KR20230079066A - 유핵 세포를 사용하여 단백질에 대한 hla-불문 면역 반응을 자극하는 방법 - Google Patents
유핵 세포를 사용하여 단백질에 대한 hla-불문 면역 반응을 자극하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 출원은 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 이러한 유핵 세포를 제조하는 방법, 및 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하기 위해 이러한 변형된 유핵 세포(예를 들어 면역 세포)를 사용하는 방법을 제공한다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 9월 2일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/073,910호 및 2021년 2월 9일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/147,473호의 이익을 주장하며, 이들 각각은 참조로서 본원에 통합된다.
ASCII 텍스트 파일을 이용한 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일을 이용해 제출한 다음 항목은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다: 컴퓨터 판독 가능한 형태(CRF)의 서열 목록(파일명: 750322002940SEQLIST.TXT, 기록일: 2021년 9월 1일, 크기: 50,203 바이트).
기술분야
본 개시는 일반적으로 단백질 및 이의 단편을 포함하는 유핵 세포, 이러한 변형된 유핵 세포를 제조하는 방법, 및 이러한 변형된 유핵 세포를 사용해 면역 반응을 자극하는 방법에 관한 것이다.
에피토프 백신의 개발과 관련된 다양한 어려움이 있다. 이들 백신에 대한 연구는 수십 년 동안 이 분야에서 초점이 되어 왔고, 암을 치료하고 감염성 질환을 예방하기 위한 HLA 제한 에피토프 백신의 연구 및 개발은 상당한 진전을 이루었지만, 제3상 임상시험에 들어간 것으로 알려진 펩티드 기반 신세포암 백신은 단 하나뿐이다(, Immmatics biotechnologies GmbH에 의해 개발된 IMA901,9,10; world wide web.immatics.com)(Zhao, L 등의 문헌[Hum Vaccin Immunother. 2013 Dec 1; 9(12): 2566-2577] 참조).
효과적이긴 하지만, HLA-제한 에피토프 백신의 한계는 이들 백신이 MHC 제한 규칙으로 인해 환자 모집단 커버리지를 제한한다는 것이다. 대부분의 경우에, 예를 들어 HLA-A*02로 제한된 단일 펩티드 에피토프 백신은 HLA-A*02를 발현하는 환자를 치료하는 데에만 유용할 것이다(인간 모집단의 약 40%). 이러한 HLA 제한이 없고 따라서 HLA 불문인 백신을 생산하게 된다면 HLA 발현과 상관없이 모든 환자의 치료가 가능할 것이다. HLA 불문 백신은 표적 항원의 전장 단백질을 백신의 일부로서 포함시킴으로써 달성될 수 있다. 전장 단백질은 단백질 자체 및/또는 전장 단백질을 암호화하는 mRNA를 전달하고/하거나 중첩하는 합성 긴 펩티드(SLP)를 사용함으로써 달성될 수 있다.
HLA 불문 방식으로 내인성 CD8+ T 세포 반응을 유도하는 현재의 방법은 교차 제시를 위해 항원을 수지상 세포로 표적화하는 것에 의존해 왔다. 항원을 수지상 세포로 표적화하고 후속하여 교차 제시하는 것은, CD8 T 세포 반응은 보존하면서 전반적으로 CD4 T 세포 반응을 유도했어야 하는 복합적인 비효율성을 갖는다. 따라서, 에피토프 백신 분야에서의 발전이 필요하다. 질환 연관 항원에 의해 자극된 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL) 및 CD4+ 헬퍼 T(Th) 세포는 병든 세포를 표적화하여 파괴할 잠재력이 있다.
특허 출원 및 공개를 포함하여, 본원에 인용된 모든 참조문헌은 그 전체가 참조로서 통합된다. 특허 출원 공개 WO 2016070136, US 20180142198, WO 2017008063, US 20180201889, WO 2019178005, 및 WO 2019178006, 및 PCT/US2020/020194는 그 전체가 참조로서 본원에 명시적으로 통합된다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다. 일부 양태에서, 본 발명은 백신 접종를 필요로 하는 개체에게 백신을 접종하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다. 일부 양태에서, 본 발명은 백신 접종를 필요로 하는 개체에게 백신을 접종하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다. 일부 구현예에서, mRNA의 뉴클레오티드 서열은 유핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 구현예에서, mRNA의 하나 이상의 잔기가 변형된다. 일부 구현예에서, mRNA의 하나 이상의 잔기는 포스포로티오에이트 잔기, 슈도우리딘 잔기, N1-메틸아데노신 잔기, 5-메틸시티딘 잔기, 또는 모르폴리노 잔기이다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편은 단백질 또는 이의 단편 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, mRNA는 면역프로테아좀-표적화 모티프를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하며, 여기서 mRNA의 번역은 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프의 융합 단백질을 생성한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는, 면역프로테아좀-표적화 모티프가 없을 때 세포 내 단백질의 분해 및/또는 세포 표면 상의 단백질로부터 유래된 펩티드의 제시와 비교하여 세포 내 단백질의 분해 및/또는 세포 표면 상의 단백질로부터 유래된 펩티드의 제시를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는 융합 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는 파괴 박스(D-박스) 도메인, KEKE 도메인, 및/또는 sec/MITD 도메인이다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 유핵 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하고; 2개 이상의 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 백신 접종을 필요로 하는 개체에게 백신을 접종하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 유핵 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하고; 2개 이상의 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다. 일부 구현예에서, 세포는 단백질로부터 유래된 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개를 초과하는 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 중 적어도 2개는 부분적으로 중첩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 모든 항원의 아미노산 서열을 합치면 단백질의 아미노산 서열과 약 90% 이상 중첩된다. 일부 구현예에서, 항원은 단백질의 2개 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 항원은 단백질의 하나 이상의 에피토프 및 하나 이상의 이종 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, N-말단 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 에피토프의 측면에는 하나 이상의 이종 펩티드 서열이 위치한다. 일부 구현예에서, N-말단 및/또는 C-말단에서 측면에 위치하는 폴리펩티드는 면역원성 합성 긴 펩티드(SLP)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, N-말단 및/또는 C-말단에서 측면에 위치하는 폴리펩티드는 질환-연관 면역원성 SLP로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원은 일련의 중첩된 SLP로서, 이는 단백질의 아미노산 서열의 약 90% 초과에 상응하거나 단백질의 아미노산 서열의 약 100%에 상응한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 종양유전자의 산물, 신생항원, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질이다. 일부 구현예에서, 개체에서 면역 반응을 자극하는 것은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, 바이러스 연관 질환은 인간 유두종바이러스(HPV), A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 단순 포진 바이러스 1(HSV-1), 단순 포진 바이러스(HSV-2), 수두-대상포진 바이러스(VZV), 6형 인간 헤르페스바이러스(HHV-6), 7형 인간 헤르페스바이러스(HHV-7), 8형 인간 헤르페스바이러스 (HHV-8), 거대세포바이러스(CMV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 엡스타인바 바이러스(EBV), 또는 인플루엔자와 연관된 질환이다. 일부 구현예에서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질이다. 일부 구현예에서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18이다. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질이다. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 코어 단백질, 작은 표면 항원, 중간 표면 항원, 큰 표면 항원, e 항원, X 항원, 또는 중합효소 단백질이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 조성물은 보조제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 보조제와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 다음에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 단백질 또는 이의 단편을 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기에 충분한 시간 동안, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포는 다음에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기에 충분한 시간 동안, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포는 다음에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 2개 이상의 항원을 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3.0 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.0 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.0 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm 또는 약 4.0 μm이다. 일부 구현예에서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 유핵 세포는 개체에 대한 자가 세포 또는 동종 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 둘 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 보조제로 컨디셔닝되어 컨디셔닝된 세포를 형성한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 10시간, 약 3시간 내지 약 6시간, 또는 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 유핵 세포 내로 도입하기 전 또는 후에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제이다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)이다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 7909이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 컨디셔닝된 세포는 컨디셔닝된 복수의 PBMC이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 공자극 분자 중 하나 이상의 발현을 증가시키도록 변형된다. 일부 구현예에서, 공자극 분자는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시키도록 변형된다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하도록 변형된다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 사이토카인 및 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합된다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 I형 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN α, IFN β, 또는 IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 서열번호 77~80의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 분자는 복수의 컨디셔닝된지 않은 PBMC 내의 B 세포와 비교하여 컨디셔닝된 복수의 PBMC의 B 세포에서 상향 조절되고, 공자극 분자는 CD80 및/또는 CD86이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 복수의 컨디셔닝되지 않은 PBMC와 비교하여 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현을 증가시킨다. 일부 구현예에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현은 상기 복수의 컨디셔닝되지 않은 PBMC와 비교하여 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배, 또는 10배 초과만큼 증가된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 복수의 횟수로 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다. 일부 구현예에서, 조성물은 또 다른 요법의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 또 다른 요법은 화학요법, 방사선요법, 항체, 사이토카인, 면역 관문 억제제, 또는 면역 항암 요법에 사용된 이중특이적 폴리펩티드이다.
일부 양태에서, 본 발명은 유핵 세포를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 유핵 세포를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA의 뉴클레오티드 서열은 유핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 구현예에서, mRNA의 하나 이상의 잔기가 변형된다. 일부 구현예에서, mRNA의 하나 이상의 잔기는 포스포로티오에이트 잔기, 슈도우리딘 잔기, N1-메틸아데노신 잔기, 5-메틸시티딘 잔기, 또는 모르폴리노 잔기이다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편은 단백질 또는 이의 단편 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프를 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, mRNA는 면역프로테아좀-표적화 모티프를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하며, 여기서 mRNA의 번역은 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프의 융합 단백질을 생성한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는, 면역프로테아좀-표적화 모티프가 없을 때 세포 내 단백질의 분해 및/또는 세포 표면 상의 단백질로부터 유래된 펩티드의 제시와 비교하여 세포 내 단백질의 분해 및/또는 세포 표면 상의 단백질로부터 유래된 펩티드의 제시를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는 융합 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는 파괴 박스(D-박스) 도메인, KEKE 도메인, 및/또는 sec/MITD 도메인이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 유핵 세포를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 유핵 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하고; 상기 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다. 일부 구현예에서, 세포는 단백질로부터 유래된 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개를 초과하는 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 중 적어도 2개는 부분적으로 중첩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 모든 항원의 아미노산 서열을 합치면 단백질의 아미노산 서열과 약 90% 이상 중첩된다. 일부 구현예에서, 항원은 단백질의 2개 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 항원은 단백질의 하나 이상의 에피토프 및 하나 이상의 이종 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, N-말단 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 에피토프의 측면에는 하나 이상의 이종 펩티드 서열이 위치한다. 일부 구현예에서, N-말단 및/또는 C-말단에서 측면에 위치하는 폴리펩티드는 면역원성 합성 긴 펩티드(SLP)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, N-말단 및/또는 C-말단에서 측면에 위치하는 폴리펩티드는 질환-연관 면역원성 SLP로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원은 일련의 중첩된 SLP로서, 이는 단백질의 아미노산 서열의 약 90% 초과에 상응하거나 단백질의 아미노산 서열의 약 100%에 상응한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 종양유전자의 산물, 신생항원, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질이다. 일부 구현예에서, 개체에서 면역 반응을 자극하는 것은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, 바이러스 연관 질환은 인간 유두종바이러스(HPV), A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 단순 포진 바이러스 1(HSV-1), 단순 포진 바이러스(HSV-2), 수두-대상포진 바이러스(VZV), 6형 인간 헤르페스바이러스(HHV-6), 7형 인간 헤르페스바이러스(HHV-7), 8형 인간 헤르페스바이러스 (HHV-8), 거대세포바이러스(CMV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 엡스타인바 바이러스(EBV), 또는 인플루엔자와 연관된 질환이다. 일부 구현예에서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질이다. 일부 구현예에서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18이다. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질이다. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 코어 단백질, 작은 표면 항원, 중간 표면 항원, 큰 표면 항원, e 항원, X 항원, 또는 중합효소 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 CMV 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 CMV 구조 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 CMV pp65 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 인플루엔자 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 인플루엔자 기질 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 인플루엔자 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 인플루엔자 기질 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 인플루엔자 M1 단백질이다. 일부 구현예에서, 개체에서 면역 반응을 자극하는 것은 흑색종의 치료에 사용된다. 일부 구현예에서, 단백질은 T 세포(MART-1)에 의해 인식되는 흑색종 연관 항원이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 조성물은 보조제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 보조제와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 다음에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 단백질 또는 이의 단편을 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기에 충분한 시간 동안, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포는 다음에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기에 충분한 시간 동안, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포는 다음에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 2개 이상의 항원을 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3.0 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.0 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.0 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm 또는 약 4.0 μm이다. 일부 구현예에서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 유핵 세포는 개체에 대한 자가 세포 또는 동종 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 둘 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 보조제로 컨디셔닝되어 컨디셔닝된 세포를 형성한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 10시간, 약 3시간 내지 약 6시간, 또는 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 유핵 세포 내로 도입하기 전 또는 후에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제이다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)이다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 7909이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 컨디셔닝된 세포는 컨디셔닝된 복수의 PBMC이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 공자극 분자 중 하나 이상의 발현을 증가시키도록 변형된다. 일부 구현예에서, 공자극 분자는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시키도록 변형된다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하도록 변형된다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 사이토카인 및 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합된다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 I형 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN α, IFN β, 또는 IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 서열번호 77~80의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 분자는 복수의 컨디셔닝된지 않은 PBMC 내의 B 세포와 비교하여 컨디셔닝된 복수의 PBMC의 B 세포에서 상향 조절되고, 공자극 분자는 CD80 및/또는 CD86이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 복수의 컨디셔닝되지 않은 PBMC와 비교하여 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현을 증가시킨다. 일부 구현예에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현은 상기 복수의 컨디셔닝되지 않은 PBMC와 비교하여 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배, 또는 10배 초과만큼 증가된다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 본원에 기술된 것과 같은 조성물의 유효량을 포함하고, 조성물은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다. 일부 양태에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 본원에 기술된 것과 같은 조성물의 유효량을 포함하고, 조성물은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 본원에 기술된 것과 같은 조성물의 유효량을 포함하고, 조성물은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다. 일부 구현예에서, 조성물은 보조제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 보조제와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 알파-갈록토실 세라미드, STING 작용제, 환형 디뉴클레오티드(CDN), RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 복수의 횟수로 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다. 일부 구현예에서, 조성물은 또 다른 요법의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 또 다른 요법은 화학요법, 방사선요법, 항체, 사이토카인, 면역 관문 억제제, 또는 면역 항암 요법에 사용된 이중특이적 폴리펩티드이다.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 의약을 제조함에 있어서 이를 위한 조성물의 용도를 제공하며, 여기서 조성물은 본원에 기술된 것과 같은 조성물의 유효량을 포함하고, 조성물은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 의약을 제조함에 있어서 조성물의 용도를 제공하며, 여기서 조성물은 본원에 기술된 것과 같은 조성물의 유효량을 포함하고, 조성물은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다. 일부 구현예에서, 조성물은 보조제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 보조제와 함께 투여되도록 제형화된다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 알파-갈록토실 세라미드, STING 작용제, 환형 디뉴클레오티드(CDN), RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 복수의 횟수로 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물은 정맥내 투여된다. 일부 구현예에서, 개체는 인간이다. 일부 구현예에서, 조성물은 또 다른 요법의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 또 다른 요법은 화학요법, 방사선요법, 항체, 사이토카인, 면역 관문 억제제, 또는 면역 항암 요법에 사용된 이중특이적 폴리펩티드이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기술된 조성물 중 어느 하나를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 완충제; 희석제; 필터; 바늘; 주사기; 또는 조성물을 개체에게 투여하여 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하기 위한 지침이 담긴 패키지 삽입물 중 하나 이상을 추가로 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 유핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 유핵 세포 내로 도입하고, 유핵 세포 내에서 mRNA가 발현되어 단백질 또는 이의 단편을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편으로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 2개 이상의 항원을 유핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 유핵 세포에 세포내 도입하는 단계는 다음을 포함한다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 단백질 또는 이의 단편을 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. 본 발명의 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포는 다음에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포는 다음에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 2개 이상의 항원을 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm이다. 일부 구현예에서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 유핵 세포를 보조제와 함께 컨디셔닝하여 컨디셔닝된 세포를 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 10시간, 약 3시간 내지 약 6시간, 또는 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 또는 단백질 유래의 2개 이상의 항원을 유핵 세포 내로 도입하기 전 또는 후에 컨디셔닝된다.
일부 양태에서, 본 발명은 면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 면역 세포에서 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 막관통 도메인 및 사이토카인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 트랜스페린 수용체 단백질 1(TFRC) 또는 종양 괴사 인자 막관통 도메인이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 I형 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN α, IFN β, 또는 IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합된다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 서열번호 77~80의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 항원을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 항원을 암호화하는 mRNA를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다. 일부 구현예에서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 종양유전자의 산물, 신생항원, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질이다. 일부 구현예에서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18이다. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질이다. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 코어 단백질, 작은 표면 항원, 중간 표면 항원, 큰 표면 항원, e 항원, X 항원, 또는 중합효소 단백질이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 면역 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 둘 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 보조제로 컨디셔닝되어 컨디셔닝된 세포를 형성한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 10시간, 약 3시간 내지 약 6시간, 또는 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 유핵 세포 내로 도입하기 전 또는 후에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제이다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 섭동된 투입 면역 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 핵산과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 섭동된 투입 면역 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및/또는 항원을 암호화하는 핵산은 mRNA이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm이다. 일부 구현예에서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과한다.
일부 양태에서, 본 발명은 면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 키메라 막-결합 사이토카인을 면역 세포에 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 막관통 도메인 및 사이토카인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 트랜스페린 수용체 단백질 1(TFRC) 또는 종양 괴사 인자 막관통 도메인이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 I형 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN α, IFN β, 또는 IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합된다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 서열번호 77~80의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 항원을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 항원을 암호화하는 mRNA를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다. 일부 구현예에서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 종양유전자의 산물, 신생항원, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질이다. 일부 구현예에서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18이다. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질이다. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 코어 단백질, 작은 표면 항원, 중간 표면 항원, 큰 표면 항원, e 항원, X 항원, 또는 중합효소 단백질이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 면역 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 둘 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 보조제로 컨디셔닝되어 컨디셔닝된 세포를 형성한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 10시간, 약 3시간 내지 약 6시간, 또는 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 유핵 세포 내로 도입하기 전 또는 후에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제이다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 섭동된 투입 면역 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 핵산과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 섭동된 투입 면역 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및/또는 항원을 암호화하는 핵산은 mRNA이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm이다. 일부 구현예에서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과한다.
일부 양태에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 본원에 기술된 것과 같은 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 조성물을 제공하며, 상기 조성물은 본원에 기술된 것과 같은 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 포함한다.
일부 양태에서, 본 발명은 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 면역 세포에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm이다. 일부 구현예에서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과한다.
도 1은 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 막-결합 사이토카인(IL-12, IFN-α2a)의 표면 발현을 보여주는 형광 플롯이다. (G4S)3은 서열번호 73.
도 2는 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 막-결합 사이토카인(IL-12, IFN-α2a)에 의한 사이토카인의 신호 전달 활성을 보여주는 그래프이다. (G4S)3은 서열번호 73.
도 3은 막-결합 IL-2를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 막-결합 IL-2의 표면 발현 지속시간을 보여주는 그래프이다. (G4S)3은 서열번호 73이고, (EA3K)3은 서열번호 74이다.
도 4는 막-결합 IL-2를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 막-결합 IL-12에 의한 사이토카인의 신호 전달 활성을 보여주는 그래프이다. (G4S)3은 서열번호 86이고, (G4S)3은 서열번호 73이고, (EA3K)3은 서열번호 74이다.
도 5는 재조합 E7 단백질 또는 E7.6 SLP이 스퀴즈 로딩된 PBMC와 공동 배양한 후, E711-20 반응자 T 세포에 의한 IFN-γ의 분비량을 보여주는 그래프이다.
도 6은 고유 E6 mRNA 또는 코돈 최적화된 E6 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC에 의한 E6 단백질의 발현량을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 7은 코돈 최적화된 E6 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC에 의한 E6 단백질의 번역 및 발현의 동역학을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 8은 고유 E7 mRNA, 코돈 최적화된 E7 mRNA, 또는 D-박스 도메인을 추가로 암호화하는 E7 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC에 의한 E6 단백질의 동역학을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 9는 고유 E7 mRNA, 코돈 최적화된 E7 mRNA, 또는 D-박스 도메인을 추가로 암호화하는 E7 mRNA가 스퀴즈-로딩된 PBMC와 공동 배양한 후, E711-20 반응자 T 세포에 의한 IFN-γ의 분비량을 보여주는 그래프이다.
도 10a 및 10b는 E7 단백질 또는 E7 SLP를 암호화하는 표시된 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC와 각각 6시간 또는 밤새 공동 배양한 후, E711-20 반응자 T 세포에 의한 IFN-γ의 분비량을 보여주는 그래프이다.
도 11a 및 11b는 E7 단백질을 암호화하는 표시된 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC와 각각 6시간 또는 밤새 공동 배양한 후, E711-20 반응자 T 세포에 의한 IFN-γ의 분비량을 보여주는 그래프이다.
도 12a 및 12b는 PBMC에서 CD-86의 발현을 보여주고, CMV pp65 항원, CD86, 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC 내 구성 세포 유형을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 13a 및 13b는 PBMC에서 막-결합 IL-12(mbIL-12)의 발현을 보여주고, CMV pp65 항원, CD-86, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC 내 구성 세포 유형을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 14는 CMV pp65 항원, CD86, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩될 때, CD3+CD8+ 반응자 T 세포 집단 내 IFN-γ+CD45RO+ 집단의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 15는 CMV pp65 항원, CD86, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩된 후, 1 μM의 pp65 항원으로 추가로 재자극했을 때, CD3+CD8+ 반응자 T 세포 집단 내 IFN-γ+CD45RO+ 집단의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 16a~16e는, CMV pp65 항원, CD86, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩된 후, 1 μM의 pp65 항원으로 추가로 재자극했을 때, 활성화된 반응자 T 세포 집단 내 기능성 마커 IFN-γ, IL-2, TNF-α, 그랜자임 B, PD-1에 대한 발현양을 각각 보여준다.
도 17a 및 17b는 PBMC에서 CD-86의 발현을 보여주고, CMV pp65 항원, CD-86, 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC 내 구성 세포 유형을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 18a 및 18b는 PBMC에서 막-결합 IL-12(mbIL-12)의 발현을 보여주고, CMV pp65 항원, CD86, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC 내 구성 세포 유형을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 19는 CMV pp65 항원, CD86, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩된 후, CpG 보조제 활성화가 있거나 없는 가운데 추가로 배양했을 때, CD3+CD8+ 반응자 T 세포 내에서 CMV pp65 사량체-양성 반응자 T 세포의 양, 및 CMV pp65 사량체-양성 집단의 백분율을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 20은 CMV pp65 항원, CD86, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩된 후, 1 μM의 pp65 항원에 의한 재자극이 있거나 없는 가운데 처리하고, CpG 보조제에 의한 컨디셔닝이 있거나 없는 가운데 추가로 배양했을 때, CD3+CD8+ 반응자 T 세포 내에서 CMV pp65 사량체-양성 반응자 T 세포의 양, 및 CMV pp65 사량체-양성 집단의 백분율을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 21a, 21b, 21c, 21d, 21e는, CMV pp65 항원, CD86, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩되었을 때, 활성화된 반응자 T 세포 집단 내 기능성 마커 그랜자임 B, IFN-γ, IL-2, TNF-α, PD-1에 대한 발현양을 각각 보여주는 그래프를 포함한다.
도 22a 및 22b는 PBMC에서 CD86 발현 세포의 백분율 및 CD86 발현량을 각각 보여주고, CMV pp65 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC 내 구성 세포 유형을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 22a 및 22b는 PBMC에서 CD86 발현 세포의 백분율 및 CD86 발현량을 각각 보여주고, CMV pp65 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC 내 구성 세포 유형을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 23a 및 23b는 PBMC에서 막-결합 IL-2(mbIL-2) 발현 세포 및 mbIL-2 발현량을 각각 보여주고, CMV pp65 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC 내 구성 세포 유형을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 24a 및 24b는 PBMC에서 막-결합 IL-12(mbIL-12) 발현 세포의 백분율 및 mbIL-12 발현량을 각각 보여주고, CMV pp65 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC 내 구성 세포 유형을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 25는 1 μM의 HLA-B*07-제한 pp65 항원 펩티드에 의한 추가의 재자극(B07 펩티드 재자극)이 있거나 없는 가운데, CMV pp65 항원, CD86, mbIL-2, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩될 때, CD3+CD8+ 반응자 T 세포 내 IFN-γ+ 집단의 양을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 26은 1 μM의 HLA-B*07-제한 pp65 항원 펩티드에 의한 추가의 재자극(B07 펩티드 재자극)이 있거나 없는 가운데, CMV pp65 항원, CD86, mbIL-2, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩될 때, CD3+CD8+ 반응자 T 세포 내 IFN-γ+CD45RO+ 집단의 양을 보여주는 그래프이다.
도 27a 및 27b는 CMV pp65 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 CD86 발현량 및 CD86 발현 세포의 백분율을 각각 보여주는 그래프이다.
도 27c 및 27d는 CMV pp65 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 막-결합 IL-2(mbIL-2) 발현량 및 mbIL-2 발현 세포의 백분율을 각각 보여주는 그래프이다.
도 27e 및 27f는 CMV pp65 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 막-결합 IL-2(mbIL-2) 발현량 및 mbIL-2 발현 세포의 백분율을 각각 보여주는 그래프이다.
도 28은 HLA-A*01 또는 HLA-B*07-제한(YSE(A01), TPR(B07) 또는 RPH(B07))에 특이적인 1 μM의 pp65 항원 펩티드에 의한 추가 재자극이 있거나 없는 가운데, CMV pp65 항원, CD86, mbIL-2, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩될 때, CD3+CD8+ 반응자 T 세포 내 IFN-γ+CD45RO+ 집단의 양을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 29a 및 29b는 인플루엔자 M1 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 CD86 발현 세포의 백분율 및 CD86 발현양을 각각 보여주는 그래프이다.
도 29c 및 29d는 인플루엔자 M1 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 막-결합 IL-2(mbIL-2) 발현 세포의 백분율 및 mbIL-2 발현양을 각각 보여주는 그래프이다.
도 29e 및 29f는 인플루엔자 M1 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 막-결합 IL-12(mbIL-12) 발현 세포의 백분율 및 mbIL-12 발현양을 각각 보여주는 그래프이다.
도 30은 1 μM의 M1 항원 펩티드로 추가로 재자극하면서, 인플루엔자 M1 항원, CD86, mbIL-2, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩될 때, IFN-γ+CD45RO+ CD8 T 세포의 양을 보여주는 그래프이다.
도 31은 1 μM의 M1 항원 펩티드로 추가로 재자극하면서, 인플루엔자 M1 항원, CD86, mbIL-2, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩될 때, CD3+CD8 반응자 T 세포 내 IFN-γ+CD45RO+ 집단의 양을 보여주는 그래프이다.
도 32는 M1 항원, CD86, mbIL-2, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩된 후, 1 μM의 pp65 항원에 의한 재자극이 있거나 없는 가운데 처리하고, CpG 보조제에 의한 컨디셔닝이 있거나 없는 가운데 추가로 배양했을 때, CD3+CD8+ 반응자 T 세포 내 인플루엔자 M1 사량체-양성 T 세포 집단의 양을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 33은 HPV16 E6을 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 특이적 HLA 일배체형의 PBMC가 항원 특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위한 실험을 나타내는 개략도이다.
도 34는 E6 mRNA가 스퀴즈-로딩된 PBMC(E6 mRNA), 미처리 PBMC(미 접촉), 모의-스퀴즈-로딩된 PBMC(빈 스퀴즈), 또는 1 mM E615-24 펩티드가 스파이크된 미 접촉 PBMC(양성 대조군) 중 하나와 공동 배양하고, 제조사의 프로토콜에 따라 현상한 E615-24 반응자 T 세포의 ELISPOT 플레이트의 이미지이다.
도 35는 E6 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC(E6 mRNA), 1 mM E615-24 펩티드가 스파이크된 미처리 PBMC(양성 대조군) 중 하나와 공동 배양하고, 제조사의 프로토콜에 따라 현상한 E615-24 반응자 T 세포에 대한 IFN-γ ELISPOT 검정에서 세포당 스팟 형성 단위(SFU)의 평균 양을 보여준다.
도 36은 E6 mRNA가 스퀴즈-로딩된 PBMC(E6 mRNA), 미처리 PBMC(빈 스퀴즈), 모의-스퀴즈-로딩된 PBMC(빈 스퀴즈), 또는 1 mM E615-24 펩티드가 스파이크된 미 접촉 PBMC(양성 대조군) 중 하나와 공동 배양하고, 제조사의 프로토콜에 따라 현상한 E615-24 반응자 T 세포에 대한 IFN-γ ELISPOT 검정에서 평균 스팟 크기를 보여준다.
도 37은 E7 mRNA가 스퀴즈 로딩된 특이적 HLA 일배체형의 PBMC가 항원 특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있는 기간을 보여주는 개략도이다.
도 38a는 (i) E7 mRNA, (ii) E7 mRNA 및 E7 E6 mRNA, (iv) E7.6 합성 긴 펩티드(SLP)를 스퀴즈 로딩하거나, (v) 첨가물 없이 스퀴즈 로딩한(빈 스퀴즈) PBMC와 함께 공동 배양하거나, E711-20 펩티드(E7 최소 에피토프)가 존재하는 가운데 미처리 PBMC와 함께 공동 배양한 E711-20 반응자 T 세포에 대한 IFN-γ ELISA의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 38b는 (i) E7 mRNA, (ii) E7 mRNA 및 E7 E6 mRNA, (iv) E7.6 합성 긴 펩티드(SLP)를 스퀴즈 로딩하거나, (v) 첨가물 없이 스퀴즈 로딩한(빈 스퀴즈) PBMC와 함께 공동 배양하거나, E711-20 펩티드(E7 최소 에피토프)가 존재하는 가운데 미처리 PBMC와 함께 공동 배양한 E711-20 반응자 T 세포에 대한 IFN-γ ELISA의 결과를 보여주는 그래프이며, 여기서 PBMC는 공동 배양하기 전에 표시된 기간 동안 배양하였다.
도 39a는 (i) E7 mRNA, (ii) E7 mRNA 및 E7 E6 mRNA, (iv) E7.6 합성 긴 펩티드(SLP)를 스퀴즈 로딩하거나, (v) 첨가물 없이 스퀴즈 로딩한(빈 스퀴즈) PBMC와 함께 공동 배양하거나, E711-20 펩티드(E7 최소 에피토프)가 존재하는 가운데 미처리 PBMC와 함께 공동 배양한 E711-20 반응자 T 세포에 대한 IFN-γ ELISA의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 39b는 (i) E7 mRNA, (ii) E7 mRNA 및 E7 E6 mRNA, (iv) E7.6 합성 긴 펩티드(SLP)를 스퀴즈 로딩하거나, (v) 첨가물 없이 스퀴즈 로딩한(빈 스퀴즈) PBMC와 함께 공동 배양하거나, E711-20 펩티드(E7 최소 에피토프)가 존재하는 가운데 미처리 PBMC와 함께 공동 배양한 E711-20 반응자 T 세포에 대한 IFN-γ ELISA의 결과를 보여주는 그래프이며, 여기서 PBMC는 공동 배양하기 전에 표시된 기간 동안 배양하였다.
도 40은 (i) 500 μg/ml E6 mRNA 및 500 μg/ml E7 mRNA, (ii) CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및 막-결합 IL-12(mbIL-12), (iii) E6 및 E7 mRNA, 및 CD86, mbIL-2, 및 mbIL-12를 암호화하는 mRNA, (iv) E6 및 E7 합성 긴 펩티드(SLP)가 스퀴즈 로딩된 PBMC, 또는 (v) 첨가물 없이 스퀴즈 로딩한(빈 스퀴즈) PBMC와 함께 공동 배양하거나, E629-38 펩티드(E6 최소 에피토프) 및/또는 E7 최소 펩티드(E7 최소 펩티드)가 존재하는 가운데 미처리 PBMC와 함께 공동 배양한 E629-38 TCR 저캇-루시아 NFAT 세포에 대한 QUANTI-Luc GOLD 루시퍼라아제 검정에서 형광을 보여주는 그래프이다.
도 41a, 41b는 (i) E6 mRNA 및 E7 mRNA, (ii) E7.6 및 E6 합성 긴 펩티드(SLP)가 스퀴즈 로딩된 PBMC, 또는 (iii) 첨가물 없이 스퀴즈 로딩한(빈 스퀴즈) PBMC와 함께 공동 배양하거나, E629-38 펩티드(E6 최소 에피토프) 및/또는 E7 최소 펩티드(E7 최소 에피토프)가 존재하는 가운데 미처리 PBMC와 함께 공동 배양한 E629-38 TCR 저캇-루시아 NFAT 세포에 대한 QUANTI-Luc GOLD 루시퍼라아제 검정에서 형광을 보여주는 그래프이다.
도 42a는 E619-28 TCR 또는 E711-19 TCR의 형질도입 후 E6 특이적 T 세포 또는 E7 특이적 T 세포의 FACs 분석을 보여주는 그래프이다. 도 42b, 42c는 다음과 공동 배양한 후 E6 특이적 T 세포 또는 E7 특이적 T 세포의 증가를 보여주는 그래프이다: E6+E7+신호 2/3 mRNA 세포(E6, E7, 및 신호 2/3 매개자를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), E6+E7 mRNA 단독 세포(E6, E7을 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), 신호 2/3 mRNA(신호 2/3 매개자를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), 또는 대조군 PBMC(빈 스퀴즈). 도 42d, 42e, 42f, 42g, 42h, 42i는 다음과 함께 공동 배양한 후; 및 E6 또는 E7 최소 에피토프로 재자극한 후, E6-TCR 또는 E7-TCR이 형질도입된 T 세포에서, IFNγ-생산 T 세포 또는 TNF-α-생산 T 세포의 자극을 보여주는 그래프이다: E6+E7+신호 2/3 mRNA 세포(E6, E7, 및 신호 2/3 매개자를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), E6+E7 mRNA 단독 세포(E6, E7을 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), 신호 2/3 mRNA(신호 2/3 매개자를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), 또는 대조군 PBMC(빈 스퀴즈).
도 43a, 42b, 43c, 43d, 및 43e는 다음으로 면역화시킨 마우스에서 pp65 항원 특이적 T 세포의 증가를 보여주는 그래프이다: eAPC-CMV 세포(pp65 및 신호2/신호3 매개자를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), pp65 단독 세포(pp65를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), 또는 미 가공 PBMC(미 접촉). 도 43f, 43g, 43h, 및 도 43i, 43j, 43k는 다음으로 면역화시킨 마우스에서 IFNγ-생산 T 세포, TNF-α-생산 T 세포, 또는 IL-2-생산 T 세포의 자극을 보여주는 그래프이다: eAPC-CMV 세포(pp65 및 신호2/신호3 매개자를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), pp65 단독 세포(pp65를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), 또는 미가공 PBMC(미 접촉).
도 2는 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 막-결합 사이토카인(IL-12, IFN-α2a)에 의한 사이토카인의 신호 전달 활성을 보여주는 그래프이다. (G4S)3은 서열번호 73.
도 3은 막-결합 IL-2를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 막-결합 IL-2의 표면 발현 지속시간을 보여주는 그래프이다. (G4S)3은 서열번호 73이고, (EA3K)3은 서열번호 74이다.
도 4는 막-결합 IL-2를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 막-결합 IL-12에 의한 사이토카인의 신호 전달 활성을 보여주는 그래프이다. (G4S)3은 서열번호 86이고, (G4S)3은 서열번호 73이고, (EA3K)3은 서열번호 74이다.
도 5는 재조합 E7 단백질 또는 E7.6 SLP이 스퀴즈 로딩된 PBMC와 공동 배양한 후, E711-20 반응자 T 세포에 의한 IFN-γ의 분비량을 보여주는 그래프이다.
도 6은 고유 E6 mRNA 또는 코돈 최적화된 E6 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC에 의한 E6 단백질의 발현량을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 7은 코돈 최적화된 E6 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC에 의한 E6 단백질의 번역 및 발현의 동역학을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 8은 고유 E7 mRNA, 코돈 최적화된 E7 mRNA, 또는 D-박스 도메인을 추가로 암호화하는 E7 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC에 의한 E6 단백질의 동역학을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 9는 고유 E7 mRNA, 코돈 최적화된 E7 mRNA, 또는 D-박스 도메인을 추가로 암호화하는 E7 mRNA가 스퀴즈-로딩된 PBMC와 공동 배양한 후, E711-20 반응자 T 세포에 의한 IFN-γ의 분비량을 보여주는 그래프이다.
도 10a 및 10b는 E7 단백질 또는 E7 SLP를 암호화하는 표시된 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC와 각각 6시간 또는 밤새 공동 배양한 후, E711-20 반응자 T 세포에 의한 IFN-γ의 분비량을 보여주는 그래프이다.
도 11a 및 11b는 E7 단백질을 암호화하는 표시된 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC와 각각 6시간 또는 밤새 공동 배양한 후, E711-20 반응자 T 세포에 의한 IFN-γ의 분비량을 보여주는 그래프이다.
도 12a 및 12b는 PBMC에서 CD-86의 발현을 보여주고, CMV pp65 항원, CD86, 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC 내 구성 세포 유형을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 13a 및 13b는 PBMC에서 막-결합 IL-12(mbIL-12)의 발현을 보여주고, CMV pp65 항원, CD-86, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC 내 구성 세포 유형을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 14는 CMV pp65 항원, CD86, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩될 때, CD3+CD8+ 반응자 T 세포 집단 내 IFN-γ+CD45RO+ 집단의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 15는 CMV pp65 항원, CD86, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩된 후, 1 μM의 pp65 항원으로 추가로 재자극했을 때, CD3+CD8+ 반응자 T 세포 집단 내 IFN-γ+CD45RO+ 집단의 백분율을 보여주는 그래프이다.
도 16a~16e는, CMV pp65 항원, CD86, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩된 후, 1 μM의 pp65 항원으로 추가로 재자극했을 때, 활성화된 반응자 T 세포 집단 내 기능성 마커 IFN-γ, IL-2, TNF-α, 그랜자임 B, PD-1에 대한 발현양을 각각 보여준다.
도 17a 및 17b는 PBMC에서 CD-86의 발현을 보여주고, CMV pp65 항원, CD-86, 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC 내 구성 세포 유형을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 18a 및 18b는 PBMC에서 막-결합 IL-12(mbIL-12)의 발현을 보여주고, CMV pp65 항원, CD86, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC 내 구성 세포 유형을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 19는 CMV pp65 항원, CD86, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩된 후, CpG 보조제 활성화가 있거나 없는 가운데 추가로 배양했을 때, CD3+CD8+ 반응자 T 세포 내에서 CMV pp65 사량체-양성 반응자 T 세포의 양, 및 CMV pp65 사량체-양성 집단의 백분율을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 20은 CMV pp65 항원, CD86, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩된 후, 1 μM의 pp65 항원에 의한 재자극이 있거나 없는 가운데 처리하고, CpG 보조제에 의한 컨디셔닝이 있거나 없는 가운데 추가로 배양했을 때, CD3+CD8+ 반응자 T 세포 내에서 CMV pp65 사량체-양성 반응자 T 세포의 양, 및 CMV pp65 사량체-양성 집단의 백분율을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 21a, 21b, 21c, 21d, 21e는, CMV pp65 항원, CD86, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩되었을 때, 활성화된 반응자 T 세포 집단 내 기능성 마커 그랜자임 B, IFN-γ, IL-2, TNF-α, PD-1에 대한 발현양을 각각 보여주는 그래프를 포함한다.
도 22a 및 22b는 PBMC에서 CD86 발현 세포의 백분율 및 CD86 발현량을 각각 보여주고, CMV pp65 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC 내 구성 세포 유형을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 22a 및 22b는 PBMC에서 CD86 발현 세포의 백분율 및 CD86 발현량을 각각 보여주고, CMV pp65 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC 내 구성 세포 유형을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 23a 및 23b는 PBMC에서 막-결합 IL-2(mbIL-2) 발현 세포 및 mbIL-2 발현량을 각각 보여주고, CMV pp65 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC 내 구성 세포 유형을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 24a 및 24b는 PBMC에서 막-결합 IL-12(mbIL-12) 발현 세포의 백분율 및 mbIL-12 발현량을 각각 보여주고, CMV pp65 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC 내 구성 세포 유형을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 25는 1 μM의 HLA-B*07-제한 pp65 항원 펩티드에 의한 추가의 재자극(B07 펩티드 재자극)이 있거나 없는 가운데, CMV pp65 항원, CD86, mbIL-2, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩될 때, CD3+CD8+ 반응자 T 세포 내 IFN-γ+ 집단의 양을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 26은 1 μM의 HLA-B*07-제한 pp65 항원 펩티드에 의한 추가의 재자극(B07 펩티드 재자극)이 있거나 없는 가운데, CMV pp65 항원, CD86, mbIL-2, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩될 때, CD3+CD8+ 반응자 T 세포 내 IFN-γ+CD45RO+ 집단의 양을 보여주는 그래프이다.
도 27a 및 27b는 CMV pp65 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 CD86 발현량 및 CD86 발현 세포의 백분율을 각각 보여주는 그래프이다.
도 27c 및 27d는 CMV pp65 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 막-결합 IL-2(mbIL-2) 발현량 및 mbIL-2 발현 세포의 백분율을 각각 보여주는 그래프이다.
도 27e 및 27f는 CMV pp65 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 막-결합 IL-2(mbIL-2) 발현량 및 mbIL-2 발현 세포의 백분율을 각각 보여주는 그래프이다.
도 28은 HLA-A*01 또는 HLA-B*07-제한(YSE(A01), TPR(B07) 또는 RPH(B07))에 특이적인 1 μM의 pp65 항원 펩티드에 의한 추가 재자극이 있거나 없는 가운데, CMV pp65 항원, CD86, mbIL-2, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩될 때, CD3+CD8+ 반응자 T 세포 내 IFN-γ+CD45RO+ 집단의 양을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 29a 및 29b는 인플루엔자 M1 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 CD86 발현 세포의 백분율 및 CD86 발현양을 각각 보여주는 그래프이다.
도 29c 및 29d는 인플루엔자 M1 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 막-결합 IL-2(mbIL-2) 발현 세포의 백분율 및 mbIL-2 발현양을 각각 보여주는 그래프이다.
도 29e 및 29f는 인플루엔자 M1 항원, CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 막-결합 IL-12(mbIL-12) 발현 세포의 백분율 및 mbIL-12 발현양을 각각 보여주는 그래프이다.
도 30은 1 μM의 M1 항원 펩티드로 추가로 재자극하면서, 인플루엔자 M1 항원, CD86, mbIL-2, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩될 때, IFN-γ+CD45RO+ CD8 T 세포의 양을 보여주는 그래프이다.
도 31은 1 μM의 M1 항원 펩티드로 추가로 재자극하면서, 인플루엔자 M1 항원, CD86, mbIL-2, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩될 때, CD3+CD8 반응자 T 세포 내 IFN-γ+CD45RO+ 집단의 양을 보여주는 그래프이다.
도 32는 M1 항원, CD86, mbIL-2, 및/또는 mbIL-12를 암호화하는 mRNA의 표시된 양이 PBMC에 스퀴즈 로딩된 후, 1 μM의 pp65 항원에 의한 재자극이 있거나 없는 가운데 처리하고, CpG 보조제에 의한 컨디셔닝이 있거나 없는 가운데 추가로 배양했을 때, CD3+CD8+ 반응자 T 세포 내 인플루엔자 M1 사량체-양성 T 세포 집단의 양을 보여주는 그래프를 포함한다.
도 33은 HPV16 E6을 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 특이적 HLA 일배체형의 PBMC가 항원 특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위한 실험을 나타내는 개략도이다.
도 34는 E6 mRNA가 스퀴즈-로딩된 PBMC(E6 mRNA), 미처리 PBMC(미 접촉), 모의-스퀴즈-로딩된 PBMC(빈 스퀴즈), 또는 1 mM E615-24 펩티드가 스파이크된 미 접촉 PBMC(양성 대조군) 중 하나와 공동 배양하고, 제조사의 프로토콜에 따라 현상한 E615-24 반응자 T 세포의 ELISPOT 플레이트의 이미지이다.
도 35는 E6 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC(E6 mRNA), 1 mM E615-24 펩티드가 스파이크된 미처리 PBMC(양성 대조군) 중 하나와 공동 배양하고, 제조사의 프로토콜에 따라 현상한 E615-24 반응자 T 세포에 대한 IFN-γ ELISPOT 검정에서 세포당 스팟 형성 단위(SFU)의 평균 양을 보여준다.
도 36은 E6 mRNA가 스퀴즈-로딩된 PBMC(E6 mRNA), 미처리 PBMC(빈 스퀴즈), 모의-스퀴즈-로딩된 PBMC(빈 스퀴즈), 또는 1 mM E615-24 펩티드가 스파이크된 미 접촉 PBMC(양성 대조군) 중 하나와 공동 배양하고, 제조사의 프로토콜에 따라 현상한 E615-24 반응자 T 세포에 대한 IFN-γ ELISPOT 검정에서 평균 스팟 크기를 보여준다.
도 37은 E7 mRNA가 스퀴즈 로딩된 특이적 HLA 일배체형의 PBMC가 항원 특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있는 기간을 보여주는 개략도이다.
도 38a는 (i) E7 mRNA, (ii) E7 mRNA 및 E7 E6 mRNA, (iv) E7.6 합성 긴 펩티드(SLP)를 스퀴즈 로딩하거나, (v) 첨가물 없이 스퀴즈 로딩한(빈 스퀴즈) PBMC와 함께 공동 배양하거나, E711-20 펩티드(E7 최소 에피토프)가 존재하는 가운데 미처리 PBMC와 함께 공동 배양한 E711-20 반응자 T 세포에 대한 IFN-γ ELISA의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 38b는 (i) E7 mRNA, (ii) E7 mRNA 및 E7 E6 mRNA, (iv) E7.6 합성 긴 펩티드(SLP)를 스퀴즈 로딩하거나, (v) 첨가물 없이 스퀴즈 로딩한(빈 스퀴즈) PBMC와 함께 공동 배양하거나, E711-20 펩티드(E7 최소 에피토프)가 존재하는 가운데 미처리 PBMC와 함께 공동 배양한 E711-20 반응자 T 세포에 대한 IFN-γ ELISA의 결과를 보여주는 그래프이며, 여기서 PBMC는 공동 배양하기 전에 표시된 기간 동안 배양하였다.
도 39a는 (i) E7 mRNA, (ii) E7 mRNA 및 E7 E6 mRNA, (iv) E7.6 합성 긴 펩티드(SLP)를 스퀴즈 로딩하거나, (v) 첨가물 없이 스퀴즈 로딩한(빈 스퀴즈) PBMC와 함께 공동 배양하거나, E711-20 펩티드(E7 최소 에피토프)가 존재하는 가운데 미처리 PBMC와 함께 공동 배양한 E711-20 반응자 T 세포에 대한 IFN-γ ELISA의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 39b는 (i) E7 mRNA, (ii) E7 mRNA 및 E7 E6 mRNA, (iv) E7.6 합성 긴 펩티드(SLP)를 스퀴즈 로딩하거나, (v) 첨가물 없이 스퀴즈 로딩한(빈 스퀴즈) PBMC와 함께 공동 배양하거나, E711-20 펩티드(E7 최소 에피토프)가 존재하는 가운데 미처리 PBMC와 함께 공동 배양한 E711-20 반응자 T 세포에 대한 IFN-γ ELISA의 결과를 보여주는 그래프이며, 여기서 PBMC는 공동 배양하기 전에 표시된 기간 동안 배양하였다.
도 40은 (i) 500 μg/ml E6 mRNA 및 500 μg/ml E7 mRNA, (ii) CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및 막-결합 IL-12(mbIL-12), (iii) E6 및 E7 mRNA, 및 CD86, mbIL-2, 및 mbIL-12를 암호화하는 mRNA, (iv) E6 및 E7 합성 긴 펩티드(SLP)가 스퀴즈 로딩된 PBMC, 또는 (v) 첨가물 없이 스퀴즈 로딩한(빈 스퀴즈) PBMC와 함께 공동 배양하거나, E629-38 펩티드(E6 최소 에피토프) 및/또는 E7 최소 펩티드(E7 최소 펩티드)가 존재하는 가운데 미처리 PBMC와 함께 공동 배양한 E629-38 TCR 저캇-루시아 NFAT 세포에 대한 QUANTI-Luc GOLD 루시퍼라아제 검정에서 형광을 보여주는 그래프이다.
도 41a, 41b는 (i) E6 mRNA 및 E7 mRNA, (ii) E7.6 및 E6 합성 긴 펩티드(SLP)가 스퀴즈 로딩된 PBMC, 또는 (iii) 첨가물 없이 스퀴즈 로딩한(빈 스퀴즈) PBMC와 함께 공동 배양하거나, E629-38 펩티드(E6 최소 에피토프) 및/또는 E7 최소 펩티드(E7 최소 에피토프)가 존재하는 가운데 미처리 PBMC와 함께 공동 배양한 E629-38 TCR 저캇-루시아 NFAT 세포에 대한 QUANTI-Luc GOLD 루시퍼라아제 검정에서 형광을 보여주는 그래프이다.
도 42a는 E619-28 TCR 또는 E711-19 TCR의 형질도입 후 E6 특이적 T 세포 또는 E7 특이적 T 세포의 FACs 분석을 보여주는 그래프이다. 도 42b, 42c는 다음과 공동 배양한 후 E6 특이적 T 세포 또는 E7 특이적 T 세포의 증가를 보여주는 그래프이다: E6+E7+신호 2/3 mRNA 세포(E6, E7, 및 신호 2/3 매개자를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), E6+E7 mRNA 단독 세포(E6, E7을 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), 신호 2/3 mRNA(신호 2/3 매개자를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), 또는 대조군 PBMC(빈 스퀴즈). 도 42d, 42e, 42f, 42g, 42h, 42i는 다음과 함께 공동 배양한 후; 및 E6 또는 E7 최소 에피토프로 재자극한 후, E6-TCR 또는 E7-TCR이 형질도입된 T 세포에서, IFNγ-생산 T 세포 또는 TNF-α-생산 T 세포의 자극을 보여주는 그래프이다: E6+E7+신호 2/3 mRNA 세포(E6, E7, 및 신호 2/3 매개자를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), E6+E7 mRNA 단독 세포(E6, E7을 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), 신호 2/3 mRNA(신호 2/3 매개자를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), 또는 대조군 PBMC(빈 스퀴즈).
도 43a, 42b, 43c, 43d, 및 43e는 다음으로 면역화시킨 마우스에서 pp65 항원 특이적 T 세포의 증가를 보여주는 그래프이다: eAPC-CMV 세포(pp65 및 신호2/신호3 매개자를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), pp65 단독 세포(pp65를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), 또는 미 가공 PBMC(미 접촉). 도 43f, 43g, 43h, 및 도 43i, 43j, 43k는 다음으로 면역화시킨 마우스에서 IFNγ-생산 T 세포, TNF-α-생산 T 세포, 또는 IL-2-생산 T 세포의 자극을 보여주는 그래프이다: eAPC-CMV 세포(pp65 및 신호2/신호3 매개자를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), pp65 단독 세포(pp65를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC), 또는 미가공 PBMC(미 접촉).
일부 양태에서, 본 발명은 개체에게 면역 반응을 자극하고/하거나 백신 접종을 필요로 하는 대상체에게 백신을 접종하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포(예: PBMC)를 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하고/하거나 백신 접종을 필요로 하는 개체에게 백신을 접종하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포내 전달된 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 전달하는 단계를 포함하되; 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: 먼저, 투입 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인 단계; 및 이어서, 단백질 또는 이의 단편을 섭동된 투입 세포에 진입시키기에 충분한 시간 동안, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 변형된 유핵 세포를 생성하는 단계. 일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하고/하거나 백신 접종을 필요로 하는 개체에게 백신을 접종하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 세포내 전달된 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 전달하는 단계를 포함하며; 여기서 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: 먼저, 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인 단계; 및 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하고, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 유핵 세포에서 발현되고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 변형된 유핵 세포가 생성되는, 단계. 본 개시의 특정 양태는 세포내 전달된 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물을 생성하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 유핵 세포는 협착부를 통과하고, 협착부는 단백질 또는 이의 단편이 변형 대상 면역 세포에 진입하도록 세포를 변형시켜 세포의 섭동을 유발한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 복수의 PBMC이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 하나 이상의 보조제와 함께 인큐베이션함으로써 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 세포내 도입된 단백질 또는 단편은 고유 단백질 서열의 전부 또는 실질적인 대부분을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA에 의해 암호화되어 세포내 도입된 단백질 또는 단편은 고유 단백질 서열의 전부 또는 실질적인 대부분을 포함한다.
본원에 기술되거나 참조된 기술 및 절차는 당업자에 의해 일반적으로 잘 이해되고, 예를 들어 하기 문헌에 기술된 널리 사용되는 방법론과 같은 통상의 방법론을 사용해 당업자에 의해 일반적으로 사용된다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook 등, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, 등 eds., 2003); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames 및 G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, 및 D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir 및 C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller 및 M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis 등, eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan 등, eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel 등, eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway 등, 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd 및 C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow 및 D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti 및 J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); 및 Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita 등, eds., J.B. Lippincott Company, 2011).
정의
본 명세서를 해석하기 위한 목적으로, 다음의 정의가 적용될 것이며, 적절한 경우, 단수로 사용된 용어는 복수를 포함할 것이고 그 반대도 마찬가지일 것이다. 아래에 제시된 정의가 참조로서 본원에 통합된 문서와 상충하는 경우, 제시된 정의가 우선한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 달리 명시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
본원에 기술된 본 발명의 양태 및 구현예는 "포함하는", "이루어지는", 및 "본질적으로 이루어지는" 양태 및 구현예를 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 이러한 기술 분야의 당업자에게 쉽게 알려진 각각의 값에 대한 통상적인 오차 범위를 지칭한다. 본원에서 "약" 어떤 값 또는 "약" 어떤 파라미터라고 언급하는 것은 해당 값 또는 파라미터 그 자체에 관한 구현예를 포함(및 기술)한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "치료"는 유익하거나 원하는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "치료"는 인간을 포함하는 포유동물에서 질환에 대한 치료제의 임의의 투여 또는 도포을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 바람직한 임상 결과는 다음 중 임의의 하나 이상을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다: 하나 이상의 증상 완화, 질환의 정도 감소, 질환의 확산(예: 전이, 예를 들어 폐 또는 림프절로의 전이)의 예방 또는 지연, 질환 재발의 예방 또는 지연, 질병 진행의 지연 또는 둔화, 병태의 개선, 질환 또는 질환 진행의 억제, 질환 또는 질환 진행의 억제 또는 둔화, 발병의 저지, 및 관해(부분 관해 또는 완전 관해 불문). "치료"는 증식성 질환의 병리학적 결과의 감소도 포괄한다. 본 발명의 방법은 치료의 이들 양태 중 임의의 하나 이상을 고려한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방적 치료"는 개체가 장애를 가진 것을 알고 있거나, 장애를 가진 것으로 또는 가질 위험이 있는 것으로 의심되지만, 장애의 증상이 나타나지 않거나 최소한의 증상이 나타날 때의 치료를 지칭한다. 예방적 치료를 받는 개체는 증상의 발생 전에 치료를 받을 수 있다. 일부 구현예에서, 개체가 전암성 병변을 갖는 경우 치료를 받을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "병용 요법"은 제1 제제가 다른 제제와 함께 투여되는 것을 의미한다. "함께(in conjunction with)"는, 다른 치료 방법에 추가하여 하나의 치료 방법을 투여하는 것, 예컨대 본원에 기술된 것과 같은 면역접합체를 투여하는 것에 추가하여 본원에 기술된 것과 같은 유핵 세포의 조성물을 동일한 개체에게 투여되는 것을 지칭한다. 이와 같이, "함께"는 다른 치료 방법을 개체에게 전달하기 전에, 전달하는 동안, 또는 전달한 후에 하나의 치료 방법을 투여하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동시 투여(simultaneous administration)"는 병용 요법에서 제1 요법 및 제2 요법이 약 15분 이하, 예컨대 약 10, 5, 또는 1분 이하의 간격을 두고 투여되는 것을 의미한다. 제1 및 제2 요법이 동시에 투여될 때, 제1 및 제2 요법은 동일한 조성물(예: 제1 및 제2 요법 둘 다를 포함하는 조성물)에 함유되거나 별도의 조성물(예: 제1 요법을 함유하는 하나의 조성물 및 제2 요법을 함유하는 또 다른 조성물)에 함유될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "순차 투여(sequential administration)"는 병용 요법에서 제1 요법 및 제2 요법이 약 15분 초과, 예컨대 약 20, 30, 40, 50, 60분 또는 그 이상의 간격을 두고 투여되는 것을 의미한다. 제1 요법 또는 제2 요법 중 어느 하나가 먼저 투여할 수 있다. 제1 및 제2 요법은 별도의 조성물에 함유되어 동일하거나 상이한 패키지 또는 키트에 함유될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "동반 투여(concurrent administration)"는 병용 요법에서 제1 요법의 투여와 제2 요법의 투여가 서로 중첩되는 것을 의미한다.
암의 맥락에서, 용어 "치료하는 것"은 암세포를 사멸시키는 것, 암세포의 성장을 억제하는 것, 암세포의 복제를 억제하는 것, 전체 종양 부담을 줄이는 것, 및 질환과 연관된 하나 이상의 증상을 개선하는 것 중 어느 하나 또는 전부를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "공극(pore)"은, 물질 내의 구멍, 열상, 공동, 애퍼쳐, 파열, 갭, 또는 천공을 포함하되 이들로 한정되지 않는 개구를 지칭한다. 일부 예에서, (표시된 경우) 상기 용어는 본 개시의 표면 내의 공극을 지칭한다. 다른 예에서, (표시된 경우) 공극은 세포막 내의 공극을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "막"은 공극을 함유하는 선택적 장벽 또는 시트를 지칭한다. 상기 용어는 경계 또는 라이닝으로서 작용하는 유연한 시트형 구조를 포함한다. 일부 예에서, 상기 용어는 공극을 함유하는 표면 또는 필터를 지칭한다. 상기 용어는 용어 "세포막"과 구별된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "필터"는 공극을 통해 선택적 통과를 허용하는 다공성 물질을 지칭한다. 일부 예에서, 상기 용어는 공극을 함유하는 표면 또는 막을 지칭한다.
세포와 관련된 항원 또는 보조제와 같은 제제와 관련하여 사용될 때의 용어 "외인성"은 세포 외부에 있는 제제 또는 세포 외부에서 세포 내로 전달되는 제제를 지칭한다. 세포는 제제를 갖지 않거나 세포에 제제가 이미 존재할 수 있고, 세포는 외인성 제제가 전달된 후에 제제를 생산하거나 생산하지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이종"은 구조 또는 조성물에 혼합되어 있거나 구조 또는 조성물에서 균일하지 않은 어떤 것을 지칭하도록 사용된다. 일부 예에서, 상기 용어는 주어진 표면 내에서 다양한 크기, 형상, 또는 분포를 갖는 공극을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "균질한"은 구조 또는 조성물 전체에 걸쳐 일관되거나 균일한 어떤 것을 지칭하도록 사용된다. 일부 예에서, 상기 용어는 주어진 표면 내에서 동일한 크기, 형상, 또는 분포를 갖는 공극을 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "상동"은 동일한 유기체로부터 유래된 분자를 지칭한다. 일부 예에서, 상기 용어는 주어진 유기체 내에서 정상적으로 발견되거나 발현되는 핵산 또는 단백질을 지칭한다.
코딩 서열 및 조절 서열과 같은 핵산 서열과 관련될 때의 용어 "이종"은, 정상적으로는 함께 결합되지 않는 서열 및/또는 정상적으로는 특정 세포와 연관되지 않는 서열을 나타낸다. 따라서, 핵산 작제물 또는 벡터의 "이종" 영역은 자연에서 다른 분자와 관련하여 발견되지 않는 다른 핵산 분자 내에 있거나 이에 부착된 핵산의 분절이다. 예를 들어, 핵산 작제물의 이종 영역은 자연에서 코딩 서열과 관련하여 발견되지 않는 서열이 측면에 위치한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 이종 코딩 서열의 또 다른 예는, 코딩 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 작제물이다(예를 들어 고유 유전자와 상이한 코돈을 갖는 합성 서열). 유사하게, 세포 내에 정상적으로 존재하지 않는 작제물로 형질전환된 세포는 본 발명의 목적을 위해 이종으로 간주될 것이다. 대립유전자 변이 또는 자연 발생 돌연변이 이벤트는 본원에서 사용되는 것과 같은 이종 DNA를 생성하지 않는다.
펩티드 서열 및 폴리펩티드 서열과 같은 아미노산 서열과 관련될 때의 용어 "이종"은, 정상적으로는 함께 결합되지 않는 서열 및/또는 정상적으로는 특정 세포와 연관되지 않는 서열을 나타낸다. 따라서, 펩티드 서열의 "이종" 영역은 자연에서 다른 분자와 관련하여 발견되지 않는 다른 아미노산 분자 내에 있거나 이에 부착된 아미노산의 분절이다. 예를 들어, 펩티드 작제물의 이종 영역은 자연에서 펩티드의 아미노산 서열과 관련하여 발견되지 않는 서열이 측면에 위치한 펩티드의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이종 펩티드 서열의 또 다른 예는, 펩티드 서열 자체가 자연에서 발견되지 않는 작제물이다(예를 들어 코딩되었을 때, 고유 유전자와 상이한 아미노산을 갖는 합성 서열). 유사하게, 세포 내에 정상적으로 존재하지 않는 아미노산 작제물을 발현하는 벡터로 형질전환된 세포는 본 발명의 목적을 위해 이종으로 간주될 것이다. 대립유전자 변이 또는 자연 발생 돌연변이 이벤트는 본원에서 사용되는 것과 같은 이종 펩티드를 생성하지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "억제(inhibit)"는 특정 표적의 존재 또는 활성을 차단, 감소, 제거, 또는 달리 길항시키는 작용을 지칭할 수 있다. 억제는 부분 억제 또는 완전한 억제를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 억제하는 것은 면역 반응의 차단, 감소, 제거, 또는 임의의 다른 길항작용을 초래하는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산의 발현 억제는 핵산의 전사 감소, mRNA 풍부도의 감소(예를 들어 mRNA 전사의 침묵화), mRNA의 분해, mRNA 번역의 억제 등을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 또 다른 예에서, 억제는 성장을 둔화시키거나 중단시키는 작용; 예를 들어 종양 세포의 성장을 지연시키거나 방지하는 작용을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "저해(suppress)"는 특정 표적의 존재 또는 활성을 감소, 금지, 제한, 경감, 또는 달리 감쇠시키는 작용을 지칭할 수 있다. 저해는 부분 저해 또는 완전 저해를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 저해하는 것은 면역 반응의 감소, 금지, 제한, 경감, 또는 달리 감쇠시키는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산의 발현 저해는 핵산의 전사 감소, mRNA 풍부도의 감소(예를 들어 mRNA 전사의 침묵화), mRNA의 분해, mRNA 번역의 억제 등을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "강화(enhance)"는 특정 표적의 존재 또는 활성을 개선, 부스팅, 높이는 것, 또는 달리 증가시키는 작용을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 강화하는 것은 면역 반응을 개선, 부스팅, 높이는 것, 또는 달리 증가시키는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 예시적인 일례에서, 면역 반응을 강화하는 것은 항원 및/또는 보조제를 사용해 면역 반응을 개선, 부스팅, 높이는 것, 또는 달리 증가시키는 것을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산의 발현 강화는 핵산의 전사 증가, mRNA 풍부도의 증가(예를 들어 mRNA 전사의 증가), mRNA의 분해 감소, mRNA 번역의 증가 등을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "조절(modulate)"은 특정 표적의 존재 또는 활성을 변화, 변경, 가변, 또는 달리 변형하는 작용을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 조절하는 것은 면역 반응의 변화, 변경, 가변, 또는 달리 변형을 초래하는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 일부 예에서, "조절"은 특정 표적의 존재 또는 활성을 강화하는 것을 지칭한다. 일부 예에서, "조절"은 특정 표적의 존재 또는 활성을 저해하는 것을 지칭한다. 다른 예에서, 핵산의 발현 조절은 핵산의 전사 변화, mRNA 풍부도의 변화(예를 들어 mRNA 전사의 증가), mRNA의 분해에 있어서 상응하는 변화, mRNA 번역의 변화 등을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유도"는 결과를 개시, 촉진, 자극, 확립, 또는 달리 생성하는 작용을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 면역 반응을 유도하는 것은 원하는 면역 반응을 개시, 촉진, 자극, 확립, 또는 달리 생성하는 임의의 작용을 지칭할 수 있다. 다른 예에서, 핵산의 발현을 유도하는 것은 핵산의 전사 개시, mRNA 번역 개시 등을 포함할 수 있지만 이에 한정되지는 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "말초 혈액 단핵구" 또는 "PBMC"는 둥근 핵을 갖는 혈구의 이종 모집단을 지칭한다. PBMC의 모집단에서 발견될 수 있는 세포의 예는 T 세포, B 세포, NK 세포(자연 살해 T 세포(NKT 세포) 및 사이토카인 유도성 살해 세포(CIK 세포) 포함)와 같은 림프구, 및 대식세포 및 수지상 세포와 같은 단핵구를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "복수의 PBMC"는 적어도 2가지 유형의 혈구로 이루어진 세포를 포함하는 PBMC의 제제를 지칭한다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포, 또는 수지상 세포 중 2개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포, 또는 수지상 세포 중 3개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포, 또는 수지상 세포 중 4개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 대식세포, 및 수지상 세포를 포함한다.
PBMC는 당업계에 알려진 수단에 의해 단리될 수 있다. 예를 들어, PBMC는 다른 혈액 세포와 비교하여 PBMC의 밀도에 기초하여 개체의 말초 혈액으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC는 피콜(Ficoll)(예: 피콜 구배)을 사용하여 개체의 말초 혈액으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, PBMC는 ELUTRA® 세포 분리 시스템을 사용하여 개체의 말초 혈액으로부터 유래된다. PBMC는 성분채집술을 거친 개체로부터 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, PBMC의 모집단이 개체로부터 단리된다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는, 특정 개체로부터 모집단이 유래되고, 본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 의해 조작되어, 특정 개체에게 다시 투여되는 PBMC의 자가 모집단이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는, 하나의 개체로부터 모집단이 유래되고, 본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 의해 조작되어, 제2 개체에게 투여되는 PBMC의 동종이계 모집단이다.
일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 재구성된 PBMC의 제제이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 PBMC의 모집단에서 일반적으로 발견되는 세포를 혼합함으로써, 예를 들어 T 세포, B 세포, NK 세포, 또는 단핵구 중 2개 이상의 모집단을 혼합함으로써 생성될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드(리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드)의 중합체 형태를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 다음을 포함하는 중합체를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다: 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 다른 천연 염기, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 염기, 비-천연 염기, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기. 폴리뉴클레오티드의 골격은 (RNA 또는 DNA에서 일반적으로 발견될 수 있는 것과 같은) 당 및 인산염 기, 또는 변형되거나 치환된 당 또는 인산염 기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드의 골격은 포스포라미데이트 및 포스포로티오에이트와 같은 합성 아단위의 중합체를 포함할 수 있고, 따라서 올리고데옥시뉴클레오시드 포스포라미데이트(P-NH2), 혼합된 포스포로티오에이트-포스포디에스테르 올리고머, 또는 혼합된 포스포라미데이트-포스포디에스테르 올리고머일 수 있다. 또한, 이중-가닥 폴리뉴클레오티드는, 상보성 가닥을 합성하고, 적절한 조건 하에서 가닥을 어닐링함으로써, 또는 적절한 프라이머와 함께 DNA 중합효소를 사용하여 상보성 가닥을 드노보(de novo) 합성함으로써, 화학적으로 합성된 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 생성물로부터 수득될 수 있다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 지칭하도록 상호 교환적으로 사용되며, 최소 길이로 한정되지는 않는다. 아미노산 잔기의 이러한 중합체는 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기를 함유할 수 있고, 펩티드, 올리고펩티드, 아미노산 잔기의 이량체, 삼량체, 및 다량체를 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다. 전장 단백질 및 이의 단편 둘 다는 정의에 포함된다. 상기 용어는 또한 폴리펩티드의 사후-발현 변형, 예를 들어 당질화, 시알화, 아세틸화, 인산화 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 목적을 위해, "폴리펩티드"는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 고유 서열에 대한 결실, 첨가, 및 치환(자연에서는 일반적으로 보존적 치환)과 같은 변형을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이러한 변형은, 부위-지향성 돌연변이유발을 통해 이루어지는 것과 같이 의도적인 변형이거나, 예컨대 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오류를 통해 이루어지는 것과 같이 우발적인 변형일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보조제"는 면역 반응을 조절하고/하거나 야기하는 물질을 지칭한다. 일반적으로, 보조제는 항원과 함께 투여되어 항원 단독과 비교하여 항원에 대한 면역 반응을 강화시킨다. 다양한 보조제가 본원에 기술된다.
본원에서의 용어 "CpG 올리고데옥시뉴클레오티드" 및 "CpG ODN"은 인산염에 의해 분리된 시토신 및 구아닌의 디뉴클레오티드를 함유하는 10 내지 30 뉴클레오티드 길이의 DNA 분자를 지칭한다(본원에서는 "CpG" 디뉴클레오티드 또는 "CpG"로도 지칭됨). 본 개시의 CpG ODN은 적어도 하나의 메틸화되지 않은 CpG 디뉴클레오티드를 함유한다. 즉, CpG 디뉴클레오티드의 시토신은 메틸화되지 않는다(즉, 5-메틸시토신이 아님). CpG ODN은 부분 또는 완전한 포스포로티오에이트(PS) 골격을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한" 또는 "약학적으로 호환 가능한"은 생물학적으로 바람직하지 않거나 달리 바람직하지 않은 것이 아닌 물질을 의미하며, 예를 들어 상기 물질은 환자에게 투여되는 약학적 조성물에 혼입되어, 임의의 바람직하지 않은 유의한 생물학적 효과를 야기하거나, 해당 물질이 함유된 조성물의 다른 성분 중 어느 하나와 유해한 방식으로 상호작용하지 않는 물질일 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제는 바람직하게는 독성학 및 제조 시험의 요구되는 표준을 충족시켰으며/거나 미국 식품의약국이 마련한 비활성 성분 가이드에 포함되어 있다.
본원에 기술된 임의의 구조적 및 기능적 특징 어느 하나에 대해, 이들 특징을 결정하는 방법이 당업계에 공지되어 있다.
숙주 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는 방법
일부 양태에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 유핵 세포(예: PBMC)를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 유핵 세포는 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기술된 조성물 중 어느 하나의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 개체는 암을 갖는다.
일부 양태에서, 백신 접종를 필요로 하는 개체에게 백신을 접종하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다.
일부 양태에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA(예: 외인성 mRNA)를 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다.
일부 양태에서, 백신 접종을 필요로 하는 개체에게 백신을 접종하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA(예: 외인성 mRNA)를 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다.
일부 양태에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 유핵 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하고; 2개 이상의 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다. 일부 양태에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 유핵 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하고; 2개 이상의 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다.
일부 구현예에서, 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 단백질로부터 유래된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 75, 80, 90, 100개 또는 그 이상의 항원 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 중 적어도 2개는 부분적으로 중첩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 모든 항원의 아미노산 서열을 합치면 단백질의 아미노산 서열과 약 90% 이상 중첩된다. 일부 구현예에서, 모든 항원의 아미노산 서열을 합친 것은 단백질의 아미노산 서열의 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나와 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 80%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 항원과 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 80%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 3개의 항원과 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 90%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 항원과 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 90%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 3개의 항원과 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 95%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 항원과 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 95%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 3개의 항원과 중첩된다.
일부 구현예에서, 항원은 단백질의 2개 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 면역원성 펩티드 에피토프는 N-말단의 측면에 위치하는 폴리펩티드 및/또는 C-말단의 측면에 위치하는 폴리펩티드에 융합된다. 일부 구현예에서, 항원은 단백질의 하나 이상의 에피토프 및 하나 이상의 이종 펩티드 서열이다. 일부 구현예에서, N-말단 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 에피토프의 측면에는 이종 펩티드 서열이 위치한다. 일부 구현예에서, 측면에 위치하는 이종 펩티드 서열은 질환-연관 면역원성 펩티드로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 측면에 위치하는 이종 펩티드 서열은 비-자연 발생 서열이다. 일부 구현예에서, 측면에 위치하는 이종 펩티드 서열은 면역원성 합성 긴 펩티드(SLP)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, N-말단의 측면에 위치하는 폴리펩티드는 서열번호 5~10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 C-말단의 측면에 위치하는 폴리펩티드는 서열번호 11~17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 MHC 클래스 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 클래스 II-제한된 펩티드로 가공될 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질(예를 들어 신생 항원, 이에 한정되지는 않음), 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질이다. 일부 구현예에서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18이다. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질이다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 다음에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 단백질 또는 이의 단편을 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포는 다음에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
일부 구현예에서, 투입 세포 현탁액은 투입 유핵 세포 및 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 투입 세포 현탁액은 투입 유핵 세포 및 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 세포 현탁액은 투입 유핵 세포 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 투입 유핵 세포(예: PBMC)가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; b) 단백질 또는 이의 단편을 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계; 및 c) 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 개체에게 투여하는 단계. 일부 구현예에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하고, mRNA가 유핵 세포에서 발현되고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포가 생성되는 단계; 및 c) 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 개체에게 투여하는 단계. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다.
일부 구현예에서, 백식 접종을 필요로 하는 개체에게 백신을 접종하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 투입 유핵 세포(예: PBMC)가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; b) 단백질 또는 이의 단편을 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계; 및 c) 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 개체에게 투여하는 단계. 일부 구현예에서, 백신 접종을 필요로 하는 개체에게 백신을 접종하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하고, mRNA가 유핵 세포에서 발현되고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포가 생성되는 단계; 및 c) 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 개체에게 투여하는 단계. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다.
일부 구현예에서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은, 유핵 세포의 모집단 내에서 가장 작은 직경을 갖는 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 45%, 약 50% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 80%, 또는 약 60% 내지 약 70% 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 유핵 세포의 모집단 내에서 가장 작은 직경을 갖는 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 45%, 약 50% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 80%, 또는 약 60% 내지 약 70% 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 2 μm 내지 약 5 μm, 약 3 μm 내지 약 5 μm, 약 2 μm 내지 약 2.2 μm, 약 2.2 μm 내지 약 2.5 μm, 약 2.5 μm 내지 약 3 μm, 약 3 μm 내지 약 5 μm, 약 3 μm 내지 약 3.5 μm, 약 3.5 μm 내지 약 4 μm, 약 4 μm 내지 약 4.5 μm, 약 3.2 μm 내지 약 3.8 μm, 약 3.8 μm 내지 약 4.3 μm, 약 4.2 μm 내지 약 6 μm, 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 2 μm, 2.2 μm, 2.5 μm, 3 μm, 3.5 μm, 4 μm, 4.5 μm, 5 μm, 5.5 μm, 6 μm, 6.5 μm, 7 μm, 7.5 μm, 8 μm, 8.5 μm, 9 μm, 9.5 μm, 10 μm, 10.5 μm, 11 μm, 11.5 μm, 12 μm, 12.5 μm, 13 μm, 13.5 μm, 14 μm, 14.5 μm, 또는 15 μm 이하 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과한다.
본원에 기술된 방법, 용도, 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 유핵 세포(예: PBMC)는 유핵 세포가 컨디셔닝되기에 충분한 시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 1 내지 약 24시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 2 내지 약 10시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 3 내지 약 6시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간, 2시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간, 또는 24시간 중 어느 하나 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 유핵 세포 내로 도입하기 전에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 유핵 세포 내로 도입한 후에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 컨디셔닝을 위해 사용되는 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 알파-갈락토실 세라미드, STING 작용제, 환형 디뉴클레오티드(CDN), RIG-I 작용제, 폴리이노신산-폴리시티딜산(폴리 I:C), TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제이다. 예시적인 보조제는 CpG ODN, 인터페론-α(IFN-α), 폴리이노신산:폴리시티딜산(polyI:C), 이미퀴모드(R837), 레시퀴모드(R848), 또는 지질다당류(LPS)를 포함하며 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)이다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 7909(CpG ODN 2006으로도 알려짐)이다.
유핵 세포가 B 세포를 포함하는 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 분자는 컨디셔닝되지 않은 유핵 세포의 B 세포와 비교하여 컨디셔닝된 유핵 세포의 B 세포에서 상향조절된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 유핵 세포가 복수의 PBMC인 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 분자는 컨디셔닝되지 않은 복수의 PBMC의 B 세포와 비교하여 컨디셔닝된 복수의 PBMC의 B 세포에서 상향 조절된다. 일부 구현예에서, 공자극 분자는 CD80 및/또는 CD86이다. 일부 구현예에서, 컨디셔닝된 복수의 PBMC는 컨디셔닝되지 않은 복수의 PBMC와 비교하여 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현을 증가시킨다. 일부 구현예에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현은 컨디셔닝되지 않은 복수의 PBMC와 비교하여 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배, 또는 10배 초과만큼 증가된다.
본원에 기술된 방법, 용도, 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 유핵 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 HLA-A*02, HLA-A*01 , HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-A*11, HLA-A*26, HLA-A*32, HLA-A*31, HLA-A*68, HLA-A*29, HLA-A*23, HLA-B*07, HLA-B*44, HLA-B*08, HLA-B*35, HLA-B*15, HLA-B*40, HLA-B*27, HLA-B*18, HLA-B*51, HLA-B*14, HLA-B*13, HLA-B*57, HLA-B*38, HLA-C*07, HLA-C*04, HLA-C*03, HLA-C*06, HLA-C*05, HLA-C*12, HLA-C*02, HLA-C*01, HLA-C*08, 또는 HLA-C*16의 일배체형을 갖는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 복수의 PBMC이다. 일부 구현예에서, 컨디셔닝된 유핵 세포는 컨디셔닝된 복수의 변형된 PBMC이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 2개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상이다.
일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 공자극 분자 중 하나 이상의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 공자극 분자는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-10, IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, IFN-γ, IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IFN-α2 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 (변형된 사이토카인과 같은) 변이체 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 키메라 막-결합 사이토카인의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 변형되고, 변형된 사이토카인은 사이토카인 및 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합된다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 키메라 막-결합 사이토카인의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 변형되고, 변형된 사이토카인은 사이토카인 및 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 트랜스페린 수용체 단백질 1(TFRC) 또는 종양 괴사 인자(예: FasL) 막관통 도메인이다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호 81 또는 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 G4S 링커 또는 EAAAK 링커이다. 구현예에서, G4S 링커는 G4S 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 반복 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, EAAAK 링커는 EAAAK 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 반복 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 서열번호 77~80 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 변형된 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 증가시키는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 서열번호 71 또는 72의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 T 세포 활성화를 자극함에 있어서 신호 3 작동자이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 활성화를 유도한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 항원 특이적 CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 활성화를 유도한다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 비-막-결합 사이토카인과 비교하여 개체에서 사이토카인의 반감기를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인의 반감기는 비-막-결합 사이토카인과 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 막-결합 사이토카인은 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여, 단백질 또는 이의 단편과 함께 도입된 유핵 세포에 의해 제시된 항원과 사이토카인의 공간 결합을 다음 중 어느 하나만큼 연장시킨다: 약 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 48, 72, 96시간 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 막-결합 사이토카인을 추가로 포함하는 유핵 세포는, 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 국소 사이토카인 농도를 나타낸다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 막-결합 사이토카인을 추가로 포함하는 유핵 세포는, 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상.
일부 구현예에서, 막-고정된(membrane-tethered) 사이토카인은 막-고정된 케모카인이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 다회 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 약 3회 내지 약 9회 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 돌연변이된 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15회 투여하는 것 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 필요에 따라 유핵 세포를 연속 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 2회 연속 투여 사이의 시간 간격은 약 1일 내지 약 30일이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 2회 연속 투여 사이의 시간 간격은 약 21일이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 2회 연속 투여 사이의 시간 간격은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 또는 150일 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 첫 2회 연속 투여 사이의 시간 간격은 1일 또는 2일이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 처음 2회의 연속 투여 사이의 시간 간격은 1일 또는 2일이며, 상기 방법은 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 3회 이상 투여하는 것(예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15회 이상 투여하는 것, 이에 한정되지는 않음)을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 정맥내, 종양내, 및/또는 피하 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 정맥내 투여된다.
일부 구현예에서, 조성물은 보조제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, IFN-γ, STING 작용제, 환형 디뉴클레오티드(CDN), 알파-갈록토실 세라미드, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제이다. 예시적인 보조제는 CpG ODN, 인터페론-α(IFN-α), 폴리이노신산:폴리시티딜산(polyI:C), 이미퀴모드(R837), 레시퀴모드(R848), 또는 지질다당류(LPS)를 포함하며 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 7909이다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 보조제는 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 보조제는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 보조제 및/또는 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 정맥내, 종양내, 및/또는 피하 투여된다. 일부 구현예에서, 보조제 및/또는 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 정맥내 투여된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 보조제를 투여하기 전에 투여된다. 예를 들어, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 보조제가 투여되기 약 1시간 내지 약 1주일 전에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 보조제가 투여되기 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일 이전에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 보조제가 투여되기 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일 이전에 투여된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 보조제가 투여된 후에 투여된다. 예를 들어, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 보조제가 투여되고 약 1시간 내지 약 1주일 후에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 보조제가 투여되고 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 보조제가 투여되고 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 개체는 HLA-A*02, HLA-A*01 , HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-A*11, HLA-A*26, HLA-A*32, HLA-A*31, HLA-A*68, HLA-A*29, HLA-A*23, HLA-B*07, HLA-B*44, HLA-B*08, HLA-B*35, HLA-B*15, HLA-B*40, HLA-B*27, HLA-B*18, HLA-B*51, HLA-B*14, HLA-B*13, HLA-B*57, HLA-B*38, HLA-C*07, HLA-C*04, HLA-C*03, HLA-C*06, HLA-C*05, HLA-C*12, HLA-C*02, HLA-C*01, HLA-C*08, 또는 HLA-C*16의 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 개체는 HLA-A*02, HLA-A*11, 및/또는 HLA-B*07의 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포 중 적어도 하나의 세포는 HLA-A*02, HLA-A*11, 및/또는 HLA-B*07의 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 99% 중 적어도 하나의 세포는 HLA-A*02, HLA-A*11, 및/또는 HLA-B*07의 발현에 대해 양성이다. 유핵 세포가 복수의 PBMC인 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 변형된 PBMC 내의 T 세포의 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 99% 중 어느 하나는 HLA-A*02, HLA-A*11, 및/또는 HLA-B*07의 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 변형된 PBMC 내의 B 세포의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 99% 중 적어도 하나의 세포는 HLA-A*02, HLA-A*11, 및/또는 HLA-B*07의 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 변형된 PBMC 내의 NK 세포의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 99% 중 적어도 하나의 세포는 HLA-A*02, HLA-A*11, 및/또는 HLA-B*07의 발현에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 변형된 PBMC 내의 단핵구의 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 99% 중 적어도 하나의 세포는 HLA-A*02, HLA-A*11, 및/또는 HLA-B*07의 발현에 대해 양성이다.
본원에 기술된 방법, 용도, 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 치료제를 투여하기 전, 투여와 동시에, 또는 투여한 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 치료제는 면역 관문 억제제, 화학요법, 또는 방사선요법 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료제는 하나 이상을 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료제는 하나 이상을 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료제는 면역-종양학에 사용된 하나 이상의 이중특이적 폴리펩티드(예: 면역접합체)를 포함한다.
면역 관문은 면역 체계의 조절자이며 면역 반응을 억제한다. 면역 관문 억제제는 면역 반응의 강화를 촉진하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역 관문 억제제의 투여와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 면역 관문 억제제는 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 면역 관문 억제제는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제, 및/또는 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 정맥내, 종양내, 및/또는 피하 투여된다. 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제, 및/또는 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 정맥내 투여된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역 관문 억제제가 투여되기 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역 관문 억제제가 투여된 후에 투여된다. 예를 들어, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역 관문 억제제가 투여되기 약 1시간 내지 약 1주일 전에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역 관문 억제제가 투여되기 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일 이전에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역 관문 억제제가 투여되기 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일 이전에 투여된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역 관문 억제제가 투여되기 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 18일, 약 21일, 약 24일, 약 28일, 약 30일, 약 35일, 약 40일, 약 45일, 또는 약 50일 이전에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역 관문 억제제가 투여되기 약 7일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 14일, 약 14일 내지 약 18일, 약 18일 내지 약 21일, 약 21일 내지 약 24일, 약 24일 내지 약 28일, 약 28일 내지 약 30일, 약 30일 내지 약 35일, 약 35일 내지 약 40일, 약 40일 내지 약 45일, 또는 약 45일 내지 약 50일 이전에 투여된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역 관문 억제제가 투여된 후에 투여된다. 예를 들어, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역 관문 억제제가 투여되고 약 1시간 내지 약 1주일 후에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역 관문 억제제가 투여되고 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역 관문 억제제가 투여되고 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역 관문 억제제가 투여되고 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 18일, 약 21일, 약 24일, 약 28일, 약 30일, 약 35일, 약 40일, 약 45일, 또는 약 50일 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 면역 관문 억제제가 투여되고 약 7일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 14일, 약 14일 내지 약 18일, 약 18일 내지 약 21일, 약 21일 내지 약 24일, 약 24일 내지 약 28일, 약 28일 내지 약 30일, 약 30일 내지 약 35일, 약 35일 내지 약 40일, 약 40일 내지 약 45일, 또는 약 45일 내지 약 50일 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물을 여러 번 투여하고/하거나 면역 관문 억제제를 여러 번 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 방법은 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물 및/또는 면역 관문 억제제를 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 또는 15회 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 방법은 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물 및/또는 면역 관문 억제제를 5회 미만, 10회 미만, 15회 미만, 20회 미만, 25회 미만, 30회 미만, 50회 미만, 75회 미만, 100명 미만, 또는 200회 미만으로 투여하는 단계를 포함한다.
예시적인 면역 관문 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM-3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1), 또는 BTLA를 표적으로 하지만 이들로 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM-3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1), 또는 BTLA 중 하나 이상을 표적으로 한다. 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 다음 중 하나 이상이다: PD-1에 결합하는 항체, PD-L1에 결합하는 항체, CTLA-4에 결합하는 항체, LAG3에 결합하는 항체, 또는 TIM-3에 결합하는 항체, TIGIT에 결합하는 항체, VISTA에 결합하는 항체, TIM-1에 결합하는 항체, B7-H4에 결합하는 항체, 또는 BTLA에 결합하는 항체. 추가의 구현예에서, 항체는 전장 항체 또는 임의의 변이체, 예를 들어 항체 단편, 단쇄 가변 단편(ScFv), 또는 단편 항원 결합(Fab)일 수 있지만 이에 한정되지는 않는다. 추가의 구현예에서, 항체는 이중특이적, 삼중특이적, 또는 다중특이적일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM-3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1), 또는 BTLA 중 하나 이상에 결합하고/하거나 이를 억제하는 하나 이상의 화학적 화합물이다. 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG3, TIM-3, TIGIT, VISTA, TIM1, B7-H4 (VTCN1), 또는 BTLA 중 하나 이상에 결합하고/하거나 이를 억제하는 하나 이상의 펩티드이다. 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 PD-1에 대해 표적화된다. 일부 구현예에서, 면역 관문 억제제는 PD-L1에 대해 표적화된다.
사이토카인은 본원에 기술된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나와 함께 사용되어 암, 예를 들어 돌연변이된 단백질과 연관된 암에 대한 부가적 또는 상승 효과를 달성할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 항원을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 하나 이상의 사이토카인의 투여와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 사이토카인은 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 사이토카인은 순차적으로 투여된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인이 투여되기 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인이 투여된 후에 투여된다. 예를 들어, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인이 투여되기 약 1시간 내지 약 1주일 전에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인이 투여되기 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일 이전에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인이 투여되기 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일 이전에 투여된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인이 투여되기 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 18일, 약 21일, 약 24일, 약 28일, 약 30일, 약 35일, 약 40일, 약 45일, 또는 약 50일 이전에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인이 투여되기 약 7일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 14일, 약 14일 내지 약 18일, 약 18일 내지 약 21일, 약 21일 내지 약 24일, 약 24일 내지 약 28일, 약 28일 내지 약 30일, 약 30일 내지 약 35일, 약 35일 내지 약 40일, 약 40일 내지 약 45일, 또는 약 45일 내지 약 50일 이전에 투여된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인이 투여된 후에 투여된다. 예를 들어, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인이 투여되고 약 1시간 내지 약 1주일 후에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인이 투여되고 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인이 투여되고 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일 후에 투여된다.
예시적인 사이토카인은 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인, 및 종양 괴사 인자, 또는 이들의 기능적 유도체를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 세포 면역 반응을 강화시킨다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 항체 반응을 강화시킨다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 I형 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 2형 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 다음 중 하나 이상을 포함한다: IL-2, IL-15, IL-10, IL-12, IFN-α, 또는 IL-21. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-15를 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인 모이어티를 포함하는 이중특이적 폴리펩티드가 투여되기 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 사이토카인 모이어티 및 면역 관문 억제제 모이어티를 포함하는 이중특이적 폴리펩티드가 투여되기 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 이중특이적 폴리펩티드는 CD3 표적화 모이어티 및 종양 항원 표적화 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 폴리펩티드는 2개의 면역 관문을 표적으로 하는 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 폴리펩티드는 간질(stroma)에서 발견되거나 암 연관 섬유아세포 상에서 발현된 항원을 표적으로 하는 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 이중특이적 폴리펩티드는 간질에서 발견되거나 암 연관 섬유아세포 상에서 발현된 항원을 표적으로 하는 모이어티 및 사이토카인 모이어티를 포함한다.
화학요법은 본원에 기술된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나와 함께 사용되어 암, 예를 들어 돌연변이된 단백질와 연관된 암에 대한 부가적 또는 상승적 효과를 달성할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 화학요법의 투여와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 화학요법은 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 화학요법은 순차적으로 투여된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 화학요법이 투여되기 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 화학요법이 투여된 후에 투여된다. 예를 들어, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 화학요법이 투여되기 약 1시간 내지 약 1주일 전에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 화학요법이 투여되기 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일 이전에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 화학요법이 투여되기 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일 이전에 투여된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 화학요법이 투여된 후에 투여된다. 예를 들어, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 화학요법이 투여되고 약 1시간 내지 약 1주일 후에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 화학요법이 투여되고 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 화학요법이 투여되고 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 화학요법이 투여되고 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 18일, 약 21일, 약 24일, 약 28일, 약 30일, 약 35일, 약 40일, 약 45일, 또는 약 50일 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 화학요법이 투여되고 약 7일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 14일, 약 14일 내지 약 18일, 약 18일 내지 약 21일, 약 21일 내지 약 24일, 약 24일 내지 약 28일, 약 28일 내지 약 30일, 약 30일 내지 약 35일, 약 35일 내지 약 40일, 약 40일 내지 약 45일, 또는 약 45일 내지 약 50일 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물을 여러 번 투여하고/하거나 화학요법을 여러 번 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 방법은 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물 및/또는 화학요법을 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 또는 15회 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 방법은 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물 및/또는 화학요법을 5회 미만, 10회 미만, 15회 미만, 20회 미만, 25회 미만, 30회 미만, 50회 미만, 75회 미만, 100명 미만, 또는 200회 미만으로 투여하는 단계를 포함한다.
예시적인 화학요법은 세포 주기 의존적이거나 세포 주기 독립적일 수 있다. 일부 구현예에서, 화학요법은 하나 이상의 화학요법제를 포함한다. 일부 구현예에서, 화학요법제는 암에서 세포 분열, DNA, 또는 대사 중 하나 이상을 표적으로 할 수 있다. 일부 구현예에서, 화학요법제는 시스플라틴, 옥살리플라틴, 또는 카르보플라틴과 같은 그러나 이에 한정되지 않는 백금계 제제이다. 일부 구현예에서, 화학요법제는 탁산(예컨대 도세탁셀 또는 파클리탁셀)이다. 일부 구현예에서, 화학요법제는 5-플루오로우라실, 독소루비신, 또는 이리노테칸이다. 일부 구현예에서, 화학요법제는 다음 중 하나 이상이다: 알킬화제, 항대사물, 항종양 항생제, 국소이성화효소 억제제, 또는 유사분열 억제제. 일부 구현예에서, 화학요법은 시스플라틴을 포함한다.
방사선요법은 본원에 기술된 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나와 함께 사용되어 암, 예를 들어 돌연변이된 단백질 또는 이의 단편과 연관된 암에 대한 부가적 또는 상승적 효과를 달성할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 방사선요법의 투여와 함께 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 방사선요법은 동시에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물과 방사선요법은 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 방사선요법의 투여와 함께, 화학요법의 투여와 함께, 및/또는 면역 관문 억제제의 투여와 함께 투여된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 방사선요법이 투여되기 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 방사선요법이 투여된 후에 투여된다. 예를 들어, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 방사선요법이 투여되기 약 1시간 내지 약 1주일 전에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 방사선요법이 투여되기 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일 이전에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 방사선요법이 투여되기 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일 이전에 투여된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 방사선요법이 투여된 후에 투여된다. 예를 들어, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 방사선요법이 투여되고 약 1시간 내지 약 1주일 후에 투여된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 방사선요법이 투여되고 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 6시간, 약 8시간, 약 10시간, 약 12시간, 약 14시간, 약 16시간, 약 18시간, 약 20시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 60시간, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 또는 약 7일 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 방사선요법이 투여되고 약 1시간 내지 약 2시간, 약 2시간 내지 약 3시간, 약 3시간 내지 약 4시간, 약 4시간 내지 약 6시간, 약 6시간 내지 약 8시간, 약 8시간 내지 약 10시간, 약 10시간 내지 약 12시간, 약 12시간 내지 약 14시간, 약 14시간 내지 약 16시간, 약 16시간 내지 약 18시간, 약 18시간 내지 약 20시간, 약 20시간 내지 약 24시간, 약 24시간 내지 약 30시간, 약 30시간 내지 약 36시간, 약 36시간 내지 약 42시간, 약 42시간 내지 약 48시간, 약 48시간 내지 약 60시간, 약 60시간 내지 약 3일, 약 3일 내지 약 4일, 약 4일 내지 약 5일, 약 5일 내지 약 6일, 약 6일 내지 약 7일 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 방사선요법이 투여되고 약 7일, 약 10일, 약 14일, 약 18일, 약 21일, 약 24일, 약 28일, 약 30일, 약 35일, 약 40일, 약 45일, 또는 약 50일 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물은 방사선요법이 투여되고 약 7일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 14일, 약 14일 내지 약 18일, 약 18일 내지 약 21일, 약 21일 내지 약 24일, 약 24일 내지 약 28일, 약 28일 내지 약 30일, 약 30일 내지 약 35일, 약 35일 내지 약 40일, 약 40일 내지 약 45일, 또는 약 45일 내지 약 50일 후에 투여된다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물을 여러 번 투여하고/하거나 방사선요법을 여러 번 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 방법은 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물 및/또는 방사선요법을 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 11회, 12회, 13회, 14회, 또는 15회 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물 및/또는 방사선요법을 5회 미만, 10회 미만, 15회 미만, 20회 미만, 25회 미만, 30회 미만, 50회 미만, 75회 미만, 100명 미만, 또는 200회 미만으로 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 따라 개체에서 면역 반응을 자극하는 방법에 사용하기 위한, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 복수의 유핵 세포(예: PBMC)가 제공된다.
일부 구현예에서, 개체에서 단백질 또는 이의 단편에 대한 면역 반응을 자극하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 본원에 기술된 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물 중 어느 하나의 유효량을 포함한다. 일부 구현예에서, 종양 성장을 감소시키기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 본원에 기술된 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물 중 어느 하나의 유효량을 포함한다. 일부 구현예에서, 개체는 암을 및/또는 감염증을 갖는다. 일부 구현예에서, 개체에서 암 및/또는 감염증을 치료하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 본원에 기술된 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물 중 어느 하나의 유효량을 포함한다. 일부 구현예에서, 암은 HPV 연관 암 또는 HBV 연관 암이다. 일부 구현예에서, 개체는 HPV 및/또는 HBV에 감염되었다.
단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA
일부 구현예에서, 개체에서 면역 반응을 자극하고/하거나 백신 접종을 필요로 하는 개체에게 백신을 접종하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 세포내 전달된 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 전달하는 단계를 포함하며; 여기서 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: 먼저, 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인 단계; 및 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하고, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 유핵 세포에서 발현되고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 변형된 유핵 세포가 생성되는 단계.
일부 구현예에서, mRNA의 뉴클레오티드 서열은 유핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 구현예에서, mRNA의 뉴클레오티드 서열은 PBMC에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일부 구현예에서, mRNA의 코돈 최적화는 발현된 단백질의 형태 및 기능에 영향을 미치지 않거나 유의하게 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, mRNA의 코돈 최적화는 발현된 단백질로부터 처리된 항원의 형태 및 기능에 영향을 미치지 않거나 유의하게 영향을 미치지 않는다. 일부 구현예에서, mRNA는 비-자기 mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 외인성 mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 시험관내 전사된(IVT) mRNA이다. 일부 구현예에서, 외인성 mRNA는 시험관내 전사된(IVT) mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 재조합 단백질을 암호화한다.
일부 구현예에서, mRNA는 발현된 단백질의 항원 처리 및 제시를 향상시키기 위한 하나 이상의 변형을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 면역프로테아좀-표적화 모티프는 단백질 분해율의 조절에 중요한 단백질의 일부분이다. 일부 구현예에서, 면역프로테아좀-표적화 모티프는 항원 처리 경로에서 단백질의 분해를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 면역프로테아좀-표적화 모티프는 항원 처리 경로에 단백질을 국소화하는 것을 용이하게 한다. 일부 구현예에서, 면역프로테아좀-표적화 모티프는 면역프로테아좀 복합체에서 단백질의 처리를 향상시킨다. 면역프로테아좀-표적화 모티프의 예는 데그론(degron)이다. 후기 촉진 복합체(anaphase-promoting complex) 또는 시클로솜(cyclosome)(APC/C)에 의해 표적화되는 것으로 알려진 데그론은 파괴 박스(D 박스), KEN 박스, 및 ABBA 모티프를 포함한다. 이들 모티프를 함유하는 단백질은 APC/C와 상호작용하여, 단백질의 유비퀴틴화 및 프로테아좀에 의한 파괴를 초래한다. KEKE 모티프를 포함하는 다른 예시적인 면역프로테아좀-표적화 모티프,
일부 구현예에서, mRNA는 면역프로테아좀-표적화 모티프를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 추가로 포함하며, 여기서 mRNA의 번역은 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프의 융합 단백질을 생성한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는, 면역프로테아좀-표적화 모티프가 없을 때 세포 내 단백질의 분해 및/또는 세포 표면 상의 단백질로부터 유래된 펩티드의 제시와 비교하여 세포 내 단백질의 분해 및/또는 세포 표면 상의 단백질로부터 유래된 펩티드의 제시를 향상시킨다.
일부 구현예에서, 면역프로테아좀-표적화 모티프를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 분해량은, 면역프로테아좀-표적화 모이어티를 암호화하는 핵산을 포함하지 않는 mRNA에 의해 암호화된 단백질과 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배, 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 면역프로테아좀-표적화 모티프를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 분해율은, 면역프로테아좀-표적화 모이어티를 암호화하는 핵산을 포함하지 않는 mRNA에 의해 암호화된 단백질과 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배, 또는 그 이상.
일부 구현예에서, 면역프로테아좀-표적화 모티프를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 mRNA에 의해 암호화된 단백질로부터 유래된 펩티드의 세포 표면 제시량은, 면역프로테아좀-표적화 모이어티를 암호화하는 핵산을 포함하지 않는 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 그것과 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배, 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 면역프로테아좀-표적화 모티프를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 mRNA에 의해 암호화된 단백질로부터 유래된 펩티드의 세포 표면 제시율은, 면역프로테아좀-표적화 모이어티를 암호화하는 핵산을 포함하지 않는 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 그것과 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배, 또는 그 이상.
일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는 융합 단백질의 N-말단에 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는 융합 단백질의 C-말단에 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는 융합 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는 다음 중 하나 이상을 포함한다: D-박스 도메인, sec/MITD 도메인, KEKE 도메인.
일부 구현예에서, mRNA는 고유 HPV E6 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 고유 HPV E6 단백질을 암호화하고, 서열번호 59의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 고유 HPV E6 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 고유 HPV E6 단백질을 암호화하고, 서열번호 60의 서열을 포함하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 고유 HPV E7 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 고유 HPV E7 단백질을 암호화하고, 서열번호 61의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 고유 HPV E7 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 고유 HPV E7 단백질을 암호화하고, 서열번호 63 또는 64의 서열을 포함하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 HPV E7 단백질 및 KEKE 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 HPV E7 단백질 및 KEKE 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하고 서열번호 67의 서열을 포함하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 67. 일부 구현예에서, mRNA는 HPV E7 단백질 및 D-박스 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 HPV E7 단백질 및 D-박스 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하고 서열번호 62의 서열을 포함하는 mRNA이다. 62. 일부 구현예에서, mRNA는 HPV E7 단백질 및 D-박스 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 HPV E7 단백질 및 D-박스 도메인을 포함하는 융합 단백질을 암호화하고 서열번호 67의 서열을 포함하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 66. 일부 구현예에서, mRNA는 돌연변이된 핵 국소화 서열(NLS)을 가진 HPV E7 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 돌연변이된 NLS를 가진 HPV E7 단백질을 포함하는 융합 단백질을 암호화하고 서열번호 70의 서열을 포함하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 70. 일부 구현예에서, mRNA는 HPV E7.6 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 HPV E7 단백질을 암호화하고 서열번호 68의 서열을 포함하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 68. 일부 구현예에서, mRNA는 HPV E7.6의 6 반복을 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 HPV E7.6의 6 반복을 포함하는 융합 단백질을 암호화하고 서열번호 서열번호 69의 서열을 포함하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 69.
일부 구현예에서, mRNA는 고유 인플루엔자 M1 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 고유 인플루엔자 M1 단백질을 암호화하고, 서열번호 83의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 고유 인플루엔자 M1 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 고유 인플루엔자 M1 단백질을 암호화하고 서열번호 84의 서열을 포함하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 84.
일부 구현예에서, mRNA는 고유 CMV pp65 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 고유 CMV pp65 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 고유 CMV pp65 단백질을 암호화하고 서열번호 85의 서열을 포함하는 코돈 최적화된 mRNA이다. 85.
일부 구현예에서, mRNA는 MART-1 항원을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 MART-1 항원을 암호화하는 코돈 최적화된 mRNA이다.
본원에 기술된 mRNA 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, mRNA의 하나 이상의 잔기가 변형된다. 일부 구현예에서, mRNA의 하나 이상의 잔기는 다음 중 하나 이상이다: 포스포로티오에이트 잔기, 슈도우리딘 잔기, N1-메틸아데노신 잔기, 5-메틸시티딘 잔기, 또는 모르폴리노 잔기.
단백질 및 이의 단편, 및 항원
본원에 기술된 방법, 조성물, 및 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 단백질은 질환 연관 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 비-자기 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 질환 세포의 용해물과 같은 용해물로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 단백질은 종양 용해물로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 단백질은 종양 항원 또는 종양 연관 항원 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질이다. 일부 구현예에서, 암은 두경부암, 자궁경부암, 외음부암, 질암, 음경암, 항문암, 항문주위암, 항문생식기암, 구강암, 또는 침샘암이다. 일부 구현예에서, 단백질은 하나 이상의 항원을 포함하며, 상기 항원은 두경부암 항원, 자궁경부암 항원, 외음부암 항원, 질암 항원, 음경암 항원, 항문암 항원, 항문주위암 항원, 항문생식기암 항원, 구강암 항원, 침샘암 항원, 유방암 항원, 피부암 항원, 방광암 항원, 결장암, 직장암 항원, 자궁내막암 항원, 신장암 항원, 백혈병 항원, 폐암 항원, 흑색종 항원, 비-호지킨 림프종 항원, 췌장암 항원, 전립선암 항원, 또는 갑상선암 항원이고, 일부 구현예에서, 암은 고형 암이다. 일부 구현예에서, 암은 혈액암이다.
일부 구현예에서, 암은 바이러스 연관 암이다. 일부 구현예에서, 암은 HPV 연관 암이다. 일부 구현예에서, 암은 국소화된 암이다. 일부 구현예에서, 암은 전이성 암이다. 일부 구현예에서, 항원은 감염성 질환과 연관된다. 일부 구현예에서, 감염성 질환은 바이러스성 감염성 질환, 진균성 감염성 질환, 및/또는 세균성 감염성 질환이다. 일부 구현예에서, 감염성 질환은 인플루엔자, CMV, HIV, HPV, EBV, MCV, HAV, HBV, HCV, HSV-1, HSV-2, VSV, HHV-6, HHV-7, 또는 HHV-8과 연관된다.
본원에 기술된 방법, 조성물, 또는 복수의 변형된 PBMC 중 하나 이상에 따른 일부 구현예에서, 단백질은 하나 이상의 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 하나 이상의 핵산에 의해 암호화되고, DNA, cDNA, mRNA, 및 플라스미드와 같은 (이에 한정되지는 않음) 하나 이상의 핵산의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 구현예에서, 항원은 하나 이상의 mRNA에 의해 암호화되고 하나 이상의 mRNA의 형태로 PBMC에 진입한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 mRNA는 본원에 기술된 변형 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 mRNA는 본원에 기술된 모티프 중 어느 하나를 포함하며, 이에는 본원에 기술된 면역프로테아좀-표적화 모티프 중 어느 하나가 포함되지만 이에 한정되지는 않는다.
본원에 기술된 방법, 조성물, 또는 복수의 변형된 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 항원은 인간 유두종바이러스(HPV) 항원이다. 유두종바이러스는 직경이 약 55 nm인 비리온 크기를 갖는 작은 비외피형 DNA 바이러스이다. 100개가 넘는 HPV 유전자형이 완전히 특성화되어 있으며, 더 많은 수가 존재하는 것으로 추정된다. HPV는 자궁경부암뿐만 아니라 일부 외음부암, 질암, 음경암, 구인두암, 항문암, 및 직장암의 알려진 원인이다. 비록 대부분의 HPV 감염증은 무증상이고 자연적으로 치유되지만, 종양원성 HPV 유형 중 하나를 동반한 지속적인 감염증이 전암 또는 암으로 진행할 수 있다. 다른 HPV-연관 질환은 흔한 사마귀, 발바닥 사마귀, 편평 사마귀, 항문생식기 사마귀, 항문 병변, 표피형성이상, 국소 상피 과다형성, 구강 유두종, 사마귀 낭종, 후두 유두종증, 편평 상피내 병변(SIL), 자궁경부 상피내 신생물(CIN), 외음부 상피내 신생물(VIN), 및 질 상피내 신생물(VIN)을 포함할 수 있다. 알려진 인간 유두종바이러스(HPV) 유형 중 다수가 종양원성인 하위집합을 동반한 양성 병변을 유발한다. 전염병학적 관계 및 계통적 관계에 기초하여, HPV 유형은 15개의 "고위험 유형"(HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73, 및 82) 및 3개의 "가능한 고위험 유형"(HPV 26, 53, 및 66)으로 분류되며, 이들은 함께 저등급 및 고등급의 자궁경부 변화 및 암 뿐만 아니라 외음부암, 질암, 음경암, 항문암, 및 항문주위암과 같은 다른 항문생식기 암 뿐만 아니라 두경부암으로서 나타나는 것으로 알려져 있다. 최근에는, 고위험 유형 HPV 16 및 18과 유방암의 연관성도 기술되었다. "저위험 유형"(HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 및 81)으로 분류된 11개의 HPV 유형은 양성 저등급 자궁경부 변화, 생식기 사마귀, 및 재발성 호흡기 유두종증으로서 나타나는 것으로 알려져 있다. 피부 HPV 유형 5, 8, 및 92는 피부암과 관련이 있다. 일부 HPV 연관 암에서, 면역 체계는 낮아지며, 이에 상응하여 항종양 반응이 상당히 손상된다. Suresh와 Burtness의 문헌[Am J Hematol Oncol 13(6):20-27 (2017)] 참조. 일부 구현예에서, 항원은 동일한 및/또는 상이한 항원에 대한 반응을 유도하는 다수의 폴리펩티드의 풀이다. 일부 구현예에서, 다수의 항원 풀 내의 항원은 다수의 항원 풀 내의 다른 항원에 대한 면역 반응을 감소시키지는 않는다. 일부 구현예에서, HPV 항원은 항원성 HPV 에피토프 및 하나 이상의 이종 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, HPV 항원은 자신, 다른 항원, 또는 보조제와 복합체를 형성한다. 일부 구현예에서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18이다. 일부 구현예에서, HPV 항원은 HLA-A*02-특이적 에피토프로 구성된다. 일부 구현예에서, HPV 항원은 HLA-B*07-특이적 에피토프로 구성된다. 일부 구현예에서, HPV 항원은 HLA-B*35-특이적 에피토프로 구성된다. 일부 구현예에서, HPV 항원은 HLA-A*01-특이적 에피토프로 구성된다. 일부 구현예에서, HPV 항원은 HPV E6 항원 또는 HPV E7 항원이다. 일부 구현예에서, 항원은 HPV E6 및/또는 E7로부터 유래된 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 HPV E6 및/또는 E7로부터 유래된 HLA-A*02-제한 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, HPV 단백질은 HPV E6이다. 일부 구현예에서, HPV 단백질은 HPV E7이다. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E6으로부터 유래된 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E7로부터 유래된 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, HPV 단백질은 고유 HPV E6(야생형, 자연 발생, 및/또는 스플라이스 변이체를 포함함)의 아미노산 서열의 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함하는 단백질이다. 일부 구현예에서, HPV 단백질은 고유 HPV E6의 아미노산 서열의 100%를 포함하는 단백질이다. 일부 구현예에서, HPV 단백질은 고유 HPV E7(야생형, 자연 발생, 및/또는 스플라이스 변이체를 포함함)의 아미노산 서열의 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함하는 단백질이다. 일부 구현예에서, HPV 단백질은 고유 HPV E7의 아미노산 서열의 약 100%를 포함하는 단백질이다.
전 세계적으로 단리된 B형 간염 바이러스(HBV) 균주는 게놈 비교로부터 추론된 6개의 게놈 군으로 분류되고, HBV 유전자형 A 내지 F로서 표시된다. B형 간염 표면 항원(HBsAg) 아형이라 불리는 9개의 혈청학적 군은 또한 구별되는 혈청에 기초하여 정의되었고, adw2, adw4, adr, adrq-, ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, 및 ayr로 지정되었다. 일부 구현예에서, HPV 항원은 항원성 HPV 에피토프 및 하나 이상의 이종 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, HPV 항원은 자신, 다른 항원, 또는 보조제와 복합체를 형성한다. 일부 구현예에서, HBV는 다음 중 어느 하나의 유전자형/아형이다: A/adw2, B/adw2, C/adr, C/adw2, D/ayw3, D/ayw2, E/ayw4, F/adw2, F/adw4, 또는 F/ayw4. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 HLA-A*02-특이적 에피토프로 구성된다. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 HBsAg이다. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 HBc이다. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 HBV 코어 단백질, HBV 표면 단백질, HBV 중합효소, 및/또는 HBV X 단백질 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 HBeAg이다. 일부 구현예에서, 단백질은 HBsAg로부터 유래된 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 HBc로부터 유래된 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 HBeAg로부터 유래된 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 고유 HBsAg(야생형, 자연 발생, 및/또는 스플라이스 변이체를 포함함)의 아미노산 서열의 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함하는 단백질이다. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 고유 HBsAg의 아미노산 서열의 100%를 포함하는 단백질이다. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 고유 HBeAg(야생형, 자연 발생, 및/또는 스플라이스 변이체를 포함함)의 아미노산 서열의 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함하는 단백질이다. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 고유 HBeAg의 아미노산 서열의 100%를 포함하는 단백질이다. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 고유 HBc(야생형, 자연 발생, 및/또는 스플라이스 변이체를 포함함)의 아미노산 서열의 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함하는 단백질이다. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 고유 HBc의 아미노산 서열의 100%를 포함하는 단백질이다. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 HBV 코어 단백질, HBV 표면 단백질, HBV 중합효소, 및/또는 HBV X 단백질 중 하나 이상의 고유 아미노산 서열의 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함하는 단백질이다. 일부 구현예에서, HBV 단백질은 HBV 코어 단백질, HBV 표면 단백질, HBV 중합효소, 및/또는 HBV X 단백질 중 하나 이상의 고유 아미노산 서열의 100%를 포함하는 단백질이다.
일부 구현예에서, 단백질은 인플루엔자 단백질이다. 일부 구현예에서, 인플루엔자 단백질은 인플루엔자 A 및/또는 인플루엔자 B로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 단백질은 인플루엔자 M1 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 인플루엔자 M1 단백질로부터 유래된 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 인플루엔자 단백질은 고유 인플루엔자 M1 단백질(야생형, 자연 발생, 및/또는 스플라이스 변이체를 포함함)의 아미노산 서열의 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나를 포함하는 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 변형된 인플루엔자 M1 단백질이다. 일부 구현예에서, 인플루엔자 단백질은 고유 인플루엔자 M1 단백질의 아미노산 서열의 100%를 포함하는 단백질이다.
본원에 기술된 방법, 조성물, 또는 복수의 유핵 세포 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 변형된 유핵 세포는 복수의 면역원성 에피토프를 포함하는 복수의 항원(예: 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원)을 포함한다. 추가의 구현예에서, 복수의 면역원성 에피토프를 포함하는 복수의 항원을 포함하는 변형된 유핵 세포를 개체에게 투여한 후, 복수의 면역원성 에피토프 중 어느 것도 개체에서 다른 면역원성 에피토프 중 어느 하나에 대한 면역 반응을 감소시키지 않는다. 일부 구현예에서, 항원은 폴리펩티드이고, 면역원성 에피토프는 면역원성 펩티드 에피토프이다. 일부 구현예에서, 면역원성 펩티드 에피토프는 N-말단의 측면에 위치하는 폴리펩티드 및/또는 C-말단의 측면에 위치하는 폴리펩티드에 융합된다. 일부 구현예에서, 항원은 면역원성 펩티드 에피토프 및 하나 이상의 이종 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 항원은 이종 펩티드 서열이 N-말단 및/또는 C-말단에서 측면에 위치하는 면역원성 펩티드 에피토프를 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 측면에 위치하는 이종 펩티드 서열은 질환-연관 면역원성 펩티드로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 측면에 위치하는 이종 펩티드 서열은 비-자연 발생 서열이다. 일부 구현예에서, 측면에 위치하는 이종 펩티드 서열은 면역원성 합성 긴 펩티드(SLP)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, N-말단의 측면에 위치하는 폴리펩티드는 서열번호 5~10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 C-말단의 측면에 위치하는 폴리펩티드는 서열번호 11~17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 MHC 클래스 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 클래스 II-제한된 펩티드로 가공될 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질 및/또는 항원은 단백질 및/또는 항원의 항원 처리 및 제시를 향상시키기 위한 하나 이상의 변형을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 면역프로테아좀-표적화 모티프는 단백질 분해율의 조절에 중요한 단백질의 일부분이다. 일부 구현예에서, 면역프로테아좀-표적화 모티프는 항원 처리 경로에서 단백질의 분해를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 면역프로테아좀-표적화 모티프는 항원 처리 경로에 단백질을 국소화하는 것을 용이하게 한다. 일부 구현예에서, 면역프로테아좀-표적화 모티프는 면역프로테아좀 복합체에서 단백질의 처리를 향상시킨다. 면역프로테아좀-표적화 모티프의 예는 데그론(degron)이다. 후기 촉진 복합체(anaphase-promoting complex) 또는 시클로솜(cyclosome)(APC/C)에 의해 표적화되는 것으로 알려진 데그론은 파괴 박스(D 박스), KEN 박스, 및 ABBA 모티프를 포함한다. 이들 모티프를 함유하는 단백질은 APC/C와 상호작용하여, 단백질의 유비퀴틴화 및 프로테아좀에 의한 파괴를 초래한다. 다른 예시적인 면역프로테아좀-표적화 모티프는 KEKE 모티프를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에 있어서, 단백질 또는 이의 단편은 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프를 추가로 포함함으로써, 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프로 이루어진 융합 단백질을 생성한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는, 면역프로테아좀-표적화 모티프가 없을 때 세포 내 단백질의 분해 및/또는 세포 표면 상의 단백질로부터 유래된 펩티드의 제시와 비교하여 세포 내 단백질의 분해 및/또는 세포 표면 상의 단백질로부터 유래된 펩티드의 제시를 향상시킨다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 단백질 면역프로테아좀-표적화 모티프를 포함하는 융합 단백질의 분해량은, 면역프로테아좀-표적화 모이어티를 포함하지 않는 상응하는 단백질과 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배, 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 면역프로테아좀-표적화 모티프를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하는 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 분해 속도는, 면역프로테아좀-표적화 모이어티를 포함하지 않는 상응하는 단백질과 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배, 또는 그 이상.
일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프를 포함하는 단백질로부터 유래된 펩티드의 세포 표면 제시량은, 면역프로테아좀-표적화 모이어티를 포함하지 않는 상응하는 단백질과 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배, 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프를 포함하는 단백질로부터 유래된 펩티드의 세포 표면 속도는, 면역프로테아좀-표적화 모이어티를 포함하지 않는 상응하는 단백질과 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배, 또는 그 이상.
일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는 융합 단백질의 N-말단에 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는 융합 단백질의 C-말단에 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는 융합 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는 다음 중 하나 이상을 포함한다: D-박스 도메인, sec/MITD 도메인, KEKE 도메인.
일부 구현예에서, 단백질은 고유 전장 HPV E7 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 고유 전장 HPV E7 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 고유 HPV E7 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 mRNA로부터 번역된다. 일부 구현예에서, 단백질은 고유 HPV E7 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 mRNA로부터 번역되며, 상기 단백질은 서열번호 52의 아미노산 서열을 포함한다. 52. 일부 구현예에서, 단백질은 고유 전장 HPV E6 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 고유 전장 HPV E6 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 고유 HPV E6 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 mRNA로부터 번역된다. 일부 구현예에서, 단백질은 고유 HPV E6 단백질을 암호화하는 코돈 최적화된 mRNA로부터 번역되며, 상기 단백질은 서열번호 51의 아미노산 서열을 포함한다. 51. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E7 단백질 및 KEKE 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E7 단백질 및 KEKE 도메인을 포함하는 융합 단백질이고, 상기 단백질은 서열번호 56의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E7 단백질 및 D-박스 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E7 단백질 및 D-박스 도메인을 포함하는 융합 단백질이고, 상기 단백질은 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함한다. 53. 일부 구현예에서, 단백질은 돌연변이된 NLS를 갖는 HPV E7 단백질을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 돌연변이된 NLS를 갖는 HPV E7 단백질을 포함하는 융합 단백질이고, 상기 단백질은 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함한다. 55. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E7.6 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E7.6 단백질이고, 상기 단백질은 서열번호 57의 아미노산 서열을 포함한다. 57. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E7.6의 6 반복을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E7.6의 6 반복을 포함하는 융합 단백질이고, 상기 단백질은 서열번호 58의 아미노산 서열을 포함한다. 58.
단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물을 생성하는 방법
일부 양태에서,발명은 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 유핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 유핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 mRNA가 발현되어 단백질 또는 이의 단편이 생산된다.
일부 양태에서, 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포를 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 2개 이상의 항원을 유핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다.
일부 양태에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨디셔닝된 유핵 세포를 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 컨디셔닝된 유핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨디셔닝된 유핵 세포를 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 컨디셔닝된 유핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 mRNA가 발현되어 단백질 또는 이의 단편이 생산된다.
일부 양태에서, 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 컨디셔닝된 유핵 세포를 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 2개 이상의 항원을 컨디셔닝된 유핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다.
일부 구현예에서, 단백질로부터 유래되고 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 단백질로부터 유래되고 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포를 생산하는 방법이 제공된다.
일부 구현예에서, 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 단백질로부터 유래된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 75, 80, 90, 100개 또는 그 이상의 항원 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 중 적어도 2개는 부분적으로 중첩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 모든 항원의 아미노산 서열을 합치면 단백질의 아미노산 서열과 약 90% 이상 중첩된다. 일부 구현예에서, 모든 항원의 아미노산 서열을 합친 것은 단백질의 아미노산 서열의 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나와 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 80%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 항원과 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 80%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 3개의 항원과 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 90%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 항원과 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 90%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 3개의 항원과 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 95%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 항원과 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 95%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 3개의 항원과 중첩된다.
일부 구현예에서, 항원은 단백질의 2개 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 면역원성 펩티드 에피토프는 N-말단의 측면에 위치하는 폴리펩티드 및/또는 C-말단의 측면에 위치하는 폴리펩티드에 융합된다. 일부 구현예에서, 항원은 단백질의 하나 이상의 에피토프 및 하나 이상의 이종 펩티드 서열이다. 일부 구현예에서, N-말단 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 에피토프의 측면에는 이종 펩티드 서열이 위치한다. 일부 구현예에서, 측면에 위치하는 이종 펩티드 서열은 질환-연관 면역원성 펩티드로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 측면에 위치하는 이종 펩티드 서열은 비-자연 발생 서열이다. 일부 구현예에서, 측면에 위치하는 이종 펩티드 서열은 면역원성 합성 긴 펩티드(SLP)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, N-말단의 측면에 위치하는 폴리펩티드는 서열번호 5~10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 C-말단의 측면에 위치하는 폴리펩티드는 서열번호 11~17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 MHC 클래스 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 클래스 II-제한된 펩티드로 가공될 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질이다. 일부 구현예에서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18이다. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질이다.
일부 구현예에서, 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 다음에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 단백질 또는 이의 단편을 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포는 다음에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 다음에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계로서, mRNA가 발현되어 단백질 또는 이의 단편을 발현하고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포가 생성되는, 단계.
일부 구현예에서, 투입 세포 현탁액은 투입 유핵 세포 및 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 투입 세포 현탁액은 투입 유핵 세포 및 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 세포 현탁액은 투입 유핵 세포 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은, 유핵 세포의 모집단 내에서 가장 작은 직경을 갖는 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 45%, 약 50% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 80%, 또는 약 60% 내지 약 70% 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 유핵 세포의 모집단 내에서 가장 작은 직경을 갖는 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 45%, 약 50% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 80%, 또는 약 60% 내지 약 70% 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 2 μm 내지 약 5 μm, 약 3 μm 내지 약 5 μm, 약 2 μm 내지 약 2.5 μm, 약 2.2 μm 내지 약 2.5 μm, 약 2.5 μm 내지 약 3 μm, 약 3 μm 내지 약 5 μm, 약 3 μm 내지 약 3.5 μm, 약 3.5 μm 내지 약 4 μm, 약 4 μm 내지 약 4.5 μm, 약 3.2 μm 내지 약 3.8 μm, 약 3.8 μm 내지 약 4.3 μm, 약 4.2 μm 내지 약 6 μm, 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 2 μm, 2.2 μm, 2.5 μm, 3 μm, 3.5 μm, 4 μm, 4.5 μm, 5 μm, 5.5 μm, 6 μm, 6.5 μm, 7 μm, 7.5 μm, 8 μm, 8.5 μm, 9 μm, 9.5 μm, 10 μm, 10.5 μm, 11 μm, 11.5 μm, 12 μm, 12.5 μm, 13 μm, 13.5 μm, 14 μm, 14.5 μm, 또는 15 μm 이하 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과한다.
본원에 기술된 방법, 용도, 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 유핵 세포(예: PBMC)는 유핵 세포가 컨디셔닝되기에 충분한 시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 1 내지 약 24시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 2 내지 약 10시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 3 내지 약 6시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간, 2시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간, 또는 24시간 중 어느 하나 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 유핵 세포 내로 도입하기 전에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 유핵 세포 내로 도입한 후에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 컨디셔닝을 위해 사용되는 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, IFN-b, IFN-g, 알파-갈락토실 세라미드, STING 작용제, 환형 디뉴클레오티드(CDN), RIG-I 작용제, 폴리이노신산-폴리시티딜산(폴리 I:C), TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제이다. 예시적인 보조제는 CpG ODN, 인터페론-α(IFN-α), 폴리이노신산:폴리시티딜산(polyI:C), 이미퀴모드(R837), 레시퀴모드(R848), 또는 지질다당류(LPS)를 포함하며 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)이다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 7909이다.
유핵 세포가 B 세포를 포함하는 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 분자는 컨디셔닝되지 않은 유핵 세포의 B 세포와 비교하여 컨디셔닝된 유핵 세포의 B 세포에서 상향조절된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 유핵 세포가 복수의 PBMC인 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 분자는 컨디셔닝되지 않은 복수의 PBMC의 B 세포와 비교하여 컨디셔닝된 복수의 PBMC의 B 세포에서 상향 조절된다. 일부 구현예에서, 공자극 분자는 CD80 및/또는 CD86이다. 일부 구현예에서, 컨디셔닝된 복수의 PBMC는 컨디셔닝되지 않은 복수의 PBMC와 비교하여 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현을 증가시킨다. 일부 구현예에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현은 컨디셔닝되지 않은 복수의 PBMC와 비교하여 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배, 또는 10배 초과만큼 증가된다.
본원에 기술된 방법, 용도, 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 유핵 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 HLA-A*02, HLA-A*01 , HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-A*11, HLA-A*26, HLA-A*32, HLA-A*31, HLA-A*68, HLA-A*29, HLA-A*23, HLA-B*07, HLA-B*44, HLA-B*08, HLA-B*35, HLA-B*15, HLA-B*40, HLA-B*27, HLA-B*18, HLA-B*51, HLA-B*14, HLA-B*13, HLA-B*57, HLA-B*38, HLA-C*07, HLA-C*04, HLA-C*03, HLA-C*06, HLA-C*05, HLA-C*12, HLA-C*02, HLA-C*01, HLA-C*08, 또는 HLA-C*16의 일배체형을 갖는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 복수의 PBMC이다. 일부 구현예에서, 컨디셔닝된 유핵 세포는 컨디셔닝된 복수의 변형된 PBMC이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 2개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상이다.
일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 공자극 분자 중 하나 이상의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 공자극 분자는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-10, IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, IFN-γ, IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IFN-α2 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 (변형된 사이토카인과 같은) 변이체 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 키메라 막-결합 사이토카인의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 변형되고, 변형된 사이토카인은 사이토카인 및 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 트랜스페린 수용체 단백질 1(TFRC) 또는 종양 괴사 인자(예: FasL) 막관통 도메인이다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호 81 또는 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함한다. 82. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 G4S 링커 또는 EAAAK 링커이다. 구현예에서, G4S 링커는 G4S 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 반복 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, EAAAK 링커는 EAAAK 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 반복 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)이다. 일부 구현예에서, 키메라 막결합 사이토카인은 서열번호 77~80 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 변형된 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 증가시키는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 서열번호 71 또는 72의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 T 세포 활성화를 자극함에 있어서 신호 3 작동자이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 비-막-결합 사이토카인과 비교하여 개체에서 사이토카인의 반감기를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인의 반감기는 비-막-결합 사이토카인과 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 막-결합 사이토카인은 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여, 단백질 또는 이의 단편과 함께 도입된 유핵 세포에 의해 제시된 항원과 사이토카인의 공간 결합을 다음 중 어느 하나만큼 연장시킨다: 약 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 48, 72, 96시간 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 막-결합 사이토카인을 추가로 포함하는 유핵 세포는, 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 국소 사이토카인 농도를 나타낸다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 막-결합 사이토카인을 추가로 포함하는 유핵 세포는, 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상.
단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물
일부 양태에서, 유핵 세포를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 유핵 세포의 유효량을 포함하고, 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 의약을 제조함에 있어서 유핵 세포의 유효량을 포함하는 조성물의 용도가 제공되며, 여기서 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 포함한다.
일부 양태에서, 유핵 세포를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 유핵 세포의 유효량을 포함하고, 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 의약을 제조함에 있어서 유핵 세포의 유효량을 포함하는 조성물의 용도가 제공되며, 여기서 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함한다.
일부 양태에서, 유핵 세포를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 유핵 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하고, 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다. 일부 양태에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포의 유효량을 포함하고, 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다. 일부 양태에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 의약을 제조함에 있어서 유핵 세포의 유효량을 포함하는 조성물의 용도가 제공되며, 여기서 유핵 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하고, 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다.
일부 양태에서, 컨디셔닝된 유핵 세포를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 컨디셔닝된 유핵 세포의 유효량을 포함하고, 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 의약을 제조함에 있어서 유핵 세포의 유효량을 포함하는 조성물의 용도가 제공되며, 여기서 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 포함한다.
일부 양태에서, 컨디셔닝된 유핵 세포를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 컨디셔닝된 유핵 세포의 유효량을 포함하고, 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 의약을 제조함에 있어서 유핵 세포의 유효량을 포함하는 조성물의 용도가 제공되며, 여기서 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함한다.
일부 양태에서, 컨디셔닝된 유핵 세포를 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 유핵 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하고, 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다. 일부 양태에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 컨디셔닝된 유핵 세포의 유효량을 포함하고, 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다. 일부 양태에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 의약을 제조함에 있어서 유핵 세포의 유효량을 포함하는 조성물의 용도가 제공되며, 여기서 유핵 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하고, 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다.
일부 양태에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 유핵 세포의 조성물의 유효량을 포함하고, 유핵세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 유핵 세포의 조성물의 유효량을 포함하고, 유핵세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 양태에서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 유핵 세포의 조성물의 유효량을 포함하고, 유핵세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하고, 2개 이상의 항원은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다.
일부 구현예에서, 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 단백질로부터 유래된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 75, 80, 90, 100개 또는 그 이상의 항원 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원 중 적어도 2개는 부분적으로 중첩된 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 모든 항원의 아미노산 서열을 합치면 단백질의 아미노산 서열과 약 90% 이상 중첩된다. 일부 구현예에서, 모든 항원의 아미노산 서열을 합친 것은 단백질의 아미노산 서열의 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 어느 하나와 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 80%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 항원과 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 80%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 3개의 항원과 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 90%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 항원과 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 90%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 3개의 항원과 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 95%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 2개의 항원과 중첩된다. 일부 구현예에서, 단백질의 아미노산 서열의 약 95%의 각각의 아미노산은 단백질로부터 유래된 적어도 3개의 항원과 중첩된다.
일부 구현예에서, 항원은 단백질의 2개 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 면역원성 펩티드 에피토프는 N-말단의 측면에 위치하는 폴리펩티드 및/또는 C-말단의 측면에 위치하는 폴리펩티드에 융합된다. 일부 구현예에서, 항원은 단백질의 하나 이상의 에피토프 및 하나 이상의 이종 펩티드 서열이다. 일부 구현예에서, N-말단 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 에피토프의 측면에는 이종 펩티드 서열이 위치한다. 일부 구현예에서, 측면에 위치하는 이종 펩티드 서열은 질환-연관 면역원성 펩티드로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 측면에 위치하는 이종 펩티드 서열은 비-자연 발생 서열이다. 일부 구현예에서, 측면에 위치하는 이종 펩티드 서열은 면역원성 합성 긴 펩티드(SLP)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, N-말단의 측면에 위치하는 폴리펩티드는 서열번호 5~10 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 C-말단의 측면에 위치하는 폴리펩티드는 서열번호 11~17 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 MHC 클래스 I-제한된 펩티드 및/또는 MHC 클래스 II-제한된 펩티드로 가공될 수 있다.
일부 구현예에서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질이다. 일부 구현예에서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18이다. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질이다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 다음에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 단백질 또는 이의 단편을 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포는 다음에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
일부 구현예에서, 투입 세포 현탁액은 투입 유핵 세포 및 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 투입 세포 현탁액은 투입 유핵 세포 및 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 세포 현탁액은 투입 유핵 세포 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은, 유핵 세포의 모집단 내에서 가장 작은 직경을 갖는 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 45%, 약 50% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 80%, 또는 약 60% 내지 약 70% 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 유핵 세포의 모집단 내에서 가장 작은 직경을 갖는 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 45%, 약 50% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 80%, 또는 약 60% 내지 약 70% 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 2 μm 내지 약 5 μm, 약 3 μm 내지 약 5 μm, 약 2 μm 내지 약 2.5 μm, 약 2.2 μm 내지 약 2.5 μm, 약 2.5 μm 내지 약 3 μm, 약 3 μm 내지 약 5 μm, 약 3 μm 내지 약 3.5 μm, 약 3.5 μm 내지 약 4 μm, 약 4 μm 내지 약 4.5 μm, 약 3.2 μm 내지 약 3.8 μm, 약 3.8 μm 내지 약 4.3 μm, 약 4.2 μm 내지 약 6 μm, 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 2 μm, 2.2 μm, 2.5 μm, 3 μm, 3.5 μm, 4 μm, 4.5 μm, 5 μm, 5.5 μm, 6 μm, 6.5 μm, 7 μm, 7.5 μm, 8 μm, 8.5 μm, 9 μm, 9.5 μm, 10 μm, 10.5 μm, 11 μm, 11.5 μm, 12 μm, 12.5 μm, 13 μm, 13.5 μm, 14 μm, 14.5 μm, 또는 15 μm 이하 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과한다.
본원에 기술된 방법, 용도, 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 유핵 세포(예: PBMC)는 유핵 세포가 컨디셔닝되기에 충분한 시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 1 내지 약 24시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 2 내지 약 10시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 3 내지 약 6시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간, 2시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간, 또는 24시간 중 어느 하나 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 유핵 세포 내로 도입하기 전에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 유핵 세포 내로 도입한 후에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 컨디셔닝을 위해 사용되는 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 알파-갈락토실 세라미드, STING 작용제, 환형 디뉴클레오티드(CDN), RIG-I 작용제, 폴리이노신산-폴리시티딜산(폴리 I:C), TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제이다. 예시적인 보조제는 CpG ODN, 인터페론-α(IFN-α), 폴리이노신산:폴리시티딜산(polyI:C), 이미퀴모드(R837), 레시퀴모드(R848), 또는 지질다당류(LPS)를 포함하며 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)이다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 7909이다.
유핵 세포가 B 세포를 포함하는 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 분자는 컨디셔닝되지 않은 유핵 세포의 B 세포와 비교하여 컨디셔닝된 유핵 세포의 B 세포에서 상향조절된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 유핵 세포가 복수의 PBMC인 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 분자는 컨디셔닝되지 않은 복수의 PBMC의 B 세포와 비교하여 컨디셔닝된 복수의 PBMC의 B 세포에서 상향 조절된다. 일부 구현예에서, 공자극 분자는 CD80 및/또는 CD86이다. 일부 구현예에서, 컨디셔닝된 복수의 PBMC는 컨디셔닝되지 않은 복수의 PBMC와 비교하여 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현을 증가시킨다. 일부 구현예에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현은 컨디셔닝되지 않은 복수의 PBMC와 비교하여 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배, 또는 10배 초과만큼 증가된다.
본원에 기술된 방법, 용도, 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 유핵 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 HLA-A*02, HLA-A*01 , HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-A*11, HLA-A*26, HLA-A*32, HLA-A*31, HLA-A*68, HLA-A*29, HLA-A*23, HLA-B*07, HLA-B*44, HLA-B*08, HLA-B*35, HLA-B*15, HLA-B*40, HLA-B*27, HLA-B*18, HLA-B*51, HLA-B*14, HLA-B*13, HLA-B*57, HLA-B*38, HLA-C*07, HLA-C*04, HLA-C*03, HLA-C*06, HLA-C*05, HLA-C*12, HLA-C*02, HLA-C*01, HLA-C*08, 및/또는 HLA-C*16의 일배체형을 갖는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 복수의 PBMC이다. 일부 구현예에서, 컨디셔닝된 유핵 세포는 컨디셔닝된 복수의 변형된 PBMC이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 2개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상이다.
일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 공자극 분자 중 하나 이상의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 공자극 분자는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-10, IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, IFN-γ, IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IFN-α2 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 (변형된 사이토카인과 같은) 변이체 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 키메라 막-결합 사이토카인의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 변형되고, 변형된 사이토카인은 사이토카인 및 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 트랜스페린 수용체 단백질 1(TFRC) 또는 종양 괴사 인자(예: FasL) 막관통 도메인이다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호 81 또는 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함한다. 82. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 G4S 링커 또는 EAAAK 링커이다. 구현예에서, G4S 링커는 G4S 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 반복 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, EAAAK 링커는 EAAAK 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 반복 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)이다. 일부 구현예에서, 키메라 막결합 사이토카인은 서열번호 77~80 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 변형된 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 증가시키는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 서열번호 71 또는 72의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 T 세포 활성화를 자극함에 있어서 신호 3 작동자이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 비-막-결합 사이토카인과 비교하여 개체에서 사이토카인의 반감기를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인의 반감기는 비-막-결합 사이토카인과 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 막-결합 사이토카인은 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여, 단백질 또는 이의 단편과 함께 도입된 유핵 세포에 의해 제시된 항원과 사이토카인의 공간 결합을 다음 중 어느 하나만큼 연장시킨다: 약 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 48, 72, 96시간 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 막-결합 사이토카인을 추가로 포함하는 유핵 세포는, 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 국소 사이토카인 농도를 나타낸다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 막-결합 사이토카인을 추가로 포함하는 유핵 세포는, 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 막-고정된 사이토카인은 막-결합된 케모카인이다.
면역 세포의 활성을 향상시키는 방법, 및 그 조성물
일부 양태에서, 면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 면역 세포에서 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 변형되고, 변형된 사이토카인은 사이토카인 및 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 트랜스페린 수용체 단백질 1(TFRC) 또는 종양 괴사 인자(예: FasL) 막관통 도메인이다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호 81 또는 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함한다. 82. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 G4S 링커 또는 EAAAK 링커이다. 구현예에서, G4S 링커는 G4S 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 반복 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, EAAAK 링커는 EAAAK 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 반복 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 서열번호 77~80의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 변형된 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 증가시키는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 서열번호 71 또는 72의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 T 세포 활성화를 자극함에 있어서 신호 3 작동자이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 비-막-결합 사이토카인과 비교하여 개체에서 사이토카인의 반감기를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인의 반감기는 비-막-결합 사이토카인과 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 막-결합 사이토카인은 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여, 단백질 또는 이의 단편과 함께 도입된 유핵 세포에 의해 제시된 항원과 사이토카인의 공간 결합을 다음 중 어느 하나만큼 연장시킨다: 약 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 48, 72, 96시간 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 막-결합 사이토카인을 추가로 포함하는 유핵 세포는, 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 국소 사이토카인 농도를 나타낸다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 막-결합 사이토카인을 추가로 포함하는 유핵 세포는, 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상.
일부 구현예에서, 막-결합 사이토카인은 막-결합 케모카인이다.
일부 양태에서, 면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 키메라 막-결합 사이토카인을 면역 세포에 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 변형되고, 변형된 사이토카인은 사이토카인 및 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 트랜스페린 수용체 단백질 1(TFRC) 또는 종양 괴사 인자(예: FasL) 막관통 도메인이다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호 81 또는 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함한다. 82. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 G4S 링커 또는 EAAAK 링커이다. 구현예에서, G4S 링커는 G4S 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 반복 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, EAAAK 링커는 EAAAK 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 반복 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)이다. 일부 구현예에서, 키메라 막결합 사이토카인은 서열번호 77~80 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 변형된 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 증가시키는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 서열번호 71 또는 72의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 T 세포 활성화를 자극함에 있어서 신호 3 작동자이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 비-막-결합 사이토카인과 비교하여 개체에서 사이토카인의 반감기를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인의 반감기는 비-막-결합 사이토카인과 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 막-결합 사이토카인은 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여, 단백질 또는 이의 단편과 함께 도입된 유핵 세포에 의해 제시된 항원과 사이토카인의 공간 결합을 다음 중 어느 하나만큼 연장시킨다: 약 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 48, 72, 96시간 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 막-결합 사이토카인을 추가로 포함하는 유핵 세포는, 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 국소 사이토카인 농도를 나타낸다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 막-결합 사이토카인을 추가로 포함하는 유핵 세포는, 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상.
일부 구현예에서, 막-결합 사이토카인은 막-결합 케모카인이다.
일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시키도록 변형된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-10, IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, IFN-γ, IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IFN-α2 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 (변형된 사이토카인과 같은) 변이체 사이토카인, 예컨대 키메라 막 결합 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 키메라 막 결합 사이토카인(예컨대 막 결합 IL-10, IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, IFN-γ, IL-21)의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다.
일부 구현예에서, 면역 세포는 항원을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 항원을 암호화하는 mRNA를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편이다. 일부 구현예에서, 면역 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다. 일부 구현예에서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질이다. 일부 구현예에서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18이다. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질이다.
일부 구현예에서, 면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 방법이 제공되며, 여기서 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 섭동된 투입 면역 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계로서, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 핵산이 발현되고, 이에 의해 키메라 막 결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포가 생성되는 단계. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA이다.
일부 구현예에서, 면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 방법이 제공되며, 여기서 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하고 항원을 추가로 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 핵산 및 항원을 섭동된 투입 면역 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하는 단계로서, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 핵산이 발현되고, 이에 의해 키메라 막 결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포가 생성되는 단계. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA이다.
일부 구현예에서, 면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 방법이 제공되며, 여기서 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하고 항원을 추가로 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및/또는 항원을 암호화하는 핵산은 mRNA이다.
일부 구현예에서, 면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 방법이 제공되며, 여기서 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계.
일부 양태에서, 의약으로서 사용하기 위한 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포의 유효량을 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포의 유효량을 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포의 유효량을 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 개체에서 면역 반응을 자극하고/자극하거나 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포의 유효량을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다. 본원에 기술된 방법, 조성물, 또는 용도에 따른 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA이다.
일부 양태에서, 의약으로서 사용하기 위한 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 면역 세포 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원의 유효량을 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포의 유효량을 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포의 유효량을 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 개체에서 면역 반응을 자극하고/자극하거나 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포의 유효량을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다. 본원에 기술된 방법, 조성물, 또는 용도에 따른 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 섭동된 투입 면역 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA이다.
일부 양태에서, 의약으로서 사용하기 위한 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포의 유효량을 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포의 유효량을 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포의 유효량을 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 개체에서 면역 반응을 자극하고/자극하거나 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포의 유효량을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다. 본원에 기술된 방법, 조성물, 또는 용도에 따른 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및/또는 항원을 암호화하는 핵산은 mRNA이다.
일부 양태에서, 의약으로서 사용하기 위한 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포의 유효량을 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포의 유효량을 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포의 유효량을 포함하는 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 개체에서 면역 반응을 자극하고/자극하거나 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포의 유효량을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다. 본원에 기술된 방법, 조성물, 또는 용도에 따른 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 항원-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계.
일부 구현예에서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 유핵 세포의 모집단 내에서 가장 작은 직경을 갖는 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 45%, 약 50% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 80%, 또는 약 60% 내지 약 70% 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 2 μm 내지 약 5 μm, 약 3 μm 내지 약 5 μm, 약 2 μm 내지 약 2.5 μm, 약 2.2 μm 내지 약 2.5 μm, 약 2.5 μm 내지 약 3 μm, 약 3 μm 내지 약 5 μm, 약 3 μm 내지 약 3.5 μm, 약 3.5 μm 내지 약 4 μm, 약 4 μm 내지 약 4.5 μm, 약 3.2 μm 내지 약 3.8 μm, 약 3.8 μm 내지 약 4.3 μm, 약 4.2 μm 내지 약 6 μm, 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 2 μm, 2.2 μm, 2.5 μm, 3 μm, 3.5 μm, 4 μm, 4.5 μm, 5 μm, 5.5 μm, 6 μm, 6.5 μm, 7 μm, 7.5 μm, 8 μm, 8.5 μm, 9 μm, 9.5 μm, 10 μm, 10.5 μm, 11 μm, 11.5 μm, 12 μm, 12.5 μm, 13 μm, 13.5 μm, 14 μm, 14.5 μm, 또는 15 μm 이하 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과한다.
본원에 기술된 방법, 용도, 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 유핵 세포(예: PBMC)는 유핵 세포가 컨디셔닝되기에 충분한 시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 1 내지 약 24시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 2 내지 약 10시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 3 내지 약 6시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간, 2시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간, 또는 24시간 중 어느 하나 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 유핵 세포 내로 도입하기 전에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 유핵 세포 내로 도입한 후에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 컨디셔닝을 위해 사용되는 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 알파-갈락토실 세라미드, STING 작용제, 환형 디뉴클레오티드(CDN), RIG-I 작용제, 폴리이노신산-폴리시티딜산(폴리 I:C), TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제이다. 예시적인 보조제는 CpG ODN, 인터페론-α(IFN-α), 폴리이노신산:폴리시티딜산(polyI:C), 이미퀴모드(R837), 레시퀴모드(R848), 또는 지질다당류(LPS)를 포함하며 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)이다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 7909이다.
유핵 세포가 B 세포를 포함하는 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 분자는 컨디셔닝되지 않은 유핵 세포의 B 세포와 비교하여 컨디셔닝된 유핵 세포의 B 세포에서 상향조절된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 유핵 세포가 복수의 PBMC인 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 분자는 컨디셔닝되지 않은 복수의 PBMC의 B 세포와 비교하여 컨디셔닝된 복수의 PBMC의 B 세포에서 상향 조절된다. 일부 구현예에서, 공자극 분자는 CD80 및/또는 CD86이다. 일부 구현예에서, 컨디셔닝된 복수의 PBMC는 컨디셔닝되지 않은 복수의 PBMC와 비교하여 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현을 증가시킨다. 일부 구현예에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현은 컨디셔닝되지 않은 복수의 PBMC와 비교하여 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배, 또는 10배 초과만큼 증가된다.
본원에 기술된 방법, 용도, 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 유핵 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 HLA-A*02, HLA-A*01 , HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-A*11, HLA-A*26, HLA-A*32, HLA-A*31, HLA-A*68, HLA-A*29, HLA-A*23, HLA-B*07, HLA-B*44, HLA-B*08, HLA-B*35, HLA-B*15, HLA-B*40, HLA-B*27, HLA-B*18, HLA-B*51, HLA-B*14, HLA-B*13, HLA-B*57, HLA-B*38, HLA-C*07, HLA-C*04, HLA-C*03, HLA-C*06, HLA-C*05, HLA-C*12, HLA-C*02, HLA-C*01, HLA-C*08, 또는 HLA-C*16의 일배체형을 갖는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 복수의 PBMC이다. 일부 구현예에서, 컨디셔닝된 유핵 세포는 컨디셔닝된 복수의 변형된 PBMC이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 2개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상이다.
투입 유핵 세포 내의 구성 세포
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에게 투여될 수 있게 하며, 여기서 단백질 또는 이의 단편은 세포내 전달된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포의 조성물은 면역 세포의 조성물이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포의 조성물은 복수의 PBMC를 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 PBMC이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, PBMC는 개체로부터 수득된 전혈로부터 백혈구성분채집술과 같은 성분채집술에 의해 단리될 수 있다. 또한, 동일한 개체 또는 상이한 개체로부터 유래된 상이한 PBMC 풀을 혼합함으로써 재구성되는 PBMC 조성물이 제공된다. 다른 예에서, PBMC는, 생성된 프로파일을 이용해 상이한 세포 모집단을 혼합된 세포 조성물로 혼합함으로써 재구성될 수도 있다. 일부 구현예에서, PBMC를 재구성하기 위해 사용되는 세포 모집단은 혼합된 세포 모집단(예컨대 T 세포, B 세포, NK 세포, 또는 단핵구 중 하나 이상의 혼합물)이다. 일부 구현예에서, PBMC를 재구성하기 위해 사용되는 세포 모집단은 정제된 세포 모집단(예컨대 정제된 T 세포, B 세포, NK 세포, 또는 단핵구 모집단)이다. 추가의 예에서, PBMC 조성물을 재구성하는 데 사용되는 상이한 세포 모집단은 동일한 개체로부터 단리되거나(예: 자가 세포) 상이한 개체로부터 단리될 수 있다(예: 동종이계 및/또는 이종 세포).
따라서, 본원에 기술된 방법에 따른 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 CD3+ T 세포, CD20+ B 세포, CD14+ 단핵구, CD56+ NK 세포 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구를 포함하고, 복수의 PBMC 중 PBMC의 총 수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구의 비율은 전혈 중 PBMC의 총 수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구의 비율과 본질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구를 포함하고, 복수의 PBMC 중 PBMC의 총 수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구의 비율은 전혈로부터 유래된 백혈구성분채집술 산물 중 PBMC의 총 수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구의 비율과 본질적으로 동일하다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구를 포함하고, 복수의 PBMC 중 PBMC의 총 수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구의 비율은 전혈 중 PBMC의 총 수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구의 비율과 1% 이하, 2% 이하, 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 또는 50% 이하 중 어느 하나만큼 상이하다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구를 포함하고, 복수의 PBMC 중 PBMC의 총 수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구의 비율은 전혈 중 PBMC의 총 수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구의 비율과 10% 이하만큼 상이하다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구를 포함하고, 복수의 PBMC 중 PBMC의 총 수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구의 비율은 전혈로부터 유래된 백혈구성분채집술 산물 중 PBMC의 총 수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구의 비율과 1% 이하, 2% 이하, 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 30% 이하, 40% 이하, 또는 50% 이하 중 어느 하나만큼 상이하다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구를 포함하고, 복수의 PBMC 중 PBMC의 총 수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구의 비율은 전혈로부터 유래된 백혈구성분채집술 산물 중 PBMC의 총 수에 대한 T 세포, B 세포, NK 세포, 및 단핵구의 비율과 10% 이하만큼 상이하다.
본원에 기술된 방법에 따른 일부 구현예에서, 변형된 PBMC의 약 25% 내지 약 70%는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC의 약 2.5% 내지 약 14%는 B 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC의 약 3.5% 내지 약 35%는 NK 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC의 약 4% 내지 약 25%는 NK 세포이다.
본원에 기술된 방법에 따른 일부 구현예에서, PBMC의 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 또는 75% 중 어느 하나는 T 세포이다. 일부 구현예에서, PBMC의 적어도 약 25%는 T 세포이다. 일부 구현예에서, PBMC의 적어도 약 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 7.5%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 또는 30% 중 어느 하나는 B 세포이다. 일부 구현예에서, PBMC의 적어도 약 2.5%는 B 세포이다. 일부 구현예에서, PBMC의 적어도 약 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 7.5%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 또는 30% 중 어느 하나는 NK 세포이다. 일부 구현예에서, PBMC의 적어도 약 3.5%는 NK 세포이다. 일부 구현예에서, PBMC의 적어도 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 또는 40% 중 어느 하나는 단핵구이다. 일부 구현예에서, PBMC의 적어도 약 4%는 단핵구이다. 일부 구현예에서, PBMC의 적어도 약 25%는 T 세포이고; PBMC의 적어도 약 2.5%는 B 세포이고; PBMC의 적어도 약 3.5%는 NK 세포이고; PBMC의 적어도 약 4%는 단핵구이다.
본원에 기술된 방법에 따른 일부 구현예에서, PBMC의 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 90% 이하 어느 하나는 T 세포이다. 일부 구현예에서, PBMC의 약 70% 이하는 T 세포이다. 일부 구현예에서, PBMC의 약 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 이하 중 어느 하나는 B 세포이다. 일부 구현예에서, PBMC의 약 14 % 이하는 B 세포이다. 일부 구현예에서, PBMC의 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 또는 60% 이하 중 어느 하나는 NK 세포이다. 일부 구현예에서, PBMC의 약 35% 이하는 NK 세포이다. 일부 구현예에서, PBMC의 약 5%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20%, 22%, 25%, 30%, 35%, 40%, 또는 50% 이하 중 어느 하나는 단핵구이다. 일부 구현예에서, PBMC의 약 4% 이하는 단핵구이다. 일부 구현예에서, PBMC의 약 25% 이하는 T 세포이고; PBMC의 약 2.5% 이하는 B 세포이고; PBMC의 약 3.5% 이하는 NK 세포이고; PBMC의 약 4% 이하는 단핵구이다.
본원에 기술된 방법에 따른 일부 구현예에서, 변형된 PBMC의 약 20% 내지 25%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 35% 내지 40%, 40% 내지 45%, 45% 내지 50%, 50% 내지 55%, 55% 내지 60%, 60% 내지 65%, 65% 내지 70%, 또는 70% 내지 75% 중 어느 하나는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC의 약 25% 내지 약 70%는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC의 약 1% 내지 2.5%, 2.5% 내지 4%, 4% 내지 6%, 6% 내지 8%, 8% 내지 10%, 10% 내지 12%, 12% 내지 14%, 14% 내지 16%, 16% 내지 20%, 또는 20% 내지 25% 중 어느 하나는 B 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC의 약 2.5% 내지 약 14%는 B 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC의 약 1% 내지 2%, 2% 내지 3.5%, 3.5% 내지 5%, 5% 내지 8%, 8% 내지 10%, 10% 내지 12%, 12% 내지 14%, 14% 내지 16%, 16% 내지 20%, 20% 내지 25%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 또는 35% 내지 40% 중 어느 하나는 NK 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC의 약 3.5% 내지 약 35%는 NK 세포이다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC의 약 2% 내지 4%, 4% 내지 6%, 6% 내지 8%, 8% 내지 10%, 10% 내지 12%, 12% 내지 14%, 14% 내지 16%, 16% 내지 20%, 20% 내지 25%, 25% 내지 30%, 30% 내지 35%, 또는 35% 내지 40% 중 어느 하나는 단핵구이다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC의 약 4% 내지 약 25%는 단핵구이다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC의 약 25% 내지 약 70%는 T 세포이고, 변형된 PBMC의 약 2.5% 내지 약 14%는 B 세포이고, 변형된 PBMC의 약 3.5% 내지 약 35%는 NK 세포이고, 변형된 PBMC의 약 4% 내지 약 25%는 NK 세포이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, PBMC는 단핵 혈구(예: 림프구 및 단핵구)가 혼합된 세포 모집단의 조성물을 조작한 후에도 생성될 수 있다. 일부 경우에, PBMC는 단핵 혈구가 혼합된 세포 모집단 내에서 (B 세포와 같은) 특정 아집단을 감소시킨 후(예를 들어 고갈시킨 후) 생성된다. 개체의 단핵 혈구가 혼합된 세포 모집단의 조성물은, 세포 모집단을 동일한 개체의 전혈로부터 얻은 백혈구성분채집술 산물과 더 가깝게 닮게 하기 위해 조작될 수 있다. 다른 예에서, 단핵 혈구(예를 들어 마우스 비장세포)가 혼합된 세포 모집단의 조성물은, 세포 모집단을 인간 전혈로부터 얻은 백혈구성분채집술 산물로부터 단리한 인간 PBMC와 더 가깝게 닮게 하기 위해 조작될 수도 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 PBMC에서 발견되는 세포의 모집단이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 CD3+ T 세포, CD20+ B 세포, CD14+ 단핵구, CD56+ NK 세포 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% T 세포 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 100% T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% B 세포 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 100% B 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% NK 세포 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 100% NK 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 단핵구 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 100% 단핵구를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 수지상 세포 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 100% 수지상 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% NK-T 세포 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물은 100% NK-T 세포를 포함한다.
단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 추가 변형
본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 유핵 세포(예를 들어 PBMC)의 조성물은 제제를 포함하지 않는 유핵 세포의 상응하는 조성물과 비교했을 때, 유핵 세포의 생존률 및/또는 기능을 향상시키는 제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포의 조성물은 제제를 포함하지 않는 유핵 세포의 상응하는 조성물과 비교했을 때, 동결-해동 사이클 후에 유핵 세포의 생존률 및/또는 기능을 향상시키는 제제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 제제는 동결보존제 및/또는 저온보존제(hypothermic preservation agent)이다. 일부 구현예에서, 동결보존제 또는 저온보존제 둘 다는, 임의의 동결-해동 사이클 전에 제제를 포함하지 않는 유핵 세포의 상응하는 조성물과 비교하여, 제제를 포함하는 유핵 세포의 조성물에서 10% 또는 20%를 초과하는 세포 사멸을 초래하지 않는다. 일부 구현예에서, 최대 1, 2, 3, 4, 5회의 동결-해동 사이클 후에 유핵 세포의 적어도 약 70%, 약 80%, 또는 약 90%가 생존할 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 세포내섭취를 강화하는 화합물, 안정화제, 또는 보조 인자이다. 일부 구현예에서, 제제는 알부민이다. 일부 구현예에서, 알부민은 마우스, 소, 또는 인간 알부민이다. 일부 구현예에서, 제제는 인간 알부민이다. 일부 구현예에서, 제제는 다음 중 하나 이상이다: 2가 금속 양이온, 포도당, ATP, 칼륨, 글리세롤, 트레할로스, D-수크로오스, PEG1500, L-아르기닌, L-글루타민, 또는 EDTA. 일부 구현예에서, 2가 금속 양이온은 Mg2+, Zn2+, 또는 Ca2+ 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 제제는 다음 중 하나 이상이다: 피루브산나트륨, 아데닌, 트레할로스, 덱스트로오스, 만노오스, 수크로오스, 인간 혈청 알부민(HSA), DMSO, HEPES, 글리세롤, 글루타티온, 이노신, 제이인산나트륨, 제일인산나트륨, 나트륨 금속 이온, 칼륨 금속 이온, 마그네슘 금속 이온, 염화물, 아세테이트, 글루콘산염, 수크로오스, 수산화칼륨, 또는 수산화나트륨. 일부 구현예에서, 제제는 다음 중 하나 이상이다: 피루브산나트륨, 아데닌, Rejuvesol®, 트레할로스, 덱스트로오스, 만노오스, 수크로오스, 인간 혈청 알부민(HSA), PlasmaLyte®, DMSO, Cryostor® CS2, Cryostor® CS5, Cryostor® CS10, Cryostor® CS15, HEPES, 글리세롤, 글루타티온, HypoThermosol®.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 유핵 세포의 조성물은 공자극 분자 중 하나 이상의 발현을 증가시키도록 추가로 변형되는 복수의 변형된 PBMC를 포함한다. 일부 구현예에서, 공자극 분자는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112이다. 일부 구현예에서, 복수의 변형된 PBMC는 하나 이상의 공자극 분자의 발현을 증가시키는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 변형된 PBMC는 하나 이상의 공자극 분자의 발현을 증가시키는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 공자극 분자는 T 세포 활성화를 자극함에 있어서 신호 2 매개자이다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 변형된 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2, IL-12, IL-21, 또는 IFNα2 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 복수의 변형된 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 증가시키는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 T 세포 활성화를 자극함에 있어서 신호 3 작동자이다.
T 세포 활성화는 TCR 신호 및 연관 신호의 강도에 따라, 궁극적으로 증식, 작동자 기능, 또는 사멸을 초래하는 세포내 신호전달 캐스케이드를 개시한다. 조기 활성화 또는 과도한 활성화를 방지하기 위해, T 세포는 완전한 활성화를 위해 2개의 독립적인 신호를 필요로 한다. 신호 1은 MHC와 복합체를 형성한 항원 펩티드에 대한 TCR의 결합에 의해 제공되는 항원 특이적 신호이다. 신호 2는 사이토카인에 의해 매개되거나 항원 제시 세포(APC) 상에서 B7.1(CD80) 및 B77.2(CD86)와 같은 공자극 분자의 결합에 의해 매개된다. 신호 3은 IL-2, IL-12, 및 IFN-α와 같은 염증성 사이토카인에 의해 매개된다.
본원에 기술된 방법 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 유핵 세포(예컨대 PBMC)는 단백질 또는 이의 단편을 포함하고, 유핵 세포는 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포(예컨대 PBMC)는 단백질 또는 이의 단편을 포함하고, 유핵 세포는 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 매개자)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포(예컨대 PBMC)는 단백질 또는 이의 단편을 포함하고, 유핵 세포는 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자) 및 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 매개자)를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제는 B7-1(CD80) 및/또는 B7-2(CD86)를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112를 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 포함하고, 일부 구현예에서, 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제는 B7-1(CD80) 및/또는 B7-2(CD86)를 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 포함한다.
일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제는 하나 이상의 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제는 IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, IFNα2 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제는 IL-2 및/또는 IL-12를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제는 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IFNα2의 변이체 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제는 IL-2 및/또는 IL-12의 변이체를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제는 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IFNα2의 변이체 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제는 막-결합 IL-2 및/또는 막-결합 IL-12를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제는 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-21, IFNα2의 변이체 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제는 IL-2 및/또는 IL12의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 제제를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 2를 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 3을 매개하는 제제를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 3을 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 제제 및/또는 신호 3을 매개하는 제제를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 2 또는 신호 3을 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 향상된 항원-특이적 T 세포 활성화는 HLA 불문이다. 일부 구현예에서, 향상된 항원 특이적 T 세포 활성화는 다음 중 하나 이상에 의한 제한에 따라 달라지는 T 세포 활성화를 포함한다: HLA-A*02, HLA-A*01 , HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-A*11, HLA-A*26, HLA-A*32, HLA-A*31, HLA-A*68, HLA-A*29, HLA-A*23, HLA-B*07, HLA-B*44, HLA-B*08, HLA-B*35, HLA-B*15, HLA-B*40, HLA-B*27, HLA-B*18, HLA-B*51, HLA-B*14, HLA-B*13, HLA-B*57, HLA-B*38, HLA-C*07, HLA-C*04, HLA-C*03, HLA-C*06, HLA-C*05, HLA-C*12, HLA-C*02, HLA-C*01, HLA-C*08, 및/또는 HLA-C*16 일배체형.
일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-10, IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, IFN-γ, IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IFN-α2 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 (변형된 사이토카인과 같은) 변이체 사이토카인, 예컨대 키메라 막 결합 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 키메라 막 결합 사이토카인(예컨대 막 결합 IL-10, IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, IFN-γ, IL-21)의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 변형되고, 변형된 사이토카인은 사이토카인 및 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 트랜스페린 수용체 단백질 1(TFRC) 또는 종양 괴사 인자(예: FasL) 막관통 도메인이다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호 81 또는 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함한다. 82. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 G4S 링커 또는 EAAAK 링커이다. 구현예에서, G4S 링커는 G4S 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 반복 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, EAAAK 링커는 EAAAK 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 반복 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)이다. 일부 구현예에서, 키메라 막결합 사이토카인은 서열번호 77~80 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 변형된 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 증가시키는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 서열번호 71 또는 72의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 T 세포 활성화를 자극함에 있어서 신호 3 작동자이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 비-막-결합 사이토카인과 비교하여 개체에서 사이토카인의 반감기를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인의 반감기는 비-막-결합 사이토카인과 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 막-결합 사이토카인은 비-막-고정 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여, 단백질 또는 이의 단편과 함께 도입된 유핵 세포에 의해 제시된 항원과 사이토카인의 공간 결합을 다음 중 어느 하나만큼 연장시킨다: 약 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 48, 72, 96시간 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 막-결합 사이토카인을 추가로 포함하는 유핵 세포는, 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 국소 사이토카인 농도를 나타낸다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 막-결합 사이토카인을 추가로 포함하는 유핵 세포는, 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상.
일부 구현예에서, 막-결합 사이토카인은 막-결합 케모카인이다.
일부 구현예에서, 변형된 PBMC는 MHC 클래스 II 발현을 조절하기 위한 추가 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 동종이계 맥락에서, 변형된 PBMC의 투여에 반응하여 개체에게서 나타나는 선천적 면역 반응은, 동종이계 맥락에서, 추가의 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC의 투여에 반응하여 개체에게서 나타나는 선천적 면역 반응과 비교하여 감소된다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 변형된 PBMC의 순환 반감기는, 추가의 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 추가의 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC의 순환 반감기에 비해 증가된다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 변형된 PBMC의 순환 반감기는, 추가의 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 추가의 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC의 순환 반감기에 비해 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상 중 어느 하나만큼 증가된다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 변형된 PBMC의 순환 반감기는, 추가의 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC가 투여된 개체에서 추가의 변형을 포함하지 않는 상응하는 변형된 PBMC의 순환 반감기와 본질적으로 동일하다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 상기 방법은 유핵 세포를 제제와 함께 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 인큐베이션 단계는 인큐베이션 단계가 없이 제조된 상응하는 유핵 세포에 비해 유핵 세포의 생존률 및/또는 기능을 향상시킨다.
HLA-불문 방식으로 항원 특이적 반응을 향상시키기 위한 유핵 세포의 추가 변형
T 세포 활성화는 TCR 신호 및 연관 신호의 강도에 따라, 궁극적으로 증식, 작동자 기능, 또는 사멸을 초래하는 세포내 신호전달 캐스케이드를 개시한다. 조기 활성화 또는 과도한 활성화를 방지하기 위해, T 세포는 완전한 활성화를 위해 2개의 독립적인 신호를 필요로 한다. 신호 1은 MHC와 복합체를 형성한 항원 펩티드에 대한 TCR의 결합에 의해 제공되는 항원 특이적 신호이다. 신호 2는 사이토카인에 의해 매개되거나 항원 제시 세포(APC) 상에서 B7.1(CD80) 및 B77.2(CD86)와 같은 공자극 분자의 결합에 의해 매개된다. 신호 3은 IL-2, IL-12, 및 IFN-α와 같은 염증성 사이토카인에 의해 매개된다.
일부 양태에서, 면역 세포의 활성을 향상시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 면역 세포에서 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자)를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 면역 세포의 활성을 향상시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 면역 세포에서 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 작동자)를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 면역 세포의 활성을 향상시키는 방법이 제공되며, 상기 방법은 면역 세포에서 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자) 및 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 작동자)를 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, T 세포 활성화를 자극함에 있어서 신호 3을 매개하는 제제(예컨대 신호 3 작동자)는 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15, IL-21, IFNα2 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-2 및/또는 IL-12를 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 면역 세포에서 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 발현시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 변형되고, 변형된 사이토카인은 사이토카인 및 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 트랜스페린 수용체 단백질 1(TFRC) 또는 종양 괴사 인자(예: FasL) 막관통 도메인이다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호 81 또는 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함한다. 82. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 G4S 링커 또는 EAAAK 링커이다. 구현예에서, G4S 링커는 G4S 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 반복 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, EAAAK 링커는 EAAAK 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 반복 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 서열번호 77~80의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 변형된 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 증가시키는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 서열번호 71 또는 72의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 T 세포 활성화를 자극함에 있어서 신호 3 작동자이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 비-막-결합 사이토카인과 비교하여 개체에서 사이토카인의 반감기를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인의 반감기는 비-막-결합 사이토카인과 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 막-결합 사이토카인은 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여, 단백질 또는 이의 단편과 함께 도입된 유핵 세포에 의해 제시된 항원과 사이토카인의 공간 결합을 다음 중 어느 하나만큼 연장시킨다: 약 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 48, 72, 96시간 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 막-결합 사이토카인을 추가로 포함하는 유핵 세포는, 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 국소 사이토카인 농도를 나타낸다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 막-결합 사이토카인을 추가로 포함하는 유핵 세포는, 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상.
일부 양태에서, 본 발명은 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하고; mRNA가 발현되어, 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다. 일부 양태에서, 본 발명은 백신 접종를 필요로 하는 개체에게 백신을 접종하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다. 일부 구현예에서, mRNA의 뉴클레오티드 서열은 유핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 포함하고, 단백질 또는 이의 단편은 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하고, 단백질 또는 이의 단편은 항원이다. 일부 구현예에서, 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다. 일부 구현예에서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질이다. 일부 구현예에서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18이다. 일부 구현예에서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질이다. 일부 구현예에서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하며; 여기서 단백질 또는 이의 단편은 MHC와 복합체를 형성하는 항원 펩티드로 가공되어, T 세포 활성화에서 신호 1을 매개한다.
일부 구현예에서, 신호 1은 MHC와 복합체를 형성한 항원 펩티드에 대한 T 세포 수용체의 결합에 의해 제공되는 항원 특이적 신호이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하며; 여기서 mRNA가 발현되어, 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하며; 여기서 단백질 또는 이의 단편은 MHC와 복합체를 형성하는 항원 펩티드로 가공되어, T 세포 활성화에서 신호 1을 매개한다.
전술한 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 유핵 세포(예컨대 PBMC)는 단백질 또는 이의 단편에 대한 면역 반응을 추가로 향상시키기 위한 추가 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포(예컨대 PBMC)를 추가로 변형하는 방법은 HLA 불문 방식으로 단백질 또는 이의 단편에 대한 면역 반응을 추가로 향상시킨다. 일부 구현예에서, 유핵 세포(예컨대 PBMC)를 추가로 변형하는 방법은 단백질 또는 이의 단편에 대한 면역 반응을 추가로 향상시키며, 여기서 향상된 면역 반응은 하나 이상의 HLA 일배체형에 의한 제한에 의존하는 면역 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포(예컨대 PBMC)를 추가로 변형하는 방법은 단백질 또는 이의 단편에 대한 면역 반응을 추가로 향상시키며, 여기서 향상된 면역 반응은 다음 중 하나 이상에 의한 제한에 의존적인 면역 반응을 포함한다: HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-A*11, HLA-A*26, HLA-A*32, HLA-A*31, HLA-A*68, HLA-A*29, HLA-A*23, HLA-B*07, HLA-B*44, HLA-B*08, HLA-B*35, HLA-B*15, HLA-B*40, HLA-B*27, HLA-B*18, HLA-B*51, HLA-B*14, HLA-B*13, HLA-B*57, HLA-B*38, HLA-C*07, HLA-C*04, HLA-C*03, HLA-C*06, HLA-C*05, HLA-C*12, HLA-C*02, HLA-C*01, HLA-C*08, 또는 HLA-C*16 일배체형. 유핵 세포가 단백질 또는 이의 단편, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편은 MHC와 복합체를 형성하는 항원 펩티드로 가공되어, T 세포 활성화에서 신호 1을 매개한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포에 대한 추가의 변형은 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자)를 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포에 대한 추가의 변형은 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 작동자)를 도입하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포에 대한 추가의 변형은 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자) 및 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 매개자)를 도입하는 것을 포함한다.
본원에 기술된 방법 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자)는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 2를 매개하는 제제는 CD70, B7-1(CD80), 및/또는 B7-2(CD86)를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 유핵 세포는 다음 중 하나 이상의 발현을 증가시키는 핵산을 포함한다: B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112. 일부 구현예에서, 변형된 유핵 세포는 다음 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함한다: B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112. 일부 구현예에서, 복수의 변형된 유핵 세포는 CD70, B7-1(CD80), 및/또는 B7-2(CD86)를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함한다.
본원에 기술된 방법 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 제제(예컨대 신호 3 작동자)는 사이토카인 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 제제는 사이토카인 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 mRNA이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-10, IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, IFN-γ, IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IFN-α2 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 (변형된 사이토카인과 같은) 변이체 사이토카인, 예컨대 키메라 막 결합 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 변형되고, 변형된 사이토카인은 사이토카인 및 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합된다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 트랜스페린 수용체 단백질 1(TFRC) 또는 종양 괴사 인자(예: FasL) 막관통 도메인이다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 서열번호 81 또는 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함한다. 82. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 G4S 링커 또는 EAAAK 링커이다. 구현예에서, G4S 링커는 G4S 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 반복 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, EAAAK 링커는 EAAAK 서열의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 반복 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)이다. 일부 구현예에서, 키메라 막결합 사이토카인은 서열번호 77~80 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 복수의 변형된 유핵 세포는 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 증가시키는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 서열번호 71 또는 72의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 T 세포 활성화를 자극함에 있어서 신호 3 작동자이다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인은 비-막-결합 사이토카인과 비교하여 개체에서 사이토카인의 반감기를 향상시킨다. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인의 반감기는 비-막-결합 사이토카인과 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 막-결합 사이토카인은 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여, 단백질 또는 이의 단편과 함께 도입된 유핵 세포에 의해 제시된 항원과 사이토카인의 공간 결합을 다음 중 어느 하나만큼 연장시킨다: 약 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 48, 72, 96시간 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 막-결합 사이토카인을 추가로 포함하는 유핵 세포는, 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 국소 사이토카인 농도를 나타낸다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 막-결합 사이토카인을 추가로 포함하는 유핵 세포는, 비-막-결합 사이토카인을 포함하는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IL-10, IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, IFN-γ, IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 IFN-α2 또는 이의 기능적 변이체이다. 일부 구현예에서, 사이토카인은 (변형된 사이토카인과 같은) 변이체 사이토카인, 예컨대 키메라 막 결합 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 하나 이상의 키메라 막-결합 사이토카인(예컨대 막 결합 IL-10, IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, IFN-γ, 및/또는 IL-21)의 발현을 증가시키도록 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 하나 이상의 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 막 결합 IL-12를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 막 결합 IL-2를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 막 결합 IL-2 및 막 결합 IL-12를 암호화하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하며, 유핵 세포는 신호 2를 매개하는 제제 및/또는 신호 3을 매개하는 제제로 추가로 변형된다. 일부 양태에서, 본 발명은 백신 접종을 필요로 하는 개체에게 백신을 접종하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하며, 유핵 세포는 신호 2를 매개하는 제제 및/또는 신호 3을 매개하는 제제로 추가로 변형된다. 일부 구현예에서, mRNA의 뉴클레오티드 서열은 유핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
본원에 기술된 방법, 유핵 세포, 또는 조성물 중 어느 하나의 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편 및 신호 2 및/또는 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제를 포함하는 유핵 세포는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편 및 신호 2 및/또는 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제에게 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여, 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포의 직경의 함수인, 단계; 및 b) 단백질 또는 이의 단편 및 신호 2 및/또는 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제를 섭동된 투입 면역 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 단백질 또는 이의 단편 및 신호 2 및/또는 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제와 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편 및 신호 2 및/또는 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제를 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계.
일부 구현예에서, 신호 2를 매개하는 제제는 CD86을 포함하고, 신호 3을 매개하는 제제는 IL-2를 포함한다. 본원에 기술된 방법, 유핵 세포, 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편 및 CD86 및 IL-2를 포함하는 유핵 세포는 다음에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편 및 CD86 및 IL-2에게 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 단백질 또는 이의 단편 및 CD86 및 IL-2를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편 및 CD86 및 IL-2와 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편 및 CD86 및 IL-2를 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계.
일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 제제는 막-결합 사이토카인이다. 본원에 기술된 방법, 유핵 세포, 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편 및 막-결합 사이토카인을 포함하는 유핵 세포는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및/또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산은 mRNA이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편은 하나 이상을 항원를 포함한다.
일부 구현예에서, 신호 2를 매개하는 제제는 키메라 막-결합 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 항원에 대한 면역 반응을 자극함에 있어서 면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 방법이 제공되며, 여기서 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하고 항원을 추가로 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 항원 및 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 핵산 및 항원을 섭동된 투입 면역 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하고, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 핵산이 발현되고, 이에 의해 키메라 막 결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포가 생성되는 단계. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA이다.
일부 구현예에서, 항원에 대한 면역 반응을 자극함에 있어서 면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 방법이 제공되며, 여기서 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하고 항원을 추가로 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및/또는 항원을 암호화하는 핵산은 mRNA이다.
일부 구현예에서, 항원에 대한 면역 반응을 자극함에 있어서 면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 방법이 제공되며, 여기서 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여, 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계.
일부 양태에서, 의약으로서 사용하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2 및/또는 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제를 추가로 포함하는 유핵 세포의 유효량을 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2 및/또는 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제를 추가로 포함하는 유핵 세포의 유효량을 포함한다. 일부 양태에서, 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 방법이 제공되며, 상기 방법은 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2 및/또는 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제를 추가로 포함하는 유핵 세포의 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 개체에서 면역 반응을 자극하고/자극하거나 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2 및/또는 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제를 추가로 포함하는 유핵 세포의 유효량을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다.
일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 제제는 하나 이상의 막-결합 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 제제는 막-결합 IL-12를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 제제는 막-결합 IL-2를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 제제는 막-결합 IL-2 및 막-결합 IL-12를 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 2를 매개하는 제제는 CD80을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 3을 매개하는 제제는 CD86을 포함한다. 일부 구현예에서, 신호 2를 매개하는 제제는 CD80 및 CD86을 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하며; 여기서 단백질 또는 이의 단편은 MHC와 복합체를 형성하는 항원 펩티드로 가공되어, T 세포 활성화에서 신호 1을 매개한다.
본원에 기술된 방법, 유핵 세포, 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편, CD86, 및 막-결합 IL-12를 포함하는 유핵 세포는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, CD86을 암호화하는 핵산, 막-결합 IL-12를 암호화하는 핵산, 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) CD86을 암호화하는 핵산, 막-결합 IL-12를 암호화하는 핵산, 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 CD86을 암호화하는 핵산, 막-결합 IL-12를 암호화하는 핵산, 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편, CD86, 및 막-결합 IL-12를 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, CD86을 암호화하는 핵산, 막-결합 IL-12를 암호화하는 핵산, 및/또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산은 mRNA이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편은 하나 이상을 항원를 포함한다.
본원에 기술된 방법, 유핵 세포, 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편, CD86, 및 막-결합 IL-2를 포함하는 유핵 세포는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, CD86을 암호화하는 핵산, 막-결합 IL-2를 암호화하는 핵산, 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) CD86을 암호화하는 핵산, 막-결합 IL-2를 암호화하는 핵산, 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 CD86을 암호화하는 핵산, 막-결합 IL-2를 암호화하는 핵산, 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편, CD86, 및 막-결합 IL-2를 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, CD86을 암호화하는 핵산, 막-결합 IL-2를 암호화하는 핵산, 및/또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산은 mRNA이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편은 하나 이상을 항원를 포함한다.
본원에 기술된 방법, 유핵 세포, 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편, CD86, 막-결합 IL-2, 및 막-결합 IL-12를 포함하는 유핵 세포는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조된다: a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, CD86을 암호화하는 핵산, 막-결합 IL-2를 암호화하는 핵산, 막-결합 IL-12를 암호화하는 핵산, 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및 b) CD86을 암호화하는 핵산, 막-결합 IL-2를 암호화하는 핵산, 막-결합 IL-12를 암호화하는 핵산, 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 CD86을 암호화하는 핵산, 막-결합 IL-2를 암호화하는 핵산, 막-결합 IL-12를 암호화하는 핵산, 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여, 단백질 또는 이의 단편, CD86, 막-결합 IL-2, 및 막-결합 IL-12를 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. 일부 구현예에서, CD86을 암호화하는 핵산, 막-결합 IL-2를 암호화하는 핵산, 막-결합 IL-12를 암호화하는 핵산, 및/또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산은 mRNA이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편은 하나 이상을 항원를 포함한다.
일부 구현예에서, 투입 세포 현탁액은 투입 유핵 세포 및 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 투입 세포 현탁액은 투입 유핵 세포 및 단백질 또는 이의 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 세포 현탁액은 투입 유핵 세포 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 투입 세포 현탁액은 투입 유핵 세포 및 단백질 또는 이의 단편뿐만 아니라 신호 2를 매개하는 제제 및/또는 신호 3을 매개하는 제제도 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 세포 현탁액은 투입 유핵 세포 및 단백질 또는 이의 단편뿐만 아니라 신호 2를 매개하는 제제 및/또는 신호 3을 매개하는 제제를 암호화하는 mRNA도 포함한다. 일부 구현예에서, 투입 세포 현탁액은 투입 유핵 세포 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA뿐만 아니라 신호 2를 매개하는 제제 및/또는 신호 3을 매개하는 제제를 암호화하는 mRNA도 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 신호 2를 매개하는 제제 및/또는 신호 3을 매개하는 제제를 암호화하는 mRNA뿐만 아니라 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 신호 2를 매개하는 제제 및/또는 신호 3을 매개하는 제제를 암호화하는 mRNA뿐만 아니라 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 인큐베이션하는 단계를 포함한다.
본원에 기술된 방법, 조성물, 또는 유핵 세포 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, mRNA(예컨대 신호 2 매개자를 암호화하는 mRNA 및 신호 3 매개자를 암호화하는 mRNA)는 외인성 mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 시험관내 전사된(IVT) mRNA이다. 일부 구현예에서, 외인성 mRNA는 시험관내 전사된(IVT) mRNA이다. 일부 구현예에서, mRNA는 재조합 단백질을 암호화한다. 일부 구현예에서, mRNA는 유핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다.
일부 구현예에서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 유핵 세포의 모집단 내에서 가장 작은 직경을 갖는 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 45%, 약 50% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 80%, 또는 약 60% 내지 약 70% 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 2 μm 내지 약 5 μm, 약 3 μm 내지 약 5 μm, 약 2 μm 내지 약 2.5 μm, 약 2.2 μm 내지 약 2.5 μm, 약 2.5 μm 내지 약 3 μm, 약 3 μm 내지 약 5 μm, 약 3 μm 내지 약 3.5 μm, 약 3.5 μm 내지 약 4 μm, 약 4 μm 내지 약 4.5 μm, 약 3.2 μm 내지 약 3.8 μm, 약 3.8 μm 내지 약 4.3 μm, 약 4.2 μm 내지 약 6 μm, 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 2 μm, 2.2 μm, 2.5 μm, 3 μm, 3.5 μm, 4 μm, 4.5 μm, 5 μm, 5.5 μm, 6 μm, 6.5 μm, 7 μm, 7.5 μm, 8 μm, 8.5 μm, 9 μm, 9.5 μm, 10 μm, 10.5 μm, 11 μm, 11.5 μm, 12 μm, 12.5 μm, 13 μm, 13.5 μm, 14 μm, 14.5 μm, 또는 15 μm 이하 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과한다.
본원에 기술된 방법, 용도, 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 유핵 세포(예: PBMC)는 유핵 세포가 컨디셔닝되기에 충분한 시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 1 내지 약 24시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 2 내지 약 10시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 3 내지 약 6시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간, 2시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간, 또는 24시간 중 어느 하나 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 유핵 세포 내로 도입하기 전에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 유핵 세포 내로 도입한 후에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 컨디셔닝을 위해 사용되는 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 알파-갈락토실 세라미드, STING 작용제, 환형 디뉴클레오티드(CDN), RIG-I 작용제, 폴리이노신산-폴리시티딜산(폴리 I:C), TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제이다. 예시적인 보조제는 CpG ODN, 인터페론-α(IFN-α), 폴리이노신산:폴리시티딜산(polyI:C), 이미퀴모드(R837), 레시퀴모드(R848), 또는 지질다당류(LPS)를 포함하며 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)이다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 7909이다.
유핵 세포가 B 세포를 포함하는 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 분자는 컨디셔닝되지 않은 유핵 세포의 B 세포와 비교하여 컨디셔닝된 유핵 세포의 B 세포에서 상향조절된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)이다. 유핵 세포가 복수의 PBMC인 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 분자는 컨디셔닝되지 않은 복수의 PBMC의 B 세포와 비교하여 컨디셔닝된 복수의 PBMC의 B 세포에서 상향 조절된다. 일부 구현예에서, 공자극 분자는 CD80 및/또는 CD86이다. 일부 구현예에서, 컨디셔닝된 복수의 PBMC는 컨디셔닝되지 않은 복수의 PBMC와 비교하여 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현을 증가시킨다. 일부 구현예에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현은 컨디셔닝되지 않은 복수의 PBMC와 비교하여 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배, 또는 10배 초과만큼 증가된다.
본원에 기술된 방법, 용도, 또는 조성물 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 유핵 세포는 면역 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 HLA-A*02, HLA-A*01 , HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-A*11, HLA-A*26, HLA-A*32, HLA-A*31, HLA-A*68, HLA-A*29, HLA-A*23, HLA-B*07, HLA-B*44, HLA-B*08, HLA-B*35, HLA-B*15, HLA-B*40, HLA-B*27, HLA-B*18, HLA-B*51, HLA-B*14, HLA-B*13, HLA-B*57, HLA-B*38, HLA-C*07, HLA-C*04, HLA-C*03, HLA-C*06, HLA-C*05, HLA-C*12, HLA-C*02, HLA-C*01, HLA-C*08, 또는 HLA-C*16의 일배체형을 갖는 인간 세포이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 복수의 PBMC이다. 일부 구현예에서, 컨디셔닝된 유핵 세포는 컨디셔닝된 복수의 변형된 PBMC이다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 2개 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상이다.
일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하며; 여기서 단백질 또는 이의 단편은 MHC와 복합체를 형성하는 항원 펩티드로 가공되어, T 세포 활성화에서 신호 1을 매개한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 2를 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 향상된 수준에서 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 2를 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 향상된 수준에서 HLA 불문 방식으로 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는 신호 2를 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 향상된 수준에서 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있으며, 여기서 향상된 면역 반응은 다음 중 하나 이상에 의한 제한에 의존적인 면역 반응을 포함한다: HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-A*11, HLA-A*26, HLA-A*32, HLA-A*31, HLA-A*68, HLA-A*29, HLA-A*23, HLA-B*07, HLA-B*44, HLA-B*08, HLA-B*35, HLA-B*15, HLA-B*40, HLA-B*27, HLA-B*18, HLA-B*51, HLA-B*14, HLA-B*13, HLA-B*57, HLA-B*38, HLA-C*07, HLA-C*04, HLA-C*03, HLA-C*06, HLA-C*05, HLA-C*12, HLA-C*02, HLA-C*01, HLA-C*08, 또는 HLA-C*16 일배체형.
일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하며; 여기서 단백질 또는 이의 단편은 MHC와 복합체를 형성하는 항원 펩티드로 가공되어, T 세포 활성화에서 신호 1을 매개한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 2를 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 2를 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 HLA 불문 방식으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는 신호 2를 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 CD8+ 세포 활성화를 유도할 수 있으며, 여기서 향상된 T 세포 활성화는 다음 중 하나 이상에 의한 제한에 의존적인 T 세포 활성화를 포함한다: HLA-A*02, HLA-A*01 , HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-A*11, HLA-A*26, HLA-A*32, HLA-A*31, HLA-A*68, HLA-A*29, HLA-A*23, HLA-B*07, HLA-B*44, HLA-B*08, HLA-B*35, HLA-B*15, HLA-B*40, HLA-B*27, HLA-B*18, HLA-B*51, HLA-B*14, HLA-B*13, HLA-B*57, HLA-B*38, HLA-C*07, HLA-C*04, HLA-C*03, HLA-C*06, HLA-C*05, HLA-C*12, HLA-C*02, HLA-C*01, HLA-C*08, 또는 HLA-C*16 일배체형. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있으며, 여기서 CD8+ T 세포의 하나 이상의 다기능성 마커는 신호 2를 매개하는 제제를 추가로 포함하지 않는 유핵 세포에 의해 활성화된 항원 특이적 CD8+ T 세포와 비교했을 때 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 하나 이상의 다기능성 마커는 다음을 포함한다: 그랜자임 B, IFN-α, IL-2, PD-1, 및/또는 IFN-γ. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있으며, 여기서 CD8+ T 세포의 증식 및/또는 생존은 신호 2를 매개하는 제제를 추가로 포함하지 않는 유핵 세포에 의해 활성화된 항원 특이적 CD8+ T 세포와 비교했을 때 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상.
일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하며; 여기서 단백질 또는 이의 단편은 MHC와 복합체를 형성하는 항원 펩티드로 가공되어, T 세포 활성화에서 신호 1을 매개한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 작동자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 3을 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 향상된 수준에서 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 작동자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 3을 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 향상된 수준에서 HLA 무관 방식으로 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 작동자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는 신호 3을 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 향상된 수준에서 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있으며, 여기서 향상된 면역 반응은 다음 중 하나 이상에 의한 제한에 의존적인 면역 반응을 포함한다: HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-A*11, HLA-A*26, HLA-A*32, HLA-A*31, HLA-A*68, HLA-A*29, HLA-A*23, HLA-B*07, HLA-B*44, HLA-B*08, HLA-B*35, HLA-B*15, HLA-B*40, HLA-B*27, HLA-B*18, HLA-B*51, HLA-B*14, HLA-B*13, HLA-B*57, HLA-B*38, HLA-C*07, HLA-C*04, HLA-C*03, HLA-C*06, HLA-C*05, HLA-C*12, HLA-C*02, HLA-C*01, HLA-C*08, 또는 HLA-C*16 일배체형.
일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하며; 여기서 단백질 또는 이의 단편은 MHC와 복합체를 형성하는 항원 펩티드로 가공되어, T 세포 활성화에서 신호 1을 매개한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 작동자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 3을 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 작동자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 3을 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 HLA 무관 방식으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 작동자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는 신호 3을 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 향상된 수준에서 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있으며, 여기서 향상된 T 세포 활성화는 다음 중 하나 이상에 의한 제한에 의존적인 T 세포 활성화를 포함한다: HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-A*11, HLA-A*26, HLA-A*32, HLA-A*31, HLA-A*68, HLA-A*29, HLA-A*23, HLA-B*07, HLA-B*44, HLA-B*08, HLA-B*35, HLA-B*15, HLA-B*40, HLA-B*27, HLA-B*18, HLA-B*51, HLA-B*14, HLA-B*13, HLA-B*57, HLA-B*38, HLA-C*07, HLA-C*04, HLA-C*03, HLA-C*06, HLA-C*05, HLA-C*12, HLA-C*02, HLA-C*01, HLA-C*08, 또는 HLA-C*16 일배체형. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 매개자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있으며, 여기서 CD8+ T 세포의 하나 이상의 다기능성 마커는 신호 3을 매개하는 제제를 추가로 포함하지 않는 유핵 세포에 의해 활성화된 항원 특이적 CD8+ T 세포와 비교했을 때 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 하나 이상의 다기능성 마커는 다음을 포함한다: 그랜자임 B, IFN-α, IL-2, PD-1, 및/또는 IFN-γ. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 매개자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있으며, 여기서 CD8+ T 세포의 증식 및/또는 생존은 신호 3을 매개하는 제제를 추가로 포함하지 않는 유핵 세포에 의해 활성화된 항원 특이적 CD8+ T 세포와 비교했을 때 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자) 및 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 작동자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 2 또는 신호 3을 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 향상된 수준에서 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자) 및 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 매개자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 2 또는 신호 3을 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 향상된 수준에서 HLA 무관 방식으로 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하며; 여기서 단백질 또는 이의 단편은 MHC와 복합체를 형성하는 항원 펩티드로 가공되어, T 세포 활성화에서 신호 1을 매개한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자) 및 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 작동자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 2 또는 신호 3을 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자) 및 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 작동자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 2 또는 신호 3을 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 HLA 무관 방식으로 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자) 및 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 작동자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는 신호 2 또는 신호 3을 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 면역 반응을 유도할 수 있으며, 여기서 향상된 면역 반응은 다음 중 하나 이상에 의한 제한에 의존적인 면역 반응을 포함한다: HLA-A*02, HLA-A*01 , HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-A*11, HLA-A*26, HLA-A*32, HLA-A*31, HLA-A*68, HLA-A*29, HLA-A*23, HLA-B*07, HLA-B*44, HLA-B*08, HLA-B*35, HLA-B*15, HLA-B*40, HLA-B*27, HLA-B*18, HLA-B*51, HLA-B*14, HLA-B*13, HLA-B*57, HLA-B*38, HLA-C*07, HLA-C*04, HLA-C*03, HLA-C*06, HLA-C*05, HLA-C*12, HLA-C*02, HLA-C*01, HLA-C*08, 또는 HLA-C*16 일배체형.
일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편, 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하며; 여기서 단백질 또는 이의 단편은 MHC와 복합체를 형성하는 항원 펩티드로 가공되어, T 세포 활성화에서 신호 1을 매개한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자) 및 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 매개자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 2 또는 신호 3을 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자) 및 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 작동자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는, 신호 2 또는 신호 3을 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 다음 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 HLA 무관 방식으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자) 및 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 매개자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는 신호 2 또는 신호 3을 매개하는 제제를 포함하지 않는 상응하는 유핵 세포와 비교하여 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상 중 어느 하나만큼 더 높은 수준으로 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있으며, 여기서 향상된 T 세포 활성화는 다음 중 하나 이상에 의한 제한에 의존적인 T 세포 활성화를 포함한다: HLA-A*02, HLA-A*01 , HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-A*11, HLA-A*26, HLA-A*32, HLA-A*31, HLA-A*68, HLA-A*29, HLA-A*23, HLA-B*07, HLA-B*44, HLA-B*08, HLA-B*35, HLA-B*15, HLA-B*40, HLA-B*27, HLA-B*18, HLA-B*51, HLA-B*14, HLA-B*13, HLA-B*57, HLA-B*38, HLA-C*07, HLA-C*04, HLA-C*03, HLA-C*06, HLA-C*05, HLA-C*12, HLA-C*02, HLA-C*01, HLA-C*08, 또는 HLA-C*16 일배체형. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자) 및 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 매개자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있으며, 여기서 CD8+ T 세포의 하나 이상의 다기능성 마커는 신호 2 또는 신호 3을 매개하는 제제를 추가로 포함하지 않는 유핵 세포에 의해 활성화된 항원 특이적 CD8+ T 세포와 비교했을 때 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상. 일부 구현예에서, 하나 이상의 다기능성 마커는 다음을 포함한다: 그랜자임 B, IFN-α, IL-2, PD-1, 및/또는 IFN-γ. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하고 신호 2를 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 2 매개자) 및 신호 3을 매개하는 하나 이상의 제제(예컨대 신호 3 매개자)를 추가로 포함하는 유핵 세포는 항원 특이적 CD8+ T 세포 활성화를 유도할 수 있으며, 여기서 CD8+ T 세포의 증식 및/또는 생존은 신호 2 또는 신호 3을 매개하는 제제를 추가로 포함하지 않는 유핵 세포에 의해 활성화된 항원 특이적 CD8+ T 세포와 비교했을 때 다음 중 어느 하나만큼 증가된다: 약 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 25배, 50배, 100배, 200배, 또는 500배 또는 그 이상.
보조제
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "보조제"는 면역 반응을 직접적으로 또는 간접적으로 조절하고/하거나 야기하는 물질을 지칭할 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 보조제는 PBMC의 집단과 같은 유핵 세포의 집단을 컨디셔닝하는 데 사용된다(즉, 세포는 개체에게 투여되기 전에 보조제와 함께 인큐베이션됨). 일부 경우에, 보조제는 단백질 또는 이의 단편과 함께 투여되어 단백질 또는 이의 단편만 투여된 것과 비교했을 때 단백질 또는 이의 단편에 대한 면역 반응을 향상시킨다. 따라서, 보조제는 단백질 또는 이의 단편에 대한 면역 세포 반응(예를 들어 T 세포 반응)의 유도를 촉진한다. 예시적인 보조제는 인터페론 유전자(STING) 작용제, 레티노산-유도성 유전자 I(RIG-I) 작용제, 및 TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, 및/또는 TLR9에 대한 작용제의 자극제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 예시적인 보조제는 CpG ODN, 인터페론-α(IFN-α), 폴리이노신산:폴리시티딜산(polyI:C), 이미퀴모드(R837), 레시퀴모드(R848), 또는 지질다당류(LPS)를 포함하며 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG ODN, LPS, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 알파-갈락토실 세라미드, STING 작용제, 환형 디뉴클레오티드(CDN), RIG-I 작용제, 폴리이노신산-폴리시티딜산, R837, R848, TLR3 작용제, TLR4 작용제, 또는 TLR9 작용제이다. 특정 구현예에서, 보조제는 CpG ODN이다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG ODN이다. 일부 구현예에서, CpG ODN은 클래스 A CpG ODN, 클래스 B CpG ODN, 또는 클래스 C CpG ODN이다. 일부 구현예에서, CpG ODN 보조제는 CpG ODN 1018, CpG ODN 1585, CpG ODN 2216, CpG ODN 2336, CpG ODN 1668, CpG ODN 1826, CPG ODN 2006, CpG ODN 2007, CpG ODN BW006, CpG ODN D-SL01, CpG ODN 2395, CpG ODN M362, CpG ODN D-SL03의 군으로부터 선택된 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CpG ODN 보조제는 CpG ODN 1826 (TCCATGACGTTCCTGACGTT (서열번호 30)) 또는 CpG ODN 2006 (CpG 7909로도 알려짐) (TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (서열번호 31)) 올리고뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 보조제는 CpG 7909이다. 일부 구현예에서, RIG-I 작용제는 폴리이노신산:폴리시티딜산(polyI:C)을 포함한다. 면역 반응 유도를 향상시키기 위해 항원과 함께 다수의 보조제가 사용될 수도 있다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC는 둘 이상의 보조제를 포함한다. 면역 반응 유도를 향상시키기 위해 항원과 함께 다수의 보조제가 사용될 수도 있다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC는 둘 이상의 보조제를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 PBMC는 보조제 CpG ODN, LPS, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 알파-갈락토실 세라미드, STING 작용제, 환형 디뉴클레오티드(CDN), RIG-I 작용제, 폴리이노신산-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제의 임의의 조합을 포함한다.
단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물을 생성하는 데 사용되는 협착부
일부 구현예에서, 본 발명은 면역 반응을 자극하기 위해 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포의 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 면역 세포, 예를 들어 복수의 PBMC; 또는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 하나 이상이다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편은 유핵 세포에게 세포내 전달된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편은, 일시적인 공극이 세포막에 도입되어 단백질 또는 이의 단편이 세포에 진입하도록, 세포를 협착부를 통과시킴으로써 유핵 세포 내로 도입된다. 협착에 기반하여 세포 내로 화합물을 전달하는 것의 예는 WO 2013/059343, WO 2015/023982, WO 2016/070136, WO2017041050, WO2017008063, WO 2017/192785, WO 2017/192786, WO 2019/178005, WO 2019/178006, WO 2020/072833, PCT/US2020/15098, 및 PCT/US2020/020194에 의해 제공된다.
일부 구현예에서, 유핵 세포(예: PBMC)가 포함된 세포 현탁액을 협착부를 통과시킴으로써, 단백질 또는 이의 단편이 유핵 세포 내로 전달되어 본 발명의 유핵 세포가 생산되며, 여기서 협착부는 단백질 또는 이의 단편이 세포에 진입하도록 세포를 변형시켜 세포의 섭동을 유발한다. 일부 구현예에서, 협착부는 미세 유체 채널 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 다수의 협착부가 미세 유체 채널 내에 병렬로 및/또는 직렬로 배치될 수 있다.
일부 구현예에서, 미세 유체 채널 내의 협착부는 입구 부분, 중심점, 및 출구 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 미세 유체 채널 내의 협착부의 길이, 깊이, 및 폭은 변화할 수 있다. 일부 구현예에서, 미세 유체 채널 내의 협착부의 폭은 유핵 세포의 직경의 함수이다. 고-함량 이미징, 세포 계수기, 또는 유세포 계측법과 같은, 유핵 세포의 직경을 결정하는 방법이 당업계에 공지되어 있다.
협착부에 기반하여 단백질 또는 이의 단편을 유핵 세포에 전달하는 것의 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3 μm 내지 약 15 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3 μm 내지 약 10 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 4.2 μm 내지 약 6 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3 μm 내지 약 5 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3 μm 내지 약 3.5 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm 내지 약 4 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 4 μm 내지 약 4.5 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3.2 μm 내지 약 3.8 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3.8 μm 내지 약 4.3 μm이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 2 μm, 2.5 μm, 3 μm, 3.5 μm, 4 μm, 4.5 μm, 5 μm, 5.5 μm, 6 μm, 6.5 μm, 7 μm, 7.5 μm, 8 μm, 8.5 μm, 9 μm, 9.5 μm, 10 μm, 10.5 μm, 11 μm, 11.5 μm, 12 μm, 12.5 μm, 13 μm, 13.5 μm, 14 μm, 14.5 μm, 또는 15 μm 이하 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 3.0 μm, 3.1 μm, 3.2 μm, 3.3 μm, 3.4 μm, 3.5 μm, 3.6 μm, 3.7 μm, 3.8 μm, 3.9 μm, 4.0 μm, 4.1 μm, 4.2 μm, 4.3 μm, 4.4 μm, 4.5 μm, 4.6 μm, 4.7 μm, 4.8 μm, 4.9 μm, 또는 5.0 μm 이하 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 조성물은 유핵 세포의 모집단 내에 복수의 유핵 세포(예를 들어 복수의 PBMC)를 포함한다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은, 유핵 세포의 모집단 집단 내에서 가장 작은 직경을 갖는 유핵 세포의 아집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 유핵 세포의 모집단 내에서 가장 작은 직경을 갖는 유핵 세포의 아집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 45%, 약 50% 내지 약 99%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 80%, 또는 약 60% 내지 약 70% 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 유핵 세포의 모집단 내에서 가장 작은 직경을 갖는 유핵 세포의 아집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 99% 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 유핵 세포의 모집단 내에서 가장 작은 직경을 갖는 유핵 세포의 아집단의 평균 직경의 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 복수의 투입 PBMC 내에서 가장 작은 평균 직경을 갖는 유핵 세포의 아집단은 림프구 모집단이며, 림프구 모집단의 직경은 약 6 μm 내지 약 10 μm이다. 일부 구현예에서, 림프구 모집단의 평균 직경은 약 7 μm이다. 일부 구현예에서, 림프구 모집단은 T 세포의 모집단이다. 일부 구현예에서, 림프구는 T 세포이다. 일부 구현예에서, 복수의 투입 PBMC 내에서 가장 작은 평균 직경을 갖는 유핵 세포의 아집단은 T 세포이다.
본 발명의 일부 구현예에서, 조성물은 유핵 세포의 모집단 내에 복수의 유핵 세포(예를 들어 복수의 PBMC)를 포함한다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은, 유핵 세포의 모집단 집단 내에서 가장 큰 직경을 갖는 유핵 세포의 아집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 유핵 세포의 모집단 내에서 가장 큰 직경을 갖는 유핵 세포의 아집단의 평균 직경의 약 10% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 45%, 약 15% 내지 약 30%, 약 15% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 25%, 약 25% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 70%, 또는 약 30% 내지 약 60% 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 유핵 세포의 모집단 내에서 가장 큰 직경을 갖는 유핵 세포의 아집단의 평균 직경의 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 99% 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 협착부의 폭은 유핵 세포의 모집단 내에서 가장 큰 직경을 갖는 유핵 세포의 아집단의 평균 직경의 약 5%, 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 복수의 투입 PBMC 내에서 가장 큰 평균 직경을 갖는 유핵 세포의 아집단은 단액구 모집단이며, 단핵구 모집단의 직경은 약 15 μm 내지 약 25 μm이다. 일부 구현예에서, 단핵구 모집단의 평균 직경은 약 18 μm이다. 일부 구현예에서, 복수의 투입 PBMC 내에서 가장 큰 평균 직경을 갖는 유핵 세포의 아집단은 단핵구이다.
면역 반응을 자극하기 위해 본원에 기술된 방법에 의해 화합물을 유핵 세포에게 전달하는 데에는 다수의 파라미터가 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 현탁액은 협착부를 통과하기 전, 통과할 때, 또는 통과한 후에 화합물과 접촉된다. 유핵 세포는 전달할 화합물을 포함하는 용액에 현탁된 협착부를 통과할 수 있다(비록 유핵 세포는 협착부를 통과한 후에는 세포 현탁액에 첨가될 수 있지만). 일부 구현예에서, 전달 대상 화합물은 협착부 상에 코팅된다.
유핵 세포 내로 화합물을 전달하는 데 영향을 미칠 수 있는 파라미터의 예는 다음을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다: 협착부의 치수, 협착부의 진입 각도, 협착부의 표면 특성(예: 거칠기, 화학적 변형, 친수성, 소수성 등), 동작 유속(예: 세포의 협착부 체류 시간), 세포 농도, 세포 현탁액 중 화합물의 농도, 세포 현탁액 중 완충액, 및 협착부를 통과한 후 유핵 세포가 회복하거나 인큐베이션하는 시간(전달된 화합물이 유핵 세포 내로 통과하는 데 영향을 미칠 수 있음). 유화 세포 내로 화합물을 전달하는 데 영향을 미치는 추가 파라미터는 다음을 포함할 수 있다: 협착부 내에서 유핵 세포의 속도, 협착부에서의 전단 속도, 세포 현탁액의 점도, 유속에 수직하는 속도 성분, 및 협착부 체류 시간. 또한, 채널들을 직렬 및/또는 병렬로 포함하는 다수의 칩이 유핵 세포로의 전달에 영향을 미칠 수 있다. 병렬인 다수의 칩은 처리량을 향상시키는 데 유용할 수 있다. 이러한 파라미터는 화합물의 전달을 조절하도록 설계될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 농도는 약 10 내지 적어도 약 1012 세포/mL의 범위이거나, 이들 사이의 임의의 농도 또는 농도 범위이다. 일부 구현예에서, 전달 화합물의 농도는 약 10 ng/mL 내지 약 1 g/mL의 범위이거나, 이들 사이의 임의의 농도 또는 농도 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 전달 화합물의 농도는 약 1 pM 내지 적어도 약 2 M의 범위이거나, 이들 사이의 임의의 농도 또는 농도 범위일 수 있다.
일부 구현예에서, 유핵 세포와 함께 인큐베이션되는 단백질 또는 이의 단편의 농도는 약 0.01 μM 내지 약 10 mM이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 유핵 세포와 함께 배양된 인큐베이션되는 단백질 또는 이의 단편의 농도는 약 0.01 μM, 약 0.1 μM, 약 1 μM, 약 10 μM, 약 100 μM, 약 1 mM, 또는 약 10 mM 미만 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포와 함께 인큐베이션되는 단백질 또는 이의 단편의 농도는 약 10 mM 초과이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포와 함께 인큐베이션되는 단백질 또는 이의 단편의 농도는 약 0.01 μM 내지 약 0.1 μM, 약 0.1 μM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 10 μM 내지 약 100 μM, 약 100 μM 내지 약 1 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 10 mM 중 어느 하나이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포와 함께 인큐베이션되는 단백질 또는 이의 단편의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 1 mM이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포와 함께 인큐베이션되는 단백질 또는 이의 단편의 농도는 약 0.1 μM 내지 약 10 mM이다. 일부 구현예에서, 유핵 세포와 함께 인큐베이션되는 단백질 또는 이의 단편의 농도는 1 μM 미만이다.
일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 약 1 nM 내지 약 1 mM의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 약 0.1 nM, 약 1 nM, 약 0.01 μM, 약 0.1 μM, 약 1 μM, 약 10 μM, 약 100 μM, 약 1 mM, 또는 약 10 mM 미만 중 어느 하나의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 약 10 mM 초과의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 약 0.1 nM 내지 약 1 nM, 약 1 nM 내지 약 10 nM, 10 nM 내지 약 100 nM, 0.1 μM 내지 약 1 μM, 약 1 μM 내지 약 10 μM, 약 10 μM 내지 약 100 μM, 약 100 μM 내지 약 1 mM, 또는 약 1 mM 내지 약 10 mM 중 어느 하나의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 약 10 nM 내지 약 100 nM의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산을 약 1 nM 내지 약 10 nM의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 약 50 nM의 농도로 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 mRNA이다.
유핵 세포의 컨디셔닝
본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포(예: PBMC)가 컨디셔닝된다. 추가의 구현예에서, 유핵 세포는 성숙된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 협착 매개 전달 후에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는, 협착-전달된 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 세포가 컨디셔닝되기에 충분한 시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션되어, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨디셔닝된 세포의 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 협착-매개 전달 후에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 협착-전달된 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는, 협착-전달된 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포가 컨디셔닝되기에 충분한 시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션되어, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨디셔닝된 유핵 세포의 조성물을 생성한다. 일부 양태에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨디셔닝된 유핵 세포의 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다: a) 세포 현탁액을 세포-변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 유핵 세포의 섭동을 유발하여, 섭동된 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 폭은 현탁액 중 유핵 세포의 함수인 단계; b) 단백질 또는 이의 단편이 섭동된 유핵 세포에 진입하기에 충분한 시간 동안, 섭동된 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 변형된 유핵 세포를 생성하는 단계; 및 c) 협착-전달된 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 변형된 유핵 세포가 컨디셔닝되기에 충분한 시간 동안, 협착-전달된 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 변형된 유핵 세포를 보조제와 함께 인큐베이션하여 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨디셔닝된 유핵 세포의 조성물을 생성하는 단계. 일부 양태에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨디셔닝된 유핵 세포의 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다: a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포-변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여, 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포의 직경의 함수인 단계; 및 b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하여 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계; 및 c) 협착-전달된 mRNA를 포함하는 변형된 유핵 세포가 컨디셔닝되기에 충분한 시간 동안, 협착-전달된 mRNA를 포함하는 변형된 유핵 세포를 보조제와 함께 인큐베이션하고, mRNA가 발현되어 단백질 또는 이의 단편을 생산하고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨디셔닝된 유핵 세포 조성물이 생성되는 단계. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 보조제와 함께 인큐베이션하여 변형된 유핵 세포를 컨디셔닝하기 전에, 세포 현탁액으로부터 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 변형된 유핵 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 유핵 세포(예: PBMC)는 협착-매개 전달 이전에 컨디셔닝된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포가 컨디셔닝되기에 충분한 시간 동안 유핵 세포를 보조제와 함께 인큐베이션하여 유핵 세포를 컨디셔닝한다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨디셔닝된 유핵 세포의 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다: a) 유핵 세포가 컨디셔닝되기에 충분한 시간 동안, 유핵 세포를 보조제와 함께 인큐베이션하여 컨디셔닝된 유핵 세포를 생성하는 단계; b) 컨디셔닝된 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 유핵 세포의 섭동을 유발하여, 컨디셔닝된 섭동된 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 폭은 현탁액 중 유핵 세포의 직경의 함수인 단계; 및 c) 단백질 또는 이의 단편이 컨디셔닝된 섭동된 유핵 세포에 진입하기에 충분한 시간 동안, 컨디셔닝된 섭동된 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨디셔닝된 유핵 세포를 생성하는 단계. 일부 양태에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨디셔닝된 유핵 세포의 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다: a) 유핵 세포가 컨디셔닝되기에 충분한 시간 동안, 유핵 세포를 보조제와 함께 인큐베이션하여 컨디셔닝된 유핵 세포를 생성하는 단계; b) 컨디셔닝된 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액을 세포-변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 유핵 세포의 섭동을 유발하여, 컨디셔닝된 섭동된 유핵 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 폭은 현탁액 중 유핵 세포의 직경의 함수인 단계; 및 c) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 컨디셔닝된 섭동된 유핵 세포에 진입하기에 충분한 시간 동안, 컨디셔닝된 섭동된 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하고, mRNA가 발현되어 단백질 또는 이의 단편을 생산하고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨디셔닝된 유핵 세포가 생성되는 단계. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 컨디셔닝된 유핵 세포를 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 보조제로부터 컨디셔닝된 유핵 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 기술된 방법 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포(예: PBMC)는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 보조제와 함께 약 1 내지 약 24시간 동안 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 2 내지 약 10시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 3 내지 약 6시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간, 2시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간, 또는 24시간 중 어느 하나 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 유핵 세포는 유핵 세포가 컨디셔닝되도록 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨디셔닝된 복수의 PBMC가 제공되며, 이는 PBMC가 컨디셔닝되기에 충분한 시간 동안 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 복수의 PBMC를 보조제와 함께 인큐베이션하여 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨디셔닝된 복수의 PBMC를 생성함으로써 제조된다. 일부 구현예에서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨디셔닝된 복수의 PBMC가 제공되며, 이는 PBMC가 컨디셔닝되기에 충분한 시간 동안 복수의 PBMC를 보조제와 함께 인큐베이션한 후, 단백질 또는 이의 단편을 PBMC에 도입하여 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 컨디셔닝된 복수의 PBMC를 생성함으로써 제조된다.
본원에 기술된 조절된 복수의 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 PBMC가 컨디셔닝되도록 약 1 내지 약 24시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 PBMC가 컨디셔닝되도록 약 2 내지 약 10시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 PBMC가 컨디셔닝되도록 약 3 내지 약 6시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 PBMC가 컨디셔닝되도록 약 1시간, 2시간, 3시간, 3.5시간, 4시간, 4.5시간, 5시간, 5.5시간, 6시간, 8시간, 12시간, 16시간, 20시간, 또는 24시간 중 어느 하나 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 복수의 PBMC는 PBMC가 컨디셔닝되도록 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션된다.
본원에 기술된 조절된 복수의 PBMC 중 어느 하나에 따른 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 분자는 컨디셔닝되지 않은 복수의 변형된 PBMC와 비교해, 컨디셔닝된 복수의 변형된 PBMC에서 상향조절된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 분자는 컨디셔닝되지 않은 복수의 변형된 PBMC 내 세포 아집단과 비교해, 컨디셔닝된 복수의 변형된 PBMC 내 세포 아집단에서 상향조절된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 공자극 분자는 컨디셔닝되지 않은 복수의 변형된 PBMC 내 B 세포와 비교해, 컨디셔닝된 복수의 변형된 PBMC 내 B 세포에서 상향조절된다. 일부 구현예에서, 공자극 분자는 CD80 및/또는 CD86이다. 일부 구현예에서, 공자극 분자는 CD86이다. 일부 구현예에서, CD80 및/또는 CD86은 컨디셔닝되지 않은 복수의 변형된 PBMC 내 B와 비교해, 컨디셔닝된 복수의 변형된 PBMC 내 B 세포에서 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배, 또는 10배 초과만큼 상향조절된다. 일부 구현예에서, CD80 및/또는 CD86은 컨디셔닝되지 않은 복수의 변형된 PBMC 내 B와 비교해, 컨디셔닝된 복수의 변형된 PBMC 내 B 세포에서 약 1.2배 내지 약 1.5배, 약 1.5배 내지 약 1.8배, 약 1.8배 내지 약 2배, 약 2배 내지 약 3배, 약 3배 내지 약 4배, 약 4배 내지 약 5배, 약 5배 내지 약 8배, 약 8배 내지 약 10배, 약 10배 내지 약 20배, 약 20배 내지 약 50배, 약 50배 내지 약 100배, 약 100배 내지 약 200배, 약 200배 내지 약 500배, 또는 약 500배 초과 중 어느 하나만큼 상향조절된다. 일부 구현예에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현은 컨디셔닝되지 않은 복수의 변형된 PBMC와 비교해 컨디셔닝된 복수의 변형된 PBMC에서 증가된다. 일부 구현예에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현은 컨디셔닝되지 않은 복수의 변형된 PBMC 내 세포 아집단와 비교해 컨디셔닝된 복수의 변형된 PBMC 내 세포 아집단에서 증가된다. 일부 구현예에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현은 컨디셔닝되지 않은 복수의 변형된 PBMC와 비교해 컨디셔닝된 복수의 변형된 PBMC에서 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배, 또는 10배 초과만큼 증가된다. 일부 구현예에서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현은 컨디셔닝되지 않은 복수의 변형된 PBMC와 비교해 컨디셔닝된 복수의 변형된 PBMC에서 약 1.2배 내지 약 1.5배, 약 1.5배 내지 약 1.8배, 약 1.8배 내지 약 2배, 약 2배 내지 약 3배, 약 3배 내지 약 4배, 약 4배 내지 약 5배, 약 5배 내지 약 8배, 약 8배 내지 약 10배, 약 10배 내지 약 20배, 약 20배 내지 약 50배, 약 50배 내지 약 100배, 약 100배 내지 약 200배, 약 200배 내지 약 500배, 또는 약 500배 초과 중 어느 하나만큼 증가된다.
시스템 및 키트
일부 양태에서, 본 발명은 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 협착부, 면역 세포 현탁액, 단백질 또는 이의 단편, 또는 보조제 중 하나 이상을 포함하는 시스템을 제공한다. 시스템은 다음을 포함하여, 위에 개시된 방법에 대해 기술된 임의의 구현예를 포함할 수 있다: 세포 변형 협착부을 제공하기 위한 공극을 갖는 미세유체 채널 또는 표면; 세포 현탁액; 세포 섭동; 전달 파라미터; 화합물; 및/또는 응용예 등. 일부 구현예에서, 세포 변형 협착부는 면역 세포를 전달하기에 적합한 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 동작 유속, 세포 및 화합물 농도, 협착부 내 세포의 속도, 및 세포 현탁액의 조성(예를 들어 오스몰 농도, 염 농도, 혈청 함량, 세포 농도, pH 등)과 같은 전달 파라미터는 면역 반응을 억제하거나 내성을 유도하기 위해 화합물의 최대 반응에 맞게 최적화된다.
또한, 암 또는 감염증을 가진 개체의 치료에 사용하기 위한 키트 또는 제조 물품이 제공된다. 일부 구현예에서, 키트는 단백질 또는 이의 단편 및 보조제를 세포내 포함하는 변형된 면역 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 암 또는 감염증을 가진 개체의 치료에 사용하기 위한 변형된 면역 세포를 생성하는 데 사용하기 위한 협착부, 면역 세포 현탁액, 단백질 또는 이의 단편, 또는 보조제 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 기술된 조성물(예: 공극을 포함하는 미세유체 채널 또는 채널, 세포 현탁액 및/또는 화합물)을 적절한 포장으로 포함한다. 적절한 포장 물질은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 바이알(예컨대 밀봉된 바이알), 용기, 앰플, 병, 항아리, 가요성 포장(예컨대 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함한다. 이들 제조 물품은 추가로 멸균 및/또는 밀봉될 수 있다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 방법의 구성요소를 포함하는 키트를 제공하며, 상기 키트는 치료를 필요로 하는 개체를 치료하기 위한 상기 방법을 수행하기 위한 지침 및/또는 단백질 또는 이의 단편 및 보조제를 면역 세포 내로 도입하기 위한 지침을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기술된 키트는 다음을 포함하여 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다: 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 본원에 기술된 임의의 방법을 수행하기 위한 지침(예를 들어 치료를 필요로 하는 개체를 치료하기 위한 지침; 또는 면역 세포가 단백질 또는 이의 단편을 세포내 함유하고 보조제를 세포내 함유하도록 변형하기 위한 지침)이 담긴 패키지 삽입물.
예시적인 구현예
구현예 1.
개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법으로서, 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는, 방법.
구현예 2.
백신 접종를 필요로 하는 개체에게 백신을 접종하기 위한 방법으로서, 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는, 방법.
구현예 3.
구현예 1 또는 2에 있어서, 단백질 또는 이의 단편은 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프를 추가로 포함하여, 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프로 이루어진 융합 단백질을 생성하는, 방법.
구현예 4.
개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법으로서, 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는, 방법.
구현예 5.
백신 접종를 필요로 하는 개체에게 백신을 접종하기 위한 방법으로서, 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는, 방법.
구현예 6.
구현예 4 또는 5에 있어서, mRNA의 뉴클레오티드 서열은 유핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는, 방법.
구현예 7.
구현예 4 내지 6 중 어느 하나에 있어서, mRNA는 면역프로테아좀-표적화 모티프를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하되, mRNA의 번역은 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프로 이루어진 융합 단백질을 생성하는, 방법.
구현예 8.
구현예 3 또는 6에 있어서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는, 면역프로테아좀-표적화 모티프가 없을 때 세포 내 단백질의 분해 및/또는 세포 표면 상의 단백질로부터 유래된 펩티드의 제시와 비교하여 세포 내 단백질의 분해 및/또는 세포 표면 상의 단백질로부터 유래된 펩티드의 제시를 향상시키는, 방법.
구현예 9.
구현예 8에 있어서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는 융합 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 있는, 방법.
구현예 10.
구현예 7 내지 9에 있어서, 하나 이상의 면역프로테아좀 표적화 모티프는 파괴 박스(D-박스) 도메인, KEKE 도메인, 및/또는 sec/MITD 도메인인, 방법.
구현예 11.
구현예 4 내지 10 중 어느 하나에 있어서, mRNA의 하나 이상의 잔기가 변형되는, 방법.
구현예 12.
구현예 11에 있어서, mRNA의 하나 이상의 잔기는 포스포로티오에이트 잔기, 슈도우리딘 잔기, N1-메틸아데노신 잔기, 5-메틸시티딘 잔기, 또는 모르폴리노 잔기인, 방법.
구현예 13.
개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법으로서, 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 여기서 유핵 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하고; 2개 이상의 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는, 방법.
구현예 14.
개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법으로서, 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 유핵 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하고; 2개 이상의 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는, 방법.
구현예 15.
구현예 13 또는 14에 있어서, 세포는 단백질로부터 유래된 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개를 초과하는 항원을 포함하는, 방법.
구현예 16.
구현예 13 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 항원 중 적어도 2개는 부분적으로 중첩된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
구현예 17.
구현예 16에 있어서, 모든 항원의 아미노산 서열을 합치면 단백질의 아미노산 서열과 약 90% 이상 중첩되는, 방법.
구현예 18.
구현예 13 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 항원은 단백질의 2개 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드인, 방법.
구현예 19.
구현예 13 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 항원은 단백질의 하나 이상의 에피토프 및 하나 이상의 이종 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드인, 방법.
구현예 20.
구현예 13 내지 19 중 어느 하나에 있어서, N-말단 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 에피토프의 측면에는 하나 이상의 이종 펩티드 서열이 위치하는, 방법.
구현예 21.
구현예 20에 있어서, N-말단 및/또는 C-말단에서 측면에 위치하는 폴리펩티드는 면역원성 합성 긴 펩티드(SLP)로부터 유래되는, 방법.
구현예 22.
구현예 21에 있어서, N-말단 및/또는 C-말단에서 측면에 위치하는 폴리펩티드는 질환-연관 면역원성 SLP로부터 유래되는, 방법.
구현예 23.
구현예 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 종양유전자의 산물, 신생항원, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질인, 방법.
구현예 24.
구현예 1, 3, 4, 6 내지 13, 15 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 개체에서 면역 반응을 자극하는 것은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환의 치료에 사용되는, 방법.
구현예 25.
구현예 24에 있어서, 바이러스 연관 질환은 인간 유두종바이러스(HPV), A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 단순 포진 바이러스 1(HSV-1), 단순 포진 바이러스(HSV-2), 수두-대상포진 바이러스(VZV), 6형 인간 헤르페스바이러스(HHV-6), 7형 인간 헤르페스바이러스(HHV-7), 8형 인간 헤르페스바이러스 (HHV-8), 거대세포바이러스(CMV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 엡스타인바 바이러스(EBV), 또는 인플루엔자와 연관된 질환인, 방법.
구현예 26.
구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질인, 방법.
구현예 27.
구현예 26에 있어서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18인, 방법.
구현예 28.
구현예 26 또는 27에 있어서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질인, 방법.
구현예 29.
구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질인, 방법.
구현예 30.
구현예 29에 있어서, HBV 단백질은 코어 단백질, 작은 표면 항원, 중간 표면 항원, 큰 표면 항원, e 항원, X 항원, 또는 중합효소 단백질인, 방법.
구현예 31.
구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 보조제를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 32.
구현예 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 보조제와 함께 투여되는, 방법.
구현예 33.
구현예 31 또는 32에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제인, 방법.
구현예 34.
구현예 1 내지 3 및 23 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편이 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여; 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
구현예 35.
구현예 4 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하여; 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
구현예 36.
구현예 12 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 2개 이상의 항원이 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
구현예 37.
구현예 34 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계.
구현예 38.
구현예 34 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계.
구현예 39.
구현예 34 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인, 방법.
구현예 40.
구현예 34 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.0 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.0 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.0 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인, 방법.
구현예 41.
구현예 34 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm인, 방법.
구현예 42.
구현예 34 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm 또는 약 4.0 μm인, 방법.
구현예 43.
구현예 34 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과하는, 방법.
구현예 44.
구현예 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포는 개체에 대한 자가 세포 또는 동종 세포인, 방법.
구현예 45.
구현예 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포는 면역 세포인, 방법.
구현예 46.
구현예 1 내지 45 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)인, 방법.
구현예 47.
구현예 46에 있어서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 둘 이상을 포함하는, 방법.
구현예 48.
구현예 1 내지 47 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상인, 방법.
구현예 49.
구현예 1 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포는 보조제로 컨디셔닝되어 컨디셔닝된 세포를 형성하는, 방법.
구현예 50.
구현예 49에 있어서, 유핵 세포는 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 10시간, 약 3시간 내지 약 6시간, 또는 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션되는, 방법.
구현예 51.
구현예 49 또는 50에 있어서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 유핵 세포 내로 도입하기 전 또는 후에 컨디셔닝되는, 방법.
구현예 52.
구현예 49 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제인, 방법.
구현예 53.
구현예 48 내지 51 중 어느 하나에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)인, 방법.
구현예 54.
구현예 49 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 보조제는 CpG 7909인, 방법.
구현예 55.
구현예 49 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 컨디셔닝된 세포는 컨디셔닝된 복수의 PBMC인, 방법.
구현예 56.
구현예 55에 있어서, 복수의 PBMC는 공자극 분자 중 하나 이상의 발현을 증가시키도록 변형되는, 방법.
구현예 57.
구현예 56에 있어서, 공자극 분자는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112인, 방법.
구현예 58.
구현예 56에 있어서, 공자극 분자는 CD86인, 방법.
구현예 59.
구현예 55 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시키도록 변형되는, 방법.
구현예 60.
구현예 55 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 복수의 PBMC는 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하도록 변형되는, 방법.
구현예 61.
구현예 60에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인은 사이토카인 및 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질인, 방법.
구현예 62.
구현예 61에 있어서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합되는, 방법.
구현예 63.
구현예 62에 있어서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)인, 방법.
구현예 64.
구현예 59 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 사이토카인은 I형 사이토카인인, 방법.
구현예 65.
구현예 59 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 사이토카인은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN α, IFN β, 또는 IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체인, 방법.
구현예 66.
구현예 65에 있어서, 사이토카인은 IL-2 또는 이의 기능적 변이체 및/또는 IL-12 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
구현예 67.
구현예 60 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인은 서열번호 77~80의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
구현예 68.
구현예 56 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 공자극 분자의 발현을 증가시키도록 변형되는, 방법.
구현예 69.
구현예 68에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 공자극 분자의 증가된 발현을 포함하고, 복수의 PBMC는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하고; mRNA가 발현되고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 포함하는 유핵 세포가 생성되는 단계.
구현예 70.
구현예 68에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 공자극 분자의 증가된 발현을 포함하고, 복수의 PBMC는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하고; mRNA가 발현되고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 포함하는 유핵 세포가 생성되는 단계.
b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하고; mRNA가 발현되고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 포함하는 유핵 세포가 생성되는 단계.
구현예 71.
구현예 68에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 공자극 분자의 증가된 발현을 포함하고, 복수의 PBMC는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 2개 이상의 항원, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 2개 이상의 항원, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 2개 이상의 항원, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하고; mRNA가 발현되고, 이에 의해 2개 이상의 항원, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 포함하는 유핵 세포가 생성되는 단계.
구현예 72.
구현예 69 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 도중에, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 도중에, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 도중에, 및/또는 후에 유핵 세포를 2개 이상의 항원, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계.
구현예 73.
구현예 69 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 도중에, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 유핵 세포를 2개 이상의 항원, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계.
구현예 74.
구현예 55 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공자극 분자는 복수의 컨디셔닝된지 않은 PBMC 내의 B 세포와 비교하여 컨디셔닝된 복수의 PBMC의 B 세포에서 상향 조절되고, 공자극 분자는 CD80 및/또는 CD86인, 방법.
구현예 75.
구현예 55 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 복수의 PBMC는 복수의 컨디셔닝되지 않은 PBMC와 비교하여 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현을 증가시킨, 방법.
구현예 76.
구현예 75에 있어서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현은 상기 복수의 컨디셔닝되지 않은 PBMC와 비교하여 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배, 또는 10배 초과만큼 증가되는, 방법.
구현예 77.
구현예 1 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 복수의 횟수로 투여되는, 방법.
구현예 78.
구현예 1 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 정맥내 투여되는, 방법.
구현예 79.
구현예 1 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 개체는 인간인, 방법.
구현예 80.
구현예 1 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 또 다른 요법의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 투여되는, 방법.
구현예 81.
구현예 80에 있어서, 또 다른 요법은 화학요법, 방사선요법, 항체, 사이토카인, 면역 관문 억제제, 또는 면역 항암 요법에 사용된 이중특이적 폴리펩티드인, 방법.
구현예 82.
유핵 세포를 포함하는 조성물로서, 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 포함하는, 조성물.
구현예 83.
구현예 82에 있어서, 단백질 또는 이의 단편은 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프를 추가로 포함하여, 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프로 이루어진 융합 단백질을 생성하는, 조성물.
구현예 84.
유핵 세포를 포함하는 조성물로서, 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는, 조성물.
구현예 85.
구현예 84에 있어서, mRNA의 뉴클레오티드 서열은 유핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는, 조성물.
구현예 86.
구현예 84 또는 85에 있어서, mRNA는 면역프로테아좀-표적화 모티프를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하되, mRNA의 번역은 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프로 이루어진 융합 단백질을 생성하는, 조성물.
구현예 87.
구현예 83 또는 86에 있어서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는, 면역프로테아좀-표적화 모티프가 없을 때 세포 내 단백질의 분해 및/또는 세포 표면 상의 단백질로부터 유래된 펩티드의 제시와 비교하여 세포 내 단백질의 분해 및/또는 세포 표면 상의 단백질로부터 유래된 펩티드의 제시를 향상시키는, 조성물.
구현예 88.
구현예 87에 있어서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는 융합 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 있는, 조성물.
구현예 89.
구현예 86 내지 88에 있어서, 하나 이상의 면역프로테아좀 표적화 모티프는 파괴 박스(D-박스) 도메인, KEKE 도메인, 및/또는 sec/MITD 도메인인, 조성물.
구현예 90.
구현예 84 내지 89 중 어느 하나에 있어서, mRNA의 하나 이상의 잔기가 변형되는, 조성물.
구현예 91.
구현예 90에 있어서, mRNA의 하나 이상의 잔기는 포스포로티오에이트 잔기, 슈도우리딘 잔기, N1-메틸아데노신 잔기, 5-메틸시티딘 잔기, 또는 모르폴리노 잔기인, 조성물.
구현예 92.
유핵 세포를 포함하는 조성물로서, 유핵 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하고, 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는, 조성물.
구현예 93.
구현예 92에 있어서, 세포는 단백질로부터 유래된 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개를 초과하는 항원을 포함하는, 조성물.
구현예 94.
구현예 92 또는 93에 있어서, 항원 중 적어도 2개는 부분적으로 중첩된 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
구현예 95.
구현예 94에 있어서, 모든 항원의 아미노산 서열을 합치면 단백질의 아미노산 서열과 약 90% 이상 중첩되는, 조성물.
구현예 96.
구현예 92 내지 95 중 어느 하나에 있어서, 항원은 단백질의 2개 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드인, 조성물.
구현예 97.
구현예 92 내지 96 중 어느 하나에 있어서, 항원은 단백질의 하나 이상의 에피토프 및 하나 이상의 이종 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드인, 조성물.
구현예 98.
구현예 92 내지 97 중 어느 하나에 있어서, N-말단 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 에피토프의 측면에는 하나 이상의 이종 펩티드 서열이 위치하는, 조성물.
구현예 99.
구현예 98에 있어서, N-말단 및/또는 C-말단에서 측면에 위치하는 폴리펩티드는 면역원성 합성 긴 펩티드(SLP)로부터 유래되는, 조성물.
구현예 100.
구현예 99에 있어서, N-말단 및/또는 C-말단에서 측면에 위치하는 폴리펩티드는 질환-연관 면역원성 SLP로부터 유래되는, 조성물.
구현예 101.
구현예 82 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 종양유전자의 산물, 신생항원, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질인, 조성물.
구현예 102.
구현예 82 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 개체에서 면역 반응을 자극하는 것은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환의 치료에 사용되는, 조성물.
구현예 103.
구현예 102에 있어서, 바이러스 연관 질환은 인간 유두종바이러스(HPV), A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 단순 포진 바이러스 1(HSV-1), 단순 포진 바이러스(HSV-2), 수두-대상포진 바이러스(VZV), 6형 인간 헤르페스바이러스(HHV-6), 7형 인간 헤르페스바이러스(HHV-7), 8형 인간 헤르페스바이러스 (HHV-8), 거대세포바이러스(CMV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 엡스타인바 바이러스(EBV), 또는 인플루엔자와 연관된 질환인, 조성물.
구현예 104.
구현예 82 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질인, 조성물.
구현예 105.
구현예 104에 있어서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18인, 조성물.
구현예 106.
구현예 104 또는 105에 있어서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질인, 조성물.
구현예 107.
구현예 82 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질인, 조성물.
구현예 108.
구현예 107에 있어서, HBV 단백질은 코어 단백질, 작은 표면 항원, 중간 표면 항원, 큰 표면 항원, e 항원, X 항원, 또는 중합효소 단백질인, 조성물.
구현예 109.
구현예 82 내지 108 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 보조제를 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 110.
구현예 109에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제인, 조성물.
구현예 111.
구현예 82 및 101 내지 110 중 어느 하나에 있어서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 조성물:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편이 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여; 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
구현예 112.
구현예 84 내지 91 및 101 내지 110 중 어느 하나에 있어서, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 조성물:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하여; 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
구현예 113.
구현예 92 내지 110 중 어느 하나에 있어서, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 조성물:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 2개 이상의 항원이 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
구현예 114.
구현예 111 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함하는, 조성물:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계.
구현예 115.
구현예 111 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함하는, 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계.
구현예 116.
구현예 111 내지 115 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인, 조성물.
구현예 117.
구현예 111 내지 116 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.0 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.0 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.0 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인, 조성물.
구현예 118.
구현예 111 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm인, 조성물.
구현예 119.
구현예 111 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm 또는 약 4.0 μm인, 조성물.
구현예 120.
구현예 111 내지 119 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과하는, 조성물.
구현예 121.
구현예 82 내지 120 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포는 개체에 대한 자가 세포 또는 동종 세포인, 조성물.
구현예 122.
구현예 82 내지 121 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포는 면역 세포인, 조성물.
구현예 123.
구현예 82 내지 122 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)인, 조성물.
구현예 124.
구현예 123에 있어서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 둘 이상을 포함하는, 조성물.
구현예 125.
구현예 82 내지 124 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상인, 조성물.
구현예 126.
구현예 82 내지 125에 있어서, 유핵 세포는 보조제로 컨디셔닝되어 컨디셔닝된 세포를 형성하는, 조성물.
구현예 127.
구현예 126에 있어서, 유핵 세포는 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 10시간, 약 3시간 내지 약 6시간, 또는 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션되는, 조성물.
구현예 128.
구현예 126 또는 127에 있어서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 유핵 세포 내로 도입하기 전 또는 후에 컨디셔닝되는, 조성물.
구현예 129.
구현예 126 내지 128 중 어느 하나에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제인, 조성물.
구현예 130.
구현예 126 내지 129 중 어느 하나에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)인, 조성물.
구현예 131.
구현예 126 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 보조제는 CpG 7909인, 조성물.
구현예 132.
구현예 126 내지 131 중 어느 하나에 있어서, 컨디셔닝된 세포는 컨디셔닝된 복수의 PBMC인, 조성물.
구현예 133.
구현예 132에 있어서, 복수의 PBMC는 공자극 분자 중 하나 이상의 발현을 증가시키도록 변형되는, 조성물.
구현예 134.
구현예 133에 있어서, 공자극 분자는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112인, 조성물.
구현예 135.
구현예 134에 있어서, 공자극 분자는 CD86인, 조성물.
구현예 136.
구현예 132 내지 135 중 어느 하나에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시키도록 변형되는, 조성물.
구현예 137.
구현예 132 내지 136 중 어느 하나에 있어서, 복수의 PBMC는 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하도록 변형되는, 조성물.
구현예 138.
구현예 137에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인은 사이토카인 및 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질인, 조성물.
구현예 139.
구현예 138에 있어서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합되는, 조성물.
구현예 140.
구현예 139에 있어서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)인, 조성물.
구현예 141.
구현예 136 내지 140 중 어느 하나에 있어서, 사이토카인은 I형 사이토카인인, 조성물.
구현예 142.
구현예 136 내지 141 중 어느 하나에 있어서, 사이토카인은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN α, IFN β, 또는 IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체인, 조성물.
구현예 143.
구현예 142에 있어서, 사이토카인은 IL-2 또는 이의 기능적 변이체 및/또는 IL-12 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
구현예 144.
구현예 137 내지 143 중 어느 하나에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인은 서열번호 77~80의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
구현예 145.
구현예 133 내지 144 중 어느 하나에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 공자극 분자의 발현을 증가시키도록 변형되는, 조성물.
구현예 146.
구현예 145에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 공자극 분자의 증가된 발현을 포함하고, 복수의 PBMC는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하고; mRNA가 발현되고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 포함하는 유핵 세포가 생성되는 단계.
구현예 147.
구현예 145에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 공자극 분자의 증가된 발현을 포함하고, 복수의 PBMC는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하고; mRNA가 발현되고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 포b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하고; mRNA가 발현되고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 포함하는 유핵 세포가 생성되는 단계.
구현예 148.
구현예 145에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 공자극 분자의 증가된 발현을 포함하고, 복수의 PBMC는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 2개 이상의 항원, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 2개 이상의 항원, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 2개 이상의 항원, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하고; mRNA가 발현되고, 이에 의해 2개 이상의 항원, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 포함하는 유핵 세포가 생성되는 단계.
구현예 149.
구현예 146 내지 148 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함하는, 조성물:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 도중에, 및/또는 후에 복수의 PBMC를 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 도중에, 및/또는 후에 복수의 PBMC를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 도중에, 및/또는 후에 복수의 PBMC를 2개 이상의 항원, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계.
구현예 150.
구현예 146 내지 148 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함하는, 조성물:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 복수의 PBMC를 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 도중에, 및/또는 후에 복수의 PBMC를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 복수의 PBMC를 2개 이상의 항원, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계.
구현예 151.
구현예 132 내지 150 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 공자극 분자는 복수의 컨디셔닝된지 않은 PBMC 내의 B 세포와 비교하여 컨디셔닝된 복수의 PBMC의 B 세포에서 상향 조절되고, 공동 자극 분자는 CD80 및/또는 CD86인, 조성물.
구현예 152.
구현예 132 내지 151 중 어느 하나에 있어서, 복수의 PBMC는 복수의 컨디셔닝되지 않은 PBMC와 비교하여 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현을 증가시킨, 조성물.
구현예 153.
구현예 152에 있어서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현은 상기 복수의 컨디셔닝되지 않은 PBMC와 비교하여 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배, 또는 10배 초과만큼 증가되는, 조성물.
구현예 154.
개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 구현예 82 내지 153 중 어느 하나의 조성물의 유효량을 포함하고; 조성물은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는, 조성물.
구현예 155.
의약으로서 사용하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 구현예 82 내지 153 중 어느 하나의 조성물의 유효량을 포함하는, 조성물.
구현예 156.
개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 구현예 82 내지 153 중 어느 하나의 조성물의 유효량을 포함하는, 조성물.
구현예 157.
구현예 154 내지 156 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 보조제를 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 158.
구현예 154 내지 157 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 보조제와 함께 투여되는, 조성물.
구현예 159.
구현예 157 또는 158에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 알파-갈락토실 세라미드, STING 작용제, 환형 디뉴클레오티드(CDN), RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제인, 조성물.
구현예 160.
구현예 157 내지 159 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 복수의 횟수로 투여되는, 조성물.
구현예 161.
구현예 157 내지 160 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 정맥내 투여되는, 조성물.
구현예 162.
구현예 157 내지 161 중 어느 하나에 있어서, 개체는 인간인, 조성물.
구현예 163.
구현예 157 내지 162 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 또 다른 요법의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 투여되는, 조성물.
구현예 164.
구현예 163에 있어서, 또 다른 요법은 화학요법, 방사선요법, 항체, 사이토카인, 면역 관문 억제제, 또는 면역 항암 요법에 사용된 이중특이적 폴리펩티드인, 조성물.
구현예 165.
개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 의약의 제조에 있어서 조성물의 용도로서, 상기 조성물은 구현예 82 내지 153 중 어느 하나의 조성물의 유효량을 포함하고; 조성물은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는, 용도.
구현예 166.
개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 조성물의 용도로서, 상기 조성물은 구현예 82 내지 153 중 어느 하나의 조성물의 유효량을 포함하는, 용도.
구현예 167.
구현예 165 또는 166에 있어서, 조성물은 보조제를 추가로 포함하는, 용도.
구현예 168.
구현예 165 내지 167 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 보조제와 함께 투여되도록 제형화되는, 조성물.
구현예 169.
구현예 167 또는 168에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 알파-갈락토실 세라미드, STING 작용제, 환형 디뉴클레오티드(CDN), RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제인, 용도.
구현예 170.
구현예 167 내지 169 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 복수의 횟수로 투여되는, 용도.
구현예 171.
구현예 167 내지 170 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 정맥내 투여되는, 용도.
구현예 172.
구현예 167 내지 171 중 어느 하나에 있어서, 개체는 인간인, 용도.
구현예 173.
구현예 167 내지 172 중 어느 하나에 있어서, 조성물은 또 다른 요법의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 투여되는, 용도.
구현예 174.
구현예 173에 있어서, 또 다른 요법은 화학요법, 방사선요법, 항체, 사이토카인, 면역 관문 억제제, 또는 면역 항암 요법에 사용된 이중특이적 폴리펩티드인, 용도.
구현예 175.
구현예 1 내지 81 중 어느 하나의 방법에 사용하기 위한 키트.
구현예 176.
구현예 82 내지 153 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 키트.
구현예 177.
구현예 175 또는 176에 있어서, 키트는 완충제; 희석제; 필터; 바늘; 주사기; 또는 조성물을 개체에게 투여하여 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하기 위한 지침이 담긴 패키지 삽입물 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 키트.
구현예 178.
단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 유핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 179.
단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 유핵 세포 내로 도입하고, mRNA가 발현되어 단백질 또는 이의 단편이 생성되는, 단계를 포함하는, 방법.
구현예 180.
단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 2개 이상의 항원을 유핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는, 방법.
구현예 181.
구현예 178에 있어서, 단백질 또는 이의 단편을 유핵 세포에게 세포내 도입하는 단계는 다음을 포함하는, 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편이 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여; 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
구현예 182.
구현예 179에 있어서, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하여; 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
구현예 183.
구현예 180에 있어서, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 2개 이상의 항원이 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계.
구현예 184.
구현예 181 내지 183 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계.
구현예 185.
구현예 181 내지 183 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계.
구현예 186.
구현예 181 내지 185 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인, 방법.
구현예 187.
구현예 181 내지 186 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인, 방법.
구현예 188.
구현예 181 내지 187 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm인, 방법.
구현예 189.
구현예 181 내지 188 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm인, 방법.
구현예 190.
구현예 181 내지 189 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과하는, 방법.
구현예 191.
구현예 178 내지 190 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 유핵 세포는 보조제로 컨디셔닝하여 컨디셔닝된 세포를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
구현예 192.
구현예 191에 있어서, 유핵 세포는 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 10시간, 약 3시간 내지 약 6시간, 또는 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션되는, 방법.
구현예 193.
구현예 191 또는 192에 있어서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 또는 단백질 유래의 2개 이상의 항원을 유핵 세포 내로 도입하기 전 또는 후에 컨디셔닝되는, 방법.
구현예 194.
면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 면역 세포에서 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 195.
구현예 193에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인은 막관통 도메인 및 사이토카인을 포함하는 융합 단백질인, 방법.
구현예 196.
구현예 194 또는 195에 있어서, 막관통 도메인은 트랜스페린 수용체 단백질 1(TFRC) 또는 종양 괴사 인자 막관통 도메인인, 방법.
구현예 197.
구현예 194 내지 196 중 어느 하나에 있어서, 사이토카인은 I형 사이토카인인, 방법.
구현예 198.
구현예 194 내지 197 중 어느 하나에 있어서, 사이토카인은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN α, IFN β, 또는 IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체인, 방법.
구현예 199.
구현예 194 내지 198 중 어느 하나에 있어서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합되는, 방법.
구현예 200.
구현예 199에 있어서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)인, 방법.
구현예 201.
구현예 194 내지 200 중 어느 하나에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인은 서열번호 77~80의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
구현예 202.
구현예 194 내지 201 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 항원을 추가로 포함하는, 방법.
구현예 203.
구현예 194 내지 201 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 항원을 암호화하는 mRNA를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 204.
구현예 202 또는 203에 있어서, 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편인, 방법.
구현예 205.
구현예 194 내지 201 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 추가로 포함하는, 방법.
구현예 206.
구현예 205에 있어서, 2개 이상의 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는, 방법.
구현예 207.
구현예 204 내지 206 중 어느 하나에 있어서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 종양유전자의 산물, 신생항원, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질인, 방법.
구현예 208.
구현예 204 내지 207 중 어느 하나에 있어서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질인, 방법.
구현예 209.
구현예 208에 있어서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18인, 방법.
구현예 210.
구현예 208 또는 209에 있어서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질인, 방법.
구현예 211.
구현예 204 내지 207 중 어느 하나에 있어서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질인, 방법.
구현예 212.
구현예 211에 있어서, HBV 단백질은 코어 단백질, 작은 표면 항원, 중간 표면 항원, 큰 표면 항원, e 항원, X 항원, 또는 중합효소 단백질인, 방법.
구현예 213.
구현예 194 내지 212 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)인, 방법.
구현예 214.
구현예 213에 있어서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 둘 이상을 포함하는, 방법.
구현예 215.
구현예 194 내지 214 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상인, 방법.
구현예 216.
구현예 194 내지 215 중 어느 하나에 있어서, 유핵 세포는 보조제로 컨디셔닝되어 컨디셔닝된 세포를 형성하는, 방법.
구현예 217.
구현예 216에 있어서, 유핵 세포는 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 10시간, 약 3시간 내지 약 6시간, 또는 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션되는, 방법.
구현예 218.
구현예 216 또는 217에 있어서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 유핵 세포 내로 도입하기 전 또는 후에 컨디셔닝되는, 방법.
구현예 219.
구현예 216 내지 218 중 어느 하나에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제인, 방법.
구현예 220.
구현예 216 내지 219 중 어느 하나에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)인, 방법.
구현예 221.
구현예 194 내지 220 중 어느 하나에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계.
구현예 222.
구현예 221에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA인, 방법.
구현예 223.
구현예 202, 204, 및 207 내지 222 중 어느 하나에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산 및 항원을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계.
구현예 224.
구현예 203, 204, 및 207 내지 222에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계.
구현예 225.
구현예 223 또는 224에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및/또는 항원을 암호화하는 핵산은 mRNA인, 방법.
구현예 226.
구현예 202, 204, 및 207 내지 222 중 어느 하나에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 ?첫溶核觀壙? 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계.
구현예 227.
구현예 221 내지 226 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하는 단계;
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(d) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계.
구현예 228.
구현예 221 내지 226 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하는 단계;
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(d) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계.
구현예 229.
구현예 221 내지 228 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인, 방법.
구현예 230.
구현예 221 내지 229 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인, 방법.
구현예 231.
구현예 221 내지 230 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm인, 방법.
구현예 232.
구현예 221 내지 231 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm인, 방법.
구현예 233.
구현예 221 내지 232 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과하는, 방법.
구현예 234.
면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 키메라 막-결합 사이토카인을 면역 세포에 포함하는, 조성물.
구현예 235.
구현예 234에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인은 막관통 도메인 및 사이토카인을 포함하는 융합 단백질인, 조성물.
구현예 236.
구현예 234 내지 235 중 어느 하나에 있어서, 막관통 도메인은 트랜스페린 수용체 단백질 1(TFRC) 또는 종양 괴사 인자 막관통 도메인인, 방법.
구현예 237.
구현예 234 내지 236 중 어느 하나에 있어서, 사이토카인은 I형 사이토카인인, 조성물.
구현예 238.
구현예 234 내지 237 중 어느 하나에 있어서, 사이토카인은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN α, IFN β, 또는 IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체인, 조성물.
구현예 239.
구현예 234 내지 238 중 어느 하나에 있어서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합되는, 조성물.
구현예 240.
구현예 239에 있어서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)인, 조성물.
구현예 241.
구현예 234 내지 240 중 어느 하나에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인은 서열번호 77~80의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
구현예 242.
구현예 234 내지 241 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 항원을 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 243.
구현예 234 내지 242 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 항원을 암호화하는 mRNA를 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 244.
구현예 242 또는 243에 있어서, 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편인, 조성물.
구현예 245.
구현예 233 내지 241 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 246.
구현예 245에 있어서, 2개 이상의 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는, 조성물.
구현예 247.
구현예 244 내지 246 중 어느 하나에 있어서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 종양유전자의 산물, 신생항원, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질인, 조성물.
구현예 248.
구현예 244 내지 247 중 어느 하나에 있어서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질인, 조성물.
구현예 249.
구현예 248에 있어서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18인, 조성물.
구현예 250.
구현예 248 또는 249에 있어서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질인, 조성물.
구현예 251.
구현예 244 내지 247 중 어느 하나에 있어서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질인, 조성물.
구현예 252.
구현예 251에 있어서, HBV 단백질은 코어 단백질, 작은 표면 항원, 중간 표면 항원, 큰 표면 항원, e 항원, X 항원, 또는 중합효소 단백질인, 조성물.
구현예 253.
구현예 233 내지 252 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)인, 조성물.
구현예 254.
구현예 253에 있어서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 둘 이상을 포함하는, 조성물.
구현예 255.
구현예 233 내지 254 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상인, 조성물.
구현예 256.
구현예 233 내지 255에 있어서, 유핵 세포는 보조제로 컨디셔닝되어 컨디셔닝된 세포를 형성하는, 조성물.
구현예 257.
구현예 256에 있어서, 유핵 세포는 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 10시간, 약 3시간 내지 약 6시간, 또는 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션되는, 조성물.
구현예 258.
구현예 256 또는 257에 있어서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 유핵 세포 내로 도입하기 전 또는 후에 컨디셔닝되는, 조성물.
구현예 259.
구현예 256 내지 258 중 어느 하나에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제인, 조성물.
구현예 260.
구현예 256 내지 259 중 어느 하나에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)인, 조성물.
구현예 261.
구현예 234 내지 260 중 어느 하나에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계.
구현예 262.
구현예 261에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA인, 조성물.
구현예 263.
구현예 242, 244, 및 247 내지 262 중 어느 하나에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계.
구현예 264.
구현예 243, 244, 및 247 내지 262 중 어느 하나에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계.
구현예 265.
구현예 263 또는 264에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및/또는 항원을 암호화하는 핵산은 mRNA인, 조성물.
구현예 266.
구현예 245 내지 262 중 어느 하나에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 ?첫溶核觀壙? 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인 및 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계.
구현예 267.
구현예 261 내지 266 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포를 유도하는 방법은 다음 단계를 포함하는, 조성물:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하는 단계;
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(d) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계.
구현예 268.
구현예 261 내지 266 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포를 유도하는 방법은 다음 단계를 포함하는, 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하는 단계;
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(d) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계.
구현예 269.
구현예 261 내지 268 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인, 조성물.
구현예 270.
구현예 261 내지 269 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인, 조성물.
구현예 271.
구현예 261 내지 270 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm인, 조성물.
구현예 272.
구현예 261 내지 271 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm인, 조성물.
구현예 273.
구현예 261 내지 272 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과하는, 조성물.
구현예 274.
의약으로서 사용하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 구현예 234 내지 273 중 어느 하나의 조성물의 유효량을 포함하는, 조성물.
구현예 275.
개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 구현예 210 내지 248 중 어느 하나의 조성물의 유효량을 포함하는, 조성물.
구현예 276.
구현예 194 내지 233 중 어느 하나의 방법에 사용하기 위한 키트.
구현예 277.
구현예 234 내지 275 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 키트.
구현예 278.
구현예 250 또는 249에 있어서, 상기 키트는 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 또는 면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 지침이 포함된 패키지 삽입물 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 키트.
구현예 279.
키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 면역 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 280.
구현예 279에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계.
구현예 281.
구현예 280에 있어서, 상기 방법은 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 282.
구현예 280에 있어서, 상기 방법은 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 방법.
구현예 283.
구현예 280, 281, 또는 282에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA인, 방법.
구현예 284.
구현예 280 내지 283 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인, 방법.
구현예 285.
구현예 280 내지 284 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인, 방법.
구현예 286.
구현예 280 내지 285 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm인, 방법.
구현예 287.
구현예 280 내지 286 중 어느 하나에 있어서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm인, 방법.
구현예 288.
구현예 280 내지 287 중 어느 하나에 있어서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과하는, 방법.
실시예
당업자는 본 발명의 범주 및 사상 내에서 여러 구현예가 가능하다는 것을 인식할 것이다. 이제부터 본 발명은 다음의 비제한적인 실시예를 참조하여 보다 상세히 설명될 것이다. 다음의 실시예는 본 발명을 추가로 예시하지만, 당연히 어떠한 방식으로도 그 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1
키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA가 번역되어 면역 세포의 막에 수송될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA를 인간 공여자 PBMC에 스퀴즈 로딩하고, 면역 세포의 표면에서 사이토카인의 존재를 유세포 계측에 의해 모니터링하였다.
방법
인간 PBMC를 2 Х 107/mL의 밀도로 제조하고, Opti-MEM 배지에서, 키메라 막-결합 사이토카인(TFRC-(G4S)3-IL-12 또는 TFRC-(G4S)3-IFN-α2a 중 어느 하나)을 암호화하는 250 μg/ml의 각각의 mRNA를 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 실온에서 60 psi로 스퀴즈 가공하거나 첨가물 없이 스퀴즈 가공하였다(빈 스퀴즈). 스퀴즈 가공 후, 스퀴즈 로딩된 PBMC를 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 R10+ 배지(RPMI, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 1x ITS-A, 50 μM β-ME, 1x MEM NEAA)에서 2회 세척한 후, 신선한 R10+ 배지에 재현탁시켰다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 다음, 각각의 형광 항체(AF488 항-인간 IL-2, V450 항-인간 IFN-α2b, 또는 퍼시픽 블루 항-인간 p40[IL-12])와 함께 인큐베이션하였다. mRNA의 번역과 막 표면으로의 수송을 평가하기 위해, 면역 세포에 결합된 항체의 형광 강도를 Attune NxT 어쿠스틱 포커싱 유세포분석기(Acoustic Focusing Cytometer)를 사용해 분석하였다.
결과
도 1에 도시된 바와 같이, TFRC-(G4S)3-IL-12, 또는 TFRC-(G4S)3-IFN-α2a를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 인간 PBMC의 경우, 빈 스퀴즈 샘플과 비교하여, 스퀴즈 로딩된 샘플에서 살아있는 면역 세포에 대한 IL-12 및 IFN-α2a의 평균 형광 강도(MFI)가 증가하였다. 결과는 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 인간 PBMC가 mRNA를 번역하여 암호화된 단백질을 면역 세포의 표면에 수송할 수 있음을 입증한다.
실시예 2
키메라 막-결합 사이토카인이 신호전달 기능을 보유하는지 여부를 결정하기 위해, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA를 인간 공여자 PBMC에 스퀴즈 로딩하고, 사이토카인-특이적 HEK-블루 리포터 세포(InvivoGen)와 공동 배양하였다.
방법
인간 PBMC를 2 Х 107/mL의 밀도로 제조하고, Opti-MEM 배지에서, 키메라 막-결합 사이토카인(TFRC-(G4S)3-IL-12 또는 TFRC-(G4S)3-IFN-α2a 중 어느 하나)을 암호화하는 250 μg/ml의 각각의 mRNA를 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 실온에서 60 psi로 스퀴즈 가공하거나 첨가물 없이 스퀴즈 가공하였다(빈 스퀴즈). 스퀴즈 가공 후, 스퀴즈 로딩된 PBMC를 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 시험 배지(DMEM, 10% FBS, 1x 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민)에서 2회 세척한 후, 신선한 시험 배지에 재현탁하였다.
PBS로 배양 플라스크를 헹구어, 대수적으로 성장하는 HEK-블루 IL-12, HEK-블루 IL-2, 및 HEK-블루 IFN-α/β (InvivoGen) 리포터 세포를 배양 플라스크로부터 수확하고, 96-웰 플레이트에서 각각의 스퀴즈 로딩된 PBMC 또는 빈 스퀴즈 PBMC와 함께 공동 배양하였다. 공동 배양물을 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후 배양 상청액을 수확하였다. 각각의 사이토카인이 수용체에 결합하고, HEK-블루 리포터 세포에서 각각의 신호전달 경로가 활성화되면, 배양 상청액에서 알칼리 인산분해효소가 분비된다. 분비된 알칼리 인산분해효소(SEAP)는 제조사의 프로토콜에 따라 QUANTI-블루 검정을 통해 검출하였다. 빈 스퀴즈 샘플 및 스퀴즈 로딩된 샘플에 대한 OD630 값에서 HEK-블루 리포터 세포 단독의 OD630을 차감하였다.
결과
도 2에 도시된 바와 같이, TFRC-(G4S)3-IL-12 또는 TFRC-(G4S)3-IFN-α2a를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 인간 PBMC는, HEK-블루 IL-2, HEK-블루 IL-12, 및 HEK-블루 IFN-α/β와의 공동 배양 후 배양 상청액에서 SEAP의 증가로 나타난 것과 같이, 각각의 신호전달 경로를 활성화시킬 수 있었다. 결과는 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 인간 PBMC가, 기능적으로 동족 수용체에 결합하여 이를 통해 신호전달을 할 수 있는 키메라 사이토카인을 생성함을 입증한다.
실시예 3
막-결합 IL-2를 암호화하는 mRNA가 번역되어 면역 세포의 막에 수송될 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 막-결합 IL-2를 암호화하는 mRNA를 인간 공여자 PBMC에 스퀴즈 로딩하고, 면역 세포의 표면에서 IL-2의 존재를 유세포 계측에 의해 50시간에 걸쳐 모니터링하였다.
방법
인간 PBMC를 2 Х 107/mL의 밀도로 제조하고, Opti-MEM 배지에서, 막-결합 IL-2(TFRC-(G4S)3-IL-2, TFRC-(EA3K)3-IL-2, FasL-(G4S)3-IL-2, 또는 FasL-(EA3K)3-IL-2 중 어느 하나)을 암호화하는 250 μg/ml의 각각의 mRNA를 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 실온에서 60 psi로 스퀴즈 가공하거나 미접촉 PBMC(미 접촉)를 스퀴즈 가공하였다. 스퀴즈 가공 후, 스퀴즈 로딩된 PBMC를 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 X-VIVO 15+ 배지(X-VIVO 15, 5% 인간 혈청, 및 1x ITS-A)에서 2회 세척한 후, 신선한 X-VIVO 15+ 배지에 재현탁하였다. 세포를 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 스퀴즈 가공 후 4, 18, 24, 및 48시간차에 별도의 배양물을 수확하였다. 막-결합 IL-2의 발현을 평가하기 위해, 세포를 각각의 BV421 항-인간 IL-2 항체와 함께 인큐베이션하고, Attune NxT 어쿠스틱 포커싱 유세포분석기를 사용해 면역 세포에 결합된 항체의 형광 강도를 분석하였다.
결과
도 3에 도시된 바와 같이, 막-결합 IL-2를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 인간 PBMC의 경우, 각각의 시점에(스퀴즈 로딩 후 4, 18, 24, 및 48시간차에) 빈 스퀴즈 샘플과 비교하여, 스퀴즈 로딩된 샘플에서 살아있는 면역 세포에 대한 IL-2의 평균 형광 강도(MFI)가 증가하였다. 결과는 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 인간 PBMC가 암호화된 단백질을 번역하여 면역 세포의 표면에 수송할 수 있고, 스퀴즈 가공 후 24시간이 넘는 기간 동안 면역 세포의 표면에서 IL-2가 검출될 수 있음을 입증한다.
실시예 4
키메라 막-결합 사이토카인이 신호전달 기능을 보유하는지 여부를 결정하기 위해, 막-결합 IL-2를 암호화하는 mRNA를 인간 공여자 PBMC에 스퀴즈 로딩하고, HEK-블루 IL-2 리포터 세포와 공동 배양하였다.
방법
인간 PBMC를 2 Х 107/mL의 밀도로 제조하고, Opti-MEM 배지에서, 막-결합 IL-2(TFRC-(G4S)3-IL-2, TFRC-(EA3K)3-IL-2, FasL-(G4S)3-IL-2, 또는 FasL-(EA3K)3-IL-2 중 어느 하나)을 암호화하는 250 μg/ml의 각각의 mRNA를 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 실온에서 60 psi로 스퀴즈 가공하거나 첨가물 없이 스퀴즈 가공하였다(빈 스퀴즈). 스퀴즈 가공 후, 스퀴즈 로딩된 PBMC를 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 시험 배지(DMEM, 10% FBS, 1x 페니실린/스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민)에서 2회 세척한 후, 신선한 시험 배지에 재현탁하였다.
PBS로 배양 플라스크를 헹구어, 대수적으로 성장하는 HEK-블루 IL-2 리포터 세포(InvivoGen)를 배양 플라스크로부터 수확하고, 96-웰 플레이트에서 스퀴즈 로딩된 PBMC 또는 빈 스퀴즈 PBMC와 함께 공동 배양하였다. 공동 배양물을 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후 배양 상청액을 수확하였다. IL-2가 이의 수용체에 결합하고, HEK-블루 IL-2 리포터 세포에서 IL-2 신호전달 경로가 활성화되면, 배양 상청액에서 알칼리 인산분해효소가 분비된다. 분비된 알칼리 인산분해효소(SEAP)는 제조사의 프로토콜에 따라 QUANTI-블루 검정을 통해 검출하였다. 빈 스퀴즈 샘플 및 스퀴즈 로딩된 샘플에 대한 OD640 값에서 HEK-블루 리포터 세포 단독의 OD640을 차감하였다.
결과
도 4에 도시된 바와 같이, HEK 블루 IL-2 리포터 세포와 공동 배양한 후 배양 상청액에서 SEAP의 증가로 나타난 것과 같이, TFRC-(G4S)3-IL-2, TFRC-(EA3K)3-IL-2, FasL-(G4S)3-IL-2, 또는 FasL-(EA3K)3-IL-2를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 인간 PBMC는, 빈 스퀴즈 PBMC가 신호전달 경로를 활성화할 수 없는 것에 비해, IL-2 신호전달 경로를 활성화할 수 있었다. 결과는 막-결합 IL-2를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 인간 PBMC가, 기능적으로 IL-2 수용체에 결합하여 이를 통해 신호전달을 할 수 있는 키메라 IL-2를 면역 세포 상에서 생성함을 입증한다.
실시예 5
재조합 E7(HPV16) 단백질이 스퀴즈 로딩된 면역 세포가 항원 특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 인간 공여자 HLA-A*02+ PBMC에 E7 단백질을 스퀴즈 로딩하고, E7 특이적 T 세포를 자극하는 능력을 IFN-γ ELISA에 의해 측정하였다.
방법
HLA-A*02+ 공여자 유래의 인간 PBMC를 10 Х 106/mL의 밀도로 제조하고, RPMI 1640 배지에서, 32 μg/ml의 재조합 E7 단백질(Abcam plc.), 50 μM E7.6 합성 긴 펩티드(SLP)를 4.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이의 협착부를 통해 60 psi로 스퀴즈 가공하거나, 첨가물 없이 스퀴즈 가공하였다(빈 스퀴즈). 스퀴즈 가공에 앞서, 미세 유체 스퀴징 장치를 15분 동안 얼음 위에서 냉각시켰다. 스퀴즈 가공 후, 스퀴즈 로딩된 PBMC를 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 공동 배양 배지(X-VIVO 15 + 5% 인간 혈청)에서 2회 세척한 후, 신선한 공동 배양 배지에 재현탁하였다.
그런 다음, 1.2 Х 105개의 스퀴즈 로딩된 PBMC를 96-웰 플레이트에서 3 Х 104개의 HLA-A*02+ E711-20 반응자 T 세포(Cellero)와 함께 공동 배양하였다. 96-웰 플레이트에서, 양성 대조군으로서 0.02 μM의 최소 에피토프 E711-20을 미처리 PBMC 및 반응자 세포에 직접 첨가하였다(E711-20 펩티드 스파이크). 37℃에서 6시간 동안 공동 배양한 후, 공동 배양 상청액을 수확하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 IFNγ ELISA를 수행하여 각 샘플에 대한 배양 상청액 중 IFNγ의 농도를 결정하였다.
결과
도 5에 도시된 바와 같이, 재조합 E7 단백질을 스퀴즈 로딩하고, E711-20 반응자 T 세포와 공동 배양한 인간 PBMC의 경우, 빈 스퀴즈 대조군과 비교하여 IFNγ 생산이 증가하였다. 결과는 전장 재조합 E7 단백질을 스퀴즈 로딩한 인간 PBMC가 E711-20 펩티드-특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있음을 입증한다.
실시예 6
고유 또는 코돈 최적화된 E6 mRNA로부터 생성된 E6 단백질의 양을 결정하기 위해, 인간 PBMC에 각각의 고유 또는 코돈 최적화된 E6 mRNA를 스퀴즈 로딩하고, 웨스턴 블롯으로 발현 수준을 측정하였다.
방법
2개의 상이한 HLA-A*02+ 공여자(237 및 246) 유래의 인간 PBMC를 2 x 107/mL의 밀도로 제조하고, Opti-MEM 배지에서 250 μg/mL의 각 E6 mRNA(고유 또는 코돈 최적화된 mRNA)를 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 실온에서 60 psi로 스퀴즈 가공하였다. 스퀴즈 가공 후, 스퀴즈 로딩된 hPBMC를 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 5% 인간 혈청을 함유하는 XVIVO 15 배지에서 2회 세척한 후, 5% 인간 혈청을 함유하는 신선한 XVIVO 15 배지에 재현탁하였다.
그런 다음, 2.5 x 106개의 세포를 96-웰 ULA 플레이트에 넣고 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 90분 인큐베이션 후, 세포를 수확하고 원심분리하였다. 세포 용해물을 생성하고 웨스턴 블롯에 사용하였다. E6 단백질의 존재는 E6에 대한 특이적 항체를 사용하여 검출하였다.
결과
도 6에 도시된 바와 같이, E6 단백질은 90분의 스퀴즈 로딩 후에 2개의 상이한 HLA-A*02+ 공여자(237 및 246) 유래의 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 성공적으로 검출되었다. 또한, E6 mRNA의 코돈 최적화는 고유 E6 mRNA와 비교하여 mRNA 번역을 증가시켰다.
실시예 7
코돈 최적화된 E6 mRNA의 번역 동역학을 결정하기 위해, 인간 PBMC에 각각의 고유 또는 코돈 최적화된 E6 mRNA를 스퀴즈 로딩하고, 웨스턴 블롯으로 24시간에 걸쳐 발현 수준을 측정하였다.
방법
2개의 상이한 HLA-A*02+ 공여자(224 및 239) 유래의 인간 PBMC를 2 x 107/mL의 밀도로 제조하고, Opti-MEM 배지에서 250 μg/mL의 코돈 최적화된 E6 mRNA를 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 실온에서 60 psi로 스퀴즈 가공하였다. 스퀴즈 가공 후, 스퀴즈 로딩된 hPBMC를 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 5% 인간 혈청을 함유하는 XVIVO 15 배지에서 2회 세척한 후, 5% 인간 혈청을 함유하는 신선한 XVIVO 15 배지에 재현탁하였다.
그런 다음, 2.5 x 106개의 세포를 96-웰 ULA 플레이트에 넣고 다양한 시점(2, 6, 및 24시간) 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 각 시점 후, 세포를 수확하고 원심분리하였다. 세포 용해물을 생성하고 웨스턴 블롯에 사용하였다. E6 단백질의 존재는 E6에 대한 특이적 항체를 사용하여 검출하였다.
결과
도 7에 도시된 바와 같이, E6 단백질은 본 연구에서 평가된 각각의 시점에 2개의 상이한 HLA-A*02+ 공여자(224 및 239) 유래의 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 성공적으로 검출되었다. 이들 결과는 코돈 최적화가 E6의 mRNA 번역을 용이하게 하거나 향상시키는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 8
E7을 암호화하는 변형된 mRNA의 전달 후 E7 단백질의 동역학을 결정하기 위해, 면역프로테아좀-표적화 모티프가 있거나 없는 가운데 각각의 고유 또는 코돈 최적화된 E7 mRNA를 인간 PBMC에 스퀴즈 로딩하고, 웨스턴 블롯으로 6시간에 걸쳐 발현 수준을 측정하였다.
방법
HLA-A*02+ 공여자 유래의 인간 PBMC를 2 x 107/mL의 밀도로 제조하고, Opti-MEM 배지에서 250 μg/mL의 각 E7 mRNA(고유, D-박스 면역프로테아좀-표적화 모이어티, 코돈 최적화된 mRNA의 2개의 상이한 버전)를 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 실온에서 60 psi로 스퀴즈 가공하였다. 스퀴즈 가공 후, 스퀴즈 로딩된 hPBMC를 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 5% 인간 혈청을 함유하는 XVIVO 15 배지에서 2회 세척한 후, 5% 인간 혈청을 함유하는 신선한 XVIVO 15 배지에 재현탁하였다.
그런 다음, 2.5 x 106개의 세포를 96-웰 ULA 플레이트에 넣고 최대 6시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 1시간 및 6시간 시점 후, 세포를 수확하고 원심분리하였다. 세포 용해물을 생성하고 웨스턴 블롯에 사용하였다. E7 단백질의 존재는 E7에 대한 특이적 항체를 사용하여 검출하였다.
결과
도 8에 도시된 바와 같이, E7 단백질은 1시간의 스퀴즈 로딩 후에 각 샘플(고유, D-박스, 코돈 최적화된 버전 1 및 버전 2)에 대해 HLA-A*02+ 공여자 유래의 스퀴즈 로딩된 PBMC에서 성공적으로 검출되었다. 또한, E7 mRNA의 코돈 최적화는 고유 E7 mRNA와 비교하여 mRNA 번역을 증가시켰다. 또한, E7 mRNA를 함유하는 D-박스 모티프는 고유 E7 mRNA와 비교하여 더 빠른 단백질 분해를 나타냈다. E7 단백질은 스퀴즈 로딩 후 6시간차에는 검출할 수 없었다.
실시예 9
E7 mRNA를 스퀴즈 로딩한 특이적 HLA 일배체형의 면역 세포가 항원특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 인간 공여자 HLA-A*02+ PBMC에 전장 E7을 암호화하는 다양한 mRNA 작제물을 스퀴즈 로딩하고, IFN-γ ELISA를 사용해 E711-20 특이적 반응자 T 세포를 자극하는 능력을 측정하였다.
방법
HLA-A*02+ 공여자 유래의 인간 PBMC를 2 x 107/mL의 밀도로 제조하고, Opti-MEM 배지에서 250 μg/mL의 다양한 E7 mRNA를 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 실온에서 60 psi로 스퀴즈 가공하였다. 스퀴즈 가공 후, 스퀴즈 로딩된 PBMC를 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 5% 인간 혈청을 함유하는 XVIVO 15 배지에서 2회 세척한 후, 5% 인간 혈청을 함유하는 XVIVO 15 배지에 재현탁하였다.
그런 다음, 96-웰 플레이트에서, 1.2 Х 105개의 스퀴즈 로딩된 PBMC를 Cellero에서 구입한 3 Х 104개의 E711-20 반응자 T 세포와의 공동 배양물에 넣었다. 공동 배양 플레이트에서, 양성 대조군으로서 20 nM E711-20 최소 에피토프를 미처리 PBMC 및 반응자 세포에 직접 첨가하였다(펩티드 스파이크). 플레이트를 37℃에서 6시간 동안 또는 밤새 인큐베이션한 다음, 제조사의 지침에 따라 현상하고/정량화하였다.
결과
도 9에 도시된 바와 같이, 다양한 E7 mRNA 작제물을 스퀴즈-로딩한 HLA-A*02+ 인간 PBMC는 6시간 동안 공동 배양한 후 E711-20 특이적 반응자 T 세포에 의한 IFNγ 분비를 증가시켰다. 또한, 면역프로테아좀-표적화 모티프(D-박스 E7)를 추가로 암호화하거나 코돈 최적화(CO v1 및 CO v2)된 E7 mRNA 작제물은 고유 E7 mRNA 작제물과 비교하여 IFNγ 분비를 증가시켰다. 이들 결과는 E7 mRNA를 스퀴즈 로딩한 HLA-A*02+ 인간 PBMC가 항원 특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있음을 입증하며, 이는 코돈 최적화에 의해, 또는 면역프로테아좀-표적화 모티프를 E7 mRNA에 추가함으로써 추가로 향상될 수 있다.
실시예 10
E7 mRNA를 스퀴즈 로딩한 특이적 HLA 일배체형의 면역 세포가 항원특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 인간 공여자 HLA-A*02+ PBMC에 전장 E7을 암호화하는 다양한 mRNA 작제물을 스퀴즈 로딩하고, IFN-γ ELISA를 사용해 E711-20 특이적 반응자 T 세포를 자극하는 능력을 측정하였다.
방법
HLA-A*02+ 공여자 유래의 인간 PBMC를 2 x 107/mL의 밀도로 제조하고, Opti-MEM 배지에서 250 μg/mL의 다양한 E7 mRNA를 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 실온에서 60 psi로 스퀴즈 가공하였다. 스퀴즈 가공 후, 스퀴즈 로딩된 PBMC를 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 5% 인간 혈청을 함유하는 XVIVO 15 배지에서 2회 세척한 후, 5% 인간 혈청을 함유하는 XVIVO 15 배지에 재현탁하였다.
그런 다음, 96-웰 플레이트에서, 1.2 Х 105개의 스퀴즈 로딩된 PBMC를 Cellero에서 구입한 3 Х 104개의 E711-20 반응자 T 세포와의 공동 배양물에 넣었다. 공동 배양 플레이트에서, 양성 대조군으로서 20 nM E711-20 최소 에피토프를 미처리 PBMC 및 반응자 세포에 직접 첨가하였다(펩티드 스파이크). 플레이트를 37℃에서 6시간 동안 또는 밤새 인큐베이션한 다음, 제조사의 지침에 따라 현상하고/정량화하였다.
결과
도 10a 및 10b에 도시된 바와 같이, 다양한 E7 mRNA 작제물(E7 CO: 코돈 최적화된 E7 mRNA; NLS E7 CO: 돌연변이된 NLS를 추가로 암호화하는 코돈 최적화된 E7 mRNA; sec/MITD E7 CO: sec/MITD 국소화 도메인을 추가로 암호화하는 코돈 최적화된 E7 mRNA; C-ter KEKE E7 CO: C-말단 KEKE 면역프로테아좀-표적화 모티프를 추가로 암호화하는 코돈 최적화된 E7 mRNA; E7.6 SLP를 암호화하는 mRNA, E7.6 SLP의 6x 반복을 암호화하는 mRNA)를 스퀴즈 로딩한 HLA-A*02+ 인간 PBMC는 6시간 동안 및 밤새 공동 배양한 후에 검출되는 IFNg 분비를 초래하였다.
실시예 11
E7 mRNA를 스퀴즈 로딩한 특이적 HLA 일배체형의 면역 세포가 항원특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 인간 공여자 HLA-A*02+ PBMC에 전장 E7을 암호화하는 다양한 mRNA 작제물을 스퀴즈 로딩하고, IFN-γ ELISA를 사용해 E711-20 특이적 반응자 T 세포를 자극하는 능력을 측정하였다.
방법
HLA-A*02+ 공여자 유래의 인간 PBMC를 2 x 107/mL의 밀도로 제조하고, Opti-MEM 배지에서 250 μg/mL의 다양한 E7 mRNA를 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 실온에서 60 psi로 스퀴즈 가공하였다. 스퀴즈 가공 후, 스퀴즈 로딩된 PBMC를 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 이어서, 세포를 5% 인간 혈청을 함유하는 XVIVO 15 배지에서 2회 세척한 후, 5% 인간 혈청을 함유하는 XVIVO 15 배지에 재현탁하였다.
그런 다음, 96-웰 플레이트에서, 1.2 Х 105개의 스퀴즈 로딩된 PBMC를 Cellero에서 구입한 3 Х 104개의 E711-20 반응자 T 세포와의 공동 배양물에 넣었다. 공동 배양 플레이트에서, 양성 대조군으로서 20 nM E711-20 최소 에피토프를 미처리 PBMC 및 반응자 세포에 직접 첨가하였다(펩티드 스파이크). 플레이트를 37℃에서 6시간 동안 또는 밤새 인큐베이션한 다음, 제조사의 지침에 따라 현상하고/정량화하였다.
결과
도 11a 및 11b에 도시된 바와 같이, 다양한 E7 mRNA 작제물을 스퀴즈-로딩한 HLA-A*02+ 인간 PBMC는 6시간 동안 공동 배양한 후 또는 밤새 공동 배양한 후 E711-20 특이적 반응자 T 세포에 의한 IFNγ 분비를 초래하였다. 또한, 이러한 E711-20특이적 T 세포 반응의 유도는 다양한 E7 mRNA 작제물을 스퀴즈 로딩한 다수의 HLA-A*02+ 인간 PBMC 공여자에서 일관되게 관찰될 수 있다. 결과는 E7 mRAN를 스퀴즈 로딩한 상이한 HLA-A*02+ 인간 PBMC가 항원 특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있음을 입증한다.
실시예 12
신호 2 및 신호 3 매개자의 공동 전달이 항원을 스퀴즈 로딩한 항원 제시 세포에 의한 T 세포 반응을 자극하는 능력을 향상시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 신호 1, 신호 2, 및/또는 신호 3을 각각 매개하는 작동자를 암호화하는 상이한 mRNA를 인간 공여자 HLA-A*02+ PBMC에 스퀴즈 로딩하였다. CD3+ CD8+ 반응자 세포의 활성화는 세포내 사이토카인 염색(ICS)을 통해 측정하였다. 펩티드로 재자극한, 다양한 mRNA를 스퀴즈 로딩한 세포의 효과를 CMV pp65 펩티드와 함께 인큐베이션한 세포(펩티드 스파이크 대조군)의 효과와 비교하였다.
방법
CMV+ HLA-A*02+ 류코팩으로부터 단리한 인간 PBMC를 NLVPMVATV(495-503 aa; 서열번호 88)에 특이적인 CMVpp65 사량체로 염색하여 이들 PBMC가 기존의 pp65-특이적 CD8 T 세포를 갖고 있는지를 결정하였다. 이어서, PBMC를 2 x107개의 세포/mL의 밀도로 제조하고, CMV pp65(신호 1)를 암호화하는 mRNA, CD86(신호 2)을 암호화하는 mRNA, 및/또는 막-결합 인터류킨-12(mbIL-12)(신호 3)를 암호화하는 mRNA와 합쳤다. 실온의 RPMI 배지에서, mRNA(들)가 존재하는 가운데, Cell Squeeze® 시스템 및 칩을 사용하여, 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 60 psi로 세포를 스퀴즈 가공하였다. 빈 페이로드로 스퀴즈 가공하고(빈 스퀴즈), 10 nM CMV pp65 펩티드와 함께 추가로 배양한 PBMC를 대조군으로서 사용하였다. 다음의 각 mRNA의 농도 및 혼합물을 시험하였다.
예를 들어, 샘플 G의 경우, 세포 현탁액 중 225 μL의 세포의 총 부피를 다음의 농도의 mRNA로 스퀴즈 가공하였다: 25 μg/mL의 CMV pp65 mRNA, 250 μg/mL의 CD86 mRNA, 및/또는 250 μg/mL의 막-결합 인터류킨-12 mRNA.
스퀴즈 가공 후, 스퀴즈 로딩된 PBMC를 RPMI + 10% 소태아 혈청에 옮기고 37℃에서 5일 동안 인큐베이션하였다. 배양 마지막 날에, 생성된 세포를 1 μM CMV pp65 펩티드로 재자극하거나, 재자극 없이 방치하고, 이들의 활성화 및 활성을 ICS를 통해 측정하였다. TNF-α, IFN-γ, IL-2, PD-1, 및 그랜자임 B를 CD3+ CD8+ 반응자 세포에서 평가하였다.
결과
세포내 염색에 의해 나타난 것과 같이, CD86 또는 mbIL-12를 각각 암호화하는 mRNA의 스퀴징 매개 전달 후 24시간 차에 CD86 mRNA(도 12a, 12b) 및 mbIL-12 mRNA(도 13a, 13b)가 성공적으로 번역되었다.
도 14는 재자극 없이 항원 특이적 T 세포를 활성화하는 데 있어서 mRNA 로딩된 PBMC에 대한 CMV pp65 mRNA의 농도 효과를 보여준다. 도 15는 1 μM의 항원으로 재자극했을 때, 항원 특이적 T 세포를 활성화하는 데 있어서 mRNA 로딩된 PBMC에 대한 CMV pp65 mRNA의 농도 효과를 보여준다. 도 15에 도시된 바와 같이, CD3+CD8+ 반응자 내에서 IFNγ + CD45RO+ 집단의 유도에 의해 입증된 것과 같이, 50 μg/mL 및 100 μg/mL로 pp65 mRNA가 스퀴즈 로딩된 모든 경우에 T 세포 활성화가 관찰되었다. 두 도면 모두는 CMV pp65 mRNA를 CD86 mRNA 및 mbIL-12 mRNA와 함께 스퀴징했을 때 IFNγ + CD45RO+ CD3+CD8+ 세포의 백분율이 더 높음을 보여준다.
도 16a~16e는 IFNg, IL-2, TNFa, 그랜자임 B, PD-1 발현에 의해 나타난 것과 같이, 항원 특이적 CD8 T 세포가 다기능성임을 보여준다. 신호 2/3 mRNA를 암호화하는 mRNA를 PBMC에 추가로 도입한 경우, 항원 단독과 비교했을 때(즉, pp65 mRNA 하나만 PBMC에 스퀴즈 로딩한 경우), 이들 기능적 마커가 추가로 상향 조절되었다.
실시예 13
CpG 성숙이 스퀴징된 세포에 미치는 효과를 측정하기 위해, 신호 1, 신호 2, 및/또는 신호 3을 매개하는 작동자를 각각 암호화하는 상이한 mRNA를 인간 공여자 HLA-A*02+ PBMC에 스퀴즈 로딩하였다. 각각의 PBMC 샘플에 대해, 세포의 절반을 1 μM의 CpG 7909로 4시간 동안 성숙시켰다. 4시간 성숙이 종료된 후, 과량의 CpG 7909를 세척하고, 세포를 도말하고, 37℃에서 5일 동안 인큐베이션하였다. 5일차에, ICS 및 사량체 분석을 통해 CD3+ CD8+ 세포의 활성화 및 활성을 측정하였다. 다양한 mRNA를 스퀴즈 로딩하고, CpG 7909로 성숙시킨 세포의 효과를, 빈 페이로드로 스퀴즈 가공하고 CMV pp65 펩티드로 스파이크한 PBMC의 효과와 비교하고, PMA/이오노마이신으로 처리한 PBMC의 효과와도 비교하였다.
방법
CMV+ HLA-A*02+ 류코팩으로부터 단리한 인간 PBMC를 NLVPMVATV(495-503 aa; 서열번호 88)에 특이적인 CMVpp65 사량체로 염색하여 이들 PBMC가 기존의 pp65-특이적 CD8 T 세포를 갖고 있는지를 결정하였다. 이어서, PBMC를 2 x107개의 세포/mL의 밀도로 제조하고, CMV pp65(신호 1), CD86(신호 2), 및/또는 막-결합 인터류킨-12(mbIL-12)(신호 3)를 암호화하는 mRNA와 합쳤다. 실온의 RPMI 배지에서, 각각의 mRNA가 존재하는 가운데, Cell Squeeze® 시스템 및 칩을 사용하여, 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 60 psi로 세포를 스퀴즈 가공하였다. 빈 페이로드로 스퀴즈 가공하고(빈 스퀴즈) 10 nM CMV pp65 펩티드로 추가로 스퀴즈 가공한 배양한 PBMC를 대조군으로서 사용하였다. 다음의 각 mRNA의 농도 및 혼합물을 시험하였다.
예를 들어, 샘플 G의 경우, 세포 현탁액 중 500 μL의 세포의 총 부피를 다음의 농도의 mRNA로 스퀴즈 가공하였다: 10 μg/mL의 CMV pp65 mRNA, 250 μg/mL의 CD86 mRNA, 및 250 μg/mL의 막-결합 인터류킨-12 mRNA. 각각의 샘플에 대해, 세포의 하위 집합을 1 μM의 CpG 7909로 4시간 동안 성숙시킨 다음, 세척하고 배양하였다.
세포를 5일 동안 추가로 인큐베이션하였다. 배양 마지막 날에, 생성된 세포를 1 μM CMV pp65 펩티드로 재자극하고, 이들의 활성화 및 활성을 ICS를 통해 측정하였다. TNF-α, IFN-γ, IL-2, PD-1, 및 그랜자임 B를 CD3+ CD8+ 반응자 세포에서 평가하였다.
ICS 평가에 추가하여, 증식 후 5일차에, 세포를 CMVpp65 사량체로 염색하여 항원 특이적 CD8 T 세포의 수를 결정하였다.
결과
세포내 염색에 의해 나타난 것과 같이, CD86 또는 mbIL-12를 각각 암호화하는 mRNA의 스퀴징 매개 전달 후 24시간 차에 CD86 mRNA(도 17a, 17b) 및 mbIL-12 mRNA(도 18a, 18b)가 성공적으로 번역되었다.
도 19는 CpG 성숙이 있고 CpG 성숙이 없는 조건 하에서 pp65 및 CD86 및/또는 mbIL-12 mRNA를 PBMC에 스퀴즈 로딩한 후 CMV pp65 사량체-특이적(TET-특이적) CD3+CD8+ 반응자 세포의 증식 증가를, pp65 mRNA 하나만 PBMC에 스퀴즈 로딩한 경우와 비교하여 보여준다. 본 실시예는 CpG 성숙이 Tet+ 세포의 백분율을 약간 감소시켰지만(도 19 상단 패널), CpG 성숙이 없는 경우보다 Tet+ 계수가 더 높았음(도 19 하단 패널)을 입증한다. 또한, CD86 및/또는 mbIL-12 mRNA의 공동 전달은 CMV pp65 mRNA 하나만 스퀴즈 로딩한 경우에 비해 Tet-특이적 반응자 세포의 계수 및 백분율 둘 다를 추가로 증강시켰다.
도 20에 도시된 바와 같이, CpG 성숙이 있거나 없는 조건 하에, 신호 1의 매개자를 암호화하는 mRNA를 신호 2 및/또는 신호 3의 매개자를 암호화하는 mRNA와 공동 전달한 경우, CD3+CD8+ 반응자 내에서 IFNγ + CD45RO+ 집단의 증가에 의해 나타난 것과 같이, 반응자 T 세포의 활성화가 증가하였다.
도 21a~21e에 도시된 바와 같이, pp65 mRNA를 PCMC에 스퀴즈 로딩한 경우, 항원 없이 PBMC를 스퀴즈 가공한 것에 비해, T 세포 반응자에서 TNF-α, IFN-γ, IL-2, PD-1, 및 그랜자임 B의 기능적 마커가 상향 조절되었다. 결과는 활성화된 항원 특이적 T 세포가 다기능성임을 나타낸다.
실시예 14
T 세포 활성화에 있어서 신호 1, 2, 또는 3에 대한 매개자를 각각 암호화하는 다양한 mRNA의 공동 스퀴징(동시 스퀴즈 로딩), 다수의 상이한 HLA 일배체형을 다루는 이들의 능력, 및 생성된 강화된 T 세포 반응을 평가하기 위해, T 세포 활성화에 있어서 신호 1, 2, 또는 3에 대한 매개자를 각각 암호화하는 mRNA의 조합을 인간 공여자 HLA-A*02+ PBMC(HLA-A*02+, HLA-B*07+, HLA-B*35+)에 스퀴즈 로딩하였다.
방법
CMV+ HLA-A*02+ 류코팩으로부터 단리한 인간 PBMC를 NLVPMVATV(495-503 aa; 서열번호 88)에 특이적인 CMVpp65 사량체로 염색하여 이들 PBMC가 기존의 pp65-특이적 CD8 T 세포를 갖고 있는지를 결정하였다. 이어서, PBMC를 4 x107개의 세포/mL의 밀도로 제조하고, CMV pp65(신호 1), CD86(신호 2), 막-결합 인터류킨-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 인터류킨-12(mbIL-12)(신호 3)를 암호화하는 mRNA와 합쳤다. 실온의 RPMI 배지에서, mRNA가 존재하는 가운데, Cell Squeeze® 시스템 및 칩을 사용하여, 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 60 psi로 세포를 스퀴즈 가공하였다. 빈 페이로드로 스퀴즈 가공하고, 10 nM CMV pp65 펩티드를 스파이크한 PBMC, 및 1X PMA/이오노마이신으로 처리한 PBMC를 대조군으로서 사용하였다. 다음의 각 mRNA의 농도 및 혼합물을 시험하였다.
예를 들어, 샘플 F의 경우, 세포 현탁액 중 500 μL의 세포의 총 부피를 다음의 농도의 mRNA로 스퀴즈 가공하였다: 50 μg/mL의 pp65 mRNA(신호 1), 250 μg/mL의 CD86, 및/또는 250 μg/mL의 mbIL-12 mRNA. 그런 다음, 각 샘플 내의 세포를 1 μM CpG 7909로 4시간 동안 성숙시킨 후, 세포의 일부를 세척한 다음, 4일 동안 동결보존하였다. 해동 후, 이들을 배양물 내에 5일 동안 방치하여 ICS 반응을 평가하였다. 일부 세포는 5일 동안 신선한 상태로 즉시 배양하여 ICS 반응을 비교하였다. 5일차에, 다음 3가지 상이한 조건 하에 이들 세포를 재자극하였다: 1) HLA-A*02-제한 pp65 최소 에피토프(NLVPMVATV; 서열번호88)가 있는 조건, 2) HLA-B*07-제한 pp65 최소 에피토프(RPHERNGFTVL; 서열번호89)가 있는 조건, 또는 (3) HLA-B*35-제한 pp65 최소 에피토프(TPRVTGGGAM; 서열번호90)이 있는 조건. 항원 특이적 반응은 CD3+ CD8+ 반응자 세포에서 TNF-α, IFN-γ 발현을 평가함여 ICS를 통해 측정하였다. 추가로, mRNA 발현은 스퀴징 후 24시간차 및 해동 후 24시간차에도 평가하였다.
결과
세포내 염색에 의해 나타난 것과 같이, 상응하는 mRNA의 스퀴징 매개 전달 후 24시간차에 CD86 (도 22a, 22b), mb-IL2(도 23a, 23b), 및 mbIL-12 mRNA(도 24a, 24b)가 성공적으로 번역되었다.
도 25에 도시된 바와 같이, HLA-B*07-제한 pp65 최소 에피토프로 재자극하거나 재자극하지 않는 조건 하에, CD86 및 mbIL2 mRNA를 스퀴즈 로딩한 PBMC의 경우, 및 CD86 및 mbIL12 mRNA를 스퀴즈 로딩한 PBMC의 경우에도, 항원 특이적 T 세포 반응자에 대한 활성화가 향상되었다. 추가로, 도 26에 도시된 바와 같이, HLA-B*07-제한 pp65 최소 에피토프를 이용한 펩티드 재자극의 경우, 펩티드로 재자극한 군 중 CD3+ CD8+ 반응자 세포 내의 IFN-γ+ CD45RO+ 집단의 백분율이 유의하게 더 높은 것에 의해 입증되는 바와 같이, T 세포 반응자 활성화가 실질적으로 향상되었다.
이들 항원 특이적 CD8 T 세포의 다기능성을 나타내기 위해, 세포 내 염색에 의해서 TNFa 생성도 측정하였다. 재자극 후, TNFa-생산 CD8 T 세포를 검출할 수 있었다. 참고로, CD86, mbIL-2, 및/또는 mbIL-12 mRNA를 PBMC에 스퀴즈 로딩했을 때, TNFa의 수준이 증가하였다.
실시예 15
T 세포 활성화에 있어서 MHC 신호 1, 2, 또는 3에 대한 작동자를 별도로 암호화하는 다양한 mRNA의 공동 스퀴징(동시 스퀴즈 로딩), 다수의 상이한 HLA 일배체형을 다루는 이들의 능력, 및 생성된 강화된 T 세포 반응을 평가하기 위해, T 세포 활성화에 있어서 신호 1, 2, 또는 3에 대한 매개자를 각각 암호화하는 mRNA의 조합을 인간 공여자 HLA-A*02+ PBMC에 스퀴즈 로딩하였다.
방법
CMV+ HLA-A*02+ 류코팩으로부터 단리한 인간 PBMC를 NLVPMVATV(495-503 aa; 서열번호 88)에 특이적인 CMVpp65 사량체로 염색하여 이들 PBMC가 기존의 pp65-특이적 CD8 T 세포를 갖고 있는지를 결정하였다. 이어서, PBMC를 5 x107개의 세포/mL의 밀도로 제조하고, CMV pp65(신호 1), CD86(신호 2), 막-결합 인터류킨-2(mbIL-2), 및/또는 막-결합 인터류킨-12(mbIL-12)(신호 3)를 암호화하는 mRNA와 합쳤다. 실온의 RPMI 배지에서, mRNA(들)가 존재하는 가운데, Cell Squeeze® 시스템 및 칩을 사용하여, 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 60 psi로 세포를 스퀴즈 가공하였다. 빈 페이로드로 스퀴즈 가공하고, 10 nM CMV pp65 펩티드를 스파이크한 세포, 및 1X PMA/이오노마이신으로 처리한 세포를 대조군으로서 사용하였다. 다음의 각 mRNA의 농도 및 혼합물을 시험하였다.
예를 들어, 샘플 H의 경우, 세포 현탁액 중 500 μL의 세포의 총 부피를 다음의 농도의 mRNA로 스퀴즈 가공하였다: 50 μg/mL의 pp65 mRNA(신호 1), 250 μg/mL의 CD86, 250 μg/mL의 mbIL-2 mRNA, 및/또는 250 μg/mL의 mbIL-12 mRNA. 각 샘플 내 세포를 RPMI+10% 인간 혈청 및 1 μM CpG 7909에 수집하고, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 원심분리에 의해 세척하고, RPMI+10% 소태아 혈청에 재현탁하고, 37℃에서 5일 동안 인큐베이션하였다.
1일차에, 각 샘플의 분획을 수집하여 유세포 계측법에 의한 mRNA 발현을 분석하였다. PBMC 구성 세포 조성물은 세포 특이적 마커(CD3, CD19, CD14, 및 CD56)에 대한 염색에 의해 정의되고, 각각의 RNA의 발현은 CD86, IL-2, 및 IL-12에 대한 염색에 의해 측정된다.
5일차에, 세포의 각 샘플 군을 12개의 웰에 도말하고, gogilstop 및 golgi plug가 존재하는 가운데, A1-제한 pp65 에피토프(YSEHPTFTSQY; 서열번호 91), B7-제한 pp65 에피토프(RPHERNGFTVL; 서열번호 89), 또는 B7-제한 pp65 에피토프(TPRVTGGGAM; 서열번호 90)로 각 샘플 군을 5시간 동안 재자극하였다.
그런 다음, CD3+ CD8+ 반응자 세포에서 IFN-γ, TNF-α, IL-2, 그랜자임 B, 및 PD-1의 발현에 대해 세포를 염색하였다.
세포를 유세포 계측법으로 분석하고 에피토프 특이적 세포를 IFNg 생산에 의해 식별하였다.
결과
도 27에 도시된 바와 같이, CD86, mbIL-2, 및 mbIL-12 MFI 발현을 1일차에 측정하였다. 이들 결과는 PBMC에 스퀴즈 로딩한 3개의 mRNA가 모두 성공적으로 번역되었음을 나타낸다.
CD86, mbIL-2, 및 mbIL-12의 발현도 PBMC 내 T 세포의 백분율로서 1일차에 측정하였다. 이들 결과는 총 T 세포의 75% 초과가 세포 내부에 스퀴즈 로딩된 mRNA를 성공적으로 번역하였음을 나타낸다.
도 28에 도시된 바와 같이, 막 결합 사이토카인 및/또는 공자극 분자와 함께 pp65가 로딩된 PBMC를 여러가지 상이한 일배체형에 대해 공동 전달할 때, HLA-*A01, HLA-*B07, 또는 HLA-*B07 반응자 T 세포를 각각 증식시키기 위한 각각의 재자극(YSE(A01), TPR(B07) 또는 RPH(B07))이 존재할 때 T 세포 활성화의 향상이 관찰된 것과 같이, T 세포 활성화가 향상되었다.
실시예 16
신호 2 및 신호 3 매개자의 공동 전달이 인플루엔자 M1 항원을 스퀴즈 로딩한 항원 제시 세포에 의한 T 세포 반응을 자극하는 능력을 향상시킬 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 신호 1, 신호 2, 및/또는 신호 3을 각각 매개하는 작동자를 암호화하는 상이한 mRNA를 인간 공여자 HLA-A*02+ PBMC에 스퀴즈 로딩하였다. ICS 및 사량체 분석을 통해 CD3+ CD8+ 세포의 활성화 및 활성을 측정하였다. 펩티드로 재자극한, 다양한 mRNA를 스퀴즈 로딩한 세포의 효과를 M1 펩티드와 함께 인큐베이션한 대조군 PBMC(펩티드 스파이크 대조군)의 효과와 비교하였다.
방법
인플루엔자 M1 + HLA-A*02+ 류코팩으로부터 단리한 인간 PBMC를 M1 사량체로 염색하여 이들 PBMC가 기존의 M1-특이적 CD8 T 세포를 갖고 있는지를 결정하였다. 이어서, PBMC를 4 x107개의 세포/mL의 밀도로 제조하고, 인플루엔자 M1(신호 1), CD86(신호 2), 및/또는 막-결합 인터류킨-12(mbIL-12)(신호 3)를 암호화하는 mRNA와 합쳤다. 실온의 RPMI 배지에서, 각각의 mRNA(들)가 존재하는 가운데, Cell Squeeze® 시스템 및 칩을 사용하여, 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 60 psi로 세포를 스퀴즈 가공하였다. 빈 페이로드로 스퀴즈 가공하고 100 nM 인플루엔자 M1 펩티드로 스파이크한 PBMC를 대조군으로서 사용하였다. 다음의 각 mRNA의 농도 및 혼합물을 시험하였다.
예를 들어, 샘플 G의 경우, 세포 현탁액 중 200 μL의 세포의 총 부피를 다음의 농도의 mRNA로 스퀴즈 가공하였다: 50 μg/mL의 인플루엔자 M1 mRNA, 250 μg/mL의 CD86 mRNA, 및/또는 250 μg/mL의 mbIL-12 mRNA.
스퀴즈 가공 후, 스퀴즈 로딩된 PBMC를 RPMI + 10% 소태아 혈청에 옮기고 37℃에서 5일 동안 인큐베이션하였다.
배양 마지막 날에, 생성된 세포를 1 μM 인플루엔자 M1 펩티드로 재자극하고, 이들의 활성화 및 활성을 ICS를 통해 측정하였다. TNF-α, IFN-γ, IL-2, PD-1, 및 그랜자임 B를 CD3+ CD8+ 반응자 세포에서 평가하였다. 추가로, GILGFVFTL 펩티드(58-66 aa; 서열번호 92)에 특이적인 인플루엔자 M1 사량체에 대해 세포를 염색하였다.
결과
세포내 염색에 의해 나타난 것과 같이, 각각의 mRNA의 스퀴징 매개 전달 후 24시간 차에, CD86 mRNA, mbIL-2 mRNA, 및 mbIL-12 mRNA(도 29)가 성공적으로 번역되었다.
도 30은 1 μM의 항원 재자극과 결합했을 때, 인플루엔자 M1 mRNA를 스퀴즈 로딩한 PBMC의 농도가 항원 특이적 T 세포의 활성화에 미치는 효과를 보여준다. 도 31에 도시된 바와 같이, 3가지 농도의 인플루엔자 M1 각각을 스퀴즈 로딩한 PBMC에 대해 항원 특이적 T 세포의 활성화를 관찰하였다. 도 30 및 31은 인플루엔자 M1 mRNA가 CD86 mRNA 및 mbIL-12 mRNA와 공동 전달되었을 때, CD3+CD8+ 반응자 세포 내에서 IFNγ + CD45RO+ 집단의 백분율이 더 높음을 보여준다.
도 32에 도시된 바와 같이, CD86 및 mbIL-2 또는 mbIL-12 mRNA의 스퀴징을 합친 경우, 사량체-양성 CD8 T 세포에 의해 측정했을 때 인플루엔자 M1 CD8 T 세포가 유의하게 증식하였다. 또한, mbIL-12가 존재할 때 이들 세포의 항원 비의존적 증식은 없었다. 반면, mbIL-2 mRNA는 이들 세포의 일부 항원 비의존적 증식을 초래하였다.
다기능성 마커의 경우, 그랜자임 B 발현이 증가하였고, IFNg, IL-2, 및 TNFa 사이토카인이 상향조절되었는데, 이는 더 높은 다기능성을 시사한다. 이들은 PBMC에 신호 2 및 3 mRNA가 존재할 때 항원 단독(즉, M1 mRNA 단독)과 비교하여 추가로 상향 조절되었다(데이터 미도시).
실시예 17
HPV16 E6을 암호화하는 mRNA를 스퀴즈 로딩한, 특이적 HLA 일배체형의 면역 세포가 항원 특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 인간 공여자 HLA-B*07+ PBMC에 E6 mRNA를 스퀴즈 로딩하였다. E6 mRNA가 로딩된 PBMC가 HLA-B*07-제한 E6 특이적 T 반응자 세포를 자극하는 능력은 IFN-γ ELISpot 검정을 사용하여 측정하였다. E6 mRNA를 스퀴즈 로딩한 PBMC의 효과를 비처리 대조군 및 모의-스퀴즈 로딩한(빈) 대조군의 효과와 비교하였다.
방법
E615-24 특이적 T 세포를 생성하기 위해, HLA-B*07 유전자 이식 마우스에게 E615-24 펩티드, B형 간염 바이러스 코어 펩티드(TPPAYRPPNAPIL; 서열번호 93), 및 불완전한 Freund 보조제의 유화액을 2주 간격으로 3회(프라임/부스트/부스트) 백신 접종을 2회 수행하였다. 마지막 백신을 접종하고 1주 후에, 마우스를 안락사시키고, 비장 및 배액 림프절을 추출하였다. 조직 추출물을 단일 세포 현탁액으로 해리시켰다. 그런 다음, E615-24 펩티드 및 IL-2의 존재 하에 세포를 37℃에서 6일 동안 배양하였다. 6일이 지난 후, PBMC와 함께 공동 배양하는 날까지 세포를 동결보존하였다.
HLA-B*07+ 공여자 유래의 인간 PBMC를 5 x 107개의 세포/mL의 밀도로 제조하고 0.5 mg/ml의 E6 mRNA와 합쳤다. 실온의 RPMI 배지에서, E6 mRNA가 존재하는 가운데, Cell Squeeze® 시스템 및 칩을 사용하여, 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 세포를 60 psi로 PBMC를 스퀴즈 가공하였다. 미처리 PBMC(미 접촉) 및 E6 mRNA가 부재한 가운데 스퀴즈 가공한 PBMC(빈 스퀴즈)를 음성 대조군으로서 사용하였다.
스퀴즈 가공 후, 스퀴즈 로딩한 PMBC를 1 μM CpG ODN 2006이 포함된 RPMI + 10% 인간 혈청으로 옮기고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 스퀴즈 로딩된 PBMC를 CTL 배지 + 1% L-글루타민으로 2회 세척한 후 CTL 배지 + 1% L-글루타민에 재현탁하였다.
5 x 104개의 E6 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC(E6 mRNA), 미처리 PBMC(미 접촉), 모의 스퀴즈 로딩된 PBMC(빈 스퀴즈), 또는 1 mM E615-24 펩티드를 스파이크한 미 접촉 PBMC(양성 대조군)를 96-웰 INF-γ ELISpot 플레이트 내 공동 배양물에 5 x 105개의 E615-24 반응자 T 세포(HLA-B*07 유전자 이식 마우스에서 생성됨)와 함께 넣었다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, 제조사의 지침에 따라 현상하였다.
결과
도 34에 도시된 바와 같이, ELISPOT 검정에서 IFN-γ 스팟 형성 단위(SFU)(도 35) 및 IFN-γ 평균 스팟 크기(도 36) 모두의 증가에 의해 나타낸 것과 같이, E6 mRNA가 스퀴즈 로딩된 HLA-B*07+ 인간 PBMC는 공동 배양 후 HLA-B*07 E615-24 특이적 T 세포에서의 HLA-γ 반응을 증가시켰다. HLA-B*07 E615-24 특이적 T 세포에서의 이들 IFN-γ 반응은 미 접촉 대조군 및 빈 스퀴즈 대조군과 비교하여 E6 mRNA가 로딩된 PBMC에서 유의하게 증가하였다. 이들 결과는 E6 mRNA가 스퀴즈 로딩된 HLA-B*07+ PBMC가 E615-24 에피토프를 처리하고 제시하여 HLA-B*07-제한 E6 특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있음을 입증한다.
실시예 18
E7 mRNA가 스퀴즈 로딩된 면역 세포가 항원 특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있는 시간의 길이를 결정하기 위해, 인간 공여자 HLA-A*02+ PBMC에 E7 mRNA를 스퀴즈 로딩하고 다양한 길이의 시간 동안 인큐베이션한 후, E7 특이적 T 세포를 자극하는 능력을 IFN-γ ELISA에 의해 평가하였다.
방법
HLA-A*02+ 공여자 유래의 인간 PBMC를 5 Х 107/mL의 밀도로 제조하고, RPMI 1640 배지에서, Cell Squeeze® 시스템 및 칩을 사용하여 (i) 0.5 mg/ml의 E7 mRNA, (ii) 0.5 mg/ml E6 mRNA, (iii) 0.5 mg/ml E7 mRNA 및 0.25 mg/ml E6 mRNA, (iv) E7.6 합성 긴 펩티드(SLP)를 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 60 psi로 스퀴즈 로딩하거나, 또는 (v) 첨가물 없이(빈 스퀴즈) 스퀴즈 로딩하였다. 스퀴즈 가공 후, 스퀴즈 로딩한 PMBC를 1 μM CpG ODN 2006이 포함된 RPMI + 10% 인간 혈청으로 옮기고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 스퀴즈 로딩된 PBMC를 공동 배양 배지(X-VIVO 15 + 5% 인간 혈청)에서 2회 세척한 후, 신선한 공동 배양 배지에 재현탁하였다. 세포의 일부를 E711-20 반응자 T 세포(Cellero)와의 즉각적인 공동-배양을 위해 위해 따로 두고, 나머지 세포는 동결보존하였다.
그런 다음, 3 Х 105개의 스퀴즈 로딩된 PBMC를 96-웰 플레이트에서 3 Х 104개의 HLA-A*02+ E711-20 반응자 T 세포(Cellero)와 함께 공동 배양하였다. 96-웰 플레이트에서, 양성 대조군으로서 0.1 μM의 E711-20 펩티드를 미처리 PBMC 및 반응자 세포에 직접 첨가하였다. 37℃에서 18시간 동안 공동 배양한 후, 공동 배양 상청액을 수확하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 IFNγ ELISA를 수행하여 각 샘플에 대한 배양 상청액 중 IFNγ의 농도를 결정하였다.
동결 보존된 스퀴즈 로딩된 PBMC를 해동하고 배양물에 8, 4, 또는 0시간 동안 방치한 후, E711-20 반응자 T 세포를 첨가하였다. 배양물에서 8, 4, 또는 0시간 방치한 후, 3 Х 105개의 스퀴즈 로딩된 PBMC를 96-웰 플레이트에서 3 Х 104개의 HLA-A*02+ E711-20 반응자 T 세포(Cellero)와 함께 공동 배양하였다. 37℃에서 18시간 동안 공동 배양한 후, 공동 배양 상청액을 수확하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 IFNγ ELISA를 수행하여 각 샘플에 대한 배양 상청액 중 IFNγ의 농도를 결정하였다.
결과
도 38a 및 39a에 도시된 바와 같이, E7 mRNA가 스퀴즈 로딩된 인간 PBMC는, E7 mRNA의 스퀴즈 로딩 직후에 공동 배양한 후, E711-20 반응자 T 세포로부터 IFN-γ 생산에 의해 측정했을 때, 면역 반응을 유도할 수 있다. 도 38b 및 39b에 도시된 바와 같이, E7 mRNA가 스퀴즈 로딩된 인간 PBMC는, E711-20 반응자 T 세포로부터의 IFN-γ 생산에 의해 측정했을 때, 스퀴즈 로딩 후 적어도 최대 8시간 동안 면역 반응을 유도할 수 있다. 이들 결과는 E7 mRNA가 스퀴즈 로딩된 HLA-A*02+ 인간 PBMC가 스퀴즈 가공 후 적어도 8시간 동안 E7 특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있음을 입증한다.
실시예 19
E6 mRNA가 스퀴즈 로딩된 면역 세포가 E6 특이적 면역 반응을 유도할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 인간 공여자 HLA-A*02+ PBMC에 E6 mRNA를 스퀴즈 로딩하고, E629-38 TCR 저캇-루시아 NFAT 리포터 세포를 자극하는 능력을 발광에 의해 평가하였다.
방법
E6 TCR 저컷-루시아 NFAT 리포터 세포는, E629-38 TCR 발현 렌티바이러스를 내인성 TCRα/β가 녹아웃된 저캇-루시아 NFAT 세포(InvivoGen) 내로 형질도입함으로써 생성하였다. 이들 세포는 동족 E629-38 에피토프와 결합된 MHC-I(HLA-A*02 제한)과 E629-38 TCR의 결합을 통해 활성화될 수 있는 통합된 NFAT-유도성 루시아 리포터를 갖는다.
HLA-A*02+ 공여자 유래의 인간 PBMC를 4 Х 107/mL의 밀도로 제조하고, 실온의 RPMI 1640 배지에서, (i) 500 μg/ml E6 mRNA 및 500 μg/ml E7 mRNA, (ii) CD86, 막-결합 IL-2(mbIL-2), 및 막-결합 IL-12(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA, (iii) E6 및 E7 mRNA, 및 CD86, mbIL-2, 및 mbIL-12를 암호화하는 mRNA, (iv) E6 및 E7 SLP를 3.5 μm 폭, 10 μm 길이, 및 70 μm 깊이를 가진 협착부를 통해 60 psi로 스퀴즈 가공하거나, (v) 첨가물이 없이(빈 스퀴즈) 스퀴즈 가공하였다. 스퀴즈 가공 후, 스퀴즈 로딩한 PMBC를 1 μM CpG ODN 2006이 포함된 RPMI + 10% 인간 혈청으로 옮기고 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 스퀴즈 로딩된 PBMC를 공동 배양 배지(X-VIVO 15 + 5% 인간 혈청)에서 2회 세척한 후, 신선한 공동 배양 배지에 재현탁하였다.
그런 다음, 4 Х 105개의 스퀴즈 로딩된 PBMC를 96-웰 플레이트 내 공동 배양물에 1 Х 105개의 E629-38 TCR 저캇-루시아 NFAT 세포와 함께 넣었다. 96-웰 플레이트에서, 양성 대조군으로서 1 μM의 E629-38 에피토프를 미처리 PBMC 및 E629-38 TCR 저캇-루시아 NFAT 세포에 직접 첨가하였다. 37℃에서 16~18시간 동안 공동 배양물을 인큐베이션한 후, 공동 배양물 상청액을 수확하였다. 배양물 상청액을 대상으로 제조사의 프로토콜에 따라 QUANTI-Luc Gold 검정(InvivoGen)을 수행하여, NFAT-유도성 루시아 리포터의 활성화로 인한 발광을 통해 루시아 루시퍼라아제를 측정하였다.
결과
도 40, 41a, 및 41b에 도시된 바와 같이, E6 mRNA를 스퀴즈 로딩하고, E629-38 TCR 저캇-루시아 NFAT 리포터 세포와 공동 배양한 인간 PBMC는 빈 스퀴즈 대조군과 비교하여 NFAT 활성화 및 발광을 증가시켰다. 결과는 E6 mRNA가 스퀴즈 로딩된 HLA-A*02+ 인간 PBMC가 E629-38 면역 반응을 유도할 수 있음을 입증한다.
실시예 20
본 연구에서는, HPV16 항원 및 신호 2/3 매개자를 암호화하는 mRNA를 스퀴즈 로딩한 자가 PBMC(SQZ-eAPC-HPV 세포)와의 공동 배양 후, E711-19 TCR- 또는 E629-38 TCR-형질도입 CD8 T 세포의 증식을 평가하였다.
방법
HLA-A*02+ 류코팩으로부터 인간 PBMC를 단리하였다. 0일차에 음성 선택을 통해 CD8+ T 세포를 단리하였다. 100 IU/mL의 IL-2가 보충된 R10(RPMI 1640 + 10% 소태아 혈청 + 100 U/mL 페니실린 + 100 μg/mL 스트렙토마이신)의 배지(R10+IL-2)를 제조하였다. T 세포를 실온에서 5분 동안 500 rcf로 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고, 세포를 R10+IL-2에 2 x 106개의 세포/mL의 세포 농도로 재현탁하였다. R10+IL-2에서 항-CD3/CD28 Dynabead를 세척하고, 2 x 106개의 Dynabead/ml의 비드 농도로 재현탁하였다. 3 mL의 T 세포 및 3 mL의 Dynabead를 플라스크에 합치되, 1 x 106개의 세포/mL와 동등한 최종 세포 및 Dynabead 농도로 합치고, 37℃, 5% CO2 하의 인큐베이터에 2일 동안 두었다.
2일차에, CD8+ T 세포를 E711-19 TCR- 또는 E629-38 TCR-발현 렌티바이러스 중 어느 하나를 형질도입하였다. X-VIVO 15 + 5% 인간 혈청 + 300 IU/ml IL-2를 포함하는 40 mL T 세포 배지를 제조하였다. CD8+ T 세포를 수확하고 T 세포 배지에 1 x 106개의 세포/mL로 재현탁하였다. 24-웰 플레이트에서, 500 μL의 CD8+ T 세포를 50 μL의 LentiBOOST 및 84.7 μL의 E7 TCR 렌티바이러스(1 x 107 TU) 또는 49.5 μL의 E6 TCR 렌티바이러스(1 x 107 TU)와 합쳤다. T 세포 배지를 형질도입물 각각에 첨가하여 총 1 mL의 부피를 만들었다. 32℃에서 2,000 rcf로 2시간 동안 원심분리하여 세포를 분취하였다. 플레이트를 37℃, 5% CO2의 인큐베이터에 밤새 넣어두었다. 제1 렌티바이러스 형질도입과 동일한 프로토콜을 따라 제2 렌티바이러스 형질도입을 3일차에 수행하였다.
4일차에, 렌티바이러스를 제거하고, T 세포를 R10 + 300 IU/mL IL-2에서 1x106개의 세포/mL로 4일 동안 배양하였다. 7일차에, E711-19 오량체 및 E629-38 사량체 염색을 수행하여 E6 또는 E7 TCR을 발현하는 세포의 백분율을 결정하였다(도 42a 참조). 신선한 R10 배지를 또한 첨가하여 세포 농도를 1x106개의 세포/mL로 되돌렸다.
그런 다음, E7- 또는 E6-TCR 형질도입된 T 세포를, E6 및 E7을 암호화하는 mRNA, 및/또는 신호 2 mRNA(CD86 mRNA)/신호 3 mRNA(mbIL-2, 및 mbIL-12 mRNA)를 스퀴즈 로딩한 자가 PBMC와 함께 0.1% 오량체/사량체+ T 세포의 농도로 총 6일 동안 공동 배양하였다.
8일차에, 동일한 공여자 유래의 PBMC를 해동하고, 아래의 일정에 따라 4개의 스퀴즈 로딩된 자까 PBMC 군을 제조하였다. 구체적으로, 실온의 RPMI 배지에서 미세유체 협착부(10 μm 깊이, 3.5 μm 폭, 및 70 μm 길이)를 사용하여 60 psi로 PBMC를 스퀴즈 가공하였다.
그런 다음, E7- 또는 E6-TCR 형질도입된 T 세포를, E6 및 E7을 mRNA, 및/또는 신호 2 매개자 mRNA(CD86 mRNA)/신호 3 매개자 mRNA(mbIL-2 및 mbIL-12 mRNA)를 스퀴즈 로딩한 자가 PBMC와 함께 일정한 세포 농도로 공동 배양하였다. 96-웰 플레이트 내에 공동 배양물을 2 x 105개의 총 세포로 도말하되; 5 x 104개의 세포는 스퀴즈 가공한 PBMC였고, 나머지 1.5 x 105개의 세포는 0.1% E6 또는 E7 TCR 발현 T 세포 및 미가공된 자가 PBMC의 조합이었다. 공동 배양물을 37℃, 5% CO2에서 6일 동안 인큐베이션하였다.
14일차에(공동 배양 개시 후 6일차), E711-19 오량체 염색 및 E629-38 사량체 염색을 수행했을 뿐만 아니라 세포내 사이토카인 염색(ICS)도 수행하였다. ICS의 경우, GolgiPlug 및 GolgiStop이 존재하는 가운데 먼저 E711-19 또는 E629-38 최소 에피토프로 세포를 6시간 동안 재자극하였다. 그런 다음, IFNγ, TFNα, IL-2의 발현에 대해 세포를 염색하였다.
결과
도 42d 내지 42i에 도시된 바와 같이, 공동 배양 환경(E7 TCR T 세포 또는 E6 TCR T 세포) 둘 다에 대해, E6+E7 mRNA만을 스퀴즈 로딩했거나 신호 2/3 mRNA만을 스퀴즈 로딩한 PBMC와의 공동 배양물과 비교해, E6, E7, CD86, mbIL-2, 및 mbIL-12 mRNA(E6+E7+신호 2/3 mRNA)를 스퀴즈 로딩한 PBMC와의 공동 배양물에서 가장 높은 백분율의 IFNγ-, TNF-α-, 또는 IL-2-생산 T 세포가 관찰되었다. 도 42b 및 42c에 도시된 바와 같이, E7 오량체 및 E6 사량체 염색을 통해서도 ICS 결과를 확인하였는데, 여기서 E6+E7 mRNA만을 스퀴즈 로딩했거나 신호2/3 mRNA만을 스퀴즈 로딩한 PBMC와의 공동 배양물과 비교했을 때, E6+E7+신호 2/3 mRNA를 스퀴즈 로딩한 PBMC와의 공동 배양물에서 E6 사량체+ 또는 E7 오량체+ T 세포의 가장 높은 증식이 관찰되었다.
이들 결과는, 항원을 암호화하는 mRNA만을 스퀴즈 로딩했거나 신호 2/3 매개자를 암호화하는 mRNA만을 스퀴즈 로딩한 PBMC와 비교했을 때, HPV16 E6 및 E7 항원 및 신호 2/3 매개자를 암호화하는 mRNA가 스퀴즈 로딩된 PBMC가 T 세포 활성화 및 증식을 더 강하게 자극했음을 나타낸다.
실시예 21
본 연구에서는 CMV 항원 및 신호 2/3 매개자를 암호화하는 mRNA를 스퀴즈 로딩한 인간 PBMC(SQZ--eAPC-CMV 세포)로 면역화한 NSG-(KbDb)null (IA)null 마우스(NSG MHC-I/II DKO 마우스)에서 pp65 특이적 인간 CD8+ T 세포의 활성화 및 증식을 평가하였다.
방법
HLA-A*02+ 류코팩으로부터 단리한, 동결보존된 인간 PBMC를 본 연구에 사용하기 위해 해동하였다. 0일 차에, HLA-A*02+ CMV+ 동결보존된 PBMC의 바이알 8개를 수조에서 해동하였다. 세포를 담긴 바이알을 실온에서 10분 동안 200rcf로 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고, 세포를 R10(RPMI 1640 + 10% 소태아 혈청 + 100 U/mL 페니실린 + 100 μg/mL 스트렙토마이신)에 약 1 x 107개의 세포/mL의 세포 농도로 재현탁하였다. 세포를 37℃에서 1시간 동안 방치한 후, 세포를 실온에서 5분 동안 500rcf로 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고 세포를 25mL의 PBS에 재현탁하였다. 세포를 실온에서 5분 동안 500 rcf로 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고, 세포를 PBS에 1 x 108개의 세포/mL의 최종 세포 농도로 재현탁하였다.
스퀴즈 로딩된 PBMC의 2개의 군을 하기에 따라 제조하였다:
실온의 RPMI 배지에서 미세유체 협착부(10 μm 깊이, 3.5 μm 폭, 및 70 μm 길이)를 사용하여 60 psi로 PBMC를 스퀴즈 가공하였다. 구체적으로, PBMC를 (1) pp65를 암호화하는 500 μg/mL의 mRNA(pp65만)로 스퀴즈 가공하거나, (2) pp65를 암호화하는 500 μg/mL의 mRNA, 및 250 μg/mL의 다음 각각으로 스퀴즈 가공하였다: 신호 2 매개자(CD86)을 암호화하는 mRNA, 신호 3 매개자(mbIL-2)를 암호화하는 mRNA, 및 또 다른 신호 3 매개자(mbIL-12)를 암호화하는 mRNA(eAPC-CMV, 또는 eAPC-pp65).
스퀴즈 가공한 세포의 2개의 군을 아래의 일정에 따라 2개의 투여 하위군으로 각각 나누었다. 군 A(제5 군)는 미 가공(미 접촉) 세포를 포함하는 대조군을 나타냈다.
표 8에 나타낸 바와 같이, 프라이밍을 위해(0일 차), 0일차 아침에 모든 군을 대상으로 5마리의 마우스/군에게 표시된 양의 미 가공 PBMC(미 접촉 PBMC)를 안구 뒤에(R.O.) 주입하고, 0일차 오후에 B~E군을 대상으로 5마리의 마우스/군에게 표시된 양의 스퀴즈 가공한 PBMC를 각각 R.O. 주입하였다.
7일차에, PBMC를 해동하고, 전술한 유사한 절차에 따라 스퀴즈 가공하고, 부스트 투여를 위해 가공된 PBMC의 2개의 군(eAPC-CMV, pp65 단독)을 위의 표 7에 따른 농도로 제조하였다.
표 8에 나타낸 바와 같이, 부스팅을 위해(7일 차), 군 A를 대상으로는 5마리의 마우스/군에게 표시된 양의 미 가공 PBMC(미 접촉 PBMC)를 R.O. 주입하거나, 군 B~E를 대상으로는 표시된 양의 가공된 PBMC를 R.O. 주입하였다.
12일차에, 마우스로부터 턱밑 혈액 채취(SMB) 출혈에 의해 혈액을 채취하여 멸균 EDTA 진공 용기에 넣었다. FACS 완충액 중에서, HLA-A*02 pp65 사량체(NLVPMVATV; 서열번호 88)를 다음 비율로 사용하여 표면 염색을 2회 수행하였다:
-
마우스 FcR 블록의 1:25 희석물
-
항체의 1:100 희석물
-
HLA-A*02 pp65 사량체(NLVPMVATV; 서열번호 88)의 1:20 희석물
구체적으로, 100 μL의 전혈 및 100 μL의 2x 표면 염색물을 14 ml FACS 튜브에 첨가하고, 실온의 암소에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 2 mL의 1x BD™ FACS 용해액(diH2O로 1:10 희석함)을 각 튜브에 첨가하였다. 그런 다음, 튜브를 부드럽게 와동시키고 실온의 암소에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, T 세포를 실온에서 5분 동안 400 rcf로 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고 세포를 0.2 mL의 FACS 완충액에 재현탁하였다. 세포를 실온에서 4분 동안 500 rcf로 다시 원심분리하였다. 상청액을 덜어 내서 0.2 mL의 FACS 완충액에 재현탁하였다. 전술한 바와 같이, 시약으로 pp65 사량체 염색을 수행하였다.
14일차에, 마우스를 희생시키고, 말단 출혈에 의해 혈액을 채취하고, 비장을 채취하였다. 세포내 사이토카인 염색(ICS)과 마찬가지로, 수집된 샘플로 pp65 사량체 염색을 수행하였다. 비장을 1mL의 R10 배지가 담긴 튜브에 수집하였다. 50mL 원뿔형 튜브를 이용해 개별 비장을 40 um 세포 여과기 위에 놓았다. 주사기의 플런저를 사용해 여과기를 통해 비장을 가압하였다. 생성된 물질을 차가운 FACS 단리 완충액으로 여과기를 통해 세척하였다. 그런 다음, 각각의 튜브에 최대 15 mL의 FACS 단리 완충액을 채웠다. T 세포를 실온에서 5분 동안 500 rcf로 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고 세포를 0.5 mL의 R10 배지에 재현탁하였다.
염색에 앞서, pp65 사량체를 4℃에서 5분 동안 14000 rcf로 원심분리하였다. 2 x 107개의 세포/mL 농도의 100 μL의 세포를 96-웰 V-바닥 플레이트에 옮겼다. 플레이트를 실온에서 4분 동안 500 rcf로 원심분리하였다. 상청액을 덜어내고, 세포를 200 μL의 PBS로 세척하였다. 상청액을 덜어내고, , PBS에 희석된(1:1000) 50 μL의 Live/Dead Near IR이 포함된 Live/Dead Fixable Near IR 죽은 세포 염색 키트(Dead Cell Stain Kit)를 사용하여 세포를 재현탁하였다. 세포를 실온의 암소에서 10분 동안 인큐베이션하였다. pp65 사량체와 FcR 블록 혼합물의 혼합물을 FACS 완충액에서 각각 1:25 희석물로 제조하였다. 유사하게, FcR 블록 단독 혼합물을 FACS 완충액에서 1:25 희석물로 제조하고, 형광 마이너스 원(fluorescence minus one; FMO) 대조군으로 사용하였다. 세포를 암소에서 30분 동안 인큐베이션하였다. FACS 완충액에서 아래 열거된 항체 각각에 대해 1:75 희석 비율로 항체 표면 염색 혼합물을 제조하였다:
항-마우스 CD45
항-인간 CD45
항-인간 CD3
항-인간 CD8
항-인간 CD45RO
50 μL의 표면 염색 혼합물을 세포 현탁액에 첨가하고, 실온의 암소에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 50 μL의 FACS 완충액을 각 웰에 첨가하였다. 세포를 실온에서 4분 동안 500 rcf로 원심분리하였다. 상청액을 덜어내고, 세포를 200 μL의 FACS 완충액으로 세척하였다. 세포를 실온에서 4분 동안 500 rcf로 원심분리하였다. 상청액을 덜어내고, 세포를 200 μL의 FACS 완충액에 재현탁하였다. 150 μL의 샘플을 100 μL/분의 속도로 Attune NxT 유세포 분석기 상에 흘렸다.
ICS를 위해, 세포를 (1) 재자극하지 않거나; (2) pp65 최소 에피토프로 재자극하거나; (3) GolgiPlug™ 및 GolgiStop™이 존재하는 가운데, 37℃, 5% CO2에서 1 μM의 PMA/이오노마이신으로 6시간 동안 재자극하였다. 총 6시간의 재자극 후, 세포를 96-웰 V-바닥 플레이트로 옮겼다. 세포를 실온에서 4분 동안 500 rcf로 원심분리하였다. 상청액을 덜어내고, 세포를 200 μL의 PBS와 함께 재현탁하였다. 세포를 실온에서 4분 동안 500 rcf로 원심분리하였다. PBS에서, PBS에 희석된(1:1000) Live/Dead Near IR을 제조하였다. Golgiplug™ (1:500) 및 Golgistop™ (1:750)을 첨가하였다. 상청액을 덜어내고, 세포를 PBS에 희석된(1:1000) 50 μL의 Live/Dead Near IR 및 Golgiplug™과 Golgistop™ 혼합물에 재현탁하였다. 세포를 실온의 암소에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
인간 FcR 블록(1:50 희석) 및 Golgiplug™(1:500) 및 Golgistop™(1:750)을 사용해 아래에 열거된 항체 각각에 대한 항체 표면 염색 혼합물을 1:100 희석 비율로 제조하였다:
항-마우스 CD45
항-인간 CD45
항-인간 CD3
항-인간 CD8
항-인간 CD45RO
PBS에서 희석한(1:1000) Live/Dead Near IR 염색에 추가하여 50 μL의 표면 항체 염색을 첨가하였다. 세포를 실온의 암소에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 100 μL의 FACS 완충액을 첨가하고, 세포를 실온에서 4분 동안 500 rcf로 원심분리하였다. 세포를 200 μL의 FACS 완충액으로 세척하고, 실온에서 4분 동안 500 rcf로 원심분리하였다. 상청액을 덜어내고, 세포를 100 μL의 BD CytoFix/CytoPerm™ 고정 및 투과화 용액에 재현탁하였다. 세포를 4℃의 암소에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 100 μL의 1x 투과화/세척 완충액을 첨가하였다. 세포를 실온에서 4분 동안 500 rcf로 원심분리하였다. 상청액을 덜어내고, 세포를 200 μL의 1x 투과화/세척 완충액에 재현탁하였다. 세포를 실온에서 4분 동안 500 rcf로 원심분리하였다. 상청액을 덜어내고, 세포를 200 μL의 1x BD™ 투과화/세척 완충액에 재현탁하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
그런 다음, 다음 날 IFNγ, TFNα, IL-2의 발현에 대해 세포를 염색하였다. 세포를 실온에서 4분 동안 500 rcf로 원심분리하였다. 1x 투과화/세척 완충액에서 항-IFNγ, 항-TFNα, 또는 항-IL-2에 대한 항체 표면 염색 혼합물을 1:100의 희석 비율로 제조하였다. 세포를 50 μL의 항체 염색 혼합물에 재현탁하였다. 세포를 4℃의 암소에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 150 μL의 1x 투과화/세척 완충액을 첨가하고, 세포를 실온에서 4분 동안 500 rcf로 다시 원심분리하였다. 세포를 200 μL의 FACS 완충액에 재현탁하였다. 150 μL의 샘플을 100 μL/분의 유속으로 Attune NxT 유세포 분석기 상에 흘렸다.
결과
도 43a, 43b, 43c, 43d, 43e에 도시된 바와 같이, 미 가공 PBMC(미 접촉)로 면역화한 마우스와 비교하여, eAPC-CMV 세포(pp65 및 신호2/신호3 매개자를 암호화하는 mRNA를 스퀴즈 로딩한 PBMC)로 면역화한 마우스에서 pp65 항원 특이적 T 세포가 유의하게 증가하였다. 도 43e에 도시된 바와 같이, 1 x 106개 대 5 x 106개의 eAPC-CMV 세포로 면역화한 NSG MHC-I/II DKO 마우스와 비교했을 때, pp65 사량체+ T 세포의 백분율이 투여량 의존적으로 증가하였다. pp65 최소 에피토프의 풀로 재자극한 후 TNF-α 및 IFNγ 생산 T 세포의 백분율을 측정할 때 유사한 투여량 의존성이 관찰된다(도 43h 및 43k). 또한, 5 x 106개의 pp65 mRNA 단독 세포(pp65를 암호화하는 mRNA만 스퀴즈 로딩한 PBMC)로 면역화한 마우스와 비교했을 때, 5 x106개의 eAPC-CMV 세포로 면역화한 마우스는 더 높은 백분율의 pp65 사량체+ 세포를 갖는 경향이 있었을 뿐만 아니라(도 43a, 43c, 43d) 더 높은 백분율의 TNF-생산 T 세포 및 IFNγ-생산 T 세포를 갖는 경향도 있었다(도 43f, 43g, 43i, 43j). 전반적으로, 이러한 데이터는 pp65, CD86, mbIL-2, 및 mbIL-12를 암호화하는 mRNA를 스퀴즈 로딩한 인간 PBMC가 생체내 인간화 마우스 모델에서 항원 특이적 T 세포를 자극하고 증식시킬 수 있음을 입증한다.
서열 목록
SEQUENCE LISTING
<110> SQZ BIOTECHNOLOGIES COMPANY
<120> METHODS TO STIMULATE HLA-AGNOSTIC IMMUNE RESPONSES TO PROTEINS
USING NUCLEATED CELLS
<130> 75032-20029.40
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 63/147,473
<151> 2021-02-09
<150> US 63/073,910
<151> 2020-09-02
<160> 93
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr
1 5 10
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<212> PRT
<213> Mus musculus
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Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Thr
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<210> 6
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr
1 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 7
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg
1 5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg
1 5 10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu
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<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 10
Gly Gln Ala Glu Pro Asp
1 5
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<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe
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<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 13
Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
1 5
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> Mus musculus
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Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Ser Asp Lys
1 5 10 15
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu
1 5 10 15
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 16
Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His
1 5 10 15
Val Asp Ile Arg
20
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 17
Ser Ser Lys Ser Asp Ser Thr Leu Arg Leu Ser Val Gln Ser Thr His
1 5 10 15
Val Asp Ile Arg
20
<210> 18
<211> 36
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile
1 5 10 15
Leu Glu Cys Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr
20 25 30
Asp Phe Ala Phe
35
<210> 19
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu
1 5 10 15
Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
20 25
<210> 20
<211> 25
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 20
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp
1 5 10 15
Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
20 25
<210> 21
<211> 35
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 21
Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala
1 5 10 15
Phe Arg Asp Leu Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val
20 25 30
Ser Asp Lys
35
<210> 22
<211> 35
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu
35
<210> 23
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu
1 5 10 15
Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
20 25
<210> 24
<211> 35
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 24
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
1 5 10 15
Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35
<210> 25
<211> 35
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 25
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Ser
1 5 10 15
Ser Lys Ser Asp Ser Thr Leu Arg Leu Ser Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 26
ggggtcaacg ttgagggggg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 27
gggggacgat cgtcgggggg 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 28
ggggacgacg tcgtgggggg g 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 29
tccatgacgt tcctgatgct 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 30
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 31
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 32
tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 33
tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 34
tcgcgacgtt cgcccgacgt tcggta 26
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 35
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 36
tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 37
tcgcgaacgt tcgccgcgtt cgaacgcgg 29
<210> 38
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 38
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu
35
<210> 39
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 39
Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu
1 5 10 15
Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn
20 25 30
Ile Val Thr
35
<210> 40
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 40
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
1 5 10 15
Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35
<210> 41
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 41
Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser
20 25 30
Gln Lys Pro
35
<210> 42
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 42
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
<210> 43
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 43
Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile
1 5 10 15
Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr
20 25 30
<210> 44
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 44
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp
1 5 10 15
Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
20 25
<210> 45
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 45
Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys
1 5 10 15
Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
20 25
<210> 46
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 46
Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr
1 5 10 15
Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
20 25
<210> 47
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 47
His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn
1 5 10 15
Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg
20 25
<210> 48
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 48
Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu
1 5 10 15
Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys
20 25 30
<210> 49
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 49
Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg
1 5 10 15
His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr
20 25 30
<210> 50
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 50
Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg
1 5 10 15
Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
20 25 30
<210> 51
<211> 158
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 51
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu
35 40 45
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly
50 55 60
Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
65 70 75 80
Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu
85 90 95
Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn
100 105 110
Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys
115 120 125
Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met
130 135 140
Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
145 150 155
<210> 52
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 52
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210> 53
<211> 108
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 53
Met Arg Thr Ala Leu Gly Asp Ile Gly Asn Met His Gly Asp Thr Pro
1 5 10 15
Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu
20 25 30
Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile
35 40 45
Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile
50 55 60
Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln
65 70 75 80
Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
85 90 95
Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro
100 105
<210> 54
<211> 179
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 54
Met Arg Val Thr Ala Pro Arg Thr Leu Ile Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser Met His Gly Asp Thr Pro
20 25 30
Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu
35 40 45
Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile
50 55 60
Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile
65 70 75 80
Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln
85 90 95
Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
100 105 110
Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Ile Val Gly Ile
115 120 125
Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val Val Val Ile Gly Ala Val Val
130 135 140
Ala Thr Val Met Cys Arg Arg Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser
145 150 155 160
Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser
165 170 175
Leu Thr Ala
<210> 55
<211> 98
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 55
Met His Gly Asp Ala Pro Ala Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210> 56
<211> 127
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 56
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro Lys Glu Lys Glu Lys Asn Lys Leu Lys Arg Lys Lys Leu Glu
100 105 110
Asn Lys Asp Lys Lys Asp Glu Glu Arg Asn Lys Ile Arg Glu Glu
115 120 125
<210> 57
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 57
Met Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro
1 5 10 15
Glu Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
20 25
<210> 58
<211> 176
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 58
Met Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro
1 5 10 15
Glu Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gln
20 25 30
Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr
35 40 45
Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys
50 55 60
Thr Glu Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Cys Lys Gln Gln Leu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Thr Glu
85 90 95
Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Tyr Cys Lys
100 105 110
Gln Gln Leu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln
115 120 125
Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln
130 135 140
Leu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Tyr
145 150 155 160
Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
165 170 175
<210> 59
<211> 477
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 59
atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60
cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120
aagcaacagt tactgcgacg tgaggtatat gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180
tatagagatg ggaatccata tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240
agtgagtata gacattattg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300
aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaactgtc aaaagccact gtgtcctgaa 360
gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa agattccata atataagggg tcggtggacc 420
ggtcgatgta tgtcttgttg cagatcatca agaacacgta gagaaaccca gctgtaa 477
<210> 60
<211> 477
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 60
atgcaccaga aacggaccgc catgttccag gatcctcaag agaggcccag aaagctgcct 60
cagctgtgta ccgagctgca gaccaccatc cacgacatca tcctggaatg cgtgtactgc 120
aagcagcagc tcctgcggag agaggtgtac gatttcgcct tccgggacct gtgcatcgtg 180
tacagagatg gcaaccccta cgccgtgtgc gacaagtgcc tgaagttcta cagcaagatc 240
agcgagtacc ggcactactg ctacagcctg tacggcacca cactggaaca gcagtacaac 300
aagcccctgt gcgacctgct gatccggtgc atcaactgcc agaaacctct gtgccccgag 360
gaaaagcagc ggcacctgga caagaagcag cggttccaca acatcagagg ccggtggacc 420
ggcagatgca tgagctgttg tcggagcagc agaaccagac gggaaaccca gctgtga 477
<210> 61
<211> 297
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 61
atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60
gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120
ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180
tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240
gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 297
<210> 62
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 62
atgagaacag ctcttgggga cattggtaac catggagata cacctacatt gcatgaatat 60
atgttagatt tgcaaccaga gacaactgat ctctactgtt atgagcaatt aaatgacagc 120
tcagaggagg aggatgaaat agatggtcca gctggacaag cagaaccgga cagagcccat 180
tacaatattg taaccttttg ttgcaagtgt gactctacgc ttcggttgtg cgtacaaagc 240
acacacgtag acattcgtac tttggaagac ctgttaatgg gcacactagg aattgtgtgc 300
cccatctgtt ctcagaaacc ataa 324
<210> 63
<211> 296
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 63
atgcacggcg acacccctac cctgcacgag tacatgctgg acctgcagcc tgagacaacc 60
gacctgtact gctacgagca gctgaacgac agcagcgagg aagaggacga gatcgacggc 120
cctgccggcc aggccgagcc tgatagagcc cactacaaca tcgtgacctt ctgctgcaag 180
tgcgacagca ccctgagact gtgcgtgcag agcacacacg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcacctt gggcatcgtg tgccccatct gcagccagaa gccttg 296
<210> 64
<211> 297
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 64
atgcacggcg atacccctac actgcacgag tacatgctgg acctgcagcc tgagacaacc 60
gacctgtact gctacgagca gctgaacgac agcagcgagg aagaggacga gattgacgga 120
cctgccggac aggccgaacc tgatagagcc cactacaata tcgtgacctt ctgctgcaag 180
tgcgacagca ccctgagact gtgtgtgcag agcacccacg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg tgccctatct gtagccagaa gccttga 297
<210> 65
<211> 540
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 65
atgagagtga cagcccctcg gacactgatc ctgctgcttt ctggtgccct ggctctgaca 60
gaaacatggg ccggatctat gcacggcgat acccctacac tgcacgagta catgctggac 120
ctgcagcctg agacaaccga cctgtactgc tacgagcagc tgaacgacag cagcgaggaa 180
gaggacgaga ttgacggacc tgccggacag gccgaacctg atagagccca ctacaatatc 240
gtgaccttct gctgcaagtg cgacagcacc ctgagactgt gtgtgcagag cacccacgtg 300
gacatcagaa ccctggaaga tctgctgatg ggcaccctgg gcatcgtgtg ccctatctgt 360
agccagaagc ctatcgtggg aatcgtggcc ggactggctg tgctggcagt ggtggttatt 420
ggagccgtgg tggccacagt gatgtgcaga agaaagagca gcggcggcaa aggcggcagc 480
tattctcagg ccgcctctag cgattctgcc cagggaagtg atgtgtccct gacagcttga 540
<210> 66
<211> 327
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 66
atgagaacag ctctcggcga catcggcaac atgcacggcg atacccctac actgcacgag 60
tacatgctgg acctgcagcc tgagacaacc gacctgtact gctacgagca gctgaacgac 120
agcagcgagg aagaggacga gattgacgga cctgccggac aggccgaacc tgatagagcc 180
cactacaata tcgtgacctt ctgctgcaag tgcgacagca ccctgagact gtgtgtgcag 240
agcacccacg tggacatcag aaccctggaa gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg 300
tgccctatct gtagccagaa gccttga 327
<210> 67
<211> 384
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 67
atgcacggcg atacccctac actgcacgag tacatgctgg acctgcagcc tgagacaacc 60
gacctgtact gctacgagca gctgaacgac agcagcgagg aagaggacga gattgacgga 120
cctgccggac aggccgaacc tgatagagcc cactacaata tcgtgacctt ctgctgcaag 180
tgcgacagca ccctgagact gtgtgtgcag agcacccacg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg tgccctatct gtagccagaa gcctaaagag 300
aaagagaaga acaagctgaa gcggaagaag ctcgagaaca aggacaagaa ggacgaggaa 360
cggaacaaga tccgggaaga gtga 384
<210> 68
<211> 81
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 68
atgcagctgt gtaccgagct gcagacctac atgctggacc tgcagcctga gacaacctac 60
tgcaagcagc aactgctttg a 81
<210> 69
<211> 531
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 69
atgcagctgt gtaccgagct gcagacctac atgctggacc tgcagcctga gacaacctac 60
tgcaagcagc aactgcttgg cggcggaggc tctcagctct gtactgaact ccagacatat 120
atgctcgatc tccagccaga aaccacgtac tgtaaacagc agctcctcgg aggcggcgga 180
tctcaactgt gcaccgaact gcaaacttat atgttggatc tgcaacccga aaccacatat 240
tgcaagcaac agttgctcgg tggcggtggc agtcagttgt gcacagaact tcagacttac 300
atgcttgatc ttcagcccga aacgacctat tgcaaacagc agcttcttgg cggaggcggc 360
agccagttgt gtactgagct tcaaacttat atgcttgacc tccaaccaga gactacttac 420
tgcaaacaac aactcctcgg cggtggtgga agccagctct gcacggaatt gcagacctat 480
atgctcgact tgcaaccgga aacgacgtac tgcaaacaac agctgctgtg a 531
<210> 70
<211> 297
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 70
atgcacggcg atgcccctgc cctgcacgag tacatgctgg acctgcagcc tgagacaacc 60
gacctgtact gctacgagca gctgaacgac agcagcgagg aagaggacga gattgacgga 120
cctgccggac aggccgaacc tgatagagcc cactacaata tcgtgacctt ctgctgcaag 180
tgcgacagca ccctgagact gtgtgtgcag agcacccacg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg tgccctatct gtagccagaa gccttga 297
<210> 71
<211> 762
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 71
atgatggtgg acggcgacaa cagccacgtg gaaatgaagc tggccgtgga cgaggaagag 60
aacgccgaca acaacaccaa ggccaacgtg accaagccta agagatgcag cggcagcatc 120
tgctacggca caatcgccgt gatcgtgttc ttcctgatcg gctttatgat cggctacctg 180
ggctactgca agagcagtga tggacctggc gaaacaggcg gaggcggagg atctggtggc 240
ggaggaagcg gtggcggcgg atcttgtgat ctgcctcaga cacacagcct gggcagcaga 300
cgaacactga tgctgctggc ccagatgcgg aagatcagcc tgttcagctg cctgaaggac 360
cggcacgatt tcggcttccc tcaagaggaa ttcggcaacc agttccagaa ggccgagaca 420
atccctgtgc tgcacgagat gatccagcag atcttcaacc tgttctccac caaggacagc 480
agcgccgcct gggatgagac actgctggac aagttctaca ccgagctgta ccagcagctg 540
aatgacctgg aagcctgcgt gatccaaggc gtgggagtga cagagacacc cctgatgaag 600
gaagatagca tcctggccgt gcgcaagtac ttccagcgga tcaccctgta cctgaaagag 660
aagaagtaca gcccctgcgc ctgggaagtc gtgcgggccg aaatcatgag aagcttcagc 720
ctgagcacca acctgcaaga gagcctgcgg agcaaagagt ga 762
<210> 72
<211> 1836
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 72
atgatggtgg acggcgacaa cagccacgtg gaaatgaagc tggccgtgga cgaggaagag 60
aacgccgaca acaacaccaa ggccaacgtg accaagccta agagatgcag cggcagcatc 120
tgctacggca caatcgccgt gatcgtgttc ttcctgatcg gctttatgat cggctacctg 180
ggctactgca agagcagtga tggacctggc gaaacaggcg gaggcggagg atctggtggc 240
ggaggaagtg gcggcggagg ttctatttgg gagctgaaga aagacgtgta cgtggtggaa 300
ctggactggt atcccgatgc tcctggcgag atggtggtgc tgacctgcga tacccctgaa 360
gaggacggca tcacctggac actggatcag tctagcgagg tgctcggcag cggcaagacc 420
ctgaccatcc aagtgaaaga gtttggcgac gccggccagt acacctgtca caaaggcgga 480
gaagtgctga gccacagcct gctgctgctc cacaagaaag aggatggcat ttggagcacc 540
gacatcctga aggaccagaa agagcccaag aacaagacct tcctgagatg cgaggccaag 600
aactacagcg gccggttcac atgttggtgg ctgaccacca tcagcaccga cctgaccttc 660
agcgtgaagt ccagcagagg cagcagtgat cctcagggcg ttacatgtgg cgccgctaca 720
ctgtctgccg aaagagtgcg gggcgataac aaagaatacg agtacagcgt ggaatgccaa 780
gaggacagcg cctgtccagc cgccgaagag tctctgccta tcgaagtgat ggtcgacgcc 840
gtgcacaagc tgaagtacga gaactacacc agcagctttt tcatccggga catcatcaag 900
cccgatcctc caaagaacct gcagctgaag cctctgaaga acagcagaca ggtggaagtg 960
tcctgggagt accccgacac ctggtctaca ccccacagct acttcagcct gaccttttgc 1020
gtgcaagtgc agggcaagtc caagcgcgag aaaaaggacc gggtgttcac cgacaagacc 1080
agcgccaccg tgatctgcag aaagaacgcc agcatcagcg tcagagccca ggaccggtac 1140
tacagcagct cttggagcga atgggccagc gtgccatgta gcggaggtgg tggtagcgga 1200
ggcggcggaa gcggcggtgg tggatcaggt ggtggtggct ctagaaacct gccagtggct 1260
acccctgatc ctggcatgtt cccttgtctg caccacagcc agaacctgct gagagccgtg 1320
tccaacatgc tgcagaaggc cagacagacc ctggaattct acccctgcac cagcgaggaa 1380
atcgaccacg aggacatcac caaggataag accagcaccg tggaagcctg cctgcctctg 1440
gaactgacca agaacgagag ctgcctgaac agccgggaaa cctccttcat caccaacggc 1500
tcttgcctgg ccagcagaaa gacaagcttc atgatggccc tgtgcctgag cagcatctac 1560
gaggacctga agatgtacca ggtggaattc aagaccatga acgccaagct gctgatggac 1620
cccaagcggc agatcttcct ggaccagaac atgctggctg tgatcgacga gctgatgcag 1680
gccctgaact tcaacagcga gacagtgccc cagaagtcta gcctggaaga acccgacttc 1740
tacaagacca agatcaagct gtgcatcctg ctgcacgcct tccggatcag agccgtgacc 1800
atcgacagag tgatgagcta cctgaacgcc tcctga 1836
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 73
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 74
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
<210> 75
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> VARIANT
<222> 1, 2, 3, 4, 5
<223> Can be present in repeats of any number
<400> 75
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 76
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> VARIANT
<222> 1, 2, 3, 4, 5
<223> Can be present in repeats of any number
<400> 76
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 77
<211> 220
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 77
Met Met Val Asp Gly Asp Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val
1 5 10 15
Asp Glu Glu Glu Asn Ala Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys
20 25 30
Pro Lys Arg Cys Ser Gly Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile
35 40 45
Val Phe Phe Leu Ile Gly Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys
50 55 60
Ser Ser Asp Gly Pro Gly Glu Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys
85 90 95
Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile
100 105 110
Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu
115 120 125
Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu
130 135 140
Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu
145 150 155 160
Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn
165 170 175
Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met
180 185 190
Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg
195 200 205
Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
210 215 220
<210> 78
<211> 191
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 78
Met Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly Leu Cys Leu Leu Val
1 5 10 15
Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Gly Leu Gly Met
20 25 30
Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser
50 55 60
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln
65 70 75 80
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg
85 90 95
Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
100 105 110
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
115 120 125
Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
130 135 140
Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
145 150 155 160
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu
165 170 175
Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
180 185 190
<210> 79
<211> 611
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 79
Met Met Val Asp Gly Asp Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val
1 5 10 15
Asp Glu Glu Glu Asn Ala Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys
20 25 30
Pro Lys Arg Cys Ser Gly Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile
35 40 45
Val Phe Phe Leu Ile Gly Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys
50 55 60
Ser Ser Asp Gly Pro Gly Glu Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val
85 90 95
Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val
100 105 110
Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu
115 120 125
Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln
130 135 140
Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly
145 150 155 160
Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly
165 170 175
Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys
180 185 190
Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys
195 200 205
Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser
210 215 220
Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr
225 230 235 240
Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser
245 250 255
Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu
260 265 270
Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn
275 280 285
Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro
290 295 300
Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val
305 310 315 320
Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser
325 330 335
Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys
340 345 350
Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys
355 360 365
Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser
370 375 380
Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
385 390 395 400
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn
405 410 415
Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His
420 425 430
Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg
435 440 445
Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu
450 455 460
Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu
465 470 475 480
Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe
485 490 495
Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met
500 505 510
Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val
515 520 525
Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln
530 535 540
Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln
545 550 555 560
Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu
565 570 575
Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His
580 585 590
Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu
595 600 605
Asn Ala Ser
610
<210> 80
<211> 253
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 80
Met Met Val Asp Gly Asp Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val
1 5 10 15
Asp Glu Glu Glu Asn Ala Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys
20 25 30
Pro Lys Arg Cys Ser Gly Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile
35 40 45
Val Phe Phe Leu Ile Gly Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys
50 55 60
Ser Ser Asp Gly Pro Gly Glu Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser
85 90 95
Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile
100 105 110
Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln
115 120 125
Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu
130 135 140
His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser
145 150 155 160
Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu
165 170 175
Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly
180 185 190
Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg
195 200 205
Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser
210 215 220
Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser
225 230 235 240
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
245 250
<210> 81
<211> 73
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 81
Met Met Val Asp Gly Asp Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val
1 5 10 15
Asp Glu Glu Glu Asn Ala Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys
20 25 30
Pro Lys Arg Cys Ser Gly Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile
35 40 45
Val Phe Phe Leu Ile Gly Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys
50 55 60
Ser Ser Asp Gly Pro Gly Glu Thr Gly
65 70
<210> 82
<211> 43
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 82
Met Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly Leu Cys Leu Leu Val
1 5 10 15
Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Gly Leu Gly Met
20 25 30
Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Thr Gly
35 40
<210> 83
<211> 756
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 83
atgagcctgc tgaccgaagt ggaaacctat gtgctgagca ttgtgccgag cggcccgctg 60
aaagcggaaa ttgcgcagcg cctggaagat gtgtttgcgg gcaaaaacac cgatctggaa 120
gtgctgatgg aatggctgaa aacccgcccg attctgagcc cgctgaccaa aggcattctg 180
ggctttgtgt ttaccctgac cgtgccgagc gaacgcggcc tgcagcgccg ccgctttgtg 240
cagaacgcgc tgaacggcaa cggcgatccg aacaacatgg ataaagcggt gaaactgtat 300
cgcaaactga aacgcgaaat tacctttcat ggcgcgaaag aaattgcgct gagctatagc 360
gcgggcgcgc tggcgagctg catgggcctg atttataacc gcatgggcgc ggtgaccacc 420
gaagtggcgt ttggcctggt gtgcgcgacc tgcgaacaga ttgcggatag ccagcatcgc 480
agccatcgcc agatggtgac caccaccaac ccgctgattc gccatgaaaa ccgcatggtg 540
ctggcgagca ccaccgcgaa agcgatggaa cagatggcgg gcagcagcga acaggcggcg 600
gaagcgatgg atattgcgag ccaggcgcgc cagatggtgc aggcgatgcg caccattggc 660
acccatccga gcagcagcgc gggcctgaaa gatgatctgc tggaaaacct gcaggcgtat 720
cagaaacgca tgggcgtgca gatgcagcgc tttaaa 756
<210> 84
<211> 759
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 84
atgtctctgc tgaccgaggt cgagacatac gtgctgagca tcgtgcctag cggccctctg 60
aaggccgaga tcgcccagag actggaagat gtgttcgccg gcaagaacac cgacctggaa 120
gtgctgatgg aatggctgaa aaccagacct atcctgagcc ccctgacaaa gggcatcctg 180
ggcttcgtgt tcaccctgac cgtgccaagc gagagaggcc tgcagcgcag aaggttcgtg 240
cagaacgccc tcaacggcaa tggcgacccc aacaacatgg ataaggctgt gaagctgtat 300
agaaagctga aaagagagat cacatttcac ggcgctaaag agattgccct ctcctacagc 360
gccggagccc tggcttcttg tatgggactg atctacaaca gaatgggagc cgtgaccacc 420
gaggtggcct tcggcctggt gtgcgccaca tgcgagcaaa tcgcagatag ccagcacaga 480
agccatcggc agatggtcac cacaacaaac cctctgatcc ggcacgagaa ccggatggtg 540
ctggccagca ccaccgccaa ggccatggaa cagatggccg gcagctctga gcaggccgct 600
gaagccatgg acatcgccag ccaggctaga cagatggttc aggccatgag aaccatcggc 660
acccaccctt ctagctccgc cggactgaag gacgacctgc tggaaaatct gcaagcctac 720
cagaagcgga tgggcgtgca gatgcagcgg tttaagtag 759
<210> 85
<211> 1686
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 85
atggaaagca gaggcagacg gtgccccgag atgatctctg tgctgggccc tatctctggc 60
cacgtgctga aggccgtgtt cagcagaggc gatacacctg tgctgcccca cgagacaaga 120
ctgctgcaga caggcatcca tgtgcgggtg tcacagccta gcctgatcct ggtgtctcag 180
tacacccctg acagcacccc ttgtcacaga ggcgacaatc agctgcaggt ccagcacacc 240
tacttcaccg gcagcgaggt ggaaaacgtg tccgtgaacg tgcacaatcc caccggcaga 300
tccatctgtc ccagccaaga gcctatgagc atctacgtgt acgccctgcc tctgaagatg 360
ctgaacatcc ccagcatcaa tgtgcatcac tacccctctg ccgccgagcg gaaacacaga 420
catctgcctg tggccgatgc cgtgattcac gcctctggca aacagatgtg gcaggccaga 480
ctgacagtgt ccggactggc ttggaccaga cagcagaacc agtggaaaga acccgacgtg 540
tactacacca gcgccttcgt gttccccacc aaggatgtgg ccctgagaca cgttgtgtgc 600
gcccacgaac tcgtgtgcag catggaaaac acccgggcca ccaagatgca agtgatcggc 660
gaccagtacg tgaaggtgta cctggaaagc ttctgcgagg atgtgcccag cggcaagctg 720
ttcatgcacg tgacactggg ctccgacgtg gaagaggacc tgaccatgac cagaaatccc 780
cagcctttca tgcggcctca cgagagaaat ggcttcaccg tgctgtgccc caagaacatg 840
atcatcaagc ccggcaagat cagccacatc atgctggacg tggccttcac cagccacgag 900
cactttggac tgctgtgtcc taagagcatc cccggcctga gcatcagcgg caacctgctg 960
atgaatggcc agcagatctt cctggaagtg caggccatcc gggaaaccgt ggaactgaga 1020
cagtacgacc ctgtggctgc cctgttcttc ttcgacatcg acctgctgct ccagagaggc 1080
cctcagtact ctgagcaccc cacctttacc agccagtacc ggatccaggg aaagctggaa 1140
taccggcaca cctgggatag acacgatgaa ggtgctgccc agggcgacga tgatgtgtgg 1200
acaagcggca gcgatagcga cgaggaactg gtcaccaccg agagaaagac ccctagagtt 1260
acaggcggag gcgctatggc tggcgcctct acatctgccg gacggaagag aaagagcgcc 1320
tcttctgcca ccgcctgtac aagcggcgtg atgacaagag gcaggctgaa agccgagagc 1380
acagtggccc ctgaagagga cacagacgag gacagcgaca acgagattca caaccccgcc 1440
gtgtttacct ggcctccttg gcaggctgga atcctggcca gaaacctggt gcctatggtg 1500
gccacagtgc agggccagaa cctgaagtac caagagttct tctgggacgc caacgacatc 1560
taccggatct tcgccgaact ggaaggcgtg tggcaaccag ccgctcagcc taagagaaga 1620
aggcacagac aagacgctct gcccggacct tgtatcgcca gcactcccaa gaagcacaga 1680
ggctga 1686
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 86
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 87
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 87
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 88
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 89
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 89
Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe Thr Val Leu
1 5 10
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 90
Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met
1 5 10
<210> 91
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 91
Tyr Ser Glu His Pro Thr Phe Thr Ser Gln Tyr
1 5 10
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 92
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5
<210> 93
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 93
Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
1 5 10
Claims (288)
- 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법으로서, 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는, 방법.
- 백신 접종를 필요로 하는 개체에게 백신을 접종하기 위한 방법으로서, 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질 또는 이의 단편은 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프를 추가로 포함하여, 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프로 이루어진 융합 단백질을 생성하는, 방법.
- 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법으로서, 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는, 방법.
- 백신 접종를 필요로 하는 개체에게 백신을 접종하기 위한 방법으로서, 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하고; 단백질 또는 이의 단편은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는, 방법.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, mRNA의 뉴클레오티드 서열은 유핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는, 방법.
- 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 면역프로테아좀-표적화 모티프를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하되, mRNA의 번역은 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프로 이루어진 융합 단백질을 생성하는, 방법.
- 제3항 또는 제6항에 있어서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는, 면역프로테아좀-표적화 모티프가 없을 때 세포 내 단백질의 분해 및/또는 세포 표면 상의 단백질로부터 유래된 펩티드의 제시와 비교하여 세포 내 단백질의 분해 및/또는 세포 표면 상의 단백질로부터 유래된 펩티드의 제시를 향상시키는, 방법.
- 제8항에 있어서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는 융합 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 있는, 방법.
- 제7항 내지 제9항에 있어서, 하나 이상의 면역프로테아좀 표적화 모티프는 파괴 박스(D-박스) 도메인, KEKE 도메인, 및/또는 sec/MITD 도메인인, 방법.
- 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA의 하나 이상의 잔기가 변형되는, 방법.
- 제11항에 있어서, mRNA의 하나 이상의 잔기는 포스포로티오에이트 잔기, 슈도우리딘 잔기, N1-메틸아데노신 잔기, 5-메틸시티딘 잔기, 또는 모르폴리노 잔기인, 방법.
- 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법으로서, 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 여기서 유핵 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하고; 2개 이상의 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는, 방법.
- 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 방법으로서, 유핵 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 개체에게 투여하는 단계를 포함하되, 유핵 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하고; 2개 이상의 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는, 방법.
- 제13항 또는 제14항에 있어서, 세포는 단백질로부터 유래된 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개를 초과하는 항원을 포함하는, 방법.
- 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 중 적어도 2개는 부분적으로 중첩된 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 모든 항원의 아미노산 서열을 합치면 단백질의 아미노산 서열과 약 90% 이상 중첩되는, 방법.
- 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 단백질의 2개 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드인, 방법.
- 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 단백질의 하나 이상의 에피토프 및 하나 이상의 이종 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드인, 방법.
- 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 에피토프의 측면에는 하나 이상의 이종 펩티드 서열이 위치하는, 방법.
- 제20항에 있어서, N-말단 및/또는 C-말단에서 측면에 위치하는 폴리펩티드는 면역원성 합성 긴 펩티드(SLP)로부터 유래되는, 방법.
- 제21항에 있어서, N-말단 및/또는 C-말단에서 측면에 위치하는 폴리펩티드는 질환-연관 면역원성 SLP로부터 유래되는, 방법.
- 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 종양유전자의 산물, 신생항원, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질인, 방법.
- 제1항, 제3항, 제4항, 제6항 내지 제13항, 제15항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에서 면역 반응을 자극하는 것은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환의 치료에 사용되는, 방법.
- 제24항에 있어서, 바이러스 연관 질환은 인간 유두종바이러스(HPV), A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 단순 포진 바이러스 1(HSV-1), 단순 포진 바이러스(HSV-2), 수두-대상포진 바이러스(VZV), 6형 인간 헤르페스바이러스(HHV-6), 7형 인간 헤르페스바이러스(HHV-7), 8형 인간 헤르페스바이러스 (HHV-8), 거대세포바이러스(CMV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 엡스타인바 바이러스(EBV), 또는 인플루엔자와 연관된 질환인, 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질인, 방법.
- 제26항에 있어서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18인, 방법.
- 제26항 또는 제27항에 있어서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질인, 방법.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질인, 방법.
- 제29항에 있어서, HBV 단백질은 코어 단백질, 작은 표면 항원, 중간 표면 항원, 큰 표면 항원, e 항원, X 항원, 또는 중합효소 단백질인, 방법.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 보조제를 추가로 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 보조제와 함께 투여되는, 방법.
- 제31항 또는 제32항에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제인, 방법.
- 제1항 내지 제3항 및 제23항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편이 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여; 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. - 제4항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하여; 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. - 제12항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 2개 이상의 항원이 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. - 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계. - 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계. - 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인, 방법.
- 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.0 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.0 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.0 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인, 방법.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm인, 방법.
- 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm 또는 약 4.0 μm인, 방법.
- 제34항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과하는, 방법.
- 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 개체에 대한 자가 세포 또는 동종 세포인, 방법.
- 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 면역 세포인, 방법.
- 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)인, 방법.
- 제46항에 있어서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 둘 이상을 포함하는, 방법.
- 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상인, 방법.
- 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 보조제로 컨디셔닝되어 컨디셔닝된 세포를 형성하는, 방법.
- 제49항에 있어서, 유핵 세포는 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 10시간, 약 3시간 내지 약 6시간, 또는 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션되는, 방법.
- 제49항 또는 제50항에 있어서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 유핵 세포 내로 도입하기 전 또는 후에 컨디셔닝되는, 방법.
- 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제인, 방법.
- 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)인, 방법.
- 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제는 CpG 7909인, 방법.
- 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 컨디셔닝된 세포는 컨디셔닝된 복수의 PBMC인, 방법.
- 제55항에 있어서, 복수의 PBMC는 공자극 분자 중 하나 이상의 발현을 증가시키도록 변형되는, 방법.
- 제56항에 있어서, 공자극 분자는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112인, 방법.
- 제56항에 있어서, 공자극 분자는 CD86인, 방법.
- 제55항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시키도록 변형되는, 방법.
- 제55항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 PBMC는 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하도록 변형되는, 방법.
- 제60항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인은 사이토카인 및 막관통 도메인을 포함하6는 융합 단백질인, 방법.
- 제61항에 있어서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합되는, 방법.
- 제62항에 있어서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)인, 방법.
- 제59항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인은 I형 사이토카인인, 방법.
- 제59항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, IFN-β, 또는 IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체인, 방법.
- 제65항에 있어서, 사이토카인은 IL-2 또는 이의 기능적 변이체 및/또는 IL-12 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
- 제60항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인은 서열번호 77~80의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
- 제56항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 공자극 분자의 발현을 증가시키도록 변형되는, 방법.
- 제68항에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 공자극 분자의 증가된 발현을 포함하고, 복수의 PBMC는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하고; mRNA가 발현되고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 포함하는 유핵 세포가 생성되는 단계. - 제68항에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 공자극 분자의 증가된 발현을 포함하고, 복수의 PBMC는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하고; mRNA가 발현되고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 포함하는 유핵 세포가 생성되는 단계. - 제68항에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 공자극 분자의 증가된 발현을 포함하고, 복수의 PBMC는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 2개 이상의 항원, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 2개 이상의 항원, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 2개 이상의 항원, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하고; mRNA가 발현되고, 이에 의해 2개 이상의 항원, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 포함하는 유핵 세포가 생성되는 단계. - 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 도중에, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 도중에, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 도중에, 및/또는 후에 유핵 세포를 2개 이상의 항원, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계. - 제69항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 도중에, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 유핵 세포를 2개 이상의 항원, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계. - 제55항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 공자극 분자는 복수의 컨디셔닝된지 않은 PBMC 내의 B 세포와 비교하여 컨디셔닝된 복수의 PBMC의 B 세포에서 상향 조절되고, 공자극 분자는 CD80 및/또는 CD86인, 방법.
- 제55항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 PBMC는 복수의 컨디셔닝되지 않은 PBMC와 비교하여 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현을 증가시킨, 방법.
- 제75항에 있어서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현은 상기 복수의 컨디셔닝되지 않은 PBMC와 비교하여 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배, 또는 10배 초과만큼 증가되는, 방법.
- 제1항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 복수의 횟수로 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 정맥내 투여되는, 방법.
- 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 인간인, 방법.
- 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 또 다른 요법의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 투여되는, 방법.
- 제80항에 있어서, 또 다른 요법은 화학요법, 방사선요법, 항체, 사이토카인, 면역 관문 억제제, 또는 면역 항암 요법에 사용된 이중특이적 폴리펩티드인, 방법.
- 유핵 세포를 포함하는 조성물로서, 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 포함하는, 조성물.
- 제82항에 있어서, 단백질 또는 이의 단편은 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프를 추가로 포함하여, 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프로 이루어진 융합 단백질을 생성하는, 조성물.
- 유핵 세포를 포함하는 조성물로서, 유핵 세포는 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는, 조성물.
- 제84항에 있어서, mRNA의 뉴클레오티드 서열은 유핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화되는, 조성물.
- 제84항 또는 제85항에 있어서, mRNA는 면역프로테아좀-표적화 모티프를 암호화하는 하나 이상의 핵산 서열을 포함하되, mRNA의 번역은 단백질 및 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프로 이루어진 융합 단백질을 생성하는, 조성물.
- 제83항 또는 제86항에 있어서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는, 면역프로테아좀-표적화 모티프가 없을 때 세포 내 단백질의 분해 및/또는 세포 표면 상의 단백질로부터 유래된 펩티드의 제시와 비교하여 세포 내 단백질의 분해 및/또는 세포 표면 상의 단백질로부터 유래된 펩티드의 제시를 향상시키는, 조성물.
- 제87항에 있어서, 하나 이상의 면역프로테아좀-표적화 모티프는 융합 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에 있는, 조성물.
- 제86항 내지 제88항에 있어서, 하나 이상의 면역프로테아좀 표적화 모티프는 파괴 박스(D-박스) 도메인, KEKE 도메인, 및/또는 sec/MITD 도메인인, 조성물.
- 제84항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA의 하나 이상의 잔기가 변형되는, 조성물.
- 제90항에 있어서, mRNA의 하나 이상의 잔기는 포스포로티오에이트 잔기, 슈도우리딘 잔기, N1-메틸아데노신 잔기, 5-메틸시티딘 잔기, 또는 모르폴리노 잔기인, 조성물.
- 유핵 세포를 포함하는 조성물로서, 유핵 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하고, 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는, 조성물.
- 제92항에 있어서, 세포는 단백질로부터 유래된 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 10개를 초과하는 항원을 포함하는, 조성물.
- 제92항 또는 제93항에 있어서, 항원 중 적어도 2개는 부분적으로 중첩된 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제94항에 있어서, 모든 항원의 아미노산 서열을 합치면 단백질의 아미노산 서열과 약 90% 이상 중첩되는, 조성물.
- 제92항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 단백질의 2개 이상의 에피토프를 포함하는 폴리펩티드인, 조성물.
- 제92항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 항원은 단백질의 하나 이상의 에피토프 및 하나 이상의 이종 펩티드 서열을 포함하는 폴리펩티드인, 조성물.
- 제92항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 및/또는 C-말단에서 하나 이상의 에피토프의 측면에는 하나 이상의 이종 펩티드 서열이 위치하는, 조성물.
- 제98항에 있어서, N-말단 및/또는 C-말단에서 측면에 위치하는 폴리펩티드는 면역원성 합성 긴 펩티드(SLP)로부터 유래되는, 조성물.
- 제99항에 있어서, N-말단 및/또는 C-말단에서 측면에 위치하는 폴리펩티드는 질환-연관 면역원성 SLP로부터 유래되는, 조성물.
- 제82항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 종양유전자의 산물, 신생항원, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질인, 조성물.
- 제82항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에서 면역 반응을 자극하는 것은 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환의 치료에 사용되는, 조성물.
- 제102항에 있어서, 바이러스 연관 질환은 인간 유두종바이러스(HPV), A형 간염 바이러스(HAV), B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV), 단순 포진 바이러스 1(HSV-1), 단순 포진 바이러스(HSV-2), 수두-대상포진 바이러스(VZV), 6형 인간 헤르페스바이러스(HHV-6), 7형 인간 헤르페스바이러스(HHV-7), 8형 인간 헤르페스바이러스 (HHV-8), 거대세포바이러스(CMV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 엡스타인바 바이러스(EBV), 또는 인플루엔자와 연관된 질환인, 조성물.
- 제82항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질인, 조성물.
- 제104항에 있어서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18인, 조성물.
- 제104항 또는 제105항에 있어서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질인, 조성물.
- 제82항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질인, 조성물.
- 제107항에 있어서, HBV 단백질은 코어 단백질, 작은 표면 항원, 중간 표면 항원, 큰 표면 항원, e 항원, X 항원, 또는 중합효소 단백질인, 조성물.
- 제82항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 보조제를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제109항에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제인, 조성물.
- 제82항 및 제101항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편이 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여; 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. - 제84항 내지 제91항 및 제101항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하여; 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. - 제92항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 2개 이상의 항원이 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. - 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함하는, 조성물:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계. - 제111항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함하는, 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계. - 제111항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인, 조성물.
- 제111항 내지 제116항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.0 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.0 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.0 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인, 조성물.
- 제111항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm인, 조성물.
- 제111항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm 또는 약 4.0 μm인, 조성물.
- 제111항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과하는, 조성물.
- 제82항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 개체에 대한 자가 세포 또는 동종 세포인, 조성물.
- 제82항 내지 제121항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 면역 세포인, 조성물.
- 제82항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)인, 조성물.
- 제123항에 있어서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 둘 이상을 포함하는, 조성물.
- 제82항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상인, 조성물.
- 제82항 내지 제125항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 보조제로 컨디셔닝되어 컨디셔닝된 세포를 형성하는, 조성물.
- 제126항에 있어서, 유핵 세포는 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 10시간, 약 3시간 내지 약 6시간, 또는 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션되는, 조성물.
- 제126항 또는 제127항에 있어서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 유핵 세포 내로 도입하기 전 또는 후에 컨디셔닝되는, 조성물.
- 제126항 내지 제128항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제인, 조성물.
- 제126항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)인, 조성물.
- 제126항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제는 CpG 7909인, 조성물.
- 제126항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 컨디셔닝된 세포는 컨디셔닝된 복수의 PBMC인, 조성물.
- 제132항에 있어서, 복수의 PBMC는 공자극 분자 중 하나 이상의 발현을 증가시키도록 변형되는, 조성물.
- 제133항에 있어서, 공자극 분자는 B7-H2 (ICOSL), B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD70, LIGHT, HVEM, CD40, 4-1BBL, OX40L, TL1A, GITRL, CD30L, TIM4, SLAM, CD48, CD58, CD155, 또는 CD112인, 조성물.
- 제134항에 있어서, 공자극 분자는 CD86인, 조성물.
- 제132항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인의 발현을 증가시키도록 변형되는, 조성물.
- 제132항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 PBMC는 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하도록 변형되는, 조성물.
- 제137항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인은 사이토카인 및 막관통 도메인을 포함하는 융합 단백질인, 조성물.
- 제138항에 있어서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합되는, 조성물.
- 제139항에 있어서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)인, 조성물.
- 제136항 내지 제140항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인은 I형 사이토카인인, 조성물.
- 제136항 내지 제141항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, IFN-β, 또는 IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체인, 조성물.
- 제142항에 있어서, 사이토카인은 IL-2 또는 이의 기능적 변이체 및/또는 IL-12 또는 이의 기능적 변이체인, 방법.
- 제137항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인은 서열번호 77~80의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제133항 내지 제144항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 공자극 분자의 발현을 증가시키도록 변형되는, 조성물.
- 제145항에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 공자극 분자의 증가된 발현을 포함하고, 복수의 PBMC는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하고; mRNA가 발현되고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 포함하는 유핵 세포가 생성되는 단계. - 제145항에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 공자극 분자의 증가된 발현을 포함하고, 복수의 PBMC는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하고; mRNA가 발현되고, 이에 의해 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 포함하는 유핵 세포가 생성되는 단계. - 제145항에 있어서, 복수의 PBMC는 하나 이상의 사이토카인 및/또는 하나 이상의 공자극 분자의 증가된 발현을 포함하고, 복수의 PBMC는 다음을 포함하는 방법에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 2개 이상의 항원, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 2개 이상의 항원, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA를 섭동된 투입 유핵 세포에 진입시키기 위해, 섭동된 투입 유핵 세포를 2개 이상의 항원, 및 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하고; mRNA가 발현되고, 이에 의해 2개 이상의 항원, 하나 이상의 사이토카인, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 포함하는 유핵 세포가 생성되는 단계. - 제146항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함하는, 조성물:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 도중에, 및/또는 후에 복수의 PBMC를 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 도중에, 및/또는 후에 복수의 PBMC를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 도중에, 및/또는 후에 복수의 PBMC를 2개 이상의 항원, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계. - 제146항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함하는, 조성물:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 복수의 PBMC를 단백질 또는 이의 단편, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 도중에, 및/또는 후에 복수의 PBMC를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에, 복수의 PBMC를 2개 이상의 항원, 하나 이상의 사이토카인을 암호화하는 하나 이상의 mRNA, 및/또는 하나 이상의 공자극 분자를 암호화하는 하나 이상의 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계. - 제132항 내지 제150항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 공자극 분자는 복수의 컨디셔닝된지 않은 PBMC 내의 B 세포와 비교하여 컨디셔닝된 복수의 PBMC의 B 세포에서 상향 조절되고, 공동 자극 분자는 CD80 및/또는 CD86인, 조성물.
- 제132항 내지 제151항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 PBMC는 복수의 컨디셔닝되지 않은 PBMC와 비교하여 IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현을 증가시킨, 조성물.
- 제152항에 있어서, IFN-γ, IL-6, MCP-1, MIP-1β, IP-10, 또는 TNF-α 중 하나 이상의 발현은 상기 복수의 컨디셔닝되지 않은 PBMC와 비교하여 약 1.2배, 1.5배, 1.8배, 2배, 3배, 4배, 5배, 8배, 또는 10배 초과만큼 증가되는, 조성물.
- 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 제82항 내지 제153항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 포함하고; 조성물은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는, 조성물.
- 의약으로서 사용하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 제82항 내지 제153항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 포함하는, 조성물.
- 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 제82항 내지 제153항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 포함하는, 조성물.
- 제154항 내지 제156항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 보조제를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제154항 내지 제157항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 보조제와 함께 투여되는, 조성물.
- 제157항 또는 제158항에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 알파-갈락토실 세라미드, STING 작용제, 환형 디뉴클레오티드(CDN), RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제인, 조성물.
- 제157항 내지 제159항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 복수의 횟수로 투여되는, 조성물.
- 제157항 내지 제160항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 정맥내 투여되는, 조성물.
- 제157항 내지 제161항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 인간인, 조성물.
- 제157항 내지 제162항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 또 다른 요법의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 투여되는, 조성물.
- 제163항에 있어서, 또 다른 요법은 화학요법, 방사선요법, 항체, 사이토카인, 면역 관문 억제제, 또는 면역 항암 요법에 사용된 이중특이적 폴리펩티드인, 조성물.
- 개체에서 면역 반응을 자극하기 위한 의약의 제조에 있어서 조성물의 용도로서, 상기 조성물은 제82항 내지 제153항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 포함하고; 조성물은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는, 용도.
- 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서 조성물의 용도로서, 상기 조성물은 제82항 내지 제153항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 포함하는, 용도.
- 제165항 또는 제166항에 있어서, 조성물은 보조제를 추가로 포함하는, 용도.
- 제165항 내지 제167항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 보조제와 함께 투여되도록 제형화되는, 조성물.
- 제167항 또는 제168항에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, 알파-갈락토실 세라미드, STING 작용제, 환형 디뉴클레오티드(CDN), RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제인, 용도.
- 제167항 내지 제169항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포를 포함하는 조성물은 복수의 횟수로 투여되는, 용도.
- 제167항 내지 제170항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 정맥내 투여되는, 용도.
- 제167항 내지 제171항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 인간인, 용도.
- 제167항 내지 제172항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 또 다른 요법의 투여 전에, 동시에, 또는 후에 투여되는, 용도.
- 제173항에 있어서, 또 다른 요법은 화학요법, 방사선요법, 항체, 사이토카인, 면역 관문 억제제, 또는 면역 항암 요법에 사용된 이중특이적 폴리펩티드인, 용도.
- 제1항 내지 제81항 중 어느 하나의 방법에 사용하기 위한 키트.
- 제82항 내지 제153항 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 키트.
- 제175항 또는 제176항에 있어서, 키트는 완충제; 희석제; 필터; 바늘; 주사기; 또는 조성물을 개체에게 투여하여 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하기 위한 지침이 담긴 패키지 삽입물 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 키트.
- 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 유핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
- 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 유핵 세포 내로 도입하고, mRNA가 발현되어 단백질 또는 이의 단편이 생성되는, 단계를 포함하는, 방법.
- 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 2개 이상의 항원을 유핵 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 상기 단백질 또는 이의 단편은 개체에서 HLA 불문 방식으로 면역 반응을 자극하는, 방법.
- 제178항에 있어서, 단백질 또는 이의 단편을 유핵 세포에게 세포내 도입하는 단계는 다음을 포함하는, 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편이 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하여; 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. - 제179항에 있어서, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조되는, 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA가 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하여; 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. - 제180항에 있어서, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포는 다음 단계에 의해 제조되는, 방법:
a) 투입 유핵 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 유핵 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 유핵 세포를 형성하되, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 유핵 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 2개 이상의 항원이 섭동된 투입 유핵 세포에 진입하도록 섭동된 투입 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여, 2개 이상의 항원을 포함하는 유핵 세포를 생성하는 단계. - 제181항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계. - 제181항 내지 제183항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA와 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 유핵 세포를 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계. - 제181항 내지 제185항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인, 방법.
- 제181항 내지 제186항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인, 방법.
- 제181항 내지 제187항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm인, 방법.
- 제181항 내지 제188항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm인, 방법.
- 제181항 내지 제189항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과하는, 방법.
- 제178항 내지 제190항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 유핵 세포를 보조제로 컨디셔닝하여 컨디셔닝된 세포를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제191항에 있어서, 유핵 세포는 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 10시간, 약 3시간 내지 약 6시간, 또는 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션되는, 방법.
- 제191항 또는 제192항에 있어서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편, 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA, 또는 단백질 유래의 2개 이상의 항원을 유핵 세포 내로 도입하기 전 또는 후에 컨디셔닝되는, 방법.
- 면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 면역 세포에서 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 발현시키는 단계를 포함하는, 방법.
- 제193항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인은 막관통 도메인 및 사이토카인을 포함하는 융합 단백질인, 방법.
- 제194항 또는 제195항에 있어서, 막관통 도메인은 트랜스페린 수용체 단백질 1(TFRC) 또는 종양 괴사 인자 막관통 도메인인, 방법.
- 제194항 내지 제196항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인은 I형 사이토카인인, 방법.
- 제194항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, IFN-β, 또는 IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체인, 방법.
- 제194항 내지 제198항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합되는, 방법.
- 제199항에 있어서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)인, 방법.
- 제194항 내지 제200항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인은 서열번호 77~80의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
- 제194항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 항원을 추가로 포함하는, 방법.
- 제194항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 항원을 암호화하는 mRNA를 추가로 포함하는, 방법.
- 제202항 또는 제203항에 있어서, 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편인, 방법.
- 제194항 내지 제201항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 추가로 포함하는, 방법.
- 제205항에 있어서, 2개 이상의 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는, 방법.
- 제204항 내지 제206항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 종양유전자의 산물, 신생항원, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질인, 방법.
- 제204항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질인, 방법.
- 제208항에 있어서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18인, 방법.
- 제208항 또는 제209항에 있어서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질인, 방법.
- 제204항 내지 제207항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질인, 방법.
- 제211항에 있어서, HBV 단백질은 코어 단백질, 작은 표면 항원, 중간 표면 항원, 큰 표면 항원, e 항원, X 항원, 또는 중합효소 단백질인, 방법.
- 제194항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)인, 방법.
- 제213항에 있어서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 둘 이상을 포함하는, 방법.
- 제194항 내지 제214항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상인, 방법.
- 제194항 내지 제215항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 보조제로 컨디셔닝되어 컨디셔닝된 세포를 형성하는, 방법.
- 제216항에 있어서, 유핵 세포는 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 10시간, 약 3시간 내지 약 6시간, 또는 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션되는, 방법.
- 제216항 또는 제217항에 있어서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 유핵 세포 내로 도입하기 전 또는 후에 컨디셔닝되는, 방법.
- 제216항 내지 제218항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제인, 방법.
- 제216항 내지 제219항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)인, 방법.
- 제194항 내지 제220항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. - 제221항에서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA인, 방법.
- 제202항, 제204항, 및 제207항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산 및 항원을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. - 제203항, 제204항, 및 제207항 내지 제222항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. - 제223항 또는 제224항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및/또는 항원을 암호화하는 핵산은 mRNA인, 방법.
- 제202항, 제204항, 및 제207항 내지 제222항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 ?첫溶核觀壙? 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는 방법:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. - 제221항 내지 제226항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하는 단계;
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(d) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계. - 제221항 내지 제226항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 다음 단계를 포함하는 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하는 단계;
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(d) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계. - 제221항 내지 제228항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인, 방법.
- 제221항 내지 제229항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인, 방법.
- 제221항 내지 제230항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm인, 방법.
- 제221항 내지 제231항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm인, 방법.
- 제221항 내지 제232항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과하는, 방법.
- 면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 키메라 막-결합 사이토카인을 면역 세포에 포함하는, 조성물.
- 제234항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인은 막관통 도메인 및 사이토카인을 포함하는 융합 단백질인, 조성물.
- 제234항 내지 제235항 중 어느 한 항에 있어서, 막관통 도메인은 트랜스페린 수용체 단백질 1(TFRC) 또는 종양 괴사 인자 막관통 도메인인, 조성물.
- 제234항 내지 제236항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인은 I형 사이토카인인, 조성물.
- 제234항 내지 제237항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인은 IL-15, IL-12, IL-2, IFN-α, IFN-β, 또는 IL-21, 또는 이들의 기능적 변이체인, 조성물.
- 제234항 내지 제238항 중 어느 한 항에 있어서, 사이토카인은 펩티드 링커에 의해 막관통 도메인에 결합되는, 조성물.
- 제239항에 있어서, 펩티드 링커는 (G4S)3(서열번호 73) 또는 (EAAAK)3(서열번호 74)인, 조성물.
- 제234항 내지 제240항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인은 서열번호 77~80의 아미노산 서열을 포함하는, 조성물.
- 제234항 내지 제241항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 항원을 추가로 포함하는, 조성물.
- 제234항 내지 제242항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 항원을 암호화하는 mRNA를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제242항 또는 제243항에 있어서, 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는 단백질 또는 이의 단편인, 조성물.
- 제233항 내지 제241항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원을 추가로 포함하는, 조성물.
- 제245항에 있어서, 2개 이상의 항원은 개체의 HLA 일배체형에 관계없이 면역 반응을 자극하는, 조성물.
- 제244항 내지 제246항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 암과 연관된 돌연변이된 단백질, 종양유전자의 산물, 신생항원, 바이러스 단백질, 박테리아 단백질, 또는 진균 단백질인, 조성물.
- 제244항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 인간 유두종바이러스(HPV) 단백질인, 조성물.
- 제248항에 있어서, HPV는 HPV-16 또는 HPV-18인, 조성물.
- 제248항 또는 제249항에 있어서, 단백질은 HPV E6 또는 HPV E7 단백질인, 조성물.
- 제244항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질은 B형 간염 바이러스(HBV) 단백질인, 조성물.
- 제251항에 있어서, HBV 단백질은 코어 단백질, 작은 표면 항원, 중간 표면 항원, 큰 표면 항원, e 항원, X 항원, 또는 중합효소 단백질인, 조성물.
- 제233항 내지 제252항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 복수의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)인, 조성물.
- 제253항에 있어서, 복수의 PBMC는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 또는 NK-T 세포 중 둘 이상을 포함하는, 조성물.
- 제233항 내지 제254항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 단핵구, 수지상 세포, 및/또는 NK-T 세포 중 하나 이상인, 조성물.
- 제233항 내지 제255항 중 어느 한 항에 있어서, 유핵 세포는 보조제로 컨디셔닝되어 컨디셔닝된 세포를 형성하는, 조성물.
- 제256항에 있어서, 유핵 세포는 세포가 컨디셔닝되도록 약 1시간 내지 약 24시간, 약 2시간 내지 약 10시간, 약 3시간 내지 약 6시간, 또는 약 4시간 동안 보조제와 함께 인큐베이션되는, 조성물.
- 제256항 또는 제257항에 있어서, 유핵 세포는 단백질 또는 이의 단편 또는 단백질 또는 이의 단편을 암호화하는 mRNA를 유핵 세포 내로 도입하기 전 또는 후에 컨디셔닝되는, 조성물.
- 제256항 내지 제258항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN), LPS, IFN-α, STING 작용제, RIG-I 작용제, 폴리이노신-폴리시티딜산, TLR3 작용제, TLR4 작용제, TLR7 작용제, TLR8 작용제, 또는 TLR9 작용제인, 조성물.
- 제256항 내지 제259항 중 어느 한 항에 있어서, 보조제는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)인, 조성물.
- 제234항 내지 제260항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. - 제261항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA인, 조성물.
- 제242항, 제244항, 및 제247항 내지 제262항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. - 제243항, 제244항, 및 제247항 내지 제262항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인 및 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. - 제263항 또는 제264항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및/또는 항원을 암호화하는 핵산은 mRNA인, 조성물.
- 제245항 내지 제262항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인 및 ?첫溶核觀壙? 유래된 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는, 조성물:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산 및 단백질로부터 유래된 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인 및 2개 이상의 항원을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. - 제261항 내지 제266항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포를 유도하는 방법은 다음 단계를 포함하는, 조성물:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하는 단계;
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(d) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계. - 제261항 내지 제266항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포를 유도하는 방법은 다음 단계를 포함하는, 방법:
(a) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계;
(b) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원과 함께 인큐베이션하는 단계;
(c) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 항원을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계; 또는
(d) 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산 및 2개 이상의 항원과 함께 인큐베이션하는 단계. - 제261항 내지 제268항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인, 조성물.
- 제261항 내지 제269항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인, 조성물.
- 제261항 내지 제270항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm인, 조성물.
- 제261항 내지 제271항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm인, 조성물.
- 제261항 내지 제272항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과하는, 조성물.
- 의약으로서 사용하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 제234항 내지 제273항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 포함하는, 조성물.
- 개체에서 암, 감염성 질환, 또는 바이러스 연관 질환을 치료하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은 제210항 내지 제248항 중 어느 한 항의 조성물의 유효량을 포함하는, 조성물.
- 제194항 내지 제233항 중 어느 한 항의 방법에 사용하기 위한 키트.
- 제234항 내지 제275항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 키트.
- 제250항 또는 제249항에 있어서, 상기 키트는 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 또는 면역 세포의 활성을 향상시키기 위한 지침이 포함된 패키지 삽입물 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 키트.
- 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산을 면역 세포에 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제279항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포는 다음 단계에 의해 제조되는, 방법:
a) 투입 면역 세포가 포함된 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시켜, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 통과하기에 충분히 큰 투입 면역 세포의 섭동을 유발하여 섭동된 투입 면역 세포를 형성하는 단계로서, 협착부의 직경은 현탁액 중 투입 면역 세포 직경의 함수인, 단계; 및
b) 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산이 발현되는 섭동된 투입 면역 세포에 핵산을 진입시키기 위해, 섭동된 투입 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암화화하는 핵산과 함께 인큐베이션하여 키메라 막-결합 사이토카인을 포함하는 면역 세포를 생성하는 단계. - 제280항에 있어서, 상기 방법은 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전, 도중, 및/또는 후에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제280항에 있어서, 상기 방법은 세포 현탁액을 세포 변형 협착부를 통과시키기 전에 면역 세포를 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 방법.
- 제280항, 제281항, 또는 제282항에 있어서, 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 핵산은 키메라 막-결합 사이토카인을 암호화하는 mRNA인, 방법.
- 제280항 내지 제283항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 투입 유핵 세포의 평균 직경의 약 10% 내지 약 99%인, 방법.
- 제280항 내지 제284항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm 내지 약 4.2 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 3.5 μm 내지 약 6 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 4.8 μm 또는 약 4.2 μm 내지 약 6 μm인, 방법.
- 제280항 내지 제285항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 3.5 μm인, 방법.
- 제280항 내지 제286항 중 어느 한 항에 있어서, 협착부의 폭은 약 4.5 μm인, 방법.
- 제280항 내지 제287항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 투입 유핵 세포를 포함하는 세포 현탁액은 직렬로 및/또는 병렬로 배열된 다수의 협착부를 통과하는, 방법.
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