CN115386549A - 一种脐带血红细胞冻存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脐带血红细胞冻存方法，包括脐带血筛选、标本前处理、沉降并分离红细胞、冻存、程控降温、复苏解冻、红细胞检测。本发明的有益效果是：脐带血资源具有来源丰富、分化潜能大、免疫原性低；6%羟乙基淀粉作为血浆替代品，是临床上常用的胶体型血浆代用品之一，作为等渗液，能增加血浆容量。脐带血造血干细胞制备提取过程中加入6%羟乙基淀粉（Hydroxyethyl Starch，HES），冻存液中无需重复添加。
Description
技术领域
本发明涉及一种红细胞冻存方法 ，具体为一种脐带血红细胞冻存方法，属于细胞生物技术领域。
背景技术
红细胞在抗肿瘤、抗感染免疫中发挥着重要作用，在成分输血中占重要的作用，我国医疗临床用血量约800吨，而且，临床用血以每年7-10%的速度递增，脐带血是脐带的静脉血管中流动的血液，是从胎盘绒毛小叶内吸取了各种营养成分的动脉血液，因胎盘内有母体和胎儿两套血循环，胎儿与母体血液并不直接接触，脐带血是胎儿的血液，一般产后或者剖宫产、断脐后，将脐带内残留的血液收集起来，一般量在100ml左右。作为曾经的“医疗废弃物”，因为含有宝贵的干细胞资源，其价值逐渐被大众所认识，近年来，更成为医学生物界研究的热点领域。
自1974年，科学家Knudtzon首次发现脐带血中存在造血干细胞以来，脐带血干细胞治疗各种血液病及先天性疾病已在临床上得到广泛应用。美国于1992年纽约血液中心(NYBC)建立首家储存脐带血干细胞的脐血库，之后在世界各国陆续建立各自的脐带血干细胞库。当前的脐带血造血干细胞制备分离技术按照纽约脐血库操作标准，制备分离得到造血干细胞后，血浆和红细胞留样到期后，直接作为医疗垃圾处理。
脐带血造血干细胞制备过程中需事先加入HES，其主要的目的是沉淀分离红细胞，这给后续红细胞制剂制备提供了便利：HES作为血容量替代物直接应急输入人体，输回人体24h后血浆中85%的HES可在体内自行代谢消除；紧急情况下，减少了大量时间洗涤红细胞的过程，海藻糖是自然界动植物和微生物中广泛存在的一种非还原性二糖，具有较高的玻璃化转变温度，尤其在干燥过程中能形成稳定的玻璃体，帮助生物体储存能量，吸收水分，用来对抗冷冻或缺水的极端环境，Dextran是一种非穿透性低温保护剂，在冷冻过程中可以减少细胞内冰晶的形成，复温时还可以减轻由于渗透压改变而引起的细胞肿胀。
发明内容
本发明的目的就在于为了解决上述至少一个技术问题而提供一种脐带血红细胞冻存方法。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：一种脐带血红细胞冻存方法，包括以下步骤
步骤一、脐带血筛选：脐带血来自医院足月妊娠健康产妇，产前检查乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、人类免疫缺陷病病毒、巨细胞病毒、EB病毒等均阴性，产妇及家属对脐带血用于实验研究均知情同意；
步骤二、标本前处理：标本表面的消毒处理，目的是去除表面污渍，和可能的细菌进入血液中；
步骤三、沉降并分离红细胞：脐带血标本中加入羟乙基淀粉，羟乙基淀粉（HES）可与红细胞膜上的负电荷结合，使红细胞凹面相贴体积增大而使得沉降速度加快，利用红细胞和白细胞的沉降速度的差异来实现分离红细胞；
步骤四、冻存：将一定比例的冻存液，加入步骤三得到的红细胞中；
步骤五、程控降温：将步骤四获得的红细胞制剂防止程控降温盒中，执行程序降温程序，从室温降至-80℃，制备成冰冻红细胞制剂；
步骤六、复苏解冻：将深低温保存一定时间的冰冻红细胞制剂进行快速复温；
步骤七、红细胞检测：将步骤六中复温的红细胞制剂进行血红蛋白（HGB）、红细胞平均体积（MCV）、红细胞渗透脆性试验（RFT）、红细胞免疫功能检测。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤二中，脐带血标本先标记，再用热合机对采集管进行热合并称重，将标本采集袋放入84消毒液充分浸泡10-20分钟，然后用75%酒精擦拭消毒后放置4℃冰箱中，通过传递窗传至净化车间进行处理。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤三中，脐带血标本按照脐带血量：羟乙基淀粉=4：1加入所需羟乙基淀粉量，无菌操作下，将HES注入脐带血袋，用止血钳夹住针孔部位，然后用热合机封管，摇床500prm/min充分混匀10min，置4℃条件下，静置30min后，离心500rpm、7min，大致分为三层，上层血浆，中层干细胞，下层红细胞，夹紧150ml转移袋的止血夹，缓慢的将干细胞及血浆挤压至另外一个250ml转移袋，残留于母袋中的红细胞进行后续处理。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤四中，获取的红细胞加入冻存液，冻存液中加入0.3M海藻糖，15%右旋糖酐，12.25%HES，得到红细胞制剂。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤五中，得到的红细胞制剂利用程序降温降温，4℃等待，红细胞制剂放入程序降温仪；以5℃/min降至0℃，保持5min；以2℃/min降至-10℃，保持5min；以1℃/min降至-45℃，保持35min；以5℃/min降至-90℃，保持5min，程序结束后，制成冰冻红细胞制剂，将其放置-80℃冰箱中。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤六中，将深低温保持3、6个月的冰冻红细胞制剂取出，立即在38～43℃恒温水浴槽中1-2min内快速复温。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤七中，将快速复温的红细胞制剂进行各种红细胞的检测：分别进行血红蛋白（HGB）、红细胞平均体积（MCV）、红细胞渗透脆性试验（RFT）、红细胞免疫功能检测采用流式双抗的方法进行红细胞平均荧光强度测定，一抗鼠抗人红细胞CR1（CD35），二抗使用羊抗鼠IgG-FITC，流式上机检测。
本发明的有益效果是：脐带血资源具有来源丰富、分化潜能大、免疫原性低，6%羟乙基淀粉作为血浆替代品，是临床上常用的胶体型血浆代用品之一，作为等渗液，能增加血浆容量。脐带血造血干细胞制备提取过程中加入6%羟乙基淀粉（Hydroxyethyl Starch，HES），冻存液中无需重复添加。
附图说明
图1为本发明流程示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
如图1所示，一种脐带血红细胞冻存方法，包括以下步骤
步骤一、脐带血筛选：脐带血来自医院足月妊娠健康产妇，产前检查乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、人类免疫缺陷病病毒、巨细胞病毒、EB病毒等均阴性，产妇及家属对脐带血用于实验研究均知情同意；
步骤二、标本前处理：标本表面的消毒处理，目的是去除表面污渍，和可能的细菌进入血液中；
步骤三、沉降并分离红细胞：脐带血标本中加入羟乙基淀粉，羟乙基淀粉（HES）可与红细胞膜上的负电荷结合，使红细胞凹面相贴体积增大而使得沉降速度加快，利用红细胞和白细胞的沉降速度的差异来实现分离红细胞；
步骤四、冻存：将一定比例的冻存液，加入步骤三得到的红细胞中；
步骤五、程控降温：将步骤四获得的红细胞制剂防止程控降温盒中，执行程序降温程序，从室温降至-80℃，制备成冰冻红细胞制剂；
步骤六、复苏解冻：将深低温保存一定时间的冰冻红细胞制剂进行快速复温；
步骤七、红细胞检测：将步骤六中复温的红细胞制剂进行血红蛋白（HGB）、红细胞平均体积（MCV）、红细胞渗透脆性试验（RFT）、红细胞免疫功能检测。
在本发明实施例中，所述步骤二中，脐带血标本先标记，再用热合机对采集管进行热合并称重，将标本采集袋放入84消毒液充分浸泡10-20分钟，然后用75%酒精擦拭消毒后放置4℃冰箱中，通过传递窗传至净化车间进行处理。
在本发明实施例中，所述步骤三中，脐带血标本按照脐带血量：羟乙基淀粉=4：1加入所需羟乙基淀粉量，无菌操作下，将HES注入脐带血袋，用止血钳夹住针孔部位，然后用热合机封管，摇床500prm/min充分混匀10min，置4℃条件下，静置30min后，离心500rpm、7min，大致分为三层，上层血浆，中层干细胞，下层红细胞，夹紧150ml转移袋的止血夹，缓慢的将干细胞及血浆挤压至另外一个250ml转移袋，残留于母袋中的红细胞进行后续处理。
在本发明实施例中，所述步骤四中，获取的红细胞加入冻存液，冻存液中加入0.3M海藻糖，15%右旋糖酐，12.25%HES，得到红细胞制剂。
实施例二
如图1所示，一种脐带血红细胞冻存方法，包括以下步骤
步骤一、脐带血筛选：脐带血来自医院足月妊娠健康产妇，产前检查乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、人类免疫缺陷病病毒、巨细胞病毒、EB病毒等均阴性，产妇及家属对脐带血用于实验研究均知情同意；
步骤二、标本前处理：标本表面的消毒处理，目的是去除表面污渍，和可能的细菌进入血液中；
步骤三、沉降并分离红细胞：脐带血标本中加入羟乙基淀粉，羟乙基淀粉（HES）可与红细胞膜上的负电荷结合，使红细胞凹面相贴体积增大而使得沉降速度加快，利用红细胞和白细胞的沉降速度的差异来实现分离红细胞；
步骤四、冻存：将一定比例的冻存液，加入步骤三得到的红细胞中；
步骤五、程控降温：将步骤四获得的红细胞制剂防止程控降温盒中，执行程序降温程序，从室温降至-80℃，制备成冰冻红细胞制剂；
步骤六、复苏解冻：将深低温保存一定时间的冰冻红细胞制剂进行快速复温；
步骤七、红细胞检测：将步骤六中复温的红细胞制剂进行血红蛋白（HGB）、红细胞平均体积（MCV）、红细胞渗透脆性试验（RFT）、红细胞免疫功能检测。
在本发明实施例中，所述步骤五中，得到的红细胞制剂利用程序降温降温，4℃等待，红细胞制剂放入程序降温仪；以5℃/min降至0℃，保持5min；以2℃/min降至-10℃，保持5min；以1℃/min降至-45℃，保持35min；以5℃/min降至-90℃，保持5min，程序结束后，制成冰冻红细胞制剂，将其放置-80℃冰箱中。
在本发明实施例中，所述步骤六中，将深低温保持3、6个月的冰冻红细胞制剂取出，立即在38～43℃恒温水浴槽中1-2min内快速复温。
在本发明实施例中，所述步骤七中，将快速复温的红细胞制剂进行各种红细胞的检测：分别进行血红蛋白（HGB）、红细胞平均体积（MCV）、红细胞渗透脆性试验（RFT）、红细胞免疫功能检测采用流式双抗的方法进行红细胞平均荧光强度测定，一抗鼠抗人红细胞CR1（CD35），二抗使用羊抗鼠IgG-FITC，流式上机检测。
工作原理：采用HES沉淀红细胞的方法，提取过脐带血造血干细胞后，将红细胞中加入冻存液，通过程序降温仪降至-80℃， 37～ 40℃恒温水浴箱复苏解冻后，分别对血红蛋白（HGB）、红细胞平均体积（MCV）、红细胞渗透脆性（RFT）、红细胞免疫功能检测。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (7)
1.一种脐带血红细胞冻存方法，其特征在于：包括以下步骤
步骤一、脐带血筛选：脐带血来自医院足月妊娠健康产妇，产前检查乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、人类免疫缺陷病病毒、巨细胞病毒、EB病毒等均阴性，产妇及家属对脐带血用于实验研究均知情同意；
步骤二、标本前处理：标本表面的消毒处理，目的是去除表面污渍，和可能的细菌进入血液中；
步骤三、沉降并分离红细胞：脐带血标本中加入羟乙基淀粉，羟乙基淀粉可与红细胞膜上的负电荷结合，使红细胞凹面相贴体积增大而使得沉降速度加快，利用红细胞和白细胞的沉降速度的差异来实现分离红细胞；
步骤四、冻存：将一定比例的冻存液，加入步骤三得到的红细胞中；
步骤五、程控降温：将步骤四获得的红细胞制剂防止程控降温盒中，执行程序降温程序，从室温降至-80℃，制备成冰冻红细胞制剂；
步骤六、复苏解冻：将深低温保存一定时间的冰冻红细胞制剂进行快速复温；
步骤七、红细胞检测：将步骤六中复温的红细胞制剂进行血红蛋白、红细胞平均体积、红细胞渗透脆性试验、红细胞免疫功能检测。
2.根据权利要求1所述的一种脐带血红细胞冻存方法，其特征在于：所述步骤二中，脐带血标本先标记，再用热合机对采集管进行热合并称重，将标本采集袋放入84消毒液充分浸泡10-20分钟，然后用75%酒精擦拭消毒后放置4℃冰箱中，通过传递窗传至净化车间进行处理。
3.根据权利要求1所述的一种脐带血红细胞冻存方法，其特征在于：所述步骤三中，脐带血标本按照脐带血量：羟乙基淀粉=4：1加入所需羟乙基淀粉量，无菌操作下，将HES注入脐带血袋，用止血钳夹住针孔部位，然后用热合机封管，摇床500prm/min充分混匀10min，置4℃条件下，静置30min后，离心500rpm、7min，大致分为三层，上层血浆，中层干细胞，下层红细胞，夹紧150ml转移袋的止血夹，缓慢的将干细胞及血浆挤压至另外一个250ml转移袋，残留于母袋中的红细胞进行后续处理。
4.根据权利要求1所述的一种脐带血红细胞冻存方法，其特征在于：所述步骤四中，获取的红细胞加入冻存液，冻存液中加入0.3M海藻糖，15%右旋糖酐，12.25%HES，得到红细胞制剂。
5.根据权利要求1所述的一种脐带血红细胞冻存方法，其特征在于：所述步骤五中，得到的红细胞制剂利用程序降温降温，4℃等待，红细胞制剂放入程序降温仪；以5℃/min降至0℃，保持5min；以2℃/min降至-10℃，保持5min；以1℃/min降至-45℃，保持35min；以5℃/min降至-90℃，保持5min，程序结束后，制成冰冻红细胞制剂，将其放置-80℃冰箱中。
6.根据权利要求1所述的一种脐带血红细胞冻存方法，其特征在于：所述步骤六中，将深低温保持3、6个月的冰冻红细胞制剂取出，立即在38～43℃恒温水浴槽中1-2min内快速复温。
7.根据权利要求1所述的一种脐带血红细胞冻存方法，其特征在于：所述步骤七中，将快速复温的红细胞制剂进行各种红细胞的检测：分别进行血红蛋白、红细胞平均体积、红细胞渗透脆性试验、红细胞免疫功能检测采用流式双抗的方法进行红细胞平均荧光强度测定，一抗鼠抗人红细胞CR1，二抗使用羊抗鼠IgG-FITC，流式上机检测。
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