JP2022050596A - T細胞又はnk細胞の製造方法、t細胞又はnk細胞の培養用培地、t細胞又はnk細胞の培養方法、未分化t細胞の未分化状態を維持する方法及びt細胞又はnk細胞の増殖促進剤 - Google Patents
T細胞又はnk細胞の製造方法、t細胞又はnk細胞の培養用培地、t細胞又はnk細胞の培養方法、未分化t細胞の未分化状態を維持する方法及びt細胞又はnk細胞の増殖促進剤 Download PDFInfo
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Abstract
Description
しかし、多能性幹細胞から誘導したT細胞の培養において、通常、健常人ドナー等の由来の細胞がフィーダー細胞として用いられるが、未知成分の未知濃度における混入のおそれ、感染の危険性又はコストの問題があり、臨床応用における課題となっている(非特許文献2)。
しかし、依然として品質管理、安全性又はコスト等の面で優れた低分子化合物等を用いた画期的なNK細胞の増殖方法は見いだされていない。
1.下記式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する培地中でT細胞又はNK細胞を培養することを含む、T細胞又はNK細胞の製造方法。
R1及びR’1は、それぞれ独立して、H又は1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
R2、R’2、R3、R’3、R4、R’4、R5及びR’5は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR2及びR3、R4及びR5、R’2及びR’3、若しくはR’4及びR’5は、一緒になってO若しくはSを表し、
R6、R’6、R7及びR’7は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR6及びR7若しくはR’6及びR’7は、一緒になってO若しくはSを表し、
X1、X2、X3及びX4は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、H、ヒドロキシ、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、n1及びn3は、それぞれ独立して、0~3の整数であり、n2及びn4は、それぞれ独立して、0~4の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。]
2.前記T細胞又はNK細胞が免疫細胞療法用のT細胞又はNK細胞である、前記1に記載の製造方法。
3.前記T細胞又はNK細胞が末梢血由来、初代造血幹・前駆細胞由来又は多能性幹細胞由来の細胞である、前記1又は2に記載の製造方法。
4.前記T細胞が未分化T細胞である、前記1~3のいずれか1に記載の製造方法。
5.前記T細胞がCD4及びCD8の少なくとも一方を発現している、前記1~4のいずれか1に記載の製造方法。
6.前記T細胞が、ヘルパーT細胞、制御性T細胞、細胞傷害性T細胞、ナイーブT細胞、メモリーT細胞及びターミナルエフェクターT細胞からなる群から選ばれる1である前記1~5のいずれか1に記載の製造方法。
7.前記制御性T細胞がFoxP3を発現している、前記6に記載の製造方法。
8.前記メモリーT細胞がステムセルメモリーT細胞、セントラルメモリーT細胞又はエフェクターメモリーT細胞である、前記6に記載の製造方法。
9.前記NK細胞が未成熟NK細胞又は成熟NK細胞である、前記1~3のいずれか1に記載の製造方法。
10.前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩が、ベルバミン、(+)-ベルバミン、E6-ベルバミン、セファランチン及びその薬学的に許容される塩から選ばれる少なくとも1である前記1~9のいずれか1に記載の製造方法。
11.前記培地中の前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の濃度が0.1nM~10μMである前記1~10のいずれか1に記載の製造方法。
12.前記培地が更にMAPKカスケード阻害剤を含有する、前記1~11のいずれか1に記載の製造方法。
13.前記培地中にフィーダー細胞を含有しない、前記1~12のいずれか1に記載の製造方法。
14.前記培養する期間が50日間以上である、前記1~13のいずれか1に記載の製造方法。
15.前記1~14のいずれか1に記載の製造方法により製造されるT細胞又はNK細胞。
16.前記15に記載のT細胞又はNK細胞を含有する免疫細胞療法剤。
17.下記式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する、T細胞又はNK細胞培養用の培地。
R1及びR’1は、それぞれ独立して、H又は1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
R2、R’2、R3、R’3、R4、R’4、R5及びR’5は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR2及びR3、R4及びR5、R’2及びR’3、若しくはR’4及びR’5は、一緒になってO若しくはSを表し、
R6、R’6、R7、及びR’7は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR6及びR7若しくはR’6及びR’7は、一緒になってO若しくはSを表し、
X1、X2、X3及びX4は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、H、ヒドロキシ、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、n1及びn3は、それぞれ独立して、0~3の整数であり、n2及びn4は、それぞれ独立して、0~4の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。]
18.前記T細胞又はNK細胞が末梢血由来、初代造血幹・前駆細胞由来又は多能性幹細胞由来の細胞である、前記17に記載の培地。
19.前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩が、ベルバミン、(+)-ベルバミン、E6-ベルバミン及びセファランチン及びその薬学的に許容される塩から選ばれる少なくとも1である前記17又は18に記載の培地。
20.前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の濃度が0.1nM~10μMである前記17~19のいずれか1に記載の培地。
21.更にMAPKカスケード阻害剤を含有する前記17~20のいずれか1に記載の培地。
22.下記式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する培地中でT細胞又はNK細胞を培養する、T細胞又はNK細胞の培養方法。
R1及びR’1は、それぞれ独立して、H又は1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
R2、R’2、R3、R’3、R4、R’4、R5及びR’5は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR2及びR3、R4及びR5、R’2及びR’3、若しくはR’4及びR’5は、一緒になってO若しくはSを表し、
R6、R’6、R7、及びR’7は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR6及びR7若しくはR’6及びR’7は、一緒になってO若しくはSを表し、
X1、X2、X3及びX4は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、H、ヒドロキシ、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、n1及びn3は、それぞれ独立して、0~3の整数であり、n2及びn4は、それぞれ独立して、0~4の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。]
23.前記T細胞又はNK細胞が末梢血由来、初代造血幹・前駆細胞由来又は多能性幹細胞由来の細胞である、前記22に記載の培養方法。
24.前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩が、ベルバミン、(+)-ベルバミン、E6-ベルバミン及びセファランチン及びその薬学的に許容される塩から選ばれる少なくとも1である、前記22又は23に記載の培養方法。
25.前記培地中の前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の濃度が0.1nM~10μMである前記22~24のいずれか1に記載の培養方法。
26.下記式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する培地中で未分化T細胞を培養することを含む、前記未分化T細胞の未分化状態を維持する方法。
R1及びR’1は、それぞれ独立して、H又は1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
R2、R’2、R3、R’3、R4、R’4、R5及びR’5は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR2及びR3、R4及びR5、R’2及びR’3、若しくはR’4及びR’5は、一緒になってO若しくはSを表し、
R6、R’6、R7、及びR’7は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR6及びR7若しくはR’6及びR’7は、一緒になってO若しくはSを表し、
X1、X2、X3及びX4は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、H、ヒドロキシ、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、n1及びn3は、それぞれ独立して、0~3の整数であり、n2及びn4は、それぞれ独立して、0~4の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。]
27.下記式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、T細胞又はNK細胞の増殖促進剤。
R1及びR’1は、それぞれ独立して、H又は1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
R2、R’2、R3、R’3、R4、R’4、R5及びR’5は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR2及びR3、R4及びR5、R’2及びR’3、若しくはR’4及びR’5は、一緒になってO若しくはSを表し、
R6、R’6、R7、及びR’7は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR6及びR7若しくはR’6及びR’7は、一緒になってO若しくはSを表し、
X1、X2、X3及びX4は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、H、ヒドロキシ、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、n1及びn3は、それぞれ独立して、0~3の整数であり、n2及びn4は、それぞれ独立して、0~4の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。]
28.CaMKII阻害剤を含有する培地でT細胞又はNK細胞を培養することを含む、T細胞又はNK細胞の製造方法。
29.CaMKII阻害剤が下記式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩である前記28に記載の製造方法。
R1及びR’1は、それぞれ独立して、H又は1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
R2、R’2、R3、R’3、R4、R’4、R5及びR’5は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR2及びR3、R4及びR5、R’2及びR’3、若しくはR’4及びR’5は、一緒になってO若しくはSを表し、
R6、R’6、R7、及びR’7は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR6及びR7若しくはR’6及びR’7は、一緒になってO若しくはSを表し、
X1、X2、X3及びX4は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、H、ヒドロキシ、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、n1及びn3は、それぞれ独立して、0~3の整数であり、n2及びn4は、それぞれ独立して、0~4の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。]
本発明に係るT細胞又はNK細胞の製造方法は、式(X-1)又は(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する培地(以下、本発明に係るT細胞又はNK細胞の培養用培地ともいう)中でT細胞又はNK細胞を培養する工程を含む。
本発明における下記式(X-1)又は(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物について説明する。
R1及びR’1は、それぞれ独立して、H又は1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
R2、R’2、R3、R’3、R4、R’4、R5及びR’5は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR2及びR3、R4及びR5、R’2及びR’3、若しくはR’4及びR’5は、一緒になってO若しくはSを表し、
R6、R’6、R7及びR’7は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR6及びR7若しくはR’6及びR’7は、一緒になってO若しくはSを表し、
X1、X2、X3及びX4は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、H、ヒドロキシ、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、n1及びn3は、それぞれ独立して、0~3の整数であり、n2及びn4は、それぞれ独立して、0~4の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。
CaMKII阻害剤としては、上記式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩のほか、その制御ドメインに存在している自己リン酸化部位の配列に由来するペプチドAIP(Autocamtide 2 Related Inhibitory Peptide)、Staurosporine、Fasudil, Monohydrochloride Salt、1-Naphthyl PP1、K-252a、KN-62、Lavendustin C、12(S)-HPETE、K-252b、HA-1077 dihydrochloride、Arcyriaflavin A等が挙げられる。CaMKII阻害剤は、化合物単体でもよく、植物抽出物のような組成物又は混合物でもよい。また、CaMKII阻害剤は、人工的に合成されたものであってもよく、天然物由来であってもよい。
本発明におけるT細胞とは、表面にT細胞受容体(T cell receptor、TCR)と称される抗原受容体を発現している細胞を意味する。
ここで、CARとは、抗原に結合する細胞外ドメインと、前記細胞外ドメインとは異なるポリペプチドに由来する細胞内ドメインを含む融合タンパク質を意味する。CARとしては、例えば、特定の抗原に対する抗体の抗原認識部位(可変領域のL鎖とH鎖)を、例えば、CD3等のT細胞受容体の細胞内ドメイン及びCD28又は4-1BB等の共刺激分子の細胞内ドメインと結合させた融合タンパク質等が挙げられる(例えば、日本国特表2015-509716号公報)。
当該リンパ球は、所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製により特異的に単離されてもよい。この精製では、所望の抗原を結合させた主要組織適合遺伝子複合体(MHC)を4量体化させたもの(いわゆるMHCテトラマー)を用いて、ヒトの組織より所望の抗原特異性を有するリンパ球を精製する方法も採用することが出来る。
本発明におけるNK細胞は、いかなるNK細胞も利用することが出来る。なお、NK細胞の提供者(ドナー)とNK細胞の被提供者(レシーピエント)は、同種であることが好ましい。例えば、提供者がヒトの場合には、被提供者はヒトである。また、NK細胞の提供者とNK細胞の被提供者は、同一個体であることがより好ましい。例えば、ドナーが提供者Xの場合には、レシーピエントは提供者Xである。
本発明に係るT細胞又はNK細胞の培養用培地は、式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する。
T細胞又はNK細胞の培養に用いる培養器としては、特に限定されないが、例えば、フラスコ、ディッシュ、シャーレ、マイクロウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ又は培養バッグ等が挙げられる。これらの培養器の基材としては、特に限定されず、例えば、ガラス又はポリプロピレイン若しくはポリスチレン等の各種プラスチック等が挙げられる。
本発明の製造方法により得られるT細胞、NK細胞又はその細胞組成物は、免疫細胞療法剤に好適に用いることが出来る。T細胞、NK細胞又はその細胞組成物は、公知の手段にしたがって医薬上許容される担体と混合する等して、経口/非経口製剤、好ましくは、注射剤、懸濁剤又は点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖又はその他の補助薬を含む等張液(例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール又は塩化ナトリウム等)等の注射用の水性液を挙げることが出来る。
本発明に係る未分化T細胞の未分化状態を維持する方法は、上記したT細胞培養用培地中で、T細胞を培養することを特徴とする。T細胞の培養方法については上記と同様とする。当該培地中で未分化T細胞を培養することにより、式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の作用により、未分化T細胞の未分化状態を維持することが出来る。
本発明に係るT細胞又はNK細胞の増殖促進剤(以下、本発明に係る増殖促進剤とも略す)は、式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含むことを特徴とする。本発明に係る増殖促進剤を含む培地を用いてT細胞又はNK細胞を培養することにより、フィーダー細胞を用いない場合であっても、T細胞又はNK細胞の増殖効率が顕著に向上し、且つ該細胞の状態(例えば未分化性)を維持することが出来る。
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
iPS細胞からのT細胞の誘導は、非特許文献1に記載の方法を改変して行った。実施例1においてiPS細胞を分化誘導した手順の模式図を図1に示す。
実施例1の方法に従い得られるCD8(+)T細胞(T-iPS-T細胞)は数千から数万細胞しかない。この細胞をPhytohemagglutinin-P(PHA)及び健常人ドナー由来PBMCと共培養し、数万倍に増やした。実施例2においてiPS-T細胞をExpansionした手順の模式図を図2に示す。
iPS-T細胞におけるT細胞関連分子の発現をフローサイトメトリーにより解析した。解析にはCD8ab(+)iPS-T細胞をPHA及びPBMCにより0~2回expandした細胞を用いた。染色にはCD8β-PE(BECKMAN)、CD5-PECy7(ThermoFisher)、CD27-APC、CD28-BV421、CCR7-APC、CD45RA-BV510、CD45RO-APCCy7及びCD62L-FITC、CD95-PECy7(以上BioLegend)を用いた。解析はBD LSRFORTESSA cytometer(BD Bioscience)を用い、ヨウ化プロピジウム(PI)を用いて死細胞を除外した。
PBMCフィーダーを用いずにT-iPS-T細胞を培養し、増殖効率を改善させる低分子化合物をスクリーニングした。スクリーニングのスキームを図5(A)~(C)に示す。
CCR7陽性細胞数を指標とした低分子化合物のスクリーニング
T-iPS-T細胞及び、実施例4で用いた1080化合物から抽出した266化合物を用い、実施例4の培養方法に従い6日間培養し、CCR7及びCD45RAの発現をFACSで解析した。化合物と培養した細胞を96ウェルプレートに移し、染色液(2%FBSを含むPBS)で洗浄後、CCR7-APC(Biolegend、353214)及びCD45RA-BV510(Biolegend、304142)で染色した。
T-iPS-T細胞のフィーダーフリー増殖における式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイドの濃度依存性を検討した。T-iPS-T細胞を15% FBS、1% PSG、PAA(50μg/mL)、ITS-G、IL-7(5ng/mL)、IL-12(50ng/mL)、IL-15(5ng/mL)、IL-18(50ng/mL)、IL-21(20ng/mL)及びz-VAD-fmk(10μM)を添加したalpha-MEM培地を用いて培養した。また、培地に、式(I)又は式(II)で示される各種ビスベンジルイソキノリンアルカロイド[ベルバミン(SIGMA、547190)、(+)-ベルバミン(Ark Pharm、AK167975)、E6-ベルバミン(Santa Cruz、SC-221573)又はセファランチン(Cayman、19648)]を、1nM、3nM、10nM、30nM、100nM、300nM、1μM、3μM又は10μMの濃度にて添加した。6日間培養後、実施例5の方法と同様に染色と測定を行った。結果を図8及び図9に示す。
T-iPS-T細胞を用い、PBMCフィーダーを用いる実施例2と同様の刺激方法、CD3/CD28 Dynabeadsを用いる実施例4と同様の刺激方法、又はCD3/CD28 Dynabeadsにベルバミン(SIGMA、547190) 1μMを加えた実施例4と同様の刺激方法の3方法を用いて培養し、増殖促進効果を比較した。PBMCフィーダー細胞はT-iPS-T細胞と識別するためにCellTrace CFSE Cell Proliferation Kit-For Flow Cytometry(CFSE、Invitrogen、100nM)で標識し、放射線照射処理を行った。
実施例4により得られた結果を更に評価するため、再現性を評価した。方法は、実施例4と同様の方法で培養し、評価した。化合物はベルバミンを含む実施例4で用いた化合物のうち20化合物を選択して用い、化合物の溶媒であるDMSO(0.1%)を対照とした。なお、統計解析にはStudent’s t-testを用いた(*:p<0.05)。結果を図11に示す。
T-iPS-T細胞の培養における影響について、メモリーT細胞の増殖に寄与する既知化合物とベルバミンとを比較して評価した。方法は、1st expansion後のT-iPS-T細胞を実施例4と同様の方法でCD3/CD28 Dynabeadsで刺激し、既知化合物として知られるTWS119(Cayman、601514-19-6)(例えば、Gattinoni et al., Nat. Med., 15(7): 808-813, 2009)、(+)―JQ1(abcam、ab146612)(例えば、Gattinoni et al., Nat. Med., 15(7): 808-813, 2009)又はベルバミン(BBM、SIGMA社、547190)のいずれかを1μM添加した。化合物の溶媒であるDMSO(0.1%)を対照とした。
ベルバミンとMAPKカスケード阻害剤との併用によるメモリーT細胞の増殖への効果を検討した。方法は、1st expansion後のT-iPS-T細胞を実施例4と同様の方法でCD3/CD28 Dynabeadsで刺激し、ベルバミン(BBM)とCEP-32496(ERKカスケード阻害剤、Cayman、18776)、SB-203580(p38カスケード阻害剤、Cayman、13344)、Losmapimod(p38カスケード阻害剤、Cayman、13614)又はZM-336372(ERKカスケード阻害剤、Cayman、10010367)とを併用して添加した。各化合物の終濃度は1μMとした。化合物の溶媒であるDMSO(0.1%)を対照とした。
ベルバミン誘導体のT細胞増殖への影響を検証した。方法は、1st expansion後のT-iPS-T細胞を実施例4と同様の方法で培養し、ベルバミン(BBM)又は13種類の誘導体[BBM1~13、Hebei Sundia MediTech Company Ltd.]を終濃度0.1nM、1nM、10nM、100nM又は1μMとなるよう各ウェル1種ずつ添加し、37℃にて5%CO2下で培養した。化合物の溶媒であるDMSO(0.1%)を対照とした。
1.Xie et al., Eur J Med Chem, 44(8: 3293-8, 2009
2.Tan et al., International Jornal of Mass Spetrometry, 386: 37-41, 2015
3.Nam et al., Mol Oncol, 6(5): 484-93, 2012
ベルバミンを用いることによるT-iPS-T細胞の長期培養の可能性を評価した。実験スキームを図14(A)に示す。まず、T-iPS細胞からフィーダーを用いずにT細胞を誘導した。iPS細胞の維持は、フィーダーフリーiPS細胞はStemFit AK02N培地(Ajinomoto)を用いた。iMatrix-511をコートした培養表面にiPS細胞を剥離剤[1×TrypLE Select(Thermo Fisher Scientific)をPBSで1/2に希釈し、0.5mol/l-EDTA溶液(pH8、Nacalai tesque)を添加し、終濃度0.5×TrypLE Select、0.75mM EDTA]を用いて剥離し、StemFit AK02Nに10μM Y-27632を加えた培地に継代、培養した(37℃、5%CO2)。翌日、Stemfit AK02Nで培地交換を行った。この操作を週に一度繰り返し、iPS細胞を維持した。
ベルバミンが初代T細胞(CD4T、CD8T細胞)の増殖に与える影響を検討した。実験スキームを図16(A)に示す。方法は、PBMC(CTL社)からPan T Cell Isolation Kit,human(Miltenyi、130-096-535)を用いてCD3T細胞を精製した。精製したCD3T細胞(20000細胞/ウェル)を播種し、ベルバミン(BBM)1μM又は化合物の溶媒であるMilliQを対照として添加し、CD3/CD28 Dynabeads(60000ビーズ/ウェル)で刺激した。
以上の結果から、ベルバミンがMilliQと比較してCD4T及びCD8T細胞の増殖を亢進することが示された。
ベルバミン(BBM)の制御性T細胞(Treg)の増殖における有用性を検証した。方法は、3ドナーの健常人由来PBMC(CTL社)から追加実施例6と同様の方法でCD3T細胞を精製し、6日間培養した。6日間培養後、トリパンブルー法で生細胞数をカウントするとともにCD25(+)FoxP3(+)細胞の割合をFACSで解析した。
以上の結果、ベルバミンがMilliQと比較してTregの増殖を亢進することが示された。
非特許文献4には、T細胞には階層性が存在することが報告されている(図18A)。本実施例ではベルバミンがT細胞内で作用する分画を検証した。方法は、健常人由来PBMC(CTL社)を染色液(2%FBSを含むPBS)で洗浄後、CCR7-APC(Biolegend、353214)、CD45RA-BV510(Biolegend、304142)、CD45RO-APC―Cy7(Biolegend、307228)、CD95-PC―Cy7(Biolegend、305622)及びCD8β-PE(Beckman、IM2217U)、CD4-BV421(Biolegend、317434)で染色した。
以上の結果、ベルバミンはナイーブT細胞やステムセルメモリーT細胞を含むT細胞に作用することが示された。
ベルバミンと培養した細胞がマウスへの生着に及ぼす影響を検討した。実験スキームを図19(A)に示す。方法は、健常人由来PBMC(CTL社)からCD8 T Cell Isolation Kit,human(Miltenyi、130-096-495)を用いてCD8T細胞を精製した。
以上の結果、ベルバミンと培養した細胞を移植すると、MilliQと培養した細胞と比較して生体内での生着が亢進し、その後の増殖と治療効果を向上させる可能性が示唆された。
NK細胞に対するベルバミンの作用を検討した。実験スキームを図20(A)に示す。方法は、3ドナーの健常人由来PBMC(CTL社)からNK Cell Isolation Kit, human(Miltenyi、130-092-657)を用いてNK細胞を精製した。
以上の結果、ベルバミンがMilliQと比較してNK細胞の増殖を亢進させることが示された。
Claims (29)
- 下記式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する培地中でT細胞又はNK細胞を培養することを含む、T細胞又はNK細胞の製造方法。
R1及びR’1は、それぞれ独立して、H又は1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
R2、R’2、R3、R’3、R4、R’4、R5及びR’5は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR2及びR3、R4及びR5、R’2及びR’3、若しくはR’4及びR’5は、一緒になってO若しくはSを表し、
R6、R’6、R7及びR’7は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR6及びR7若しくはR’6及びR’7は、一緒になってO若しくはSを表し、
X1、X2、X3及びX4は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、H、ヒドロキシ、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、n1及びn3は、それぞれ独立して、0~3の整数であり、n2及びn4は、それぞれ独立して、0~4の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。] - 前記T細胞又はNK細胞が免疫細胞療法用のT細胞又はNK細胞である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記T細胞又はNK細胞が末梢血由来、初代造血幹・前駆細胞由来又は多能性幹細胞由来の細胞である、請求項1又は2に記載の製造方法。
- 前記T細胞が未分化T細胞である、請求項1~3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記T細胞がCD4及びCD8の少なくとも一方を発現している、請求項1~4のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記T細胞が、ヘルパーT細胞、制御性T細胞、細胞傷害性T細胞、ナイーブT細胞、メモリーT細胞及びターミナルエフェクターT細胞からなる群から選ばれる1である請求項1~5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記制御性T細胞がFoxP3を発現している、請求項6に記載の製造方法。
- 前記メモリーT細胞がステムセルメモリーT細胞又は、セントラルメモリーT細胞又はエフェクターメモリーT細胞である、請求項6に記載の製造方法。
- 前記NK細胞が未成熟NK細胞又は成熟NK細胞である、請求項1~3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩が、ベルバミン、(+)-ベルバミン、E6-ベルバミン、セファランチン及びその薬学的に許容される塩から選ばれる少なくとも1である請求項1~9のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記培地中の前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の濃度が0.1nM~10μMである請求項1~10のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記培地が更にMAPKカスケード阻害剤を含有する、請求項1~11のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記培地中にフィーダー細胞を含有しない、請求項1~12のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記培養する期間が50日間以上である、請求項1~13のいずれか1項に記載の製造方法。
- 請求項1~14のいずれか1項に記載の製造方法により製造されるT細胞又はNK細胞。
- 請求項15に記載のT細胞又はNK細胞を含有する免疫細胞療法剤。
- 下記式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する、T細胞又はNK細胞培養用の培地。
R1及びR’1は、それぞれ独立して、H又は1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
R2、R’2、R3、R’3、R4、R’4、R5及びR’5は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR2及びR3、R4及びR5、R’2及びR’3、若しくはR’4及びR’5は、一緒になってO若しくはSを表し、
R6、R’6、R7、及びR’7は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR6及びR7若しくはR’6及びR’7は、一緒になってO若しくはSを表し、
X1、X2、X3及びX4は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、H、ヒドロキシ、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、n1及びn3は、それぞれ独立して、0~3の整数であり、n2及びn4は、それぞれ独立して、0~4の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。] - 前記T細胞又はNK細胞が末梢血由来、初代造血幹・前駆細胞由来又は多能性幹細胞由来の細胞である、請求項17に記載の培地。
- 前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩が、ベルバミン、(+)-ベルバミン、E6-ベルバミン及びセファランチン及びその薬学的に許容される塩から選ばれる少なくとも1である請求項17又は18に記載の培地。
- 前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の濃度が0.1nM~10μMである請求項17~19のいずれか1項に記載の培地。
- 更にMAPKカスケード阻害剤を含有する請求項17~20のいずれか1項に記載の培地。
- 下記式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する培地中でT細胞又はNK細胞を培養する、T細胞又はNK細胞の培養方法。
R1及びR’1は、それぞれ独立して、H又は1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
R2、R’2、R3、R’3、R4、R’4、R5及びR’5は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR2及びR3、R4及びR5、R’2及びR’3、若しくはR’4及びR’5は、一緒になってO若しくはSを表し、
R6、R’6、R7、及びR’7は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR6及びR7若しくはR’6及びR’7は、一緒になってO若しくはSを表し、
X1、X2、X3及びX4は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、H、ヒドロキシ、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、n1及びn3は、それぞれ独立して、0~3の整数であり、n2及びn4は、それぞれ独立して、0~4の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。] - 前記T細胞又はNK細胞が末梢血由来、初代造血幹・前駆細胞由来又は多能性幹細胞由来の細胞である、請求項22に記載の培養方法。
- 前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩が、ベルバミン、(+)-ベルバミン、E6-ベルバミン及びセファランチン及びその薬学的に許容される塩から選ばれる少なくとも1である、請求項22又は23に記載の培養方法。
- 前記培地中の前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の濃度が0.1nM~10μMである請求項22~24のいずれか1項に記載の培養方法。
- 下記式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する培地中で未分化T細胞を培養することを含む、前記未分化T細胞の未分化状態を維持する方法。
R1及びR’1は、それぞれ独立して、H又は1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
R2、R’2、R3、R’3、R4、R’4、R5及びR’5は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR2及びR3、R4及びR5、R’2及びR’3、若しくはR’4及びR’5は、一緒になってO若しくはSを表し、
R6、R’6、R7、及びR’7は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR6及びR7若しくはR’6及びR’7は、一緒になってO若しくはSを表し、
X1、X2、X3及びX4は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、H、ヒドロキシ、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、n1及びn3は、それぞれ独立して、0~3の整数であり、n2及びn4は、それぞれ独立して、0~4の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。] - 下記式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、T細胞又はNK細胞の増殖促進剤。
R1及びR’1は、それぞれ独立して、H又は1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
R2、R’2、R3、R’3、R4、R’4、R5及びR’5は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR2及びR3、R4及びR5、R’2及びR’3、若しくはR’4及びR’5は、一緒になってO若しくはSを表し、
R6、R’6、R7、及びR’7は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR6及びR7若しくはR’6及びR’7は、一緒になってO若しくはSを表し、
X1、X2、X3及びX4は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、H、ヒドロキシ、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、n1及びn3は、それぞれ独立して、0~3の整数であり、n2及びn4は、それぞれ独立して、0~4の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。] - CaMKII阻害剤を含有する培地でT細胞又はNK細胞を培養することを含む、T細胞又はNK細胞の製造方法。
- CaMKII阻害剤が下記式(X-1)又は式(X-2)で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは1つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩である請求項28に記載の製造方法。
R1及びR’1は、それぞれ独立して、H又は1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
R2、R’2、R3、R’3、R4、R’4、R5及びR’5は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR2及びR3、R4及びR5、R’2及びR’3、若しくはR’4及びR’5は、一緒になってO若しくはSを表し、
R6、R’6、R7、及びR’7は、それぞれ独立に、H、アシル、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、O、N若しくはSヘテロ原子で中断されていてもよく、又はR6及びR7若しくはR’6及びR’7は、一緒になってO若しくはSを表し、
X1、X2、X3及びX4は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、H、ヒドロキシ、1~10個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、n1及びn3は、それぞれ独立して、0~3の整数であり、n2及びn4は、それぞれ独立して、0~4の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。]
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