JP2023539370A - 有核細胞を使用してタンパク質に対するｈｌａ非依存的な免疫応答を刺激する方法 - Google Patents
有核細胞を使用してタンパク質に対するｈｌａ非依存的な免疫応答を刺激する方法 Download PDFInfo
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Abstract
本願は、タンパク質またはその断片を含む有核細胞、タンパク質またはその断片を含むこのような有核細胞を製造する方法、およびＨＬＡ非依存的な様式で免疫応答を刺激するためにこのような改変型有核細胞（例えば、免疫細胞）を使用する方法を提供する。
Description
関連出願の相互参照
本願は、２０２０年９月２日に出願された米国仮特許出願第６３／０７３，９１０号、および２０２１年９月２日出願の米国仮特許出願第６３／１４７，４７３号の利益を主張するものであり、これらそれぞれの全体は参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
本願は、２０２０年９月２日に出願された米国仮特許出願第６３／０７３，９１０号、および２０２１年９月２日出願の米国仮特許出願第６３／１４７，４７３号の利益を主張するものであり、これらそれぞれの全体は参照により本明細書に組み込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピューター可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：７５０３２２００２９４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０２１年９月１日、サイズ：５０，２０３バイト）。
本開示は、概して、タンパク質またはその断片を含む有核細胞、そのような改変型有核細胞を製造する方法、および免疫応答を刺激するためにそのような改変型有核細胞を使用する方法に関する。
エピトープワクチンの開発に関連する様々な課題がある。これらのワクチンに関する研究は、当技術分野で数十年にわたって焦点を当てられてきた。がんの治療および感染症の予防のためのＨＬＡ制限型エピトープワクチンの研究開発は実質的な進歩を遂げているものの、ただ一つ、ペプチドベースの腎細胞がんワクチン（Ｉｍｍａｔｉｃｓ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨによって開発されたＩＭＡ９０１，９，１０）が、第ＩＩＩ相臨床試験に入ったことが知られているに過ぎない（ｗｗｗ．ｉｍｍａｔｉｃｓ．ｃｏｍ）。また、Ｚｈａｏ，Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１３ Ｄｅｃ １；９（１２）：２５６６－２５７７を参照されたい。
有効性がある一方で、ＨＬＡ制限型エピトープワクチンの制約として、ＭＨＣ制限則のゆえに患者集団の適用範囲を限定することがある。ほとんどの場合、例えば、ＨＬＡ－Ａ＊０２に制限された単一ペプチドエピトープのワクチンは、ＨＬＡ－Ａ＊０２を発現する患者（ヒト集団の約４０％）の治療にのみ有用である。これらのＨＬＡ制限を有さず、したがってＨＬＡ非依存性のワクチンを生み出すことは、ＨＬＡ発現にかかわらずすべての患者の治療を可能にするものとなる。ＨＬＡ非依存性のワクチンは、ワクチンの一部として標的抗原の完全長タンパク質を含めることによって達成することができる。完全長タンパク質は、タンパク質自体の送達、完全長タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および／または重複型合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）の使用によって達成され得る。
ＨＬＡ非依存的な様式で内因性ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導するための現在の方法は、交差提示のための樹状細胞への抗原の標的化に依存してきた。樹状細胞への抗原の標的化およびその後の交差提示は、ＣＤ８ Ｔ細胞応答を残しつつＣＤ４ Ｔ細胞応答を全般的に惹起するという複合的な非効率性がある。したがって、エピトープワクチンの分野の進歩に対するニーズがある。疾患関連抗原によって刺激されるＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）およびＣＤ４＋ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞は、疾患細胞を標的として破壊する潜在性がある。
特許出願および刊行物を含む本明細書に引用される全ての参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。特許公開公報ＷＯ２０１６０７０１３６、ＵＳ２０１８０１４２１９８、ＷＯ２０１７００８０６３、ＵＳ２０１８０２０１８８９、ＷＯ２０１９１７８００５、およびＷＯ２０１９１７８００６、ならびにＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２０１９４は、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。
Ｚｈａｏ，Ｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｖａｃｃｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１３ Ｄｅｃ １；９（１２）：２５６６－２５７７
一部の態様では、本発明は、個体における免疫応答を刺激する方法を提供し、本方法は、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞はタンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の態様では、本発明は、それを必要とする個体にワクチン接種する方法を提供し、本方法は、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞はタンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。
一部の態様では、本発明は、個体における免疫応答を刺激する方法を提供し、本方法は、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の態様では、本発明は、それを必要とする個体にワクチン接種する方法を提供し、本方法は、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞はタンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、上記有核細胞における発現のために最適化されたコドンである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基が修飾される。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基は、ホスホロチオエート残基、シュードウリジン残基、Ｎ１－メチルアデノシン残基、５－メチルシチジン残基、またはモルホリノ残基である。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片は、上記タンパク質またはその断片と、一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする一つまたは複数の核酸配列を含み、上記ｍＲＮＡの翻訳は、上記タンパク質と上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとの融合タンパク質を生成する。一部の実施形態では、免疫プロテアソーム標的化モチーフの非存在下での上記細胞における上記タンパク質の分解および／または上記細胞の表面上の上記タンパク質由来のペプチドの提示と比較して、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフは、上記細胞における上記タンパク質の分解および／または上記細胞の表面上の上記タンパク質由来のペプチドの提示を増強する。一部の実施形態では、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフは、上記融合タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端にある。一部の実施形態では、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフは、破壊ボックス（Ｄ－ボックス）ドメイン、ＫＥＫＥドメイン、および／またはｓｅｃ／ＭＩＴＤドメインである。
一部の態様では、本発明は、個体における免疫応答を刺激する方法を提供し、本方法は、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞は、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含み、上記二つ以上の抗原は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、本発明は、それを必要とする個体にワクチン接種する方法を提供し、本方法は、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞は、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含み、上記二つ以上の抗原は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記細胞は、上記タンパク質に由来する三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十またはそれ以上の抗原を含む。一部の実施形態では、上記抗原のうちの少なくとも二つは、部分的に重複するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記抗原のすべてを組み合わせたアミノ酸配列は、上記タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上重複している。一部の実施形態では、上記抗原は、上記タンパク質の二つ以上のエピトープを含むポリペプチドである。一部の実施形態では、上記抗原は、上記タンパク質の一つまたは複数のエピトープと一つまたは複数の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである。一部の実施形態では、一つまたは複数のエピトープは、Ｎ末端および／またはＣ末端で一つまたは複数の異種ペプチド配列に隣接する。一部の実施形態では、上記Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチド配列は、免疫原性合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）に由来する。一部の実施形態では、上記Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチドは、疾患関連免疫原性ＳＬＰに由来する。一部の実施形態では、上記一つまたは複数の抗原は、上記タンパク質のアミノ酸配列の約９０％超または上記タンパク質のアミノ酸配列の約１００％に相当する、一連の重複型ＳＬＰである。
本発明の一部の実施形態では、上記タンパク質は、がんに関連する変異タンパク質、癌遺伝子産物、ネオ抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である。一部の実施形態では、個体における免疫応答の刺激は、がん、感染症、またはウイルス関連疾患の治療に使用される。一部の実施例では、ウイルス関連疾患は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に関連する疾患である。一部の実施形態では、上記タンパク質はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＰＶは、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、コアタンパク質、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、ｅ抗原、Ｘ抗原、またはポリメラーゼタンパク質である。
本発明の一部の実施形態では、上記組成物は、アジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、上記組成物は、アジュバントと併せて投与される。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。
本発明の一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を上記タンパク質またはその断片とインキュベートして、上記タンパク質またはその断片が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む上記有核細胞は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む有核細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、二つ以上の抗原を含む上記有核細胞は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記二つ以上の抗原が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を二つ以上の抗原とインキュベートして、上記二つ以上の抗原が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、二つ以上の抗原を含む有核細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３．０μｍ～約４．２μｍ、または約３．０μｍ～約４．８μｍ、または約３．０μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３．５μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約４．５μｍまたは約４．０μｍである。一部の実施形態では、上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液は、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部は、直列および／または並列に配置されている。
本発明の一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記個体に対して自己または同種である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、アジュバントにより馴化されて、馴化細胞を形成する。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードする上記ｍＲＮＡを上記有核細胞に導入する前または後に馴化される。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧ ７９０９である。
一部の実施形態では、上記馴化細胞は、馴化された複数のＰＢＭＣである。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するように改変される。一部の実施形態では、上記共刺激分子は、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２である。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数のサイトカインの発現が増加するように改変される。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、キメラ膜結合型サイトカインを含むように改変される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、上記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合される。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である。一部の実施形態では、上記サイトカインは、Ｉ型サイトカインである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、一つまたは複数の共刺激分子は、上記馴化されていない複数のＰＢＭＣ中のＢ細胞と比較して、馴化された複数のＰＢＭＣのＢ細胞では上方制御されており、上記共刺激分子は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６である。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、馴化されていない複数のＰＢＭＣと比較して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が増加している。一部の実施形態では、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現は、上記複数の馴化されていないＰＢＭＣと比較して、約１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、または１０倍を超えて増加している。
本発明の一部の実施形態では、有核細胞を含む上記組成物は、複数回投与される。一部の実施形態では、上記組成物は、静脈内に投与される。一部の実施形態では、上記個体は、ヒトである。一部の実施形態では、上記組成物は、別の療法の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与される。一部の実施形態では、別の療法は、免疫腫瘍療法で使用される化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、または二重特異性ポリペプチドである。
一部の態様では、本発明は、有核細胞を含む組成物を提供し、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の態様では、本発明は、有核細胞を含む組成物を提供し、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、上記有核細胞における発現のために最適化されたコドンである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基が修飾される。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基は、ホスホロチオエート残基、シュードウリジン残基、Ｎ１－メチルアデノシン残基、５－メチルシチジン残基、またはモルホリノ残基である。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片は、上記タンパク質またはその断片と、一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする一つまたは複数の核酸配列を含み、上記ｍＲＮＡの翻訳は、上記タンパク質と上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとの融合タンパク質を生成する。一部の実施形態では、免疫プロテアソーム標的化モチーフの非存在下での上記細胞における上記タンパク質の分解および／または上記細胞の表面上の上記タンパク質由来のペプチドの提示と比較して、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフは、上記細胞における上記タンパク質の分解および／または上記細胞の表面上の上記タンパク質由来のペプチドの提示を増強する。一部の実施形態では、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフは、上記融合タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端にある。一部の実施形態では、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフは、破壊ボックス（Ｄ－ボックス）ドメイン、ＫＥＫＥドメイン、および／またはｓｅｃ／ＭＩＴＤドメインである。
一部の実施形態では、本発明は、有核細胞を含む組成物を提供し、上記有核細胞は、二つ以上の抗原を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記細胞は、上記タンパク質に由来する三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十またはそれ以上の抗原を含む。一部の実施形態では、上記抗原のうちの少なくとも二つは、部分的に重複するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記抗原のすべてを組み合わせたアミノ酸配列は、上記タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上重複している。一部の実施形態では、上記抗原は、上記タンパク質の二つ以上のエピトープを含むポリペプチドである。一部の実施形態では、上記抗原は、上記タンパク質の一つまたは複数のエピトープと一つまたは複数の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである。一部の実施形態では、一つまたは複数のエピトープは、Ｎ末端および／またはＣ末端で一つまたは複数の異種ペプチド配列に隣接する。一部の実施形態では、上記Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチド配列は、免疫原性合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）に由来する。一部の実施形態では、上記Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチドは、疾患関連免疫原性ＳＬＰに由来する。一部の実施形態では、上記一つまたは複数の抗原は、上記タンパク質のアミノ酸配列の約９０％超または上記タンパク質のアミノ酸配列の約１００％に相当する、一連の重複型ＳＬＰである。
本発明の一部の実施形態では、上記タンパク質は、がんに関連する変異タンパク質、癌遺伝子産物、ネオ抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である。一部の実施形態では、個体における免疫応答の刺激は、がん、感染症、またはウイルス関連疾患の治療に使用される。一部の実施例では、ウイルス関連疾患は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に関連する疾患である。一部の実施形態では、上記タンパク質はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＰＶは、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、コアタンパク質、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、ｅ抗原、Ｘ抗原、またはポリメラーゼタンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質はＣＭＶタンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質はＣＭＶ構造タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質はＣＭＶ ｐｐ６５タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質はインフルエンザタンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質はインフルエンザマトリックスタンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質はインフルエンザタンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質はインフルエンザマトリックスタンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質はインフルエンザＭ１タンパク質である。一部の実施形態では、個体における免疫応答を刺激することが、黒色腫の治療に使用される。一部の実施形態では、上記タンパク質は、Ｔ細胞によって認識される黒色腫関連抗原（ＭＡＲＴ－１）である。
本発明の一部の実施形態では、上記組成物は、アジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、上記組成物は、アジュバントと併せて投与される。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。
本発明の一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を上記タンパク質またはその断片とインキュベートして、上記タンパク質またはその断片が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む上記有核細胞は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む有核細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、二つ以上の抗原を含む上記有核細胞は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記二つ以上の抗原が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を二つ以上の抗原とインキュベートして、上記二つ以上の抗原が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、二つ以上の抗原を含む有核細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３．０μｍ～約４．２μｍ、または約３．０μｍ～約４．８μｍ、または約３．０μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３．５μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約４．５μｍまたは約４．０μｍである。一部の実施形態では、上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液は、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部は、直列および／または並列に配置されている。
本発明の一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記個体に対して自己または同種である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、免疫細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、アジュバントにより馴化されて、馴化細胞を形成する。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードする上記ｍＲＮＡを上記有核細胞に導入する前または後に馴化される。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧ ７９０９である。
一部の実施形態では、上記馴化細胞は、馴化された複数のＰＢＭＣである。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するように改変される。一部の実施形態では、上記共刺激分子は、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２である。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数のサイトカインの発現が増加するように改変される。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、キメラ膜結合型サイトカインを含むように改変される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、上記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合される。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である。一部の実施形態では、上記サイトカインは、Ｉ型サイトカインである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、一つまたは複数の共刺激分子は、上記馴化されていない複数のＰＢＭＣ中のＢ細胞と比較して、馴化された複数のＰＢＭＣのＢ細胞では上方制御されており、上記共刺激分子は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６である。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、馴化されていない複数のＰＢＭＣと比較して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が増加している。一部の実施形態では、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現は、上記複数の馴化されていないＰＢＭＣと比較して、約１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、または１０倍を超えて増加している。
一部の態様では、本発明は、個体における免疫応答を刺激するための組成物を提供し、上記組成物は、本明細書に記載の有効量の組成物を含み、上記組成物は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の態様では、本発明は、医薬として使用するための組成物を提供し、上記組成物は、本明細書に記載の有効量の組成物を含み、上記組成物は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の態様では、本発明は、個体におけるがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための組成物を提供し、上記組成物は、本明細書に記載の有効量の組成物を含み、上記組成物は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記組成物は、アジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、上記組成物は、アジュバントと併せて投与される。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。一部の実施形態では、有核細胞を含む上記組成物は、複数回投与される。一部の実施形態では、上記組成物は、静脈内に投与される。一部の実施形態では、上記個体は、ヒトである。一部の実施形態では、上記組成物は、別の療法の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与される。一部の実施形態では、別の療法は、免疫腫瘍療法で使用される化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、または二重特異性ポリペプチドである。
一部の態様では、本発明は、個体における免疫応答を刺激するための医薬の製造での組成物の使用を提供し、上記組成物は、本明細書に記載の有効量の組成物を含み、上記組成物は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の態様では、本発明は、個体におけるがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための医薬の製造での組成物の使用を提供し、上記組成物は、本明細書に記載の有効量の組成物を含み、上記組成物は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記組成物は、アジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、上記組成物は、アジュバントと併せて製剤化される。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。一部の実施形態では、有核細胞を含む上記組成物は、複数回投与される。一部の実施形態では、上記組成物は、静脈内に投与される。一部の実施形態では、上記個体は、ヒトである。一部の実施形態では、上記組成物は、別の療法の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与される。一部の実施形態では、別の療法は、免疫腫瘍療法で使用される化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、または二重特異性ポリペプチドである。
一部の態様では、本発明は、本明細書に記載される方法のいずれかで使用するためのキットを提供する。一部の態様では、本発明は、本明細書に記載される組成物のいずれかを含むキットを提供する。一部の実施形態では、上記キットは、緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、または上記組成物を個体に投与してＨＬＡ非依存的な様式で免疫応答を刺激するための指示を伴う添付文書のうちの一つまたは複数をさらに含む。
一部の態様では、本発明は、タンパク質またはその断片を含む有核細胞を作製する方法を提供し、本方法は、上記タンパク質またはその断片を上記有核細胞に導入することを含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の態様では、本発明は、タンパク質またはその断片を含む有核細胞を作製する方法を提供し、本方法は、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを上記有核細胞に導入することを含み、上記ｍＲＮＡは、発現されて上記タンパク質またはその断片を産生し、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の態様では、本発明は、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含む有核細胞を作製する方法を提供し、本方法は、上記二つ以上の抗原を上記有核細胞に導入することを含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を上記有核細胞内に導入することは、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を上記タンパク質またはその断片とインキュベートして、上記タンパク質またはその断片が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を生成することを含む。本発明の一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む上記有核細胞は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む有核細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、二つ以上の抗原を含む上記有核細胞は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記二つ以上の抗原が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を二つ以上の抗原とインキュベートして、上記二つ以上の抗原が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、二つ以上の抗原を含む有核細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３．５μｍ～約４．２μｍ、または約３．５μｍ～約４．８μｍ、または約３．５μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３．５μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約４．５μｍである。一部の実施形態では、上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液は、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部は、直列および／または並列に配置されている。一部の実施形態では、上記方法は、上記有核細胞をアジュバントにより馴化して、馴化細胞を形成することを含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記タンパク質もしくはその断片、上記タンパク質もしくはその断片をコードする上記ｍＲＮＡ、またはタンパク質由来の上記二つ以上の抗原を上記有核細胞に導入する前または後に馴化される。
一部の態様では、本発明は、免疫細胞の活性を増強する方法を提供し、本方法は、上記免疫細胞においてキメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸を発現することを含む。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、膜貫通ドメインとサイトカインとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＴＦＲＣ）または腫瘍壊死因子膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、Ｉ型サイトカインである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合される。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、上記免疫細胞は、抗原をさらに含む。一部の実施形態では、上記免疫細胞は、抗原をコードするｍＲＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、上記抗原は、タンパク質またはその断片であり、このタンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記免疫細胞は、タンパク質由来の二つ以上の抗原をさらに含む。一部の実施形態では、上記二つ以上の抗原は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記タンパク質は、がんに関連する変異タンパク質、癌遺伝子産物、ネオ抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＰＶは、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、コアタンパク質、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、ｅ抗原、Ｘ抗原、またはポリメラーゼタンパク質である。
本発明の一部の実施形態では、上記免疫細胞は、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む。一部の実施形態では、上記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、アジュバントにより馴化されて、馴化細胞を形成する。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードする上記ｍＲＮＡを上記有核細胞に導入する前または後に馴化される。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。
本発明の一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能として、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインを含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸は、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と上記抗原とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸および上記抗原とインキュベートして、上記核酸および上記抗原が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインとタンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡとを含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と上記抗原をコードする核酸とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸および上記抗原をコードする核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸および上記抗原をコードする核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸および／または上記抗原をコードする核酸は、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインおよびタンパク質由来の上記二つ以上の抗原を含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸とタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸およびタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３．５μｍ～約４．２μｍ、または約３．５μｍ～約４．８μｍ、または約３．５μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３．５μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約４．５μｍである。一部の実施形態では、上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液は、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部は、直列および／または並列に配置されている。
一部の態様では、本発明は、免疫細胞の活性を増強する組成物を提供し、上記組成物は、上記免疫細胞にキメラ膜結合型サイトカインを含む。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、膜貫通ドメインとサイトカインとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＴＦＲＣ）または腫瘍壊死因子膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、Ｉ型サイトカインである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合される。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、上記免疫細胞は、抗原をさらに含む。一部の実施形態では、上記免疫細胞は、抗原をコードするｍＲＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、上記抗原は、タンパク質またはその断片であり、このタンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記免疫細胞は、タンパク質由来の二つ以上の抗原をさらに含む。一部の実施形態では、上記二つ以上の抗原は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記タンパク質は、がんに関連する変異タンパク質、癌遺伝子産物、ネオ抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＰＶは、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、コアタンパク質、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、ｅ抗原、Ｘ抗原、またはポリメラーゼタンパク質である。
本発明の一部の実施形態では、上記免疫細胞は、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む。一部の実施形態では、上記免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、アジュバントにより馴化されて、馴化細胞を形成する。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードする上記ｍＲＮＡを上記有核細胞に導入する前または後に馴化される。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。
本発明の一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能として、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインを含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸は、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と上記抗原とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸および上記抗原とインキュベートして、上記核酸および上記抗原が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインとタンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡとを含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と上記抗原をコードする核酸とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸および上記抗原をコードする核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸および上記抗原をコードする核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸および／または上記抗原をコードする核酸は、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインおよびタンパク質由来の上記二つ以上の抗原を含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸とタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸およびタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３．５μｍ～約４．２μｍ、または約３．５μｍ～約４．８μｍ、または約３．５μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３．５μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約４．５μｍである。一部の実施形態では、上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液は、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部は、直列および／または並列に配置されている。
一部の態様では、本発明は、医薬として使用するための組成物を提供し、上記組成物は、本明細書に記載のキメラ膜結合型サイトカインを含む細胞を含む有効量の組成物を含む。一部の態様では、本発明は、個体におけるがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための組成物を提供し、上記組成物は、本明細書に記載のキメラ膜結合型サイトカインを含む細胞を含む有効量の組成物を含む。
一部の態様では、本発明は、キメラ膜結合型サイトカインを含む免疫細胞を作製する方法を提供し、本方法は、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸を上記免疫細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能として、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインを含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸は、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３．５μｍ～約４．２μｍ、または約３．５μｍ～約４．８μｍ、または約３．５μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３．５μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約４．５μｍである。一部の実施形態では、上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液は、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部は、直列および／または並列に配置されている。
図２２Ａ、Ｂは、ＣＭＶ ｐｐ６５抗原、ＣＤＣＤ８６、膜結合型ＩＬ－２（ｍｂＩＬ－２）、および／または膜結合型ＩＬ－１２（ｍｂＩＬ－１２）をコードする標示されたｍＲＮＡを圧迫装填したＰＢＭＣにおけるＣＤ８６発現細胞のパーセンテージおよびＣＤ８６発現量のそれぞれと、ＰＢＭＣに含まれる構成細胞のタイプと示すグラフを含む。
同上。
同上。
同上。
同上。
同上。
一部の態様では、本発明は、個体における免疫応答をシミュレートする方法、および／またはそれを必要とする個体にワクチン接種する方法を提供し、本方法は、タンパク質またはその断片を含む有核細胞（例えばＰＢＭＣ）を含む組成物を上記個体に投与することを含み、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の態様では、本発明は、個体における免疫応答をシミュレートする方法、および／またはそれを必要とする個体にワクチン接種する方法を提供し、本方法は、細胞内に送達されるタンパク質またはその断片を含む有核細胞を含む有効量の組成物を上記個体に投与することを含み、上記有核細胞は、まず、インプット細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに、次いで、上記摂動インプット有核細胞を上記タンパク質またはその断片とインキュベートして、上記タンパク質またはその断片が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む改変型有核細胞を生成することを含み、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の態様では、本発明は、個体における免疫応答をシミュレートする方法、および／またはそれを必要とする個体にワクチン接種する方法を提供し、本方法は、細胞内に送達されるタンパク質またはその断片を含む有核細胞を含む有効量の組成物を上記個体に投与することを含み、上記有核細胞は、まず、インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに、上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡが発現して、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む上記改変型有核細胞を生成することを含み、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。本開示の特定の態様は、細胞内に送達されるタンパク質またはその断片を含む有核細胞を含む組成物を生成するための方法に関し、有核細胞は、狭窄部を通過し、上記狭窄部は、上記細胞を変形させ、それによって、タンパク質またはその断片が上記免疫細胞に入ってそれを改変するように上記細胞の摂動を引き起こす。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数のＰＢＭＣである。一部の実施形態では、上記有核細胞は、一つまたは複数のアジュバントをインキュベートすることによって馴化される。一部の実施形態では、細胞内に導入された上記タンパク質または断片は、上記天然型タンパク質配列の全体または実質的に大部分を含む。一部の実施形態では、細胞内に導入されたｍＲＮＡによりコードされる上記タンパク質または断片は、上記天然型タンパク質配列の全体または実質的に大部分を含む。
本明細書で説明または参照される技術および手順は、一般的に十分に理解されており、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２０１２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２００３）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．，１９９５）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．，１９８８）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ （Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１０）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ （Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９８）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ （Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９８）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ （Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９３－８）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９６）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ （Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２００２）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ （Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，２００４）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ （Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ （Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ （Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，２０１１）に記載される広範に利用されている方法論など、当業者によって従来の方法論を使用して一般的に利用される。
定義
定義
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用されるが、適切な場合には、単数形で使用される用語は複数形を含み、その逆も同様である。以下に記載されるいずれかの定義が、参照により本明細書に組み込まれるいずれかの文書と矛盾する場合、上記に定める定義が優先するものとする。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段の指示がない限り、複数の参照を含む。
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、「含む」、「からなる」、および「から本質的になる」態様および実施形態を含むことが理解される。
本明細書で使用される「約」という用語は、当技術分野の当業者に容易に認識されるそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における値またはパラメータの「約」への言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（および説明する）。
本明細書で使用される場合、「治療」は、有益なまたは望ましい臨床結果を得るためのアプローチである。本明細書で使用される「治療」は、ヒトを含む哺乳動物における疾患に対する治療剤の任意の投与または適用を包含する。本発明の目的のために、有益なまたは望ましい臨床結果には、一つまたは複数の症状の緩和、疾患の程度の軽減、疾患の拡大（例えば転移、例えば肺またはリンパ節への転移など）の予防または遅延、疾患の再発の予防または遅延、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の回復、疾患または疾患の進行の阻害、疾患もしくはその進行の阻害または緩徐化、その発達の停止、および寛解 （部分的または全体的）のうちのいずれか一つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。また、増殖性疾患の病理学的結果の減少も「治療」に包含される。本発明の方法は、治療のこれらの態様のうちのいずれか一つまたは複数を企図する。
本明細書で使用される場合、「予防的治療」という用語は、個体が、障害を有することまたは障害を有するリスクがあることが知られているかまたは疑われるが、障害の症状を呈していないかまたは最小限の症状を呈している治療を指す。予防的治療を受ける個体は、症状の発症前に治療され得る。一部の実施形態では、個体は、それらが前がん病変を有する場合に治療され得る。
本明細書で使用される場合、「併用療法」とは、第一の薬剤が別の薬剤と併せて投与されることを意味する。「と併せて」とは、同じ個体への本明細書に記載の免疫コンジュゲートの投与に加えて本明細書に記載の有核細胞の組成物を投与するなど、別の治療モダリティに加えてある一つの治療モダリティを投与することを指す。したがって、「と併せて」とは、この個体へ他の治療モダリティを送達する前、間、または後に、ある一つの治療モダリティを投与することを指す。
本明細書で使用される「同時投与」という用語は、併用療法における第一の療法および第二の療法が、約１５分以内、例えば約１０分以内、５分以内、または１分以内のうちのいずれかなどの時間間隔で投与されることを意味する。第一および第二の療法が同時に投与される場合、この第一および第二の療法は、同じ組成物中に含まれてもよいし（例えば、第一および第二の療法のどちらも含む組成物）、別の組成物に含まれてもよい（例えば、一方の組成物中に第一の療法が含まれ、別の組成物中に第二の療法が含まれる）。
本明細書で使用される場合、「連続投与」という用語は、併用療法における第一の療法および第二の療法が、約１５分超、例えば約２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、またはそれ以上のうちのいずれかなどの時間間隔で投与されることを意味する。第一の療法または第二の療法のいずれかが最初に投与され得る。第一および第二の療法は、同じまたは異なるパッケージまたはキットに含まれ得る別々の組成物中に含まれる。
本明細書で使用される場合、「同時投与」という用語は、併用療法における第一の療法および第二の療法の投与が互いに重複することを意味する。
がんの文脈において、「治療する」という用語は、がん細胞を死滅させること、がん細胞の成長を阻害すること、がん細胞の複製を阻害すること、全体的な腫瘍負荷を軽減すること、および疾患に関連する一つまたは複数の症状を寛解させることのうちのいずれかまたはすべてを含む。
本明細書で使用される「細孔」という用語は、開口部を指し、以下に限定されないが、材料内の穴、裂け目、空洞、隙間、切れ目、間隙、または穿孔が挙げられる。一部の例では、（示されている場合）この用語は、本開示の表面内の細孔を指す。他の例では、（示されている場合）細孔は、細胞膜の細孔を指すことができる。
本明細書で使用される「膜」という用語は、細孔を含有する選択的バリアまたはシートを指す。この用語は、境界または内張として作用する、柔軟なシート様構造を含む。一部の例では、用語は、細孔を含有する表面またはフィルタを指す。この用語は、「細胞膜」という用語とは異なる。
本明細書で使用される「フィルタ」という用語は、細孔を選択的に通過することが可能である多孔性物品を指す。一部の例では、この用語は、細孔を含有する表面または膜を指す。
細胞に関連する抗原またはアジュバントなどの剤に関して使用される場合の「外因性」という用語は、細胞の外側の剤または細胞の外側から細胞内に送達される剤を指す。細胞は、既に存在する剤を有してもよいし有しなくてもよく、外因性の剤が送達された後にこの剤を産生してもよいし産生しなくてもよい。
本明細書で使用される「異種」という用語は、構造または組成が混合されているかまたは均一でないものを指す。一部の例では、この用語は、所与の表面内で様々なサイズ、形状、または分布を有する細孔を指す。
本明細書で使用される「同種」という用語は、全体を通して構造または組成が一貫しているかまたは均一であるものを指す。一部の例では、この用語は、所与の表面内で一貫したサイズ、形状、または分布を有する細孔を指す。
本明細書で使用される「相同」という用語は、同じ生物に由来する分子を指す。一部の例では、この用語は、所与の生物内で通常見出されるかもしくは発現される、核酸またはタンパク質を指す。
コード配列および制御配列などの核酸配列に関連するような「異種」という用語は、通常は一緒に連結されていないおよび／または特定の細胞と通常は関連しない配列を意味する。したがって、核酸構築物またはベクターの「異種」領域は、天然では他の分子と関連して見出されない、別の核酸分子内のまたは別の核酸分子と付着した核酸のセグメントである。例えば、核酸構築物の異種領域は、天然ではコード配列と関連して見出されない配列が隣接するコード配列を含み得る。異種コード配列の別の例は、コード配列自体が天然には見出されない構築物である（例えば、天然の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。同様に、細胞内に通常存在しない構築物で形質転換された細胞は、本発明の目的では異種と考えられるものとなる。対立遺伝子変異または自然に発生する変異事象は、本明細書で使用される場合、異種ＤＮＡを生じさせない。
ペプチド配列およびポリペプチド配列などのアミノ酸配列に関連するような「異種」という用語は、通常は一緒に連結されていないおよび／または特定の細胞と通常は関連しない配列を意味する。したがって、ペプチド配列の「異種」領域は、天然では他の分子と関連して見出されない、別のアミノ酸分子内にあるかまたは別のアミノ酸分子に付加したアミノ酸のセグメントである。例えば、ペプチド構築物の異種領域は、天然ではペプチドのアミノ酸配列と関連して見出されない配列が隣接するペプチドのアミノ酸配列を含み得る。異種ペプチド配列の別の例は、ペプチド配列自体が天然には見出されない構築物である（例えば、天然遺伝子とは異なるコードされたアミノ酸を有する合成配列）。同様に、細胞内に通常存在しないアミノ酸構築物を発現するベクターにより形質転換された細胞は、本発明の目的では異種と考えられるものとなる。対立遺伝子変異または自然に発生する変異事象は、本明細書で使用される場合、異種ペプチドを生じさせない。
本明細書で使用される場合、「阻害する」という用語は、特定の標的の存在または活性を遮断、低減、排除、またはその他拮抗する作用を指し得る。阻害は、部分的阻害または完全阻害を指し得る。例えば、免疫応答を阻害することは、免疫応答の遮断、低減、排除、または任意の他の拮抗作用をもたらす任意の作用を指し得る。他の例では、核酸の発現の阻害には、核酸の転写の低減、ｍＲＮＡ存在量の低減（例えば、ｍＲＮＡ転写のサイレンシング）、ｍＲＮＡの分解、ｍＲＮＡ翻訳の阻害などが含まれるが、これらに限定されない。別の実施例では、阻害は、例えば、腫瘍細胞の成長を遅延もしくは防止するなど、成長を緩徐化または停止する作用を指し得る。
本明細書で使用される場合、「抑制する」という用語は、特定の標的の存在または活性を減少、低減、妨害、制限、軽減、またはその他縮小する作用を指し得る。抑制は、部分的な抑制または完全な抑制を指し得る。例えば、免疫応答を抑制することは、免疫応答を減少、低減、妨害、制限、軽減、またはその他縮小することをもたらす任意の作用を指し得る。他の例では、核酸の発現の抑制には、核酸の転写の低減、ｍＲＮＡ存在量の低減（例えば、ｍＲＮＡ転写のサイレンシング）、ｍＲＮＡの分解、ｍＲＮＡ翻訳の阻害などが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「増強する」という用語は、特定の標的の存在または活性を向上させる、ブーストする、高める、またはその他増加させる作用を指し得る。例えば、免疫応答を増強することは、免疫応答を向上させる、ブーストする、高める、またはその他増加させることをもたらす任意の作用を指し得る。例示的な一例では、免疫応答を増強することは、抗原および／またはアジュバントを利用して、免疫応答を向上させる、ブーストする、高める、またはその他増加することを指し得る。他の例では、核酸の発現を増強することには、核酸の転写の増加、ｍＲＮＡ存在量の増加（例えば、ｍＲＮＡ転写の増加）、ｍＲＮＡの分解の減少、ｍＲＮＡ翻訳の増加などが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、特定の標的の存在または活性を変える、変化させる、変更する、またはその他改変する作用を指し得る。例えば、免疫応答を調節することは、免疫応答を変える、変化させる、変更する、またはその他改変することをもたらす任意の作用を指し得る。一部の例では、「調節」は、特定の標的の存在または活性を増強することを指す。一部の例では、「調節」は、特定の標的の存在または活性を抑制することを指す。他の例では、核酸の発現を調節することには、核酸の転写の変化、ｍＲＮＡ存在量の変化（例えば、ｍＲＮＡ転写の増加）、ｍＲＮＡ分解の対応する変化、ｍＲＮＡ翻訳の変化などを含み得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「誘導する」という用語は、効果を開始、促進、刺激、確立、またはその他産生する作用を指し得る。例えば、免疫応答を誘導することは、所望の免疫応答を開始、促進、刺激、確立、またはその他産生することをもたらす任意の作用を指し得る。他の例では、核酸の発現を誘導することには、核酸の転写の開始、ｍＲＮＡ翻訳の開始などが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「末梢血単核細胞」または「ＰＢＭＣ」は、丸い核を有する血液細胞の不均一な集団を指す。ＰＢＭＣの集団に見出され得る細胞の例には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞（ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）およびサイトカイン誘導性キラー細胞（ＣＩＫ細胞）を含む）などのリンパ球、ならびにマクロファージおよび樹状細胞などの単球が含まれ得る。本明細書で使用される「複数のＰＢＭＣ」とは、少なくとも二種類の血液細胞の細胞を含むＰＢＭＣの調製物を指す。一部の実施形態では、複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、または樹状細胞のうちの二つ以上を含む。一部の実施形態では、複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、または樹状細胞のうちの三つ以上を含む。一部の実施形態では、複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、または樹状細胞のうちの四つ以上を含む。一部の実施形態では、複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、および樹状細胞を含む。
ＰＢＭＣは、当技術分野で公知の手段によって単離することができる。例えば、ＰＢＭＣは、他の血液細胞と比較したＰＢＭＣの密度に基づいて、個体の末梢血から得ることができる。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、フィコール（例えば、フィコール勾配）を使用して個体の末梢血から得ることができる。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、ＥＬＵＴＲＡ（登録商標）細胞分離システムを使用して個体の末梢血から得ることができる。ＰＢＭＣは、アフェレーシスを受けている個体から取得することができる。
一部の実施形態では、ＰＢＭＣの集団は個体から単離される。一部の実施形態では、複数のＰＢＭＣは、自己のＰＢＭＣ集団であり、この集団は、特定の個体に由来し、本明細書に記載のいずれかの方法によって操作され、その特定の個体に戻される。一部の実施形態では、複数のＰＢＭＣは、同種のＰＢＭＣ集団であり、この集団は、ある個体に由来し、本明細書に記載のいずれかの方法によって操作され、第二の個体に投与される。
一部の実施形態では、複数のＰＢＭＣは、ＰＢＭＣの再構成調製物である。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、または単球のうちの二つ以上の集団を混合することによって、ＰＢＭＣ集団に典型的に見出される細胞を混合することによって生成されてもよい。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのどちらかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、プリンおよびピリミジン塩基、または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含む、一本鎖、二本鎖、または複数鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはポリマーが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（典型的にはＲＮＡまたはＤＮＡに見出され得る）、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含むことができる。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホルアミデートおよびホスホロチオエートなどの合成サブユニットのポリマーを含むことができ、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデート（Ｐ－ＮＨ２）、混合ホスホロチオエート－ホスホジエステルオリゴマー、または混合ホスホルアミデート－ホスホジエステルオリゴマーとすることができる。加えて、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成して適切な条件下で鎖をアニーリングするか、または適切なプライマーを用いてＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖をデノボ合成するかのいずれかにより、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から取得することができる。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用され、最小の長さに限定されない。そのようなアミノ酸残基のポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含有していてもよく、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、および多量体を含むがこれらに限定されない。完全長タンパク質およびその断片の両方が定義によって包含される。この用語には、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化なども含まれる。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」とは、所望の活性を維持する限り、天然の配列に対して欠失、付加、および置換などの改変（一般に天然では保存されている）を含むタンパク質を指す。これらの改変は、部位特異的変異誘導を介してのように意図的であってもよいし、タンパク質を産生する宿主の変異またはＰＣＲ増幅によるエラーを介するなど偶発的であってもよい。
本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、免疫応答を調節および／または生成する物質を指す。概して、アジュバントは抗原と併せて投与されて、抗原単独と比較して抗原に対する免疫応答の増強をもたらす。様々なアジュバントが本明細書に記載される。
本明細書における「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド」および「ＣｐＧ ＯＤＮ」という用語は、リン酸によって分離されたシトシンおよびグアニンのジヌクレオチド（本明細書では「ＣｐＧ」ジヌクレオチド、または「ＣｐＧ」とも称される）を含有する、１０～３０ヌクレオチド長のＤＮＡ分子を指す。本開示のＣｐＧ ＯＤＮは、少なくとも一つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む。すなわち、ＣｐＧジヌクレオチド中のシトシンはメチル化されていない（すなわち、５－メチルシトシンではない）。ＣｐＧ ＯＤＮは、部分的または完全なホスホロチオエート（ＰＳ）骨格を有し得る。
本明細書で使用される場合、「医薬的に許容可能な」または「薬理学的に適合する」とは、生物学的にまたはその他望ましくないものではない物質を意味し、例えば、その物質は、望ましくない重大な生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれを含有する組成物の他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することなく、患者に投与される医薬組成物に組み込まれ得る。医薬的に許容される担体または賦形剤は、毒性試験および製造試験の必要な基準を満たしていること、および／または米国食品医薬品局によって準備された不活性成分ガイドに含まれていることが好ましい。
本明細書に記載される構造的および機能的特徴のいずれについても、これらの特徴を決定する方法は当技術分野で公知である。
宿主ＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する方法
宿主ＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する方法
一部の態様では、個体における免疫応答を刺激する方法が提供され、本方法は、有核細胞（例えばＰＢＭＣ）を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞はタンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、本方法は、有効量の本明細書に記載される組成物のうちのいずれかを投与することを含む。一部の実施形態では、上記個体は、がんを有する。
一部の態様では、それを必要とする個体にワクチン接種する方法が提供され、本方法は、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞はタンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。
一部の態様では、個体における免疫応答を刺激する方法が提供され、本方法は、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡ（例えば、外因性ｍＲＮＡ）を含み、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。
一部の態様では、それを必要とする個体にワクチン接種する方法が提供され、本方法は、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞はタンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡ（例えば、外因性ｍＲＮＡ）を含み、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。
一部の実施形態では、個体における免疫反応を刺激する方法が提供され、本方法は、有核細胞を含む組成物の有効量を個体に投与することを含み、上記有核細胞は、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含み、上記二つ以上の抗原は、個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫反応を刺激する。一部の実施形態では、個体における免疫反応を刺激する方法が提供され、本方法は、有核細胞を含む組成物の有効量を個体に投与することを含み、上記有核細胞は、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含み、上記二つ以上の抗原は、個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫反応を刺激する。
一部の実施形態では、上記細胞は、上記タンパク質に由来する二つ以上の抗原を含む。一部の実施形態では、上記細胞は、上記タンパク質に由来する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、７５、８０、９０、１００またはそれ以上の抗原のうちのいずれか約一つを含む。一部の実施形態では、上記抗原のうちの少なくとも二つは、部分的に重複するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記抗原のすべてを組み合わせたアミノ酸配列は、上記タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上重複している。一部の実施形態では、上記抗原のすべてを組み合わせたアミノ酸配列は、上記タンパク質のアミノ酸配列の５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のうちのいずれか約一つで重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約８０％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも二つの抗原と重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約８０％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも三つの抗原と重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約９０％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも二つの抗原と重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約９０％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも三つの抗原と重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約９５％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも二つの抗原と重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約９５％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも三つの抗原と重複している。
一部の実施形態では、上記抗原は、上記タンパク質の二つ以上のエピトープを含むポリペプチドである。一部の実施形態では、実施形態、免疫原性ペプチドエピトープは、Ｎ末端隣接ポリペプチドおよび／またはＣ末端隣接ポリペプチドと融合している。一部の実施形態では、上記抗原は、上記タンパク質の一つまたは複数のエピトープと一つまたは複数の異種ペプチド配列である。一部の実施形態では、上記一つまたは複数のエピトープは、Ｎ末端および／またはＣ末端で異種ペプチド配列に隣接する。一部の実施形態では、上記隣接異種ペプチド配列は、疾患関連免疫原性ペプチドに由来する。一部の実施形態では、上記隣接異種ペプチド配列は、天然に存在しない配列である。一部の実施形態では、上記隣接異種ペプチド配列は、免疫原性合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）に由来する。一部の実施形態では、Ｎ末端隣接ポリペプチドは、配列番号５～１０のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含み、および／またはＣ末端隣接ポリペプチドは、配列番号 １１～１７のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記抗原は、ＭＨＣクラスＩ制限ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ制限ペプチドにプロセシングされることが可能である。
一部の実施形態では、上記タンパク質は、がんに関連する変異タンパク質（例えば、ネオ抗原であるがこれに限定されない）、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＰＶは、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を上記タンパク質またはその断片とインキュベートして、上記タンパク質またはその断片が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む上記有核細胞は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む有核細胞を生成することにより調製される。
一部の実施形態では、上記インプット細胞懸濁液は、上記インプット有核細胞および抗原を含んでもよい。一部の実施形態では、上記インプット細胞懸濁液は、上記インプット有核細胞と上記タンパク質またはその断片とを含む。一部の実施形態では、上記インプット細胞懸濁液は、上記インプット有核細胞と上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡとを含む。一部の実施形態では、本方法は、上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、上記タンパク質もしくはその断片と共に、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡと共に、上記有核細胞をインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、本方法は、上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記タンパク質もしくはその断片と共に、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡと共に、上記有核細胞をインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、個体における免疫応答を刺激する方法が提供され、本方法は、ａ）インプット有核細胞（例えばＰＢＭＣ）を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ｂ）上記摂動インプット有核細胞を上記タンパク質またはその断片とインキュベートして、上記タンパク質またはその断片が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を生成すること、ならびにｃ）上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を上記個体に投与することを含む。一部の実施形態では、個体における免疫応答を刺激する方法が提供され、本方法は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、上記ｍＲＮＡが発現し、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を生成すること、ならびにｃ）上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を上記個体に投与することを含む。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存型の様式で個体における免疫応答を刺激する。
一部の実施形態では、それを必要とする個体にワクチン接種する方法が提供され、本方法は、ａ）インプット有核細胞（例えばＰＢＭＣ）を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ｂ）上記摂動インプット有核細胞を上記タンパク質またはその断片とインキュベートして、上記タンパク質またはその断片が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を生成すること、ならびにｃ）上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を上記個体に投与することを含む。一部の実施形態では、それを必要とする個体にワクチン接種する方法が提供され、本方法は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質またはその断片が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、上記ｍＲＮＡが発現し、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を生成すること、ならびにｃ）上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を上記個体に投与することを含む。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存型の様式で個体における免疫応答を刺激する。
一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、有核細胞集団内で最小の直径を有する上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約６０％、約４０％～約６０％、約３０％～約４５％、約５０％～約９９％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、または約６０％～約７０％のうちのいずれか一つである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記有核細胞の集団内で最小の直径を有する上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約６０％、約４０％～約６０％、約３０％～約４５％、約５０％～約９９％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、または約６０％～約７０％のうちのいずれか一つである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約２μｍ～約５μｍ、約３μｍ～約５μｍ、約２μｍ～約２．２μｍ、約２．２μｍ～約２．５μｍ、約２．５μｍ～約３μｍ、約３μｍ～約３．５μｍ、約３．５μｍ～約４μｍ、約４μｍ～約４．５μｍ、約３．２μｍ～約３．８μｍ、約３．８μｍ～約４．３μｍ、約４．２μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約４．５μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約２μｍ、２．２μｍ、２．５μｍ、３μｍ、３．５μｍ、４μｍ、４．５μｍ、５μｍ、５．５μｍ、６μｍ、６．５μｍ、７μｍ、７．５μｍ、８μｍ、８．５μｍ、９μｍ、９．５μｍ、１０μｍ、１０．５μｍ、１１μｍ、１１．５μｍ、１２μｍ、１２．５μｍ、１３μｍ、１３．５μｍ、１４μｍ、１４．５μｍ、または１５μｍのうちのいずれか一つまたはそれ未満である。一部の実施形態では、上記インプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液は、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部は、直列および／または並列に配置されている。
本明細書に記載される方法、使用、または組成物のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記有核細胞（例えば、ＰＢＭＣ）は、上記有核細胞を馴化するのに十分な時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約１時間～約２４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約２時間～約１０時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約３時間～約６時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約１時間、２時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間のうちのいずれか一つの間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードする核酸を上記有核細胞に導入する前に馴化される。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードする核酸を上記有核細胞に導入した後に馴化される。一部の実施形態では、馴化に用いられる上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。例示的なアジュバントとしては、ＣｐＧ ＯＤＮ、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（Ｒ８４８）、またはリポ多糖（ＬＰＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧ ７９０９ （ＣｐＧ ＯＤＮ ２００６としても公知）である。
一部の実施形態では、上記有核細胞は、Ｂ細胞を含み、一つまたは複数の共刺激分子は、上記馴化された有核細胞のＢ細胞では、上記馴化されていない有核細胞のＢ細胞と比較して上方制御される。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数のＰＢＭＣであり、一つまたは複数の共刺激分子は、馴化された複数のＰＢＭＣのＢ細胞では、馴化されていない複数のＰＢＭＣのＢ細胞と比較して上方制御される。一部の実施形態では、上記共刺激分子は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６である。一部の実施形態では、上記馴化された複数のＰＢＭＣは、馴化されていない複数のＰＢＭＣと比較して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が増加している。一部の実施形態では、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が、馴化されていない複数のＰＢＭＣと比較して、約１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、または１０倍を超えて増加している。
本明細書に記載の方法、使用、または組成物のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記有核細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、ハプロタイプＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、またはＨＬＡ－Ｃ＊１６を有するヒト細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数のＰＢＭＣである。一部の実施形態では、上記馴化された有核細胞は、馴化された複数の改変ＰＢＭＣである。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である。
一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するようにさらに改変される。一部の実施形態では、上記共刺激分子は、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２である。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数のサイトカインの発現が増加するようにさらに改変される。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＦＮ－α２またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、バリアントサイトカイン（改変型サイトカインなど）である。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数のキメラ膜結合型サイトカインの発現が増加するようにさらに改変される。一部の実施形態では、上記サイトカインは改変され、上記改変サイトカインは上記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合される。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数のキメラ膜結合型サイトカインの発現が増加するようにさらに改変される。一部の実施形態では、上記サイトカインは改変され、上記改変サイトカインは上記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合される。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＴＦＲＣ）または腫瘍壊死因子（例えばＦａｓＬ）膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、配列番号８１または配列番号 ８２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、Ｇ４ＳリンカーまたはＥＡＡＡＫリンカーである。実施形態では、上記Ｇ４Ｓリンカーは、Ｇ４Ｓ配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のリピートのうちのいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記ＥＡＡＡＫリンカーは、ＥＡＡＡＫ配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のリピートのうちいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、配列番号７７～８０のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記複数の改変型ＰＢＭＣは、一つまたは複数のサイトカインの発現および／または分泌の増加をもたらす核酸を含む。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸は、配列番号７１または７２のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上記サイトカインは、Ｔ細胞活性化の刺激におけるシグナル３エフェクターである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化を誘導する。一部の実施形態では、上記サイトカインは、抗原特異的ＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化を誘導する。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、非膜結合型サイトカインと比較して、個体における上記サイトカインの半減期を増強する。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインの半減期は、非膜結合型サイトカインと比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のうちのいずれか一つに増加する。一部の実施形態では、上記膜結合型サイトカインは、非膜結合型サイトカインを含む対応する有核細胞と比較して、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２８時間、３２時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、またはそれ以上の時間、上記タンパク質またはその断片を導入された上記有核細胞によって提示される上記抗原との上記サイトカインの空間的会合を延長させる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、膜結合型サイトカインをさらに含む有核細胞は、非膜結合型サイトカインを含む対応する有核細胞と比較して、約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のうちいずれか一つに高い、局所サイトカイン濃度を呈する。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、膜結合型サイトカインをさらに含む有核細胞は、対応する非膜結合型サイトカインを含む有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。
一部の実施形態では、上記膜結合型サイトカインは、膜結合型ケモカインである。
一部の実施形態では、上記方法は、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞の複数回の投与を含む。一部の実施形態では、上記方法は、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞の約３回～９回の投与を含む。一部の実施形態では、本方法は、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞の約１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、または１５回の投与のうちいずれか一つを含む。一部の実施形態では、本方法は、必要に応じて、上記有核細胞を継続投与することを含む。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞の二回の逐次投与の間の時間間隔は、約１日と約３０日との間である。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む有核細胞の二回の逐次投与の間の時間間隔は、約２１日である。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞の二回の逐次投与の間の時間間隔は、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、１０日、１２日、１４日、１６日、２０日、２５日、３０日、３５日、４０日、４５日、５０日、５５日、６０日、６５日、７０日、７５日、８０日、８５日、９０日、９５日、１００日、または１５０日のうちのいずれか一つである。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞の最初の二回の逐次投与の間の時間間隔は、１日または２日である。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞の最初の二回の逐次投与の間の時間間隔は、１日または２日であり、本方法は、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞の２回超の投与（例えば、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、またはそれ以上の投与であるが、これらに限定されない）を含む。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞は、静脈内、腫瘍内、および／または皮下に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞は、静脈内に投与される。
一部の実施形態では、上記組成物は、アジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。例示的なアジュバントとしては、ＣｐＧ ＯＤＮ、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（Ｒ８４８）、またはリポ多糖（ＬＰＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドである。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧ ７９０９である。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む組成物と上記アジュバントとが、同時に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を含む組成物と上記アジュバントとが、順次投与される。一部の実施形態では、上記アジュバント、および／または上記タンパク質もしくはその断片を含む上記有核細胞が、静脈内、腫瘍内、および／または皮下に投与される。一部の実施形態では、上記アジュバント、および／または上記タンパク質もしくはその断片を含む上記有核細胞が、静脈内に投与される。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を含む上記組成物は、上記アジュバントを投与する前に投与される。例えば、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記アジュバントの投与の約１時間前～約１週間前に投与される。例えば、一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記アジュバントの投与の約１時間前、約２時間前、約３時間前、約４時間前、約６時間前、約８時間前、約１０時間前、約１２時間前、約１４時間前、約１６時間前、約１８時間前、約２０時間前、約２４時間前、約３０時間前、約３６時間前、約４２時間前、約４８時間前、約６０時間前、約３日前、約４日前、約５日前、約６日前、または約７日前に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記アジュバントの投与の約１時間～約２時間前から、約２時間～約３時間前から、約３時間～約４時間前から、約４時間～約６時間前から、約６時間～約８時間前から、約８時間～約１０時間前から、約１０時間～約１２時間前から、約１２時間～約１４時間前から、約１４時間～約１６時間前から、約１６時間～約１８時間前から、約１８時間～約２０時間前から、約２０時間～約２４時間前から、約２４時間～約３０時間前から、約３０時間～約３６時間前から、約３６時間～約４２時間前から、約４２時間～約４８時間前から、約４８時間～約６０時間前から、約６０時間～約３日前から、約３日～約４日前から、約４日～約５日前から、約５日～約６日前から、約６日～約７日前から投与される。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記アジュバントの投与後に投与される。例えば、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記アジュバントの投与の約１時間後～約１週間後に投与される。例えば、一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記アジュバントの投与の約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約６時間後、約８時間後、約１０時間後、約１２時間後、約１４時間後、約１６時間後、約１８時間後、約２０時間後、約２４時間後、約３０時間後、約３６時間後、約４２時間後、約４８時間後、約６０時間後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、または約７日後に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記アジュバントの投与の約１時間～約２時間後から、約２時間～約３時間後から、約３時間～約４時間後から、約４時間～約６時間後から、約６時間～約８時間後から、約８時間～約１０時間後から、約１０時間～約１２時間後から、約１２時間～約１４時間後から、約１４時間～約１６時間後から、約１６時間～約１８時間後から、約１８時間～約２０時間後から、約２０時間～約２４時間後から、約２４時間～約３０時間後から、約３０時間～約３６時間後から、約３６時間～約４２時間後から、約４２時間～約４８時間後から、約４８時間～約６０時間後から、約６０時間～約３日後から、約３日～約４日後から、約４日～約５日後から、約５日～約６日後から、約６日～約７日後から投与される。
一部の実施形態では、上記個体は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、またはＨＬＡ－Ｃ＊１６の発現が陽性である。一部の実施形態では、上記個体は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊１１、および／またはＨＬＡ－Ｂ＊０７の発現が陽性である。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞の少なくとも一つの細胞は、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊１１、および／またはＨＬＡ－Ｂ＊０７の発現が陽性である。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％のうちのいずれか一つは、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊１１、および／またはＨＬＡ－Ｂ＊０７の発現が陽性である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数のＰＢＭＣであり、上記タンパク質またはその断片を含む改変型ＰＢＭＣに含まれるＴ細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％のうちのいずれか一つは、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊１１、および／またはＨＬＡ－Ｂ＊０７の発現が陽性である。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む改変型ＰＢＭＣに含まれるＢ細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％のうちのいずれか一つは、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊１１、および／またはＨＬＡ－Ｂ＊０７の発現が陽性である。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む改変型ＰＢＭＣに含まれるＮＫ細胞の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％のうちのいずれか一つは、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊１１、および／またはＨＬＡ－Ｂ＊０７の発現が陽性である。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む改変型ＰＢＭＣに含まれる単球の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９９％のうちのいずれか一つは、ＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊１１、および／またはＨＬＡ－Ｂ＊０７の発現が陽性である。
本明細書に記載される方法、使用、または組成物のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞は、治療剤の投与の前に、同時に、または後に投与される。一部の実施形態では、上記治療剤は、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法、または放射線療法のうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、上記治療剤は、一つまたは複数のサイトカインを含む。一部の実施形態では、上記治療剤は、一つまたは複数の抗体を含む。一部の実施形態では、上記治療剤は、免疫腫瘍学で使用される一つまたは複数の二重特異性ポリペプチド（例えば、免疫コンジュゲート）を含む。
免疫チェックポイントは、免疫系の調節因子であり、免疫応答を抑制する。免疫チェックポイント阻害剤を使用して、免疫応答の増強を促進することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、免疫チェックポイント阻害剤の投与との併用で投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物と上記免疫チェックポイント阻害剤とは、同時に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物と上記免疫チェックポイント阻害剤とは、順次投与される。一部の実施形態では、上記免疫チェックポイント阻害剤および／または上記タンパク質もしくはその断片を含む上記有核細胞は、静脈内、腫瘍内、および／または皮下に投与される。一部の実施形態では、上記免疫チェックポイント阻害剤および／または上記タンパク質もしくはその断片を含む上記有核細胞は、静脈内に投与される。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、免疫チェックポイント阻害剤の投与前に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記免疫チェックポイント阻害剤の投与後に投与される。例えば、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記免疫チェックポイント阻害剤の投与の約１時間前～約１週間前に投与される。例えば、一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記免疫チェックポイント阻害剤の投与の約１時間前、約２時間前、約３時間前、約４時間前、約６時間前、約８時間前、約１０時間前、約１２時間前、約１４時間前、約１６時間前、約１８時間前、約２０時間前、約２４時間前、約３０時間前、約３６時間前、約４２時間前、約４８時間前、約６０時間前、約３日前、約４日前、約５日前、約６日前、または約７日前に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記免疫チェックポイント阻害剤の投与の約１時間～約２時間前から、約２時間～約３時間前から、約３時間～約４時間前から、約４時間～約６時間前から、約６時間～約８時間前から、約８時間～約１０時間前から、約１０時間～約１２時間前から、約１２時間～約１４時間前から、約１４時間～約１６時間前から、約１６時間～約１８時間前から、約１８時間～約２０時間前から、約２０時間～約２４時間前から、約２４時間～約３０時間前から、約３０時間～約３６時間前から、約３６時間～約４２時間前から、約４２時間～約４８時間前から、約４８時間～約６０時間前から、約６０時間～約３日前から、約３日～約４日前から、約４日～約５日前から、約５日～約６日前から、約６日～約７日前から投与される。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記免疫チェックポイント阻害剤の投与の約７日前、約１０日前、約１４日前、約１８日前、約２１日前、約２４日前、約２８日前、約３０日前、約３５日前、約４０日前、約４５日前、または約５０日前に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記免疫チェックポイント阻害剤の投与の約７日～約１０日前から、約１０日～約１４日前から、約１４日～約１８日前から、約１８日～約２１日前から、約２１日～約２４日前から、約２４日～約２８日前から、約２８日～約３０日前から、約３０日～約３５日前から、約３５日～約４０日前から、約４０日～約４５日前から、または約４５日～約５０日前から投与される。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記免疫チェックポイント阻害剤の投与後に投与される。例えば、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記免疫チェックポイント阻害剤の投与の約１時間後～約１週間後に投与される。例えば、一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記免疫チェックポイント阻害剤の投与の約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約６時間後、約８時間後、約１０時間後、約１２時間後、約１４時間後、約１６時間後、約１８時間後、約２０時間後、約２４時間後、約３０時間後、約３６時間後、約４２時間後、約４８時間後、約６０時間後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、または約７日後に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記免疫チェックポイント阻害剤の投与の約１時間～約２時間後から、約２時間～約３時間後から、約３時間～約４時間後から、約４時間～約６時間後から、約６時間～約８時間後から、約８時間～約１０時間後から、約１０時間～約１２時間後から、約１２時間～約１４時間後から、約１４時間～約１６時間後から、約１６時間～約１８時間後から、約１８時間～約２０時間後から、約２０時間～約２４時間後から、約２４時間～約３０時間後から、約３０時間～約３６時間後から、約３６時間～約４２時間後から、約４２時間～約４８時間後から、約４８時間～約６０時間後から、約６０時間～約３日後から、約３日～約４日後から、約４日～約５日後から、約５日～約６日後から、約６日～約７日後から投与される。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記免疫チェックポイント阻害剤の投与の約７日後、約１０日後、約１４日後、約１８日後、約２１日後、約２４日後、約２８日後、約３０日後、約３５日後、約４０日後、約４５日後、または約５０日後に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記免疫チェックポイント阻害剤の投与の約７日～約１０日後から、約１０日～約１４日後から、約１４日～約１８日後から、約１８日～約２１日後から、約２１日～約２４日後から、約２４日～約２８日後から、約２８日～約３０日後から、約３０日～約３５日後から、約３５日～約４０日後から、約４０日～約４５日後から、または約４５日～約５０日後から投与される。
一部の実施形態では、本方法は、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物の複数回の投与および／または上記免疫チェックポイント阻害剤の複数回の投与を含む。例えば、一部の実施形態では、本方法は、上記タンパク質もしくはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物および／または上記免疫チェックポイント阻害剤の２回投与、３回投与、４回投与、５回投与、６回投与、７回投与、８回投与、９回投与、１０回投与、１１回投与、１２回投与、１３回投与、１４回投与、または１５回投与を含む。例えば、一部の実施形態では、本方法は、上記タンパク質もしくはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物および／または上記免疫チェックポイント阻害剤の５回未満の投与、１０回未満の投与、１５回未満の投与、２０回未満の投与、２５回未満の投与、３０回未満の投与、５０回未満の投与、７５回未満の投与、１００回未満の投与、または２００回未満の投与を含む。
例示的な免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ１、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、またはＢＴＬＡを標的とするが、これらに限定されない。一部の実施形態では、上記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ１、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、またはＢＴＬＡのうちの一つまたは複数を標的とする。一部の実施形態では、上記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１と結合する抗体、ＰＤ－Ｌ１と結合する抗体、ＣＴＬＡ－４と結合する抗体、ＬＡＧ３と結合する抗体、またはＴＩＭ－３と結合する抗体、ＴＩＧＩＴと結合する抗体、ＶＩＳＴＡと結合する抗体、ＴＩＭ－１と結合する抗体、Ｂ７－Ｈ４と結合する抗体、またはＢＴＬＡと結合する抗体のうちの一つまたは複数である さらに別の実施形態では、上記抗体は、完全長抗体または任意のバリアント、例えば、抗体断片、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、または抗原結合断片（Ｆａｂ）であり得るが、これらに限定されない。さらに別の実施形態では、上記抗体は、二重特異性、三重特異性、または多重特異性であり得る。一部の実施形態では、上記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ１、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、またはＢＴＬＡのうちの一つまたは複数を結合および／または阻害する一つまたは複数の化学的な化合物である。一部の実施形態では、上記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ－３、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＭ１、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、またはＢＴＬＡのうちの一つまたは複数を結合および／または阻害する一つまたは複数のペプチドである。一部の実施形態では、上記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１を標的とする。一部の実施形態では、上記免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１を標的とする。
サイトカインは、本明細書に記載される複数の改変型ＰＢＭＣのうちのいずれか一つと組み合わせて使用されて、がん、例えば、変異型タンパク質に関連するがんに対し相加効果または相乗効果を達成することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、一つまたは複数のサイトカインの投与との併用で投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む組成物と上記サイトカインとが、同時に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む組成物と上記サイトカインとが、連続して投与される。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記サイトカインの投与前に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記サイトカインの投与後に投与される。例えば、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記サイトカインの投与の約１時間前～約１週間前に投与される。例えば、一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記サイトカインの投与の約１時間前、約２時間前、約３時間前、約４時間前、約６時間前、約８時間前、約１０時間前、約１２時間前、約１４時間前、約１６時間前、約１８時間前、約２０時間前、約２４時間前、約３０時間前、約３６時間前、約４２時間前、約４８時間前、約６０時間前、約３日前、約４日前、約５日前、約６日前、または約７日前に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記サイトカイン投与の約１時間～約２時間前から、約２時間～約３時間前から、約３時間～約４時間前から、約４時間～約６時間前から、約６時間～約８時間前から、約８時間～約１０時間前から、約１０時間～約１２時間前から、約１２時間～約１４時間前から、約１４時間～約１６時間前から、約１６時間～約１８時間前から、約１８時間～約２０時間前から、約２０時間～約２４時間前から、約２４時間～約３０時間前から、約３０時間～約３６時間前から、約３６時間～約４２時間前から、約４２時間～約４８時間前から、約４８時間～約６０時間前から、約６０時間～約３日前から、約３日～約４日前から、約４日～約５日前から、約５日～約６日前から、約６日～約７日前から投与される。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記サイトカインの投与の約７日前、約１０日前、約１４日前、約１８日前、約２１日前、約２４日前、約２８日前、約３０日前、約３５日前、約４０日前、約４５日前、または約５０日前に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記サイトカインの投与の約７日～約１０日前から、約１０日～約１４日前から、約１４日～約１８日前から、約１８日～約２１日前から、約２１日～約２４日前から、約２４日～約２８日前から、約２８日～約３０日前から、約３０日～約３５日前から、約３５日～約４０日前から、約４０日～約４５日前から、または約４５日～約５０日前から投与される。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記サイトカインの投与後に投与される。例えば、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記サイトカインの投与の約１時間後～約１週間後に投与される。例えば、一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記サイトカインの投与の約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約６時間後、約８時間後、約１０時間後、約１２時間後、約１４時間後、約１６時間後、約１８時間後、約２０時間後、約２４時間後、約３０時間後、約３６時間後、約４２時間後、約４８時間後、約６０時間後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、または約７日後に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記サイトカインの投与の約１時間～約２時間後から、約２時間～約３時間後から、約３時間～約４時間後から、約４時間～約６時間後から、約６時間～約８時間後から、約８時間～約１０時間後から、約１０時間～約１２時間後から、約１２時間～約１４時間後から、約１４時間～約１６時間後から、約１６時間～約１８時間後から、約１８時間～約２０時間後から、約２０時間～約２４時間後から、約２４時間～約３０時間後から、約３０時間～約３６時間後から、約３６時間～約４２時間後から、約４２時間～約４８時間後から、約４８時間～約６０時間後から、約６０時間～約３日後から、約３日～約４日後から、約４日～約５日後から、約５日～約６日後から、約６日～約７日後から投与される。
例示的なサイトカインとしては、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンフォカイン、および腫瘍壊死因子、またはそれらの機能的誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、上記サイトカインは、細胞性免疫応答を増強する。一部の実施形態では、上記サイトカインは、抗体応答を増強する。一部の実施形態では、上記サイトカインは、Ｉ型サイトカインである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、２型サイトカインである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＦＮ－α、またはＩＬ－２１のうち一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＬ－１５を含む。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、サイトカイン部分を含む二重特異性ポリペプチドを投与する前に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、サイトカイン部分と免疫チェックポイント阻害剤部分とを含む二重特異性ポリペプチドを投与する前に投与される。一部の実施形態では、上記二重特異性ポリペプチドは、ＣＤ３標的部分および腫瘍抗原標的部分を含む。一部の実施形態では、上記二重特異性ポリペプチドは、二つの免疫チェックポイントを標的とする部分を含む。一部の実施形態では、上記二特異性ポリペプチドは、間質で見出されるかまたはがん関連線維芽細胞で発現する抗原を標的とする部分を含む。一部の実施形態では、上記二特異性ポリペプチドは、間質で見出されるかまたはがん関連線維芽細胞で発現する抗原を標的とする部分とサイトカイン部分とを含む。
化学療法は、本明細書に記載される複数の改変型ＰＢＭＣのうちのいずれか一つと組み合わせて使用されて、がん、例えば、変異型タンパク質に関連するがんに対し相加効果または相乗効果を達成することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、化学療法の施療との併用で投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む組成物と上記化学療法とが、同時に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む組成物と上記化学療法とが、連続して投与される。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記化学療法の施療前に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記化学療法の施療後に投与される。例えば、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記化学療法の施療の約１時間前～約１週間前に投与される。例えば、一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記化学療法の施療の約１時間前、約２時間前、約３時間前、約４時間前、約６時間前、約８時間前、約１０時間前、約１２時間前、約１４時間前、約１６時間前、約１８時間前、約２０時間前、約２４時間前、約３０時間前、約３６時間前、約４２時間前、約４８時間前、約６０時間前、約３日前、約４日前、約５日前、約６日前、または約７日前に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記化学療法の施療の約１時間～約２時間前から、約２時間～約３時間前から、約３時間～約４時間前から、約４時間～約６時間前から、約６時間～約８時間前から、約８時間～約１０時間前から、約１０時間～約１２時間前から、約１２時間～約１４時間前から、約１４時間～約１６時間前から、約１６時間～約１８時間前から、約１８時間～約２０時間前から、約２０時間～約２４時間前から、約２４時間～約３０時間前から、約３０時間～約３６時間前から、約３６時間～約４２時間前から、約４２時間～約４８時間前から、約４８時間～約６０時間前から、約６０時間～約３日前から、約３日～約４日前から、約４日～約５日前から、約５日～約６日前から、約６日～約７日前から投与される。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記化学療法の施療後に投与される。例えば、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記化学療法の施療の約１時間後～約１週間後に投与される。例えば、一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記化学療法の施療の約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約６時間後、約８時間後、約１０時間後、約１２時間後、約１４時間後、約１６時間後、約１８時間後、約２０時間後、約２４時間後、約３０時間後、約３６時間後、約４２時間後、約４８時間後、約６０時間後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、または約７日後に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記化学療法の施療の約１時間～約２時間後から、約２時間～約３時間後から、約３時間～約４時間後から、約４時間～約６時間後から、約６時間～約８時間後から、約８時間～約１０時間後から、約１０時間～約１２時間後から、約１２時間～約１４時間後から、約１４時間～約１６時間後から、約１６時間～約１８時間後から、約１８時間～約２０時間後から、約２０時間～約２４時間後から、約２４時間～約３０時間後から、約３０時間～約３６時間後から、約３６時間～約４２時間後から、約４２時間～約４８時間後から、約４８時間～約６０時間後から、約６０時間～約３日後から、約３日～約４日後から、約４日～約５日後から、約５日～約６日後から、約６日～約７日後から投与される。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記化学療法の施療の約７日後、約１０日後、約１４日後、約１８日後、約２１日後、約２４日後、約２８日後、約３０日後、約３５日後、約４０日後、約４５日後、または約５０日後に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記化学療法の施療の約７日～約１０日後から、約１０日～約１４日後から、約１４日～約１８日後から、約１８日～約２１日後から、約２１日～約２４日後から、約２４日～約２８日後から、約２８日～約３０日後から、約３０日～約３５日後から、約３５日～約４０日後から、約４０日～約４５日後から、または約４５日～約５０日後から投与される。
一部の実施形態では、本方法は、上記タンパク質もしくはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物の複数回の投与および／または上記化学療法の複数回の施療を含む。例えば、一部の実施形態では、本方法は、上記タンパク質もしくはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物および／または上記化学療法の２回投与、３回投与、４回投与、５回投与、６回投与、７回投与、８回投与、９回投与、１０回投与、１１回投与、１２回投与、１３回投与、１４回投与、または１５回投与を含む。例えば、一部の実施形態では、本方法は、上記タンパク質もしくはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物および／または上記化学療法の５回未満の投与、１０回未満の投与、１５回未満の投与、２０回未満の投与、２５回未満の投与、３０回未満の投与、５０回未満の投与、７５回未満の投与、１００回未満の投与、または２００回未満の投与を含む。
例示的な化学療法は、細胞周期依存性であっても細胞周期非依存性であってもよい。一部の実施形態では、上記化学療法は、一つまたは複数の化学療法剤を含む。一部の実施形態では、化学療法剤は、がんにおける細胞分裂、ＤＮＡ、または代謝のうちの一つまたは複数を標的とすることができる。一部の実施形態では、上記化学療法剤は、プラチナ系薬剤であり、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、またはカルボプラチンなどであるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、上記化学療法剤は、タキサン（ドセタキセルまたはパクリタキセルなど）である。一部の実施形態では、上記化学療法剤は、５－フルオロウラシル、ドキソルビシン、またはイリノテカンである。一部の実施形態では、上記化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗腫瘍抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、または有糸分裂阻害剤のうちの一つまたは複数である。一部の実施形態では、上記化学療法は、シスプラチンを含む。
放射線療法は、本明細書に記載される複数の改変型ＰＢＭＣのうちのいずれか一つと組み合わせて使用して、がん、例えば、変異型タンパク質またはその断片に関連するがんに対する相加効果または相乗効果を達成することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、放射線療法の施療との併用で投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む組成物と上記放射線療法とが、同時に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む組成物と上記放射線療法とが、連続して投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、放射線療法の施療との併用で、化学療法との併用で、および／または免疫チェックポイント阻害剤との併用で投与される。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記放射線療法の施療前に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記放射線療法の施療後に投与される。例えば、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記放射線療法の施療の約１時間前～約１週間前に投与される。例えば、一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記放射線療法の施療の約１時間前、約２時間前、約３時間前、約４時間前、約６時間前、約８時間前、約１０時間前、約１２時間前、約１４時間前、約１６時間前、約１８時間前、約２０時間前、約２４時間前、約３０時間前、約３６時間前、約４２時間前、約４８時間前、約６０時間前、約３日前、約４日前、約５日前、約６日前、または約７日前に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記放射線療法の施療の約１時間～約２時間前から、約２時間～約３時間前から、約３時間～約４時間前から、約４時間～約６時間前から、約６時間～約８時間前から、約８時間～約１０時間前から、約１０時間～約１２時間前から、約１２時間～約１４時間前から、約１４時間～約１６時間前から、約１６時間～約１８時間前から、約１８時間～約２０時間前から、約２０時間～約２４時間前から、約２４時間～約３０時間前から、約３０時間～約３６時間前から、約３６時間～約４２時間前から、約４２時間～約４８時間前から、約４８時間～約６０時間前から、約６０時間～約３日前から、約３日～約４日前から、約４日～約５日前から、約５日～約６日前から、約６日～約７日前から投与される。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記放射線療法の施療後に投与される。例えば、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記放射線療法の施療の約１時間後～約１週間後に投与される。例えば、一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記放射線療法の施療の約１時間後、約２時間後、約３時間後、約４時間後、約６時間後、約８時間後、約１０時間後、約１２時間後、約１４時間後、約１６時間後、約１８時間後、約２０時間後、約２４時間後、約３０時間後、約３６時間後、約４２時間後、約４８時間後、約６０時間後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、または約７日後に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記放射線療法の施療の約１時間～約２時間後から、約２時間～約３時間後から、約３時間～約４時間後から、約４時間～約６時間後から、約６時間～約８時間後から、約８時間～約１０時間後から、約１０時間～約１２時間後から、約１２時間～約１４時間後から、約１４時間～約１６時間後から、約１６時間～約１８時間後から、約１８時間～約２０時間後から、約２０時間～約２４時間後から、約２４時間～約３０時間後から、約３０時間～約３６時間後から、約３６時間～約４２時間後から、約４２時間～約４８時間後から、約４８時間～約６０時間後から、約６０時間～約３日後から、約３日～約４日後から、約４日～約５日後から、約５日～約６日後から、約６日～約７日後から投与される。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記放射線療法の施療の約７日後、約１０日後、約１４日後、約１８日後、約２１日後、約２４日後、約２８日後、約３０日後、約３５日後、約４０日後、約４５日後、または約５０日後に投与される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物は、上記放射線療法の施療の約７日～約１０日後から、約１０日～約１４日後から、約１４日～約１８日後から、約１８日～約２１日後から、約２１日～約２４日後から、約２４日～約２８日後から、約２８日～約３０日後から、約３０日～約３５日後から、約３５日～約４０日後から、約４０日～約４５日後から、または約４５日～約５０日後から投与される。
一部の実施形態では、本方法は、上記タンパク質もしくはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物の複数回の投与および／または上記放射線療法の複数回の施療を含む。例えば、一部の実施形態では、本方法は、上記タンパク質もしくはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物および／または上記放射線療法の２回投与、３回投与、４回投与、５回投与、６回投与、７回投与、８回投与、９回投与、１０回投与、１１回投与、１２回投与、１３回投与、１４回投与、または１５回投与を含む。例えば、一部の実施形態では、本方法は、上記タンパク質もしくはその断片を含む上記有核細胞を含む上記組成物および／または上記放射線療法の５回未満の投与、１０回未満の投与、１５回未満の投与、２０回未満の投与、２５回未満の投与、３０回未満の投与、５０回未満の投与、７５回未満の投与、１００回未満の投与、または２００回未満の投与を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載される方法のいずれか一つによる個体における免疫応答を刺激する方法で使用するためのタンパク質またはその断片を含む複数の有核細胞（例えば、ＰＢＭＣ）が提供される。
一部の実施形態では、個体においてタンパク質またはその断片に対する免疫応答を刺激するための組成物の使用が提供され、この組成物は、有効量の本明細書に記載される上記タンパク質または断片を含む有核細胞を含む上記組成物のうちのいずれか一つを含む。一部の実施形態では、腫瘍成長を低減させるための組成物が提供され、この組成物は、有効量の本明細書に記載される上記タンパク質または断片を含む有核細胞を含む上記組成物のうちのいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記個体は、がんおよび／または感染を有する。一部の実施形態では、個体におけるがんおよび／または感染を治療するための組成物が提供され、この組成物は、有効量の本明細書に記載のタンパク質または断片を含む有核細胞を含む上記組成物のうちいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記がんは、ＨＰＶ関連がんまたはＨＢＶ関連がんである。一部の実施形態では、上記個体は、ＨＰＶおよび／またはＨＢＶに感染している。
タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡ
タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡ
一部の態様では、個体における免疫応答をシミュレートする方法、および／またはそれを必要とする個体にワクチン接種する方法が提供され、本方法は、細胞内に送達されるタンパク質またはその断片を含む有核細胞を含む有効量の組成物を上記個体に投与することを含み、上記有核細胞は、まず、インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに、上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡが発現して、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む改変型有核細胞を生成することを含み、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。
一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、上記有核細胞における発現のために最適化されたコドンである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＰＢＭＣにおける発現のために最適化されたコドンである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの上記コドン最適化は、発現されたタンパク質の立体配置および機能に影響を及ぼさないかまたは大きく影響を及ぼさない。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの上記コドン最適化は、発現されたタンパク質からプロセシングされた抗原の立体配置および機能に影響を及ぼさないかまたは大きく影響を及ぼさない。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは非自己ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは外因性ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記外因性ｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは組換えタンパク質をコードする。
一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、上記発現されたタンパク質の上記抗原プロセシングおよび提示を増強するための一つまたは複数の修飾を含む。
本明細書で使用される場合、免疫プロテアソーム標的化モチーフは、タンパク質分解速度の調節に重要なタンパク質の一部である。一部の実施形態では、免疫プロテアソーム標的化モチーフは、抗原プロセシング経路におけるタンパク質の分解を増強する。一部の実施形態では、免疫プロテアソーム標的化モチーフは、タンパク質の抗原プロセシング経路への局在化を促進する。一部の実施形態では、免疫プロテアソーム標的化モチーフは、免疫プロテアソーム複合体におけるタンパク質のプロセシングを増強する。免疫プロテアソーム標的化モチーフの一例は、デグロンである。分裂後期促進複合体またはシクロソーム（ＡＰＣ／Ｃ）によって標的化されることが知られているデグロンは、破壊ボックス（Ｄボックス）、ＫＥＮボックス、およびＡＢＢＡモチーフを含む。これらのモチーフを含有するタンパク質は、ＡＰＣ／Ｃと相互作用し、タンパク質のユビキチン化およびプロテアソームによる破壊をもたらす。他の例示的な免疫プロテアソーム標的化モチーフとしては、ＫＥＫＥモチーフが挙げられる。
一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする一つまたは複数の核酸配列をさらに含み、上記ｍＲＮＡの翻訳は、上記タンパク質と上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとの融合タンパク質を生成する。一部の実施形態では、免疫プロテアソーム標的化モチーフの非存在下での上記細胞における上記タンパク質の分解および／または上記細胞の表面上の上記タンパク質由来のペプチドの提示と比較して、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフは、上記細胞における上記タンパク質の分解および／または上記細胞の表面上の上記タンパク質由来のペプチドの提示を増強する。
一部の実施形態では、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする上記一つまたは複数の核酸配列を含むｍＲＮＡによってコードされる上記タンパク質の分解量は、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする核酸を含まないｍＲＮＡによってコードされるタンパク質と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに増加する。一部の実施形態では、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする上記一つまたは複数の核酸配列を含むｍＲＮＡによってコードされる上記タンパク質の分解速度は、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする核酸を含まないｍＲＮＡによってコードされるタンパク質と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに増加する。
一部の実施形態では、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする上記一つまたは複数の核酸配列を含むｍＲＮＡによってコードされる上記タンパク質に由来するペプチドの細胞表面提示量は、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする核酸を含まないｍＲＮＡによってコードされるタンパク質と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに増加する。一部の実施形態では、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする上記一つまたは複数の核酸配列を含むｍＲＮＡによってコードされる上記タンパク質に由来するペプチドの細胞表面提示速度は、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする核酸を含まないｍＲＮＡによってコードされる上記タンパク質と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに増加する。
一部の実施形態では、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフは、上記融合タンパク質のＮ末端にある。一部の実施形態では、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフは、上記融合タンパク質のＣ末端にある。一部の実施形態では、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフは、上記融合タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端にある。
一部の実施形態では、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフは、Ｄ－ボックスドメイン、ｓｅｃ／ＭＩＴＤドメイン、ＫＥＫＥモチーフのうち一つまたは複数を含む。
一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、天然型ＨＰＶ Ｅ６タンパク質をコードする。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、天然型ＨＰＶ Ｅ６タンパク質をコードし、配列番号５９の配列を含む。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、天然型ＨＰＶ Ｅ６タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、天然型ＨＰＶ Ｅ６タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡであり、このコドン最適化されたｍＲＮＡは、配列番号６０の配列を含む。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、天然型ＨＰＶ Ｅ７タンパク質をコードする。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、天然型ＨＰＶ Ｅ７タンパク質をコードし、配列番号６１の配列を含む。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、天然型ＨＰＶ Ｅ７タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、天然型ＨＰＶ Ｅ７タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡであり、このコドン最適化されたｍＲＮＡは、配列番号６３または６４の配列を含む。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＫＥＫＥドメインとを含む融合タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＫＥＫＥドメインとを含む融合タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡであり、このｍＲＮＡは、配列番号６７の配列を含む。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＤ－ボックスドメインとを含む融合タンパク質をコードするｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＤ－ボックスドメインとを含む融合タンパク質をコードするｍＲＮＡであり、このｍＲＮＡは、配列番号６２の配列を含む。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＤ－ボックスドメインとを含む融合タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＤ－ボックスドメインとを含む融合タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡであり、このｍＲＮＡは、配列番号６６の配列を含む。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、変異型核局在配列（ＮＬＳ）を有するＨＰＶ Ｅ７タンパク質を含む融合タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、変異型ＮＬＳを有するＨＰＶ Ｅ７タンパク質を含む融合タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡであり、このｍＲＮＡは、配列番号７０の配列を含む。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、ＨＰＶ Ｅ７．６タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、ＨＰＶ Ｅ７．６タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡであり、このｍＲＮＡは、配列番号６８の配列を含む。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、６つのＨＰＶ Ｅ７．６リピートを含む融合タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、６つのＨＰＶ Ｅ７．６リピートを含む融合タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡであり、このｍＲＮＡは、配列番号６９の配列を含む。
一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、天然型インフルエンザＭ１タンパク質をコードする。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、天然型インフルエンザＭ１タンパク質をコードし、配列番号８３の配列を含む。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、天然型インフルエンザＭ１タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、天然型インフルエンザＭ１タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡであり、このコドン最適化されたｍＲＮＡは、配列番号８４の配列を含む。
一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、天然型ＣＭＶ ｐｐ６５タンパク質をコードする。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、天然型ＣＭＶ ｐｐ６５タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、天然型ＣＭＶ ｐｐ６５タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡであり、このコドン最適化されたｍＲＮＡは、配列番号８５の配列を含む。
一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、ＭＡＲＴ－１抗原をコードする。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、ＭＡＲＴ－１抗原をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡである。
本明細書に記載されるｍＲＮＡのいずれか一つによる一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基が修飾される。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基は、ホスホロチオエート残基、シュードウリジン残基、Ｎ１－メチルアデノシン残基、５－メチルシチジン残基、またはモルホリノ残基のうち一つまたは複数である。
タンパク質およびその断片、ならびに抗原
タンパク質およびその断片、ならびに抗原
本明細書に記載の方法、組成物、または複数の改変型ＰＢＭＣのいずれか一つによる一部の実施形態では、上記タンパク質は、疾患関連タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は非自己タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、がんに関連する変異タンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片は、疾患細胞の可溶化物などの可溶化物に由来する。一部の実施形態では、上記タンパク質は、腫瘍可溶化物に由来する。一部の実施形態では、上記タンパク質は、腫瘍抗原または腫瘍関連抗原のうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、上記タンパク質は、がんに関連する変異型タンパク質である。一部の実施形態では、上記がんは、頭頸部がん、子宮頸がん、外陰がん、膣がん、陰茎がん、肛門がん、肛門周囲がん、肛門生殖器がん、口腔がん、または唾液腺がんである。一部の実施形態では、上記タンパク質は、一つまたは複数の抗原を含み、上記抗原は、頭頸部がん抗原、子宮頸がん抗原、外陰部がん抗原、膣がん抗原、陰茎がん抗原、肛門がん抗原、肛門周囲がん抗原、肛門生殖器がん抗原、口腔がん抗原、唾液腺がん抗原、乳がん抗原、皮膚がん抗原、膀胱がん抗原、結腸がん、直腸がん抗原、子宮内膜がん抗原、腎がん抗原、白血病抗原、肺がん抗原、黒色腫抗原、非ホジキンリンパ腫抗原、膵がん抗原、前立腺がん抗原、または甲状腺がん抗原である。 一部の実施形態では、上記がんは固形がんである。一部の実施形態では、上記がんは、血液がんである。
一部の実施形態では、上記がんは、ウイルス関連がんである。一部の実施形態では、上記がんは、ＨＰＶ関連がんである。一部の実施形態では、上記がんは、局在性がんである。一部の実施形態では、上記がんは、転移性がんである。一部の実施形態では、上記抗原は、感染症と関連している。一部の実施形態では、上記感染症は、ウイルス性感染症、真菌性感染症、および／または細菌性感染症である。一部の実施形態では、上記感染症は、インフルエンザ、ＣＭＶ、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＭＣＶ、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ－２、ＶＳＶ、ＨＨＶ－６、ＨＨＶ－７、またはＨＨＶ－８と関連している。
本明細書に記載の方法、組成物、または複数の改変型ＰＢＭＣのいずれか一つによる一部の実施形態では、上記タンパク質は、一つまたは複数の抗原を含む。一部の実施形態では、上記抗原は、一つまたは複数の核酸によってコードされ、以下に限定されないがＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびプラスミドなどの一つまたは複数の核酸の形態で、上記ＰＢＭＣに入る。一部の実施形態では、上記抗原は、一つまたは複数のｍＲＮＡによってコードされ、一つまたは複数のｍＲＮＡの形態で上記ＰＢＭＣに入る。一部の実施形態では、上記一つまたは複数のｍＲＮＡは、本明細書に記載のいずれか一つの修飾を含む。一部の実施形態では、上記一つまたは複数のｍＲＮＡは、本明細書に記載されるモチーフのうちのいずれか一つを含み、そのようなものとしては、以下に限定されないが、本明細書に記載される免疫プロテアソーム標的化モチーフのうちのいずれか一つが挙げられる。
本明細書に記載の方法、組成物、または複数の改変型ＰＢＭＣのいずれか一つによる一部の実施形態では、上記抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原である。パピローマウイルスは、直径約５５ｎｍのビリオンサイズを有する小さな非エンベロープＤＮＡウイルスである。１００を超えるＨＰＶ遺伝子型が完全に特徴付けられ、より高い数が存在するものと推定されている。ＨＰＶは、子宮頸がん、ならびに一部の外陰部がん、膣がん、陰茎がん、中咽頭がん、肛門がん、および直腸がんの公知の原因である。ほとんどのＨＰＶ感染は無症状であり自然に消失するが、発癌性ＨＰＶ型の一つによる持続性感染は、前がんまたはがんに進行し得る。他のＨＰＶ関連疾患としては、一般的ないぼ、足底いぼ、扁平いぼ、肛門生殖器いぼ、肛門病変、表皮異形成、局所性上皮過形成、口腔パピローマ、疣贅嚢胞、喉頭パピローマ、扁平上皮内病変（ＳＩＬ）、子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、および膣上皮内腫瘍（ＶＡＩＮ）が挙げられる。公知のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）型の多くは、サブセットが発がん性である良性病変を引き起こす。疫学的および系統的関係に基づき、ＨＰＶ型は、十五の「高リスク型」（ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、７３、および８２）と、三つの「潜在的な高リスク型」（ＨＰＶ２６、５３、および６６）とに分類され、これらはともに、低悪性度および高悪性度の子宮頸部の変化およびがん、ならびに他の肛門生殖器がん、例えば、外陰がん、膣がん、陰茎がん、肛門がん、および肛門周囲がんなど、ならびに頭頸部がんとして現れることが知られている。最近では、高リスク型のＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８と乳がんとの関連も記述された。「低リスク型」に分類される十一種類のＨＰＶ型（ＨＰＶ６、１１、４０、４２、４３、４４、５４、６１、７０、７２、および８１型）が、良性かつ低悪性度の子宮頸部変化、生殖器いぼ、および再発性呼吸器パピローマとして現れることが知られている。皮膚型ＨＰＶの５型、８型、および９２型は、皮膚がんに関連している。一部のＨＰＶ関連がんでは、免疫系が低下し、それに応じて抗腫瘍応答が著しく損なわれる。Ｓｕｒｓｈ ａｎｄ Ｂｕｒｔｎｅｓｓ，Ａｍ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ １３（６）：２０－２７ （２０１７）を参照されたい。一部の実施形態では、上記抗原は、同じおよび／または異なる抗原に対する応答を惹起する複数のポリペプチドのプールである。一部の実施形態では、上記複数の抗原のプール中の抗原は、上記複数の抗原のプール中の他の抗原への免疫応答を減少させない。一部の実施形態では、上記ＨＰＶ抗原は、抗原性ＨＰＶエピトープと一つまたは複数の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである。一部の実施形態では、上記ＨＰＶ抗原は、それ自体と、他の抗原と、またはアジュバントと、複合体を形成する。一部の実施形態では、上記ＨＰＶは、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である。一部の実施形態では、上記ＨＰＶ抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０２特異的エピトープからなる。一部の実施形態では、上記ＨＰＶ抗原は、ＨＬＡ－Ｂ＊０７特異的エピトープからなる。一部の実施形態では、上記ＨＰＶ抗原は、ＨＬＡ－Ｂ＊３５特異的エピトープからなる。一部の実施形態では、上記ＨＰＶ抗原は、ＨＬＡ－Ａ＊０１特異的エピトープからなる。一部の実施形態では、上記ＨＰＶ抗原は、ＨＰＶ Ｅ６抗原またはＨＰＶ Ｅ７抗原である。一部の実施形態では、上記抗原は、ＨＰＶ Ｅ６および／またはＥ７に由来するペプチドを含む。一部の実施形態では、上記抗原は、ＨＰＶ Ｅ６および／またはＥ７に由来するＨＬＡ－Ａ＊０２制限ペプチドを含む。一部の実施形態では、上記ＨＰＶタンパク質は、ＨＰＶ Ｅ６である。一部の実施形態では、上記ＨＰＶタンパク質は、ＨＰＶ Ｅ７である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ６に由来するペプチドを含む。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ７に由来するペプチドを含む。一部の実施形態では、上記ＨＰＶタンパク質は、天然型（野生型、自然発生型、および／またはスプライスバリアントを含む）ＨＰＶ Ｅ６のアミノ酸配列の約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか一つを含むタンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＰＶタンパク質は、天然型ＨＰＶ Ｅ６のアミノ酸配列の１００％を含むタンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＰＶタンパク質は、天然型（野生型、自然発生型、および／またはスプライスバリアントを含む）ＨＰＶ Ｅ７のアミノ酸配列の約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか一つを含むタンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＰＶタンパク質は、天然型ＨＰＶ Ｅ７のアミノ酸配列の約１００％を含むタンパク質である。
世界中で単離されたＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）株は、ゲノム比較から推測された六つのゲノム群に分類され、ＨＢＶ遺伝子型Ａ～Ｆとして標示されている。Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）サブタイプと呼ばれる九つの血清学的群も、血清の弁別に基づいて定義されており、ａｄｗ２、ａｄｗ４、ａｄｒ、ａｄｒｑ－、ａｙｗ１、ａｙｗ２、ａｙｗ３、ａｙｗ４、およびａｙｒと名付けられている。一部の実施形態では、上記ＨＰＶ抗原は、抗原性ＨＰＶエピトープと一つまたは複数の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである。一部の実施形態では、上記ＨＰＶ抗原は、それ自体と、他の抗原と、またはアジュバントと、複合体を形成する。一部の実施形態では、上記ＨＢＶは、Ａ／ａｄｗ２、Ｂ／ａｄｗ２、Ｃ／ａｄｒ、Ｃ／ａｄｗ２、Ｄ／ａｙｗ３、Ｄ／ａｙｗ２、Ｅ／ａｙｗ４、Ｆ／ａｄｗ２、Ｆ／ａｄｗ４、またはＦ／ａｙｗ４のうちいずれか一つの遺伝子型／サブタイプである。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、ＨＬＡ－Ａ＊０２特異的エピトープからなる。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、ＨＢｓＡｇである。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、ＨＢｃである。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ表面タンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、および／またはＨＢＶ Ｘタンパク質のうちの一つまたは複数である。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、ＨＢｅＡｇである。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＢｓＡｇに由来するペプチドを含む。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＢｃに由来するペプチドを含む。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＢｅＡｇに由来するペプチドを含む。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、天然型（野生型、自然発生型、および／またはスプライスバリアントを含む）ＨＢｓＡｇのアミノ酸配列の約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか一つを含むタンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、天然型ＨＢｓＡｇのアミノ酸配列の１００％を含むタンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、天然型（野生型、自然発生型、および／またはスプライスバリアントを含む）ＨＢｅＡｇのアミノ酸配列の約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか一つを含むタンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、天然型ＨＢｅＡｇのアミノ酸配列の１００％を含むタンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、天然型（野生型、自然発生型、および／またはスプライスバリアントを含む）ＨＢｃのアミノ酸配列の約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか一つを含むタンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、天然型ＨＢｃのアミノ酸配列の１００％を含むタンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ表面タンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、および／またはＨＢＶ Ｘタンパク質のうちの一つまたは複数の天然型アミノ酸配列の約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のうちいずれか一つを含むタンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＢＶタンパク質は、ＨＢＶコアタンパク質、ＨＢＶ表面タンパク質、ＨＢＶポリメラーゼ、および／またはＨＢＶ Ｘタンパク質のうちの一つまたは複数の天然型アミノ酸配列の１００％を含むタンパク質である。
一部の実施形態では、上記タンパク質は、インフルエンザタンパク質である。一部の実施形態では、上記インフルエンザタンパク質は、インフルエンザＡおよび／またはインフルエンザＢに由来する。一部の実施形態では、上記タンパク質は、インフルエンザＭ１タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、インフルエンザＭ１タンパク質に由来するペプチドを含む。一部の実施形態では、上記インフルエンザタンパク質は、天然型（野生型、自然発生型、および／またはスプライスバリアントを含む）インフルエンザＭ１タンパク質のアミノ酸配列の約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか一つを含むタンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、改変型インフルエンザＭ１タンパク質である。一部の実施形態では、上記インフルエンザタンパク質は、天然型インフルエンザＭ１タンパク質のアミノ酸配列の１００％を含むタンパク質である。
本明細書に記載される方法、組成物、または複数の有核細胞のうちのいずれか一つによる一部の実施形態では、上記改変型有核細胞は、複数の免疫原性エピトープを含む複数の抗原（例えば、タンパク質由来の二つ以上の抗原）を含む。さらに別の実施形態では、上記複数の免疫原性エピトープを含む上記複数の抗原を含む上記改変型有核細胞を個体に投与した後、上記複数の免疫原性エピトープのいずれも、他の免疫原性エピトープのいずれかに対する個体における免疫応答を減少させない。一部の実施形態では、上記抗原は、ポリペプチドであり、上記免疫原性エピトープは、免疫原性ペプチドエピトープである。一部の実施形態では、上記免疫原性ペプチドエピトープは、Ｎ末端隣接ポリペプチドおよび／またはＣ末端隣接ポリペプチドと融合されている。一部の実施形態では、上記抗原は、免疫原性ペプチドエピトープと一つまたは複数の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである。一部の実施形態では、上記抗原は、Ｎ末端および／またはＣ末端で異種ペプチド配列に隣接する免疫原性ペプチドエピトープを含むポリペプチドである。一部の実施形態では、上記隣接異種ペプチド配列は、疾患関連免疫原性ペプチドに由来する。一部の実施形態では、上記隣接異種ペプチド配列は、天然に存在しない配列である。一部の実施形態では、上記隣接異種ペプチド配列は、免疫原性合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）に由来する。一部の実施形態では、Ｎ末端隣接ポリペプチドは、配列番号５～１０のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含み、および／またはＣ末端隣接ポリペプチドは、配列番号１１～１７のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記抗原は、ＭＨＣクラスＩ制限ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ制限ペプチドにプロセシングされることが可能である。
一部の実施形態では、上記タンパク質および／または上記抗原は、上記タンパク質および／または上記抗原の上記抗原プロセシングおよび提示を増強するための一つまたは複数の修飾を含む。
本明細書で使用される場合、免疫プロテアソーム標的化モチーフは、タンパク質分解速度の調節に重要なタンパク質の一部である。一部の実施形態では、免疫プロテアソーム標的化モチーフは、抗原プロセシング経路におけるタンパク質の分解を増強する。一部の実施形態では、免疫プロテアソーム標的化モチーフは、タンパク質の抗原プロセシング経路への局在化を促進する。一部の実施形態では、免疫プロテアソーム標的化モチーフは、免疫プロテアソーム複合体におけるタンパク質のプロセシングを増強する。免疫プロテアソーム標的化モチーフの一例は、デグロンである。分裂後期促進複合体またはシクロソーム（ＡＰＣ／Ｃ）によって標的化されることが知られているデグロンは、破壊ボックス（Ｄボックス）、ＫＥＮボックス、およびＡＢＢＡモチーフを含む。これらのモチーフを含有するタンパク質は、ＡＰＣ／Ｃと相互作用し、タンパク質のユビキチン化およびプロテアソームによる破壊をもたらす。他の例示的な免疫プロテアソーム標的化モチーフとしては、以下に限定されないが、ＫＥＫＥモチーフが挙げられる。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片は、一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフをさらに含み、上記タンパク質と上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとの融合タンパク質を生じる。一部の実施形態では、免疫プロテアソーム標的化モチーフの非存在下での上記細胞における上記タンパク質の分解および／または上記細胞の表面上の上記タンパク質由来のペプチドの提示と比較して、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフは、上記細胞における上記タンパク質の分解および／または上記細胞の表面上の上記タンパク質由来のペプチドの提示を増強する。
一部の実施形態では、上記一つまたは複数のタンパク質免疫プロテアソーム標的化モチーフを含む融合タンパク質の分解量は、上記免疫プロテアソーム標的化モチーフを含まない対応するタンパク質と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに増加する。一部の実施形態では、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする一つまたは複数の核酸配列を含むｍＲＮＡによってコードされる上記タンパク質の分解速度は、上記免疫プロテアソーム標的化モチーフを含まない対応するタンパク質と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに増加する。
一部の実施形態では、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフを含む上記タンパク質に由来するペプチドの細胞表面提示量は、上記免疫プロテアソーム標的化モチーフを含まない対応するタンパク質と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれかに増加する。一部の実施形態では、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフを含む上記タンパク質に由来するペプチドの細胞表面提示速度は、上記免疫プロテアソーム標的化モチーフを含まない対応するタンパク質と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれかに増加する。
一部の実施形態では、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフは、上記融合タンパク質のＮ末端にある。一部の実施形態では、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフは、上記融合タンパク質のＣ末端にある。一部の実施形態では、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフは、上記融合タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端にある。
一部の実施形態では、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフは、Ｄ－ボックスドメイン、ｓｅｃ／ＭＩＴＤドメイン、ＫＥＫＥモチーフのうち一つまたは複数を含む。
一部の実施形態では、上記タンパク質は、天然型の全長ＨＰＶ Ｅ７タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、配列番号５２のアミノ酸配列を含む天然型の全長ＨＰＶ Ｅ７タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、上記天然型ＨＰＶ Ｅ７タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡから翻訳される。一部の実施形態では、上記タンパク質は、上記天然型ＨＰＶ Ｅ７タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡから翻訳され、上記タンパク質は、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記タンパク質は、天然型の全長ＨＰＶ Ｅ６タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、配列番号５１のアミノ酸配列を含む天然型の全長ＨＰＶ Ｅ６タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、上記天然型ＨＰＶ Ｅ６タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡから翻訳される。一部の実施形態では、上記タンパク質は、上記天然型ＨＰＶ Ｅ６タンパク質をコードするコドン最適化されたｍＲＮＡから翻訳され、上記タンパク質は、配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＫＥＫＥドメインとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＫＥＫＥドメインとを含む融合タンパク質であり、このタンパク質は、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＤ－ボックスドメインとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ７タンパク質とＤ－ボックスドメインとを含む融合タンパク質であり、このタンパク質は、配列番号５３のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記タンパク質は、変異型ＮＬＳを有するＨＰＶ Ｅ７タンパク質を含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、変異型ＮＬＳを有するＨＰＶ Ｅ７タンパク質を含む融合タンパク質であり、このタンパク質は、配列番号５５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ７．６タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ７．６タンパク質であり、このタンパク質は、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記タンパク質は、６つのＨＰＶ Ｅ７．６のリピートを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、６つのＨＰＶ Ｅ７．６のリピートを含む融合タンパク質であり、このタンパク質は、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
タンパク質またはその断片を含む、有核細胞の組成物を生成する方法
タンパク質またはその断片を含む、有核細胞の組成物を生成する方法
一部の態様では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞を作製する方法が提供され、本方法は、上記タンパク質またはその断片を上記有核細胞に導入することを含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。
一部の態様では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞を作製する方法が提供され、本方法は、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを上記有核細胞に導入することを含み、上記ｍＲＮＡは、発現して上記タンパク質またはその断片を産生し、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。
一部の態様では、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含む有核細胞を作製する方法が提供され、本方法は、上記二つ以上の抗原を上記有核細胞に導入することを含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。
一部の態様では、タンパク質またはその断片を含む馴化された有核細胞を作製する方法が提供され、本方法は、上記タンパク質またはその断片を上記馴化された有核細胞に導入することを含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。
一部の態様では、タンパク質またはその断片を含む馴化された有核細胞を作製する方法が提供され、本方法は、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを上記馴化された有核細胞に導入することを含み、上記ｍＲＮＡは、発現されて上記タンパク質またはその断片を産生し、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。
一部の態様では、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含む馴化された有核細胞を作製する方法が提供され、本方法は、上記二つ以上の抗原を上記馴化された有核細胞に導入することを含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。
一部の実施形態では、タンパク質に由来する二つ以上の抗原を含む有核細胞を作製する方法が提供され、この二つ以上の抗原は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、タンパク質に由来する二つ以上の抗原を含む有核細胞を作製する方法が提供され、この二つ以上の抗原は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。
一部の実施形態では、上記細胞は、上記タンパク質に由来する二つ以上の抗原を含む。一部の実施形態では、上記細胞は、上記タンパク質に由来する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、７５、８０、９０、１００またはそれ以上の抗原のうちのいずれか約一つを含む。一部の実施形態では、上記抗原のうちの少なくとも二つは、部分的に重複するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記抗原のすべてを組み合わせたアミノ酸配列は、上記タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上重複している。一部の実施形態では、上記抗原のすべてを組み合わせたアミノ酸配列は、上記タンパク質のアミノ酸配列の５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のうちのいずれか約一つで重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約８０％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも二つの抗原と重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約８０％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも三つの抗原と重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約９０％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも二つの抗原と重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約９０％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも三つの抗原と重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約９５％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも二つの抗原と重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約９５％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも三つの抗原と重複している。
一部の実施形態では、上記抗原は、上記タンパク質の二つ以上のエピトープを含むポリペプチドである。一部の実施形態では、実施形態、免疫原性ペプチドエピトープは、Ｎ末端隣接ポリペプチドおよび／またはＣ末端隣接ポリペプチドと融合している。一部の実施形態では、上記抗原は、上記タンパク質の一つまたは複数のエピトープと一つまたは複数の異種ペプチド配列である。一部の実施形態では、上記一つまたは複数のエピトープは、Ｎ末端および／またはＣ末端で異種ペプチド配列に隣接する。一部の実施形態では、上記隣接異種ペプチド配列は、疾患関連免疫原性ペプチドに由来する。一部の実施形態では、上記隣接異種ペプチド配列は、天然に存在しない配列である。一部の実施形態では、上記隣接異種ペプチド配列は、免疫原性合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）に由来する。一部の実施形態では、Ｎ末端隣接ポリペプチドは、配列番号５～１０のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含み、および／またはＣ末端隣接ポリペプチドは、配列番号 １１～１７のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記抗原は、ＭＨＣクラスＩ制限ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ制限ペプチドにプロセシングされることが可能である。
一部の実施形態では、上記タンパク質は、がんに関連する変異タンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＰＶは、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を上記タンパク質またはその断片とインキュベートして、上記タンパク質またはその断片が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を生成することであって、上記タンパク質またはその断片がＨＬＡ非依存的な様式で個体において免疫応答を刺激する、上記インキュベートすることにより調製される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む上記有核細胞は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む有核細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、上記ｍＲＮＡが発現して上記タンパク質またはその断片を産生し、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を生成することであって、上記タンパク質またはその断片がＨＬＡ非依存的な様式で個体において免疫応答を刺激する、上記インキュベートすることにより調製される。
一部の実施形態では、上記インプット細胞懸濁液は、上記インプット有核細胞および抗原を含んでもよい。一部の実施形態では、上記インプット細胞懸濁液は、上記インプット有核細胞と上記タンパク質またはその断片とを含む。一部の実施形態では、上記インプット細胞懸濁液は、上記インプット有核細胞と上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡとを含む。一部の実施形態では、本方法は、上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、上記タンパク質もしくはその断片と共に、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡと共に、上記有核細胞をインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、本方法は、上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記タンパク質もしくはその断片と共に、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡと共に、上記有核細胞をインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、有核細胞集団内で最小の直径を有する上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約６０％、約４０％～約６０％、約３０％～約４５％、約５０％～約９９％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、または約６０％～約７０％のうちのいずれか一つである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記有核細胞の集団内で最小の直径を有する上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約６０％、約４０％～約６０％、約３０％～約４５％、約５０％～約９９％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、または約６０％～約７０％のうちのいずれか一つである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約２μｍ～約５μｍ、約３μｍ～約５μｍ、約２μｍ～約２．５μｍ、約２．２μｍ～約２．５μｍ、約２．５μｍ～約３μｍ、約３μｍ～約３．５μｍ、約３．５μｍ～約４μｍ、約４μｍ～約４．５μｍ、約３．２μｍ～約３．８μｍ、約３．８μｍ～約４．３μｍ、約４．２μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約４．５μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約２μｍ、２．２μｍ、２．５μｍ、３μｍ、３．５μｍ、４μｍ、４．５μｍ、５μｍ、５．５μｍ、６μｍ、６．５μｍ、７μｍ、７．５μｍ、８μｍ、８．５μｍ、９μｍ、９．５μｍ、１０μｍ、１０．５μｍ、１１μｍ、１１．５μｍ、１２μｍ、１２．５μｍ、１３μｍ、１３．５μｍ、１４μｍ、１４．５μｍ、または１５μｍのうちのいずれか一つまたはそれ未満である。一部の実施形態では、上記インプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液は、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部は、直列および／または並列に配置されている。
本明細書に記載される方法、使用、または組成物のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記有核細胞（例えば、ＰＢＭＣ）は、上記有核細胞を馴化するのに十分な時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約１時間～約２４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約２時間～約１０時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約３時間～約６時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約１時間、２時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間のうちのいずれか一つの間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードする核酸を上記有核細胞に導入する前に馴化される。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードする核酸を上記有核細胞に導入した後に馴化される。一部の実施形態では、馴化に用いられる上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。例示的なアジュバントとしては、ＣｐＧ ＯＤＮ、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（Ｒ８４８）、またはリポ多糖（ＬＰＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧ ７９０９である。
一部の実施形態では、上記有核細胞は、Ｂ細胞を含み、一つまたは複数の共刺激分子は、上記馴化された有核細胞のＢ細胞では、上記馴化されていない有核細胞のＢ細胞と比較して上方制御される。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数のＰＢＭＣであり、一つまたは複数の共刺激分子は、馴化された複数のＰＢＭＣのＢ細胞では、馴化されていない複数のＰＢＭＣのＢ細胞と比較して上方制御される。一部の実施形態では、上記共刺激分子は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６である。一部の実施形態では、上記馴化された複数のＰＢＭＣは、馴化されていない複数のＰＢＭＣと比較して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が増加している。一部の実施形態では、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が、馴化されていない複数のＰＢＭＣと比較して、約１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、または１０倍を超えて増加している。
本明細書に記載の方法、使用、または組成物のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記有核細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、ハプロタイプＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、またはＨＬＡ－Ｃ＊１６を有するヒト細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数のＰＢＭＣである。一部の実施形態では、上記馴化された有核細胞は、馴化された複数の改変ＰＢＭＣである。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である。
一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するようにさらに改変される。一部の実施形態では、上記共刺激分子は、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２である。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数のサイトカインの発現が増加するようにさらに改変される。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＦＮ－α２またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、バリアントサイトカイン（改変型サイトカインなど）である。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数のキメラ膜結合型サイトカインの発現が増加するようにさらに改変される。一部の実施形態では、上記サイトカインは改変され、上記改変サイトカインは上記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合される。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＴＦＲＣ）または腫瘍壊死因子（例えばＦａｓＬ）膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、配列番号８１または配列番号 ８２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、Ｇ４ＳリンカーまたはＥＡＡＡＫリンカーである。実施形態では、上記Ｇ４Ｓリンカーは、Ｇ４Ｓ配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のリピートのうちのいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記ＥＡＡＡＫリンカーは、ＥＡＡＡＫ配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のリピートのうちいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、配列番号７７～８０のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記複数の改変型ＰＢＭＣは、一つまたは複数のサイトカインの発現および／または分泌の増加をもたらす核酸を含む。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸は、配列番号７１または７２のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上記サイトカインは、Ｔ細胞活性化の刺激におけるシグナル３エフェクターである。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、非膜結合型サイトカインと比較して、個体における上記サイトカインの半減期を増強する。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインの半減期は、非膜結合型サイトカインと比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のうちのいずれか一つに増加する。一部の実施形態では、上記膜結合型サイトカインは、非膜結合型サイトカインを含む対応する有核細胞と比較して、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２８時間、３２時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、またはそれ以上の時間、上記タンパク質またはその断片を導入された上記有核細胞によって提示される上記抗原との上記サイトカインの空間的会合を延長させる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、膜結合型サイトカインをさらに含む有核細胞は、非膜結合型サイトカインを含む対応する有核細胞と比較して、約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のうちいずれか一つに高い、局所サイトカイン濃度を呈する。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、膜結合型サイトカインをさらに含む有核細胞は、対応する非膜結合型サイトカインを含む有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。
タンパク質またはその断片を含む有核細胞の組成物
タンパク質またはその断片を含む有核細胞の組成物
一部の態様では、有核細胞を含む組成物が提供され、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の態様では、個体における免疫応答を刺激するための組成物が提供され、上記組成物は、タンパク質またはその断片を含む有効量の有核細胞を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、個体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における有効量の有核細胞を含む組成物の使用が提供され、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。
一部の態様では、有核細胞を含む組成物が提供され、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の態様では、個体における免疫応答を刺激するための組成物が提供され、上記組成物は、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む有効量の有核細胞を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、個体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における有効量の有核細胞を含む組成物の使用が提供され、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。
一部の態様では、有核細胞を含む組成物が提供され、上記有核細胞は、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の態様では、個体における免疫応答を刺激するための組成物が提供され、上記組成物は、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含む有効量の有核細胞を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、個体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における有効量の有核細胞を含む組成物の使用が提供され、上記有核細胞は、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。
一部の態様では、馴化された有核細胞を含む組成物が提供され、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の態様では、個体における免疫応答を刺激するための組成物が提供され、上記組成物は、タンパク質またはその断片を含む有効量の馴化された有核細胞を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、個体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における有効量の有核細胞を含む組成物の使用が提供され、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。
一部の態様では、馴化された有核細胞を含む組成物が提供され、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の態様では、個体における免疫応答を刺激するための組成物が提供され、上記組成物は、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む有効量の馴化された有核細胞を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、個体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における有効量の有核細胞を含む組成物の使用が提供され、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。
一部の態様では、馴化された有核細胞を含む組成物が提供され、上記有核細胞は、二つ以上の抗原を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の態様では、個体における免疫応答を刺激するための組成物が提供され、上記組成物は、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含む有効量の馴化された有核細胞を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、個体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における有効量の有核細胞を含む組成物の使用が提供され、上記有核細胞は、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。
一部の態様では、本発明は、医薬として使用するための組成物を提供し、上記組成物は、断片のタンパク質を含む無核細胞の有効量の組成物を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の態様では、本発明は、医薬として使用するための組成物を提供し、上記組成物は、断片のタンパク質をコードするｍＲＮＡを含む無核細胞の有効量の組成物を含み、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の態様では、本発明は、医薬として使用するための組成物を提供し、上記組成物は、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含む無核細胞の有効量の組成物を含み、上記二つ以上の抗原は、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する。
一部の実施形態では、上記細胞は、上記タンパク質に由来する二つ以上の抗原を含む。一部の実施形態では、上記細胞は、上記タンパク質に由来する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、７５、８０、９０、１００またはそれ以上の抗原のうちのいずれか約一つを含む。一部の実施形態では、上記抗原のうちの少なくとも二つは、部分的に重複するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記抗原のすべてを組み合わせたアミノ酸配列は、上記タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上重複している。一部の実施形態では、上記抗原のすべてを組み合わせたアミノ酸配列は、上記タンパク質のアミノ酸配列の５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のうちのいずれか約一つで重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約８０％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも二つの抗原と重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約８０％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも三つの抗原と重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約９０％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも二つの抗原と重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約９０％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも三つの抗原と重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約９５％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも二つの抗原と重複している。一部の実施形態では、上記タンパク質のアミノ酸配列の約９５％の各アミノ酸は、上記タンパク質に由来する少なくとも三つの抗原と重複している。
一部の実施形態では、上記抗原は、上記タンパク質の二つ以上のエピトープを含むポリペプチドである。一部の実施形態では、実施形態、免疫原性ペプチドエピトープは、Ｎ末端隣接ポリペプチドおよび／またはＣ末端隣接ポリペプチドと融合している。一部の実施形態では、上記抗原は、上記タンパク質の一つまたは複数のエピトープと一つまたは複数の異種ペプチド配列である。一部の実施形態では、上記一つまたは複数のエピトープは、Ｎ末端および／またはＣ末端で異種ペプチド配列に隣接する。一部の実施形態では、上記隣接異種ペプチド配列は、疾患関連免疫原性ペプチドに由来する。一部の実施形態では、上記隣接異種ペプチド配列は、天然に存在しない配列である。一部の実施形態では、上記隣接異種ペプチド配列は、免疫原性合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）に由来する。一部の実施形態では、Ｎ末端隣接ポリペプチドは、配列番号５～１０のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含み、および／またはＣ末端隣接ポリペプチドは、配列番号 １１～１７のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記抗原は、ＭＨＣクラスＩ制限ペプチドおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ制限ペプチドにプロセシングされることが可能である。
一部の実施形態では、上記タンパク質は、がんに関連する変異タンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＰＶは、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を上記タンパク質またはその断片とインキュベートして、上記タンパク質またはその断片が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む上記有核細胞は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む有核細胞を生成することにより調製される。
一部の実施形態では、上記インプット細胞懸濁液は、上記インプット有核細胞および抗原を含んでもよい。一部の実施形態では、上記インプット細胞懸濁液は、上記インプット有核細胞と上記タンパク質またはその断片とを含む。一部の実施形態では、上記インプット細胞懸濁液は、上記インプット有核細胞と上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡとを含む。一部の実施形態では、本方法は、上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、上記タンパク質もしくはその断片と共に、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡと共に、上記有核細胞をインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、本方法は、上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記タンパク質もしくはその断片と共に、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡと共に、上記有核細胞をインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、有核細胞集団内で最小の直径を有する上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約６０％、約４０％～約６０％、約３０％～約４５％、約５０％～約９９％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、または約６０％～約７０％のうちのいずれか一つである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記有核細胞の集団内で最小の直径を有する上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約６０％、約４０％～約６０％、約３０％～約４５％、約５０％～約９９％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、または約６０％～約７０％のうちのいずれか一つである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約２μｍ～約５μｍ、約３μｍ～約５μｍ、約２μｍ～約２．５μｍ、約２．２μｍ～約２．５μｍ、約２．５μｍ～約３μｍ、約３μｍ～約３．５μｍ、約３．５μｍ～約４μｍ、約４μｍ～約４．５μｍ、約３．２μｍ～約３．８μｍ、約３．８μｍ～約４．３μｍ、約４．２μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約４．５μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約２μｍ、２．２μｍ、２．５μｍ、３μｍ、３．５μｍ、４μｍ、４．５μｍ、５μｍ、５．５μｍ、６μｍ、６．５μｍ、７μｍ、７．５μｍ、８μｍ、８．５μｍ、９μｍ、９．５μｍ、１０μｍ、１０．５μｍ、１１μｍ、１１．５μｍ、１２μｍ、１２．５μｍ、１３μｍ、１３．５μｍ、１４μｍ、１４．５μｍ、または１５μｍのうちのいずれか一つまたはそれ未満である。一部の実施形態では、上記インプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液は、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部は、直列および／または並列に配置されている。
本明細書に記載される方法、使用、または組成物のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記有核細胞（例えば、ＰＢＭＣ）は、上記有核細胞を馴化するのに十分な時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約１時間～約２４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約２時間～約１０時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約３時間～約６時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約１時間、２時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間のうちのいずれか一つの間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードする核酸を上記有核細胞に導入する前に馴化される。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードする核酸を上記有核細胞に導入した後に馴化される。一部の実施形態では、馴化に用いられる上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。例示的なアジュバントとしては、ＣｐＧ ＯＤＮ、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（Ｒ８４８）、またはリポ多糖（ＬＰＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧ ７９０９である。
一部の実施形態では、上記有核細胞は、Ｂ細胞を含み、一つまたは複数の共刺激分子は、上記馴化された有核細胞のＢ細胞では、上記馴化されていない有核細胞のＢ細胞と比較して上方制御される。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数のＰＢＭＣであり、一つまたは複数の共刺激分子は、馴化された複数のＰＢＭＣのＢ細胞では、馴化されていない複数のＰＢＭＣのＢ細胞と比較して上方制御される。一部の実施形態では、上記共刺激分子は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６である。一部の実施形態では、上記馴化された複数のＰＢＭＣは、馴化されていない複数のＰＢＭＣと比較して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が増加している。一部の実施形態では、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が、馴化されていない複数のＰＢＭＣと比較して、約１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、または１０倍を超えて増加している。
本明細書に記載の方法、使用、または組成物のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記有核細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、ハプロタイプＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、および／またはＨＬＡ－Ｃ＊１６を有するヒト細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数のＰＢＭＣである。一部の実施形態では、上記馴化された有核細胞は、馴化された複数の改変ＰＢＭＣである。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である。
一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するようにさらに改変される。一部の実施形態では、上記共刺激分子は、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２である。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数のサイトカインの発現が増加するようにさらに改変される。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＦＮ－α２またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、バリアントサイトカイン（改変型サイトカインなど）である。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数のキメラ膜結合型サイトカインの発現が増加するようにさらに改変される。一部の実施形態では、上記サイトカインは改変され、上記改変サイトカインは上記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合される。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＴＦＲＣ）または腫瘍壊死因子（例えばＦａｓＬ）膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、配列番号８１または配列番号 ８２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、Ｇ４ＳリンカーまたはＥＡＡＡＫリンカーである。実施形態では、上記Ｇ４Ｓリンカーは、Ｇ４Ｓ配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のリピートのうちのいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記ＥＡＡＡＫリンカーは、ＥＡＡＡＫ配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のリピートのうちいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である。一部の実施形態では、キメラ膜結合型サイトカインは、配列番号７７～８０のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記複数の改変型ＰＢＭＣは、一つまたは複数のサイトカインの発現および／または分泌の増加をもたらす核酸を含む。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸は、配列番号７１または７２のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上記サイトカインは、Ｔ細胞活性化の刺激におけるシグナル３エフェクターである。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、非膜結合型サイトカインと比較して、個体における上記サイトカインの半減期を増強する。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインの半減期は、非膜結合型サイトカインと比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のうちのいずれか一つに増加する。一部の実施形態では、上記膜結合型サイトカインは、非膜結合型サイトカインを含む対応する有核細胞と比較して、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２８時間、３２時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、またはそれ以上の時間、上記タンパク質またはその断片を導入された上記有核細胞によって提示される上記抗原との上記サイトカインの空間的会合を延長させる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、膜結合型サイトカインをさらに含む有核細胞は、非膜結合型サイトカインを含む対応する有核細胞と比較して、約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のうちいずれか一つに高い、局所サイトカイン濃度を呈する。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、膜結合型サイトカインをさらに含む有核細胞は、対応する非膜結合型サイトカインを含む有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。一部の実施形態では、上記膜結合型サイトカインは、膜結合型ケモカインである。
免疫細胞の活性を増強する方法およびその組成物
免疫細胞の活性を増強する方法およびその組成物
一部の態様では、免疫細胞の活性を増強する方法が提供され、本方法は、上記免疫細胞においてキメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸を発現することを含む。一部の実施形態では、上記サイトカインは改変され、上記改変サイトカインは上記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合される。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＴＦＲＣ）または腫瘍壊死因子（例えばＦａｓＬ）膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、配列番号８１または配列番号 ８２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、Ｇ４ＳリンカーまたはＥＡＡＡＫリンカーである。実施形態では、上記Ｇ４Ｓリンカーは、Ｇ４Ｓ配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のリピートのうちのいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記ＥＡＡＡＫリンカーは、ＥＡＡＡＫ配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のリピートのうちいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記複数の改変型ＰＢＭＣは、一つまたは複数のサイトカインの発現および／または分泌の増加をもたらす核酸を含む。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸は、配列番号７１または７２のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上記サイトカインは、Ｔ細胞活性化の刺激におけるシグナル３エフェクターである。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、非膜結合型サイトカインと比較して、個体における上記サイトカインの半減期を増強する。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインの半減期は、非膜結合型サイトカインと比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のうちのいずれか一つに増加する。一部の実施形態では、上記膜結合型サイトカインは、非膜結合型サイトカインを含む対応する有核細胞と比較して、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２８時間、３２時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、またはそれ以上の時間、上記タンパク質またはその断片を導入された上記有核細胞によって提示される上記抗原との上記サイトカインの空間的会合を延長させる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、膜結合型サイトカインをさらに含む有核細胞は、非膜結合型サイトカインを含む対応する有核細胞と比較して、約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のうちいずれか一つに高い、局所サイトカイン濃度を呈する。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、膜結合型サイトカインをさらに含む有核細胞は、対応する非膜結合型サイトカインを含む有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。
一部の実施形態では、上記膜結合型サイトカインは、膜結合型ケモカインである。
一部の態様では、免疫細胞の活性を増強する組成物が提供され、この組成物は、上記免疫細胞にキメラ膜結合型サイトカインを含む。一部の実施形態では、上記サイトカインは改変され、上記改変サイトカインは上記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合される。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＴＦＲＣ）または腫瘍壊死因子（例えばＦａｓＬ）膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、配列番号８１または配列番号 ８２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、Ｇ４ＳリンカーまたはＥＡＡＡＫリンカーである。実施形態では、上記Ｇ４Ｓリンカーは、Ｇ４Ｓ配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のリピートのうちのいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記ＥＡＡＡＫリンカーは、ＥＡＡＡＫ配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のリピートのうちいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、配列番号７７～８０のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記複数の改変型ＰＢＭＣは、一つまたは複数のサイトカインの発現および／または分泌の増加をもたらす核酸を含む。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸は、配列番号７１または７２のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上記サイトカインは、Ｔ細胞活性化の刺激におけるシグナル３エフェクターである。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、非膜結合型サイトカインと比較して、個体における上記サイトカインの半減期を増強する。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインの半減期は、非膜結合型サイトカインと比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のうちのいずれか一つに増加する。一部の実施形態では、上記膜結合型サイトカインは、非膜結合型サイトカインを含む対応する有核細胞と比較して、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２８時間、３２時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、またはそれ以上の時間、上記タンパク質またはその断片を導入された上記有核細胞によって提示される上記抗原との上記サイトカインの空間的会合を延長させる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、膜結合型サイトカインをさらに含む有核細胞は、非膜結合型サイトカインを含む対応する有核細胞と比較して、約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のうちいずれか一つに高い、局所サイトカイン濃度を呈する。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、膜結合型サイトカインをさらに含む有核細胞は、対応する非膜結合型サイトカインを含む有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。
一部の実施形態では、上記膜結合型サイトカインは、膜結合型ケモカインである。
一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数のサイトカインの発現が増加するように改変される。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＦＮ－α２またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、バリアントサイトカイン（改変型サイトカインなど）、例えばキメラ膜結合型サイトカインなどである。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数のキメラ膜結合型サイトカイン（例えば、膜結合型ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１）の発現を増加させるようにさらに改変される。
一部の実施形態では、上記免疫細胞は、抗原をさらに含む。一部の実施形態では、上記免疫細胞は、抗原をコードするｍＲＮＡをさらに含む。一部の実施形態では、上記抗原は、タンパク質またはその断片であり、このタンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記免疫細胞は、タンパク質由来の二つ以上の抗原をさらに含む。一部の実施形態では、上記二つ以上の抗原は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記タンパク質は、がんに関連する変異タンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＰＶは、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である。
一部の実施形態では、免疫細胞の上記活性を増強する方法であって、上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能として、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインを含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸は、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである。
一部の実施形態では、免疫細胞の上記活性を増強する方法が提供され、上記キメラ膜結合型サイトカインを含み、抗原をさらに含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と抗原とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原とインキュベートして、上記核酸および上記抗原が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能として、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が発現し、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインと上記抗原とを含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸は、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである。
一部の実施形態では、免疫細胞の上記活性を増強する方法が提供され、上記キメラ膜結合型サイトカインを含み、抗原をさらに含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と上記抗原をコードする核酸とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原をコードする上記核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能として、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸および上記抗原をコードする上記核酸が発現し、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインと上記抗原とを含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸および／または上記抗原をコードする核酸は、ｍＲＮＡである。
一部の実施形態では、免疫細胞の上記活性を増強する方法が提供され、上記キメラ膜結合型サイトカインおよびタンパク質由来の上記二つ以上の抗原を含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸とタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸およびタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインとタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とを含む免疫細胞を生成することにより調製される。
一部の態様では、医薬として使用するための組成物が提供され、上記組成物は、キメラ膜結合型サイトカインを含む有効量の免疫細胞を含む。一部の態様では、個体において組成物によりがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための組成物が提供され、上記組成物は、キメラ膜結合型サイトカインを含む有効量の免疫細胞を含む。一部の態様では、個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療する方法が提供され、本方法は、キメラ膜結合型サイトカインを含む有効量の免疫細胞を含む組成物を上記個体に投与することを含む。一部の実施形態では、個体における免疫応答を刺激するための、および／または個体におけるがん、感染症、もしくはウイルス関連疾患を治療するための医薬の製造における、キメラ膜結合型サイトカインを含む有効量の免疫細胞を含む組成物の使用が提供される。本明細書に記載の方法、組成物、または使用による一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能として、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインを含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸は、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである。
一部の態様では、医薬として使用するための組成物が提供され、上記組成物は、キメラ膜結合型サイトカインと抗原とを含む、有効量の免疫細胞を含む。一部の態様では、個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための組成物が提供され、上記組成物は、キメラ膜結合型サイトカインと抗原とを含む有効量の免疫細胞を含む。一部の態様では、個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療する方法が提供され、本方法は、キメラ膜結合型サイトカインと抗原とを含む有効量の免疫細胞を含む組成物を上記個体に投与することを含む。一部の実施形態では、個体における免疫応答を刺激するための、および／または個体におけるがん、感染症、もしくはウイルス関連疾患を治療するための医薬の製造における、キメラ膜結合型サイトカインと抗原とを含む有効量の免疫細胞を含む組成物の使用が提供される。本明細書に記載の方法、組成物、または使用による一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインと上記抗原とを含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と上記抗原とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原とインキュベートして、上記核酸および上記抗原が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能として、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が発現し、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインと上記抗原とを含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸は、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである。
一部の態様では、医薬として使用するための組成物が提供され、上記組成物は、キメラ膜結合型サイトカインと抗原とを含む有効量の免疫細胞を含む。一部の態様では、個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための組成物が提供され、上記組成物は、キメラ膜結合型サイトカインと抗原とを含む有効量の免疫細胞を含む。一部の態様では、個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療する方法が提供され、本方法は、キメラ膜結合型サイトカインと抗原とを含む有効量の免疫細胞を含む組成物を上記個体に投与することを含む。一部の実施形態では、個体における免疫応答を刺激するための、および／または個体におけるがん、感染症、もしくはウイルス関連疾患を治療するための医薬の製造における、キメラ膜結合型サイトカインと抗原とを含む有効量の免疫細胞を含む組成物の使用が提供される。本明細書に記載の方法、組成物、または使用による一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインおよび上記抗原を含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と上記抗原をコードする核酸とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原をコードする上記核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能として、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸および上記抗原をコードする上記核酸が発現し、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインと上記抗原とを含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸および／または上記抗原をコードする核酸は、ｍＲＮＡである。
一部の態様では、医薬として使用するための組成物が提供され、上記組成物は、キメラ膜結合型サイトカインとタンパク質由来の二つ以上の抗原とを含む有効量の免疫細胞を含む。一部の態様では、個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための組成物が提供され、上記組成物は、キメラ膜結合型サイトカインとタンパク質由来の二つ以上の抗原とを含む有効量の免疫細胞を含む。一部の態様では、個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療する方法が提供され、本方法は、キメラ膜結合型サイトカインとタンパク質由来の二つ以上の抗原とを含む有効量の免疫細胞を含む組成物を上記個体に投与することを含む。一部の実施形態では、個体における免疫応答を刺激するための、および／または個体におけるがん、感染症、もしくはウイルス関連疾患を治療するための医薬の製造における、キメラ膜結合型サイトカインとタンパク質由来の二つ以上の抗原とを含む有効量の免疫細胞を含む組成物の使用が提供される。本明細書に記載の方法、組成物、または使用による一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインおよびタンパク質由来の上記二つ以上の抗原を含む上記免疫細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸とタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸およびタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインとタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とを含む免疫細胞を生成することにより調製される。
一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記有核細胞の集団内で最小の直径を有する上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約６０％、約４０％～約６０％、約３０％～約４５％、約５０％～約９９％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、または約６０％～約７０％のうちのいずれか一つである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約２μｍ～約５μｍ、約３μｍ～約５μｍ、約２μｍ～約２．５μｍ、約２．２μｍ～約２．５μｍ、約２．５μｍ～約３μｍ、約３μｍ～約３．５μｍ、約３．５μｍ～約４μｍ、約４μｍ～約４．５μｍ、約３．２μｍ～約３．８μｍ、約３．８μｍ～約４．３μｍ、約４．２μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約４．５μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約２μｍ、２．２μｍ、２．５μｍ、３μｍ、３．５μｍ、４μｍ、４．５μｍ、５μｍ、５．５μｍ、６μｍ、６．５μｍ、７μｍ、７．５μｍ、８μｍ、８．５μｍ、９μｍ、９．５μｍ、１０μｍ、１０．５μｍ、１１μｍ、１１．５μｍ、１２μｍ、１２．５μｍ、１３μｍ、１３．５μｍ、１４μｍ、１４．５μｍ、または１５μｍのうちのいずれか一つまたはそれ未満である。一部の実施形態では、上記インプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液は、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部は、直列および／または並列に配置されている。
本明細書に記載される方法、使用、または組成物のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記有核細胞（例えば、ＰＢＭＣ）は、上記有核細胞を馴化するのに十分な時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約１時間～約２４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約２時間～約１０時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約３時間～約６時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約１時間、２時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間のうちのいずれか一つの間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードする核酸を上記有核細胞に導入する前に馴化される。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードする核酸を上記有核細胞に導入した後に馴化される。一部の実施形態では、馴化に用いられる上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。例示的なアジュバントとしては、ＣｐＧ ＯＤＮ、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（Ｒ８４８）、またはリポ多糖（ＬＰＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧ ７９０９である。
一部の実施形態では、上記有核細胞は、Ｂ細胞を含み、一つまたは複数の共刺激分子は、上記馴化された有核細胞のＢ細胞では、上記馴化されていない有核細胞のＢ細胞と比較して上方制御される。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数のＰＢＭＣであり、一つまたは複数の共刺激分子は、馴化された複数のＰＢＭＣのＢ細胞では、馴化されていない複数のＰＢＭＣのＢ細胞と比較して上方制御される。一部の実施形態では、上記共刺激分子は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６である。一部の実施形態では、上記馴化された複数のＰＢＭＣは、馴化されていない複数のＰＢＭＣと比較して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が増加している。一部の実施形態では、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が、馴化されていない複数のＰＢＭＣと比較して、約１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、または１０倍を超えて増加している。
本明細書に記載の方法、使用、または組成物のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記有核細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、ハプロタイプＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、またはＨＬＡ－Ｃ＊１６を有するヒト細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数のＰＢＭＣである。一部の実施形態では、上記馴化された有核細胞は、馴化された複数の改変ＰＢＭＣである。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である。
インプット有核細胞内の構成細胞
インプット有核細胞内の構成細胞
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、それを必要とする個体に有効量のタンパク質またはその断片を含む有核細胞の組成物を投与することを提供し、上記タンパク質またはその断片は、細胞内に送達される。一部の実施形態では、有核細胞の上記組成物は、免疫細胞の組成物である。一部の実施形態では、有核細胞の上記組成物は、複数のＰＢＭＣを含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である。
本発明の特定の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞は、ＰＢＭＣである。本明細書で使用される場合、ＰＢＭＣは、個体から取得される全血からの白血球アフェレーシスなどのアフェレーシスによって単離され得る。また、同じ個体または異なる個体由来の異なるプールのＰＢＭＣを混合することによって再構成されたＰＢＭＣ組成物も提供される。他の例では、ＰＢＭＣは、生成されたプロファイルを有する混合細胞組成物に異なる細胞集団を混合することによって再構成することもできる。一部の実施形態では、ＰＢＭＣを再構成するために使用される細胞集団は、混合された細胞集団（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、または単球のうちの一つまたは複数の混合物）である。一部の実施形態では、ＰＢＭＣを再構成するために使用される細胞集団は、精製された細胞集団（例えば、精製されたＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、または単球）である。追加の例では、ＰＢＭＣ組成物の再構成に使用される上記異なる細胞集団は、同じ個体から（例えば、自己で）単離するか、または異なる個体から（例えば、同種および／もしくは異種で）単離することができる。
したがって、本明細書に記載される方法による一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ２０＋Ｂ細胞、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞のうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球を含み、上記複数のＰＢＭＣ中のＰＢＭＣの総数に対するＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球の比率は、全血中のＰＢＭＣの総数に対するＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球の比率と本質的に同じである。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球を含み、上記複数のＰＢＭＣ中のＰＢＭＣの総数に対するＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球の比率は、全血由来の白血球アフェレーシス産物中のＰＢＭＣの総数に対するＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球の比率と本質的に同じである。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球を含み、上記複数のＰＢＭＣ中のＰＢＭＣの総数に対するＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球の比率は、全血中のＰＢＭＣの総数に対するＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球の比率と１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、または５０％以下のうちのいずれか一つで異なる。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球を含み、上記複数のＰＢＭＣ中のＰＢＭＣの総数に対するＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球の比率は、全血中のＰＢＭＣの総数に対するＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球の比率と１０％以下のうちのいずれか一つで異なる。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球を含み、上記複数のＰＢＭＣ中のＰＢＭＣの総数に対するＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球の比率は、全血由来の白血球アフェレーシス産物中のＰＢＭＣの総数に対するＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球の比率と１％、２％、５％、１０％ １５％、２０％、２５％、３０％、４０％、または５０％以下のうちのいずれか一つで異なる。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球を含み、上記複数のＰＢＭＣ中のＰＢＭＣの総数に対するＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球の比率は、全血由来の白血球アフェレーシス産物中のＰＢＭＣの総数に対するＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球の比率と１０％以下のうちのいずれか一つで異なる。
本明細書に記載の方法による一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣの約２５％～約７０％は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣの約２．５％～約１４％は、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣの約３．５％～約３５％は、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣの約４％～約２５％は、ＮＫ細胞である。
本明細書に記載される方法による一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの少なくとも約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％のうちのいずれか一つは、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの少なくとも約２５％は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの少なくとも約０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、６％、７％、７．５％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％ 、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、または３０％のうちのいずれか一つは、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの少なくとも約２．５％は、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの少なくとも約０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、４％、５％、６％、７％、７．５％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％ 、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、または３０％のうちのいずれか一つは、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの少なくとも約３．５％は、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２５％、３０％ 、３５％、または４０％のうちのいずれか一つは、単球である。一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの少なくとも約４％は、単球である。一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの少なくとも約２５％はＴ細胞であり、上記ＰＢＭＣの少なくとも約２．５％はＢ細胞であり、上記ＰＢＭＣの少なくとも約３．５％はＮＫ細胞であり、上記ＰＢＭＣの少なくとも約４％は単球である。
本明細書に記載される方法による一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％以下のうちのいずれか一つは、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの約７０％以下は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの約５％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２５％、３０％、３５％、４０％、または５０％以下のうちのいずれか一つは、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの約１４％以下は、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、または６０％以下のうちのいずれか一つは、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの約３５％以下は、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの約５％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２５％、３０％、３５％、４０％、または５０％以下のうちのいずれか一つは、単球である。一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの約４％以下は、単球である。一部の実施形態では、上記ＰＢＭＣの約２５％以下はＴ細胞であり、上記ＰＢＭＣの約２．５％以下はＢ細胞であり、上記ＰＢＭＣの約３．５％以下はＮＫ細胞であり、上記ＰＢＭＣの約４％以下は単球である。
本明細書に記載される方法による一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣの約２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、３５％～４０％、４０％～４５％、４５％～５０％、５０％～５５％、５５％～６０％、６０％～６５％、６５％～７０％、または７０％～７５％のうちのいずれか一つは、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣの約２５％～約７０％は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣの約１％～２．５％、２．５％～４％、４％～６％、６％～８％、８％～１０％、１０％～１２％、１２％～１４％、１４％～１６％、１６％～２０％、または２０％～２５％のうちのいずれか一つは、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣの約２．５％～約１４％は、Ｂ細胞である。一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣの約１％～２％、２％～３．５％、３．５％～５％、５％～８％、８％～１０％、１０％～１２％、１２％～１４％、１４％～１６％、１６％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、または３５％～４０％のうちのいずれか一つは、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣの約３．５％～約３５％は、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣの約２％～４％、４％～６％、６％～８％、８％～１０％、１０％～１２％、１２％～１４％、１４％～１６％、１６％～２０％、２０％～２５％、２５％～３０％、３０％～３５％、または３５％～４０％のうちのいずれか一つは、単球である。一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣの約４％～約２５％は、単球である。一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣの約２５％～約７０％はＴ細胞であり、上記改変型ＰＢＭＣの約２．５％～約１４％はＢ細胞であり、上記改変型ＰＢＭＣの約３．５％～約３５％はＮＫ細胞であり、上記改変型ＰＢＭＣの約４％～約２５％はＮＫ細胞である。
本明細書で使用される場合、ＰＢＭＣは、単核血球（例えば、リンパ球および単球）の混合細胞集団の組成物を操作した後に生成することもできる。一部の事例では、上記ＰＢＭＣは、単核血球の混合細胞集団内の特定の亜集団（例えばＢ細胞）を低減（例えば枯渇）させた後に生成される。個体における単核血球の混合細胞集団中の組成物を操作して、上記細胞集団を同じ個体の全血由来の白血球アフェレーシス産物にいっそう厳密に類似させることができる。他の例では、単核血球（例えば、マウス脾細胞）の混合細胞集団中の組成物を操作して、上記細胞集団をヒト全血由来の白血球アフェレーシス産物から単離されたヒトＰＢＭＣにいっそう厳密に類似させることもできる。
本発明の一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞の上記組成物は、ＰＢＭＣに見られる細胞の集団である。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞の上記組成物は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞の上記組成物は、ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ２０＋Ｂ細胞、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ５６＋ＮＫ細胞のうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞の上記組成物は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のうちのいずれかのＴ細胞を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞の上記組成物は、１００％のＴ細胞を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞の上記組成物は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のうちのいずれかのＢ細胞を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞の上記組成物は、１００％のＢ細胞を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞の上記組成物は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のうちのいずれかのＮＫ細胞を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞の上記組成物は、１００％のＮＫ細胞を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞の上記組成物は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のうちのいずれかの単球を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞の上記組成物は、１００％の単球を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞の上記組成物は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のうちのいずれかの樹状細胞を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞の上記組成物は、１００％の樹状細胞を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞の上記組成物は、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のうちのいずれかのＮＫ－Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む有核細胞の上記組成物は、１００％のＮＫ－Ｔ細胞細胞を含む。
タンパク質またはその断片を含む有核細胞のさらに別の改変
タンパク質またはその断片を含む有核細胞のさらに別の改変
本明細書に記載される方法のいずれか一つによる一部の実施形態では、有核細胞（例えばＰＢＭＣ）の上記組成物は、ある剤を含み、この剤は、上記有核細胞の生存率および／または機能を、この剤を含まない対応する有核細胞の組成物と比較して増強する。一部の実施形態では、有核細胞の上記組成物は、ある剤を含み、この剤は、凍結融解サイクル時に上記有核細胞の生存率および／または機能を、この剤を含まない対応する有核細胞の組成物と比較して増強する。一部の実施形態では、上記剤は、凍結保存剤および／または低温保存剤である。一部の実施形態では、上記凍結保存剤も上記低温保存剤も、上記剤を含む有核細胞の組成物では、任意の凍結融解サイクルの前に上記剤を含まない有核細胞の対応する組成物と比較して、１０％以下または２０％以下の細胞死を生じる。一部の実施形態では、上記有核細胞の少なくとも約７０％、約８０％、または約９０％は、最大１回、２回、３回、４回、５回の凍結融解サイクル後に生存可能である。一部の実施形態では、上記剤は、エンドサイトーシスを増強する化合物、安定化剤、または補因子である。一部の実施形態では、上記剤は、アルブミンである。一部の実施形態では、上記アルブミンは、マウス、ウシ、またはヒトのアルブミンである。一部の実施形態では、上記薬剤は、ヒトアルブミンである。一部の実施形態では、上記薬剤は、二価金属カチオン、グルコース、ＡＴＰ、カリウム、グリセロール、トレハロース、Ｄ－スクロース、ＰＥＧ１５００、Ｌ－アルギニン、Ｌ－グルタミン、またはＥＤＴＡのうちの一つまたは複数である。一部の実施形態では、上記二価金属カチオンは、Ｍｇ２＋ 、Ｚｎ２＋、またはＣａ２＋ のうちの一つまたは複数である。一部の実施形態では、上記剤は、ピルビン酸ナトリウム、アデニン、トレハロース、デキストロース、マンノース、スクロース、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＤＭＳＯ、ＨＥＰＥＳ、グリセロール、グルタチオン、イノシン、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、ナトリウム金属イオン、カリウム金属イオン、マグネシウム金属イオン、塩化物、アセテート、グルコネート、スクロース、水酸化カリウム、または水酸化ナトリウムのうちの一つまたは複数である。一部の実施形態では、上記剤は、ピルビン酸ナトリウム、アデニン、Ｒｅｊｕｖｅｓｏｌ（登録商標）、トレハロース、デキストロース、マンノース、スクロース、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ（登録商標）、ＤＭＳＯ、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１５、ＨＥＰＥＳ、グリセロール、グルタチオン、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）のうちの一つまたは複数である。
本明細書に記載される方法のいずれか一つによる一部の実施形態では、有核細胞の上記組成物は、一つまたは複数の共刺激分子の発現を増加させるようにさらに改変された複数の改変型ＰＢＭＣを含む。一部の実施形態では、上記共刺激分子は、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２である。一部の実施形態では、上記複数の改変型ＰＢＭＣは、上記一つまたは複数の共刺激分子の発現の増加をもたらす核酸を含む。一部の実施形態では、上記複数の改変型ＰＢＭＣは、上記一つまたは複数の共刺激分子の発現の増加をもたらすｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、上記共刺激分子は、Ｔ細胞活性化の刺激におけるシグナル２メディエータである。
本明細書に記載される方法のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣは、一つまたは複数のサイトカインの発現を増加させるためにさらに改変される。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、またはＩＦＮα２のうちの一つまたは複数である。一部の実施形態では、上記複数の改変型ＰＢＭＣは、一つまたは複数のサイトカインの発現および／または分泌の増加をもたらす核酸を含む。一部の実施形態では、上記サイトカインは、Ｔ細胞活性化の刺激におけるシグナル３エフェクターである。
Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲシグナルおよび関連シグナルの強度に応じて、最終的に増殖、エフェクター機能、または死をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードを開始する。成熟前のまたは過剰な活性化から保護するため、Ｔ細胞には完全な活性化のための二つの独立したシグナルが必要である。シグナル１は、ＭＨＣと複合体化された抗原性ペプチドへの上記ＴＣＲの結合によって提供される抗原特異的シグナルである。シグナル２は、サイトカイン、または抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＢ７．１（ＣＤ８０）やＢ７．２（ＣＤ８６）などの共刺激分子の会合のいずれかによって媒介される。シグナル３はＩＬ－２、ＩＬ－１２、およびＩＦＮ－αなどの炎症性サイトカインによって媒介される。
本明細書に記載の方法または組成物のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記有核細胞（ＰＢＭＣなど）は、タンパク質またはその断片を含み、この有核細胞は、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）をさらに含む。一部の実施形態では、上記有核細胞（ＰＢＭＣなど）は、タンパク質またはその断片を含み、この有核細胞は、シグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３エフェクターなど）をさらに含む。一部の実施形態では、上記有核細胞（ＰＢＭＣなど）は、タンパク質またはその断片を含み、この有核細胞は、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）、およびシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３エフェクターなど）をさらに含む。
一部の実施形態では、シグナル２を媒介する上記一つまたは複数の剤は、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２のうち一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、シグナル２を媒介する上記一つまたは複数の剤は、Ｂ７－１（ＣＤ８０）および／またはＢ７－２（ＣＤ８６）を含む。一部の実施形態では、シグナル２を媒介する上記一つまたは複数の剤は、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２をコードする一つまたは複数のｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、シグナル２を媒介する上記一つまたは複数の剤は、Ｂ７－１（ＣＤ８０）および／またはＢ７－２（ＣＤ８６）をコードする一つまたは複数のｍＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記一つまたは複数の剤は、一つまたは複数のサイトカインを含む。一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記一つまたは複数の剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＦＮα２のうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記一つまたは複数の剤は、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１２を含む。一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記一つまたは複数の剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＦＮα２のバリアントのうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記一つまたは複数の剤は、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１２のバリアントを含む。一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記一つまたは複数の剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＦＮα２のバリアントのうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記一つまたは複数の剤は、膜結合型ＩＬ－２および／または膜結合型ＩＬ－１２を含む。一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記一つまたは複数の剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＦＮα２のバリアントのうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記一つまたは複数の剤は、ＩＬ－２および／またはＩＬ１２のバリアントを含む。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する剤をさらに含む有核細胞は、シグナル２を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル３を媒介する剤をさらに含む有核細胞は、シグナル３を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する剤および／またはシグナル３を媒介する剤をさらに含む有核細胞は、シグナル２またはシグナル３を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。一部の実施形態では、上記抗原特異的Ｔ細胞の活性化の増強は、ＨＬＡ非依存的である。一部の実施形態では、上記抗原特異的Ｔ細胞の活性化の増強は、ハプロタイプＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、および／またはＨＬＡ－Ｃ＊１６のうち一つまたは複数による制限に依存するＴ細胞活性化を含む。
一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数のサイトカインの発現が増加するようにさらに改変される。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＦＮ－α２またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、バリアントサイトカイン（改変型サイトカインなど）、例えばキメラ膜結合型サイトカインなどである。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、一つまたは複数のキメラ膜結合型サイトカイン（例えば、膜結合型ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１）の発現を増加させるようにさらに改変される。一部の実施形態では、上記サイトカインは改変され、上記改変サイトカインは上記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合される。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＴＦＲＣ）または腫瘍壊死因子（例えばＦａｓＬ）膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、配列番号８１または配列番号 ８２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、Ｇ４ＳリンカーまたはＥＡＡＡＫリンカーである。実施形態では、上記Ｇ４Ｓリンカーは、Ｇ４Ｓ配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のリピートのうちのいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記ＥＡＡＡＫリンカーは、ＥＡＡＡＫ配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のリピートのうちいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、配列番号７７～８０のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記複数の改変型ＰＢＭＣは、一つまたは複数のサイトカインの発現および／または分泌の増加をもたらす核酸を含む。一部の実施形態では、キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸は、配列番号７１または７２のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上記サイトカインは、Ｔ細胞活性化の刺激におけるシグナル３エフェクターである。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、非膜結合型サイトカインと比較して、個体における上記サイトカインの半減期を増強する。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインの半減期は、非膜結合型サイトカインと比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のうちのいずれか一つに増加する。一部の実施形態では、上記膜結合型サイトカインは、非膜結合型サイトカインを含む対応する有核細胞と比較して、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２８時間、３２時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、またはそれ以上の時間、上記タンパク質またはその断片を導入された上記有核細胞によって提示される上記抗原との上記サイトカインの空間的会合を延長させる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、膜結合型サイトカインをさらに含む有核細胞は、非膜結合型サイトカインを含む対応する有核細胞と比較して、約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のうちいずれか一つに高い、局所サイトカイン濃度を呈する。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、膜結合型サイトカインをさらに含む有核細胞は、対応する非膜結合型サイトカインを含む有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。
一部の実施形態では、上記膜結合型サイトカインは、膜結合型ケモカインである。
一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣは、ＭＨＣクラスＩＩ発現を調節するためのさらに別の改変を含む。一部の実施形態では、改変型ＰＢＭＣの同種での投与に応答して、個体で開始される自然免疫応答は、さらに別の改変を含まない対応する改変型ＰＢＭＣの同種での投与に応答して個体で開始される自然免疫応答と比較して低減する。一部の実施形態では、改変型ＰＢＭＣの投与された個体におけるそれらの循環半減期は、それらの投与された個体におけるさらに別の改変を含まない対応する改変型ＰＢＭＣの循環半減期と比較して増加する。一部の実施形態では、改変型ＰＢＭＣの投与された個体におけるそれらの循環半減期は、それらの投与された個体におけるさらに別の改変を含まない対応する改変型ＰＢＭＣの循環半減期と比較して、約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、または５００倍以上のいずれか一つに増加する。一部の実施形態では、改変型ＰＢＭＣの投与された個体におけるそれらの循環半減期は、それらの投与された個体におけるさらに別の改変を含まない対応する改変型ＰＢＭＣの循環半減期と本質的に同じである。
本明細書に記載の方法のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記プロセスは、さらに別のインキュベーションステップを行わずに調製された対応する有核細胞と比較して、上記有核細胞の生存率および／または機能を増強する剤と有核細胞の組成物をインキュベートするステップをさらに含む。
ＨＬＡ非依存的な様式で抗原特異的応答を増強するための有核細胞のさらに別の改変
ＨＬＡ非依存的な様式で抗原特異的応答を増強するための有核細胞のさらに別の改変
Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲシグナルおよび関連シグナルの強度に応じて、最終的に増殖、エフェクター機能、または死をもたらす細胞内シグナル伝達カスケードを開始する。成熟前のまたは過剰な活性化から保護するため、Ｔ細胞には完全な活性化のための二つの独立したシグナルが必要である。シグナル１は、ＭＨＣと複合体化された抗原性ペプチドへの上記ＴＣＲの結合によって提供される抗原特異的シグナルである。シグナル２は、サイトカイン、または抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＢ７．１（ＣＤ８０）やＢ７．２（ＣＤ８６）などの共刺激分子の会合のいずれかによって媒介される。シグナル３はＩＬ－２、ＩＬ－１２、およびＩＦＮ－αなどの炎症性サイトカインによって媒介される。
一部の態様では、免疫細胞の上記活性を増強するための方法が提供され、本方法は、上記免疫細胞においてシグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）を発現することを含む。一部の態様では、免疫細胞の上記活性を増強するための方法が提供され、本方法は、上記免疫細胞においてシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３エフェクターなど）を発現することを含む。一部の態様では、免疫細胞の上記活性を増強するための方法が提供され、本方法は、上記免疫細胞においてシグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）およびシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３エフェクターなど）を発現することを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞活性化の刺激におけるシグナル３を媒介する剤（シグナル３エフェクターなど）は、サイトカインである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＩＦＮα２のうち一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１２を含む。一部の実施形態では、免疫細胞の上記活性を増強する方法が提供され、本方法は、上記免疫細胞においてキメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸を発現することを含む。一部の実施形態では、上記サイトカインは改変され、上記改変サイトカインは上記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合される。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＴＦＲＣ）または腫瘍壊死因子（例えばＦａｓＬ）膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、配列番号８１または配列番号 ８２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、Ｇ４ＳリンカーまたはＥＡＡＡＫリンカーである。実施形態では、上記Ｇ４Ｓリンカーは、Ｇ４Ｓ配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のリピートのうちのいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記ＥＡＡＡＫリンカーは、ＥＡＡＡＫ配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のリピートのうちいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記複数の改変型ＰＢＭＣは、一つまたは複数のサイトカインの発現および／または分泌の増加をもたらす核酸を含む。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸は、配列番号７１または７２のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上記サイトカインは、Ｔ細胞活性化の刺激におけるシグナル３エフェクターである。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、非膜結合型サイトカインと比較して、個体における上記サイトカインの半減期を増強する。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインの半減期は、非膜結合型サイトカインと比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のうちのいずれか一つに増加する。一部の実施形態では、上記膜結合型サイトカインは、非膜結合型サイトカインを含む対応する有核細胞と比較して、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２８時間、３２時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、またはそれ以上の時間、上記タンパク質またはその断片を導入された上記有核細胞によって提示される上記抗原との上記サイトカインの空間的会合を延長させる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、膜結合型サイトカインをさらに含む有核細胞は、非膜結合型サイトカインを含む対応する有核細胞と比較して、約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のうちいずれか一つに高い、局所サイトカイン濃度を呈する。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、膜結合型サイトカインをさらに含む有核細胞は、対応する非膜結合型サイトカインを含む有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。
一部の態様では、本発明は、個体における免疫応答を刺激する方法を提供し、本方法は、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記ｍＲＮＡは発現し、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の態様では、本発明は、それを必要とする個体にワクチン接種する方法を提供し、本方法は、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞はタンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、上記有核細胞における発現のために最適化されたコドンである。
一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片は、抗原を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片は、抗原である。一部の実施形態では、上記抗原は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質に由来する二つ以上の抗原を含む。一部の実施形態では、上記二つ以上の抗原は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記タンパク質は、がんに関連する変異タンパク質、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である。一部の実施形態では、上記ＨＰＶは、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である。一部の実施形態では、上記タンパク質は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質もしくはその断片、またはタンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、このタンパク質もしくはその断片は、ＭＨＣと複合体化された抗原性ペプチドにプロセシングされ、それによってＴ細胞活性化においてシグナル１を媒介する。
一部の実施形態では、シグナル１は、ＭＨＣと複合体化された抗原性ペプチドへのＴ細胞受容体の結合によって提供される抗原特異的シグナルである。一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、ｍＲＮＡが発現し、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質もしくはその断片、またはタンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、このタンパク質もしくはその断片は、ＭＨＣと複合体化された抗原性ペプチドにプロセシングされ、それによってＴ細胞活性化においてシグナル１を媒介する。
上述の方法のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記有核細胞（ＰＢＭＣなど）は、上記タンパク質またはその断片に対する上記免疫応答をさらに増強するためのさらに別の改変を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞（ＰＢＭＣなど）へのさらに別の改変の方法は、ＨＬＡ非依存的な様式で、上記タンパク質またはその断片に対する免疫応答をさらに増強する。一部の実施形態では、上記有核細胞（ＰＢＭＣなど）へのさらに別の改変の方法は、上記タンパク質またはその断片に対する免疫応答をさらに増強し、上記増強された免疫応答は、一つまたは複数のＨＬＡハプロタイプによる制限に依存する免疫応答を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞（ＰＢＭＣなど）へのさらに別の改変の方法は、上記タンパク質またはその断片に対する上記免疫応答をさらに増強し、上記増強された免疫応答は、ハプロタイプＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、またはＨＬＡ－Ｃ＊１６のうちの一つまたは複数による制限に依存する免疫応答を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質もしくはその断片、またはタンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、このタンパク質もしくはその断片は、ＭＨＣと複合体化された抗原性ペプチドにプロセシングされ、それによってＴ細胞活性化においてシグナル１を媒介する。一部の実施形態では、上記有核細胞へのさらに別の改変は、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２エフェクターなど）の導入を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞へのさらに別の改変は、シグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３エフェクターなど）の導入を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞へのさらに別の改変は、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）、およびシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３メディエータなど）の導入を含む。
本明細書に記載される方法または組成物のうちいずれか一つによる一部の実施形態では、シグナル２を媒介する上記剤（例えばシグナル２メディエータなど）は、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２のうち一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、シグナル２を媒介する上記剤は、ＣＤ７０、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、および／またはＢ７－２（ＣＤ８６）を含む。一部の実施形態では、上記改変型有核細胞は、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２のうち一つまたは複数の発現の増加をもたらす核酸を含む。一部の実施形態では、上記改変型有核細胞は、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２のうち一つまたは複数をコードする一つまたは複数の核酸を含む。一部の実施形態では、上記複数の改変型有核細胞は、ＣＤ７０、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、および／またはＢ７－２（ＣＤ８６）をコードする一つまたは複数の核酸を含む。
本明細書に記載される方法または組成物のいずれか一つによる一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記剤（シグナル３エフェクターなど）は、サイトカインまたはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記剤は、サイトカインまたはその機能的バリアントをコードするｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＦＮ－α２またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、バリアントサイトカイン（改変型サイトカインなど）、例えばキメラ膜結合型サイトカインなどである。一部の実施形態では、上記サイトカインは改変され、上記改変サイトカインは上記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合される。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＴＦＲＣ）または腫瘍壊死因子（例えばＦａｓＬ）膜貫通ドメインである。一部の実施形態では、上記膜貫通ドメインは、配列番号８１または配列番号 ８２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、Ｇ４ＳリンカーまたはＥＡＡＡＫリンカーである。実施形態では、上記Ｇ４Ｓリンカーは、Ｇ４Ｓ配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のリピートのうちのいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記ＥＡＡＡＫリンカーは、ＥＡＡＡＫ配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個のリピートのうちいずれか一つを含む。一部の実施形態では、上記ペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、配列番号７７～８０のいずれか一つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、上記複数の改変型有核細胞は、一つまたは複数のサイトカインの発現および／または分泌の増加をもたらす核酸を含む。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸は、配列番号７１または７２のヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、上記サイトカインは、Ｔ細胞活性化の刺激におけるシグナル３エフェクターである。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインは、非膜結合型サイトカインと比較して、個体における上記サイトカインの半減期を増強する。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインの半減期は、非膜結合型サイトカインと比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のうちのいずれか一つに増加する。一部の実施形態では、上記膜結合型サイトカインは、非膜結合型サイトカインを含む対応する有核細胞と比較して、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、２４時間、２８時間、３２時間、３６時間、４８時間、７２時間、９６時間、またはそれ以上の時間、上記タンパク質またはその断片を導入された上記有核細胞によって提示される上記抗原との上記サイトカインの空間的会合を延長させる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、膜結合型サイトカインをさらに含む有核細胞は、非膜結合型サイトカインを含む対応する有核細胞と比較して、約１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のうちいずれか一つに高い、局所サイトカイン濃度を呈する。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、膜結合型サイトカインをさらに含む有核細胞は、対応する非膜結合型サイトカインを含む有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、ＩＦＮ－α２またはその機能的バリアントである。一部の実施形態では、上記サイトカインは、バリアントサイトカイン（改変型サイトカインなど）、例えばキメラ膜結合型サイトカインなどである。一部の実施形態では、上記有核細胞は、一つまたは複数のキメラ膜結合型サイトカイン（例えば、膜結合型ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、および／またはＩＬ－２１）の発現を増加させるようにさらに改変される。一部の実施形態では、上記有核細胞は、一つまたは複数のキメラ膜結合型サイトカインをコードする一つまたは複数の核酸をさらに含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、膜結合型ＩＬ－１２をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、膜結合型ＩＬ－２をコードする核酸をさらに含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、膜結合型ＩＬ－２および膜結合型ＩＬ－１２をコードする核酸をさらに含む。
一部の態様では、個体における免疫応答を刺激する方法が提供され、本方法は、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激し、上記有核細胞は、シグナル２を媒介する剤およびシグナル３を媒介する剤を有してさらに改変されている。一部の態様では、それを必要とする個体にワクチン接種する方法が提供され、本方法は、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞はタンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片は、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激し、上記有核細胞は、シグナル２を媒介する剤およびシグナル３を媒介する剤を有してさらに改変されている。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、上記有核細胞における発現のために最適化されたコドンである。
本明細書に提供される方法、有核細胞、または組成物のいずれか一つによる一部の実施形態では、タンパク質またはその断片と、シグナル２および／またはシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤とを含む上記有核細胞は、ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片と、シグナル２および／またはシグナル３を媒介する上記一つまたは複数の剤に対し十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記タンパク質またはその断片、ならびにシグナル２および／またはシグナル３を媒介する上記一つまたは複数の剤とインキュベートして、上記タンパク質またはその断片と、シグナル２および／またはシグナル３を媒介する上記一つまたは複数の剤とが上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片、ならびにシグナル２および／またはシグナル３を媒介する上記一つまたは複数の剤を含む免疫細胞を生成することを含むプロセスによって調製される。
一部の実施形態では、シグナル２を媒介する上記剤は、ＣＤ８６を含み、シグナル３を媒介する上記剤は、ＩＬ－２を含む。本明細書に提供される方法、有核細胞、または組成物のいずれか一つによる一部の実施形態では、タンパク質またはその断片とＣＤ８６とＩＬ－２とを含む上記有核細胞は、ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片とＣＤ８６とＩＬ－２に対し十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を上記タンパク質またはその断片とＣＤ８６とＩＬ－２とインキュベートして、上記タンパク質またはその断片とＣＤ８６とＩＬ－２とが上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片とＣＤ８６とＩＬ－２とを含む免疫細胞を生成することを含むプロセスによって調製される。
一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記剤は、膜結合型サイトカインである。本明細書に提供される方法、組成物、または使用による一部の実施形態では、タンパク質またはその断片と膜結合型サイトカインとを含む上記有核細胞は、ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と上記タンパク質またはその断片をコードする核酸とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能として、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸および上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸が発現し、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインと上記タンパク質またはその断片とを含む免疫細胞を生成することを含むプロセスによって調製される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸、および／または上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸は、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片は、一つまたは複数の抗原を含む。
一部の実施形態では、シグナル２を媒介する上記剤は、キメラ膜結合型サイトカインを含む。一部の実施形態では、抗原に対する免疫応答の刺激において免疫細胞の上記活性を増強する方法が提供され、上記キメラ膜結合型サイトカインを含み、抗原をさらに含む上記免疫細胞は、ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記抗原と上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原とインキュベートして、上記核酸および上記抗原が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能として、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が発現し、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインと上記抗原とを含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸は、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである。
一部の実施形態では、抗原に対する免疫応答の刺激において免疫細胞の上記活性を増強する方法が提供され、上記キメラ膜結合型サイトカインを含み、抗原をさらに含む上記免疫細胞は、ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と上記抗原をコードする核酸とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原をコードする上記核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能として、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸および上記抗原をコードする上記核酸が発現し、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインと上記抗原とを含む免疫細胞を生成することにより調製される。一部の実施形態では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸および／または上記抗原をコードする核酸は、ｍＲＮＡである。
一部の実施形態では、抗原に対する免疫応答の刺激において免疫細胞の上記活性を増強する方法が提供され、上記キメラ膜結合型サイトカインおよびタンパク質由来の上記二つ以上の抗原を含む上記免疫細胞は、ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸とタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸およびタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインとタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とを含む免疫細胞を生成することにより調製される。
一部の態様では、医薬として使用するための組成物が提供され、この組成物は、タンパク質またはその断片を含み、シグナル２および／またはシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤をさらに含む、有効量の有核細胞を含む。一部の態様では、個体において組成物を用いてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための組成物が提供され、この組成物は、タンパク質またはその断片を含み、シグナル２および／またはシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤をさらに含む、有効量の有核細胞を含む。一部の態様では、個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療する方法が提供され、本方法は、タンパク質またはその断片を含み、シグナル２および／またはシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤をさらに含む、有効量の有核細胞を含む組成物を投与することを含む。一部の実施形態では、個体における免疫応答を刺激するための、および／または個体におけるがん、感染症、もしくはウイルス関連疾患を治療するための医薬の製造における、タンパク質またはその断片を含みかつシグナル２および／またはシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤をさらに含む有効量の有核細胞を含む組成物の使用が提供される。
一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記剤は、一つまたは複数の膜結合型サイトカインを含む。一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記剤は、膜結合型ＩＬ－１２を含む。一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記剤は、膜結合型ＩＬ－２を含む。一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記剤は、膜結合型ＩＬ－２および膜結合型ＩＬ－１２を含む。一部の実施形態では、シグナル２を媒介する上記剤は、ＣＤ８０を含む。一部の実施形態では、シグナル３を媒介する上記剤は、ＣＤ８６を含む。一部の実施形態では、シグナル２を媒介する上記剤は、ＣＤ８０およびＣＤ８６を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質もしくはその断片、またはタンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、このタンパク質もしくはその断片は、ＭＨＣと複合体化された抗原性ペプチドにプロセシングされ、それによってＴ細胞活性化においてシグナル１を媒介する。
本明細書に記載の方法、組成物、または使用による一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片、ＣＤ８６、および膜結合型ＩＬ－１２を含み、上記有核細胞は、ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、ＣＤ８６をコードする核酸、膜結合型ＩＬ－１２をコードする核酸、および上記タンパク質またはその断片をコードする核酸が通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、ＣＤ８６をコードする上記核酸、膜結合型ＩＬ－１２をコードする上記核酸、および上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能として、細胞内では、ＣＤ８６をコードする上記核酸、膜結合型ＩＬ－１２をコードする上記核酸、および上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸が発現し、それによって、上記タンパク質またはその断片、ＣＤ８６、および膜結合型ＩＬ－１２を含む免疫細胞を生成することを含むプロセスによって調製される。一部の実施形態では、ＣＤ８６をコードする上記核酸、膜結合型ＩＬ－１２をコードする上記核酸、および／または上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸は、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片は、一つまたは複数の抗原を含む。
本明細書に記載の方法、組成物、または使用による一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片、ＣＤ８６、および膜結合型ＩＬ－２を含み、上記有核細胞は、ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、ＣＤ８６をコードする核酸、膜結合型ＩＬ－２をコードする核酸、および上記タンパク質またはその断片をコードする核酸が通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、ＣＤ８６をコードする上記核酸、膜結合型ＩＬ－２をコードする上記核酸、および上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能として、細胞内では、ＣＤ８６をコードする上記核酸、膜結合型ＩＬ－２をコードする上記核酸、および上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸が発現し、それによって、上記タンパク質またはその断片、ＣＤ８６、および膜結合型ＩＬ－２を含む免疫細胞を生成することを含むプロセスによって調製される。一部の実施形態では、ＣＤ８６をコードする上記核酸、膜結合型ＩＬ－２をコードする上記核酸、および／または上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸は、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片は、一つまたは複数の抗原を含む。
本明細書に記載の方法、組成物、または使用による一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質またはその断片、ＣＤ８６、膜結合型ＩＬ－２、および膜結合型ＩＬ－１２を含み、上記有核細胞は、ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、ＣＤ８６をコードする核酸、膜結合型ＩＬ－２をコードする核酸、膜結合型ＩＬ－１２をコードする核酸、および上記タンパク質またはその断片をコードする核酸が通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびにｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、ＣＤ８６をコードする上記核酸、膜結合型ＩＬ－２をコードする上記核酸、膜結合型ＩＬ－１２をコードする上記核酸、および上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能として、細胞内では、ＣＤ８６をコードする上記核酸、膜結合型ＩＬ－２をコードする上記核酸、膜結合型ＩＬ－１２をコードする上記核酸、および上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸が発現し、それによって、上記タンパク質またはその断片、ＣＤ８６、膜結合型ＩＬ－２、および膜結合型ＩＬ－１２を含む免疫細胞を生成することを含むプロセスによって調製される。一部の実施形態では、ＣＤ８６をコードする上記核酸、膜結合型ＩＬ－２をコードする上記核酸、膜結合型ＩＬ－１２をコードする上記核酸、および／または上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸は、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片は、一つまたは複数の抗原を含む。
一部の実施形態では、上記インプット細胞懸濁液は、上記インプット有核細胞および抗原を含んでもよい。一部の実施形態では、上記インプット細胞懸濁液は、上記インプット有核細胞と上記タンパク質またはその断片とを含む。一部の実施形態では、上記インプット細胞懸濁液は、上記インプット有核細胞と上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡとを含む。一部の実施形態では、本方法は、上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、上記タンパク質もしくはその断片と共に、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡと共に、上記有核細胞をインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、本方法は、上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記タンパク質もしくはその断片と共に、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡと共に、上記有核細胞をインキュベートすることを含む。
一部の実施形態では、上記インプット細胞懸濁液は、上記インプット有核細胞および上記タンパク質またはその断片、ならびにシグナル２を媒介する剤および／またはシグナル３を媒介する剤を含む。一部の実施形態では、上記インプット細胞懸濁液は、上記インプット有核細胞および上記タンパク質またはその断片、ならびにシグナル２を媒介する剤および／またはシグナル３を媒介する剤をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、上記インプット細胞懸濁液は、上記インプット有核細胞および上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡ、ならびにシグナル２を媒介する剤および／またはシグナル３を媒介する剤をコードするｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、本方法は、細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、シグナル２を媒介する剤および／またはシグナル３を媒介する剤をコードするｍＲＮＡ、ならびに上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡと、上記有核細胞をインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、本方法は、細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させる前に、シグナル２を媒介する剤および／またはシグナル３を媒介する剤をコードするｍＲＮＡ、ならびに上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡと、上記有核細胞をインキュベートすることを含む。
本明細書に記載される方法、組成物、または有核細胞のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡ（シグナル２メディエータをコードするｍＲＮＡ、およびシグナル３メディエータをコードするｍＲＮＡなど）は、外因性ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記外因性ｍＲＮＡは、インビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは組換えタンパク質をコードする。一部の実施形態では、上記ｍＲＮＡは、有核細胞における発現のためにコドン最適化される。
一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、上記有核細胞の集団内で最小の直径を有する上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約６０％、約４０％～約６０％、約３０％～約４５％、約５０％～約９９％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、または約６０％～約７０％のうちのいずれか一つである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約２μｍ～約５μｍ、約３μｍ～約５μｍ、約２μｍ～約２．５μｍ、約２．２μｍ～約２．５μｍ、約２．５μｍ～約３μｍ、約３μｍ～約３．５μｍ、約３．５μｍ～約４μｍ、約４μｍ～約４．５μｍ、約３．２μｍ～約３．８μｍ、約３．８μｍ～約４．３μｍ、約４．２μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約４．５μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約２μｍ、２．２μｍ、２．５μｍ、３μｍ、３．５μｍ、４μｍ、４．５μｍ、５μｍ、５．５μｍ、６μｍ、６．５μｍ、７μｍ、７．５μｍ、８μｍ、８．５μｍ、９μｍ、９．５μｍ、１０μｍ、１０．５μｍ、１１μｍ、１１．５μｍ、１２μｍ、１２．５μｍ、１３μｍ、１３．５μｍ、１４μｍ、１４．５μｍ、または１５μｍのうちのいずれか一つまたはそれ未満である。一部の実施形態では、上記インプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液は、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部は、直列および／または並列に配置されている。
本明細書に記載される方法、使用、または組成物のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記有核細胞（例えば、ＰＢＭＣ）は、上記有核細胞を馴化するのに十分な時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約１時間～約２４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約２時間～約１０時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約３時間～約６時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約１時間、２時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間のうちのいずれか一つの間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードする核酸を上記有核細胞に導入する前に馴化される。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードする核酸を上記有核細胞に導入した後に馴化される。一部の実施形態では、馴化に用いられる上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ Ｉ：Ｃ）、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。例示的なアジュバントとしては、ＣｐＧ ＯＤＮ、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（Ｒ８４８）、またはリポ多糖（ＬＰＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧ ７９０９である。
一部の実施形態では、上記有核細胞は、Ｂ細胞を含み、一つまたは複数の共刺激分子は、上記馴化された有核細胞のＢ細胞では、上記馴化されていない有核細胞のＢ細胞と比較して上方制御される。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数のＰＢＭＣであり、一つまたは複数の共刺激分子は、馴化された複数のＰＢＭＣのＢ細胞では、馴化されていない複数のＰＢＭＣのＢ細胞と比較して上方制御される。一部の実施形態では、上記共刺激分子は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６である。一部の実施形態では、上記馴化された複数のＰＢＭＣは、馴化されていない複数のＰＢＭＣと比較して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が増加している。一部の実施形態では、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が、馴化されていない複数のＰＢＭＣと比較して、約１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、または１０倍を超えて増加している。
本明細書に記載の方法、使用、または組成物のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記有核細胞は免疫細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、ハプロタイプＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、またはＨＬＡ－Ｃ＊１６を有するヒト細胞である。一部の実施形態では、上記有核細胞は、複数のＰＢＭＣである。一部の実施形態では、上記馴化された有核細胞は、馴化された複数の改変ＰＢＭＣである。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である。
一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質もしくはその断片、またはタンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、このタンパク質もしくはその断片は、ＭＨＣと複合体化された抗原性ペプチドにプロセシングされ、それによってＴ細胞活性化においてシグナル１を媒介する。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル２を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、増強されたレベルで抗原特異的免疫応答を誘導することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル２を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、ＨＬＡ非依存的な様式で増強されたレベルで抗原特異的免疫応答を誘導することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル２を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、増強されたレベルで抗原特異的免疫応答を誘導することができ、上記増強された免疫応答は、ハプロタイプＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、またはＨＬＡ－Ｃ＊１６のうちの一つまたは複数による制限に依存する免疫応答を含む。
一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質もしくはその断片、またはタンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、このタンパク質もしくはその断片は、ＭＨＣと複合体化された抗原性ペプチドにプロセシングされ、それによってＴ細胞活性化においてシグナル１を媒介する。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル２を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル２を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、ＨＬＡ非依存的な様式で、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル２を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができ、上記Ｔ細胞活性化の増強は、ハプロタイプＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、またはＨＬＡ－Ｃ＊１６のうちの一つまたは複数による制限に依存するＴ細胞活性化を含む。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）をさらに含む有核細胞は、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができ、上記ＣＤ８＋ Ｔ細胞の一つまたは複数の多機能性マーカーは、シグナル２を媒介する剤を含まない有核細胞による抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに増加している。一部の実施形態では、上記一つまたは複数の多機能性マーカーは、グランザイムＢ、ＩＦＮ－α、ＩＬ－２、ＰＤ－１、および／またはＩＦＮ－γを含む。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）をさらに含む有核細胞は、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができ、上記ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖または生存は、シグナル２を媒介する剤を含まない有核細胞による抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに増加している。
一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質もしくはその断片、またはタンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、このタンパク質もしくはその断片は、ＭＨＣと複合体化された抗原性ペプチドにプロセシングされ、それによってＴ細胞活性化においてシグナル１を媒介する。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３エフェクターなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル３を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、増強されたレベルで抗原特異的免疫応答を誘導することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３エフェクターなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル３を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、ＨＬＡ非依存的な様式で増強されたレベルで抗原特異的免疫応答を誘導することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３エフェクターなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル３を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、増強されたレベルで抗原特異的免疫応答を誘導することができ、上記増強された免疫応答は、ハプロタイプＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、またはＨＬＡ－Ｃ＊１６のうちの一つまたは複数による制限に依存する免疫応答を含む。
一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質もしくはその断片、またはタンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、このタンパク質もしくはその断片は、ＭＨＣと複合体化された抗原性ペプチドにプロセシングされ、それによってＴ細胞活性化においてシグナル１を媒介する。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３メディエータなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル３を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３エフェクターなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル３を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、ＨＬＡ非依存的な様式で、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３エフェクターなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル３を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、増強されたレベルで抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができ、上記Ｔ細胞活性化の増強は、ハプロタイプＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、またはＨＬＡ－Ｃ＊１６のうちの一つまたは複数による制限に依存するＴ細胞活性化を含む。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３メディエータなど）をさらに含む有核細胞は、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができ、上記ＣＤ８＋ Ｔ細胞の一つまたは複数の多機能性マーカーは、シグナル３を媒介する剤を含まない有核細胞による抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに増加している。一部の実施形態では、上記一つまたは複数の多機能性マーカーは、グランザイムＢ、ＩＦＮ－α、ＩＬ－２、ＰＤ－１、および／またはＩＦＮ－γを含む。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３メディエータなど）をさらに含む有核細胞は、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができ、上記ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖または生存は、シグナル３を媒介する剤を含まない有核細胞による抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに増加している。
一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）およびシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３エフェクターなど）をさらに含む有核細胞は、対応するシグナル２またはシグナル３を媒介する剤を含まない有核細胞と比較して、増強されたレベルで抗原特異的免疫応答を誘導することができる。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）およびシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３メディエータなど）をさらに含む有核細胞は、対応するシグナル２またはシグナル３を媒介する剤を含まない有核細胞と比較して、ＨＬＡ非依存的な様式で、増強されたレベルで抗原特異的免疫応答を誘導することができる。
一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質もしくはその断片、またはタンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、このタンパク質もしくはその断片は、ＭＨＣと複合体化された抗原性ペプチドにプロセシングされ、それによってＴ細胞活性化においてシグナル１を媒介する。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）およびシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３エフェクターなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル２またはシグナル３を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的免疫応答を誘導することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）およびシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３エフェクターなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル２またはシグナル３を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、ＨＬＡ非依存的な様式で、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的免疫応答を誘導することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）およびシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３エフェクターなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル２またはシグナル３を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、免疫応答を誘導することができ、上記増強された免疫応答は、ハプロタイプＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、またはＨＬＡ－Ｃ＊１６のうちの一つまたは複数による制限に依存する免疫応答を含む。
一部の実施形態では、上記有核細胞は、タンパク質もしくはその断片、またはタンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、このタンパク質もしくはその断片は、ＭＨＣと複合体化された抗原性ペプチドにプロセシングされ、それによってＴ細胞活性化においてシグナル１を媒介する。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）およびシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３メディエータなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル２またはシグナル３を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２エフェクターなど）およびシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３エフェクターなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル２またはシグナル３を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、ＨＬＡ非依存的な様式で、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができる。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）およびシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３メディエータなど）をさらに含む有核細胞は、シグナル２またはシグナル３を媒介する剤を含まない対応する有核細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍、またはそれ以上のいずれか一つに高いレベルで、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができ、上記Ｔ細胞活性化の増強は、ハプロタイプＨＬＡ－Ａ＊０２、ＨＬＡ－Ａ＊０１、ＨＬＡ－Ａ＊０３、ＨＬＡ－Ａ＊２４、ＨＬＡ－Ａ＊１１、ＨＬＡ－Ａ＊２６、ＨＬＡ－Ａ＊３２、ＨＬＡ－Ａ＊３１、ＨＬＡ－Ａ＊６８、ＨＬＡ－Ａ＊２９、ＨＬＡ－Ａ＊２３、ＨＬＡ－Ｂ＊０７、ＨＬＡ－Ｂ＊４４、ＨＬＡ－Ｂ＊０８、ＨＬＡ－Ｂ＊３５、ＨＬＡ－Ｂ＊１５、ＨＬＡ－Ｂ＊４０、ＨＬＡ－Ｂ＊２７、ＨＬＡ－Ｂ＊１８、ＨＬＡ－Ｂ＊５１、ＨＬＡ－Ｂ＊１４、ＨＬＡ－Ｂ＊１３、ＨＬＡ－Ｂ＊５７、ＨＬＡ－Ｂ＊３８、ＨＬＡ－Ｃ＊０７、ＨＬＡ－Ｃ＊０４、ＨＬＡ－Ｃ＊０３、ＨＬＡ－Ｃ＊０６、ＨＬＡ－Ｃ＊０５、ＨＬＡ－Ｃ＊１２、ＨＬＡ－Ｃ＊０２、ＨＬＡ－Ｃ＊０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０８、またはＨＬＡ－Ｃ＊１６のうちの一つまたは複数による制限に依存するＴ細胞活性化を含む。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）およびシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３メディエータなど）をさらに含む有核細胞は、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができ、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の一つまたは複数の多機能性マーカーは、シグナル２またはシグナル３を媒介する剤をさらに含まない有核細胞によって活性化される抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍またはそれ以上に増加する。一部の実施形態では、上記一つまたは複数の多機能性マーカーは、グランザイムＢ、ＩＦＮ－α、ＩＬ－２、ＰＤ－１、および／またはＩＦＮ－γを含む。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含み、シグナル２を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル２メディエータなど）およびシグナル３を媒介する一つまたは複数の剤（シグナル３メディエータなど）とをさらに含む有核細胞は、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性化を誘導することができ、上記ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増殖および／または生存は、シグナル２またはシグナル３を媒介する剤をさらに含まない有核細胞によって活性化される抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞と比較して、１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、もしくは５００倍またはそれ以上に増加する。
アジュバント
アジュバント
本明細書で使用される場合、「アジュバント」という用語は、免疫応答を直接的にまたは間接的にのどちらかで調節するおよび／または生じる物質を指すことができる。本発明の一部の実施形態では、アジュバントは、ＰＢＭＣの集団などの有核細胞の集団を馴化するために使用される（すなわち、上記細胞は、個体への投与前にアジュバントとインキュベートされる）。一部の実例では、上記アジュバントは、タンパク質またはその断片との併用で投与され、上記タンパク質またはその断片単独と比較して、上記タンパク質またはその断片に対する免疫応答の増強をもたらす。したがって、アジュバントは、タンパク質またはその断片に対する免疫細胞応答（例えば、Ｔ細胞応答）の惹起をブーストするために使用することができる。例示的なアジュバントとしては、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニスト、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）アゴニスト、ならびにＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、および／またはＴＬＲ９のアゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なアジュバントとしては、ＣｐＧ ＯＤＮ、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、イミキモド（Ｒ８３７）、レシキモド（Ｒ８４８）、またはリポ多糖（ＬＰＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮ、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、Ｒ８３７、Ｒ８４８、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである。特定の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮである。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮである。一部の実施形態では、上記ＣｐＧ ＯＤＮは、クラスＡ ＣｐＧ ＯＤＮ、クラスＢ ＣｐＧ ＯＤＮ、またはクラスＣ ＣｐＧ ＯＤＮである。一部の実施形態では、上記ＣｐＧ ＯＤＮアジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮ １０１８、ＣｐＧ ＯＤＮ １５８５、ＣｐＧ ＯＤＮ ２２１６、ＣｐＧ ＯＤＮ ２３３６、ＣｐＧ ＯＤＮ １６６８、ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６、ＣＰＧ ＯＤＮ ２００６、ＣｐＧ ＯＤＮ ２００７、ＣｐＧ ＯＤＮ ＢＷ００６、ＣｐＧ ＯＤＮ Ｄ－ＳＬ０１、ＣｐＧ ＯＤＮ ２３９５、ＣｐＧ ＯＤＮ Ｍ３６２、ＣｐＧ ＯＤＮ Ｄ－ＳＬ０３の群からの選択を含む。一部の実施形態では、上記ＣｐＧ ＯＤＮアジュバントは、ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６ （ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号３０））、またはＣｐＧ ＯＤＮ ２００６（ＣｐＧ ７９０９としても知られる）（ＴＣＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴＴＴＧＴＣＧＴＴ（配列番号３１））オリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、上記アジュバントは、ＣｐＧ ７９０９である。一部の実施形態では、上記ＲＩＧ－Ｉアゴニストは、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）を含む。複数のアジュバントを、上記抗原との併用で使用して、免疫応答の惹起を増強することもできる。一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣは、一つを超えるアジュバントを含む。複数のアジュバントを、上記抗原との併用で使用して、免疫応答の惹起を増強することもできる。一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣは、一つを超えるアジュバントを含む。一部の実施形態では、上記改変型ＰＢＭＣは、アジュバントであるＣｐＧ ＯＤＮ、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストの任意の組合せを含む。
タンパク質またはその断片を含む有核細胞の組成物の生成に使用される圧迫
タンパク質またはその断片を含む有核細胞の組成物の生成に使用される圧迫
一部の実施形態では、本発明は、免疫応答を刺激するためのタンパク質またはその断片を含む有核細胞の組成物を提供する。一部の実施形態では、上記有核細胞は、免疫細胞、例えば、複数のＰＢＭＣ、またはＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、もしくはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つもしくは複数である。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片は、有核細胞内に送達される。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片は、細胞膜に一過性の細孔が導入され、それにより上記タンパク質またはその断片が細胞に入ることができるように、上記細胞を狭窄部に通過させることによって、上記有核細胞に導入される。細胞への化合物の狭窄ベースの送達の例は、ＷＯ２０１３／０５９３４３、ＷＯ２０１５／０２３９８２、ＷＯ２０１６／０７０１３６、ＷＯ２０１７０４１０５０、ＷＯ２０１７００８０６３、ＷＯ２０１７／１９２７８５、ＷＯ２０１７／１９２７８６、ＷＯ２０１９／１７８００５、ＷＯ２０１９／１７８００６、ＷＯ２０２０／０７２８３３、ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／１５０９８、およびＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０２０１９４により示されている。
一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を、上記有核細胞（例えばＰＢＭＣ）を含む細胞懸濁液を狭窄部に通過させることによって上記有核細胞に送達して、本発明の有核細胞を作製するが、その際に、上記狭窄部が上記細胞を変形させ、それにより、タンパク質またはその断片が上記細胞に入るように上記細胞の摂動が引き起こされる。一部の実施形態では、上記狭窄部は、マイクロ流体チャネル内に含まれる。一部の実施形態では、複数の狭窄部を、マイクロ流体チャネル内で並列および／または直列に配置することができる。
一部の実施形態では、上記マイクロ流体チャネル内の上記狭窄部は、入口部分、中心点、および出口部分を含む。一部の実施形態では、上記マイクロ流体チャネル内の上記狭窄部の長さ、深さ、および幅は変わり得る。一部の実施形態では、上記マイクロ流体チャネル内の上記狭窄部の幅は、上記有核細胞の直径の関数である。有核細胞の直径を決定する方法は、当技術分野で公知であり、例えば、ハイコンテントイメージング、細胞カウンタ、またはフローサイトメトリーである。
有核細胞へのタンパク質またはその断片の狭窄ベースの送達の一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３μｍ～約１５μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３μｍ～約１０μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３μｍ～約６μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約４．２μｍ～約６μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約４．２μｍ～約４．８μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３μｍ～約５μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３μｍ～約３．５μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３．５μｍ～約４μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約４μｍ～約４．５μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３．２μｍ～約３．８μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３．８μｍ～約４．３μｍである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約２μｍ、２．５μｍ、３μｍ、３．５μｍ、４μｍ、４．５μｍ、５μｍ、５．５μｍ、６μｍ、６．５μｍ、７μｍ、７．５μｍ、８μｍ、８．５μｍ、９μｍ、９．５μｍ、１０μｍ、１０．５μｍ、１１μｍ、１１．５μｍ、１２μｍ、１２．５μｍ、１３μｍ、１３．５μｍ、１４μｍ、１４．５μｍ、または１５μｍのうちのいずれか一つまたはそれ未満である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約３．０μｍ、３．１μｍ、３．２μｍ、３．３μｍ、３．４μｍ、３．５μｍ、３．６μｍ、３．７μｍ、３．８μｍ、３．９μｍ、４．０μｍ、４．１μｍ、４．２μｍ、４．３μｍ、４．４μｍ、４．５μｍ、４．６μｍ、４．７μｍ、４．８μｍ、４．９μｍ、または５．０μｍ以下のうちのいずれか一つまたはそれ未満である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、約４．５μｍである。
本発明の一部の実施形態では、上記組成物は、有核細胞の集団内に複数の有核細胞（例えば、複数のＰＢＭＣ）を含む。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、有核細胞の集団内で最小の直径を有する有核細胞の亜集団の平均直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、有核細胞の集団内で最小の直径を有する有核細胞の亜集団の平均直径の約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約６０％、約４０％～約６０％、約３０％～約４５％、約５０％～約９９％、約５０％～約９０％、約５０％～約８０％、約５０％～約７０％、約６０％～約９０％、約６０％～約８０％、または約６０％～約７０％のうちのいずれか一つである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、有核細胞の集団内で最小の直径を有する有核細胞の亜集団の平均直径の約１０％～約２０％、約２０％～約３０％、約３０％～約４０％、約４０％～約５０％、約５０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約９０％、または約９０％～約９９％のうちのいずれか一つである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、有核細胞の集団内で最小の直径を有する有核細胞の亜集団の平均直径の約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のうちのいずれか一つである。一部の実施形態では、複数のインプットＰＢＭＣ内で最小の平均直径を有する有核細胞の上記亜集団は、リンパ球の集団であり、このリンパ球集団の直径は、約６μｍ～約１０μｍである。一部の実施形態では、上記リンパ球集団の平均直径は、約７μｍである。一部の実施形態では、上記リンパ球集団はＴ細胞集団である。一部の実施形態では、上記リンパ球はＴ細胞である。一部の実施形態では、上記複数のインプットＰＢＭＣ内で最小の平均直径を有する有核細胞の亜集団は、Ｔ細胞である。
本発明の一部の実施形態では、上記組成物は、有核細胞の集団内に複数の有核細胞（例えば、複数のＰＢＭＣ）を含む。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、有核細胞の集団内で最大の直径を有する有核細胞の亜集団の平均直径の約１０％～約９９％である。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、有核細胞の集団内で最大の直径を有する有核細胞の亜集団の平均直径の約１０％～約９０％、約１０％～約８０％、約１０％～約７０％、約２０％～約６０％、約４０％～約６０％、約３０％～約４５％、約１５％～約３０％、約１５％～約２０％、約２０％～約２５％、約２５％～約３０％、約２０％～約３０％、約３０％～約７０％、または約３０％～約６０％のうちのいずれか一つである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、有核細胞の集団内で最大の直径を有する有核細胞の亜集団の平均直径の約５％～約１０％、約１０％～約２０％、約２０％～約３０％、約３０％～約４０％、約４０％～約５０％、約５０％～約６０％、約６０％～約７０％、約７０％～約８０％、約８０％～約９０％、または約９０％～約９９％のうちのいずれか一つである。一部の実施形態では、上記狭窄部の幅は、有核細胞の集団内で最大の直径を有する有核細胞の亜集団の平均直径の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％のうちのいずれか一つである。一部の実施形態では、複数のインプットＰＢＭＣ内で最大の平均直径を有する有核細胞の亜集団は、単球の集団であり、この単球集団の直径は、約１５μｍ～約２５μｍである。一部の実施形態では、上記単球集団の平均直径は、約１８μｍである。一部の実施形態では、上記複数のインプットＰＢＭＣ内で最大の平均直径を有する有核細胞の亜集団は、単球である。
いくつかのパラメータは、本明細書に記載される方法によって免疫応答を刺激するための有核細胞への化合物の送達に影響を与え得る。一部の実施形態では、上記細胞懸濁液を、上記狭窄部を通過する前に、同時に、または後に、上記化合物と接触させる。上記有核細胞は、上記送達する化合物を含む溶液中に懸濁されて上記狭窄部を通過してもよいが、上記化合物は、上記有核細胞が狭窄部を通過した後に、上記細胞懸濁液に追加することができる。一部の実施形態では、送達される上記化合物は、上記狭窄部上にコーティングされる。
上記有核細胞内への上記化合物の送達に影響を与え得るパラメータの例としては、以下に限定されないが、狭窄部の寸法、狭窄部の入射角、狭窄部の表面特性 （例えば、粗さ、化学修飾、親水性、疎水性など）、動作流速 （例えば、狭窄部を通過する細胞の通過時間）、細胞濃度、細胞懸濁液中の化合物の濃度、細胞懸濁液中の緩衝液、および狭窄部を通過した後に有核細胞が回収またはインキュベートされる時間の長さが挙げられ、送達化合物の有核細胞内への通過に影響を与え得る。上記有核細胞への上記化合物の送達に影響を与える追加的なパラメータとしては、狭窄部での有核細胞の速度、狭窄部でのせん断速度、細胞懸濁液の粘度、流速に垂直な速度成分、および狭窄部での時間を挙げることができる。加えて、直列および／または並列のチャネルを含む複数のチップは、有核細胞への送達に影響を与え得る。並列の複数のチップは、スループットを増強するために有用であり得る。このようなパラメータは、上記化合物の送達を制御するように設計することができる。一部の実施形態では、上記細胞濃度は、約１０～少なくとも約１０１２細胞個／ｍＬの範囲、またはそれらの間の任意の濃度もしくは濃度範囲である。一部の実施形態では、送達化合物濃度は、約１０ｎｇ／ｍＬから約１ｇ／ｍＬの範囲、またはそれらの間の任意の濃度もしくは濃度範囲であり得る。一部の実施形態では、送達化合物濃度は、約１ｐＭから少なくとも約２Ｍの範囲、またはそれらの間の任意の濃度もしくは濃度範囲であり得る。
一部の実施形態では、上記有核細胞とインキュベートされるタンパク質またはその断片の濃度は、約０．０１μＭから約１０ｍＭの間である。例えば、一部の実施形態では、上記有核細胞とインキュベートされるタンパク質またはその断片の濃度は、約０．０１μＭ未満、約０．１μＭ未満、約１μＭ未満、約１０μＭ未満、約１００μＭ未満、約１ｍＭ未満、または約１０ｍＭ未満のうちのいずれかである。一部の実施形態では、上記有核細胞とインキュベートされるタンパク質またはその断片の濃度は、約１０ｍＭ超である。一部の実施形態では、上記有核細胞とインキュベートされるタンパク質またはその断片の濃度は、約０．０１μＭから約０．１μＭの間、約０．１μＭから約１μＭの間、約１μＭから約１０μＭの間、約１０μＭから約１００μＭの間、約１００μＭから約１ｍＭの間、または約１ｍＭから約１０ｍＭの間のうちのいずれかである。一部の実施形態では、上記有核細胞とインキュベートされるタンパク質またはその断片の濃度は、約０．１μＭから約１ｍＭの間である。一部の実施形態では、上記有核細胞とインキュベートされるタンパク質またはその断片の濃度は、約０．１μＭから約１０μＭの間である。一部の実施形態では、上記有核細胞とインキュベートされるタンパク質またはその断片の濃度は、１μＭである。
一部の実施形態では、上記有核細胞は、約１ｎＭから約１ｍＭの間の濃度で、上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、約０．１ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．０１μＭ未満、約０．１μＭ未満、約１μＭ未満、約１０μＭ未満、約１００μＭ未満、約１ｍＭ未満、または約１０ｍＭ未満のうちのいずれかの濃度で、上記タンパク質またはその断片をコードする核酸を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、約１０ｍＭ超の濃度で、上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、約０．１ｎＭから約１ｎＭ、約１ｎＭから約１０ｎＭ、約１０ｎＭから約１００ｎＭ、約０．１μＭから約１μＭ、約１μＭから約１０μＭ、約１０μＭから約１００μＭ、約１００μＭから約１ｍＭ、または１ｍＭから約１０ｍＭの間のうちのいずれかの濃度で、上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、約１０ｎＭから約１００ｎＭの間の濃度で、上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、約１ｎＭから約１０ｎＭの間の濃度で、上記タンパク質またはその断片をコードする上記核酸を含む。一部の実施形態では、上記有核細胞は、約５０ｎＭの濃度で、上記タンパク質またはその断片を含む。一部の実施形態では、上記核酸は、ｍＲＮＡである。
有核細胞の馴化
有核細胞の馴化
本明細書に記載の方法のいずれか一つによる一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞（例えばＰＢＭＣ）は、馴化されている。さらに別の実施形態では、上記有核細胞は成熟している。一部の実施形態では、上記有核細胞は、狭窄媒介性の送達に続いて馴化される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞は、狭窄により送達された上記タンパク質またはその断片を含む上記細胞が馴化されるのに十分な時間の間、アジュバントとインキュベートされ、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む馴化細胞の組成物を生成する。一部の実施形態では、上記有核細胞は、狭窄媒介性の送達に続いて馴化される。一部の実施形態では、狭窄により送達された上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞は、狭窄により送達された上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞が馴化されるのに十分な時間の間、アジュバントとインキュベートされ、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む馴化された有核細胞の組成物を生成する。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む馴化された有核細胞の組成物が提供され、この細胞は、ａ）細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの上記有核細胞の摂動を引き起こして、摂動有核細胞を形成するステップであって、上記狭窄部の幅が、上記懸濁液中の上記有核細胞の直径の関数である、上記通過させるステップ、ならびにｂ）上記摂動有核細胞を、上記タンパク質またはその断片とインキュベートして、上記タンパク質またはその断片が上記摂動有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を生成するステップ、ならびにｃ）狭窄により送達された上記タンパク質またはその断片を含む上記改変型有核細胞が馴化するのに十分な時間の間、狭窄により送達された上記タンパク質を含む上記改変型有核細胞を、アジュバントとインキュベートし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む馴化された有核細胞の組成物を生成するステップを含むプロセスによって調製される。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む馴化された有核細胞の組成物が提供され、この細胞は、ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成するステップであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させるステップ、ならびにｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡを含む有核細胞を生成するステップ、ならびにｃ）狭窄により送達された上記ｍＲＮＡを含む上記改変型有核細胞が馴化するのに十分な時間の間、狭窄により送達された上記ｍＲＮＡを含む上記改変型有核細胞を、アジュバントとインキュベートし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む馴化された有核細胞の組成物を生成するステップを含むプロセスによって調製される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存型の様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記プロセスは、上記改変型有核細胞を馴化するためのアジュバントとのインキュベーションの前に、上記タンパク質またはその断片を含む上記改変型有核細胞を細胞懸濁液から単離することをさらに含む。
一部の実施形態では、上記有核細胞（例えばＰＢＭＣ）は、狭窄媒介性の送達の前に馴化される。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞が馴化されるのに十分な時間の間、アジュバントとインキュベートされ、それによって、有核細胞が馴化される。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む馴化された有核細胞の組成物が提供され、この細胞は、ａ）有核細胞を馴化するのに十分な時間の間、上記有核細胞をアジュバントとインキュベートし、それによって、馴化された有核細胞を生成するステップ、ｂ）上記馴化された有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの上記有核細胞の摂動を引き起こして、馴化された摂動有核細胞を形成するステップであって、上記狭窄部の幅が、上記懸濁液中の上記有核細胞の直径の関数である、上記通過させるステップ、ならびにｃ）上記馴化された摂動有核細胞を、十分な時間の間、上記タンパク質またはその断片とインキュベートして、上記タンパク質またはその断片が上記馴化された摂動有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む上記馴化された有核細胞を生成するステップを含むプロセスによって調製される。一部の態様では、タンパク質またはその断片を含む馴化された有核細胞の組成物が提供され、この細胞は、ａ）有核細胞を馴化するのに十分な時間の間、上記有核細胞をアジュバントとインキュベートし、それによって、馴化された有核細胞を生成するステップ、ｂ）上記馴化された有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの上記有核細胞の摂動を引き起こして、馴化された摂動有核細胞を形成するステップであって、上記狭窄部の幅が、上記懸濁液中の上記有核細胞の直径の関数である、上記通過させるステップ、ならびにｃ）上記馴化された摂動有核細胞を、十分な時間の間、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡが上記馴化された摂動有核細胞に入ることを可能とし、上記ｍＲＮＡが発現して上記タンパク質またはその断片を産生し、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む上記馴化された有核細胞を生成するステップを含むプロセスによって調製される。一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片は、ＨＬＡ非依存型の様式で個体における免疫応答を刺激する。一部の実施形態では、上記プロセスは、上記馴化された有核細胞を細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記馴化された有核細胞を上記アジュバントから単離することをさらに含む。
本明細書に記載の方法のいずれか一つによる一部の実施形態では、上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞（例えばＰＢＭＣ）は、上記有核細胞を馴化するのに約１～約２４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約２時間～約１０時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約３時間～約６時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約１時間、２時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間のうちのいずれか一つの間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記有核細胞は、上記有核細胞を馴化するのに約４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。
一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む馴化された複数のＰＢＭＣが提供され、このＰＢＭＣは、上記ＰＢＭＣが馴化されるのに十分な時間の間、上記タンパク質またはその断片を含む上記複数のＰＢＭＣを、アジュバントとインキュベートし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む上記馴化された複数のＰＢＭＣを生成することにより調製される。一部の実施形態では、タンパク質またはその断片を含む馴化された複数のＰＢＭＣが提供され、このＰＢＭＣは、上記タンパク質またはその断片を上記ＰＢＭＣに導入する前に、ＰＢＭＣが馴化されるのに十分な時間の間、上記複数のＰＢＭＣをアジュバントとインキュベートし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む上記馴化された複数のＰＢＭＣを生成することにより調製される。
本明細書に記載される上記馴化された複数のＰＢＭＣのいずれかによる一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、上記ＰＢＭＣを馴化するのに約１～約２４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、上記ＰＢＭＣを馴化するのに約２～約１０時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、上記ＰＢＭＣを馴化するのに約３～約６時間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、上記ＰＢＭＣを馴化するのに約１時間、２時間、３時間、３．５時間、４時間、４．５時間、５時間、５．５時間、６時間、８時間、１２時間、１６時間、２０時間、または２４時間のうちのいずれか一つの間、上記アジュバントとインキュベートされる。一部の実施形態では、上記複数のＰＢＭＣは、上記ＰＢＭＣを馴化するのに約４時間、上記アジュバントとインキュベートされる。
本明細書に記載される上記馴化された複数のＰＢＭＣのいずれか一つによる一部の実施形態では、一つまたは複数の共刺激分子は、馴化されていない複数の改変型ＰＢＭＣと比較して、上記馴化された複数の改変型ＰＢＭＣでは上方制御される。一部の実施形態では、一つまたは複数の共刺激分子は、上記馴化された複数の改変型ＰＢＭＣにおける細胞の亜集団では、馴化されていない複数の改変型ＰＢＭＣ中の細胞の亜集団と比較して上方制御される。一部の実施形態では、一つまたは複数の共刺激分子は、上記馴化された複数の改変型ＰＢＭＣのＢ細胞では、馴化されていない複数の改変型ＰＢＭＣ中のＢ細胞と比較して上方制御される。一部の実施形態では、上記共刺激分子は、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６である。一部の実施形態では、上記共刺激分子は、ＣＤ８６である。一部の実施形態では、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６は、上記馴化された複数の改変型ＰＢＭＣのＢ細胞では、馴化されていない複数の改変型ＰＢＭＣ中のＢ細胞と比較して、約１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍を超えて、または１０倍を超えて上方制御される。一部の実施形態では、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６は、上記馴化された複数の改変型ＰＢＭＣのＢ細胞では、馴化されていない複数の改変型ＰＢＭＣ中のＢ細胞と比較して、約１．２倍～約１．５倍、約１．５倍～約１．８倍、約１．８倍～約２倍、約２倍～約３倍、約３倍～約４倍、約４倍～約５倍、約５倍～約８倍、約８倍～約１０倍、約１０倍～約２０倍、約２０倍～約５０倍、約５０倍～約１００倍、約１００倍～約２００倍、約２００倍～約５００倍、または約５００倍超のうちのいずれかで上方制御される。一部の実施形態では、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちのいずれか一つまたは複数の発現は、上記馴化された複数の改変型ＰＢＭＣでは、馴化されていない複数の改変型ＰＢＭＣと比較して増加する。一部の実施形態では、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現は、上記馴化された複数の改変型ＰＢＭＣでは、馴化されていない複数の改変型ＰＢＭＣ中の亜集団と比較して増加する。一部の実施形態では、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現は、馴化された複数の改変型ＰＢＭＣでは、馴化されていない複数の改変型ＰＢＭＣと比較して、約１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、または１０倍を超えて増加する。一部の実施形態では、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現は、馴化された複数の改変型ＰＢＭＣでは、馴化されていない複数の改変型ＰＢＭＣと比較して、約１．２倍～約１．５倍、約１．５倍～約１．８倍、約１．８倍～約２倍、約２倍～約３倍、約３倍～約４倍、約４倍～約５倍、約５倍～約８倍、約８倍～約１０倍、約１０倍～約２０倍、約２０倍～約５０倍、約５０倍～約１００倍、約１００倍～約２００倍、約２００倍～約５００倍、または約５００倍超のうちのいずれかに増加する。
システムおよびキット
システムおよびキット
一部の態様では、本発明は、本明細書に開示される方法で使用するための、上記狭窄部、免疫細胞懸濁液、タンパク質もしくはその断片、またはアジュバントのうちの一つまたは複数を含むシステムを提供する。上記システムは、上記で開示された方法について記載された任意の実施形態を含むことができ、そのようなものとしては、細胞変形狭窄部、細胞懸濁液、細胞摂動、送達パラメータ、化合物、および／またはアプリケーションなどを提供するためのマイクロ流体チャネルまたは細孔を有する表面が挙げられる。一部の実施形態では、上記細胞変形狭窄部は、免疫細胞への送達のためにサイズ設定される。一部の実施形態では、動作流速、細胞および化合物濃度、上記狭窄部内の細胞の速度、ならびに細胞懸濁液の組成（例えば、浸透圧、塩濃度、血清含有量、細胞濃度、ｐＨなど）などの送達パラメータは、免疫応答を抑制するかまたは寛容を誘導するための化合物の応答が最大になるように最適化される。
また、がんまたは感染症を有する個体の治療に際して使用するためのキットまたは物品も提供される。一部の実施形態では、上記キットは改変型免疫細胞を含み、この改変型免疫細胞は、細胞内にタンパク質またはその断片を含み、細胞内にアジュバントを含む。一部の実施形態では、上記キットは、がんまたは感染症を有する個体の治療に際して使用するための改変型免疫細胞の生成に使用するための、上記狭窄部、免疫細胞懸濁液、タンパク質またはその断片、またはアジュバントのうちの一つまたは複数を含む。一部の実施形態では、上記キットは、適したパッケージングに、本明細書に記載の組成物（例えば、細孔を含むマイクロ流体チャネルもしくは表面、細胞懸濁液、および／または化合物）を含む。適したパッケージング材料は当技術分野で公知であり、そのようなものとしては、例えば、バイアル（密閉バイアルなど）、容器、アンプル、ボトル、ジャー、柔軟なパッケージ（例えば、密閉マイラまたはビニールバッグ）などが挙げられる。これらの製造品はさらに、滅菌および／または密封されてもよい。
本発明はまた、本明細書に記載される方法の構成要素を含むキットを提供し、それを必要とする個体を治療する上記方法を実施するための指示、および／またはタンパク質もしくはその断片とアジュバントとを免疫細胞に導入するための指示を、さらに含んでいてもよい。本明細書に記載されるキットは、他の材料を含むことがあり、そのようなものとしては、他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、および本明細書に記載のいずれかの方法を実施するための指示を含む添付文書、例えば、それを必要とする個体を治療するための指示や、タンパク質もしくはその断片を細胞内にまたはアジュバントを細胞内に含有するように免疫細胞を改変するための指示を伴う添付文書が挙げられる。
例示的な実施形態
例示的な実施形態
実施形態１．
個体における免疫応答を刺激する方法であって、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞が、タンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
個体における免疫応答を刺激する方法であって、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞が、タンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
実施形態２．
それを必要とする個体にワクチン接種する方法であって、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞が、タンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
それを必要とする個体にワクチン接種する方法であって、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞が、タンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
実施形態３．
上記タンパク質またはその断片が、一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフをさらに含み、上記タンパク質と上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとの融合タンパク質を生成する、実施形態１または２に記載の方法。
上記タンパク質またはその断片が、一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフをさらに含み、上記タンパク質と上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとの融合タンパク質を生成する、実施形態１または２に記載の方法。
実施形態４．
個体における免疫応答を刺激する方法であって、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞が、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
個体における免疫応答を刺激する方法であって、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞が、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
実施形態５．
それを必要とする個体にワクチン接種する方法であって、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞が、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
それを必要とする個体にワクチン接種する方法であって、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞が、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
実施形態６．
上記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列が、上記有核細胞における発現のために最適化されたコドンである、実施形態４または５に記載の方法。
上記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列が、上記有核細胞における発現のために最適化されたコドンである、実施形態４または５に記載の方法。
実施形態７．
上記ｍＲＮＡが、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする一つまたは複数の核酸配列を含み、上記ｍＲＮＡの翻訳が、上記タンパク質と上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとの融合タンパク質を生成する、実施形態４～６のいずれか一つに記載の方法。
上記ｍＲＮＡが、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする一つまたは複数の核酸配列を含み、上記ｍＲＮＡの翻訳が、上記タンパク質と上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとの融合タンパク質を生成する、実施形態４～６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態８．
免疫プロテアソーム標的化モチーフの非存在下での上記細胞における上記タンパク質の分解および／または上記細胞の表面上の上記タンパク質由来のペプチドの提示と比較して、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、上記細胞における上記タンパク質の分解および／または上記細胞の表面上の上記タンパク質由来のペプチドの提示を増強する、実施形態３または６に記載の方法。
免疫プロテアソーム標的化モチーフの非存在下での上記細胞における上記タンパク質の分解および／または上記細胞の表面上の上記タンパク質由来のペプチドの提示と比較して、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、上記細胞における上記タンパク質の分解および／または上記細胞の表面上の上記タンパク質由来のペプチドの提示を増強する、実施形態３または６に記載の方法。
実施形態９．
上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、上記融合タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端にある、実施形態８に記載の方法。
上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、上記融合タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端にある、実施形態８に記載の方法。
実施形態１０．
上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、破壊ボックス（Ｄ－ボックス）ドメイン、ＫＥＫＥドメイン、および／またはｓｅｃ／ＭＩＴＤドメインである、実施形態７～９のいずれか一つに記載の方法。
上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、破壊ボックス（Ｄ－ボックス）ドメイン、ＫＥＫＥドメイン、および／またはｓｅｃ／ＭＩＴＤドメインである、実施形態７～９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１１．
上記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基が改変されている、実施形態４～１０のいずれか一つに記載の方法。
上記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基が改変されている、実施形態４～１０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１２．
上記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基が、ホスホロチオエート残基、シュードウリジン残基、Ｎ１－メチルアデノシン残基、５－メチルシチジン残基、またはモルホリノ残基である、実施形態１１に記載の方法。
上記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基が、ホスホロチオエート残基、シュードウリジン残基、Ｎ１－メチルアデノシン残基、５－メチルシチジン残基、またはモルホリノ残基である、実施形態１１に記載の方法。
実施形態１３．
個体における免疫応答を刺激する方法であって、有核細胞を含む組成物の有効量を個体に投与することを含み、上記有核細胞が、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含み、上記二つ以上の抗原が、個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
個体における免疫応答を刺激する方法であって、有核細胞を含む組成物の有効量を個体に投与することを含み、上記有核細胞が、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含み、上記二つ以上の抗原が、個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
実施形態１４．
それを必要とする個体にワクチン接種する方法であって、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞が、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含み、上記二つ以上の抗原が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
それを必要とする個体にワクチン接種する方法であって、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、上記有核細胞が、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含み、上記二つ以上の抗原が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
実施形態１５．
上記細胞が、上記タンパク質に由来する三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十またはそれ以上の抗原を含む、実施形態１３または１４に記載の方法。
上記細胞が、上記タンパク質に由来する三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十またはそれ以上の抗原を含む、実施形態１３または１４に記載の方法。
実施形態１６．
上記抗原のうちの少なくとも二つが、部分的に重複するアミノ酸配列を含む、実施形態１３～１５のいずれか一つに記載の方法。
上記抗原のうちの少なくとも二つが、部分的に重複するアミノ酸配列を含む、実施形態１３～１５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１７．
すべての上記抗原を組み合わせたアミノ酸配列が、上記タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上重複している、実施形態１６に記載の方法。
すべての上記抗原を組み合わせたアミノ酸配列が、上記タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上重複している、実施形態１６に記載の方法。
実施形態１８．
上記抗原が、上記タンパク質の二つ以上のエピトープを含むポリペプチドである、実施形態１３～１７のいずれか一つに記載の方法。
上記抗原が、上記タンパク質の二つ以上のエピトープを含むポリペプチドである、実施形態１３～１７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１９．
上記抗原が、上記タンパク質の一つまたは複数のエピトープと一つまたは複数の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである、実施形態１３～１８のいずれか一つに記載の方法。
上記抗原が、上記タンパク質の一つまたは複数のエピトープと一つまたは複数の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである、実施形態１３～１８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２０．
一つまたは複数のエピトープが、Ｎ末端および／またはＣ末端で一つまたは複数の異種ペプチド配列に隣接する、実施形態１３～１９のいずれか一つに記載の方法。
一つまたは複数のエピトープが、Ｎ末端および／またはＣ末端で一つまたは複数の異種ペプチド配列に隣接する、実施形態１３～１９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２１．
上記Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチド配列が、免疫原性合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）に由来する、実施形態２０に記載の方法。
上記Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチド配列が、免疫原性合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）に由来する、実施形態２０に記載の方法。
実施形態２２．
上記Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチドが、疾患関連免疫原性ＳＬＰに由来する、実施形態２１に記載の方法。
上記Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチドが、疾患関連免疫原性ＳＬＰに由来する、実施形態２１に記載の方法。
実施形態２３．
上記タンパク質が、がんに関連する変異タンパク質、癌遺伝子産物、ネオ抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である、実施形態１～２２のいずれか一つに記載の方法。
上記タンパク質が、がんに関連する変異タンパク質、癌遺伝子産物、ネオ抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である、実施形態１～２２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２４．
個体における免疫応答の刺激が、がん、感染症、またはウイルス関連疾患の治療に使用される、実施形態１、３、４、６～１３、１５～２３のいずれか一つに記載の方法。
個体における免疫応答の刺激が、がん、感染症、またはウイルス関連疾患の治療に使用される、実施形態１、３、４、６～１３、１５～２３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２５．
上記ウイルス関連疾患が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に関連する疾患である、実施形態２４に記載の方法。
上記ウイルス関連疾患が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に関連する疾患である、実施形態２４に記載の方法。
実施形態２６．
上記タンパク質が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である、実施形態１～２４のいずれか一つに記載の方法。
上記タンパク質が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である、実施形態１～２４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２７．
上記ＨＰＶが、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である、実施形態２６に記載の方法。
上記ＨＰＶが、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である、実施形態２６に記載の方法。
実施形態２８．
上記タンパク質が、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である、実施形態２６または２７に記載の方法。
上記タンパク質が、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である、実施形態２６または２７に記載の方法。
実施形態２９．
上記タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である、実施形態１～２４のいずれか一つに記載の方法。
上記タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である、実施形態１～２４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３０．
上記ＨＢＶタンパク質が、コアタンパク質、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、ｅ抗原、Ｘ抗原、またはポリメラーゼタンパク質である、実施形態２９に記載の方法。
上記ＨＢＶタンパク質が、コアタンパク質、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、ｅ抗原、Ｘ抗原、またはポリメラーゼタンパク質である、実施形態２９に記載の方法。
実施形態３１．
上記組成物が、アジュバントをさらに含む、実施形態１～３０のいずれか一つに記載の方法。
上記組成物が、アジュバントをさらに含む、実施形態１～３０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３２．
上記組成物が、アジュバントと併せて投与される、実施形態１～３１のいずれか一つに記載の方法。
上記組成物が、アジュバントと併せて投与される、実施形態１～３１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３３．
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態３１または３２に記載の方法。
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態３１または３２に記載の方法。
実施形態３４．
上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞が、
上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞が、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット有核細胞を上記タンパク質またはその断片とインキュベートして、上記タンパク質またはその断片が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を生成することにより調製される、実施形態１～３および２３～３３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３５．
上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡを含む有核細胞が、
上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡを含む有核細胞が、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡを含む有核細胞を生成することにより調製される、実施形態４～１１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３６．
二つ以上の抗原を含む上記有核細胞が、
二つ以上の抗原を含む上記有核細胞が、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記二つ以上の抗原が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット有核細胞を二つ以上の抗原とインキュベートして、上記二つ以上の抗原が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、二つ以上の抗原を含む有核細胞を生成することにより調製される、実施形態１２～３３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３７．
（ａ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、上記有核細胞を上記タンパク質またはその断片と共にインキュベートすること、
（ｂ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡと共に上記有核細胞をインキュベートすること、または
（ｃ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、上記有核細胞を上記二つ以上の抗原と共にインキュベートすること、を含む、実施形態３４～３６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３８．
（ａ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記有核細胞を上記タンパク質またはその断片と共にインキュベートすること、
（ｂ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡと共に上記有核細胞をインキュベートすること、または
（ｃ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記有核細胞を上記二つ以上の抗原と共にインキュベートすること、を含む、実施形態３４～３６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態３９．
上記狭窄部の幅が、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、実施形態３４～３８のいずれか一つに記載の方法。
上記狭窄部の幅が、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、実施形態３４～３８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４０．
上記狭窄部の幅が、約３．０μｍ～約４．２μｍ、または約３．０μｍ～約４．８μｍ、または約３．０μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、実施形態３４～３９のいずれか一つに記載の方法。
上記狭窄部の幅が、約３．０μｍ～約４．２μｍ、または約３．０μｍ～約４．８μｍ、または約３．０μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、実施形態３４～３９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４１．
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、実施形態３４～４０のいずれか一つに記載の方法。
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、実施形態３４～４０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４２．
上記狭窄部の幅が、約４．５μｍまたは約４．０μｍである、実施形態３４～４１のいずれか一つに記載の方法。
上記狭窄部の幅が、約４．５μｍまたは約４．０μｍである、実施形態３４～４１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４３．
上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置されている、実施形態３４～４２のいずれか一つに記載の方法。
上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置されている、実施形態３４～４２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４４．
上記有核細胞が、上記個体に対して自己または同種である、実施形態１～４３のいずれか一つに記載の方法。
上記有核細胞が、上記個体に対して自己または同種である、実施形態１～４３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４５．
上記有核細胞が免疫細胞である、実施形態１～４４のいずれか一つに記載の方法。
上記有核細胞が免疫細胞である、実施形態１～４４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４６．
上記有核細胞が、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、実施形態１～４５のいずれか一つに記載の方法。
上記有核細胞が、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、実施形態１～４５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４７．
上記複数のＰＢＭＣが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む、実施形態４６に記載の方法。
上記複数のＰＢＭＣが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む、実施形態４６に記載の方法。
実施形態４８．
上記有核細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である、実施形態１～４７のいずれか一つに記載の方法。
上記有核細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である、実施形態１～４７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態４９．
上記有核細胞が、アジュバントにより馴化されて、馴化細胞を形成する、実施形態１～４８のいずれか一つに記載の方法。
上記有核細胞が、アジュバントにより馴化されて、馴化細胞を形成する、実施形態１～４８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５０．
上記有核細胞が、上記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、アジュバントとインキュベートされる、実施形態４９に記載の方法。
上記有核細胞が、上記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、アジュバントとインキュベートされる、実施形態４９に記載の方法。
実施形態５１．
上記有核細胞が、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを上記有核細胞に導入する前または後に馴化される、実施形態４９または５０に記載の方法。
上記有核細胞が、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを上記有核細胞に導入する前または後に馴化される、実施形態４９または５０に記載の方法。
実施形態５２．
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態４９～５１のいずれか一つに記載の方法。
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態４９～５１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５３．
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、実施形態４８～５１のいずれか一つに記載の方法。
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、実施形態４８～５１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５４．
上記アジュバントが、ＣｐＧ ７９０９である、実施形態４９～５３のいずれか一つに記載の方法。
上記アジュバントが、ＣｐＧ ７９０９である、実施形態４９～５３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５５．
上記馴化細胞が、馴化された複数のＰＢＭＣである、実施形態４９～５４のいずれか一つに記載の方法。
上記馴化細胞が、馴化された複数のＰＢＭＣである、実施形態４９～５４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態５６．
上記複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するように改変されている、実施形態５５に記載の方法。
上記複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するように改変されている、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７．
上記共刺激分子が、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２である、実施形態５６に記載の方法。
上記共刺激分子が、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２である、実施形態５６に記載の方法。
実施形態５８．
上記共刺激分子がＣＤ８６である、実施形態５６に記載の方法。
上記共刺激分子がＣＤ８６である、実施形態５６に記載の方法。
実施形態５９．
上記複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数のサイトカインの発現が増加するように改変されている、実施形態５５～５８のいずれか一つに記載の方法。
上記複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数のサイトカインの発現が増加するように改変されている、実施形態５５～５８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６０．
上記複数のＰＢＭＣが、キメラ膜結合型サイトカインを含むように改変されている、実施形態５５～５９のいずれか一つに記載の方法。
上記複数のＰＢＭＣが、キメラ膜結合型サイトカインを含むように改変されている、実施形態５５～５９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６１．
上記キメラ膜結合型サイトカインが、上記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である、実施形態６０に記載の方法。
上記キメラ膜結合型サイトカインが、上記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である、実施形態６０に記載の方法。
実施形態６２．
上記サイトカインが、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合されている、実施形態６１に記載の方法。
上記サイトカインが、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合されている、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６３．
上記ペプチドリンカーが、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である、実施形態６２に記載の方法。
上記ペプチドリンカーが、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である、実施形態６２に記載の方法。
実施形態６４．
上記サイトカインが、Ｉ型サイトカインである、実施形態５９～６３のいずれか一つに記載の方法。
上記サイトカインが、Ｉ型サイトカインである、実施形態５９～６３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６５．
上記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである、実施形態５９～６４のいずれか一つに記載の方法。
上記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである、実施形態５９～６４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６６．
上記サイトカインが、ＩＬ－２もしくはその機能的バリアント、および／またはＩＬ－１２もしくはその機能的バリアントである、実施形態６５に記載の方法。
上記サイトカインが、ＩＬ－２もしくはその機能的バリアント、および／またはＩＬ－１２もしくはその機能的バリアントである、実施形態６５に記載の方法。
実施形態６７．
上記キメラ膜結合型サイトカインが、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む、実施形態６０～６５のいずれか一つに記載の方法。
上記キメラ膜結合型サイトカインが、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む、実施形態６０～６５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６８．
上記複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数のサイトカインおよび／または一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するように改変されている、実施形態５６～６７のいずれか一つに記載の方法。
上記複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数のサイトカインおよび／または一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するように改変されている、実施形態５６～６７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態６９．
上記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、上記複数のＰＢＭＣが、
上記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、上記複数のＰＢＭＣが、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片と、一つまたは複数のサイトカインをコードする一つまたは複数のｍＲＮＡと、一つまたは複数の共刺激分子をコードする一つまたは複数のｍＲＮＡとが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片とインキュベートして、上記タンパク質もしくはその断片、一つもしくは複数のサイトカインをコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、上記ｍＲＮＡが発現し、それによって、上記タンパク質もしくはその断片、上記一つもしくは複数のサイトカイン、および／または上記一つもしくは複数の共刺激分子を含む有核細胞を生成することを含むプロセスによって調製される、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７０．
上記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、上記複数のＰＢＭＣが、
上記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、上記複数のＰＢＭＣが、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡと、一つまたは複数のサイトカインをコードする一つまたは複数のｍＲＮＡと、一つまたは複数の共刺激分子をコードする一つまたは複数のｍＲＮＡとが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質もしくはその断片をコードする上記ｍＲＮＡ、一つもしくは複数のサイトカインをコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、上記ｍＲＮＡが発現し、それによって、上記タンパク質もしくはその断片、上記一つもしくは複数のサイトカイン、および／または上記一つもしくは複数の共刺激分子を含む有核細胞を生成することを含むプロセスによって調製される、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７１．
上記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、上記複数のＰＢＭＣが、
上記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、上記複数のＰＢＭＣが、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記二つ以上の抗原と、一つまたは複数のサイトカインをコードする一つまたは複数のｍＲＮＡと、一つまたは複数の共刺激分子をコードする一つまたは複数のｍＲＮＡとが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記二つ以上の抗原、一つもしくは複数のサイトカインをコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートして、上記二つ以上の抗原、一つもしくは複数のサイトカインをコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、上記ｍＲＮＡが発現し、それによって、二つ以上の抗原、上記一つもしくは複数のサイトカイン、および／または上記一つもしくは複数の共刺激分子を含む有核細胞を生成することを含むプロセスによって調製される、実施形態６８に記載の方法。
実施形態７２．
（ａ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記有核細胞を上記タンパク質もしくはその断片、一つもしくは複数のサイトカインをコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすること、
（ｂ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記有核細胞を上記タンパク質もしくはその断片をコードする上記ｍＲＮＡ、一つもしくは複数のサイトカインをコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすること、または
（ｃ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記有核細胞を上記二つ以上の抗原、一つもしくは複数のサイトカインをコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすることを含む、実施形態６９～７１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７３．
（ａ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記有核細胞を上記タンパク質もしくはその断片、一つもしくは複数のサイトカインをコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすること、
（ｂ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記有核細胞を上記タンパク質もしくはその断片をコードする上記ｍＲＮＡ、一つもしくは複数のサイトカインをコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすること、または
（ｃ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記有核細胞を上記二つ以上の抗原、一つもしくは複数のサイトカインをコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすることを含む、実施形態６９～７１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７４．
一つまたは複数の共刺激分子が、上記馴化されていない複数のＰＢＭＣ中のＢ細胞と比較して、馴化された複数のＰＢＭＣのＢ細胞では上方制御されており、上記共刺激分子が、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６である、実施形態５５～７３のいずれか一つに記載の方法。
一つまたは複数の共刺激分子が、上記馴化されていない複数のＰＢＭＣ中のＢ細胞と比較して、馴化された複数のＰＢＭＣのＢ細胞では上方制御されており、上記共刺激分子が、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６である、実施形態５５～７３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７５．
上記複数のＰＢＭＣが、複数の馴化されていないＰＢＭＣと比較して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が増加している、実施形態５５～７４のいずれか一つに記載の方法。
上記複数のＰＢＭＣが、複数の馴化されていないＰＢＭＣと比較して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が増加している、実施形態５５～７４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７６．
ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が、上記複数の馴化されていないＰＢＭＣと比較して、約１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、または１０倍を超えて増加している、実施形態７５に記載の方法。
ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が、上記複数の馴化されていないＰＢＭＣと比較して、約１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、または１０倍を超えて増加している、実施形態７５に記載の方法。
実施形態７７．
有核細胞を含む上記組成物が、複数回投与される、実施形態１～７６のいずれか一つに記載の方法。
有核細胞を含む上記組成物が、複数回投与される、実施形態１～７６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７８．
上記組成物が、静脈内に投与される、実施形態１～７７のいずれか一つに記載の方法。
上記組成物が、静脈内に投与される、実施形態１～７７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態７９．
上記個体がヒトである、実施形態１～７８のいずれか一つに記載の方法。
上記個体がヒトである、実施形態１～７８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態８０．
上記組成物が、別の療法の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与される、実施形態１～７９のいずれか一つに記載の方法。
上記組成物が、別の療法の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与される、実施形態１～７９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態８１．
別の療法が、免疫腫瘍療法で使用される化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、または二重特異性ポリペプチドである、実施形態８０に記載の方法。
別の療法が、免疫腫瘍療法で使用される化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、または二重特異性ポリペプチドである、実施形態８０に記載の方法。
実施形態８２．
有核細胞を含む組成物であって、上記有核細胞が、タンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、組成物。
有核細胞を含む組成物であって、上記有核細胞が、タンパク質またはその断片を含み、上記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、組成物。
実施形態８３．
上記タンパク質またはその断片が、一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフをさらに含み、上記タンパク質と上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとの融合タンパク質を生成する、実施形態８２に記載の組成物。
上記タンパク質またはその断片が、一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフをさらに含み、上記タンパク質と上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとの融合タンパク質を生成する、実施形態８２に記載の組成物。
実施形態８４．
有核細胞を含む組成物であって、上記有核細胞が、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、組成物。
有核細胞を含む組成物であって、上記有核細胞が、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、上記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、組成物。
実施形態８５．
上記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列が、上記有核細胞における発現のために最適化されたコドンである、実施形態８４に記載の組成物。
上記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列が、上記有核細胞における発現のために最適化されたコドンである、実施形態８４に記載の組成物。
実施形態８６．
上記ｍＲＮＡが、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする一つまたは複数の核酸配列を含み、上記ｍＲＮＡの翻訳が、上記タンパク質と上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとの融合タンパク質を生成する、実施形態８４または８５に記載の組成物。
上記ｍＲＮＡが、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする一つまたは複数の核酸配列を含み、上記ｍＲＮＡの翻訳が、上記タンパク質と上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとの融合タンパク質を生成する、実施形態８４または８５に記載の組成物。
実施形態８７．
免疫プロテアソーム標的化モチーフの非存在下での上記細胞における上記タンパク質の分解および／または上記細胞の表面上の上記タンパク質由来のペプチドの提示と比較して、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、上記細胞における上記タンパク質の分解および／または上記細胞の表面上の上記タンパク質由来のペプチドの提示を増強する、実施形態８３または８６に記載の組成物。
免疫プロテアソーム標的化モチーフの非存在下での上記細胞における上記タンパク質の分解および／または上記細胞の表面上の上記タンパク質由来のペプチドの提示と比較して、上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、上記細胞における上記タンパク質の分解および／または上記細胞の表面上の上記タンパク質由来のペプチドの提示を増強する、実施形態８３または８６に記載の組成物。
実施形態８８．
上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、上記融合タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端にある、実施形態８７に記載の組成物。
上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、上記融合タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端にある、実施形態８７に記載の組成物。
実施形態８９．
上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、破壊ボックス（Ｄ－ボックス）ドメイン、ＫＥＫＥドメイン、および／またはｓｅｃ／ＭＩＴＤドメインである、実施形態８６～８８のいずれか一つに記載の組成物。
上記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、破壊ボックス（Ｄ－ボックス）ドメイン、ＫＥＫＥドメイン、および／またはｓｅｃ／ＭＩＴＤドメインである、実施形態８６～８８のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態９０．
上記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基が改変されている、実施形態８４～８９のいずれか一つに記載の組成物。
上記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基が改変されている、実施形態８４～８９のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態９１．
上記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基が、ホスホロチオエート残基、シュードウリジン残基、Ｎ１－メチルアデノシン残基、５－メチルシチジン残基、またはモルホリノ残基である、実施形態９０に記載の組成物。
上記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基が、ホスホロチオエート残基、シュードウリジン残基、Ｎ１－メチルアデノシン残基、５－メチルシチジン残基、またはモルホリノ残基である、実施形態９０に記載の組成物。
実施形態９２．
有核細胞を含む組成物であって、上記有核細胞が、二つ以上の抗原を含み、上記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、組成物。
有核細胞を含む組成物であって、上記有核細胞が、二つ以上の抗原を含み、上記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、組成物。
実施形態９３．
上記細胞が、上記タンパク質に由来する三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十またはそれ以上の抗原を含む、実施形態９２に記載の組成物。
上記細胞が、上記タンパク質に由来する三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十またはそれ以上の抗原を含む、実施形態９２に記載の組成物。
実施形態９４．
上記抗原のうちの少なくとも二つが、部分的に重複するアミノ酸配列を含む、実施形態９２または９３に記載の組成物。
上記抗原のうちの少なくとも二つが、部分的に重複するアミノ酸配列を含む、実施形態９２または９３に記載の組成物。
実施形態９５．
すべての上記抗原を組み合わせたアミノ酸配列が、上記タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上重複している、実施形態９４に記載の組成物。
すべての上記抗原を組み合わせたアミノ酸配列が、上記タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上重複している、実施形態９４に記載の組成物。
実施形態９６．
抗原が、上記タンパク質の二つ以上のエピトープを含むポリペプチドである、実施形態９２～９５のいずれか一つに記載の組成物。
抗原が、上記タンパク質の二つ以上のエピトープを含むポリペプチドである、実施形態９２～９５のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態９７．
抗原が、上記タンパク質の一つまたは複数のエピトープと一つまたは複数の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである、実施形態９２～９６のいずれか一つに記載の組成物。
抗原が、上記タンパク質の一つまたは複数のエピトープと一つまたは複数の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである、実施形態９２～９６のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態９８．
一つまたは複数のエピトープが、Ｎ末端および／またはＣ末端で一つまたは複数の異種ペプチド配列に隣接する、実施形態９２～９７のいずれか一つに記載の組成物。
一つまたは複数のエピトープが、Ｎ末端および／またはＣ末端で一つまたは複数の異種ペプチド配列に隣接する、実施形態９２～９７のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態９９．
上記Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチド配列が、免疫原性合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）に由来する、実施形態９８に記載の組成物。
上記Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチド配列が、免疫原性合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）に由来する、実施形態９８に記載の組成物。
実施形態１００．
上記Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチドが、疾患関連免疫原性ＳＬＰに由来する、実施形態９９に記載の組成物。
上記Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチドが、疾患関連免疫原性ＳＬＰに由来する、実施形態９９に記載の組成物。
実施形態１０１．
上記タンパク質が、がんに関連する変異タンパク質、癌遺伝子産物、ネオ抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である、実施形態８２～１００のいずれか一つに記載の組成物。
上記タンパク質が、がんに関連する変異タンパク質、癌遺伝子産物、ネオ抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である、実施形態８２～１００のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１０２．
個体における免疫応答の刺激が、がん、感染症、またはウイルス関連疾患の治療に使用される、実施形態８２～１０１のいずれか一つに記載の組成物。
個体における免疫応答の刺激が、がん、感染症、またはウイルス関連疾患の治療に使用される、実施形態８２～１０１のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１０３．
上記ウイルス関連疾患が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に関連する疾患である、実施形態１０２に記載の組成物。
上記ウイルス関連疾患が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に関連する疾患である、実施形態１０２に記載の組成物。
実施形態１０４．
タンパク質が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である、実施形態８２～１０３のいずれか一つに記載の組成物。
タンパク質が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である、実施形態８２～１０３のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１０５．
上記ＨＰＶが、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である、実施形態１０４に記載の組成物。
上記ＨＰＶが、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である、実施形態１０４に記載の組成物。
実施形態１０６．
上記タンパク質が、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である、実施形態１０４または１０５に記載の組成物。
上記タンパク質が、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である、実施形態１０４または１０５に記載の組成物。
実施形態１０７．
上記タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である、実施形態８２～１０３のいずれか一つに記載の組成物。
上記タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である、実施形態８２～１０３のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１０８．
上記ＨＢＶタンパク質が、コアタンパク質、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、ｅ抗原、Ｘ抗原、またはポリメラーゼタンパク質である、実施形態１０７に記載の組成物。
上記ＨＢＶタンパク質が、コアタンパク質、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、ｅ抗原、Ｘ抗原、またはポリメラーゼタンパク質である、実施形態１０７に記載の組成物。
実施形態１０９．
上記組成物が、アジュバントをさらに含む、実施形態８２～１０８のいずれか一つに記載の方法。
上記組成物が、アジュバントをさらに含む、実施形態８２～１０８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１１０．
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態１０９に記載の組成物。
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態１０９に記載の組成物。
実施形態１１１．
上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞が、
上記タンパク質またはその断片を含む上記有核細胞が、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット有核細胞を上記タンパク質またはその断片とインキュベートして、上記タンパク質またはその断片が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を生成することにより調製される、実施形態８２および１０１～１１０のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１１２．
上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む有核細胞が、
上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む有核細胞が、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡを含む有核細胞を生成することにより調製される、実施形態８４～９１および１０１～１１０のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１１３．
二つ以上の抗原を含む上記有核細胞が、
二つ以上の抗原を含む上記有核細胞が、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記二つ以上の抗原が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット有核細胞を上記二つ以上の抗原とインキュベートして、上記二つ以上の抗原が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、二つ以上の抗原を含む有核細胞を生成することにより調製される、実施形態９２～１１０のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１１４．
上記有核細胞を調製するプロセスが、
上記有核細胞を調製するプロセスが、
（ａ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、上記有核細胞を上記タンパク質またはその断片と共にインキュベートすること、
（ｂ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡと共に上記有核細胞をインキュベートすること、または
（ｃ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、上記有核細胞を上記二つ以上の抗原と共にインキュベートすること、を含む、実施形態１１１～１１３のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１１５．
上記有核細胞を調製するプロセスが、
上記有核細胞を調製するプロセスが、
（ａ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記有核細胞を上記タンパク質またはその断片と共にインキュベートすること、
（ｂ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡと共に上記有核細胞をインキュベートすること、または
（ｃ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記有核細胞を上記二つ以上の抗原と共にインキュベートすること、を含む、実施形態１１１～１１３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１１６．
上記狭窄部の幅が、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、実施形態１１１～１１５のいずれか一つに記載の組成物。
上記狭窄部の幅が、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、実施形態１１１～１１５のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１１７．
上記狭窄部の幅が、約３．０μｍ～約４．２μｍ、または約３．０μｍ～約４．８μｍ、または約３．０μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、実施形態１１１～１１６のいずれか一つに記載の組成物。
上記狭窄部の幅が、約３．０μｍ～約４．２μｍ、または約３．０μｍ～約４．８μｍ、または約３．０μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、実施形態１１１～１１６のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１１８．
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、実施形態１１１～１１７のいずれか一つに記載の組成物。
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、実施形態１１１～１１７のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１１９．
上記狭窄部の幅が、約４．５μｍまたは約４．０μｍである、実施形態１１１～１１８のいずれか一つに記載の組成物。
上記狭窄部の幅が、約４．５μｍまたは約４．０μｍである、実施形態１１１～１１８のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１２０．
上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置されている、実施形態１１１～１１９のいずれか一つに記載の組成物。
上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置されている、実施形態１１１～１１９のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１２１．
上記有核細胞が、上記個体に対して自己または同種である、実施形態８２～１２０のいずれか一つに記載の組成物。
上記有核細胞が、上記個体に対して自己または同種である、実施形態８２～１２０のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１２２．
上記有核細胞が免疫細胞である、実施形態８２～１２１のいずれか一つに記載の組成物。
上記有核細胞が免疫細胞である、実施形態８２～１２１のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１２３．
上記有核細胞が、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、実施形態８２～１２２のいずれか一つに記載の組成物。
上記有核細胞が、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、実施形態８２～１２２のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１２４．
上記複数のＰＢＭＣが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む、実施形態１２３に記載の組成物。
上記複数のＰＢＭＣが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む、実施形態１２３に記載の組成物。
実施形態１２５．
上記有核細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である、実施形態８２～１２４のいずれか一つに記載の組成物。
上記有核細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である、実施形態８２～１２４のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１２６．
上記有核細胞が、アジュバントにより馴化されて、馴化細胞を形成する、実施形態８２～１２５のいずれか一つに記載の組成物。
上記有核細胞が、アジュバントにより馴化されて、馴化細胞を形成する、実施形態８２～１２５のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１２７．
上記有核細胞が、上記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、アジュバントとインキュベートされる、実施形態１２６に記載の組成物。
上記有核細胞が、上記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、アジュバントとインキュベートされる、実施形態１２６に記載の組成物。
実施形態１２８．
上記有核細胞が、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを上記有核細胞に導入する前または後に馴化される、実施形態１２６または１２７に記載の組成物。
上記有核細胞が、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを上記有核細胞に導入する前または後に馴化される、実施形態１２６または１２７に記載の組成物。
実施形態１２９．
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態１２６～１２８のいずれか一つに記載の組成物。
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態１２６～１２８のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１３０．
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、実施形態１２６～１２９のいずれか一つに記載の組成物。
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、実施形態１２６～１２９のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１３１．
上記アジュバントが、ＣｐＧ ７９０９である、実施形態１２６～１３０のいずれか一つに記載の組成物。
上記アジュバントが、ＣｐＧ ７９０９である、実施形態１２６～１３０のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１３２．
上記馴化細胞が、馴化された複数のＰＢＭＣである、実施形態１２６～１３１のいずれか一つに記載の組成物。
上記馴化細胞が、馴化された複数のＰＢＭＣである、実施形態１２６～１３１のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１３３．
上記複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するように改変されている、実施形態１３２に記載の組成物。
上記複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するように改変されている、実施形態１３２に記載の組成物。
実施形態１３４．
上記共刺激分子が、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２である、実施形態１３３に記載の組成物。
上記共刺激分子が、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２である、実施形態１３３に記載の組成物。
実施形態１３５．
上記共刺激分子がＣＤ８６である、実施形態１３４に記載の組成物。
上記共刺激分子がＣＤ８６である、実施形態１３４に記載の組成物。
実施形態１３６．
複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数のサイトカインの発現が増加するように修飾される、実施形態１３２～１３５のいずれか一つに記載の組成物。
複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数のサイトカインの発現が増加するように修飾される、実施形態１３２～１３５のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１３７．
上記複数のＰＢＭＣが、キメラ膜結合型サイトカインを含むように改変されている、実施形態１３２～１３６のいずれか一つに記載の組成物。
上記複数のＰＢＭＣが、キメラ膜結合型サイトカインを含むように改変されている、実施形態１３２～１３６のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１３８．
上記キメラ膜結合型サイトカインが、上記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である、実施形態１３７に記載の組成物。
上記キメラ膜結合型サイトカインが、上記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である、実施形態１３７に記載の組成物。
実施形態１３９．
上記サイトカインが、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合されている、実施形態１３８に記載の組成物。
上記サイトカインが、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合されている、実施形態１３８に記載の組成物。
実施形態１４０．
上記ペプチドリンカーが、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である、実施形態１３９に記載の組成物。
上記ペプチドリンカーが、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である、実施形態１３９に記載の組成物。
実施形態１４１．
上記サイトカインが、Ｉ型サイトカインである、実施形態１３６～１４０のいずれか一つに記載の組成物。
上記サイトカインが、Ｉ型サイトカインである、実施形態１３６～１４０のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１４２．
上記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである、実施形態１３６～１４１のいずれか一つに記載の組成物。
上記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである、実施形態１３６～１４１のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１４３．
上記サイトカインが、ＩＬ－２もしくはその機能的バリアント、および／またはＩＬ－１２もしくはその機能的バリアントである、実施形態１４２に記載の方法。
上記サイトカインが、ＩＬ－２もしくはその機能的バリアント、および／またはＩＬ－１２もしくはその機能的バリアントである、実施形態１４２に記載の方法。
実施形態１４４．
上記キメラ膜結合型サイトカインが、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む、実施形態１３７～１４３のいずれか一項に記載の組成物。
上記キメラ膜結合型サイトカインが、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む、実施形態１３７～１４３のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態１４５．
上記複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数のサイトカインおよび／または一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するように改変されている、実施形態１３３～１４４のいずれか一つに記載の組成物。
上記複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数のサイトカインおよび／または一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するように改変されている、実施形態１３３～１４４のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１４６．
上記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、上記複数のＰＢＭＣが、
上記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、上記複数のＰＢＭＣが、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片と、一つまたは複数のサイトカインをコードする一つまたは複数のｍＲＮＡと、一つまたは複数の共刺激分子をコードする一つまたは複数のｍＲＮＡとが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片とインキュベートして、上記タンパク質もしくはその断片、一つもしくは複数のサイトカインをコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、上記ｍＲＮＡが発現し、それによって、上記タンパク質もしくはその断片、上記一つもしくは複数のサイトカイン、および／または上記一つもしくは複数の共刺激分子を含む有核細胞を生成することを含むプロセスによって調製される、実施形態１４５に記載の組成物。
実施形態１４７．
上記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、上記複数のＰＢＭＣが、
上記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、上記複数のＰＢＭＣが、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡと、一つまたは複数のサイトカインをコードする一つまたは複数のｍＲＮＡと、一つまたは複数の共刺激分子をコードする一つまたは複数のｍＲＮＡとが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質もしくはその断片をコードする上記ｍＲＮＡ、一つもしくは複数のサイトカインをコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、上記摂動インプット有核細胞内では、上記ｍＲＮＡが発現し、それによって、上記タンパク質もしくはその断片、上記一つもしくは複数のサイトカイン、および／または上記一つもしくは複数の共刺激分子を含む有核細胞を生成することを含むプロセスによって調製される、実施形態１４５に記載の組成物。
実施形態１４８．
上記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、上記複数のＰＢＭＣが、
上記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、上記複数のＰＢＭＣが、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記二つ以上の抗原と、一つまたは複数のサイトカインをコードする一つまたは複数のｍＲＮＡと、一つまたは複数の共刺激分子をコードする一つまたは複数のｍＲＮＡとが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記二つ以上の抗原一つ、もしくは複数のサイトカインをコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートして、上記二つ以上の抗原、一つもしくは複数のサイトカインをコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、上記ｍＲＮＡが発現し、それによって、二つ以上の抗原、上記一つもしくは複数のサイトカイン、および／または上記一つもしくは複数の共刺激分子を含む有核細胞を生成することを含むプロセスによって調製される、実施形態１４５に記載の組成物。
実施形態１４９．
上記複数のＰＢＭＣを調製するプロセスが、
上記複数のＰＢＭＣを調製するプロセスが、
（ａ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記複数のＰＢＭＣを上記タンパク質もしくはその断片、一つもしくは複数のサイトカインをコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすること、
（ｂ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記複数のＰＢＭＣを、上記タンパク質もしくはその断片をコードする上記ｍＲＮＡ、一つもしくは複数のサイトカインをコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすること、または
（ｃ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記複数のＰＢＭＣを上記二つ以上の抗原、一つもしくは複数のサイトカインをコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすることを含む、実施形態１４６～１４８のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１５０．
上記複数のＰＢＭＣを調製するプロセスが、
上記複数のＰＢＭＣを調製するプロセスが、
（ａ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記複数のＰＢＭＣを上記タンパク質もしくはその断片、一つもしくは複数のサイトカインをコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすること、
（ｂ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記複数のＰＢＭＣを、上記タンパク質もしくはその断片をコードする上記ｍＲＮＡ、一つもしくは複数のサイトカインをコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすること、または
（ｃ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記複数のＰＢＭＣを上記二つ以上の抗原、一つもしくは複数のサイトカインをコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする上記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすることを含む、実施形態１４６～１４８のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１５１．
一つまたは複数の共刺激分子が、上記馴化されていない複数のＰＢＭＣ中のＢ細胞と比較して、馴化された複数のＰＢＭＣのＢ細胞では上方制御されており、上記共刺激分子が、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６である、実施形態１３２～１５０のいずれか一つに記載の組成物。
一つまたは複数の共刺激分子が、上記馴化されていない複数のＰＢＭＣ中のＢ細胞と比較して、馴化された複数のＰＢＭＣのＢ細胞では上方制御されており、上記共刺激分子が、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６である、実施形態１３２～１５０のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１５２．
上記複数のＰＢＭＣが、複数の馴化されていないＰＢＭＣと比較して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が増加している、実施形態１３２～１５１に記載の組成物。
上記複数のＰＢＭＣが、複数の馴化されていないＰＢＭＣと比較して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が増加している、実施形態１３２～１５１に記載の組成物。
実施形態１５３．
ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が、上記複数の馴化されていないＰＢＭＣと比較して、約１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、または１０倍を超えて増加している、実施形態１５２に記載の組成物。
ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が、上記複数の馴化されていないＰＢＭＣと比較して、約１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、または１０倍を超えて増加している、実施形態１５２に記載の組成物。
実施形態１５４．
個体における免疫応答を刺激するための組成物であって、有効量の実施形態８２～１５３のいずれか一つに記載の組成物を含み、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、組成物。
個体における免疫応答を刺激するための組成物であって、有効量の実施形態８２～１５３のいずれか一つに記載の組成物を含み、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、組成物。
実施形態１５５．
医薬として使用するための組成物であって、有効量の実施形態８２～１５３のいずれか一つに記載の組成物を含む、組成物。
医薬として使用するための組成物であって、有効量の実施形態８２～１５３のいずれか一つに記載の組成物を含む、組成物。
実施形態１５６．
個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための組成物であって、有効量の実施形態８２～１５３のいずれか一つに記載の組成物を含む、組成物。
個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための組成物であって、有効量の実施形態８２～１５３のいずれか一つに記載の組成物を含む、組成物。
実施形態１５７．
上記組成物が、アジュバントをさらに含む、実施形態１５４～１５６のいずれか一つに記載の組成物。
上記組成物が、アジュバントをさらに含む、実施形態１５４～１５６のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１５８．
上記組成物が、アジュバントと併せて投与される、実施形態１５４～１５７のいずれか一つに記載の組成物。
上記組成物が、アジュバントと併せて投与される、実施形態１５４～１５７のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１５９．
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態１５７または１５８に記載の組成物。
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態１５７または１５８に記載の組成物。
実施形態１６０．
有核細胞を含む上記組成物が、複数回投与される、実施形態１５７～１５９のいずれか一つに記載の組成物。
有核細胞を含む上記組成物が、複数回投与される、実施形態１５７～１５９のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１６１．
上記組成物が、静脈内に投与される、実施形態１５７～１６０のいずれか一つに記載の組成物。
上記組成物が、静脈内に投与される、実施形態１５７～１６０のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１６２．
上記個体がヒトである、実施形態１５７～１６１のいずれか一つに記載の組成物。
上記個体がヒトである、実施形態１５７～１６１のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１６３．
別の療法の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与される、実施形態１５７～１６２のいずれか一つに記載の組成物。
別の療法の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与される、実施形態１５７～１６２のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１６４．
別の療法が、免疫腫瘍療法で使用される化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、又は二重特異性ポリペプチドである、実施形態１６３に記載の組成物。
別の療法が、免疫腫瘍療法で使用される化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、又は二重特異性ポリペプチドである、実施形態１６３に記載の組成物。
実施形態１６５．
個体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における組成物の使用であって、有効量の実施形態８２～１５３のいずれか一つに記載の組成物を含み、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、使用。
個体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における組成物の使用であって、有効量の実施形態８２～１５３のいずれか一つに記載の組成物を含み、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、使用。
実施形態１６６．
個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための医薬の製造における組成物の使用であって、上記組成物が、有効量の実施形態８２～１５３のいずれか一つに記載の組成物を含む、使用。
個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための医薬の製造における組成物の使用であって、上記組成物が、有効量の実施形態８２～１５３のいずれか一つに記載の組成物を含む、使用。
実施形態１６７．
上記組成物が、アジュバントをさらに含む、実施形態１６５または１６６に記載の組成物。
上記組成物が、アジュバントをさらに含む、実施形態１６５または１６６に記載の組成物。
実施形態１６８．
上記組成物が、アジュバントと併せて投与するために製剤化される、実施形態１６５～１６７のいずれか一つに記載の組成物。
上記組成物が、アジュバントと併せて投与するために製剤化される、実施形態１６５～１６７のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態１６９．
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態１６７または１６８に記載の使用。
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態１６７または１６８に記載の使用。
実施形態１７０．
有核細胞を含む上記組成物が、複数回投与される、実施形態１６７～１６９のいずれか一つに記載の使用。
有核細胞を含む上記組成物が、複数回投与される、実施形態１６７～１６９のいずれか一つに記載の使用。
実施形態１７１．
上記組成物が、静脈内に投与される、実施形態１６７～１７０のいずれか一つに記載の使用。
上記組成物が、静脈内に投与される、実施形態１６７～１７０のいずれか一つに記載の使用。
実施形態１７２．
上記個体がヒトである、実施形態１６７～１７１のいずれか一つに記載の使用。
上記個体がヒトである、実施形態１６７～１７１のいずれか一つに記載の使用。
実施形態１７３．
上記組成物が、別の療法の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与される、実施形態１６７～１７２のいずれか一つに記載の使用。
上記組成物が、別の療法の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与される、実施形態１６７～１７２のいずれか一つに記載の使用。
実施形態１７４．
別の療法が、免疫腫瘍療法で使用される化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、または二重特異性ポリペプチドである、実施形態１７３に記載の使用。
別の療法が、免疫腫瘍療法で使用される化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、または二重特異性ポリペプチドである、実施形態１７３に記載の使用。
実施形態１７５．
実施形態１～８１のいずれか一つに記載の方法で使用するためのキット。
実施形態１～８１のいずれか一つに記載の方法で使用するためのキット。
実施形態１７６．
実施形態８２～１５３のいずれか一つに記載の組成物を含むキット。
実施形態８２～１５３のいずれか一つに記載の組成物を含むキット。
実施形態１７７．
緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、または上記組成物を個体に投与してＨＬＡ非依存的な様式で免疫応答を刺激するための指示を伴う添付文書のうちの一つまたは複数をさらに含む、実施形態１７５または１７６に記載のキット。
緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、または上記組成物を個体に投与してＨＬＡ非依存的な様式で免疫応答を刺激するための指示を伴う添付文書のうちの一つまたは複数をさらに含む、実施形態１７５または１７６に記載のキット。
実施形態１７８．
タンパク質またはその断片を含む有核細胞を作製する方法であって、上記タンパク質またはその断片を上記有核細胞に導入することを含み、上記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、方法。
タンパク質またはその断片を含む有核細胞を作製する方法であって、上記タンパク質またはその断片を上記有核細胞に導入することを含み、上記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、方法。
実施形態１７９．
タンパク質またはその断片を含む有核細胞を作製する方法であって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを上記有核細胞に導入することを含み、上記ｍＲＮＡが、発現されて上記タンパク質またはその断片を産生し、上記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、方法。
タンパク質またはその断片を含む有核細胞を作製する方法であって、上記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを上記有核細胞に導入することを含み、上記ｍＲＮＡが、発現されて上記タンパク質またはその断片を産生し、上記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、方法。
実施形態１８０．
タンパク質由来の二つ以上の抗原を含む有核細胞を作製する方法であって、上記二つ以上の抗原を上記有核細胞に導入することを含み、上記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、方法。
タンパク質由来の二つ以上の抗原を含む有核細胞を作製する方法であって、上記二つ以上の抗原を上記有核細胞に導入することを含み、上記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、方法。
実施形態１８１．
上記タンパク質またはその断片を上記有核細胞内に導入することが、
上記タンパク質またはその断片を上記有核細胞内に導入することが、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット有核細胞を上記タンパク質またはその断片とインキュベートして、上記タンパク質またはその断片が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を生成することを含む、実施形態１７８に記載の方法。
実施形態１８２．
上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡを含む有核細胞が、
上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡを含む有核細胞が、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット有核細胞を、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡとインキュベートして、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡが上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡを含む有核細胞を生成することにより調製される、実施形態１７９に記載の方法。
実施形態１８３．
二つ以上の抗原を含む上記有核細胞が、
二つ以上の抗原を含む上記有核細胞が、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記二つ以上の抗原が通過するのに十分な大きさの上記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット有核細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット有核細胞を上記二つ以上の抗原とインキュベートして、上記二つ以上の抗原が上記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、二つ以上の抗原を含む有核細胞を生成することにより調製される、実施形態１８０に記載の方法。
実施形態１８４．
（ａ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、上記有核細胞を上記タンパク質またはその断片と共にインキュベートすること、
（ｂ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡと共に上記有核細胞をインキュベートすること、または
（ｃ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、上記有核細胞を上記二つ以上の抗原と共にインキュベートすること、を含む、実施形態１８１～１８３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１８５．
（ａ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記有核細胞を上記タンパク質またはその断片と共にインキュベートすること、
（ｂ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記タンパク質またはその断片をコードする上記ｍＲＮＡと共に上記有核細胞をインキュベートすること、または
（ｃ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記有核細胞を上記二つ以上の抗原と共にインキュベートすること、を含む、実施形態１８１～１８３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１８６．
上記狭窄部の幅が、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、実施形態１８１～１８５のいずれか一つに記載の方法。
上記狭窄部の幅が、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、実施形態１８１～１８５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１８７．
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍ～約４．２μｍ、または約３．５μｍ～約４．８μｍ、または約３．５μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、実施形態１８１～１８６のいずれか一つに記載の方法。
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍ～約４．２μｍ、または約３．５μｍ～約４．８μｍ、または約３．５μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、実施形態１８１～１８６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１８８．
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、実施形態１８１～１８７のいずれか一つに記載の方法。
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、実施形態１８１～１８７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１８９．
上記狭窄部の幅が、約４．５μｍである、実施形態１８１～１８８のいずれか一つに記載の方法。
上記狭窄部の幅が、約４．５μｍである、実施形態１８１～１８８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１９０．
上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置されている、実施形態１８１～１８９のいずれか一つに記載の方法。
上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置されている、実施形態１８１～１８９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１９１．
上記有核細胞をアジュバントにより馴化して、馴化細胞を形成することをさらに含む、実施形態１７８～１９０のいずれか一つに記載の方法。
上記有核細胞をアジュバントにより馴化して、馴化細胞を形成することをさらに含む、実施形態１７８～１９０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１９２．
上記有核細胞が、上記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、上記アジュバントとインキュベートされる、実施形態１９１に記載の方法。
上記有核細胞が、上記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、上記アジュバントとインキュベートされる、実施形態１９１に記載の方法。
実施形態１９３．
上記有核細胞が、上記タンパク質もしくはその断片、上記タンパク質もしくはその断片をコードする上記ｍＲＮＡ、またはタンパク質由来の上記二つ以上の抗原を上記有核細胞に導入する前または後に馴化される、実施形態１９１または１９２に記載の方法。
上記有核細胞が、上記タンパク質もしくはその断片、上記タンパク質もしくはその断片をコードする上記ｍＲＮＡ、またはタンパク質由来の上記二つ以上の抗原を上記有核細胞に導入する前または後に馴化される、実施形態１９１または１９２に記載の方法。
実施形態１９４．
免疫細胞の上記活性を増強する方法であって、上記免疫細胞においてキメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸を発現することを含む方法。
免疫細胞の上記活性を増強する方法であって、上記免疫細胞においてキメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸を発現することを含む方法。
実施形態１９５．
上記キメラ膜結合型サイトカインが、膜貫通ドメインとサイトカインとを含む融合タンパク質である、実施形態１９３に記載の方法。
上記キメラ膜結合型サイトカインが、膜貫通ドメインとサイトカインとを含む融合タンパク質である、実施形態１９３に記載の方法。
実施形態１９６．
上記膜貫通ドメインが、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＴＦＲＣ）または腫瘍壊死因子膜貫通ドメインである、実施形態１９４または１９５に記載の方法。
上記膜貫通ドメインが、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＴＦＲＣ）または腫瘍壊死因子膜貫通ドメインである、実施形態１９４または１９５に記載の方法。
実施形態１９７．
上記サイトカインが、Ｉ型サイトカインである、実施形態１９４～１９６のいずれか一つに記載の方法。
上記サイトカインが、Ｉ型サイトカインである、実施形態１９４～１９６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１９８．
上記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである、実施形態１９４～１９７のいずれか一つに記載の方法。
上記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである、実施形態１９４～１９７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態１９９．
上記サイトカインが、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合されている、実施形態１９４～１９８のいずれか一つに記載の方法。
上記サイトカインが、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合されている、実施形態１９４～１９８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２００．
上記ペプチドリンカーが、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である、実施形態１９９に記載の方法。
上記ペプチドリンカーが、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である、実施形態１９９に記載の方法。
実施形態２０１．
上記キメラ膜結合型サイトカインが、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む、実施形態１９４～２００のいずれか一つに記載の方法。
上記キメラ膜結合型サイトカインが、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む、実施形態１９４～２００のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２０２．
上記免疫細胞が、抗原をさらに含む、実施形態１９４～２０１のいずれか一つに記載の方法。
上記免疫細胞が、抗原をさらに含む、実施形態１９４～２０１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２０３．
上記免疫細胞が、抗原をコードするｍＲＮＡをさらに含む、実施形態１９４～２０１のいずれか一つに記載の方法。
上記免疫細胞が、抗原をコードするｍＲＮＡをさらに含む、実施形態１９４～２０１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２０４．
上記抗原が、タンパク質またはその断片であり、上記タンパク質またはその断片が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、実施形態２０２または２０３に記載の方法。
上記抗原が、タンパク質またはその断片であり、上記タンパク質またはその断片が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、実施形態２０２または２０３に記載の方法。
実施形態２０５．
上記免疫細胞が、タンパク質由来の二つ以上の抗原をさらに含む、実施形態１９４～２０１のいずれか一つに記載の方法。
上記免疫細胞が、タンパク質由来の二つ以上の抗原をさらに含む、実施形態１９４～２０１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２０６．
上記二つ以上の抗原が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、実施形態２０５に記載の方法。
上記二つ以上の抗原が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、実施形態２０５に記載の方法。
実施形態２０７．
上記タンパク質が、がんに関連する変異タンパク質、癌遺伝子産物、ネオ抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である、実施形態２０４～２０６のいずれか一つに記載の方法。
上記タンパク質が、がんに関連する変異タンパク質、癌遺伝子産物、ネオ抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である、実施形態２０４～２０６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２０８．
上記タンパク質が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である、実施形態２０４～２０７のいずれか一つに記載の方法。
上記タンパク質が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である、実施形態２０４～２０７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２０９．
上記ＨＰＶが、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である、実施形態２０８に記載の方法。
上記ＨＰＶが、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である、実施形態２０８に記載の方法。
実施形態２１０．
上記タンパク質が、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である、実施形態２０８または２０９に記載の方法。
上記タンパク質が、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である、実施形態２０８または２０９に記載の方法。
実施形態２１１．
上記タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である、実施形態２０４～２０７のいずれか一つに記載の方法。
上記タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である、実施形態２０４～２０７のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２１２．
上記ＨＢＶタンパク質が、コアタンパク質、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、ｅ抗原、Ｘ抗原、またはポリメラーゼタンパク質である、実施形態２１１に記載の方法。
上記ＨＢＶタンパク質が、コアタンパク質、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、ｅ抗原、Ｘ抗原、またはポリメラーゼタンパク質である、実施形態２１１に記載の方法。
実施形態２１３．
上記免疫細胞が、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、実施形態１９４～２１２のいずれか一つに記載の方法。
上記免疫細胞が、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、実施形態１９４～２１２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２１４．
上記複数のＰＢＭＣが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む、実施形態２１３に記載の方法。
上記複数のＰＢＭＣが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む、実施形態２１３に記載の方法。
実施形態２１５．
上記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である、実施形態１９４～２１４のいずれか一つに記載の方法。
上記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である、実施形態１９４～２１４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２１６．
上記有核細胞が、アジュバントにより馴化されて、馴化細胞を形成する、実施形態１９４～２１５のいずれか一つに記載の方法。
上記有核細胞が、アジュバントにより馴化されて、馴化細胞を形成する、実施形態１９４～２１５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２１７．
上記有核細胞が、上記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、アジュバントとインキュベートされる、実施形態２１６に記載の方法。
上記有核細胞が、上記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、アジュバントとインキュベートされる、実施形態２１６に記載の方法。
実施形態２１８．
上記有核細胞が、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを上記有核細胞に導入する前または後に馴化される、実施形態２１６または２１７に記載の組成物。
上記有核細胞が、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを上記有核細胞に導入する前または後に馴化される、実施形態２１６または２１７に記載の組成物。
実施形態２１９．
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態２１６～２１８のいずれか一つに記載の方法。
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態２１６～２１８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２２０．
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、実施形態２１６～２１９のいずれか一つに記載の方法。
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、実施形態２１６～２１９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２２１．
上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞が、
上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインを含む免疫細胞を生成することにより調製される、実施形態１９４～２２０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２２２．
上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである、実施形態２２１に記載の方法。
上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである、実施形態２２１に記載の方法。
実施形態２２３．
上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞が、
上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸と上記抗原とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原とインキュベートして、上記核酸および上記抗原が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される、実施形態２０２、２０４、および２０７～２２２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２２４．
上記キメラ膜結合型サイトカインと、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡとを含む免疫細胞が、
上記キメラ膜結合型サイトカインと、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡとを含む免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と上記抗原をコードする核酸とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原をコードする上記核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原をコードする上記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される、実施形態２０３、２０４、および２０７～２２２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２２５．
上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および／または上記抗原をコードする上記核酸が、ｍＲＮＡである、実施形態２２３または２２４に記載の方法。
上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および／または上記抗原をコードする上記核酸が、ｍＲＮＡである、実施形態２２３または２２４に記載の方法。
実施形態２２６．
上記キメラ膜結合型サイトカインと、タンパク質由来の上記二つ以上の抗原とを含む免疫細胞が、
上記キメラ膜結合型サイトカインと、タンパク質由来の上記二つ以上の抗原とを含む免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸とタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸およびタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される、実施形態２０２、２０４、および２０７～２２２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２２７．
（ａ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸とインキュベートすること、
（ｂ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原とインキュベートすること、
（ｃ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原をコードする上記核酸とインキュベートすること、または
（ｄ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記二つ以上の抗原とインキュベートすることを含む、実施形態２２１～２２６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２２８．
（ａ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸とインキュベートすること、
（ｂ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原とインキュベートすること、
（ｃ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原をコードする上記核酸とインキュベートすること、または
（ｄ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記二つ以上の抗原とインキュベートすることを含む、実施形態２２１～２２６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２２９．
上記狭窄部の幅が、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、実施形態２２１～２２８のいずれか一つに記載の方法。
上記狭窄部の幅が、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、実施形態２２１～２２８のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２３０．
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍ～約４．２μｍ、または約３．５μｍ～約４．８μｍ、または約３．５μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、実施形態２２１～２２９のいずれか一つに記載の方法。
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍ～約４．２μｍ、または約３．５μｍ～約４．８μｍ、または約３．５μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、実施形態２２１～２２９のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２３１．
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、実施形態２２１～２３０のいずれか一つに記載の方法。
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、実施形態２２１～２３０のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２３２．
上記狭窄部の幅が、約４．５μｍである、実施形態２２１～２３１のいずれか一つに記載の方法。
上記狭窄部の幅が、約４．５μｍである、実施形態２２１～２３１のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２３３．
上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置されている、実施形態２２１～２３２のいずれか一つに記載の方法。
上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置されている、実施形態２２１～２３２のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２３４．
免疫細胞の上記活性を増強する組成物であって、上記免疫細胞にキメラ膜結合型サイトカインを含む、組成物。
免疫細胞の上記活性を増強する組成物であって、上記免疫細胞にキメラ膜結合型サイトカインを含む、組成物。
実施形態２３５．
上記キメラ膜結合型サイトカインが、膜貫通ドメインとサイトカインとを含む融合タンパク質である、実施形態２３４に記載の組成物。
上記キメラ膜結合型サイトカインが、膜貫通ドメインとサイトカインとを含む融合タンパク質である、実施形態２３４に記載の組成物。
実施形態２３６．
上記膜貫通ドメインが、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＴＦＲＣ）または腫瘍壊死因子膜貫通ドメインである、実施形態２３４～２３５のいずれか一つに記載の組成物。
上記膜貫通ドメインが、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＴＦＲＣ）または腫瘍壊死因子膜貫通ドメインである、実施形態２３４～２３５のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２３７．
上記サイトカインが、Ｉ型サイトカインである、実施形態２３４～２３６のいずれか一つに記載の組成物。
上記サイトカインが、Ｉ型サイトカインである、実施形態２３４～２３６のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２３８．
上記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである、実施形態２３４～２３７のいずれか一つに記載の組成物。
上記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである、実施形態２３４～２３７のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２３９．
上記サイトカインが、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合されている、実施形態２３４～２３８のいずれか一つに記載の組成物。
上記サイトカインが、ペプチドリンカーによって上記膜貫通ドメインに結合されている、実施形態２３４～２３８のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２４０．
上記ペプチドリンカーが、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である、実施形態２３９に記載の組成物。
上記ペプチドリンカーが、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である、実施形態２３９に記載の組成物。
実施形態２４１．
上記キメラ膜結合型サイトカインが、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む、実施形態２３４～２４０のいずれか一項に記載の組成物。
上記キメラ膜結合型サイトカインが、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む、実施形態２３４～２４０のいずれか一項に記載の組成物。
実施形態２４２．
上記免疫細胞が、抗原をさらに含む、実施形態２３４～２４１のいずれか一つに記載の組成物。
上記免疫細胞が、抗原をさらに含む、実施形態２３４～２４１のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２４３．
上記免疫細胞が、抗原をコードするｍＲＮＡをさらに含む、実施形態２３４～２４２のいずれか一つに記載の組成物。
上記免疫細胞が、抗原をコードするｍＲＮＡをさらに含む、実施形態２３４～２４２のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２４４．
上記抗原が、タンパク質またはその断片であり、上記タンパク質またはその断片が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、実施形態２４２または２４３に記載の組成物。
上記抗原が、タンパク質またはその断片であり、上記タンパク質またはその断片が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、実施形態２４２または２４３に記載の組成物。
実施形態２４５．
上記免疫細胞が、タンパク質由来の二つ以上の抗原をさらに含む、実施形態２３３～２４１のいずれか一つに記載の組成物。
上記免疫細胞が、タンパク質由来の二つ以上の抗原をさらに含む、実施形態２３３～２４１のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２４６．
上記二つ以上の抗原が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、実施形態２４５に記載の組成物。
上記二つ以上の抗原が、上記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、実施形態２４５に記載の組成物。
実施形態２４７．
上記タンパク質が、がんに関連する変異タンパク質、癌遺伝子産物、ネオ抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である、実施形態２４４～２４６のいずれか一つに記載の組成物。
上記タンパク質が、がんに関連する変異タンパク質、癌遺伝子産物、ネオ抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である、実施形態２４４～２４６のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２４８．
タンパク質が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である、実施形態２４４～２４７のいずれか一つに記載の組成物。
タンパク質が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である、実施形態２４４～２４７のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２４９．
上記ＨＰＶが、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である、実施形態２４８に記載の組成物。
上記ＨＰＶが、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である、実施形態２４８に記載の組成物。
実施形態２５０．
上記タンパク質が、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である、実施形態２４８または２４９に記載の組成物。
上記タンパク質が、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である、実施形態２４８または２４９に記載の組成物。
実施形態２５１．
上記タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である、実施形態２４４～２４７のいずれか一つに記載の組成物。
上記タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である、実施形態２４４～２４７のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２５２．
上記ＨＢＶタンパク質が、コアタンパク質、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、ｅ抗原、Ｘ抗原、またはポリメラーゼタンパク質である、実施形態２５１に記載の組成物。
上記ＨＢＶタンパク質が、コアタンパク質、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、ｅ抗原、Ｘ抗原、またはポリメラーゼタンパク質である、実施形態２５１に記載の組成物。
実施形態２５３．
上記免疫細胞が、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、実施形態２３３～２５２のいずれか一つに記載の組成物。
上記免疫細胞が、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、実施形態２３３～２５２のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２５４．
上記複数のＰＢＭＣが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む、実施形態２５３に記載の組成物。
上記複数のＰＢＭＣが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む、実施形態２５３に記載の組成物。
実施形態２５５．
上記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である、実施形態２３３～２５４のいずれか一つに記載の組成物。
上記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である、実施形態２３３～２５４のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２５６．
上記有核細胞が、アジュバントにより馴化されて、馴化細胞を形成する、実施形態２３３～２５５のいずれか一つに記載の組成物。
上記有核細胞が、アジュバントにより馴化されて、馴化細胞を形成する、実施形態２３３～２５５のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２５７．
上記有核細胞が、上記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、アジュバントとインキュベートされる、実施形態２５６に記載の組成物。
上記有核細胞が、上記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、アジュバントとインキュベートされる、実施形態２５６に記載の組成物。
実施形態２５８．
上記有核細胞が、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを上記有核細胞に導入する前または後に馴化される、実施形態２５６または２５７に記載の組成物。
上記有核細胞が、上記タンパク質もしくはその断片、または上記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを上記有核細胞に導入する前または後に馴化される、実施形態２５６または２５７に記載の組成物。
実施形態２５９．
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態２５６～２５８のいずれか一つに記載の組成物。
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、実施形態２５６～２５８のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２６０．
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、実施形態２５６～２５９のいずれか一つに記載の組成物。
上記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、実施形態２５６～２５９のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２６１．
上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞が、
上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインを含む免疫細胞を生成することにより調製される、実施形態２３４～２６０のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２６２．
上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである、実施形態２６１に記載の組成物。
上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである、実施形態２６１に記載の組成物。
実施形態２６３．
上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞が、
上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と上記抗原とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される、実施形態２４２、２４４、および２４７～２６２のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２６４．
上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞が、
上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と上記抗原をコードする核酸とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原をコードする上記核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原をコードする上記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される、実施形態２４３、２４４、および２４７～２６２のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２６５．
上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および／または上記抗原をコードする上記核酸が、ｍＲＮＡである、実施形態２６３または２６４に記載の組成物。
上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および／または上記抗原をコードする上記核酸が、ｍＲＮＡである、実施形態２６３または２６４に記載の組成物。
実施形態２６６．
上記キメラ膜結合型サイトカインと、タンパク質由来の上記二つ以上の抗原とを含む免疫細胞が、
上記キメラ膜結合型サイトカインと、タンパク質由来の上記二つ以上の抗原とを含む免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸とタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とが通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸およびタンパク質由来の上記二つ以上の抗原とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび二つ以上の抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される、実施形態２４５～２６２のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２６７．
上記免疫細胞を取得するプロセスが、
上記免疫細胞を取得するプロセスが、
（ａ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸とインキュベートすること、
（ｂ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原とインキュベートすること、
（ｃ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原をコードする上記核酸とインキュベートすること、または
（ｄ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記免疫細胞を上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記二つ以上の抗原とインキュベートすることを含む、実施形態２６１～２６６のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２６８．
上記免疫細胞を取得するプロセスが、
上記免疫細胞を取得するプロセスが、
（ａ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸とインキュベートすること、
（ｂ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原とインキュベートすること、
（ｃ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記抗原をコードする上記核酸とインキュベートすること、または
（ｄ）上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸および上記二つ以上の抗原とインキュベートすることを含む、実施形態２６１～２６６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２６９．
上記狭窄部の幅が、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、実施形態２６１～２６８のいずれか一つに記載の組成物。
上記狭窄部の幅が、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、実施形態２６１～２６８のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２７０．
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍ～約４．２μｍ、または約３．５μｍ～約４．８μｍ、または約３．５μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、実施形態２６１～２６９のいずれか一つに記載の組成物。
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍ～約４．２μｍ、または約３．５μｍ～約４．８μｍ、または約３．５μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、実施形態２６１～２６９のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２７１．
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、実施形態２６１～２７０のいずれか一つに記載の組成物。
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、実施形態２６１～２７０のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２７２．
上記狭窄部の幅が、約４．５μｍである、実施形態２６１～２７１のいずれか一つに記載の組成物。
上記狭窄部の幅が、約４．５μｍである、実施形態２６１～２７１のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２７３．
上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置されている、実施形態２６１～２７２のいずれか一つに記載の組成物。
上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、上記複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置されている、実施形態２６１～２７２のいずれか一つに記載の組成物。
実施形態２７４．
医薬として使用するための組成物であって、有効量の実施形態２３４～２７３のいずれか一つに記載の組成物を含む、組成物。
医薬として使用するための組成物であって、有効量の実施形態２３４～２７３のいずれか一つに記載の組成物を含む、組成物。
実施形態２７５．
個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための組成物であって、有効量の実施形態２１０～２４８のいずれか一つに記載の組成物を含む、組成物。
個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための組成物であって、有効量の実施形態２１０～２４８のいずれか一つに記載の組成物を含む、組成物。
実施形態２７６．
実施形態１９４～２３３のいずれか一つに記載の方法で使用するためのキット。
実施形態１９４～２３３のいずれか一つに記載の方法で使用するためのキット。
実施形態２７７．
実施形態２３４～２７５のいずれか一つに記載の組成物を含むキット。
実施形態２３４～２７５のいずれか一つに記載の組成物を含むキット。
実施形態２７８．
上記キットが、緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、または免疫細胞の活性を増強するための指示を伴う添付文書のうちの一つまたは複数をさらに含む、実施形態２５０または２４９に記載のキット。
上記キットが、緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、または免疫細胞の活性を増強するための指示を伴う添付文書のうちの一つまたは複数をさらに含む、実施形態２５０または２４９に記載のキット。
実施形態２７９．
キメラ膜結合型サイトカインを含む免疫細胞を作製する方法であって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸を免疫細胞に導入することを含む方法。
キメラ膜結合型サイトカインを含む免疫細胞を作製する方法であって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸を免疫細胞に導入することを含む方法。
実施形態２８０．
上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞が、
上記キメラ膜結合型サイトカインを含む上記免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が通過するのに十分な大きさの上記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、上記狭窄部の直径が、上記懸濁液中の上記インプット免疫細胞の直径の関数である、上記通過させること、ならびに
ｂ）上記摂動インプット免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸とインキュベートして、上記核酸が上記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインを含む免疫細胞を生成することにより調製される、実施形態２７９に記載の方法。
実施形態２８１．
上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸とインキュベートすることを含む、実施形態２８０に記載の方法。
上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸とインキュベートすることを含む、実施形態２８０に記載の方法。
実施形態２８２．
上記方法が、上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸とインキュベートすることを含む、実施形態２８０に記載の方法。
上記方法が、上記細胞懸濁液を上記細胞変形狭窄部に通過させる前に、上記免疫細胞を、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする上記核酸とインキュベートすることを含む、実施形態２８０に記載の方法。
実施形態２８３．
上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである、実施形態２８０、２８１、または２８２に記載の方法。
上記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が、上記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである、実施形態２８０、２８１、または２８２に記載の方法。
実施形態２８４．
上記狭窄部の幅が、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、実施形態２８０～２８３のいずれか一つに記載の方法。
上記狭窄部の幅が、上記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、実施形態２８０～２８３のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２８５．
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍ～約４．２μｍ、または約３．５μｍ～約４．８μｍ、または約３．５μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、実施形態２８０～２８４のいずれか一つに記載の方法。
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍ～約４．２μｍ、または約３．５μｍ～約４．８μｍ、または約３．５μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、実施形態２８０～２８４のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２８６．
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、実施形態２８０～２８５のいずれか一つに記載の方法。
上記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、実施形態２８０～２８５のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２８７．
上記狭窄部の幅が、約４．５μｍである、実施形態２８０～２８６のいずれか一つに記載の方法。
上記狭窄部の幅が、約４．５μｍである、実施形態２８０～２８６のいずれか一つに記載の方法。
実施形態２８８．
上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、複数の狭窄部が、直列及び／又は並列に配置される、実施形態２８０～２８７のいずれか一つに記載の方法。
上記複数のインプット有核細胞を含む上記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、複数の狭窄部が、直列及び／又は並列に配置される、実施形態２８０～２８７のいずれか一つに記載の方法。
当業者は、一部の実施形態が本発明の範囲および趣旨の範疇で可能であることを認識するものとなる。これより、以下の非限定的な実施例を参照して、本発明をより詳細に記述する。以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、当然のことながら、形はどうあれその範囲を制限しているものと解釈されるべきではない。
実施例１
実施例１
キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡが翻訳され、免疫細胞の膜に輸送できるか否かを判定するために、ヒトドナーＰＢＭＣに、キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡを圧迫装填し、免疫細胞の表面のサイトカインの存在をフローサイトメトリーによりモニタリングした。
方法
方法
ヒトＰＢＭＣを２×１０７個／ｍＬの密度に調製し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地中、キメラ膜結合型サイトカイン（ＴＦＲＣ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１２もしくはＴＦＲＣ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＦＮ－α２ａのどちらか）をコードする２５０μｇ／ｍｌの各ｍＲＮＡまたは積載なし（空の圧迫圧迫）を、室温下６０ｐｓｉで幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して、圧迫圧迫処理した。圧迫圧迫処理した後、圧迫圧迫装填済みＰＢＭＣを遠心分離し、上清を廃棄した。次いで、細胞をＲ１０＋培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１×ＩＴＳ－Ａ、５０μＭのβ－ＭＥ、１×ＭＥＭ ＮＥＡＡ）中で二回洗浄し、その後、新鮮なＲ１０＋培地に再懸濁した。細胞を３７℃で四時間インキュベートし、次いでそれぞれの蛍光抗体（ＡＦ４８８抗ヒトＩＬ－２、Ｖ４５０抗ヒトＩＦＮ－α２ｂ、またはＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ抗ヒトｐ４０［ＩＬ－１２］のいずれか）とインキュベートした。膜表面へのｍＲＮＡの翻訳および輸送を評価するために、免疫細胞に結合された抗体の蛍光強度を、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ音響集束サイトメーターを使用して分析した。
結果
結果
図１に示されるように、ＴＦＲＣ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１２またはＴＦＲＣ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＦＮ－α２ａをコードするｍＲＮＡを圧迫装填したヒトＰＢＭＣでは、結果として、圧迫装填した試料中の生きた免疫細胞において、空の圧迫試料と比較してＩＬ－１２およびＩＦＮ－α２ａの平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増加が生じた。この結果は、キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡを圧迫装填したヒトＰＢＭＣがそのｍＲＮＡを翻訳し、コードされたタンパク質を免疫細胞の表面へ輸送できることを示す。
実施例２
実施例２
キメラ膜結合型サイトカインがそのシグナル伝達機能性を保持しているか否かを判定するために、ヒトドナーＰＢＭＣに、キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡを圧迫装填し、サイトカイン特異的ＨＥＫ－Ｂｌｕｅレポーター細胞（インビボジェン社）と共培養した。
方法
方法
ヒトＰＢＭＣを２×１０７個／ｍＬの密度に調製し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地中、キメラ膜結合型サイトカイン（ＴＦＲＣ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１２もしくはＴＦＲＣ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＦＮ－α２ａのどちらか）をコードする２５０μｇ／ｍｌの各ｍＲＮＡまたは積載なし（空の圧迫）を、室温下６０ｐｓｉで幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して、圧迫処理した。圧迫処理後、圧迫装填したＰＢＭＣを遠心分離し、上清を廃棄した。続いて、細胞を、試験培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン）中で二回洗浄した後、新鮮な試験培地に再懸濁した。
対数増殖期のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２、およびＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／β（インビボジェン社）レポーター細胞を、ＰＢＳで培養フラスコをリンスすることによりフラスコから採集し、圧迫装填した各ＰＢＭＣまたは空の圧迫ＰＢＭＣと９６ウェルプレート中で共培養した。共培養物を３７℃で一晩インキュベートした後、培養上清を採取した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅレポーター細胞において各サイトカインが受容体へ結合し、各シグナル伝達経路が活性化される結果、培養上清中のアルカリホスファターゼの分泌が生じる。分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を、製造業者のプロトコールに従ってＱＵＡＮＴＩ－ｂｌｕｅアッセイを介して検出した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅレポーター細胞のＯＤ６３０のみを、空の圧迫試料および圧迫装填した試料のＯＤ６３０値から減算した。
結果
結果
図２に示されるように、ＴＦＲＣ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－１２、またはＴＦＲＣ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＦＮ－α２ａをコードするｍＲＮＡを圧迫装填したヒトＰＢＭＣは、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２、およびＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＦＮ－α／βとの共培養時の培養上清中のＳＥＡＰの増加によってそれぞれ示される通り、それぞれのシグナル伝達経路を活性化することが可能であった。この結果は、キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡを圧迫装填したヒトＰＢＭＣが、機能的にその同族受容体に結合しその同族受容体を介してシグナル伝達できるキメラサイトカインを産生することを示す。
実施例３
実施例３
膜結合型ＩＬ－２をコードするｍＲＮＡが翻訳され、免疫細胞の膜に輸送できるか否かを判定するために、ヒトドナーＰＢＭＣに、膜結合型ＩＬ－２をコードするｍＲＮＡを圧迫装填し、免疫細胞の表面のＩＬ－２の存在をフローサイトメトリーにより経時的に５０時間、モニタリングした。
方法
方法
ヒトＰＢＭＣを２×１０７個／ｍＬの密度に調製し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地中、膜結合型ＩＬ－２（ＴＦＲＣ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－２、ＴＦＲＣ－（ＥＡ３Ｋ）３－ＩＬ－２、ＦａｓＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－２、またはＦａｓＬ－（ＥＡ３Ｋ）３－ＩＬ－２のいずれか）をコードする２５０μｇ／ｍｌの各ｍＲＮＡ、または非接触ＰＢＭＣ（接触なし）を、室温下６０ｐｓｉで幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して、圧迫処理した。圧迫処理後、圧迫装填したＰＢＭＣを遠心分離し、上清を廃棄した。その後、細胞をＸ－ＶＩＶＯ １５＋培地（Ｘ－ＶＩＶＯ １５、５％ヒト血清、および１×ＩＴＳ－Ａ）中で二回洗浄した後、新鮮なＸ－ＶＩＶＯ １５＋培地に再懸濁した。細胞を、３７℃で４８時間インキュベートした。 別の培養物を、圧迫処理の４、１８、２４、および４８時間後に採取した。膜結合型ＩＬ－２の発現を評価するために、細胞を、各ＢＶ４２１抗ヒトＩＬ－２抗体とインキュベートし、免疫細胞に結合された抗体の蛍光強度を、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ音響集束サイトメーターを使用して分析した。
結果
結果
図３に示されるように、膜結合型ＩＬ－２をコードするｍＲＮＡを圧迫装填したヒトＰＢＭＣでは、結果として、上記圧迫処理した試料中の生きた免疫細胞について、各時点（圧迫の４、１８、２４、および４８時間後）で、空の圧迫試料に比較して、ＩＬ－２の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の増加が生じた。この結果は、キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡを圧迫装填したヒトＰＢＭＣが、コードされたタンパク質を翻訳して免疫細胞の表面へ輸送できること、およびＩＬ－２が、圧迫処理後２４時間超の間、免疫細胞の表面に検出され得ることを示す。
実施例４
実施例４
上記キメラ膜結合型サイトカインがそのシグナル伝達機能性を保持しているか否かを判定するために、ヒトドナーＰＢＭＣに、膜結合型ＩＬ－２をコードするｍＲＮＡを圧迫装填し、ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２レポーター細胞と共培養した。
方法
方法
ヒトＰＢＭＣを２×１０７個／ｍＬの密度に調製し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地中、膜結合型ＩＬ－２（ＴＦＲＣ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－２、ＴＦＲＣ－（ＥＡ３Ｋ）３－ＩＬ－２、ＦａｓＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－２、もしくはＦａｓＬ－（ＥＡ３Ｋ）３－ＩＬ－２のいずれか）をコードする２５０μｇ／ｍｌの各ｍＲＮＡ、または積載なし（空の圧迫）を、室温下６０ｐｓｉで幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して、圧迫処理した。圧迫処理後、圧迫装填したＰＢＭＣを遠心分離し、上清を廃棄した。続いて、細胞を、試験培地（ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１×ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン）中で二回洗浄した後、新鮮な試験培地に再懸濁した。
対数増殖期のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２レポーター細胞（インビボジェン社）を、ＰＢＳで培養フラスコをリンスすることによりフラスコから採集し、圧迫装填したＰＢＭＣまたは空の圧迫ＰＢＭＣと９６ウェルプレート中で共培養した。共培養物を３７℃で一晩インキュベートした後、培養上清を採取した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－２レポーター細胞においてＩＬ－２が受容体へ結合し、ＩＬ－２シグナル伝達経路が活性化される結果、培養上清中のアルカリホスファターゼの分泌が生じる。分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を、製造業者のプロトコールに従ってＱＵＡＮＴＩ－ｂｌｕｅアッセイを介して検出した。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅレポーター細胞のＯＤ６４０のみを、空の圧迫試料および圧迫装填した試料のＯＤ６４０値から減算した。
結果
結果
図４に示されるように、ＴＦＲＣ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－２、ＴＦＲＣ－（ＥＡ３Ｋ）３－ＩＬ－２、ＦａｓＬ－（Ｇ４Ｓ）３－ＩＬ－２、またはＦａｓＬ－（ＥＡ３Ｋ）３－ＩＬ－２をコードするｍＲＮＡを圧迫装填したヒトＰＢＭＣは、ＨＥＫ Ｂｌｕｅ ＩＬ－２レポーター細胞と共培養した際に、空の圧迫ＰＢＭＣによる無活性化と比較して培養上清中のＳＥＡＰが増加することによって示されるように、ＩＬ－２シグナル伝達経路を活性化することが可能であった。 この結果は、膜結合型ＩＬ－２をコードするｍＲＮＡを圧迫装填したヒトＰＢＭＣが、機能的にＩＬ－２受容体に結合しＩＬ－２受容体を介してシグナル伝達できるキメラＩＬ－２を免疫細胞表面に産生することを示す。
実施例５
実施例５
組み換え型Ｅ７（ＨＰＶ１６）タンパク質を圧迫装填した免疫細胞が抗原特異的Ｔ細胞応答を惹起できるか否かを判定するために、ヒトドナーＨＬＡ－Ａ＊０２＋ＰＢＭＣにＥ７タンパク質を圧迫装填し、Ｅ７特異的Ｔ細胞を刺激する能力をＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡによって測定した。
方法
方法
ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のヒトＰＢＭＣを、１０×１０６個／ｍＬの密度に調製し、ＲＰＭＩ １６４０培地中、３２μｇ／ｍｌの組換えＥ７タンパク質（アブカム社）、５０μＭのＥ７．６合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）、または積載なし（空の圧迫）を、６０ｐｓｉで幅４．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して、圧迫処理した。マイクロ流体圧迫デバイスを、氷上で１５分間冷却した後、圧迫処理を行った。圧迫処理後、圧迫装填したＰＢＭＣを遠心分離し、上清を廃棄した。その後、細胞を共培養培地（Ｘ－ＶＩＶＯ １５＋５％ヒト血清）中で二回洗浄した後、新鮮な共培養培地に再懸濁した。
次いで、１．２×１０５個の圧迫装填したＰＢＭＣを、９６ウェルプレート中の３×１０４個のＨＬＡ－Ａ＊０２＋Ｅ７１１－２０レスポンダーＴ細胞（Ｃｅｌｌｅｒｏ社）と共培養した。陽性対照として、０．０２μＭの最小エピトープＥ７１１－２０を、９６ウェルプレート中の未処理のＰＢＭＣおよびレスポンダー細胞に直接添加した（Ｅ７１１－２０ペプチドスパイク）。３７℃、６時間の共培養後、共培養上清を採取した。ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡを製造業者のプロトコールに従って行い、各試料の培養上清中のＩＦＮγの濃度を決定した。
結果
結果
図５に示すように、組換えＥ７タンパク質を圧迫装填して、Ｅ７１１－２０レスポンダーＴ細胞と共培養したヒトＰＢＭＣは、空の圧迫対照と比較してＩＦＮγ産生の増加を生じた。この結果は、全長組換えＥ７タンパク質を圧迫装填したヒトＰＢＭＣが、Ｅ７１１－２０ペプチド特異的Ｔ細胞応答を惹起できることを示す。
実施例６
実施例６
天然またはコドン最適化されたＥ６ ｍＲＮＡから生成されるＥ６タンパク質の量を決定するために、ヒトＰＢＭＣに天然型またはコドン最適化されたＥ６ ｍＲＮＡをそれぞれ圧迫装填し、発現レベルをウェスタンブロットにより測定した。
方法
方法
二つの異なるＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー（２３７および２４６）由来のヒトＰＢＭＣを、２×１０７個／ｍＬの密度に調製し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地中、２５０μｇ／ｍＬの各Ｅ６ ｍＲＮＡ（天然型またはコドン最適化された）を、室温下６０ｐｓｉで幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して圧迫処理した。圧迫処理後、圧迫装填したｈＰＢＭＣを遠心分離し、上清を廃棄した。続いて、細胞を、５％ヒト血清を含有するＸＶＩＶＯ １５培地中で二回洗浄した後、５％ヒト血清を含有する新鮮なＸＶＩＶＯ １５培地に再懸濁した。
次いで、２．５×１０６個の細胞を９６ウェルのＵＬＡプレート内に配し、３７℃で９０分間インキュベートした。 ９０分間のインキュベーション後、細胞を採取し、遠心分離した。細胞可溶化物を作製してウェスタンブロットに使用した。Ｅ６タンパク質の存在を、Ｅ６に対する特異的抗体を用いて検出した。
結果
結果
図６に示されるように、Ｅ６タンパク質は、二つの異なるＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー（２３７および２４６）由来の圧迫装填したＰＢＭＣにおいて、圧迫装填の９０分後に首尾よく検出された。さらに、Ｅ６ ｍＲＮＡのコドン最適化により、天然型Ｅ６ ｍＲＮＡと比較して、ｍＲＮＡ翻訳が増加した。
実施例７
実施例７
コドン最適化されたＥ６ ｍＲＮＡの翻訳の動態を決定するために、ヒトＰＢＭＣに天然型またはコドン最適化された各Ｅ６ ｍＲＮＡを圧迫装填し、２４時間の経時的な発現レベルをウェスタンブロットにより測定した。
方法
方法
二つの異なるＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー（２２４および２３９）由来のヒトＰＢＭＣを、２×１０７個／ｍＬの密度に調製し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地中、２５０μｇ／ｍＬのコドン最適化Ｅ６ ｍＲＮＡを、室温下６０ｐｓｉで幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して圧迫処理した。圧迫処理後、圧迫装填したｈＰＢＭＣを遠心分離し、上清を廃棄した。続いて、細胞を、５％ヒト血清を含有するＸＶＩＶＯ １５培地中で二回洗浄した後、５％ヒト血清を含有する新鮮なＸＶＩＶＯ １５培地に再懸濁した。
次いで、２．５×１０６個の細胞を９６ウェルのＵＬＡプレート内に配し、様々な時点（２時間、６時間、および２４時間）で３７℃でインキュベートした。 各時点後、細胞を採取して遠心分離した。細胞可溶化物を作製してウェスタンブロットに使用した。Ｅ６タンパク質の存在を、Ｅ６に対する特異的抗体を用いて検出した。
結果
結果
図７に示されるように、Ｅ６タンパク質は、この研究で評価した各時点で、二つの異なるＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー（２２４および２３９）由来の、圧迫装填したＰＢＭＣにおいて首尾よく検出された。これらの結果は、コドン最適化を使用して、Ｅ６のｍＲＮＡ翻訳を促進または増強できたことを示す。
実施例８
実施例８
Ｅ７をコードする改変型ｍＲＮＡの送達後のＥ７タンパク質の動態を決定するために、ヒトＰＢＭＣに、免疫プロテアソーム標的化モチーフを有するかまたは有さない天然型またはコドン最適化されたＥ７ ｍＲＮＡのそれぞれを圧迫装填し、６時間の経時的な発現レベルをウェスタンブロットにより測定した。
方法
方法
ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のヒトＰＢＭＣを、２×１０７個／ｍＬの密度に調製し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地中、２５０μｇ／ｍＬの各Ｅ７ ｍＲＮＡ（天然型、Ｄ－ボックス免疫プロテアソーム標的化モチーフ、二つの異なるコドン最適化バージョン）を、室温下６０ｐｓｉで幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して圧迫処理した。圧迫処理後、圧迫装填したｈＰＢＭＣを遠心分離し、上清を廃棄した。続いて、細胞を、５％ヒト血清を含有するＸＶＩＶＯ １５培地中で二回洗浄した後、５％ヒト血清を含有する新鮮なＸＶＩＶＯ １５培地に再懸濁した。
次いで、２．５×１０６個の細胞を９６ウェルのＵＬＡプレート内に配し、３７℃で６時間、インキュベートした。 １時間後および６時間後の時点で、細胞を採取して遠心分離した。細胞可溶化物を作製してウェスタンブロットに使用した。Ｅ７タンパク質の存在を、Ｅ７に対する特異的抗体を用いて検出した。
結果
結果
図８に示されるように、Ｅ７タンパク質は、圧迫装填の１時間後、各試料（天然型、Ｄ－ボックス、コドン最適化バージョン１およびバージョン２）について、ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来の圧迫装填済みＰＢＭＣに首尾よく検出された。さらに、Ｅ７ ｍＲＮＡのコドン最適化により、天然型Ｅ７ ｍＲＮＡと比較して、ｍＲＮＡ翻訳が増加した。さらに、Ｅ７ ｍＲＮＡを含有するＤ－ボックスモチーフは、天然型Ｅ７ ｍＲＮＡと比較して、より速いタンパク質分解を示した。Ｅ７タンパク質は、圧迫装填の６時間後では検出不能であった。
実施例９
実施例９
Ｅ７ ｍＲＮＡを圧迫装填した特定のＨＬＡハプロタイプの免疫細胞が、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導できるか否かを判定するために、ヒトドナーＨＬＡ－Ａ＊０２＋ ＰＢＭＣに、完全長Ｅ７をコードする様々なｍＲＮＡ構築物を圧迫装填し、Ｅ７１１－２０特異的レスポンダーＴ細胞を刺激する能力を、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。
方法
方法
ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のヒトＰＢＭＣを、２×１０７個／ｍＬの密度に調製し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地中、２５０μｇ／ｍＬの様々なＥ７ ｍＲＮＡを、室温下６０ｐｓｉで幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して圧迫処理した。圧迫処理後、圧迫装填したＰＢＭＣを遠心分離し、上清を廃棄した。続いて、細胞を、５％ヒト血清を含有するＸＶＩＶＯ １５培地中で二回洗浄した後、５％ヒト血清を含有するＸＶＩＶＯ １５培地に再懸濁した。
次いで、１．２×１０５個の圧迫装填したＰＢＭＣを、９６ウェルＵＬＡプレート中、Ｃｅｌｌｅｒｏ社より購入した３×１０４個のＥ７１１－２０レスポンダーＴ細胞と共培養した。陽性対照として、２０ｎＭのＥ７１１－２０最小エピトープを、共培養プレート中の未処理のＰＢＭＣおよびレスポンダー細胞に直接添加した（ペプチドスパイク）。プレートを３７℃で６時間または一晩インキュベートし、次いで、製造元の指示に従って展開／定量した。
結果
結果
図９に示されるように、様々なＥ７ ｍＲＮＡ構築物を圧迫装填したＨＬＡ－Ａ＊０２＋ヒトＰＢＭＣにより、６時間の共培養時にＥ７１１－２０特異的レスポンダーＴ細胞によるＩＦＮγ分泌の増加が生じた。さらに、免疫プロテアソーム標的化モチーフ（Ｄ－ボックスＥ７）をさらにコードするかまたはコドン最適化（ＣＯ ｖ１およびＣＯ ｖ２）を施されたＥ７ ｍＲＮＡ構築物は、天然型Ｅ７ ｍＲＮＡ構築物と比較してＩＦＮγ分泌の増加を生じた。これらの結果は、Ｅ７ ｍＲＮＡを圧迫装填したＨＬＡ－Ａ＊０２＋ヒトＰＢＭＣが抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導できること、およびそれがコドン最適化またはＥ７ ｍＲＮＡへの免疫プロテアソーム標的化モチーフの付加によってさらに増強できることを示す。
実施例１０
実施例１０
Ｅ７ ｍＲＮＡを圧迫装填した特定のＨＬＡハプロタイプの免疫細胞が、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導できるか否かを判定するために、ヒトドナーＨＬＡ－Ａ＊０２＋ ＰＢＭＣに、完全長Ｅ７をコードする様々なｍＲＮＡ構築物を圧迫装填し、Ｅ７１１－２０特異的レスポンダーＴ細胞を刺激する能力を、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。
方法
方法
ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のヒトＰＢＭＣを、２×１０７個／ｍＬの密度に調製し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地中、２５０μｇ／ｍＬの様々なＥ７ ｍＲＮＡを、室温下６０ｐｓｉで幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して圧迫処理した。圧迫処理後、圧迫装填したＰＢＭＣを遠心分離し、上清を廃棄した。続いて、細胞を、５％ヒト血清を含有するＸＶＩＶＯ １５培地中で二回洗浄した後、５％ヒト血清を含有するＸＶＩＶＯ １５培地に再懸濁した。
次いで、１．２×１０５個の圧迫装填したＰＢＭＣを、９６ウェルＵＬＡプレート中、Ｃｅｌｌｅｒｏ社より購入した３×１０４個のＥ７１１－２０レスポンダーＴ細胞と共培養した。陽性対照として、２０ｎＭのＥ７１１－２０最小エピトープを、共培養プレート中の未処理のＰＢＭＣおよびレスポンダー細胞に直接添加した（ペプチドスパイク）。プレートを３７℃で６時間または一晩インキュベートし、次いで、製造元の指示に従って展開／定量した。
結果
結果
図１０Ａおよび図１０Ｂに示されるように、様々なＥ７ ｍＲＮＡ構築物（Ｅ７ ＣＯ：コドン最適化Ｅ７ ｍＲＮＡ；ＮＬＳ Ｅ７ ＣＯ：変異型ＮＬＳをさらにコードするコドン最適化Ｅ７ ｍＲＮＡ；ｓｅｃ／ＭＩＴＤ Ｅ７ ＣＯ：ｓｅｃ／ＭＩＴＤ局在化ドメインをさらにコードするコドン最適化Ｅ７ ｍＲＮＡ；Ｃ－ｔｅｒ ＫＥＫＥ Ｅ７ ＣＯ：Ｃ末端ＫＥＫＥ免疫プロテアソーム標的化モチーフをさらにコードするコドン最適化されたＥ７ ｍＲＮＡ；Ｅ７．６ ＳＬＰをコードするｍＲＮＡ、６×Ｅ７．６ ＳＬＰリピートをコードするｍＲＮＡ）を圧迫装填したＨＬＡ－Ａ＊０２＋ヒトＰＢＭＣにより、６時間および一晩の共培養後の両方にＩＦＮγ分泌が検出された。
実施例１１
実施例１１
Ｅ７ ｍＲＮＡを圧迫装填した特定のＨＬＡハプロタイプの免疫細胞が、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導できるか否かを判定するために、ヒトドナーＨＬＡ－Ａ＊０２＋ ＰＢＭＣに、完全長Ｅ７をコードする様々なｍＲＮＡ構築物を圧迫装填し、Ｅ７１１－２０特異的レスポンダーＴ細胞を刺激する能力を、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。
方法
方法
ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のヒトＰＢＭＣを、２×１０７個／ｍＬの密度に調製し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地中、２５０μｇ／ｍＬの様々なＥ７ ｍＲＮＡを、室温下６０ｐｓｉで幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して圧迫処理した。圧迫処理後、圧迫装填したＰＢＭＣを遠心分離し、上清を廃棄した。続いて、細胞を、５％ヒト血清を含有するＸＶＩＶＯ １５培地中で二回洗浄した後、５％ヒト血清を含有するＸＶＩＶＯ １５培地に再懸濁した。
次いで、１．２×１０５個の圧迫装填したＰＢＭＣを、９６ウェルＵＬＡプレート中、Ｃｅｌｌｅｒｏ社より購入した３×１０４個のＥ７１１－２０レスポンダーＴ細胞と共培養した。陽性対照として、２０ｎＭのＥ７１１－２０最小エピトープを、共培養プレート中の未処理のＰＢＭＣおよびレスポンダー細胞に直接添加した（ペプチドスパイク）。プレートを３７℃で６時間または一晩インキュベートし、次いで、製造元の指示に従って展開／定量した。
結果
結果
図１１Ａおよび図１１Ｂに示されるように、様々なＥ７ ｍＲＮＡ構築物を圧迫装填したＨＬＡ－Ａ＊０２＋ヒトＰＢＭＣにより、６時間または一晩の共培養時に、Ｅ７１１－２０特異的レスポンダーＴ細胞によるＩＦＮγ分泌が生じた。さらに、Ｅ７１１－２０特異的Ｔ細胞応答のこの誘導は、様々なＥ７ ｍＲＮＡ構築物を圧迫装填した複数のＨＬＡ－Ａ＊０２＋ヒトＰＢＭＣドナーに一貫して観察することができる。この結果は、Ｅ７ ｍＲＮＡを圧迫装填した異なるＨＬＡ－Ａ＊０２＋ヒトＰＢＭＣが、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導できることを示す。
実施例１２
実施例１２
シグナル２メディエータおよびシグナル３メディエータの共送達が、抗原を圧迫装填した抗原提示細胞によってＴ細胞応答を刺激する能力を増強できるか否かを判定するために、ヒトドナーＨＬＡ－Ａ＊０２＋ＰＢＭＣに、シグナル１、シグナル２、および／またはシグナル３を媒介するエフェクターをコードする異なるｍＲＮＡをそれぞれ圧迫装填した。ＣＤ３＋ＣＤ８＋レスポンダー細胞の活性化を、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を介して測定した。ペプチドにより再刺激された、様々なｍＲＮＡを圧迫装填した細胞の効果を、ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドとインキュベートした細胞（ペプチドスパイク対照）の効果と比較した。
方法
方法
ＣＭＶ＋ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ロイコパックから単離したヒトＰＢＭＣを、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（４９５～５０３ａａ；配列番号８８）に特異的なＣＭＶｐｐ６５四量体により染色して、これらのＰＢＭＣが既存のｐｐ６５特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を有することを決定した。その後、ＰＢＭＣを２×１０７細胞個／ｍＬの密度に調製し、ＣＭＶ ｐｐ６５（シグナル１）をコードするｍＲＮＡ、ＣＤ８６（シグナル２）をコードするｍＲＮＡ、および／または膜結合型インターロイキン－１２（ｍｂＩＬ－１２）（シグナル３）をコードするｍＲＮＡと合わせた。細胞を、Ｃｅｌｌ Ｓｑｕｅｅｚｅ（登録商標）システムおよびチップを用いて、ＲＰＭＩ培地中、室温下６０ｐｓｉで、ｍＲＮＡ（複数可）の存在下、幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して圧迫装填した。空のペイロードにより圧迫処理されて（空の圧迫）１０ｎＭのＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドとさらにインキュベートされたＰＢＭＣを、対照として使用した。以下の濃度および混合物の各ｍＲＮＡを供試した。
例えば、試料Ｇについて、総体積２２５μＬの細胞懸濁液中の細胞に、以下の濃度でｍＲＮＡを圧迫処理した：２５μｇ／ｍＬのＣＭＶ ｐｐ６５ ｍＲＮＡ、２５０μｇ／ｍＬのＣＤ８６ ｍＲＮＡ、および／または２５０μｇ／ｍＬの膜結合型インターロイキン－１２ ｍＲＮＡ。
圧迫処理後、圧迫装填したＰＢＭＣをＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎児血清に移し、３７℃で５日間インキュベートした。インキュベーションの最終日に、得られた細胞を１μｍのＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドにより再刺激するか、または再刺激なしで放置し、それらの活性化および活性を、ＩＣＳを介して測定した。ＣＤ３＋ＣＤ８＋レスポンダー細胞において、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＰＤ－１、およびグランザイムＢを評価した。
結果
結果
細胞内染色によって示されるように、ＣＤ８６またはｍｂＩＬ－１２をコードするｍＲＮＡをそれぞれ圧迫媒介的に送達して２４時間後に、首尾よくＣＤ８６ ｍＲＮＡ（図１２Ａ、Ｂ）およびｍｂＩＬ－１２ ｍＲＮＡ（図１３Ａ、Ｂ）が翻訳された。
図１４は、再刺激せずに抗原特異的Ｔ細胞を活性化した際のｍＲＮＡロードＰＢＭＣに対するＣＭＶ ｐｐ６５ ｍＲＮＡの濃度効果を示す。図１５は、１μＭの抗原の再刺激により抗原特異的Ｔ細胞を活性化した際のｍＲＮＡ装填したＰＢＭＣに対するＣＭＶ ｐｐ６５ ｍＲＮＡｍＲＮＡの濃度効果を示す。図１５に示されるように、ＣＤ３＋ＣＤ８＋レスポンダーに含まれるＩＦＮγ＋ＣＤ４５ＲＯ＋集団の誘導によって示されるように、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの圧迫装填されたｐｐ６５ ｍＲＮＡのすべてで、Ｔ細胞活性化が観察された。どちらの図も、ＣＭＶ ｐｐ６５ ｍＲＮＡがＣＤ８６ ｍＲＮＡおよびｍｂＩＬ－１２ ｍＲＮＡと共に圧迫された際に、よりＩＦＮγ＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞が高いパーセンテージであることを示す。
図１６Ａ～Ｅは、ＩＦＮｇ、ＩＬ－２、ＴＮＦａ、グランザイムＢ、ＰＤ－１の発現によって示されるように、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞が多機能性であったことを示す。シグナル２／３ ｍＲＮＡをコードするｍＲＮＡをＰＢＭＣにさらに導入することにより、抗原単独（すなわち、ｐｐ６５ ｍＲＮＡのみをＰＢＭＣ内に圧迫装填したもの）と比較して、これらの機能性マーカーがさらに上方制御された。
実施例１３
実施例１３
圧迫した細胞に対するＣｐＧ成熟の効果を測定するために、ヒトドナーＨＬＡ－Ａ＊０２＋ＰＢＭＣに、シグナル１、シグナル２、および／またはシグナル３を媒介するエフェクターをコードする異なるｍＲＮＡをそれぞれ圧迫装填した。各ＰＢＭＣ試料について、細胞の半分を、１μＭのＣｐＧ ７９０９により４時間成熟させた。４時間の成熟の終了時に、過剰なＣｐＧ ７９０９を洗浄し、細胞を播種し、３７℃で５日間インキュベートした。５日目に、ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の活性化および活性を、ＩＣＳならびに四量体分析を介して測定した。ＣｐＧ ７９０９により成熟した、様々なｍＲＮＡを圧迫装填した細胞の効果を、空のペイロードを圧迫処理してＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドによりスパイクしたＰＢＭＣの効果、およびＰＭＡ／イオノマイシンにより処理したＰＢＭＣの効果と比較した。
方法
方法
ＣＭＶ＋ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ロイコパックから単離したヒトＰＢＭＣを、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（４９５～５０３ａａ；配列番号８８）に特異的なＣＭＶｐｐ６５四量体により染色して、これらのＰＢＭＣが既存のｐｐ６５特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を有することを決定した。その後、ＰＢＭＣを２×１０７細胞個／ｍＬの密度に調製し、ＣＭＶ ｐｐ６５（シグナル１）、ＣＤ８６（シグナル２）、および／または膜結合型インターロイキン－１２（ｍｂＩＬ－１２）（シグナル３）をコードするｍＲＮＡと組み合わせた。細胞を、Ｃｅｌｌ Ｓｑｕｅｅｚｅ（登録商標）システムおよびチップを用いて、ＲＰＭＩ培地中、室温下６０ｐｓｉで、各ｍＲＮＡの存在下、幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して圧迫処理した。空のペイロードにより処理されて（空の圧迫）１０ｎＭのＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドをさらに有するＰＢＭＣを、対照として使用した。以下の濃度および混合物の各ｍＲＮＡを供試した。
例えば、試料Ｇについて、総体積５００μＬの細胞懸濁液中の細胞に、以下の濃度でｍＲＮＡを圧迫処理した：１０μｇ／ｍＬのＣＭＶ ｐｐ６５ ｍＲＮＡ、２５０μｇ／ｍＬのＣＤ８６ ｍＲＮＡ、および２５０μｇ／ｍＬの膜結合型インターロイキン－１２ ｍＲＮＡ。各試料について、細胞のサブセットを、１μＭのＣｐＧ ７９０９により４時間成熟させ、次いで洗浄して培養した。
細胞をさらに５日間インキュベートした。インキュベーションの最終日に、得られた細胞を１μｍのＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドにより再刺激し、それらの活性化および活性を、ＩＣＳを介して測定した。ＣＤ３＋ＣＤ８＋レスポンダー細胞において、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＰＤ－１、およびグランザイムＢを評価した。
ＩＣＳ評価に加えて、拡大増殖の５日後に、細胞をＣＭＶｐｐ６５四量体により染色して、抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の数を決定した。
結果
結果
細胞内染色によって示されるように、ＣＤ８６またはｍｂＩＬ－１２をコードするｍＲＮＡをそれぞれ圧迫媒介的に送達して２４時間後に、首尾よくＣＤ８６ ｍＲＮＡ（図１７Ａ、図１７Ｂ）およびｍｂＩＬ－１２ ｍＲＮＡ（図１８Ａ、図１８Ｂ）が翻訳された。
図１９は、ＣｐＧ成熟を行う条件およびＣｐＧ成熟を行わない条件下で、ＰＢＭＣにｐｐ６５ならびにＣＤ８６および／またはｍｂＩＬ－１２ ｍＲＮＡを圧迫装填した後、ＣＭＶ ｐｐ６５四量体特異的（ＴＥＴ特異的）ＣＤ３＋ＣＤ８＋レスポンダー細胞の増殖拡大が、ｐｐ６５ ｍＲＮＡのみを圧迫装填したＰＢＭＣと比較して増加したことを示す。 本実施例は、ＣｐＧ成熟がＴｅｔ＋細胞のパーセンテージにわずかな減少をもたらしたが（図１９の上部パネル）、ＣｐＧ成熟のない場合よりもＴｅｔ＋カウントが高かった（図１９の下部パネル）ことを示す。さらに、ＣＤ８６ ｍＲＮＡおよび／またはｍｂＩＬ－１２ ｍＲＮＡの共送達により、ＣＭＶ ｐｐ６５ ｍＲＮＡのみを圧迫処理する場合と比較して、Ｔｅｔ特異的レスポンダー細胞の数とパーセンテージとの両方がさらに増大した。
図２０に示されるように、ＣｐＧ成熟を行う条件および行わない条件下では、シグナル１ ｍＲＮＡのメディエータをコードするｍＲＮＡが、シグナル２および／または３のメディエータをコードするｍＲＮＡと共送達された場合に、ＣＤ３＋ＣＤ８＋レスポンダーに含まれるＩＦＮγ＋ＣＤ４５ＲＯ＋集団の増加によって示される通り、レスポンダーＴ細胞の活性化が増加した。
図２１Ａ～Ｅに示されるように、ＰＢＭＣにｐｐ６５ｍＲＮＡを圧迫装填した際に、抗原なしで圧迫処理されたＰＢＭＣと比較して、Ｔ細胞レスポンダーでは、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＰＤ－１、およびグランザイムＢの機能性マーカーが上方制御された。この結果は、活性化された抗原特異的Ｔ細胞が多機能性であったことを示す。
実施例１４
実施例１４
Ｔ細胞活性化におけるシグナル１、２、または３のメディエータをそれぞれコードする様々なｍＲＮＡの共圧迫処理（同時の圧迫装填）と、複数の異なるＨＬＡハプロタイプに対処するそれらの能力と、結果として生じる増強されたＴ細胞応答とを評価するために、ヒトドナーＨＬＡ－Ａ＊０２＋ＰＢＭＣ（ＨＬＡ－Ａ＊０２＋、ＨＬＡ－Ｂ＊０７＋、ＨＬＡ－Ｂ＊３５＋）に、Ｔ細胞活性化におけるシグナル１、２、または３のメディエータをそれぞれコードするｍＲＮＡの組合せを圧迫装填した。
方法
方法
ＣＭＶ＋ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ロイコパックから単離したヒトＰＢＭＣを、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（４９５～５０３ａａ；配列番号８８）に特異的なＣＭＶｐｐ６５四量体により染色して、これらのＰＢＭＣが既存のｐｐ６５特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を有することを決定した。その後、ＰＢＭＣを４×１０７細胞個／ｍＬの密度に調製し、ＣＭＶ ｐｐ６５（シグナル１）、ＣＤ８６（シグナル２）、膜結合型インターロイキン－２（ｍｂＩＬ－２）、および／または膜結合型インターロイキン－１２（ｍｂＩＬ－１２）（シグナル３）をコードするｍＲＮＡと組み合わせた。細胞を、Ｃｅｌｌ Ｓｑｕｅｅｚｅ（登録商標）システムおよびチップを用いて、ＲＰＭＩ培地中、室温下６０ｐｓｉで、ｍＲＮＡの存在下、幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して圧迫処理した。空のペイロードを圧迫処理して１０ｎＭのＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドによりスパイクしたＰＢＭＣ、および１×ＰＭＡ／イオノマイシンにより処理したＰＢＭＣを、対照として使用した。以下の濃度および混合物の各ｍＲＮＡを供試した。
例えば、試料Ｆについて、総体積５００μＬの細胞懸濁液中の細胞に、以下の濃度でｍＲＮＡを圧迫処理した：５０μｇ／ｍＬのｐｐ６５ ｍＲＮＡ （シグナル１）、２５０μｇ／ｍＬのＣＤ８６、および／または２５０μｇ／ｍＬのｍｂＩＬ－１２ ｍＲＮＡ。次いで、各試料中の細胞を１μＭのＣｐＧ ７９０９により４時間成熟させた後、細胞の一部を洗浄し、次いで４日間凍結保存した。解凍後、それらを５日間の培養に置いて、ＩＣＳ応答を評価した。一部の細胞を、直ちに新鮮に５日間培養して、ＩＣＳ応答を比較した。５日目に、これらの細胞を、三つの異なる条件下で再刺激した：１）ＨＬＡ－Ａ＊０２制限ｐｐ６５最小エピトープ（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ；配列番号８８）、２）ＨＬＡ－Ｂ＊０７制限ｐｐ６５最小エピトープ（ＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ；配列番号８９）、または（３）ＨＬＡ－Ｂ＊３５制限ｐｐ６５最小エピトープ（ＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ、配列番号９０）。抗原特異的応答は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋レスポンダー細胞におけるＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γの発現を評価することにより、ＩＣＳを介して測定されるものとなる。さらに、ｍＲＮＡ発現を、圧迫の２４時間後、ならびに解凍の２４時間後に評価した。
結果
結果
細胞内染色によって示されるように、対応するｍＲＮＡを圧迫媒介的に送達して２４時間後に、首尾よくＣＤ８６ ｍＲＮＡ（図２２Ａ、図２２Ｂ）、ｍｂ－ＩＬ２ ｍＲＮＡ（図２３Ａ、図２３Ｂ）、およびｍｂＩＬ－１２ ｍＲＮＡ（図２４Ａ、図２４Ｂ）が翻訳された。
図２５に示されるように、ＣＤ８６およびｍｂＩＬ２ ｍＲＮＡを圧迫処理したＰＢＭＣ、ならびにＨＬＡ－Ｂ＊０７制限ｐｐ６５最小エピトープの再刺激を伴う条件下および伴わない条件下でＣＤ８６ ｍＲＮＡおよびｍｂＩＬ１２ ｍＲＮＡを圧迫処理したＰＢＭＣに対する、抗原特異的Ｔ細胞レスポンダーの活性化が増強された。さらに、図２６に示されるように、ＨＬＡ－Ｂ＊０７制限ｐｐ６５最小エピトープを用いたペプチド再刺激の例では、ペプチド再刺激を行った群においてＣＤ３＋ＣＤ８＋レスポンダー細胞に含まれるＩＦＮ－γ＋ ＣＤ４５ＲＯ＋集団のパーセンテージが有意に高かったことに示されるように、Ｔ細胞レスポンダー活性化の実質的な増強があった。
これらの抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の多機能性を示すために、ＴＮＦａ産生も細胞内染色によって測定した。再刺激すると、ＴＮＦａ産生ＣＤ８ Ｔ細胞を検出することができた。注目すべきことに、ＰＢＭＣにＣＤ８６ ｍＲＮＡ、ｍｂＩＬ－２ ｍＲＮＡ、および／またはｍｂＩＬ－１２ ｍＲＮＡを圧迫装填した際に、ＴＮＦａのレベルが増加した。
実施例１５
実施例１５
Ｔ細胞活性化におけるＭＨＣシグナル１、２、または３のエフェクターを別々にコードする様々なｍＲＮＡの共圧迫処理（同時の圧迫装填）と、複数の異なるＨＬＡハプロタイプに対処するそれらの能力と、結果として生じる増強された応答とを評価するために、ヒトドナーＨＬＡ－Ａ＊０２＋ＰＢＭＣに、シグナル１、２、または３のメディエータをそれぞれコードするｍＲＮＡの組合せを圧迫装填した。
方法
方法
ＣＭＶ＋ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ロイコパックから単離したヒトＰＢＭＣを、ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（４９５～５０３ａａ；配列番号８８）に特異的なＣＭＶｐｐ６５四量体により染色して、これらのＰＢＭＣが既存のｐｐ６５特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を有することを決定した。その後、ＰＢＭＣを５×１０７細胞個／ｍＬの密度に調製し、ＣＭＶ ｐｐ６５（シグナル１）、ＣＤ８６（シグナル２）、膜結合型インターロイキン－２（ｍｂＩＬ－２）、および／または膜結合型インターロイキン－１２（ｍｂＩＬ－１２）（シグナル３）をコードするｍＲＮＡと組み合わせた。細胞を、Ｃｅｌｌ Ｓｑｕｅｅｚｅ（登録商標）システムおよびチップを用いて、ＲＰＭＩ培地中、室温下６０ｐｓｉで、ｍＲＮＡ（複数可）の存在下、幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して圧迫装填した。１０ｎＭのＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドによりスパイクした空の圧迫処理細胞、および１×ＰＭＡ／イオノマイシンにより処理した細胞を、対照として使用した。以下の濃度および混合物の各ｍＲＮＡを供試した。
例えば、試料Ｈについて、総体積５００μＬの細胞懸濁液中の細胞に、以下の濃度でｍＲＮＡを圧迫処理した：５０μｇ／ｍＬのｐｐ６５ ｍＲＮＡ （シグナル１）、２５０μｇ／ｍＬのＣＤ８６、２５０μｇ／ｍＬのｍｂＩＬ－２ ｍＲＮＡ、および／または２５０μｇ／ｍＬのｍｂＩＬ－１２ ｍＲＮＡ。各試料中の細胞をＲＰＭＩ＋１０％ヒト血清および１μＭのＣｐＧ ７９０９中に収集し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を遠心分離により洗浄し、ＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎児血清中に再懸濁し、３７℃で５日間インキュベートした。
１日目に、フローサイトメトリーによるｍＲＮＡ発現分析用に各試料のアリコートを収集した。ＰＢＭＣ構成細胞組成物は、細胞特異的マーカー（ＣＤ３、ＣＤ１９，ＣＤ１４、およびＣＤ５６）の染色によって画定され、各ＲＮＡの発現は、ＣＤ８６、ＩＬ－２、およびＩＬ－１２の染色によって測定される。
５日目に、１２ウェルの各試料細胞群を播種し、各試料群を、５時間のゴルジストップおよびゴルジプラグの存在下で、Ａ１制限ｐｐ６５エピトープ（ＹＳＥＨＰＴＦＴＳＱＹ；配列番号９１）、Ｂ７制限ｐｐ６５エピトープ（ＲＰＨＥＲＮＧＦＴＶＬ；配列番号８９）、またはＢ７制限ｐｐ６５エピトープ（ＴＰＲＶＴＧＧＧＡＭ；配列番号９０）それぞれにより再刺激した。
次いで、細胞を、ＣＤ３＋ＣＤ８＋レスポンダー細胞における以下の発現について染色した：ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、グランザイムＢ、およびＰＤ－１。
細胞をフローサイトメトリーにより分析し、エピトープ特異的細胞をＩＦＮｇ産生により特定した。
結果
結果
図２７に示されるように、ＣＤ８６、ｍｂＩＬ－２、およびｍｂＩＬ－１２ ＭＦＩ発現を１日目に測定した。これらの結果は、ＰＢＭＣ内に圧迫装填された三つすべてのｍＲＮＡが首尾よく翻訳されたことを示す。
ＣＤ８６、ｍｂＩＬ－２、およびｍｂＩＬ－１２の発現も、１日目に、ＰＢＭＣに含まれるＴ細胞のパーセンテージとして測定した。これらの結果は、総Ｔ細胞の７５％超が、細胞内に圧迫装填されたｍＲＮＡを首尾よく翻訳したことを示す。
図２８に示されるように、膜結合型サイトカインおよび／または共刺激分子を有してｐｐ６５を装填したＰＢＭＣが、いくつかの異なるハプロタイプについて共送達された場合に、Ｔ細胞活性化の増強があり、このことは、Ｔ細胞活性化の増強が、ＨＬＡ－＊Ａ０１、ＨＬＡ－＊Ｂ０７、またはＨＬＡ－＊Ｂ０７レスポンダーＴ細胞それぞれの拡大成長のための各再刺激（ＹＳＥ（Ａ０１）、ＴＰＲ（Ｂ０７）、またはＲＰＨ（Ｂ０７））の存在下で観察されたことに示された通りである。
実施例１６
実施例１６
シグナル２メディエータおよびシグナル３メディエータの共送達が、インフルエンザＭ１抗原を圧迫装填した抗原提示細胞によってＴ細胞応答を刺激する能力を増強できるか否かを判定するために、ヒトドナーＨＬＡ－Ａ＊０２＋ＰＢＭＣに、シグナル１、シグナル２、および／またはシグナル３を媒介するエフェクターをコードする異なるｍＲＮＡをそれぞれ圧迫装填した。ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の活性化および活性を、ＩＣＳおよび四量体分析を介して測定した。ペプチドにより再刺激された、様々なｍＲＮＡを圧迫装填した細胞の効果を、Ｍ１ペプチドとインキュベートした対照ＰＢＭＣ（ペプチドスパイク対照）の効果と比較した。
方法
方法
インフルエンザＭ１＋ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ロイコパックから単離したヒトＰＢＭＣをＭ１四量体により染色して、これらのＰＢＭＣが既存のＭ１特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を有することを決定した。その後、ＰＢＭＣを４×１０７細胞個／ｍＬの密度に調製し、インフルエンザＭ１（シグナル１）、ＣＤ８６（シグナル２）、および／または膜結合型インターロイキン－１２（ｍｂＩＬ－１２）（シグナル３）をコードするｍＲＮＡと組み合わせた。細胞を、Ｃｅｌｌ Ｓｑｕｅｅｚｅ（登録商標）システムおよびチップを用いて、ＲＰＭＩ培地中、室温下６０ｐｓｉで、各ｍＲＮＡ（複数可）の存在下、幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して圧迫処理した。空のペイロードを圧迫処理して１００ｎＭのインフルエンザＭ１ペプチドでスパイクしたＰＢＭＣを、対照として使用した。以下の濃度および混合物の各ｍＲＮＡを供試した。
例えば、試料Ｇについて、総体積２００μＬの細胞懸濁液中の細胞に、以下の濃度でｍＲＮＡを圧迫処理した：５０μｇ／ｍＬのインフルエンザＭ１ ｍＲＮＡ、２５０μｇ／ｍＬのＣＤ８６ ｍＲＮＡ、および／または２５０μｇ／ｍＬのｍｂＩＬ－１２ ｍＲＮＡ。
圧迫処理後、圧迫装填したＰＢＭＣをＲＰＭＩ＋１０％ウシ胎児血清に移し、３７℃で５日間インキュベートした。
インキュベーションの最終日に、得られた細胞を１μＭのインフルエンザＭ１ペプチドにより再刺激し、それらの活性化および活性を、ＩＣＳを介して測定した。ＣＤ３＋ＣＤ８＋レスポンダー細胞において、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＰＤ－１、およびグランザイムＢを評価した。さらに、ＧＩＬＧＦＶＦＴＬペプチド（５８～６６ａａ；配列番号９２）に特異的なインフルエンザＭ１四量体について細胞を染色した。
結果
結果
細胞内染色によって示されるように、各ｍＲＮＡを圧迫媒介的に送達して２４時間後に、首尾よくＣＤ８６ ｍＲＮＡ、ｍｂＩＬ－２ ｍＲＮＡ、およびｍｂＩＬ－１２ ｍＲＮＡ（図２９）が翻訳された。
図３０は、１μＭの抗原再刺激と組み合わせた場合の、抗原特異的Ｔ細胞の活性化に対する、インフルエンザＭ１ ｍＲＮＡを有する圧迫装填されたＰＢＭＣの濃度効果を示す。図３１に示されるように、三つの濃度のインフルエンザＭ１をそれぞれ圧迫装填したＰＢＭＣについて、抗原特異的Ｔ細胞の活性化が観察された。図３０と図３１との両方で、インフルエンザＭ１ ｍＲＮＡがＣＤ８６ ｍＲＮＡおよびｍｂＩＬ－１２ ｍＲＮＡと共送達された場合に、ＣＤ３＋ＣＤ８＋レスポンダー細胞に含まれるＩＦＮγ＋ＣＤ４５ＲＯ＋集団のパーセンテージが高いことが示された。
図３２に示されるように、ＣＤ８６ ｍＲＮＡおよびｍｂＩＬ－２ ｍＲＮＡまたはｍｂＩＬ－１２ ｍＲＮＡとの圧迫の組合せにより、四量体陽性ＣＤ８ Ｔ細胞によって測定した際に、インフルエンザＭ１ ＣＤ８ Ｔ細胞の有意な増殖拡大が生じた。また、ｍｂＩＬ－１２が存在した場合、これらの細胞の抗原非依存的な増殖拡大はなかった。一方、ｍｂＩＬ－２ ｍＲＮＡは、これらの細胞のいくらかの抗原非依存的な増殖拡大をもたらした。
多機能性マーカーについては、グランザイムＢの発現が増加し、ＩＦＮｇ、ＩＬ－２、およびＴＮＦａサイトカインが上方制御され、このことは高い多機能性を示唆している。それらは、抗原単独（すなわち、Ｍ１ ｍＲＮＡ単独）と比較して、ＰＢＭＣ中のシグナル２および３のｍＲＮＡの存在によってさらに上方制御された（データ示さず）。
実施例１７
実施例１７
ＨＰＶ１６ Ｅ６をコードするｍＲＮＡを圧迫装填した特異的ＨＬＡハプロタイプの免疫細胞が、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘導できるか否かを判定するために、ヒトドナーＨＬＡ－Ｂ＊０７＋ＰＢＭＣにＥ６ ｍＲＮＡを圧迫装填した。Ｅ６ ｍＲＮＡを装填したＰＢＭＣによるＨＬＡ－Ｂ＊０７制限Ｅ６特異的Ｔレスポンダー細胞を刺激する能力を、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いて測定した。Ｅ６ ｍＲＮＡを圧迫装填したＰＢＭＣの効果を、未処理対照およびモックを圧迫装填した（空の）対照と比較した。
方法
方法
Ｅ６１５－２４特異的Ｔ細胞を生成するために、ＨＬＡ－Ｂ＊０７トランスジェニックマウスに、Ｅ６１５－２４ペプチドとＢ型肝炎ウイルスコアペプチド（ＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬ；配列番号９３）と不完全フロイントアジュバントとのエマルジョンを、２週間隔で二回３回（プライム／ブースト／ブースト）接種した。最後の接種の一週間後、マウスを安楽死させ、脾臓および流入領域リンパ節を摘出した。組織抽出物を単一の細胞懸濁液に解離させた。次いで、細胞を、Ｅ６１５－２４ペプチドおよびＩＬ－２の存在下、３７℃で６日間培養した。６日後、ＰＢＭＣとの共培養の日まで細胞を凍結保存した。
ＨＬＡ－Ｂ＊０７＋ドナー由来のヒトＰＢＭＣを、５×１０７細胞個／ｍＬの密度に調製し、０．５ｍｇ／ｍｌのＥ６ ｍＲＮＡと組み合わせた。ＰＢＭＣは、Ｃｅｌｌ Ｓｑｕｅｅｚｅ（登録商標）システムおよびチップを用いてＥ６ ｍＲＮＡの存在下、ＲＰＭＩ培地中、６０ｐｓｉで幅３．５ｕｍ、長さ１０ｕｍ、および奥行７０ｕｍの狭窄部を介して圧迫処理した。未処理ＰＢＭＣ（接触なし）およびＥ６ ｍＲＮＡの非存在下で圧迫処理したＰＢＭＣ（空の圧迫）を、陰性対照として使用した。
圧迫処理後、圧迫装填したＰＭＢＣを、１μＭのＣｐＧ ＯＤＮ ２００６を含むＲＰＭＩ＋１０％ヒト血清に移し、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、圧迫装填したＰＢＭＣをＣＴＬ培地＋１％Ｌ－グルタミンで二回洗浄した後、ＣＴＬ培地＋１％Ｌ－グルタミンに再懸濁した。
Ｅ６ ｍＲＮＡを圧迫装填したＰＢＭＣ（Ｅ６ ｍＲＮＡ）、未処理ＰＢＭＣ（接触なし）、モックを圧迫装填したＰＢＭＣ（空の圧迫）、１ｍＭのＥ６１５－２４ペプチドによりスパイクした接触なしＰＢＭＣ（陽性対照）のいずれか５×１０４個を、９６ウェルプレート中、５ ×１０５個のＥ６１５－２４レスポンダーＴ細胞（ＨＬＡ－Ｂ＊０７トランスジェニックマウスにて作製）と共培養した。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、次いで、製造元の指示に従って成長させた。
結果
結果
図３４に示されるように、Ｅ６ ｍＲＮＡを圧迫装填したＨＬＡ－Ｂ＊０７＋ヒトＰＢＭＣは、共培養時のＨＬＡ－Ｂ＊０７ Ｅ６１５－２４特異的Ｔ細胞において、ＩＦＮ－γ応答の増加をもたらし、それはＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおけるＩＦＮ－γスポット形成単位（ＳＦＵ）（図３５）およびＩＦＮ－γ平均スポットサイズ（図３６）の両方の増加によって示される通りであった。ＨＬＡ－Ｂ＊０７ Ｅ６１５－２４特異的Ｔ細胞におけるこれらのＩＦＮγ応答は、Ｅ６ ｍＲＮＡを装填したＰＢＭＣでは、接触なし対照および空の圧迫対照と比較して有意に増加した。これらの結果は、Ｅ６ ｍＲＮＡを圧迫装填したＨＬＡ－Ｂ＊０７＋ＰＢＭＣが、Ｅ６１５－２４エピトープをプロセシングして提示し、ＨＬＡ－Ｂ＊０７制限Ｅ６特異的Ｔ細胞応答を誘導することができることを示す。
実施例１８
実施例１８
Ｅ７ ｍＲＮＡを圧迫装填した免疫細胞の抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発できる時間を決定するために、ヒトドナーＨＬＡ－Ａ＊０２＋ＰＢＭＣにＥ７ ｍＲＮＡを圧迫装填し、様々な長さの時間でインキュベートした後、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡによりＥ７特異的Ｔ細胞を刺激する能力を評価した。
方法
方法
ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のヒトＰＢＭＣを、５×１０７個／ｍＬの密度に調製し、Ｃｅｌｌ Ｓｑｕｅｅｚｅ（登録商標）システムおよびチップを用いて、ＲＰＭＩ １６４０培地中、６０ ｐｓｉで幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して、（ｉ） ０．５ｍｇ／ｍｌのＥ７ ｍＲＮＡ、（ｉｉ） ０．５ｍｇ／ｍｌのＥ６ ｍＲＮＡ、（ｉｉｉ） ０．５ｍｇ／ｍｌのＥ７ ｍＲＮＡおよび０．２５ｍｇ／ｍｌのＥ６ ｍＲＮＡ、（ｉｖ） Ｅ７．６合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）、または（ｖ） 積載なし（空の圧迫）を圧迫装填した。圧迫処理後、圧迫装填したＰＭＢＣを、１μＭのＣｐＧ ＯＤＮ ２００６を含むＲＰＭＩ＋１０％ヒト血清に移し、３７℃で４時間インキュベートした。その後、圧迫装填したＰＢＭＣを共培養培地（Ｘ－ＶＩＶＯ １５＋５％ヒト血清）中で二回洗浄した後、新鮮な共培養培地に再懸濁した。Ｅ７１１－２０レスポンダーＴ細胞（Ｃｅｌｌｅｒｏ社）と直ちに共培養するために、細胞の一部を取り置いて、残りの細胞を凍結保存した。
次いで、３×１０５個の圧迫装填したＰＢＭＣを、９６ウェルプレート中で３×１０４個のＨＬＡ－Ａ＊０２＋Ｅ７１１－２０レスポンダーＴ細胞（Ｃｅｌｌｅｒｏ社）と共培養した。陽性対照として、０．１μＭのＥ７１１－２０ペプチドを、９６ウェルプレート中の未処理のＰＢＭＣおよびレスポンダー細胞に直接添加した。３７℃、１８時間の共培養後、共培養上清を採取した。ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡを製造業者のプロトコールに従って行い、各試料の培養上清中のＩＦＮγの濃度を決定した。
凍結保存した圧迫装填済みのＰＢＭＣを解凍し、８時間、４時間、または０時間、培養に静置してから、Ｅ７１１－２０レスポンダーＴ細胞に添加した。培養して８時間、４時間、または０時間後に、３×１０５個の圧迫装填したＰＢＭＣを、３×１０４個のＨＬＡ－Ａ＊０２＋Ｅ７１１－２０レスポンダーＴ細胞（Ｃｅｌｌｅｒｏ社）と９６ウェルプレート中で共培養した。３７℃、１８時間の共培養後、共培養上清を採取した。ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡを製造業者のプロトコールに従って行い、各試料の培養上清中のＩＦＮγの濃度を決定した。
結果
結果
図３８Ａおよび図３９Ａに示されるように、Ｅ７ ｍＲＮＡを圧迫装填したヒトＰＢＭＣは、Ｅ７ ｍＲＮＡの圧迫装填直後の共培養時に、Ｅ７１１－２０レスポンダーＴ細胞からのＩＦＮ－γ産生によって測定される免疫応答を誘発することができる。図３８Ｂおよび図３９Ｂに示されるように、Ｅ７ ｍＲＮＡを圧迫装填したヒトＰＢＭＣは、Ｅ７１１－２０レスポンダーＴ細胞からのＩＦＮ－γ産生によって測定された際に、圧迫処理後少なくとも８時間にわたって免疫応答を惹起することができる。これらの結果は、Ｅ７ ｍＲＮＡを圧迫装填したＨＬＡ－Ａ＊０２＋ヒトＰＢＭＣが、圧迫処理後少なくとも８時間、Ｅ７特異的Ｔ細胞応答を惹起し得ることを示す。
実施例１９
実施例１９
Ｅ６ ｍＲＮＡを圧迫装填した免疫細胞がＥ６特異的な免疫応答を惹起できるか否かを判定するために、ヒトドナーＨＬＡ－Ａ＊０２＋ＰＢＭＣにＥ６ ｍＲＮＡを圧迫装填し、Ｅ６２９－３８ ＴＣＲ Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴレポーター細胞を刺激する能力を発光により評価した。
方法
方法
レンチウイルスを発現するＥ６２９－３８ ＴＣＲを、内因性ＴＣＲα／βをノックアウトされたＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ細胞（インビボジェン社）に形質導入することによって、Ｅ６ ＴＣＲ Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴレポーター細胞を作製した。これらの細胞は、Ｅ６２９－３８ ＴＣＲと、同族Ｅ６２９－３８エピトープに結合したＭＨＣ－Ｉ（ＨＬＡ－Ａ＊０２制限）との会合を介して活性化され得る、ＮＦＡＴ誘導性Ｌｕｃｉａレポーターを内蔵している。
ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ドナー由来のヒトＰＢＭＣを、４×１０７個／ｍＬの密度に調製し、ＲＰＭＩ １６４０中、室温下６０ ｐｓｉで、幅３．５μｍ、長さ１０μｍ、および奥行７０μｍの狭窄部を介して、（ｉ） ５００μｇ／ｍｌのＥ６ ｍＲＮＡおよび５００μｇ／ｍｌのＥ７ ｍＲＮＡ、（ｉｉ） ＣＤ８６膜結合型ＩＬ－２ （ｍｂＩＬ－２）、および膜結合型ＩＬ－１２ （ｍｂＩＬ－１２）をコードするｍＲＮＡ、（ｉｉｉ） Ｅ６およびＥ７のｍＲＮＡ、ならびにＣＤ８６、ｍｂＩＬ－２、およびｍｂＩＬ－１２をコードするｍＲＮＡ、（ｉｖ） Ｅ６およびＥ７のＳＬＰ、または（ｖ）積載なし（空の圧迫）を圧迫装填した。圧迫処理後、圧迫装填したＰＭＢＣを、１μＭのＣｐＧ ＯＤＮ ２００６を含むＲＰＭＩ＋１０％ヒト血清に移し、３７℃で４時間インキュベートした。その後、圧迫装填したＰＢＭＣを共培養培地（Ｘ－ＶＩＶＯ １５＋５％ヒト血清）中で二回洗浄した後、新鮮な共培養培地に再懸濁した。
次いで、４×１０５個の圧迫装填したＰＢＭＣを、９６ウェルプレート中の１×１０５個のＥ６２９－３８ ＴＣＲ Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ細胞と共培養した。陽性対照として、１μＭのＥ６２９－３８エピトープを、９６ウェルプレート中の未処理のＰＢＭＣおよびＥ６２９－３８ ＴＣＲ Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴ細胞に直接添加した。３７℃で１６～１８時間の共培養後、共培養上清を採取した。製造業者のプロトコールに従って、培養上清を用いてＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ Ｇｏｌｄアッセイ（インビボジェン社）を実施して、ＮＦＡＴ誘導性Ｌｕｃｉａレポーターの活性化による発光を介したＬｕｃｉａルシフェラーゼを測定した。
結果
結果
図４０、図４１Ａ、および図４１Ｂに示されるように、Ｅ６ ｍＲＮＡを圧迫装填してＥ６２９－３８ ＴＣＲ Ｊｕｒｋａｔ－Ｌｕｃｉａ ＮＦＡＴレポーター細胞と共培養したヒトＰＢＭＣは、空の圧迫対照と比較して、ＮＦＡＴ活性化および発光の増加を生じた。この結果は、Ｅ６ ｍＲＮＡを圧迫装填したＨＬＡ－Ａ＊０２＋ヒトＰＢＭＣが、Ｅ６２９－３８免疫応答を惹起することができることを示す。
実施例２０
実施例２０
この研究では、ＨＰＶ１６抗原およびシグナル２／３メディエータをコードするｍＲＮＡを圧迫装填した自己ＰＢＭＣ（ＳＱＺ－ｅＡＰＣ－ＨＰＶ細胞）と共培養した際の、Ｅ７１１－１９ ＴＣＲまたはＥ６２９－３８ ＴＣＲの形質導入ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖拡大を評価した。
方法
方法
ヒトＰＢＭＣをＨＬＡ－Ａ＊０２＋ロイコパックから単離した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、０日目に陰性選択を介して単離した。１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２（Ｒ１０＋ＩＬ－２）を補充したＲ１０（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ウシ胎児血清＋１００Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）の培地を調製した。Ｔ細胞を、室温で５分間、５００ｒｃｆで遠心分離した。上清を吸引し、細胞を細胞濃度２×１０６細胞個／ｍＬでＲ１０＋ＩＬ－２に再懸濁した。抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズを洗浄し、２×１０６個ダイナビーズ／ｍＬのビーズ濃度でＲ１０＋ＩＬ－２に再懸濁した。３ｍＬのＴ細胞および３ｍＬのダイナビーズをフラスコ中で合一し、最終細胞密度および最終ダイナビーズ濃度を１×１０６個／ｍＬに揃えて、３７℃、５％ ＣＯ２で２日間、インキュベーターに置いた。
２日目に、Ｅ７１１－１９ ＴＣＲまたはＥ６２９－３８ ＴＣＲを発現するレンチウイルスのどちらかをＣＤ８＋ Ｔ細胞に形質導入した。Ｘ－ＶＩＶＯ １５ ＋ ５％ヒト血清 ＋ ３００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を含む４０ｍＬのＴ細胞培地を調製した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を採取し、１×１０６細胞個／ｍＬでＴ細胞培地に再懸濁した。２４ウェルプレートでは、５００μＬのＣＤ８＋Ｔ細胞を、５０μＬのＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ、および８４．７μＬのＥ７ ＴＣＲレンチウイルス（１×１０７ＴＵ）または４９．５μＬのＥ６ ＴＣＲレンチウイルス（１×１０７ＴＵ）のどちらかと合わせた。Ｔ細胞培地を各形質導入物に添加し、体積を合計１ｍＬにした。細胞を、３２℃、２，０００ｒｃｆで２時間、遠心分離によりスピノキュレートした。 プレートを３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターに一晩置いた。最初のレンチウイルスの形質導入と同じプロトコールに従って、二番目のレンチウイルス形質導入を３日目に行った。
４日目に、レンチウイルスを除去して、Ｔ細胞をＲ１０＋３００ＩＵ／ｍＬ ＩＬ－２中、１×１０６細胞個／ｍＬで４日間培養した。７日目に、Ｅ７１１－１９五量体およびＥ６２９－３８四量体の染色を実施して、Ｅ６またはＥ７ ＴＣＲを発現する細胞のパーセンテージを決定した（図４２Ａ）。新鮮なＲ１０培地も添加し、細胞濃度を１×１０６細胞個／ｍＬに戻した
次いで、Ｅ７－ＴＣＲまたはＥ６－ＴＣＲを形質導入したＴ細胞を、０．１％のｐｅｎｔ／ｔｅｔ＋ Ｔ細胞の密度で、Ｅ６およびＥ７をコードするｍＲＮＡ、および／またはシグナル２ ｍＲＮＡ（ＣＤ８６ ｍＲＮＡ）／シグナル３ ｍＲＮＡ（ｍｂＩＬ－２およびｍｂＩＬ－１２のｍＲＮＡ）を圧迫処理された自己ＰＢＭＣと合計６日間、共培養した。
８日目に、同じドナー由来のＰＢＭＣを解凍し、以下のスケジュールに従って、四つの群の圧迫装填した自己ＰＢＭＣを調製した。具体的には、ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ培地中、マイクロ流体狭窄（奥行１０μｍ、幅３．５μｍ、および長さ７０μｍ）を用いて、室温下６０ｐｓｉで圧迫処理した。
次に、Ｅ７－ＴＣＲまたはＥ６－ＴＣＲの形質導入Ｔ細胞を、Ｅ６およびＥ７のｍＲＮＡ、ならびに／またはシグナル２メディエータｍＲＮＡ（ＣＤ８６ ｍＲＮＡ）／シグナル３メディエータｍＲＮＡ（ｍｂＩＬ－２およびｍｂＩＬ－１２のｍＲＮＡ）を圧迫処理した自家ＰＢＭＣと、の細胞濃度で共培養した。共培養物を、合計２×１０５個の細胞を含む９６ウェルプレートに播種した。ここで、５×１０４個の細胞を、圧迫処理したＰＢＭＣとし、残りの１．５×１０５個の細胞を、０．１％のＥ６またはＥ７ ＴＣＲ発現Ｔ細胞と未処理の自己ＰＢＭＣとの組合せとした。共培養物を、３７℃、５％ＣＯ２で６日間インキュベートした。
１４日目（共培養開始の６日後）に、Ｅ７１１－１９五量体染色およびＥ６２９－３８四量体染色、ならびに細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を実施した。ＩＣＳについては、ＧｏｌｇｉＰｌｕｇおよびＧｏｌｇｉＳｔｏｐの存在下で、最初に最小エピトープＥ７１１－１９またはＥ６２９－３８のどちらかにより６時間、細胞を再刺激した。次いで、ＩＦＮγ、ＴＦＮα、ＩＬ－２の発現について細胞を染色した。
結果
結果
図４２Ｄ～図４２Ｉに示されるように、両方の共培養セット（Ｅ７ ＴＣＲ Ｔ細胞またはＥ６ ＴＣＲ Ｔ細胞）について、Ｅ６、Ｅ７、ＣＤ８６、ｍｂＩＬ－２、およびｍｂＩＬ－１２のｍＲＮＡ（Ｅ６＋Ｅ７＋シグナル２／３のｍＲＮＡ）を圧迫装填したＰＢＭＣとの共培養では、Ｅ６＋Ｅ７のｍＲＮＡのみまたはシグナル２／３のｍＲＮＡのみを圧迫装填したＰＢＭＣとの共培養と比較して、最も高いパーセンテージのＩＦＮγ産生Ｔ細胞、ＴＮＦ－α産生Ｔ細胞、またはＩＬ－２産生Ｔ細胞が観察された。図４２Ｂおよび図４２Ｃに示されるように、Ｅ７五量体およびＥ６四量体の染色もまたＩＣＳの結果を裏付けており、Ｅ６＋Ｅ７＋シグナル２／３のｍＲＮＡを圧迫装填したＰＢＭＣとの共培養では、Ｅ６＋Ｅ７のｍＲＮＡのみまたはシグナル２／３のｍＲＮＡのみを圧迫装填したＰＢＭＣとの共培養と比較して、Ｅ６四量体＋Ｔ細胞またはＥ７五量体＋Ｔ細胞の最も高い増殖が観察された。
これらの結果は、ＨＰＶ１６ Ｅ６およびＥ７抗原をコードするｍＲＮＡとシグナル２／３メディエータをコードするｍＲＮＡとを圧迫装填したＰＢＭＣが、抗原をコードするｍＲＮＡまたはシグナル２／３メディエーターのみをコードするｍＲＮＡのどちらかを圧迫装填したＰＢＭＣと比較して、より強いＴ細胞の活性化および増殖を刺激することを示すものであった。
実施例２１
実施例２１
この研究では、ＣＭＶ抗原およびシグナル２／３メディエータをコードするｍＲＮＡを圧迫装填したヒトＰＢＭＣ（ＳＱＺ－ｅＡＰＣ－ＣＭＶ細胞）を用いて免疫した後の、ＮＳＧ－（ＫｂＤｂ）ｎｕｌｌ （ＩＡ）ｎｕｌｌマウス（ＮＳＧ ＭＨＣ－Ｉ／ＩＩ ＤＫＯマウス）におけるｐｐ６５特異的ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化および増殖拡大を評価した。
方法
方法
ＨＬＡ－Ａ＊０２＋ロイコパックから単離した凍結保存ヒトＰＢＭＣを解凍し、本試験に使用した。０日目に、８バイアルのＨＬＡ－Ａ＊０２＋ＣＭＶ＋凍結保存ＰＢＭＣを水浴中で解凍した。細胞を含有するバイアルを、室温で１０分間、２００ｒｃｆで遠心分離した。上清を吸引し、約１×１０７細胞個／ｍＬの細胞濃度で細胞をＲ１０（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ウシ胎児血清＋１００ Ｕ／ｍＬペニシリン＋１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン）に再懸濁した。細胞を３７℃で１時間静置し、その後、細胞を室温で５分間、５００ｒｃｆで遠心分離した。上清を吸引し、細胞を２５ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。細胞を、室温で５分間、５００ｒｃｆで遠心分離した。上清を吸引し、細胞を最終細胞濃度１×１０８細胞個／ｍＬでＰＢＳに再懸濁した。
二つの群の圧迫装填したＰＢＭＣを、以下に従って調製した。
ＰＢＭＣを、ＲＰＭＩ培地中、マイクロ流体狭窄（奥行１０μｍ、幅３．５μｍ、および長さ７０μｍ）を用いて、室温下６０ｐｓｉで圧迫処理した。具体的には、ＰＢＭＣに、（１）５００μｇ／ｍＬのｐｐ６５をコードするｍＲＮＡを圧迫装填するか（ｐｐ６５のみ）、または（２）５００μｇ／ｍＬのｐｐ６５をコードするｍＲＮＡと、２５０μｇ／ｍＬのシグナル２メディエータ（ＣＤ８６）をコードするｍＲＮＡ、シグナル３メディエータ（ｍｂＩＬ－２）をコードするｍＲＮＡ、および別のシグナル３メディエータ（ｍｂＩＬ－１２）をコードするｍＲＮＡのそれぞれとを圧迫装填するか（ｅＡＰＣ－ＣＭＶまたはｅＡＰＣ－ｐｐ６５）のいずれかとした。
上記二つの群の圧迫処理細胞をそれぞれ、以下のスケジュールに従って、二つの投与部分集団に分けた。第五の群であるグループＡは、未処理（接触なし）細胞を含む対照群を表す。
表８に示されるように、プライミング（０日目）では、０日目の朝に、全群で群当たり五匹のマウスに、指示量の未処理ＰＢＭＣ（接触なしＰＢＭＣ）を後眼窩（Ｒ．Ｏ．）注射し、０日目の午後に、Ｂ群～Ｅ群について、群当たり五匹のマウスにそれぞれ、指示量の圧迫装填したＰＢＭＣをＲ．Ｏ．注射した。
７日目に、ＰＢＭＣを、上述と同様の手順に従って解凍して圧迫処理し、二つの群の処理済みＰＢＭＣ（ｅＡＰＣ－ＣＭＶ、ｐｐ６５のみ）を、上記表７に従った濃度によるブースト投与のために調製した。
表８に示されるように、ブースト（７日目）では、群当たり５匹のマウスに、Ａ群について指示量の未処理ＰＢＭＣ（接触なしＰＢＭＣ）を、またはＢ群～Ｅ群について指示量の処理済みＰＢＭＣをＲ．Ｏ．注射した。
１２日目に、顎下採血（ＳＭＢ）により、マウスから血液を滅菌ＥＤＴＡバキュテナに採取した。２×表面染色を、以下の比で、ＦＡＣＳ緩衝液中のＨＬＡ－Ａ＊０２ ｐｐ６５四量体（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ；配列番号８８）を用いて実施した：
・ １：２５希釈のマウスＦｃＲブロック
・ １：１００希釈の抗体
・ １：２０希釈のＨＬＡ－Ａ＊０２ ｐｐ６５四量体（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ、配列番号８８）。
・ １：２５希釈のマウスＦｃＲブロック
・ １：１００希釈の抗体
・ １：２０希釈のＨＬＡ－Ａ＊０２ ｐｐ６５四量体（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ、配列番号８８）。
具体的には、１００μＬの全血および１００μＬの２×表面染色液を１４ｍＬのＦＡＣ管に添加し、室温、暗所で３０分間インキュベートした。２ｍＬの１×ＢＤ（商標）ＦＡＣＳ溶解溶液（１：１０希釈、脱イオンＨ２Ｏ）を各管に添加した。次いで、管を穏やかにボルテックスし、暗所、室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞を４００ｒｃｆ、室温で５分間遠心分離した。上清を吸引し、細胞を０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。細胞を、室温で４分間、５００ｒｃｆで再度遠心分離した。上清をデカントし、０．２ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。ｐｐ６５四量体染色を、上述のように試薬を用いて実施した。
１４日目に、マウスを屠殺し、終末時放血によって血液を回収し、脾臓を摘出した。採集した試料を用いて、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）と同様に、ｐｐ６５四量体染色を実施した。脾臓を、１ｍＬのＲ１０培地を含む管に採取した。個々の脾臓を、５０ｍＬの円錐管上の４０μｍセルストレーナ上に配した。注射器からのプランジャーを用いて脾臓をストレーナに通過させた。得られた材料を、冷たいＦＡＣＳ単離緩衝液でストレーナを通過させて洗浄した。次いで、各管をＦＡＣＳ単離緩衝液で１５ｍＬまで充填した。細胞を、室温で５分間、５００ｒｃｆで遠心分離した。上清を吸引し、細胞を０．５ｍＬのＲ１０培地に再懸濁した。
染色前に、ｐｐ６５四量体を４℃で５分間、１４０００ｒｃｆで遠心分離した。２×１０７細胞個／ｍＬの濃度の１００μＬの細胞を、９６ウェルＶ字底プレートに移した。プレートを、室温で４分間、５００ｒｃｆで遠心分離した。上清をデカントし、細胞を２００μＬのＰＢＳで洗浄した。上清をデカントし、ＰＢＳに希釈（１：１０００）した５０μＬのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲを用いて、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔを使用して、細胞を再懸濁した。細胞を暗所、室温で１０分間インキュベートした。ｐｐ６５四量体とＦｃＲブロックミックスとの混合物を、ＦＡＣＳ緩衝液中それぞれ１：２５希釈で調製した。同様に、ＦｃＲブロックのみの混合物を、ＦＡＣＳ緩衝液中１：２５の希釈で調製して、蛍光マイナス１（ＦＭＯ）対照に使用した。細胞を暗所で３０分間インキュベートした。抗体表面染色混合物を、以下に列挙された抗体のそれぞれについて、ＦＡＣＳ緩衝液中１：７５の希釈比で調製した：
抗マウスＣＤ４５
抗ヒトＣＤ４５
抗ヒトＣＤ３
抗ヒトＣＤ８
抗ヒトＣＤ４５ＲＯ。
抗マウスＣＤ４５
抗ヒトＣＤ４５
抗ヒトＣＤ３
抗ヒトＣＤ８
抗ヒトＣＤ４５ＲＯ。
５０μＬの表面染色混合物を、細胞懸濁液に添加し、暗所、室温で１５分間インキュベートした。次いで、５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液を各ウェルに添加した。細胞を、室温で４分間、５００ｒｃｆで遠心分離した。上清をデカントし、細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。細胞を、室温で４分間、５００ｒｃｆで遠心分離した。上清をデカントし、細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。１５０μＬの試料を、１００μＬ／分でＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター上でランした。
ＩＣＳでは、細胞を、（１）再刺激しなかったか、（２）ｐｐ６５最小エピトープにより再刺激したか、または（３）ＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（商標）およびＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標）の存在下で、３７℃、５％のＣＯ２インキュベーターで６時間、１μＭのＰＭＡ／イオノマイシンにより再刺激した。合計６時間の再刺激の後、細胞を９６ウェルＶ字底プレートに移した。細胞を、室温で４分間、５００ｒｃｆで遠心分離した。上清をデカントし、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁した。細胞を、室温で４分間、５００ｒｃｆで遠心分離した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲのＰＢＳ希釈物（１：１０００）をＰＢＳ中に調製した。Ｇｏｌｇｉｐｌｕｇ（商標）（１：５００）およびＧｏｌｇｉｓｔｏｐ（商標）（１：７５０）を添加した。上清をデカントし、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲのＰＢＳ希釈物（１：１０００）とＧｏｌｇｉｐｌｕｇ（商標）とＧｏｌｇｉｓｔｏｐ（商標）との混合物５０μＬに細胞を再懸濁した。細胞を暗所、室温で１０分間インキュベートした。
抗体表面染色混合物を、ヒトＦｃＲブロック（１：５０希釈）とＧｏｌｇｉｐｌｕｇ（商標）（１：５００）とＧｏｌｇｉｓｔｏｐ（商標）（１：７５０）とを用いて、以下に列挙する抗体のそれぞれに対して１：１００希釈比で調製した：
抗マウスＣＤ４５
抗ヒトＣＤ４５
抗ヒトＣＤ３
抗ヒトＣＤ８
抗ヒトＣＤ４５ＲＯ。
抗マウスＣＤ４５
抗ヒトＣＤ４５
抗ヒトＣＤ３
抗ヒトＣＤ８
抗ヒトＣＤ４５ＲＯ。
Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲのＰＢＳ希釈（１：１０００）染色液に加えて、５０μＬの表面抗体染色を添加した。細胞を暗所、室温で１５分間インキュベートした。１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を添加し、細胞を室温で４分間、５００ｒｃｆで遠心分離した。細胞を、２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、室温で４分間、５００ｒｃｆで遠心分離した。上清をデカントし、細胞を１００μＬのＢＤ ＣｙｔｏＦｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍ（商標）固定および透過処理溶液に再懸濁した。細胞を暗所、４Ｃで２０分間インキュベートした。インキュベーション後、１００μＬの１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液を添加した。細胞を、室温で４分間、５００ｒｃｆで遠心分離した。上清をデカントし、細胞を２００μＬの１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液に再懸濁した。細胞を、室温で４分間、５００ｒｃｆで遠心分離した。上清をデカントし、細胞を２００μＬの１×ＢＤ（商標）Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液に再懸濁した。プレートを、４Ｃで一晩インキュベートした。
次いで翌日、細胞をＩＦＮγ、ＴＦＮα、ＩＬ－２の発現について染色した。細胞を、室温で４分間、５００ｃｒｆで遠心分離した。抗体表面染色混合物を、抗ＩＦＮγ、抗ＴＦＮα、または抗ＩＬ－２について１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液中１：１００の希釈比で調製した。細胞を５０μＬの抗体染色混合物に再懸濁した。細胞を暗所、４Ｃで３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１５０μＬの１×Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液を添加し、細胞を室温で４分間、５００ｒｃｆで再び遠心分離した。細胞を２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。１５０μＬの試料を、流速１００μＬ／分でＡｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーター上でランした。
結果
結果
図４３Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅに示されるように、ｅＡＰＣ－ＣＭＶ細胞（ｐｐ６５およびシグナル２／シグナル３メディエータをコードするｍＲＮＡを圧迫装填したＰＢＭＣ）で免疫したマウスでは、未処理ＰＢＭＣ（接触なし）を免疫したマウスと比較して、ｐｐ６５抗原特異的Ｔ細胞の有意な増加があった。図４３Ｅに示されるように、ＮＳＧ ＭＨＣ－Ｉ／ＩＩ ＤＫＯマウスを１×１０６個対５×１０６個のｅＡＰＣ－ＣＭＶ細胞で免疫したときのｐｐ６５四量体＋Ｔ細胞のパーセンテージに用量依存的な増加があった。ｐｐ６５最小エピトープのプールで再刺激した後、ＴＮＦ－α産生Ｔ細胞およびＩＦＮγ産生Ｔ細胞のパーセンテージを測定する際に、同様の用量依存性が観察される（図 ４３ＨおよびＫ）。さらに、５×１０６個のｅＡＰＣ－ＣＭＶ細胞で免疫したマウスは、５×１０６個のｐｐ６５ ｍＲＮＡのみの細胞（ｐｐ６５をコードするｍＲＮＡのみを圧迫装填したＰＢＭＣ）で免疫したマウスと比較して、ｐｐ６５四量体＋細胞のパーセンテージがより高く（図４３Ａ、図４３Ｃ、図４３Ｄ）、またＴＮＦ産生Ｔ細胞およびＩＦＮγ産生Ｔ細胞のパーセンテージがより高い（図４３Ｆ、図４３Ｇ、図４３Ｉ、図４３Ｊ）傾向にあった。全体的に、このデータは、ｐｐ６５、ＣＤ８６、ｍｂＩＬ－２、およびｍｂＩＬ－１２をコードするｍＲＮＡにより圧迫処理したヒトＰＢＭＣが、ｉｎ ｖｉｖｏヒト化マウスモデルにおいて抗原特異的Ｔ細胞を刺激し増殖させることができることを示す。
Claims (288)
- 個体における免疫応答を刺激する方法であって、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、前記有核細胞が、タンパク質またはその断片を含み、前記タンパク質またはその断片が、前記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
- それを必要とする個体にワクチン接種する方法であって、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、前記有核細胞が、タンパク質またはその断片を含み、前記タンパク質またはその断片が、前記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
- 前記タンパク質またはその断片が、一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフをさらに含み、前記タンパク質および前記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフの融合タンパク質を生成する、請求項１または２に記載の方法。
- 個体における免疫応答を刺激する方法であって、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、前記有核細胞が、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、前記タンパク質またはその断片が、前記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
- それを必要とする個体にワクチン接種する方法であって、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、前記有核細胞が、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、前記タンパク質またはその断片が、前記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
- 前記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列が、前記有核細胞における発現のために最適化されたコドンである、請求項４または５に記載の方法。
- 前記ｍＲＮＡが、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする一つまたは複数の核酸配列を含み、前記ｍＲＮＡの翻訳が、前記タンパク質と前記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとの融合タンパク質を生成する、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫プロテアソーム標的化モチーフの非存在下での前記細胞における前記タンパク質の分解および／または前記細胞の表面上の前記タンパク質由来のペプチドの提示と比較して、前記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、前記細胞における前記タンパク質の分解および／または前記細胞の表面上の前記タンパク質由来のペプチドの提示を増強する、請求項３または６に記載の方法。
- 前記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、前記融合タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端にある、請求項８に記載の方法。
- 前記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、破壊ボックス（Ｄ－ボックス）ドメイン、ＫＥＫＥドメイン、および／またはｓｅｃ／ＭＩＴＤドメインである、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基が改変されている、請求項４～１０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基が、ホスホロチオエート残基、シュードウリジン残基、Ｎ１－メチルアデノシン残基、５－メチルシチジン残基、またはモルホリノ残基である、請求項１１に記載の方法。
- 個体における免疫応答を刺激する方法であって、有核細胞を含む組成物の有効量を個体に投与することを含み、前記有核細胞が、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含み、前記二つ以上の抗原が、個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
- それを必要とする個体にワクチン接種する方法であって、有核細胞を含む有効量の組成物を個体に投与することを含み、前記有核細胞が、タンパク質由来の二つ以上の抗原を含み、前記二つ以上の抗原が、前記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、方法。
- 前記細胞が、前記タンパク質に由来する三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十またはそれ以上の抗原を含む、請求項１３または１４に記載の方法。
- 前記抗原のうちの少なくとも二つが、部分的に重複するアミノ酸配列を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
- すべての前記抗原を組み合わせたアミノ酸配列が、前記タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上重複している、請求項１６に記載の方法。
- 前記抗原が、前記タンパク質の二つ以上のエピトープを含むポリペプチドである、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原が、前記タンパク質の一つまたは複数のエピトープと一つまたは複数の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 一つまたは複数のエピトープが、Ｎ末端および／またはＣ末端で一つまたは複数の異種ペプチド配列に隣接する、請求項１３～１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチド配列が、免疫原性合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）に由来する、請求項２０に記載の方法。。
- 前記Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチドが、疾患関連免疫原性ＳＬＰに由来する、請求項２１に記載の方法。
- 前記タンパク質が、がんに関連する変異タンパク質、癌遺伝子産物、ネオ抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
- 個体における免疫応答の刺激が、がん、感染症、またはウイルス関連疾患の治療に使用される、請求項１、３、４、６～１３、１５～２３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルス関連疾患が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に関連する疾患である、請求項２４に記載の方法。
- 前記タンパク質が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＨＰＶが、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である、請求項２６に記載の方法。
- 前記タンパク質が、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である、請求項２６または２７に記載の方法。
- 前記タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＨＢＶタンパク質が、コアタンパク質、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、ｅ抗原、Ｘ抗原、またはポリメラーゼタンパク質である、請求項２９に記載の方法。
- 前記組成物が、アジュバントをさらに含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、アジュバントと併せて投与される、請求項１～３１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、請求項３１または３２に記載の方法。
- 前記タンパク質またはその断片を含む前記有核細胞が、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの前記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット有核細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット有核細胞を前記タンパク質またはその断片とインキュベートして、前記タンパク質またはその断片が前記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、前記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を生成することにより調製される、請求項１～３および２３～３３のいずれか一項に記載の方法。 - 前記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む前記有核細胞が、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの前記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット有核細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット有核細胞を、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡとインキュベートして、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡが前記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡを含む有核細胞を生成することにより調製される、請求項４～１１のいずれか一項に記載の方法。 - 二つ以上の抗原を含む前記有核細胞が、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記二つ以上の抗原が通過するのに十分な大きさの前記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット有核細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット有核細胞を二つ以上の抗原とインキュベートして、前記二つ以上の抗原が前記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、二つ以上の抗原を含む有核細胞を生成することにより調製される、請求項１２～３３のいずれか一項に記載の方法。 - （ａ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部を通過させる前、間、および／もしくは後に、前記有核細胞を前記タンパク質またはその断片と共にインキュベートすること、
（ｂ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部を通過させる前、間、および／もしくは後に、前記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡと共に前記有核細胞をインキュベートすること、または
（ｃ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部を通過させる前、間、および／もしくは後に、前記有核細胞を前記二つ以上の抗原と共にインキュベートすること、を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。 - （ａ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部を通過させる前に、前記有核細胞を前記タンパク質またはその断片と共にインキュベートすること、
（ｂ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部を通過させる前に、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡと共に前記有核細胞をインキュベートすること、または
（ｃ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部を通過させる前に、前記有核細胞を前記二つ以上の抗原と共にインキュベートすること、を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。 - 前記狭窄部の幅が、前記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記狭窄部の幅が、約３．０μｍ～約４．２μｍ、または約３．０μｍ～約４．８μｍ、または約３．０μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、請求項３４～３９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、請求項３４～４０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記狭窄部の幅が、約４．５μｍまたは約４．０μｍである、請求項３４～４１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のインプット有核細胞を含む前記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、前記複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置されている、請求項３４～４２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有核細胞が、前記個体に対して自己または同種である、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有核細胞が免疫細胞である、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有核細胞が、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項１～４５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のＰＢＭＣが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む、請求項４６に記載の方法。
- 前記有核細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有核細胞が、アジュバントにより馴化されて、馴化細胞を形成する、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有核細胞が、前記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、アジュバントとインキュベートされる、請求項４９に記載の方法。
- 前記有核細胞が、前記タンパク質もしくはその断片、または前記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを前記有核細胞に導入する前または後に馴化される、請求項４９または５０に記載の方法。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、請求項４９～５１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、請求項４８～５１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧ ７９０９である、請求項４９～５３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記馴化細胞が、馴化された複数のＰＢＭＣである、請求項４９～５４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するように改変されている、請求項５５に記載の方法。
- 前記共刺激分子が、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２である、請求項５６に記載の方法。
- 前記共刺激分子がＣＤ８６である、請求項５６に記載の方法。
- 前記複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数のサイトカインの発現が増加するように改変されている、請求項５５～５８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のＰＢＭＣが、キメラ膜結合型サイトカインを含むように改変されている、請求項５５～５９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キメラ膜結合型サイトカインが、前記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である、請求項６０に記載の方法。
- 前記サイトカインが、ペプチドリンカーによって前記膜貫通ドメインに結合されている、請求項６１に記載の方法。
- 前記ペプチドリンカーが、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である、請求項６２に記載の方法。
- 前記サイトカインが、Ｉ型サイトカインである、請求項５９～６３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである、請求項５９～６４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サイトカインが、ＩＬ－２もしくはその機能的バリアント、および／またはＩＬ－１２もしくはその機能的バリアントである、請求項６５に記載の方法。
- 前記キメラ膜結合型サイトカインが、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む、請求項６０～６５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数のサイトカインおよび／または一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するように改変されている、請求項５６～６７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、前記複数のＰＢＭＣが、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記タンパク質またはその断片と、一つまたは複数のサイトカインをコードする一つまたは複数のｍＲＮＡと、一つまたは複数の共刺激分子をコードする一つまたは複数のｍＲＮＡとが通過するのに十分な大きさの前記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット有核細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット有核細胞を、前記タンパク質またはその断片とインキュベートして、前記タンパク質もしくはその断片、一つもしくは複数のサイトカインをコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡが前記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、前記ｍＲＮＡが発現し、それによって、前記タンパク質もしくはその断片、前記一つもしくは複数のサイトカイン、および／または前記一つもしくは複数の共刺激分子を含む有核細胞を生成することを含むプロセスによって調製される、請求項６８に記載の方法。 - 前記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、前記複数のＰＢＭＣが、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡと、一つまたは複数のサイトカインをコードする一つまたは複数のｍＲＮＡと、一つまたは複数の共刺激分子をコードする一つまたは複数のｍＲＮＡとが通過するのに十分な大きさの前記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット有核細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット有核細胞を、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡとインキュベートして、前記タンパク質もしくはその断片をコードする前記ｍＲＮＡ、一つもしくは複数のサイトカインをコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡが前記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、前記ｍＲＮＡが発現し、それによって、前記タンパク質もしくはその断片、前記一つもしくは複数のサイトカイン、および／または前記一つもしくは複数の共刺激分子を含む有核細胞を生成することを含むプロセスによって調製される、請求項６８に記載の方法。 - 前記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、前記複数のＰＢＭＣが、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記二つ以上の抗原と、一つまたは複数のサイトカインをコードする一つまたは複数のｍＲＮＡと、一つまたは複数の共刺激分子をコードする一つまたは複数のｍＲＮＡとが通過するのに十分な大きさの前記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット有核細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット有核細胞を、前記二つ以上の抗原、一つもしくは複数のサイトカインをコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートして、前記二つ以上の抗原、一つもしくは複数のサイトカインをコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡが前記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、前記ｍＲＮＡが発現し、それによって、二つ以上の抗原、前記一つもしくは複数のサイトカイン、および／または前記一つもしくは複数の共刺激分子を含む有核細胞を生成することを含むプロセスによって調製される、請求項６８に記載の方法。 - （ａ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記有核細胞を前記タンパク質もしくはその断片、一つもしくは複数のサイトカインをコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすること、
（ｂ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記有核細胞を前記タンパク質もしくはその断片をコードする前記ｍＲＮＡ、一つもしくは複数のサイトカインをコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすること、または
（ｃ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記有核細胞を前記二つ以上の抗原、一つもしくは複数のサイトカインをコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすることを含む、請求項６９～７１のいずれか一項に記載の方法。 - （ａ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記有核細胞を前記タンパク質もしくはその断片、一つもしくは複数のサイトカインをコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすること、
（ｂ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記有核細胞を前記タンパク質もしくはその断片をコードする前記ｍＲＮＡ、一つもしくは複数のサイトカインをコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすること、または
（ｃ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記有核細胞を前記二つ以上の抗原、一つもしくは複数のサイトカインをコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすることを含む、請求項６９～７１のいずれか一項に記載の方法。 - 一つまたは複数の共刺激分子が、前記馴化されていない複数のＰＢＭＣ中のＢ細胞と比較して、馴化された複数のＰＢＭＣのＢ細胞では上方制御されており、前記共刺激分子が、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６である、請求項５５～７３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のＰＢＭＣが、複数の馴化されていないＰＢＭＣと比較して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が増加している、請求項５５～７４のいずれか一項に記載の方法。
- ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が、前記複数の馴化されていないＰＢＭＣと比較して、約１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、または１０倍を超えて増加している、請求項７５に記載の方法。
- 有核細胞を含む前記組成物が、複数回投与される、請求項１～７６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、静脈内に投与される、請求項１～７７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記個体がヒトである、請求項１～７８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記組成物が、別の療法の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与される、請求項１～７９のいずれか一項に記載の方法。
- 別の療法が、免疫腫瘍療法で使用される化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、または二重特異性ポリペプチドである、請求項８０に記載の方法。
- 有核細胞を含む組成物であって、前記有核細胞が、タンパク質またはその断片を含み、前記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、組成物。
- 前記タンパク質またはその断片が、一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフをさらに含み、前記タンパク質と前記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとの融合タンパク質を生成する、請求項８２に記載の組成物。
- 有核細胞を含む組成物であって、前記有核細胞が、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含み、前記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、組成物。
- 前記ｍＲＮＡのヌクレオチド配列が、前記有核細胞における発現のために最適化されたコドンである、請求項８４に記載の組成物。
- 前記ｍＲＮＡが、免疫プロテアソーム標的化モチーフをコードする一つまたは複数の核酸配列を含み、前記ｍＲＮＡの翻訳が、前記タンパク質と前記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフとの融合タンパク質を生成する、請求項８４または８５に記載の組成物。
- 免疫プロテアソーム標的化モチーフの非存在下での前記細胞における前記タンパク質の分解および／または前記細胞の表面上の前記タンパク質由来のペプチドの提示と比較して、前記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、前記細胞における前記タンパク質の分解および／または前記細胞の表面上の前記タンパク質由来のペプチドの提示を増強する、請求項８３または８６に記載の組成物。
- 前記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、前記融合タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端にある、請求項８７に記載の組成物。
- 前記一つまたは複数の免疫プロテアソーム標的化モチーフが、破壊ボックス（Ｄ－ボックス）ドメイン、ＫＥＫＥドメイン、および／またはｓｅｃ／ＭＩＴＤドメインである、請求項８６～８８に記載の組成物。
- 前記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基が改変されている、請求項８４～８９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ｍＲＮＡの一つまたは複数の残基が、ホスホロチオエート残基、シュードウリジン残基、Ｎ１－メチルアデノシン残基、５－メチルシチジン残基、またはモルホリノ残基である、請求項９０に記載の組成物。
- 有核細胞を含む組成物であって、前記有核細胞が、二つ以上の抗原を含み、前記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、組成物。
- 前記細胞が、前記タンパク質に由来する三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十またはそれ以上の抗原を含む、請求項９２に記載の組成物。
- 前記抗原のうちの少なくとも二つが、部分的に重複するアミノ酸配列を含む、請求項９２または９３に記載の組成物。
- すべての前記抗原を組み合わせたアミノ酸配列が、前記タンパク質のアミノ酸配列と約９０％以上重複している、請求項９４に記載の組成物。
- 抗原が、前記タンパク質の二つ以上のエピトープを含むポリペプチドである、請求項９２～９５のいずれか一項に記載の組成物。
- 抗原が、前記タンパク質の一つまたは複数のエピトープと一つまたは複数の異種ペプチド配列とを含むポリペプチドである、請求項９２～９６のいずれか一項に記載の組成物。
- 一つまたは複数のエピトープが、Ｎ末端および／またはＣ末端で一つまたは複数の異種ペプチド配列に隣接する、請求項９２～９７のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチド配列が、免疫原性合成長鎖ペプチド（ＳＬＰ）に由来する、請求項９８に記載の組成物。
- 前記Ｎ末端および／またはＣ末端隣接ポリペプチドが、疾患関連免疫原性ＳＬＰに由来する、請求項９９に記載の組成物。
- 前記タンパク質が、がんに関連する変異タンパク質、癌遺伝子産物、ネオ抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である、請求項８２～１００のいずれか一項に記載の組成物。
- 個体における免疫応答の刺激が、がん、感染症、またはウイルス関連疾患の治療に使用される、請求項８２～１０１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ウイルス関連疾患が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、単純ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ－１）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－２）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ－６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ－７）、ヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ－８）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に関連する疾患である、請求項１０２に記載の組成物。
- タンパク質が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である、請求項８２～１０３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ＨＰＶが、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である、請求項１０４に記載の組成物。
- 前記タンパク質が、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である、請求項１０４または１０５に記載の組成物。
- 前記タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である、請求項８２～１０３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ＨＢＶタンパク質が、コアタンパク質、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、ｅ抗原、Ｘ抗原、またはポリメラーゼタンパク質である、請求項１０７に記載の組成物。
- 前記組成物が、アジュバントをさらに含む、請求項８２～１０８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、請求項１０９に記載の組成物。
- 前記タンパク質またはその断片を含む前記有核細胞が、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの前記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット有核細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット有核細胞を前記タンパク質またはその断片とインキュベートして、前記タンパク質またはその断片が前記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、前記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を生成することにより調製される、請求項８２および１０１～１１０のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む前記有核細胞が、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの前記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット有核細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット有核細胞を、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡとインキュベートして、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡが前記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡを含む有核細胞を生成することにより調製される、請求項８４～９１および１０１～１１０のいずれか一項に記載の組成物。 - 二つ以上の抗原を含む前記有核細胞が、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記二つ以上の抗原が通過するのに十分な大きさの前記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット有核細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット有核細胞を前記二つ以上の抗原とインキュベートして、前記二つ以上の抗原が前記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、二つ以上の抗原を含む有核細胞を生成することにより調製される、請求項９２～１１０のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記有核細胞を調製するプロセスが、
（ａ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、前記有核細胞を前記タンパク質またはその断片と共にインキュベートすること、
（ｂ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡと共に前記有核細胞をインキュベートすること、または
（ｃ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、前記有核細胞を前記二つ以上の抗原と共にインキュベートすること、を含む、請求項１１１～１１３のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記有核細胞を調製するプロセスが、
（ａ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記有核細胞を前記タンパク質またはその断片と共にインキュベートすること、
（ｂ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡと共に前記有核細胞をインキュベートすること、または
（ｃ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記有核細胞を前記二つ以上の抗原と共にインキュベートすること、を含む、請求項１１１～１１３のいずれか一項に記載の方法。 - 前記狭窄部の幅が、前記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、請求項１１１～１１５のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記狭窄部の幅が、約３．０μｍ～約４．２μｍ、または約３．０μｍ～約４．８μｍ、または約３．０μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、請求項１１１～１１６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、請求項１１１～１１７のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記狭窄部の幅が、約４．５μｍまたは約４．０μｍである、請求項１１１～１１８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数のインプット有核細胞を含む前記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、前記複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置されている、請求項１１１～１１９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記有核細胞が、前記個体に対して自己または同種である、請求項８２～１２０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記有核細胞が免疫細胞である、請求項８２～１２１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記有核細胞が、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項８２～１２２のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数のＰＢＭＣが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む、請求項１２３に記載の組成物。
- 前記有核細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である、請求項８２～１２４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記有核細胞が、アジュバントにより馴化されて、馴化細胞を形成する、請求項８２～１２５のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記有核細胞が、前記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、アジュバントとインキュベートされる、請求項１２６に記載の組成物。
- 前記有核細胞が、前記タンパク質もしくはその断片、または前記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを前記有核細胞に導入する前または後に馴化される、請求項１２６または１２７に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、請求項１２６～１２８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、請求項１２６～１２９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧ ７９０９である、請求項１２６～１３０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記馴化細胞が、馴化された複数のＰＢＭＣである、請求項１２６～１３１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するように改変されている、請求項１３２に記載の組成物。
- 前記共刺激分子が、Ｂ７－Ｈ２（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＬ１Ａ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＩＭ４、ＳＬＡＭ、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、またはＣＤ１１２である、請求項１３３に記載の組成物。
- 前記共刺激分子がＣＤ８６である、請求項１３４に記載の組成物。
- 複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数のサイトカインの発現が増加するように修飾される、請求項１３２～１３５のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数のＰＢＭＣが、キメラ膜結合型サイトカインを含むように改変されている、請求項１３２～１３６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記キメラ膜結合型サイトカインが、前記サイトカインと膜貫通ドメインとを含む融合タンパク質である、請求項１３７に記載の組成物。
- 前記サイトカインが、ペプチドリンカーによって前記膜貫通ドメインに結合されている、請求項１３８に記載の組成物。
- 前記ペプチドリンカーが、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である、請求項１３９に記載の組成物。
- 前記サイトカインが、Ｉ型サイトカインである、請求項１３６～１４０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである、請求項１３６～１４１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記サイトカインが、ＩＬ－２もしくはその機能的バリアント、および／またはＩＬ－１２もしくはその機能的バリアントである、請求項１４２に記載の方法。
- 前記キメラ膜結合型サイトカインが、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む、請求項１３７～１４３のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数のＰＢＭＣが、一つまたは複数のサイトカインおよび／または一つまたは複数の共刺激分子の発現が増加するように改変されている、請求項１３３～１４４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、前記複数のＰＢＭＣが、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記タンパク質またはその断片と、一つまたは複数のサイトカインをコードする一つまたは複数のｍＲＮＡと、一つまたは複数の共刺激分子をコードする一つまたは複数のｍＲＮＡとが通過するのに十分な大きさの前記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット有核細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット有核細胞を、前記タンパク質またはその断片とインキュベートして、前記タンパク質もしくはその断片、一つもしくは複数のサイトカインをコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡが前記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、前記ｍＲＮＡが発現し、それによって、前記タンパク質もしくはその断片、前記一つもしくは複数のサイトカイン、および／または前記一つもしくは複数の共刺激分子を含む有核細胞を生成することを含むプロセスによって調製される、請求項１４５に記載の組成物。 - 前記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、前記複数のＰＢＭＣが、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡと、一つまたは複数のサイトカインをコードする一つまたは複数のｍＲＮＡと、一つまたは複数の共刺激分子をコードする一つまたは複数のｍＲＮＡとが通過するのに十分な大きさの前記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット有核細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット有核細胞を、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡとインキュベートして、前記タンパク質もしくはその断片をコードする前記ｍＲＮＡ、一つもしくは複数のサイトカインをコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡが前記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、前記ｍＲＮＡが発現し、それによって、前記タンパク質もしくはその断片、前記一つもしくは複数のサイトカイン、および／または前記一つもしくは複数の共刺激分子を含む有核細胞を生成することを含むプロセスによって調製される、請求項１４５に記載の組成物。 - 前記複数のＰＢＭＣが、一つもしくは複数のサイトカインおよび／または一つもしくは複数の共刺激分子の発現の増加を含み、前記複数のＰＢＭＣが、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記二つ以上の抗原と、一つまたは複数のサイトカインをコードする一つまたは複数のｍＲＮＡと、一つまたは複数の共刺激分子をコードする一つまたは複数のｍＲＮＡとが通過するのに十分な大きさの前記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット有核細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット有核細胞を、前記二つ以上の抗原、一つもしくは複数のサイトカインをコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートして、前記二つ以上の抗原、一つもしくは複数のサイトカインをコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする一つもしくは複数のｍＲＮＡが前記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、前記ｍＲＮＡが発現し、それによって、二つ以上の抗原、前記一つもしくは複数のサイトカイン、および／または前記一つもしくは複数の共刺激分子を含む有核細胞を生成することを含むプロセスによって調製される、請求項１４５に記載の組成物。 - 前記複数のＰＢＭＣを調製するプロセスが、
（ａ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記複数のＰＢＭＣを前記タンパク質もしくはその断片、一つもしくは複数のサイトカインをコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすること、
（ｂ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記複数のＰＢＭＣを、前記タンパク質もしくはその断片をコードする前記ｍＲＮＡ、一つもしくは複数のサイトカインをコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすること、または
（ｃ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記複数のＰＢＭＣを前記二つ以上の抗原、一つもしくは複数のサイトカインをコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすることを含む、請求項１４６～１４８のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記複数のＰＢＭＣを調製するプロセスが、
（ａ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記複数のＰＢＭＣを前記タンパク質もしくはその断片、一つもしくは複数のサイトカインをコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすること、
（ｂ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記複数のＰＢＭＣを、前記タンパク質もしくはその断片をコードする前記ｍＲＮＡ、一つもしくは複数のサイトカインをコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすること、または
（ｃ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記複数のＰＢＭＣを前記二つ以上の抗原、一つもしくは複数のサイトカインをコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡ、および／または一つもしくは複数の共刺激分子をコードする前記一つもしくは複数のｍＲＮＡとインキュベートすることを含む、請求項１４６～１４８のいずれか一つに記載の組成物。 - 一つまたは複数の共刺激分子が、前記馴化されていない複数のＰＢＭＣ中のＢ細胞と比較して、馴化された複数のＰＢＭＣのＢ細胞では上方制御されており、前記共刺激分子が、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６である、請求項１３２～１５０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数のＰＢＭＣが、複数の馴化されていないＰＢＭＣと比較して、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が増加している、請求項１３２～１５１に記載の組成物。
- ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１β、ＩＰ－１０、またはＴＮＦ－αのうちの一つまたは複数の発現が、前記複数の馴化されていないＰＢＭＣと比較して、約１．２倍、１．５倍、１．８倍、２倍、３倍、４倍、５倍、８倍、または１０倍を超えて増加している、請求項１５２に記載の組成物。
- 個体における免疫応答を刺激するための組成物であって、有効量の請求項８２～１５３のいずれか一項に記載の組成物を含み、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、組成物。
- 医薬として使用するための組成物であって、有効量の請求項８２～１５３のいずれか一項に記載の組成物を含む、組成物。
- 個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための組成物であって、有効量の請求項８２～１５３のいずれか一項に記載の組成物を含む、組成物。
- 前記組成物が、アジュバントをさらに含む、請求項１５４～１５６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、アジュバントと併せて投与される、請求項１５４～１５７のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、請求項１５７または１５８に記載の組成物。
- 有核細胞を含む前記組成物が、複数回投与される、請求項１５７～１５９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記組成物が、静脈内に投与される、請求項１５７～１６０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記個体がヒトである、請求項１５７～１６１のいずれか一項に記載の組成物。
- 別の療法の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与される、請求項１５７～１６２のいずれか一項に記載の組成物。
- 別の療法が、免疫腫瘍療法で使用される、化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、又は二重特異性ポリペプチドである、請求項１６３に記載の組成物。
- 個体における免疫応答を刺激するための医薬の製造における組成物の使用であって、有効量の請求項８２～１５３のいずれか一項に記載の組成物を含み、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、使用。
- 個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための医薬の製造における組成物の使用であって、前記組成物が、有効量の請求項８２～１５３のいずれか一項に記載の組成物を含む、使用。
- 前記組成物が、アジュバントをさらに含む、請求項１６５または１６６に記載の組成物。
- 前記組成物が、アジュバントと併せて投与するために製剤化される、請求項１６５～１６７のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、アルファ－ガラクトシルセラミド、ＳＴＩＮＧアゴニスト、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、請求項１６７または１６８に記載の使用。
- 有核細胞を含む前記組成物が、複数回投与される、請求項１６７～１６９のいずれか一項に記載の使用。
- 前記組成物が、静脈内に投与される、請求項１６７～１７０のいずれか一項に記載の使用。
- 前記個体がヒトである、請求項１６７～１７１のいずれか一項に記載の使用。
- 前記組成物が、別の療法の投与前に、投与と同時に、または投与後に投与される、請求項１６７～１７２のいずれか一項に記載の使用。
- 別の療法が、免疫腫瘍療法で使用される化学療法、放射線療法、抗体、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、または二重特異性ポリペプチドである、請求項１７３に記載の使用。
- 請求項１～８１のいずれか一項に記載の方法で使用するためのキット。
- 請求項８２～１５３のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
- 緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、または前記組成物を個体に投与してＨＬＡ非依存的な様式で免疫応答を刺激するための指示を伴う添付文書のうちの一つまたは複数をさらに含む、請求項１７５または１７６に記載のキット。
- タンパク質またはその断片を含む有核細胞を作製する方法であって、前記タンパク質またはその断片を前記有核細胞に導入することを含み、前記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、方法。
- タンパク質またはその断片を含む有核細胞を作製する方法であって、前記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを前記有核細胞に導入することを含み、前記ｍＲＮＡが、発現されて前記タンパク質またはその断片を産生し、前記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、方法。
- タンパク質由来の二つ以上の抗原を含む有核細胞を作製する方法であって、前記二つ以上の抗原を前記有核細胞に導入することを含み、前記タンパク質またはその断片が、ＨＬＡ非依存的な様式で個体における免疫応答を刺激する、方法。
- 前記タンパク質またはその断片を前記有核細胞内に導入することが、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記タンパク質またはその断片が通過するのに十分な大きさの前記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット有核細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット有核細胞を前記タンパク質またはその断片とインキュベートして、前記タンパク質またはその断片が前記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、前記タンパク質またはその断片を含む有核細胞を生成することを含む、請求項１７８に記載の方法。 - 前記タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡを含む前記有核細胞が、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡが通過するのに十分な大きさの前記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット有核細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット有核細胞を、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡとインキュベートして、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡが前記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡを含む有核細胞を生成することにより調製される、請求項１７９に記載の方法。 - 二つ以上の抗原を含む前記有核細胞が、
ａ）インプット有核細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記二つ以上の抗原が通過するのに十分な大きさの前記インプット有核細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット有核細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット有核細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット有核細胞を前記二つ以上の抗原とインキュベートして、前記二つ以上の抗原が前記摂動インプット有核細胞に入ることを可能とし、それによって、二つ以上の抗原を含む有核細胞を生成することにより調製される、請求項１８０に記載の方法。 - （ａ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、前記有核細胞を前記タンパク質またはその断片と共にインキュベートすること、
（ｂ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡと共に前記有核細胞をインキュベートすること、または
（ｃ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／もしくは後に、前記有核細胞を前記二つ以上の抗原と共にインキュベートすること、を含む、請求項１８１～１８３のいずれか一項に記載の方法。 - （ａ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記有核細胞を前記タンパク質またはその断片と共にインキュベートすること、
（ｂ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記タンパク質またはその断片をコードする前記ｍＲＮＡと共に前記有核細胞をインキュベートすること、または
（ｃ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記有核細胞を前記二つ以上の抗原と共にインキュベートすること、を含む、請求項１８１～１８３のいずれか一項に記載の方法。 - 前記狭窄部の幅が、前記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、請求項１８１～１８５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記狭窄部の幅が、約３．５μｍ～約４．２μｍ、または約３．５μｍ～約４．８μｍ、または約３．５μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、請求項１８１～１８６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、請求項１８１～１８７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記狭窄部の幅が、約４．５μｍである、請求項１８１～１８８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のインプット有核細胞を含む前記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、前記複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置されている、請求項１８１～１８９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有核細胞をアジュバントにより馴化して、馴化細胞を形成することをさらに含む、請求項１７８～１９０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有核細胞が、前記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、前記アジュバントとインキュベートされる、請求項１９１に記載の方法。
- 前記有核細胞が、前記タンパク質もしくはその断片、前記タンパク質もしくはその断片をコードする前記ｍＲＮＡ、またはタンパク質由来の前記二つ以上の抗原を前記有核細胞に導入する前または後に馴化される、請求項１９１または１９２に記載の方法。
- 免疫細胞の前記活性を増強する方法であって、前記免疫細胞においてキメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸を発現することを含む方法。
- 前記キメラ膜結合型サイトカインが、膜貫通ドメインとサイトカインとを含む融合タンパク質である、請求項１９３に記載の方法。
- 前記膜貫通ドメインが、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＴＦＲＣ）または腫瘍壊死因子膜貫通ドメインである、請求項１９４または１９５に記載の方法。
- 前記サイトカインが、Ｉ型サイトカインである、請求項１９４～１９６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである、請求項１９４～１９７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記サイトカインが、ペプチドリンカーによって前記膜貫通ドメインに結合されている、請求項１９４～１９８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ペプチドリンカーが、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である、請求項１９９に記載の方法。
- 前記キメラ膜結合型サイトカインが、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む、請求項１９４～２００のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫細胞が、抗原をさらに含む、請求項１９４～２０１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫細胞が、抗原をコードするｍＲＮＡをさらに含む、請求項１９４～２０１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記抗原が、タンパク質またはその断片であり、前記タンパク質またはその断片が、前記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、請求項２０２または２０３に記載の方法。
- 前記免疫細胞が、タンパク質由来の二つ以上の抗原をさらに含む、請求項１９４～２０１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記二つ以上の抗原が、前記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、請求項２０５に記載の方法。
- 前記タンパク質が、がんに関連する変異タンパク質、癌遺伝子産物、ネオ抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である、請求項２０４～２０６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である、請求項２０４～２０７のいずれか一つに記載の方法。
- 前記ＨＰＶが、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である、請求項２０８に記載の方法。
- 前記タンパク質が、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である、請求項２０８または２０９に記載の方法。
- 前記タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である、請求項２０４～２０７のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ＨＢＶタンパク質が、コアタンパク質、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、ｅ抗原、Ｘ抗原、またはポリメラーゼタンパク質である、請求項２１１に記載の方法。
- 前記免疫細胞が、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項１９４～２１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のＰＢＭＣが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む、請求項２１３に記載の方法。
- 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である、請求項１９４～２１４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有核細胞が、アジュバントにより馴化されて、馴化細胞を形成する、請求項１９４～２１５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記有核細胞が、前記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、アジュバントとインキュベートされる、請求項２１６に記載の方法。
- 前記有核細胞が、前記タンパク質もしくはその断片、または前記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを前記有核細胞に導入する前または後に馴化される、請求項２１６または２１７に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、請求項２１６～２１８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、請求項２１６～２１９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記キメラ膜結合型サイトカインを含む前記免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が通過するのに十分な大きさの前記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット免疫細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸とインキュベートして、前記核酸が前記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインを含む免疫細胞を生成することにより調製される、請求項１９４～２２０のいずれか一項に記載の方法。 - 前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸が、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである、請求項２２１に記載の方法。
- 前記キメラ膜結合型サイトカインを含む前記免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と前記抗原とが通過するのに十分な大きさの前記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット免疫細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記抗原とインキュベートして、前記核酸および前記抗原が前記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される、請求項２０２、２０４、および２０７～２２２のいずれか一項に記載の方法。 - 前記キメラ膜結合型サイトカインと、タンパク質またはその断片をコードするｍＲＮＡとを含む免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と前記抗原をコードする核酸とが通過するのに十分な大きさの前記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット免疫細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記抗原をコードする前記核酸とインキュベートして、前記核酸が前記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記抗原をコードする前記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される、請求項２０３、２０４、および２０７～２２２に記載の方法。 - 前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および／または前記抗原をコードする前記核酸が、ｍＲＮＡである、請求項２２３または２２４に記載の方法。
- 前記キメラ膜結合型サイトカインと、タンパク質由来の前記二つ以上の抗原とを含む免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸とタンパク質由来の前記二つ以上の抗原とが通過するのに十分な大きさの前記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット免疫細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸およびタンパク質由来の前記二つ以上の抗原とインキュベートして、前記核酸が前記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される、請求項２０２、２０４、および２０７～２２２のいずれか一つに記載の方法。 - （ａ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸とインキュベートすること、
（ｂ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記抗原とインキュベートすること、
（ｃ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記抗原をコードする前記核酸とインキュベートすること、または
（ｄ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記二つ以上の抗原とインキュベートすることを含む、請求項２２１～２２６のいずれか一項に記載の方法。 - （ａ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸とインキュベートすること、
（ｂ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記抗原とインキュベートすること、
（ｃ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記抗原をコードする前記核酸とインキュベートすること、または
（ｄ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記二つ以上の抗原とインキュベートすることを含む、請求項２２１～２２６のいずれか一項に記載の方法。 - 前記狭窄部の幅が、前記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、請求項２２１～２２８のいずれか一項に記載の方法。
- 前記狭窄部の幅が、約３．５μｍ～約４．２μｍ、または約３．５μｍ～約４．８μｍ、または約３．５μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、請求項２２１～２２９のいずれか一項に記載の方法。
- 前記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、請求項２２１～２３０のいずれか一項に記載の方法。
- 前記狭窄部の幅が、約４．５μｍである、請求項２２１～２３１のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のインプット有核細胞を含む前記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、前記複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置されている、請求項２２１～２３２のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫細胞の前記活性を増強する組成物であって、前記免疫細胞にキメラ膜結合型サイトカインを含む、組成物。
- 前記キメラ膜結合型サイトカインが、膜貫通ドメインとサイトカインとを含む融合タンパク質である、請求項２３４に記載の組成物。
- 前記膜貫通ドメインが、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＴＦＲＣ）または腫瘍壊死因子膜貫通ドメインである、請求項２３４～２３５のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記サイトカインが、Ｉ型サイトカインである、請求項２３４～２３６のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記サイトカインが、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＬ－２１、またはそれらの機能的バリアントである、請求項２３４～２３７のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記サイトカインが、ペプチドリンカーによって前記膜貫通ドメインに結合されている、請求項２３４～２３８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドリンカーが、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号７３）または（ＥＡＡＡＫ）３（配列番号７４）である、請求項２３９に記載の組成物。
- 前記キメラ膜結合型サイトカインが、配列番号７７～８０のアミノ酸配列を含む、請求項２３４～２４０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記免疫細胞が、抗原をさらに含む、請求項２３４～２４１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記免疫細胞が、抗原をコードするｍＲＮＡをさらに含む、請求項２３４～２４２のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記抗原が、タンパク質またはその断片であり、前記タンパク質またはその断片が、前記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、請求項２４２または２４３に記載の組成物。
- 前記免疫細胞が、タンパク質由来の二つ以上の抗原をさらに含む、請求項２３３～２４１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記二つ以上の抗原が、前記個体のＨＬＡハプロタイプにかかわらず免疫応答を刺激する、請求項２４５に記載の組成物。
- 前記タンパク質が、がんに関連する変異タンパク質、癌遺伝子産物、ネオ抗原、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、または真菌タンパク質である、請求項２４４～２４６のいずれか一項に記載の組成物。
- タンパク質が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質である、請求項２４４～２４７のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ＨＰＶが、ＨＰＶ－１６またはＨＰＶ－１８である、請求項２４８に記載の組成物。
- 前記タンパク質が、ＨＰＶ Ｅ６またはＨＰＶ Ｅ７タンパク質である、請求項２４８または２４９に記載の組成物。
- 前記タンパク質が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）タンパク質である、請求項２４４～２４７のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ＨＢＶタンパク質が、コアタンパク質、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、ｅ抗原、Ｘ抗原、またはポリメラーゼタンパク質である、請求項２５１に記載の組成物。
- 前記免疫細胞が、複数の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項２３３～２５２のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数のＰＢＭＣが、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの二つ以上を含む、請求項２５３に記載の組成物。
- 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、樹状細胞、および／またはＮＫ－Ｔ細胞のうちの一つまたは複数である、請求項２３３～２５４のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記有核細胞が、アジュバントにより馴化されて、馴化細胞を形成する、請求項２３３～２５５のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記有核細胞が、前記細胞を馴化するために、約１時間～約２４時間、約２時間～約１０時間、約３時間～約６時間、または約４時間、アジュバントとインキュベートされる、請求項２５６に記載の組成物。
- 前記有核細胞が、前記タンパク質もしくはその断片、または前記タンパク質もしくはその断片をコードするｍＲＮＡを前記有核細胞に導入する前または後に馴化される、請求項２５６または２５７に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、ＬＰＳ、ＩＦＮ－α、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ポリイノシン酸－ポリシチジル酸、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ７アゴニスト、ＴＬＲ８アゴニスト、またはＴＬＲ９アゴニストである、請求項２５６～２５８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記アジュバントが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である、請求項２５６～２５９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記キメラ膜結合型サイトカインを含む前記免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が通過するのに十分な大きさの前記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット免疫細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸とインキュベートして、前記核酸が前記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインを含む免疫細胞を生成することにより調製される、請求項２３４～２６０のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸が、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである、請求項２６１に記載の組成物。
- 前記キメラ膜結合型サイトカインを含む前記免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と前記抗原とが通過するのに十分な大きさの前記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット免疫細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記抗原とインキュベートして、前記核酸が前記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される、請求項２４２、２４４、および２４７～２６２のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記キメラ膜結合型サイトカインを含む前記免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸と前記抗原をコードする核酸とが通過するのに十分な大きさの前記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット免疫細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記抗原をコードする前記核酸とインキュベートして、前記核酸が前記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記抗原をコードする前記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される、請求項２４３、２４４、および２４７～２６２に記載の組成物。 - 前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および／または前記抗原をコードする前記核酸が、ｍＲＮＡである、請求項２６３または２６４に記載の組成物。
- 前記キメラ膜結合型サイトカインと、タンパク質由来の前記二つ以上の抗原とを含む免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸とタンパク質由来の前記二つ以上の抗原とが通過するのに十分な大きさの前記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット免疫細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸およびタンパク質由来の前記二つ以上の抗原とインキュベートして、前記核酸が前記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインおよび二つ以上の抗原を含む免疫細胞を生成することにより調製される、請求項２４５～２６２のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記免疫細胞を取得するプロセスが、
（ａ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸とインキュベートすること、
（ｂ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記抗原とインキュベートすること、
（ｃ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記抗原をコードする前記核酸とインキュベートすること、または
（ｄ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記二つ以上の抗原とインキュベートすることを含む、請求項２６１～２６６のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記免疫細胞を取得するプロセスが、
（ａ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸とインキュベートすること、
（ｂ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記抗原とインキュベートすること、
（ｃ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記抗原をコードする前記核酸とインキュベートすること、または
（ｄ）前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸および前記二つ以上の抗原とインキュベートすることを含む、請求項２６１～２６６のいずれか一項に記載の方法。 - 前記狭窄部の幅が、前記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、請求項２６１～２６８のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記狭窄部の幅が、約３．５μｍ～約４．２μｍ、または約３．５μｍ～約４．８μｍ、または約３．５μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、請求項２６１～２６９のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、請求項２６１～２７０のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記狭窄部の幅が、約４．５μｍである、請求項２６１～２７１のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記複数のインプット有核細胞を含む前記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、前記複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置されている、請求項２６１～２７２のいずれか一項に記載の組成物。
- 医薬として使用するための組成物であって、有効量の請求項２３４～２７３のいずれか一項に記載の組成物を含む、組成物。
- 個体においてがん、感染症、またはウイルス関連疾患を治療するための組成物であって、有効量の請求項２１０～２４８のいずれか一項に記載の組成物を含む、組成物。
- 請求項１９４～２３３のいずれか一項に記載の方法で使用するためのキット。
- 請求項２３４～２７５のいずれか一項に記載の組成物を含むキット。
- 前記キットが、緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、シリンジ、または免疫細胞の活性を増強するための指示を伴う添付文書のうちの一つまたは複数をさらに含む、請求項２５０または２４９に記載のキット。
- キメラ膜結合型サイトカインを含む免疫細胞を作製する方法であって、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸を免疫細胞に導入することを含む方法。
- 前記キメラ膜結合型サイトカインを含む前記免疫細胞が、
ａ）インプット免疫細胞を含む細胞懸濁液を細胞変形狭窄部に通過させ、それによって、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が通過するのに十分な大きさの前記インプット免疫細胞の摂動を引き起こして、摂動インプット免疫細胞を形成することであって、前記狭窄部の直径が、前記懸濁液中の前記インプット免疫細胞の直径の関数である、前記通過させること、ならびに
ｂ）前記摂動インプット免疫細胞を、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸とインキュベートして、前記核酸が前記摂動インプット免疫細胞に入ることを可能とし、細胞内では、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸が発現し、それによって、キメラ膜結合型サイトカインを含む免疫細胞を生成することにより調製される、請求項２７９に記載の方法。 - 前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前、間、および／または後に、前記免疫細胞を前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸とインキュベートすることを含む、請求項２８０に記載の方法。
- 前記方法が、前記細胞懸濁液を前記細胞変形狭窄部に通過させる前に、前記免疫細胞を前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする前記核酸とインキュベートすることを含む、請求項２８０に記載の方法。
- 前記キメラ膜結合型サイトカインをコードする核酸が、前記キメラ膜結合型サイトカインをコードするｍＲＮＡである、請求項２８０、２８１、または２８２に記載の方法。
- 前記狭窄部の幅が、前記インプット有核細胞の平均直径の約１０％～約９９％である、請求項２８０～２８３のいずれか一項に記載の方法。
- 前記狭窄部の幅が、約３．５μｍ～約４．２μｍ、または約３．５μｍ～約４．８μｍ、または約３．５μｍ～約６μｍ、または約４．２μｍ～約４．８μｍ、または約４．２μｍ～約６μｍである、請求項２８０～２８４のいずれか一項に記載の方法。
- 前記狭窄部の幅が、約３．５μｍである、請求項２８０～２８５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記狭窄部の幅が、約４．５μｍである、請求項２８０～２８６のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のインプット有核細胞を含む前記細胞懸濁液が、複数の狭窄部を通過し、前記複数の狭窄部が、直列および／または並列に配置されている、請求項２８０～２８７のいずれか一項に記載の方法。
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