenta livelli di espressione notevolmente inferiori non solo rispetto al caso controllo ma anche in rapporto al caso trattato con sumatante di CM-ET con vettore vuoto.
10 - Conclusioni.
Secondo l?invenzione ? stata indagata la secrezione endogena di DCN A da parte di CM provenienti da differenti fonti.
Ogni fonte ha dimostrato secernere un differente livello di secrezione proteica e tra queste sono state scelte le CM-TE come debolmente secementi e le CM-TA come cellule altamente secementi il recettore decoy identificato, per capire meglio l?effetto della modifica genica sulle cellule stesse.
Il metodo di infezione con il vettore virale contenente DCN A e il gene per la Puromicina ? stato ottimizzato portando ad un?efficiente infezione.
Le CM, dopo infezione, non hanno mostrato segni di sofferenza, cambiamento di morfologia e/o modifiche dell? espressione di marker tipici di CM.
I protocolli per la quantificazione genica tramite Reai Time-PCR e per la quantificazione della sequenza segnale tramite analisi al citofluorimetro sono stati ottimizzati, dimostrando un incremento del gene per DCN A.
La secrezione della proteina ? stata comprovata tramite saggio ELISA, indicando un incremento del rilascio in CM indotte a produrre la DCN A, confermando i dati ottenuti per mezzo di analisi molecolare, i quali mostrano una maggiore espressione del gene per DCN A, e dati ottenuti tramite analisi al citofluorimetro nelle quali le CM indotte ad esprimere DCN A, mostrano un incremento in positivit? rispetto alle CM con vettore vuoto.
Inoltre, la comparazione effettuata tra differenti fonti di CM ha portato a selezionare come migliore fonte le CM-TE che hanno dimostrato avere una maggiore positivit? alla sequenza segnale MYC tramite analisi al citofluorimetro, un maggiore incremento nell?espressione del mRNA, che risulta a sua volta nell? incremento di quantit? di proteina secreta. Per questa ragione le CM-TE rappresentano il miglior carrier per lo scopo della presente invenzione che si esplicita in un approccio di terapia cellulare e genica eseguibile con l?invenzione.
Per verificare la funzionalit? delle CM-TE modificate in un ambiente f?brotico, un modello di co-cultura ? stato disegnato e la capacit? proliferativa, di migrazione e l?attivit? metabolica sono state valutate.
Fibroblasti ipertrofici da fibrosi polmonare idiopatica commercialmente disponibili, sono stati coltivati con le CM-TE modificate (vettore virale vuoto o esprimente la DCN A). La co-cultura ? stata effettuata al fine di osservare l?effetto sul fenotipo proliferativo e pro-fibrotico a loro associato e per valutare le funzionalit? del TGF? decoy rilasciato sul comportamento cellulare come proliferazione cellulare, migrazione ed attivit? metabolica.
La proteina DCN A, prodotta dalle CM-TE modificate, interferisce con la proliferazione dei fibroblasti fibrotici, con la loro migrazione, evento fondamentale nel processo fibrotico in vivo, ma interferisce anche con la loro attivit? metabolica.
Inoltre, in maniera sorprendente, il blocco del TGF-Beta non determina un danno a livello delle CM che notoriamente utilizzano il TGF-Beta come fattore proliferativo, non arrecando alcun danno alla performance delle CM ex vivo. La persona esperta comprende che il metodo per la produzione di CM modificate con un agente modificante descritto nella presente invenzione e le CM modificate ottenute con il metodo possono essere utilizzati anche in trattamenti di ulteriori tipologie di fibrosi, come ad esempio non limitativo, la fibrosi renale, cardiaca, epatica, polmonare oppure quella che intercorre su altri tessuti e organi come le giunture, il midollo osseo, il cervello, gli occhi, lintestino, il peritoneo e il retroperitoneo, il pancreas e la pelle.
Si ? in pratica constatato come l?invenzione raggiunga gli scopi prefissati. L?invenzione come concepita ? suscettibile di modifiche e varianti, tutte rientranti nel concetto inventivo.
Inoltre, tutti i dettagli sono sostituibili con altri elementi tecnicamente equivalenti.
Nella attuazione pratica, i materiali impiegati nonch? le forme e le dimensioni potranno essere qualsiasi, a seconda delle esigenze, senza per questo uscire dall?ambito di protezione delle seguenti rivendicazioni.

Claims (16)

RIVENDICAZIONI
1. Metodo per la produzione di cellule mesenchimali modificate con un agente modificante ottenendo cellule mesenchimali modificate, caratterizzato dal fatto che detto agente modificante comprende un vettore virale che codifica per una proteina e che detta proteina ? la Decorina e caratterizzato dal fatto che dette cellule mesenchimali modificate esprimono detta Decorina.
2. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto modificare comprende infettare dette cellule mesenchimali con detto vettore virale.
3. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detta Decorina ? scelta tra decorina isoforma A, oppure isoforma B, oppure isoforma C, oppure isoforma D, oppure isoforma E.
4. Il metodo secondo la rivendicazione 3, in cui detta Decorina ? Decorina isoforma A.
5. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui detto vettore virale ? scelto tra un lentivirus oppure un retrovirus.
6. Il metodo secondo la rivendicazione 1, in cui dette cellule mesenchimali esprimono la molecola HLA-G.
7. Cellule mesenchimali modificate con un agente modificante ottenibili con il metodo secondo una o pi? delle rivendicazioni 1-6, caratterizzate dal fatto che detto agente modificante comprende un vettore virale infettante dette cellule mesenchimali e che dette cellule mesenchimali infettate con vettore retrovirale sono cellule mesenchimali infettate esprimenti Decorina.
8. Le cellule secondo la rivendicazione 7, in cui detta Decorina ? scelta tra decorina isoforma A, oppure isoforma B, oppure isoforma C, oppure isoforma D oppure isoforma E.
9. Le cellule secondo la rivendicazione 8, in cui detta Decorina ? Decorina isoforma A.
10. Le cellule secondo una o pi? delle rivendicazioni 7-9, in cui dette cellule mesenchimali sono scelte tra cellule mesenchimali di origine umana oppure animale.
11. Le cellule secondo una o pi? delle rivendicazioni 7-10, in cui dette cellule mesenchimali sono scelte tra cellule mesenchimali autologhe oppure cellule mesenchimali allogeniche.
12. Le cellule secondo una o pi? delle rivendicazioni 7-11, in cui dette cellule mesenchimali sono scelte tra cellule mesenchimali provenienti da tessuto adiposo, oppure da midollo osseo, da tessuto endometriale, da tessuto placentare, da sangue periferico, da sangue da cordone ombelicale, da fluido amniotico e/o derivati.
13. Le cellule secondo la rivendicazione 7, in cui dette cellule mesenchimali sono provenienti da tessuto endometriale.
14. Le cellule secondo la rivendicazione 7, in cui detta Decorina espressa da dette cellule mesenchimali modificate ? Decorina espressa ripetitivamente.
15. Un medicamento, in particolare per il rallentamento del processo fibrotico del rene, caratterizzato dal fatto che comprende cellule mesenchimali modificate con un agente modificante secondo una o pi? delle rivendicazioni da 7 a 14 e dal fatto che detto agente modificante comprende un vettore virale scelto tra lentivirale oppure retrovirale infettante dette cellule mesenchimali modificate comprendendo cellule modificate esprimenti Decorina.
16. Cellule mesenchimali modificate con un vettore virale scelto tra lentivirale oppure retrovirale ed esprimenti Decorina seconda una o pi? delle rivendicazioni precedenti per l?uso come medicamento per il trattamento della fibrosi del rene,
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