TW202227125A - 使用有核細胞刺激對蛋白質之ｈｌａ－不可知免疫反應之方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供包含蛋白質或其片段之有核細胞、製造此類包含該蛋白質或其片段之有核細胞的方法及使用此類經修飾有核細胞(例如免疫細胞)以HLA不可知方式刺激免疫反應的方法。
Description
本發明大體上關於包含蛋白質或其片段之有核細胞、製造該等經修飾有核細胞之方法及使用該等經修飾有核細胞刺激免疫反應之方法。
抗原決定基疫苗的開發存在各種與其相關的挑戰。數十年來，對此等疫苗之研究一直為該領域的焦點，且儘管研究及開發HLA限制性抗原決定基疫苗來治療癌症並預防感染性疾病已取得實質性進展，但已知僅有一種基於肽之腎細胞癌疫苗(IMA901,9,10，由Immatics biotechnologies GmbH開發)進入了III期臨床試驗(world wide web.immatics.com)，亦參見Zhao, L等人, Hum Vaccin Immunother. 2013年12月1日; 9(12): 2566-2577。
儘管有效，但HLA限制性抗原決定基疫苗之侷限性在於，由於MHC限制的規則，該等疫苗的患者群體覆蓋度有限。在大多數情況下，例如限於HLA-A*02之單一肽抗原決定基疫苗僅適用於治療表現HLA-A*02之患者(人群之約40%)。產生不具有此等HLA限制且因此為HLA不可知性之疫苗將使得能夠治療所有患者，而不考慮HLA的表現。HLA不可知疫苗可藉由包括目標抗原全長蛋白作為疫苗之一部分來達成。全長蛋白可藉由遞送蛋白質本身、編碼全長蛋白之mRNA及/或使用重疊合成長肽(SLP)來達成。
以HLA不可知方式誘導內源性CD8
+T細胞反應之當前方法依賴於使抗原靶向樹突狀細胞以便交叉呈現。使抗原靶向樹突狀細胞及隨後交叉呈現具有混配低效率，通常引發CD4 T細胞反應，而忽略了CD8 T細胞反應。因此，需要在抗原決定基疫苗領域取得進展。由疾病相關抗原刺激之CD8
+細胞毒性T淋巴球(CTL)及CD4
+輔助T (Th)細胞具有靶向及破壞病變細胞的潛力。
本文所引用之所有參考文獻，包括專利申請案及公開案以全文引用之方式併入本文中。專利公開案WO 2016070136、US 20180142198、WO 2017008063、US 20180201889、WO 2019178005及WO 2019178006以及PCT/US2020/020194特此以全文引用之方式明確併入。
在一些態樣中，本發明提供刺激個體之免疫反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含蛋白質或其片段；其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些態樣中，本發明提供對有需要之個體進行疫苗接種的方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含蛋白質或其片段；其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。
在一些態樣中，本發明提供刺激個體之免疫反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些態樣中，本發明提供對有需要之個體進行疫苗接種的方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，mRNA之核苷酸序列經密碼子最佳化以在有核細胞中表現。在一些實施例中，mRNA之一或多個殘基經修飾。在一些實施例中，mRNA之一或多個殘基為硫代磷酸酯殘基、假尿苷殘基、N1-甲基腺苷殘基、5-甲基胞苷殘基或N-𠰌啉基殘基。
在一些實施例中，蛋白質或其片段為包含蛋白質或其片段及一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體的融合蛋白。在一些實施例中，mRNA包含一或多種編碼靶向免疫蛋白酶體之模體的核酸序列，其中mRNA之轉譯產生蛋白質與一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體的融合蛋白。在一些實施例中，相比於在不存在靶向免疫蛋白酶體之模體的情況下蛋白質在細胞中之降解及/或源於蛋白質之肽在細胞表面上之呈現，一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體增強蛋白質在細胞中之降解及/或源於蛋白質之肽在細胞表面上之呈現。在一些實施例中，一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體位於融合蛋白之N端及/或C端處。在一些實施例中，一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體為破壞盒(D-盒)域、KEKE域及/或sec/MITD域。
在一些態樣中，本發明提供刺激個體之免疫反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原；其中該等兩種或更多種抗原刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，本發明提供對有需要之個體進行疫苗接種之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原；其中兩種或更多種抗原刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，細胞包含三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或超過十個源於蛋白質之抗原。在一些實施例中，抗原中之至少兩個包含部分重疊之胺基酸序列。在一些實施例中，所有抗原之組合胺基酸序列與蛋白質之胺基酸序列重疊約90%或更多。在一些實施例中，抗原為包含蛋白質之兩個或更多個抗原決定基之多肽。在一些實施例中，抗原為包含蛋白質之一或多個抗原決定基及一或多個異源肽序列的多肽。在一些實施例中，一或多個抗原決定基在N端及/或C端上側接一或多個異源肽序列。在一些實施例中，N端及/或C端側接多肽源於免疫原性合成長肽(SLP)。在一些實施例中，N端及/或C端側接多肽源於疾病相關之免疫原性SLP。在一些實施例中，一或多種抗原為一系列重疊SLP，該等SLP對應於大於約90%之胺基酸序列蛋白質或約100%之蛋白質胺基酸序列。
在本發明之一些實施例中，其中蛋白質為與癌症相關之突變蛋白、致癌基因產物、新抗原、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白。在一些實施例中，刺激個體之免疫反應係用於治療癌症、感染性疾病或病毒相關疾病。在一些實施例中，該病毒相關疾病係與以下各者相關之疾病：人類乳突狀瘤病毒(HPV)、A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、單純疱疹病毒1 (HSV-1)、單純疱疹病毒(HSV-2)、水痘帶狀疱疹病毒(VZV)、人類疱疹病毒6 (HHV-6)、人類疱疹病毒7 (HHV-7)、人類疱疹病毒8 (HHV-8)、巨細胞病毒(CMV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)、EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)或流感。在一些實施例中，蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。在一些實施例中，HPV為HPV-16或HPV-18。在一些實施例中，蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。在一些實施例中，蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白質。在一些實施例中，HBV蛋白為核心蛋白、小表面抗原、中等表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
在本發明之一些實施例中，組合物進一步包含佐劑。在一些實施例中，組合物與佐劑結合投與。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
在本發明之一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含該蛋白質或其片段之有核細胞。在一些實施例中，包含編碼蛋白質或其片段之mRNA的有核細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的有核細胞。在一些實施例中，包含兩種或更多種抗原之有核細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育，使得該等兩種或更多種抗原能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含兩種或更多種抗原之有核細胞。在一些實施例中，收縮部寬度為輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，收縮部寬度為約3.0 µm至約4.2 µm，或約3.0 µm至約4.8 µm，或約3.0 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約3.5 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約4.5 µm或約4.0 µm。在一些實施例中，包含複數個輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中多個收縮部串聯及/或並聯配置。
在本發明之一些實施例中，有核細胞對於個體而言為自體或同種異體的。在一些實施例中，有核細胞係免疫細胞。在一些實施例中，有核細胞係複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。在一些實施例中，有核細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。在一些實施例中，有核細胞用佐劑調節，形成經調節細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約1小時至約24小時、約2小時至約10小時、約3小時至約6小時或約4小時以調節該等細胞。在一些實施例中，在將蛋白質或其片段或編碼蛋白質或其片段之mRNA引入有核細胞中之前或之後，調節有核細胞。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。在一些實施例中，佐劑為CpG 7909。
在本發明之一些實施例中，經調節細胞為複數個經調節PBMC。在一些實施例中，複數個PBMC經修飾以增加共刺激分子中之一或多者的表現。在一些實施例中，共刺激分子為B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些實施例中，複數個PBMC經修飾以增加一或多種細胞介素之表現。在一些實施例中，複數個PBMC經修飾以包含嵌合膜結合細胞介素。在一些實施例中，嵌合膜結合細胞介素為包含細胞介素及跨膜域之融合蛋白。在一些實施例中，細胞介素藉由肽連接子接合至跨膜域。在一些實施例中，肽連接子為(G
4S)
3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)
3(SEQ ID NO:74)。在一些實施例中，細胞介素為I型細胞介素。在一些實施例中，細胞介素為IL-15、IL-12、IL-2、IFN α、IFN β或IL-21或其功能變異體。在一些實施例中，嵌合膜結合細胞介素包含胺基酸序列SEQ ID NO: 77-80。
在一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC中之B細胞，一或多種共刺激分子在複數個經調節PBMC中之B細胞中上調，其中共刺激分子為CD80及/或CD86。在一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC，複數個PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者之增加的表現。在一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者的表現增加超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
在本發明之一些實施例中，包含有核細胞之組合物經複數次投與。在一些實施例中，組合物經靜脈內投與。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，組合物在另一種療法投與之前、同時或之後投與。在一些實施例中，另一種療法為化學療法、輻射療法、抗體、細胞介素、免疫檢查點抑制劑或免疫腫瘤學療法中所用之雙特異性多肽。
在一些態樣中，本發明提供包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含蛋白質或其片段；其中蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些態樣中，本發明提供一種包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些實施例中，mRNA之核苷酸序列經密碼子最佳化以在有核細胞中表現。在一些實施例中，mRNA之一或多個殘基經修飾。在一些實施例中，mRNA之一或多個殘基為硫代磷酸酯殘基、假尿苷殘基、N1-甲基腺苷殘基、5-甲基胞苷殘基或N-𠰌啉基殘基。
在一些實施例中，蛋白質或其片段為包含蛋白質或其片段及一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體的融合蛋白。在一些實施例中，mRNA包含一或多種編碼靶向免疫蛋白酶體之模體的核酸序列，其中mRNA之轉譯產生蛋白質與一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體的融合蛋白。在一些實施例中，相比於在不存在靶向免疫蛋白酶體之模體的情況下蛋白質在細胞中之降解及/或源於蛋白質之肽在細胞表面上之呈現，一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體增強蛋白質在細胞中之降解及/或源於蛋白質之肽在細胞表面上之呈現。在一些實施例中，一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體位於融合蛋白之N端及/或C端處。在一些實施例中，一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體為破壞盒(D-盒)域、KEKE域及/或sec/MITD域。
在一些實施例中，本發明提供包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原；其中蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些實施例中，細胞包含三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或超過十個源於蛋白質之抗原。在一些實施例中，抗原中之至少兩個包含部分重疊之胺基酸序列。在一些實施例中，所有抗原之組合胺基酸序列與蛋白質之胺基酸序列重疊約90%或更多。在一些實施例中，抗原為包含蛋白質之兩個或更多個抗原決定基之多肽。在一些實施例中，抗原為包含蛋白質之一或多個抗原決定基及一或多個異源肽序列的多肽。在一些實施例中，一或多個抗原決定基在N端及/或C端上側接一或多個異源肽序列。在一些實施例中，N端及/或C端側接多肽源於免疫原性合成長肽(SLP)。在一些實施例中，N端及/或C端側接多肽源於疾病相關之免疫原性SLP。在一些實施例中，一或多種抗原為一系列重疊SLP，該等SLP對應於大於約90%之胺基酸序列蛋白質或約100%之蛋白質胺基酸序列。
在本發明之一些實施例中，其中蛋白質為與癌症相關之突變蛋白、致癌基因產物、新抗原、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白。在一些實施例中，刺激個體之免疫反應係用於治療癌症、感染性疾病或病毒相關疾病。在一些實施例中，該病毒相關疾病係與以下各者相關之疾病：人類乳突狀瘤病毒(HPV)、A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、單純疱疹病毒1 (HSV-1)、單純疱疹病毒(HSV-2)、水痘帶狀疱疹病毒(VZV)、人類疱疹病毒6 (HHV-6)、人類疱疹病毒7 (HHV-7)、人類疱疹病毒8 (HHV-8)、巨細胞病毒(CMV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)、EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)或流感。在一些實施例中，蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。在一些實施例中，HPV為HPV-16或HPV-18。在一些實施例中，蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。在一些實施例中，蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白質。在一些實施例中，HBV蛋白為核心蛋白、小表面抗原、中等表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。在一些實施例中，蛋白質為CMV蛋白質。在一些實施例中，蛋白質為CMV結構蛋白。在一些實施例中，蛋白質為CMV pp65蛋白質。在一些實施例中，蛋白質為流感蛋白。在一些實施例中，蛋白質為流感基質蛋白。在一些實施例中，蛋白質為流感蛋白。在一些實施例中，蛋白質為流感基質蛋白。在一些實施例中，蛋白質為流感M1蛋白。在一些實施例中，刺激個體之免疫反應係用於治療黑色瘤。在一些實施例中，蛋白質係由T細胞(MART-1)識別之黑素瘤相關抗原。
在本發明之一些實施例中，組合物進一步包含佐劑。在一些實施例中，組合物與佐劑結合投與。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
在本發明之一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含該蛋白質或其片段之有核細胞。在一些實施例中，包含編碼蛋白質或其片段之mRNA的有核細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的有核細胞。在一些實施例中，包含兩種或更多種抗原之有核細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育，使得該等兩種或更多種抗原能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含兩種或更多種抗原之有核細胞。在一些實施例中，收縮部寬度為輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，收縮部寬度為約3.0 µm至約4.2 µm，或約3.0 µm至約4.8 µm，或約3.0 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約3.5 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約4.5 µm或約4.0 µm。在一些實施例中，包含複數個輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中多個收縮部串聯及/或並聯配置。
在本發明之一些實施例中，有核細胞對於個體而言為自體或同種異體的。在一些實施例中，有核細胞係免疫細胞。在一些實施例中，有核細胞係複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。在一些實施例中，有核細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。在一些實施例中，有核細胞用佐劑調節，形成經調節細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約1小時至約24小時、約2小時至約10小時、約3小時至約6小時或約4小時以調節該等細胞。在一些實施例中，在將蛋白質或其片段或編碼蛋白質或其片段之mRNA引入有核細胞中之前或之後，調節有核細胞。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。在一些實施例中，佐劑為CpG 7909。
在本發明之一些實施例中，經調節細胞為複數個經調節PBMC。在一些實施例中，複數個PBMC經修飾以增加共刺激分子中之一或多者的表現。在一些實施例中，共刺激分子為B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些實施例中，複數個PBMC經修飾以增加一或多種細胞介素之表現。在一些實施例中，複數個PBMC經修飾以包含嵌合膜結合細胞介素。在一些實施例中，嵌合膜結合細胞介素為包含細胞介素及跨膜域之融合蛋白。在一些實施例中，細胞介素藉由肽連接子接合至跨膜域。在一些實施例中，肽連接子為(G
4S)
3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)
3(SEQ ID NO:74)。在一些實施例中，細胞介素為I型細胞介素。在一些實施例中，細胞介素為IL-15、IL-12、IL-2、IFN α、IFN β或IL-21或其功能變異體。在一些實施例中，嵌合膜結合細胞介素包含胺基酸序列SEQ ID NO: 77-80。
在一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC中之B細胞，一或多種共刺激分子在複數個經調節PBMC中之B細胞中上調，其中共刺激分子為CD80及/或CD86。在一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC，複數個PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者之增加的表現。在一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者的表現增加超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
在一些態樣中，本發明提供用於刺激個體之免疫反應的組合物，其中該組合物包含有效量之如本文所述之組合物，其中該組合物以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些態樣中，本發明提供用作藥物之組合物，其中該組合物包含有效量之如本文所述之組合物，其中該組合物以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些態樣中，本發明提供用於治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的組合物，其中該組合物包含有效量之如本文所述之組合物，其中該組合物以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些實施例中，組合物進一步包含佐劑。在一些實施例中，組合物與佐劑結合投與。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖苷腦醯胺、STING激動劑、環二核苷酸(CDN)、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。在一些實施例中，包含有核細胞之組合物經複數次投與。在一些實施例中，組合物經靜脈內投與。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，組合物在另一種療法投與之前、同時或之後投與。在一些實施例中，另一種療法為化學療法、輻射療法、抗體、細胞介素、免疫檢查點抑制劑或免疫腫瘤學療法中所用之雙特異性多肽。
在一些態樣中，本發明提供一種組合物之用途，其用於製造用於刺激個體之免疫反應的藥劑，其中該組合物包含有效量之如本文所述之組合物，其中該組合物以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些態樣中，本發明提供一種組合物在製造用於治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病之藥劑中的用途，其中該組合物包含有效量之如本文所述之組合物，其中該組合物以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些實施例中，組合物進一步包含佐劑。在一些實施例中，組合物經調配以用於與佐劑結合投與。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖苷腦醯胺、STING激動劑、環二核苷酸(CDN)、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。在一些實施例中，包含有核細胞之組合物經複數次投與。在一些實施例中，組合物經靜脈內投與。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，組合物在另一種療法投與之前、同時或之後投與。在一些實施例中，另一種療法為化學療法、輻射療法、抗體、細胞介素、免疫檢查點抑制劑或免疫腫瘤學療法中所用之雙特異性多肽。
在一些實施例中，本發明提供一種用於本文所描述之方法中之任一者中的套組。在一些實施例中，本發明提供包含本文所描述之組合物中之任一者的套組。在一些實施例中，套組進一步包含緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器或關於向個體投與該組合物以HLA不可知方式刺激免疫反應之說明的藥品說明書中之一或多者。
在一些態樣中，本發明提供產生包含蛋白質或其片段之有核細胞之方法；該方法包含將該蛋白質或其片段引入有核細胞中，其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些態樣中，本發明提供產生包含蛋白質或其片段之有核細胞的方法；該方法包含將編碼蛋白質或其片段之mRNA引入有核細胞中，其中該mRNA經表現以產生蛋白質或其片段；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些態樣中，本發明提供產生包含兩種或更多種來自蛋白質之抗原的有核細胞之方法；該方法包含將兩種或更多種抗原引入有核細胞中；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些實施例中，將蛋白質或其片段引入有核細胞內包含：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含該蛋白質或其片段之有核細胞。在本發明之一些實施例中，包含編碼蛋白質或其片段之mRNA的有核細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的有核細胞。在一些實施例中，包含兩種或更多種抗原之有核細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育，使得該等兩種或更多種抗原能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含兩種或更多種抗原之有核細胞。在一些實施例中，收縮部寬度為輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，收縮部寬度為約3.5 µm至約4.2 µm，或約3.5 µm至約4.8 µm，或約3.5 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約3.5 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約4.5 µm。在一些實施例中，包含複數個輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中多個收縮部串聯及/或並聯配置。在一些實施例中，該方法進一步包含用佐劑調節該等有核細胞，形成經調節細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約1小時至約24小時、約2小時至約10小時、約3小時至約6小時或約4小時以調節該等細胞。在一些實施例中，在將蛋白質或其片段、編碼蛋白質或其片段之mRNA或來自蛋白質之兩種或更多種抗原引入有核細胞中之前或之後，調節有核細胞。
在一些態樣中，本發明提供增強免疫細胞活性之方法，該等方法包含表現編碼免疫細胞中之嵌合膜結合細胞介素的核酸。在一些實施例中，嵌合膜結合細胞介素為包含跨膜域及細胞介素之融合蛋白。在一些實施例中，跨膜域為運鐵蛋白受體蛋白1 (TFRC)或腫瘤壞死因子跨膜域。在一些實施例中，細胞介素為I型細胞介素。在一些實施例中，細胞介素為IL-15、IL-12、IL-2、IFN α、IFN β或IL-21或其功能變異體。在一些實施例中，細胞介素藉由肽連接子接合至跨膜域。在一些實施例中，肽連接子為(G
4S)
3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)
3(SEQ ID NO:74)。在一些實施例中，嵌合膜結合細胞介素包含胺基酸序列SEQ ID NO: 77-80。
在一些實施例中，免疫細胞進一步包含抗原。在一些實施例中，免疫細胞進一步包含編碼抗原之mRNA。在一些實施例中，抗原為蛋白質或其片段，其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，免疫細胞進一步包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原。在一些實施例中，兩種或更多種抗原均刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，蛋白質為與癌症相關之突變蛋白、致癌基因產物、新抗原、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白。在一些實施例中，蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。在一些實施例中，HPV為HPV-16或HPV-18。在一些實施例中，蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。在一些實施例中，蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白質。在一些實施例中，HBV蛋白為核心蛋白、小表面抗原、中等表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
在本發明之一些實施例中，免疫細胞為複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。在一些實施例中，免疫細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。在一些實施例中，有核細胞用佐劑調節，形成經調節細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約1小時至約24小時、約2小時至約10小時、約3小時至約6小時或約4小時以調節該等細胞。在一些實施例中，在將蛋白質或其片段或編碼蛋白質或其片段之mRNA引入有核細胞中之前或之後，調節有核細胞。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。
在本發明之一些實施例中，包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸為編碼嵌合膜結合細胞介素之mRNA。在一些實施例中，包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及該抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該抗原一起培育，使得該核酸及該抗原能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。在一些實施例中，包含嵌合膜結合細胞介素及編碼蛋白質或其片段之mRNA的免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼該抗原之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及/或編碼抗原之核酸為mRNA。在一些實施例中，包含嵌合膜結合細胞介素及兩種或更多種源於蛋白質之抗原的免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。在一些實施例中，收縮部寬度為輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，收縮部寬度為約3.5 µm至約4.2 µm，或約3.5 µm至約4.8 µm，或約3.5 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約3.5 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約4.5 µm或約4.0 µm。在一些實施例中，包含複數個輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中多個收縮部串聯及/或並聯配置。
在一些態樣中，本發明提供用於增強免疫細胞活性之組合物，該組合物包含免疫細胞中之嵌合膜結合細胞介素。在一些實施例中，嵌合膜結合細胞介素為包含跨膜域及細胞介素之融合蛋白。在一些實施例中，跨膜域為運鐵蛋白受體蛋白1 (TFRC)或腫瘤壞死因子跨膜域。在一些實施例中，細胞介素為I型細胞介素。在一些實施例中，細胞介素為IL-15、IL-12、IL-2、IFN α、IFN β或IL-21或其功能變異體。在一些實施例中，細胞介素藉由肽連接子接合至跨膜域。在一些實施例中，肽連接子為(G
4S)
3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)
3(SEQ ID NO:74)。在一些實施例中，嵌合膜結合細胞介素包含胺基酸序列SEQ ID NO: 77-80。
在一些實施例中，免疫細胞進一步包含抗原。在一些實施例中，免疫細胞進一步包含編碼抗原之mRNA。在一些實施例中，抗原為蛋白質或其片段，其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，免疫細胞進一步包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原。在一些實施例中，兩種或更多種抗原均刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，蛋白質為與癌症相關之突變蛋白、致癌基因產物、新抗原、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白。在一些實施例中，蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。在一些實施例中，HPV為HPV-16或HPV-18。在一些實施例中，蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。在一些實施例中，蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白質。在一些實施例中，HBV蛋白為核心蛋白、小表面抗原、中等表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
在本發明之一些實施例中，免疫細胞為複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。在一些實施例中，免疫細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。在一些實施例中，有核細胞用佐劑調節，形成經調節細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約1小時至約24小時、約2小時至約10小時、約3小時至約6小時或約4小時以調節該等細胞。在一些實施例中，在將蛋白質或其片段或編碼蛋白質或其片段之mRNA引入有核細胞中之前或之後，調節有核細胞。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。
在本發明之一些實施例中，包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸為編碼嵌合膜結合細胞介素之mRNA。在一些實施例中，包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及該抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該抗原一起培育，使得該核酸及該抗原能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。在一些實施例中，包含嵌合膜結合細胞介素及編碼蛋白質或其片段之mRNA的免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼該抗原之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及/或編碼抗原之核酸為mRNA。在一些實施例中，包含嵌合膜結合細胞介素及兩種或更多種源於蛋白質之抗原的免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。在一些實施例中，收縮部寬度為輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，收縮部寬度為約3.5 µm至約4.2 µm，或約3.5 µm至約4.8 µm，或約3.5 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約3.5 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約4.5 µm。在一些實施例中，包含複數個輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中多個收縮部串聯及/或並聯配置。
在一些態樣中，本發明提供用作藥物之組合物，其中該組合物包含有效量的包含細胞之組合物，該等細胞包含如本文中所描述之嵌合膜結合細胞介素。在一些態樣中，本發明提供用於治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的組合物，其中該組合物包含有效量的包含細胞之組合物，該等細胞包含如本文所描述之嵌合膜結合細胞介素。
在一些態樣中，本發明提供產生包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞的方法，該方法包含將編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸引入免疫細胞中。在一些實施例中，包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸為編碼嵌合膜結合細胞介素之mRNA。在一些實施例中，收縮部寬度為輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，收縮部寬度為約3.5 µm至約4.2 µm，或約3.5 µm至約4.8 µm，或約3.5 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約3.5 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約4.5 µm。在一些實施例中，包含複數個輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中多個收縮部串聯及/或並聯配置。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2020年9月2日申請之美國臨時申請案第63/073,910號及2021年2月9日申請之美國臨時申請案第63/147,473號的權益，其各者之全部內容以引用之方式併入本文中。
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在一些態樣中，本發明提供仿擬個體免疫反應及/或疫苗接種有需要之個體的方法，其包含向個體投與包含有包含蛋白質或其片段的有核細胞(例如PBMC)之組合物，其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些態樣中，本發明提供仿擬個體之免疫反應及/或疫苗接種有需要之個體的方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，該等有核細胞包含胞內遞送之蛋白質或其片段；其中有核細胞係藉由以下製備：首先，使包含輸入細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供蛋白質或其片段穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；且隨後將經擾動之輸入有核細胞與蛋白質或其片段一起培育足夠的時間，使得蛋白質或其片段能夠進入經擾動之輸入細胞；由此產生包含蛋白質或其片段之經修飾有核細胞，其中該蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些態樣中，本發明提供仿擬個體之免疫反應及/或疫苗接種有需要之個體的方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，該等有核細胞包含胞內遞送之蛋白質或其片段；其中該等有核細胞係藉由以下製備：首先，使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中編碼該蛋白質或其片段之該mRNA於該等有核細胞中表現，由此產生包含該蛋白質或其片段之經修飾有核細胞，其中該蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。本發明之某些態樣係關於產生包含有包含胞內遞送之蛋白質或其片段的有核細胞之組合物的方法，其中使有核細胞穿過收縮部，其中該收縮部使該細胞變形，由此引起該細胞之擾動，使得蛋白質或其片段進入待修飾之免疫細胞。在一些實施例中，有核細胞係複數個PBMC。在一些實施例中，有核細胞係藉由與一或多種佐劑一起培育來調節。在一些實施例中，引入胞內之蛋白質或片段包含整個或實質上大部分天然蛋白質序列。在一些實施例中，引入胞內的由mRNA編碼之蛋白質或片段包含整個或實質上大部分天然蛋白質序列。
熟習此項技術者一般很好理解本文中所描述或提及之技術及程序且通常使用習知方法使用，諸如以下中描述的廣泛利用的方法：
Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Sambrook等人, 第4版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012);
Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel等人編, 2003)；系列
Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.);
PCR 2: A Practical Approach(M.J. MacPherson, B.D. Hames及G.R. Taylor eds., 1995);
Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow及Lane編, 1988);
Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications(R.I. Freshney, 第6版, J. Wiley and Sons, 2010);
Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait編, 1984);
Methods in Molecular Biology, Humana Press;
Cell Biology: A Laboratory Notebook(J.E. Cellis編, Academic Press, 1998);
Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P. Mather及P.E. Roberts, Plenum Press, 1998);
Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures(A. Doyle, J.B. Griffiths及D.G. Newell編, J. Wiley and Sons, 1993-8);
Handbook of Experimental Immunology(D.M. Weir及C.C. Blackwell編, 1996);
Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M. Miller及M.P. Calos編, 1987);
PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis等人編, 1994);
Current Protocols in Immunology(J.E. Coligan等人編, 1991);
Short Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人編, J. Wiley and Sons, 2002);
Immunobiology(C.A. Janeway等人, 2004);
Antibodies(P. Finch, 1997);
Antibodies: A Practical Approach(D. Catty編, IRL Press, 1988-1989);
Monoclonal Antibodies: A Practical Approach(P. Shepherd及C. Dean編, Oxford University Press, 2000);
Using Antibodies: A Laboratory Manual(E. Harlow及D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999);
The Antibodies(M. Zanetti及J. D. Capra編, Harwood Academic Publishers, 1995); 及
Cancer: Principles and Practice of Oncology(V.T. DeVita等人編, J.B. Lippincott Company, 2011)。
定義
出於解釋本說明書之目的，將應用以下定義且只要合適，以單數形式使用之術語亦將包括複數形式且反之亦然。在以下闡述之任何定義與以引用之方式併入本文中之任何文獻矛盾的情況下，應以所闡述之定義為準。
除非另外指示，否則如本文所用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參考物。
應理解，本文所述之本發明之態樣及實施例包括「包含」態樣及實施例、「由」態樣及實施例「組成」及「基本上由」態樣及實施例「組成」。
如本文所用，術語「約」係指此技術領域之技術人員易於知曉之相應值的常見誤差範圍。本文中對「約」一值或參數之提及包括(且描述)本身係關於彼值或參數之實施例。
如本文所用，「治療」為用於獲得有利的或所期望的臨床結果之途徑。如本文所用之「治療」涵蓋對於包括人類在內之哺乳動物之疾病進行之任何投與或施用治療方案。出於本發明之目的，有益或所需臨床結果包括但不限於以下中之任一者或多者：緩解一或多個症狀；減輕疾病程度；預防或延遲疾病擴散(例如癌轉移，例如癌轉移至肺或至淋巴結)；預防或延遲疾病復發；延遲或減緩疾病進展；改善疾病病況；抑制疾病或疾病之進展；抑制或減緩疾病或其進展；遏制其發展；及緩和(無論為部分的抑或為完全的)。「治療」亦涵蓋增殖性疾病之病理後果減輕。本發明之方法涵蓋該等治療態樣中之任一者或多者。
如本文所用，術語「預防性治療」係指治療，其中已知或懷疑個體患有病症或具有患有病症之風險，但未顯示病症之症狀或最小症狀。經歷預防性治療之個體可在症狀發作之前進行治療。在一些實施例中，若個體患有癌前病變，則可治療個體。
如本文所用，「組合療法」意謂第一藥劑與另一藥劑結合投與。「與……結合」係指投與一種除另一種治療模態之外的治療模態，諸如除向同一個體投與如本文所述之免疫結合物之外，亦投與如本文所述之有核細胞的組合物。因此，「與......結合」係指在向個體遞送一種治療模態之前、在遞送一種治療模態期間或在遞送一種治療模態之後投與另一種治療模態。
如本文所用之術語「同時投與」意謂以不超過約15分鐘(諸如不超過約10分鐘、5分鐘或1分鐘中之任一者)之時間間隔投與組合療法中之第一療法及第二療法。當同時投與第一及第二療法時，第一及第二療法可包含於同一組合物(例如包含第一及第二療法兩者之組合物)或分開之組合物中(例如，第一療法在一種組合物中且第二療法含於另一組合物中)。
如本文所用，術語「依序投與」意謂以超過約15分鐘(諸如超過約20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘、60分鐘或更長時間中之任一者)之時間間隔投與組合療法中之第一療法及第二療法。可首先投與第一療法或第二療法。第一及第二療法含於分開之組合物中，其可含於相同或不同包裝或套組中。
如本文所用，術語「並行投與」意謂組合療法中之第一療法之投與及第二療法之投與彼此重疊。
在癌症之情況下，術語「治療」包括以下任一種或全部：抑制癌細胞生長、抑制癌細胞複製、減小整體腫瘤負荷及改善與疾病相關之一或多種症狀。
如本文所用，術語「孔」係指開口，包括但不限於材料內之孔洞、撕裂口、空腔、孔隙、破口、間隙或穿孔。在一些實施例中，(其中指示)術語係指本發明表面內之孔。在其他實施例中，(其中指示)孔可指細胞膜中之孔。
如本文所用，術語「膜」係指選擇性障壁或含有孔之薄片。該術語包括充當邊界或襯裡之柔韌的薄片狀結構。在一些實例中，該術語係指含孔表面或過濾器。此術語不同於術語「細胞膜」。
如本文所用，術語「過濾器」係指允許選擇性通過孔之多孔物件。在一些實例中，該術語係指含孔表面或膜。
當參考藥劑，諸如抗原或佐劑使用時，與細胞相關之術語「外源性」係指細胞外部藥劑或自細胞外部遞送至細胞中之藥劑。細胞可或可不具有已存在之藥劑，且可或可不在已遞送外源性藥劑之後產生藥劑。
如本文所用，術語「異質」係指結構或組成混合或不均勻的某物。在一些實例中，該術語係指在給定表面內具有不同尺寸、形狀或分佈之孔。
如本文所用，術語「均質」係指結構或組成始終一致或均勻的某物。在一些實例中，該術語係指在給定表面內具有一致尺寸、形狀或分佈之孔。
如本文所用，術語「同源」係指衍生自相同生物體之分子。在一些實例中，該術語係指通常在給定生物體內發現或表現之核酸或蛋白質。
在係關於諸如編碼序列及控制序列之核酸序列時，術語「異源」表示不正常地接合在一起及/或不正常地與特定細胞結合之序列。因此，核酸構築體或載體之「異源」區域為在自然界中未發現與另一分子結合之另一核酸分子內或附接至該另一核酸分子的核酸的鏈段。舉例而言，核酸構築體之異源區域可包括在自然界中未發現與編碼序列結合之序列側接的編碼序列。異源編碼序列之另一實例為編碼序列本身在自然界中未發現之構築體(例如，具有不同於天然基因之密碼子的合成序列)。類似地，出於本發明之目的，藉由通常不存在於細胞中之構築體轉型之細胞將被視為異源的。如本文所用，對偶基因變異或天然存在之突變事件不產生異源DNA。
在關於諸如肽序列及多肽序列之胺基酸序列時，術語「異源」表示不正常地接合在一起及/或不正常地與特定細胞結合之序列。因此，肽序列之「異源」區域為在另一胺基酸分子內或附接至另一胺基酸分子的胺基酸鏈段，該另一胺基酸分子在自然界中未發現與另一分子結合。舉例而言，肽構築體之異源區域可包括肽之胺基酸序列，該肽之胺基酸序列側接未發現與自然界中之肽之胺基酸序列結合的序列。異源肽序列之另一實例為其中肽序列本身在自然界中未有發現之構築體(例如具有與天然基因所編碼不同之胺基酸的合成序列)。類似地，出於本發明之目的，用表現通常不存在於細胞中之胺基酸構築體的載體轉型之細胞將視為異源的。如本文所用，對偶基因變異或天然存在之突變事件不產生異源肽。
如本文所用，術語「抑制」可指阻斷、減少、消除或以其他方式拮抗特定目標之存在或活性的操作。抑制可指部分抑制或完全抑制。舉例而言，抑制免疫反應可指任何引起免疫反應之阻斷、減少、消除或任何其他拮抗作用之操作。在其他實例中，核酸表現之抑制可包括但不限於核酸轉錄之降低、mRNA豐度之降低(例如，沉默mRNA轉錄)、mRNA之降解、mRNA轉譯之抑制等。在另一實例中，抑制可指減緩或終止生長之操作；例如，延遲或阻止腫瘤細胞生長。
如本文所用，術語「遏制」可指減少、降低、阻止、限制、減輕或以其他方式減少特定目標之存在或活性的操作。遏制可指部分遏制或完全遏制。舉例而言，遏制免疫反應可指任何引起減少、降低、阻止、限制、減輕或以其他方式減少免疫反應之操作。在其他實例中，核酸表現之遏制可包括但不限於核酸轉錄之降低、mRNA豐度之降低(例如，沉默mRNA轉錄)、mRNA之降解、mRNA轉譯之抑制等。
如本文所用，術語「增強」可指改善、促進、加強或以其他方式增加特定目標之存在或活性的操作。舉例而言，增強免疫反應可指任何引起改善、促進、加強或以其他方式增加免疫反應之操作。在一個例示性實例中，增強免疫反應可指採用抗原及/或佐劑改善、促進、加強或以其他方式增加免疫反應。在其他實例中，增強核酸表現可包括但不限於核酸轉錄之增加、mRNA豐度之增加(例如，增加mRNA轉錄)、mRNA降解之減少、mRNA轉譯之增加等。
如本文所用，術語「調節」可指改變、更改、變更或以其他方式修改特定目標之存在或活性的操作。舉例而言，調節免疫反應可指任何引起改變、更改、變更或以其他方式修改免疫反應之操作。在一些實例中，「調節」係指增強特定目標之存在或活性。在一些實例中，「調節」係指遏制特定目標之存在或活性。在其他實例中，調節核酸表現可包括但不限於核酸轉錄之改變、mRNA豐度之改變(例如，增加mRNA轉錄)、mRNA降解之對應改變、mRNA轉譯之改變等。
如本文所用，術語「誘導」可指代起始、促使、刺激、建立或以其他方式產生結果的操作。舉例而言，誘導免疫反應可指任何引起起始、促使、刺激、建立或以其他方式產生所需免疫反應之操作。在其他實例中，誘導核酸表現可包括但不限於核酸轉錄之起始、mRNA轉譯之起始等。
如本文所用，「周邊血液單核細胞」或「PBMC」係指具有圓形核之血細胞之異質母體。可在PBMC群體中發現之細胞之實例包括淋巴球，諸如T細胞、B細胞、NK細胞(包括自然殺手T細胞(NKT細胞)及細胞介素誘導之殺手細胞(CIK細胞))，以及單核球，諸如巨噬細胞及樹突狀細胞。如本文所用，「複數個PBMC」係指包含具有至少兩種血細胞類型之細胞的PBMC製備物。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞中之兩者或更多者。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞中之三者或三者以上。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞中之四種或四種以上。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞。
可藉由此項技術中已知之方法分離PBMC。舉例而言，可基於PBMC與其他血細胞相比之密度，自個體之周邊血液得到PBMC。在一些實施例中，使用Ficoll (例如，ficoll梯度)，自個體之周邊血液得到PBMC。在一些實施例中，使用ELUTRA®細胞分離系統，自個體之周邊血液得到PBMC。可自經歷血球分離術之個體獲得PBMC。
在一些實施例中，自個體分離出PBMC群體。在一些實施例中，複數個PBMC為自體PBMC群體，其中群體源於特定個體，藉由本文所描述之方法中之任一者操縱且返回至特定個體。在一些實施例中，複數個PBMC為同種異體PBMC群體，其中該群體源於一個個體，藉由本文所描述之方法中之任一者操縱且向第二個個體投與。
在一些實施例中，複數個PBMC為重構PBMC製備物。在一些實施例中，複數個PBMC可藉由混合通常發現於PBMC群體中之細胞產生；例如藉由混合T細胞、B細胞、NK細胞或單核球中之兩者或更多者之群體來產生。
如本文所用，術語「聚核苷酸」或「核酸」係指任何長度之核苷酸之聚合形式，為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸。因此，此術語包括但不限於單股、雙股或多股DNA或RNA、基因體DNA、cDNA、DNA-RNA雜交體或包含嘌呤及嘧啶鹼基或其他天然、經化學或生物化學修飾、非天然或衍生之核苷酸鹼基的聚合物。聚核苷酸之主鏈可包含糖及磷酸酯基團(如通常可於RNA或DNA中發現)，或經修飾或取代之糖或磷酸酯基團。替代地，聚核苷酸之主鏈可包含合成次單元之聚合物，諸如胺基磷酸酯及硫代磷酸酯，且因此可為寡去氧核苷胺基磷酸酯(P-NH2)、混合硫代磷酸酯-磷酸二酯寡聚物或混合胺基磷酸酯-磷酸二酯寡聚物。此外，雙股聚核苷酸可藉由在適當條件下合成互補股且黏接股，或藉由使用具有適當引子之DNA聚合酶重新合成互補股，來自化學合成之單股聚核苷酸產物獲得。
術語「多肽」及「蛋白質」可互換使用且係指胺基酸殘基之聚合物，且不限於最小長度。此類胺基酸殘基之聚合物可含有天然或非天然胺基酸殘基且包括但不限於胺基酸殘基構成之肽、寡肽、二聚體、三聚體及多聚體。全長蛋白質與其片段皆涵蓋於該定義中。術語亦包括多肽之表現後修飾，例如糖基化、唾液酸化、乙醯化、磷酸化及類似修飾。此外，出於本發明之目的，「多肽」係指包括對天然序列之修飾(諸如缺失、添加及取代(一般為保守性質))之蛋白質，只要該蛋白質維持所要活性即可。此等修飾可為有意的，如經由定點突變誘發進行；或可為偶然的，諸如經由產生蛋白質之宿主的突變或由於PCR擴增所引起的錯誤引起。
如本文所用，術語「佐劑」係指調節及/或引起免疫反應之物質。一般而言，佐劑與抗原結合投與以實現與僅抗原相比對抗原增強之免疫反應。多種佐劑描述於本文中。
本文中術語「CpG寡去氧核苷酸」及「CpG ODN」係指長度為10至30個核苷酸，含有由磷酸酯分離之胞嘧啶及鳥嘌呤之二核苷酸(在本文中亦稱為「CpG」二核苷酸或「CpG」)的DNA分子。本發明之CpG ODN含有至少一種未甲基化CpG二核苷酸。亦即，CpG二核苷酸中之胞嘧啶未經甲基化(亦即，不為5-甲基胞嘧啶)。CpG ODN可具有部分或完全硫代磷酸酯(PS)主鏈。
如本文所用，「醫藥學上可接受」或「藥理學相容性」意謂在生物學上或在其他方面無不良影響之材料，亦即，該材料可併入投與患者之醫藥組合物中而不會引起任何顯著不良生物學效應或以有害方式與含有其之組合物中的任何其他組分相互作用。醫藥學上可接受之載劑或賦形劑較佳滿足毒理學及製造測試之必需標準及/或包括於美國食品藥物管理局(U.S. Food and Drug administration)制定之非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)中。
對於本文所描述之結構及功能特徵中之任一者，測定此等特徵之方法為此項技術中已知的。
無關於宿主 HLA 單倍型刺激免疫反應之方法
在一些態樣中，提供刺激個體之免疫反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞(例如PBMC)之組合物，其中該等有核細胞包含蛋白質或其片段；其中該蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，該方法包含投與有效量的本文所描述之組合物中之任一者。在一些實施例中，個體患有癌症。
在一些態樣中，提供對有需要之個體進行疫苗接種的方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含蛋白質或其片段；其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。
在一些態樣中，提供刺激個體之免疫反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA (例如外源性mRNA)；其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。
在一些態樣中，提供對有需要之個體進行疫苗接種的方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA (例如外源性mRNA)；其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。
在一些實施例中，提供刺激個體之免疫反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原；其中兩種或更多種抗原刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，提供刺激個體之免疫反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原；其中兩種或更多種抗原刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。
在一些實施例中，細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原。在一些實施例中，細胞包含約以下中之任一者：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、70、75、80、90、100種或更多種源於蛋白質之抗原。在一些實施例中，抗原中之至少兩個包含部分重疊之胺基酸序列。在一些實施例中，所有抗原之組合胺基酸序列與蛋白質之胺基酸序列重疊約90%或更多。在一些實施例中，所有抗原之組合胺基酸序列與約以下中之任一者重疊：50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%蛋白質之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質之約80%胺基酸序列之各胺基酸與至少兩種源於蛋白質之抗原重疊。在一些實施例中，蛋白質之約80%胺基酸序列之各胺基酸與至少三種源於蛋白質之抗原重疊。在一些實施例中，蛋白質之約90%胺基酸序列之各胺基酸與至少兩種源於蛋白質之抗原重疊。在一些實施例中，蛋白質之約90%胺基酸序列之各胺基酸與至少三種源於蛋白質之抗原重疊。在一些實施例中，蛋白質之約95%胺基酸序列之各胺基酸與至少兩種源於蛋白質之抗原重疊。在一些實施例中，蛋白質之約95%胺基酸序列之各胺基酸與至少三種源於蛋白質之抗原重疊。
在一些實施例中，抗原為包含蛋白質之兩個或更多個抗原決定基之多肽。在一些實施例中，免疫原性肽抗原決定基融合至N端側接多肽及/或C端側接多肽。在一些實施例中，抗原為一或多個蛋白質抗原決定基及一或多個異源肽序列。在一些實施例中，一或多個抗原決定基在N端及/或C端上側接異源肽序列。在一些實施例中，側接異源肽序列源於疾病相關之免疫原性肽。在一些實施例中，側接異源肽序列為非天然存在之序列。在一些實施例中，側接異源肽序列源於免疫原性合成長肽(SLP)。在一些實施例中，N端側接多肽包含SEQ ID NO: 5-10中之任一者之胺基酸序列，及/或C端側接多肽包含SEQ ID NO: 11-17中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原能夠經加工成I類MHC限制性肽及/或II類MHC限制性肽。
在一些實施例中，蛋白質為與癌症相關之突變蛋白(例如(但不限於)新抗原)、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白。在一些實施例中，蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。在一些實施例中，HPV為HPV-16或HPV-18。在一些實施例中，蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。在一些實施例中，蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白質。
在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含該蛋白質或其片段之有核細胞。在一些實施例中，包含編碼蛋白質或其片段之mRNA的有核細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的有核細胞。
在一些實施例中，輸入細胞懸浮液可包含輸入有核細胞及抗原。在一些實施例中，輸入細胞懸浮液包含輸入有核細胞及蛋白質或其片段。在一些實施例中，輸入細胞懸浮液包含輸入有核細胞及編碼蛋白質或其片段之mRNA。在一些實施例中，該方法包含在使細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將有核細胞與蛋白質或其片段或與編碼蛋白質或其片段之mRNA一起培育。在一些實施例中，該方法包含在使細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部之前，將有核細胞與蛋白質或其片段或與編碼蛋白質或其片段之mRNA一起培育。
在一些實施例中，提供刺激個體之免疫反應的方法，其包含：a)使包含輸入有核細胞(例如PBMC)之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含該蛋白質或其片段之有核細胞；及(c)向個體投與包含蛋白質或其片段之有核細胞。在一些實施例中，提供刺激個體之免疫反應的方法，其包含：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中mRNA經表現，由此產生包含編碼該蛋白質或其片段之有核細胞。及(c)向個體投與包含蛋白質或其片段之有核細胞。在一些實施例中，蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
在一些實施例中，提供對有需要之個體進行疫苗接種的方法，其包含：a)使包含輸入有核細胞(例如PBMC)之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含該蛋白質或其片段之有核細胞；及(c)向個體投與包含蛋白質或其片段之有核細胞。在一些實施例中，提供對有需要之個體進行疫苗接種的方法，其包含：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中mRNA經表現，由此產生包含編碼該蛋白質或其片段之有核細胞。及(c)向個體投與包含蛋白質或其片段之有核細胞。在一些實施例中，蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
在一些實施例中，收縮部寬度為輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，收縮部寬度為在有核細胞群內具有最小直徑的輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，收縮部寬度為輸入有核細胞平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%、約30%至約45%、約50%至約99%、約50%至約90%、約50%至約80%、約50%至約70%、約60%至約90%、約60%至約80%或約60%至約70%中之任一者。在一些實施例中，收縮部寬度為有核細胞群內具有最小直徑之輸入有核細胞的平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%、約30%至約45%、約50%至約99%、約50%至約90%、約50%至約80%、約50%至約70%、約60%至約90%、約60%至約80%或約60%至約70%中之任一者。在一些實施例中，收縮部寬度為約2 µm至約5 µm、約3 µm至約5 µm、約2 µm至約2.2 µm、約2.2 µm至約2.5 µm、約2.5 µm至約3 µm、約3 µm至約3.5 µm、約3.5 µm至約4 µm、約4 µm至約4.5 µm、約3.2 µm至約3.8 µm、約3.8 µm至約4.3 µm、約4.2 µm至約6 µm或約4.2 µm至約4.8 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約4.5 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約以下中之任一者或小於以下中之任一者：2 µm、2.2 µm、2.5 µm、3 µm、3.5 µm、4 µm、4.5 µm、5 µm、5.5 µm、6 µm、6.5 µm、7 µm、7.5 µm、8 µm、8.5 µm、9 µm、9.5 µm、10 µm、10.5 µm、11 µm、11.5 µm、12 µm、12.5 µm、13 µm、13.5 µm、14 µm、14.5 µm或15 µm。在一些實施例中，包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中多個收縮部串聯及/或並聯配置。
在根據本文所描述之方法、用途或組合物中之任一者的一些實施例中，有核細胞(例如PBMC)與佐劑一起培育足夠的時間以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約1至約24小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約2至約10小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約3至約6小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約1小時、2小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時、5.5小時、6小時、8小時、12小時、16小時、20小時或24小時中之任一者以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約4小時以調節有核細胞。在一些實施例中，在將蛋白質或其片段或編碼核酸之蛋白質或其片段引入有核細胞中之前調節有核細胞。在一些實施例中，在將蛋白質或其片段或編碼蛋白質或其片段之核酸引入有核細胞中之後，調節有核細胞。在一些實施例中，用於調節之佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖苷腦醯胺、STING激動劑、環二核苷酸(CDN)、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸(聚I:C)、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。例示性佐劑包括但不限於CpG ODN、干擾素-α (IFN-α)、多聚肌苷酸:多聚胞苷酸(聚I:C)、咪喹莫特(imiquimod) (R837)、雷西莫特(resiquimod) (R848)或脂多醣(LPS)。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。在一些實施例中，佐劑為CpG 7909 (亦稱為CpG ODN 2006)。
在其中有核細胞包含B細胞之一些實施例中，相比於未經調節有核細胞之B細胞，一或多種共刺激分子在經調節有核細胞之B細胞中上調。在一些實施例中，有核細胞係複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。在其中有核細胞係複數個PBMC之一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC之B細胞，一或多種共刺激分子在複數個經調節PBMC之B細胞中上調。在一些實施例中，共刺激分子為CD80及/或CD86。在一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC，複數個經調節PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者之增加的表現。在一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者的表現增加超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
在根據本文所描述之方法、用途或組合物中之任一者的一些實施例中，有核細胞係免疫細胞。在一些實施例中，有核細胞係人類細胞。在一些實施例中，有核細胞為具有以下單倍型之人類細胞：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16。在一些實施例中，有核細胞係複數個PBMC。在一些實施例中，經調節有核細胞為經調節的複數個經修飾PBMC。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。在一些實施例中，有核細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。
在一些實施例中，複數個PBMC經進一步修飾以增加共刺激分子中之一或多者的表現。在一些實施例中，共刺激分子為B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些實施例中，複數個PBMC經進一步修飾以增加一或多種細胞介素之表現。在一些實施例中，細胞介素為IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21或其功能變異體。在一些實施例中，細胞介素為IFN-α2或其功能變異體。在一些實施例中，細胞介素係變異細胞介素(諸如經修飾細胞介素)。在一些實施例中，複數個PBMC經進一步修飾以增加一或多種嵌合膜結合細胞介素之表現。在一些實施例中，細胞介素經修飾，且經修飾細胞介素為包含細胞介素及跨膜域之融合蛋白。在一些實施例中，細胞介素藉由肽連接子接合至跨膜域。在一些實施例中，複數個PBMC經進一步修飾以增加一或多種嵌合膜結合細胞介素之表現。在一些實施例中，細胞介素經修飾，且經修飾細胞介素為包含細胞介素及跨膜域之融合蛋白。在一些實施例中，細胞介素藉由肽連接子接合至跨膜域。在一些實施例中，跨膜域為運鐵蛋白受體蛋白1 (TFRC)或腫瘤壞死因子(例如FasL)跨膜域。在一些實施例中，跨膜域包含SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。在一些實施例中，肽連接子為G
4S連接子或EAAAK連接子。在實施例中，G
4S連接子包含G
4S序列之2、3、4、5、6、7、8、9或10個重複序列中之任一者。在一些實施例中，EAAAK連接子包含EAAAK序列之2、3、4、5、6、7、8、9或10個重複序列中之任一者。在一些實施例中，肽連接子為(G
4S)
3(SEQ ID NO: 73)或(EAAAK)
3(SEQ ID NO: 74)。在一些實施例中，嵌合膜結合細胞介素包含SEQ ID NO: 77-80中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，複數個經修飾PBMC包含引起一或多種細胞介素之表現及/或分泌增加的核酸。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸包含SEQ ID NO: 71或72之核苷酸序列。在一些實施例中，細胞介素為刺激T細胞活化之信號3效應子。在一些實施例中，細胞介素誘導CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞活化。在一些實施例中，細胞介素誘導抗原特異性CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞之活化。在一些實施例中，相比於非膜結合細胞介素，嵌合膜結合細胞介素增強個體中之細胞介素半衰期。在一些實施例中，相比於非膜結合細胞介素，嵌合膜結合細胞介素之半衰期增加約以下中之任一者：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，膜結合細胞介素使細胞介素與抗原的空間關聯延長約1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96小時或更多小時中之任一者，該等抗原由與蛋白質或其片段一起引入之有核細胞呈現。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含膜結合細胞介素之有核細胞呈現高出約以下中之任一者的局部細胞介素濃度：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含膜結合細胞介素之有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些實施例中，膜繫栓細胞介素為膜繫栓趨化介素。
在一些實施例中，該方法包含多次投與包含蛋白質或其片段之有核細胞。在一些實施例中，該方法包含投與包含蛋白質或其片段之有核細胞約3至約9次。在一些實施例中，該方法包含投與包含蛋白質或其片段之有核細胞約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次中之任一者。在一些實施例中，該方法包含視需要連續投與有核細胞。在一些實施例中，在兩次連續投與包含蛋白質或其片段之有核細胞之間的時間間隔係在約1天與約30天之間。在一些實施例中，在兩次連續投與包含蛋白質或其片段之有核細胞之間的時間間隔為約21天。在一些實施例中，在兩次連續投與包含蛋白質或其片段之有核細胞之間的時間間隔係約1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或150天中之任一者。在一些實施例中，在前兩次連續投與包含蛋白質或其片段之有核細胞之間的時間間隔為1天或2天。在一些實施例中，在前兩次連續投與包含蛋白質或其片段之有核細胞之間的時間間隔為1天或2天，其中該方法包含投與包含蛋白質或其片段之有核細胞超過2次(諸如但不限於投與3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15次或更多次)。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞係經靜脈內、瘤內及/或皮下投與。在一些實施例中，靜脈內投與包含蛋白質或其片段之有核細胞。
在一些實施例中，組合物進一步包含佐劑。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFNγ、STING激動劑、環二核苷酸(CDN)、α-半乳糖苷腦醯胺、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。例示性佐劑包括但不限於CpG ODN、干擾素-α (IFN-α)、多聚肌苷酸:多聚胞苷酸(聚I:C)、咪喹莫特(R837)、雷西莫特(R848)或脂多醣(LPS)。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸。在一些實施例中，佐劑為CpG 7909。
在一些實施例中，同時投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及佐劑。在一些實施例中，依序投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及佐劑。在一些實施例中，佐劑及/或包含蛋白質或其片段之有核細胞係靜脈內、瘤內及/或皮下投與。在一些實施例中，佐劑及/或包含蛋白質或其片段之有核細胞係靜脈內投與。
在一些實施例中，在投與佐劑之前投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物。舉例而言，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與佐劑之前約1小時至約1週內投與。舉例而言，在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與佐劑之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與佐劑之前約1小時及約2小時之間、約2小時及約3小時之間、約3小時及約4小時之間、約4小時及約6小時之間、約6小時及約8小時之間、約8小時及約10小時之間、約10小時及約12小時之間、約12小時及約14小時之間、約14小時及約16小時之間、約16小時及約18小時之間、約18小時及約20小時之間、約20小時及約24小時之間、約24小時及約30小時之間、約30小時及約36小時之間、約36小時及約42小時之間、約42小時及約48小時之間、約48小時及約60小時之間、約60小時及約3天之間、約3天及約4天之間、約4天及約5天之間、約5天及約6天之間、約6天及約7天之間投與。
在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與佐劑後投與。舉例而言，在投與佐劑之後約1小時至約1週投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物。舉例而言，在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與佐劑之後約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與佐劑之後約1小時及約2小時之間、約2小時及約3小時之間、約3小時及約4小時之間、約4小時及約6小時之間、約6小時及約8小時之間、約8小時及約10小時之間、約10小時及約12小時之間、約12小時及約14小時之間、約14小時及約16小時之間、約16小時及約18小時之間、約18小時及約20小時之間、約20小時及約24小時之間、約24小時及約30小時之間、約30小時及約36小時之間、約36小時及約42小時之間、約42小時及約48小時之間、約48小時及約60小時之間、約60小時及約3天之間、約3天及約4天之間、約4天及約5天之間、約5天及約6天之間、約6天及約7天之間投與。
在一些實施例中，個體對以下之表現呈陽性：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16。在一些實施例中，個體對HLA-A*02、HLA-A*11及/或HLA-B*07之表現呈陽性。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞中之至少一個細胞對HLA-A*02、HLA-A*11及/或HLA-B*07之表現呈陽性。在一些實施例中，至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%之包含蛋白質或其片段的有核細胞中之任一者對HLA-A*02、HLA-A*11及/或HLA-B*07之表現呈陽性。在其中有核細胞為複數個PBMC之一些實施例中，包含蛋白質或其片段之經修飾PBMC內之至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%之T細胞中之任一者對HLA-A*02、HLA-A*11及/或HLA-B*07之表現呈陽性。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之經修飾PBMC內至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%之B細胞中之任一者對HLA-A*02、HLA-A*11及/或HLA-B*07之表現呈陽性。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之經修飾PBMC內之至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%之NK細胞中之任一者對HLA-A*02、HLA-A*11及/或HLA-B*07之表現呈陽性。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之經修飾PBMC內之至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或99%單核球中之任一者對HLA-A*02、HLA-A*11及/或HLA-B*07之表現呈陽性。
在根據本文所描述之方法、用途或組合物中之任一者的一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞在投與治療劑之前、同時或之後投與。在一些實施例中，治療劑包含免疫檢查點抑制劑、化學療法或放射線療法中之一或多者。在一些實施例中，治療劑包含一或多種細胞介素。在一些實施例中，治療劑包含一或多種抗體。在一些實施例中，治療劑包含免疫腫瘤學中所用之一或多種雙特異性多肽(例如免疫結合物)。
免疫檢查點為免疫系統之調節劑且在檢查中保持免疫反應。可採用免疫檢查點抑制劑以有助於增強免疫反應。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物係與免疫檢查點抑制劑之投與組合投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物係與免疫檢查點抑制劑同時投與。在一些實施例中，依序投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及免疫檢查點抑制劑。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑及/或包含蛋白質或其片段之有核細胞係靜脈內、瘤內及/或皮下投與。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑及/或包含蛋白質或其片段之有核細胞係靜脈內投與。
在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與免疫檢查點抑制劑之前投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與免疫檢查點抑制劑之後投與。舉例而言，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與免疫檢查點抑制劑之前約1小時至約1週內投與。舉例而言，在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與免疫檢查點抑制劑之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與免疫檢查點抑制劑之前約1小時及約2小時之間、約2小時及約3小時之間、約3小時及約4小時之間、約4小時及約6小時之間、約6小時及約8小時之間、約8小時及約10小時之間、約10小時及約12小時之間、約12小時及約14小時之間、約14小時及約16小時之間、約16小時及約18小時之間、約18小時及約20小時之間、約20小時及約24小時之間、約24小時及約30小時之間、約30小時及約36小時之間、約36小時及約42小時之間、約42小時及約48小時之間、約48小時及約60小時之間、約60小時及約3天之間、約3天及約4天之間、約4天及約5天之間、約5天及約6天之間、約6天及約7天之間投與。
在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與免疫檢查點抑制劑之前約7天、約10天、約14天、約18天、約21天、約24天、約28天、約30天、約35天、約40天、約45天或約50天投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與免疫檢查點抑制劑之前約7天至約10天之間、約10天及約14天之間、約14天及約18天之間、約18天及約21天之間、約21天及約24天之間、約24天及約28天之間、約28天及約30天之間、約30天及約35天之間、約35天及約40天之間、約40天及約45天之間或約45天及約50天之間投與。
在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與免疫檢查點抑制劑之後投與。舉例而言，在投與免疫檢查點抑制劑之後約1小時至約1週投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物。舉例而言，在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與免疫檢查點抑制劑之後約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與免疫檢查點抑制劑之後約1小時及約2小時之間、約2小時及約3小時之間、約3小時及約4小時之間、約4小時及約6小時之間、約6小時及約8小時之間、約8小時及約10小時之間、約10小時及約12小時之間、約12小時及約14小時之間、約14小時及約16小時之間、約16小時及約18小時之間、約18小時及約20小時之間、約20小時及約24小時之間、約24小時及約30小時之間、約30小時及約36小時之間、約36小時及約42小時之間、約42小時及約48小時之間、約48小時及約60小時之間、約60小時及約3天之間、約3天及約4天之間、約4天及約5天之間、約5天及約6天之間、約6天及約7天之間投與。
在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與免疫檢查點抑制劑之後約7天、約10天、約14天、約18天、約21天、約24天、約28天、約30天、約35天、約40天、約45天或約50天投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與免疫檢查點抑制劑之後約7天至約10天之間、約10天及約14天之間、約14天及約18天之間、約18天及約21天之間、約21天及約24天之間、約24天及約28天之間、約28天及約30天之間、約30天及約35天之間、約35天及約40天之間、約40天及約45天之間或約45天及約50天之間投與。
在一些實施例中，該方法包含多次投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及/或多次投與免疫檢查點抑制劑。舉例而言，在一些實施例中，該方法包含投與兩次、投與三次、投與四次、投與五次、投與六次、投與七次、投與八次、投與九次、投與十次、投與十一次、投與十二次、投與十三次、投與十四次或投與十五次包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及/或免疫檢查點抑制劑。舉例而言，在一些實施例中，該方法包含投與小於五次、投與小於十次、投與小於十五次、投與小於二十次、投與小於二十五次、投與小於三十次、投與小於五十次、投與小於七十五次、投與小於一百次或投與小於兩百次包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及/或免疫檢查點抑制劑。
例示性免疫檢查點抑制劑靶向(但不限於) PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中之一或多者。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑為以下中之一或多者：結合至PD-1之抗體、結合PD-L1之抗體、結合CTLA-4之抗體、結合LAG3之抗體或結合TIM-3之抗體、結合TIGIT之抗體、結合VISTA之抗體、結合TIM-1之抗體、結合B7-H4之抗體或結合BTLA之抗體。在其他實施例中，抗體可為全長抗體或任何變異體，例如(但不限於)抗體片段、單鏈可變片段(ScFv)或抗原結合片段(Fab)。在其他實施例中，抗體可為雙特異性、三特異性或多特異性抗體。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑為一或多種結合至及/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中之一或多者的化合物。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑為一或多種結合至及/或抑制PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4 (VTCN1)或BTLA中之一或多者的肽。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑靶向PD-1。在一些實施例中，免疫檢查點抑制劑靶向PD-L1。
細胞介素可與本文所述之複數個經修飾PBMC中之任一者組合使用以實現針對癌症，例如與突變蛋白相關之癌症的累加或協同效應。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物係與一或多種細胞介素之投與組合投與。在一些實施例中，同時投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及細胞介素。在一些實施例中，依序投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及細胞介素。
在一些實施例中，在投與細胞介素之前投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物。在一些實施例中，在投與細胞介素之後投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物。舉例而言，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與細胞介素之前約1小時至約1週內投與。舉例而言，在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與細胞介素之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與細胞介素之前約1小時及約2小時之間、約2小時及約3小時之間、約3小時及約4小時之間、約4小時及約6小時之間、約6小時及約8小時之間、約8小時及約10小時之間、約10小時及約12小時之間、約12小時及約14小時之間、約14小時及約16小時之間、約16小時及約18小時之間、約18小時及約20小時之間、約20小時及約24小時之間、約24小時及約30小時之間、約30小時及約36小時之間、約36小時及約42小時之間、約42小時及約48小時之間、約48小時及約60小時之間、約60小時及約3天之間、約3天及約4天之間、約4天及約5天之間、約5天及約6天之間、約6天及約7天之間投與。
在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與細胞介素之前約7天、約10天、約14天、約18天、約21天、約24天、約28天、約30天、約35天、約40天、約45天或約50天投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與細胞介素之前約7天至約10天之間、約10天及約14天之間、約14天及約18天之間、約18天及約21天之間、約21天及約24天之間、約24天及約28天之間、約28天及約30天之間、約30天及約35天之間、約35天及約40天之間、約40天及約45天之間或約45天及約50天之間投與。
在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與細胞介素後投與。舉例而言，在投與細胞介素之後約1小時至約1週投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物。舉例而言，在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與細胞介素之後約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與細胞介素之後約1小時及約2小時之間、約2小時及約3小時之間、約3小時及約4小時之間、約4小時及約6小時之間、約6小時及約8小時之間、約8小時及約10小時之間、約10小時及約12小時之間、約12小時及約14小時之間、約14小時及約16小時之間、約16小時及約18小時之間、約18小時及約20小時之間、約20小時及約24小時之間、約24小時及約30小時之間、約30小時及約36小時之間、約36小時及約42小時之間、約42小時及約48小時之間、約48小時及約60小時之間、約60小時及約3天之間、約3天及約4天之間、約4天及約5天之間、約5天及約6天之間、約6天及約7天之間投與。
例示性細胞介素包括但不限於趨化介素、干擾素、介白素、淋巴介質及腫瘤壞死因子或其功能衍生物。在一些實施例中，細胞介素增強細胞免疫反應。在一些實施例中，細胞介素增強抗體反應。在一些實施例中，細胞介素為I型細胞介素。在一些實施例中，細胞介素為2型細胞介素。在一些實施例中，細胞介素包含以下中之一或多者：IL-2、IL-15、IL-10、IL-12、IFN-α或IL-21。在一些實施例中，細胞介素包含IL-15。
在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與包含細胞介素部分之雙特異性多肽之前投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與包含細胞介素部分及免疫檢查點抑制劑部分之雙特異性多肽之前投與。在一些實施例中，雙特異性多肽包含CD3靶向部分及腫瘤抗原靶向部分。在一些實施例中，雙特異性多肽包含靶向兩個免疫檢查點之部分。在一些實施例中，雙特異性多肽包含靶向基質中所發現或表現於癌症相關纖維母細胞上之抗原的部分。在一些實施例中，雙特異性多肽包含靶向基質中所發現或表現於癌症相關纖維母細胞上之抗原的部分及細胞介素部分。
化學療法可與本文所述之複數個經修飾PBMC中之任一者組合使用以實現針對癌症，例如與突變蛋白相關之癌症的累加或協同效應。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物係與化學療法之投與組合投與。在一些實施例中，同時投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及化學療法。在一些實施例中，依序投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及化學療法。
在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與化學療法之前投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與化學療法後投與。舉例而言，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與化學療法之前約1小時至約1週內投與。舉例而言，在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與化學療法之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與化學療法之前約1小時及約2小時之間、約2小時及約3小時之間、約3小時及約4小時之間、約4小時及約6小時之間、約6小時及約8小時之間、約8小時及約10小時之間、約10小時及約12小時之間、約12小時及約14小時之間、約14小時及約16小時之間、約16小時及約18小時之間、約18小時及約20小時之間、約20小時及約24小時之間、約24小時及約30小時之間、約30小時及約36小時之間、約36小時及約42小時之間、約42小時及約48小時之間、約48小時及約60小時之間、約60小時及約3天之間、約3天及約4天之間、約4天及約5天之間、約5天及約6天之間、約6天及約7天之間投與。
在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與化學療法後投與。舉例而言，在投與化學療法之後約1小時至約1週投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物。舉例而言，在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與化學療法之後約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與化學療法之後約1小時及約2小時之間、約2小時及約3小時之間、約3小時及約4小時之間、約4小時及約6小時之間、約6小時及約8小時之間、約8小時及約10小時之間、約10小時及約12小時之間、約12小時及約14小時之間、約14小時及約16小時之間、約16小時及約18小時之間、約18小時及約20小時之間、約20小時及約24小時之間、約24小時及約30小時之間、約30小時及約36小時之間、約36小時及約42小時之間、約42小時及約48小時之間、約48小時及約60小時之間、約60小時及約3天之間、約3天及約4天之間、約4天及約5天之間、約5天及約6天之間、約6天及約7天之間投與。
在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與化學療法之後約7天、約10天、約14天、約18天、約21天、約24天、約28天、約30天、約35天、約40天、約45天或約50天投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與化學療法之後約7天至約10天之間、約10天及約14天之間、約14天及約18天之間、約18天及約21天之間、約21天及約24天之間、約24天及約28天之間、約28天及約30天之間、約30天及約35天之間、約35天及約40天之間、約40天及約45天之間或約45天及約50天之間投與。
在一些實施例中，該方法包含多次投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及/或多次投與化學療法。舉例而言，在一些實施例中，該方法包含投與兩次、投與三次、投與四次、投與五次、投與六次、投與七次、投與八次、投與九次、投與十次、投與十一次、投與十二次、投與十三次、投與十四次或投與十五次包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及/或化學療法。舉例而言，在一些實施例中，該方法包含投與小於五次、投與小於十次、投與小於十五次、投與小於二十次、投與小於二十五次、投與小於三十次、投與小於五十次、投與小於七十五次、投與小於一百次或投與小於兩百次包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及/或化學療法。
例示性化學療法可為細胞週期依賴性或細胞週期非依賴性的。在一些實施例中，化學療法包含一或多種化學治療劑。在一些實施例中，化學治療劑可靶向癌症中之細胞分裂、DNA或代謝中之一或多者。在一些實施例中，化學治療劑係基於鉑之藥劑，諸如但不限於順鉑、奧沙利鉑(oxaliplatin)或卡鉑。在一些實施例中，化學治療劑為紫杉烷(諸如多烯紫杉醇或太平洋紫杉醇)。在一些實施例中，化學治療劑為5-氟尿嘧啶、小紅莓或伊立替康(irinotecan)。在一些實施例中，化學治療劑為以下中之一或多者：烷基化劑、抗代謝物、抗腫瘤抗生素、拓樸異構酶抑制劑或有絲分裂抑制劑。在一些實施例中，化學療法包含順鉑。
放射線療法可與本文所述之複數個經修飾PBMC中之任一者組合使用以實現針對癌症，例如與突變蛋白或其片段相關之癌症的累加或協同效應。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物係與放射線療法之投與組合投與。在一些實施例中，同時投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及放射線療法。在一些實施例中，依序投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及放射線療法。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物係與放射線療法之投與組合、與化學療法組合及/或與免疫檢查點抑制劑組合投與。
在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與放射線療法之前投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與放射線療法後投與。舉例而言，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與放射線療法之前約1小時至約1週內投與。舉例而言，在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與放射線療法之前約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與放射線療法之前約1小時及約2小時之間、約2小時及約3小時之間、約3小時及約4小時之間、約4小時及約6小時之間、約6小時及約8小時之間、約8小時及約10小時之間、約10小時及約12小時之間、約12小時及約14小時之間、約14小時及約16小時之間、約16小時及約18小時之間、約18小時及約20小時之間、約20小時及約24小時之間、約24小時及約30小時之間、約30小時及約36小時之間、約36小時及約42小時之間、約42小時及約48小時之間、約48小時及約60小時之間、約60小時及約3天之間、約3天及約4天之間、約4天及約5天之間、約5天及約6天之間、約6天及約7天之間投與。
在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與放射線療法後投與。舉例而言，在投與放射線療法之後約1小時至約1週投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物。舉例而言，在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與放射線療法之後約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時、約10小時、約12小時、約14小時、約16小時、約18小時、約20小時、約24小時、約30小時、約36小時、約42小時、約48小時、約60小時、約3天、約4天、約5天、約6天或約7天投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與放射線療法之後約1小時及約2小時之間、約2小時及約3小時之間、約3小時及約4小時之間、約4小時及約6小時之間、約6小時及約8小時之間、約8小時及約10小時之間、約10小時及約12小時之間、約12小時及約14小時之間、約14小時及約16小時之間、約16小時及約18小時之間、約18小時及約20小時之間、約20小時及約24小時之間、約24小時及約30小時之間、約30小時及約36小時之間、約36小時及約42小時之間、約42小時及約48小時之間、約48小時及約60小時之間、約60小時及約3天之間、約3天及約4天之間、約4天及約5天之間、約5天及約6天之間、約6天及約7天之間投與。
在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與放射線療法之後約7天、約10天、約14天、約18天、約21天、約24天、約28天、約30天、約35天、約40天、約45天或約50天投與。在一些實施例中，包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物在投與放射線療法之後約7天至約10天之間、約10天及約14天之間、約14天及約18天之間、約18天及約21天之間、約21天及約24天之間、約24天及約28天之間、約28天及約30天之間、約30天及約35天之間、約35天及約40天之間、約40天及約45天之間或約45天及約50天之間投與。
在一些實施例中，該方法包含多次投與包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及/或多次投與放射線療法。舉例而言，在一些實施例中，該方法包含投與兩次、投與三次、投與四次、投與五次、投與六次、投與七次、投與八次、投與九次、投與十次、投與十一次、投與十二次、投與十三次、投與十四次或投與十五次包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及/或放射線療法。舉例而言，在一些實施例中，該方法包含投與小於五次、投與小於十次、投與小於十五次、投與小於二十次、投與小於二十五次、投與小於三十次、投與小於五十次、投與小於七十五次、投與小於一百次或投與小於兩百次包含有包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物及/或放射線療法。
在一些實施例中，提供包含蛋白質或其片段之複數個有核細胞(例如PBMC)以用於根據本文所描述之方法中之任一者刺激個體之免疫反應的方法中。
在一些實施例中，提供一種用於刺激個體對蛋白質或其片段之免疫反應的組合物，其中該組合物包含有效量之包含有核細胞之組合物中之任一者，該等有核細胞包含本文所述之蛋白質或片段。在一些實施例中，提供一種用於減少腫瘤生長之組合物，其中該組合物包含有效量之包含有包含本文所描述之蛋白質或片段之有核細胞的組合物中之任一者。在一些實施例中，個體患有癌症及/或感染。在一些實施例中，提供一種用於治療個體之癌症及/或感染的組合物，其中該組合物包含有效量之包含有核細胞之組合物中之任一者，該等有核細胞包含本文所描述之蛋白質或片段。在一些實施例中，癌症為HPV相關癌症或HBV相關癌症。在一些實施例中，個體感染HPV及/或HBV。
編碼其蛋白質或片段之 mRNA
在一些實施例中，提供仿擬個體之免疫反應及/或對有需要之個體進行疫苗接種的方法，該方法包含向個體投與有效量之組合物，該組合物包含有包含胞內遞送之蛋白質或其片段的有核細胞；其中該等有核細胞係藉由以下製備：首先，使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中編碼該蛋白質或其片段之該mRNA於該等有核細胞中表現，由此產生包含該蛋白質或其片段之經修飾有核細胞，其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。
在一些實施例中，mRNA之核苷酸序列經密碼子最佳化以在有核細胞中表現。在一些實施例中，mRNA之核苷酸序列經密碼子最佳化以在PBMC中表現。在一些實施例中，mRNA之密碼子最佳化不影響或不顯著影響所表現之蛋白質的構形及功能。在一些實施例中，mRNA之密碼子最佳化不影響或不顯著影響自所表現之蛋白質加工之抗原的構形及功能。在一些實施例中，mRNA為非自身mRNA。在一些實施例中，mRNA為外源性mRNA。在一些實施例中，mRNA為活體外轉錄(IVT) mRNA。在一些實施例中，外源性mRNA為活體外轉錄(IVT) mRNA。在一些實施例中，mRNA編碼重組蛋白。
在一些實施例中，mRNA包含一或多個修飾以增強所表現之蛋白質的抗原加工及呈現。
如本文所用，靶向免疫蛋白酶體之模體為蛋白質之一部分，其在調節蛋白質降解率方面起重要作用。在一些實施例中，靶向免疫蛋白酶體之模體增強蛋白質在抗原加工路徑中之降解。在一些實施例中，靶向免疫蛋白酶體之模體有助於蛋白質定位至抗原加工路徑。在一些實施例中，靶向免疫蛋白酶體之模體增強免疫蛋白酶體複合體中蛋白質之加工。靶向免疫蛋白酶體之模體之實例為降解決定子。已知由促後期複合體或週期體(APC/C)靶向之降解決定子包括破壞盒(D盒)、KEN盒及ABBA模體。含有此等模體之蛋白質與APC/C相互作用，引起蛋白質泛素化及蛋白酶體破壞。其他例示性靶向免疫蛋白酶體之模體包括KEKE模體，
在一些實施例中，mRNA進一步包含一或多種編碼靶向免疫蛋白酶體之模體的核酸序列，其中mRNA之轉譯產生蛋白質與一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體的融合蛋白。在一些實施例中，相比於在不存在靶向免疫蛋白酶體之模體的情況下蛋白質在細胞中之降解及/或源於蛋白質之肽在細胞表面上之呈現，一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體增強蛋白質在細胞中之降解及/或源於蛋白質之肽在細胞表面上之呈現。
在一些實施例中，相比於由不包含編碼靶向免疫蛋白酶體之模體之核酸的mRNA編碼之蛋白質，由包含編碼靶向免疫蛋白酶體之模體之一或多種核酸序列的mRNA編碼之蛋白質的降解量增加約以下中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於由不包含編碼靶向免疫蛋白酶體之模體之核酸的mRNA編碼之蛋白質，由包含編碼靶向免疫蛋白酶體之模體之一或多種核酸序列的mRNA編碼之蛋白質的降解率增加約以下中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些實施例中，相比於由不包含編碼靶向免疫蛋白酶體之模體之核酸的mRNA編碼之蛋白質，源於由包含編碼靶向免疫蛋白酶體之模體之一或多種核酸序列的mRNA編碼之蛋白質的肽之細胞表面呈現量增加約以下中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於由不包含編碼靶向免疫蛋白酶體之模體之核酸的mRNA編碼之蛋白質，源於由包含編碼靶向免疫蛋白酶體之模體之一或多種核酸序列的mRNA編碼之蛋白質的肽之細胞表面呈現率增加約以下中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些實施例中，一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體位於融合蛋白之N端。在一些實施例中，一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體位於融合蛋白之C端。在一些實施例中，一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體位於融合蛋白之N端及/或C端處。
在一些實施例中，一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體包含以下中之一或多者：D-盒域、sec/MITD域、KEKE模體。
在一些實施例中，mRNA編碼天然HPV E6蛋白。在一些實施例中，mRNA編碼天然HPV E6蛋白，且包含SEQ ID NO: 59之序列。在一些實施例中，mRNA為編碼天然HPV E6蛋白之密碼子最佳化mRNA。在一些實施例中，mRNA為編碼天然HPV E6蛋白之密碼子最佳化mRNA，其中密碼子最佳化mRNA包含SEQ ID NO: 60之序列。在一些實施例中，mRNA編碼天然HPV E7蛋白。在一些實施例中，mRNA編碼天然HPV E7蛋白，且包含SEQ ID NO: 61之序列。在一些實施例中，mRNA為編碼天然HPV E7蛋白之密碼子最佳化mRNA。在一些實施例中，mRNA為編碼天然HPV E7蛋白之密碼子最佳化mRNA，其中密碼子最佳化mRNA包含SEQ ID NO: 63或64之序列。在一些實施例中，mRNA為編碼包含HPV E7蛋白及KEKE域之融合蛋白的密碼子最佳化mRNA。在一些實施例中，mRNA為編碼包含HPV E7蛋白及KEKE域之融合蛋白的密碼子最佳化mRNA，其中mRNA包含SEQ ID NO: 67之序列。在一些實施例中，mRNA為編碼包含HPV E7蛋白及D-盒域之融合蛋白的mRNA。在一些實施例中，mRNA為編碼包含HPV E7蛋白及D-盒域之融合蛋白的mRNA，其中mRNA包含SEQ ID NO: 62之序列。在一些實施例中，mRNA為編碼包含HPV E7蛋白及D-域之融合蛋白的密碼子最佳化mRNA。在一些實施例中，mRNA為編碼包含HPV E7蛋白及D-盒域之融合蛋白的密碼子最佳化mRNA，其中mRNA包含SEQ ID NO: 66之序列。在一些實施例中，mRNA為編碼融合蛋白之密碼子最佳化mRNA，該融合蛋白包含具有突變核定位序列(NLS)之HPV E7蛋白。在一些實施例中，mRNA為編碼融合蛋白之密碼子最佳化mRNA，該融合蛋白包含具有突變NLS之HPV E7蛋白，其中mRNA包含SEQ ID NO: 70之序列。在一些實施例中，mRNA為編碼HPV E7.6蛋白之密碼子最佳化mRNA。在一些實施例中，mRNA為編碼HPV E7.6蛋白之密碼子最佳化mRNA，其中mRNA包含SEQ ID NO: 68之序列。在一些實施例中，mRNA為編碼包含HPV E7.6之6個重複序列之融合蛋白的密碼子最佳化mRNA。在一些實施例中，mRNA為編碼包含HPV E7.6之6個重複序列之融合蛋白的密碼子最佳化mRNA，其中mRNA包含SEQ ID NO: 69之序列。
在一些實施例中，mRNA編碼天然流感M1蛋白。在一些實施例中，mRNA編碼天然流感M1蛋白，且包含SEQ ID NO: 83之序列。在一些實施例中，mRNA為編碼天然流感M1蛋白之密碼子最佳化mRNA。在一些實施例中，mRNA為編碼天然流感M1蛋白之密碼子最佳化mRNA，其中密碼子最佳化mRNA包含SEQ ID NO: 84之序列。
在一些實施例中，mRNA編碼天然CMV pp65蛋白質。在一些實施例中，mRNA為編碼天然CMV pp65蛋白質之密碼子最佳化mRNA。在一些實施例中，mRNA為編碼天然CMV pp65蛋白質之密碼子最佳化mRNA，其中密碼子最佳化mRNA包含SEQ ID NO: 85之序列。
在一些實施例中，mRNA編碼MART-1抗原。在一些實施例中，mRNA為編碼MART-1抗原之密碼子最佳化mRNA。
在根據本文所述之任一種mRNA的一些實施例中，mRNA之一或多個殘基經修飾。在一些實施例中，mRNA之一或多個殘基為以下中之一或多者：硫代磷酸酯殘基、假尿苷殘基、N1-甲基腺苷殘基、5-甲基胞苷殘基或N-𠰌啉基殘基。
蛋白質及其片段及抗原
在根據本文所述之方法、組合物或複數個經修飾PBMC中之任一者的一些實施例中，蛋白質為疾病相關蛋白質。在一些實施例中，蛋白質為非自身蛋白質。在一些實施例中，蛋白質為與癌症相關之突變蛋白、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白。在一些實施例中，蛋白質源於裂解物，諸如疾病細胞之裂解物。在一些實施例中，蛋白質源於腫瘤裂解物。在一些實施例中，蛋白質包含腫瘤抗原或腫瘤相關抗原中之一或多者。在一些實施例中，蛋白質為與癌症相關之突變蛋白。在一些實施例中，癌症為頭頸癌、子宮頸癌、外陰癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌、肛周癌、肛門生殖癌、口腔癌或唾液癌。在一些實施例中，蛋白質包含一或多種抗原，其中抗原為頭頸癌抗原、子宮頸癌抗原、外陰癌抗原、陰道癌抗原、陰莖癌抗原、肛門癌抗原、肛周癌症抗原、肛門生殖癌抗原、口腔癌抗原、唾液癌抗原、乳癌抗原、皮膚癌抗原、膀胱癌抗原、大腸癌、直腸癌抗原、子宮內膜癌抗原、腎癌抗原、白血病抗原、肺癌抗原、黑素瘤抗原、非霍奇金氏淋巴瘤抗原、胰臟癌抗原、前列腺癌抗原或甲狀腺癌抗原。在一些實施例中，癌症為實體癌症。在一些實施例中，癌症為血液癌。
在一些實施例中，癌症為病毒相關癌症。在一些實施例中，癌症為HPV相關癌症。在一些實施例中，癌症為局部癌。在一些實施例中，癌症為轉移性癌症。在一些實施例中，抗原與感染性疾病相關。在一些實施例中，感染性疾病為病毒感染性疾病、真菌感染性疾病及/或細菌感染性疾病。在一些實施例中，感染性疾病與流感、CMV、HIV、HPV、EBV、MCV、HAV、HBV、HCV、HSV-1、HSV-2、VSV、HHV-6、HHV-7或HHV-8相關。
在根據本文所述之方法、組合物或複數個經修飾PBMC中之任一者的一些實施例中，蛋白質包含一或多種抗原。在一些實施例中，抗原由一或多種核酸編碼且以一或多種核酸，諸如但不限於DNA、cDNA、mRNA及質體形式進入PBMC。在一些實施例中，抗原由一或多種mRNA編碼且以一或多種mRNA形式進入PBMC。在一些實施例中，一或多種mRNA包含本文所述之任一種修飾。在一些實施例中，一或多種mRNA包含本文所述之模體中之任一者，包括但不限於本文所述之靶向免疫蛋白酶體之模體中之任一者。
在根據本文所述之方法、組合物或複數個經修飾PBMC中之任一者的一些實施例中，抗原為人類乳突狀瘤病毒(HPV)抗原。乳突狀瘤病毒為病毒粒子尺寸直徑為約55 nm之較小非包膜DNA病毒。超過100種HPV基因型經完全表徵，且假定存在更高數目。HPV為子宮頸癌以及一些外陰癌、陰道癌、陰莖癌、口咽癌、肛門癌及直腸癌之已知病因。儘管大部分HPV感染無症狀且自發明晰，但持續感染致癌HPV類型中之一者可發展為初癌或癌症。其他HPV相關疾病可包括尋常性疣、蹠疣、扁平疣、肛門生殖疣、肛門病變、表皮發育不良、病灶性上皮增生、口腔乳頭狀瘤、疣狀囊腫、喉部乳頭狀瘤、鱗狀上皮內病變(SIL)、子宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)、外陰上皮內瘤樣病變(VIN)及陰道上皮內瘤樣病變(VAIN)。許多已知人類乳突狀瘤病毒(HPV)類型引起良性病變，其中有一亞群致癌。基於流行病及系統發育關係，HPV類型分為十五種「高風險類型」(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73及82)及三種「可能高風險類型」(HPV 26、53及66)，其一起已知表現為低級及高級子宮頸變化及癌症以及其他肛門生殖癌，諸如外陰癌、陰道癌、陰莖癌、肛門癌及肛周癌以及頭頸癌。最近，亦描述高風險類型HPV 16及18與乳癌之關聯。已知歸類為「低風險類型」之十一種HPV類型(HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、70、72及81)表現為良性低級子宮頸變化、生殖疣及復發性呼吸道乳頭狀瘤症。皮膚HPV類型5、8及92與皮膚癌相關。在一些HPV相關癌症中，免疫系統受到抑制，且因此抗腫瘤反應顯著減弱。參見Suresh及Burtness,
Am J Hematol Oncol13(6):20-27 (2017)。在一些實施例中，抗原為引發針對相同及或不同抗原之反應的多個多肽之池。在一些實施例中，多種抗原之池中之抗原不減少直接針對多種抗原之池中之其他抗原的免疫反應。在一些實施例中，HPV抗原為包含抗原HPV抗原決定基及一或多個異源肽序列之多肽。在一些實施例中，HPV抗原與自身、與其他抗原或與佐劑複合。在一些實施例中，HPV為HPV-16或HPV-18。在一些實施例中，HPV抗原由HLA-A*02特異性抗原決定基構成。在一些實施例中，HPV抗原由HLA-B*07特異性抗原決定基構成。在一些實施例中，HPV抗原由HLA-B*35特異性抗原決定基構成。在一些實施例中，HPV抗原由HLA-A*01特異性抗原決定基構成。在一些實施例中，HPV抗原為HPV E6抗原或HPV E7抗原。在一些實施例中，抗原包含源於HPV E6及/或E7之肽。在一些實施例中，抗原包含源於HPV E6及/或E7之HLA-A*02限制性肽。在一些實施例中，HPV蛋白為HPV E6。在一些實施例中，HPV蛋白為HPV E7。在一些實施例中，蛋白質包含源於HPV E6之肽。在一些實施例中，蛋白質包含源於HPV E7之肽。在一些實施例中，HPV蛋白為包含約以下中之任一者的蛋白質：50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%天然(包括野生型、天然存在及/或剪接變異體) HPV E6胺基酸序列。在一些實施例中，HPV蛋白質為包含100%天然HPV E6胺基酸序列之蛋白質。在一些實施例中，HPV蛋白質為包含約以下中之任一者的蛋白質：50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%天然(包括野生型、天然存在及/或剪接變異體) HPV E7胺基酸序列。在一些實施例中，HPV蛋白質為包含約100%天然HPV E7胺基酸序列之蛋白質。
全世界分離之B型肝炎病毒(HBV)株已分類成六組自基因體比較推導出的基因體組，且表示為HBV基因型A至F。亦基於鑑別血清定義九組血清學組，稱為B型肝炎表面抗原(HBsAg)亞型，且將其命名為adw2、adw4、adr、adrq−、ayw1、ayw2、ayw3、ayw4及ayr。在一些實施例中，HPV抗原為包含抗原HPV抗原決定基及一或多個異源肽序列之多肽。在一些實施例中，HPV抗原與自身、與其他抗原或與佐劑複合。在一些實施例中，HBV具有以下中之任一者的基因型/亞型：A/adw2、B/adw2、C/adr、C/adw2、D/ayw3、D/ayw2、E/ayw4、F/adw2、F/adw4或F/ayw4。在一些實施例中，HBV蛋白由HLA-A*02特異性抗原決定基構成。在一些實施例中，HBV蛋白為HBsAg。在一些實施例中，HBV蛋白為HBc。在一些實施例中，HBV蛋白為HBV核心蛋白、HBV表面蛋白、HBV聚合酶及/或HBV X蛋白中之一或多者。在一些實施例中，HBV蛋白為HBeAg。在一些實施例中，蛋白質包含源於HBsAg之肽。在一些實施例中，蛋白質包含源於HBc之肽。在一些實施例中，蛋白質包含源於HBeAg之肽。在一些實施例中，HBV蛋白係包含約以下中之任一者的蛋白質：50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%天然(包括野生型、天然存在及/或剪接變異體) HBsAg胺基酸序列。在一些實施例中，HBV蛋白係包含100%天然HBsAg胺基酸序列的蛋白質。在一些實施例中，HBV蛋白係包含約以下中之任一者的蛋白質：50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%天然(包括野生型、天然存在及/或剪接變異體) HBeAg胺基酸序列。在一些實施例中，HBV蛋白係包含100%天然HBeAg胺基酸序列的蛋白質。在一些實施例中，HBV蛋白質為包含約以下中之任一者的蛋白質：50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%天然(包括野生型、天然存在及/或剪接變異體) HBc胺基酸序列。在一些實施例中，HBV蛋白質為包含100%天然HBc胺基酸序列之蛋白質。在一些實施例中，HBV蛋白係包含約以下中之任一者的蛋白質：50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的HBV核心蛋白、HBV表面蛋白、HBV聚合酶及/或HBV X蛋白中之任一者或多者之天然胺基酸序列。在一些實施例中，HBV蛋白係包含HBV核心蛋白、HBV表面蛋白、HBV聚合酶及/或HBV X蛋白中之一或多者的100%天然胺基酸序列的蛋白質。
在一些實施例中，蛋白質為流感蛋白。在一些實施例中，流感蛋白源於A型流感及/或B型流感。在一些實施例中，蛋白質係流感M1蛋白。在一些實施例中，蛋白質包含源於流感M1蛋白之肽。在一些實施例中，流感蛋白為包含約以下中之任一者的蛋白質：50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%天然(包括野生型、天然存在及/或剪接變異體)流感M1蛋白胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質為經修飾流感M1蛋白。在一些實施例中，流感蛋白係包含100%天然流感M1蛋白胺基酸序列的蛋白質。
在根據本文所述之方法、組合物或複數個有核細胞中之任一者的一些實施例中，經修飾有核細胞包含有包含複數個免疫原性抗原決定基之複數種抗原(例如兩種或更多種源於蛋白質之抗原)。在其他實施例中，在投與個體包含有包含複數個免疫原性抗原決定基之複數種抗原的經修飾有核細胞後，該複數個免疫原性抗原決定基中無一者減少個體對其他免疫原性抗原決定基中之任一者的免疫反應。在一些實施例中，抗原為多肽且免疫原性抗原決定基為免疫原性肽抗原決定基。在一些實施例中，免疫原性肽抗原決定基融合至N端側接多肽及/或C端側接多肽。在一些實施例中，抗原為包含免疫原性肽抗原決定基及一或多個異源肽序列的多肽。在一些實施例中，抗原係包含免疫原性肽抗原決定基之多肽，該免疫原性肽抗原決定基在N端及/或C端上側接異源肽序列。在一些實施例中，側接異源肽序列源於疾病相關之免疫原性肽。在一些實施例中，側接異源肽序列為非天然存在之序列。在一些實施例中，側接異源肽序列源於免疫原性合成長肽(SLP)。在一些實施例中，N端側接多肽包含SEQ ID NO: 5-10中之任一者之胺基酸序列，及/或C端側接多肽包含SEQ ID NO: 11-17中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原能夠經加工成I類MHC限制性肽及/或II類MHC限制性肽。
在一些實施例中，蛋白質及/或抗原包含一或多個修飾以增強蛋白質及/或抗原之抗原加工及呈現。
如本文所用，靶向免疫蛋白酶體之模體為蛋白質之一部分，其在調節蛋白質降解率方面起重要作用。在一些實施例中，靶向免疫蛋白酶體之模體增強蛋白質在抗原加工路徑中之降解。在一些實施例中，靶向免疫蛋白酶體之模體有助於蛋白質定位至抗原加工路徑。在一些實施例中，靶向免疫蛋白酶體之模體增強免疫蛋白酶體複合體中蛋白質之加工。靶向免疫蛋白酶體之模體之實例為降解決定子。已知由促後期複合體或週期體(APC/C)靶向之降解決定子包括破壞盒(D盒)、KEN盒及ABBA模體。含有此等模體之蛋白質與APC/C相互作用，引起蛋白質泛素化及蛋白酶體破壞。其他例示性靶向免疫蛋白酶體之模體包括但不限於KEKE模體。
在一些實施例中，蛋白質或其片段進一步包含一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體，產生蛋白質與一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體的融合蛋白。在一些實施例中，相比於在不存在靶向免疫蛋白酶體之模體的情況下蛋白質在細胞中之降解及/或源於蛋白質之肽在細胞表面上之呈現，一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體增強蛋白質在細胞中之降解及/或源於蛋白質之肽在細胞表面上之呈現。
在一些實施例中，相比於不包含靶向免疫蛋白酶體之模體的對應蛋白質，包含一或多個蛋白質靶向免疫蛋白酶體之模體的融合蛋白的降解量增加約以下中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於不包含靶向免疫蛋白酶體之模體的對應蛋白質，由包含編碼靶向免疫蛋白酶體之模體之一或多種核酸序列的mRNA編碼之蛋白質的降解率增加約以下中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些實施例中，相比於不包含靶向免疫蛋白酶體之模體的對應蛋白質，源於包含一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體的蛋白質的肽之細胞表面呈現量增加約以下中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於不包含靶向免疫蛋白酶體之模體的對應蛋白質，源於包含一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體的蛋白質的肽之細胞表面呈現率增加約以下中之任一者：10%、20%、30%、40%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些實施例中，一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體位於融合蛋白之N端。在一些實施例中，一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體位於融合蛋白之C端。在一些實施例中，一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體位於融合蛋白之N端及/或C端處。
在一些實施例中，一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體包含以下中之一或多者：D-盒域、sec/MITD域、KEKE模體。
在一些實施例中，蛋白質為天然全長HPV E7蛋白。在一些實施例中，蛋白質為包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列的天然全長HPV E7蛋白。在一些實施例中，蛋白質自編碼天然HPV E7蛋白之密碼子最佳化mRNA轉譯。在一些實施例中，蛋白質自編碼天然HPV E7蛋白之密碼子最佳化mRNA轉譯，其中蛋白質包含SEQ ID NO: 52之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質為天然全長HPV E6蛋白。在一些實施例中，蛋白質為包含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列的天然全長HPV E6蛋白。在一些實施例中，蛋白質自編碼天然HPV E6蛋白之密碼子最佳化mRNA轉譯。在一些實施例中，蛋白質自編碼天然HPV E6蛋白之密碼子最佳化mRNA轉譯，其中蛋白質包含SEQ ID NO: 51之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質為包含HPV E7蛋白及KEKE域之融合蛋白。在一些實施例中，蛋白質為包含HPV E7蛋白及KEKE域之融合蛋白，其中蛋白質包含SEQ ID NO: 56之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質為包含HPV E7蛋白及D-盒域之融合蛋白。在一些實施例中，蛋白質為包含HPV E7蛋白及D-盒域之融合蛋白，其中蛋白質包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質為包含HPV E7蛋白及突變NLS的融合蛋白。在一些實施例中，蛋白質為包含HPV E7蛋白及突變NLS的融合蛋白，其中蛋白質包含SEQ ID NO: 55之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質為HPV E7.6蛋白。在一些實施例中，蛋白質為HPV E7.6蛋白，其中蛋白質包含SEQ ID NO: 57之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質為包含HPV E7.6之6個重複序列的融合蛋白。在一些實施例中，蛋白質為包含HPV E7.6之6個重複序列的融合蛋白，其中蛋白質包含SEQ ID NO: 58之胺基酸序列。
產生包含蛋白質或其片段之有核細胞之組合物的方法
在一些態樣中，提供產生包含蛋白質或其片段之有核細胞的方法；該方法包含將該蛋白質或其片段引入有核細胞中，其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
在一些態樣中，提供產生包含蛋白質或其片段之有核細胞的方法；該方法包含將編碼蛋白質或其片段之mRNA引入有核細胞中，其中該mRNA經表現以產生蛋白質或其片段；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
在一些態樣中，提供產生包含兩種或更多種來自蛋白質之抗原的有核細胞之方法；該方法包含將兩種或更多種抗原引入有核細胞中；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
在一些態樣中，提供產生包含蛋白質或其片段之經調節有核細胞的方法；該方法包含將該蛋白質或其片段引入經調節有核細胞中，其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
在一些態樣中，本發明提供產生包含蛋白質或其片段之經調節有核細胞的方法；該方法包含將編碼蛋白質或其片段之mRNA引入經調節有核細胞中，其中該mRNA經表現以產生蛋白質或其片段；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
在一些態樣中，提供產生包含兩種或更多種來自蛋白質之抗原的經調節有核細胞之方法；該方法包含將兩種或更多種抗原引入經調節有核細胞中；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
在一些實施例中，提供產生包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原的有核細胞的方法；其中兩種或更多種抗原刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，提供產生包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原的有核細胞之方法；其中兩種或更多種抗原刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。
在一些實施例中，細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原。在一些實施例中，細胞包含約以下中之任一者：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、70、75、80、90、100種或更多種源於蛋白質之抗原。在一些實施例中，抗原中之至少兩個包含部分重疊之胺基酸序列。在一些實施例中，所有抗原之組合胺基酸序列與蛋白質之胺基酸序列重疊約90%或更多。在一些實施例中，所有抗原之組合胺基酸序列與約以下中之任一者重疊：50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%蛋白質之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質之約80%胺基酸序列之各胺基酸與至少兩種源於蛋白質之抗原重疊。在一些實施例中，蛋白質之約80%胺基酸序列之各胺基酸與至少三種源於蛋白質之抗原重疊。在一些實施例中，蛋白質之約90%胺基酸序列之各胺基酸與至少兩種源於蛋白質之抗原重疊。在一些實施例中，蛋白質之約90%胺基酸序列之各胺基酸與至少三種源於蛋白質之抗原重疊。在一些實施例中，蛋白質之約95%胺基酸序列之各胺基酸與至少兩種源於蛋白質之抗原重疊。在一些實施例中，蛋白質之約95%胺基酸序列之各胺基酸與至少三種源於蛋白質之抗原重疊。
在一些實施例中，抗原為包含蛋白質之兩個或更多個抗原決定基之多肽。在一些實施例中，免疫原性肽抗原決定基融合至N端側接多肽及/或C端側接多肽。在一些實施例中，抗原為一或多個蛋白質抗原決定基及一或多個異源肽序列。在一些實施例中，一或多個抗原決定基在N端及/或C端上側接異源肽序列。在一些實施例中，側接異源肽序列源於疾病相關之免疫原性肽。在一些實施例中，側接異源肽序列為非天然存在之序列。在一些實施例中，側接異源肽序列源於免疫原性合成長肽(SLP)。在一些實施例中，N端側接多肽包含SEQ ID NO: 5-10中之任一者之胺基酸序列，及/或C端側接多肽包含SEQ ID NO: 11-17中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原能夠經加工成I類MHC限制性肽及/或II類MHC限制性肽。
在一些實施例中，蛋白質為與癌症相關之突變蛋白、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白。在一些實施例中，蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。在一些實施例中，HPV為HPV-16或HPV-18。在一些實施例中，蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。在一些實施例中，蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白質。
在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含該蛋白質或其片段之有核細胞，其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些實施例中，包含編碼蛋白質或其片段之mRNA的有核細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的有核細胞。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中該mRNA經表現以產生該蛋白質或其片段，由此產生包含該蛋白質或其片段之有核細胞，其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
在一些實施例中，輸入細胞懸浮液可包含輸入有核細胞及抗原。在一些實施例中，輸入細胞懸浮液包含輸入有核細胞及蛋白質或其片段。在一些實施例中，輸入細胞懸浮液包含輸入有核細胞及編碼蛋白質或其片段之mRNA。在一些實施例中，該方法包含在使細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將有核細胞與蛋白質或其片段或與編碼蛋白質或其片段之mRNA一起培育。在一些實施例中，該方法包含在使細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部之前，將有核細胞與蛋白質或其片段或與編碼蛋白質或其片段之mRNA一起培育。在一些實施例中，收縮部寬度為輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，收縮部寬度為在有核細胞群內具有最小直徑的輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，收縮部寬度為輸入有核細胞平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%、約30%至約45%、約50%至約99%、約50%至約90%、約50%至約80%、約50%至約70%、約60%至約90%、約60%至約80%或約60%至約70%中之任一者。在一些實施例中，收縮部寬度為有核細胞群內具有最小直徑之輸入有核細胞的平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%、約30%至約45%、約50%至約99%、約50%至約90%、約50%至約80%、約50%至約70%、約60%至約90%、約60%至約80%或約60%至約70%中之任一者。在一些實施例中，收縮部寬度為約2 µm至約5 µm、約3 µm至約5 µm、約2 µm至約2.5 µm、約2.2 µm至約2.5、約2.5 µm至約3 µm、約3 µm至約3.5 µm、約3.5 µm至約4 µm、約4 µm至約4.5 µm、約3.2 µm至約3.8 µm、約3.8 µm至約4.3 µm、約4.2 µm至約6 µm或約4.2 µm至約4.8 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約4.5 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約以下中之任一者或小於以下中之任一者：2 µm、2.2 µm、2.5 µm、3 µm、3.5 µm、4 µm、4.5 µm、5 µm、5.5 µm、6 µm、6.5 µm、7 µm、7.5 µm、8 µm、8.5 µm、9 µm、9.5 µm、10 µm、10.5 µm、11 µm、11.5 µm、12 µm、12.5 µm、13 µm、13.5 µm、14 µm、14.5 µm或15 µm。在一些實施例中，包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中多個收縮部串聯及/或並聯配置。
在根據本文所描述之方法、用途或組合物中之任一者的一些實施例中，有核細胞(例如PBMC)與佐劑一起培育足夠的時間以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約1至約24小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約2至約10小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約3至約6小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約1小時、2小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時、5.5小時、6小時、8小時、12小時、16小時、20小時或24小時中之任一者以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約4小時以調節有核細胞。在一些實施例中，在將蛋白質或其片段或編碼核酸之蛋白質或其片段引入有核細胞中之前調節有核細胞。在一些實施例中，在將蛋白質或其片段或編碼蛋白質或其片段之核酸引入有核細胞中之後，調節有核細胞。在一些實施例中，用於調節之佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖苷腦醯胺、STING激動劑、環二核苷酸(CDN)、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸(聚I:C)、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。例示性佐劑包括但不限於CpG ODN、干擾素-α (IFN-α)、多聚肌苷酸:多聚胞苷酸(聚I:C)、咪喹莫特(R837)、雷西莫特(R848)或脂多醣(LPS)。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。在一些實施例中，佐劑為CpG 7909。
在其中有核細胞包含B細胞之一些實施例中，相比於未經調節有核細胞之B細胞，一或多種共刺激分子在經調節有核細胞之B細胞中上調。在一些實施例中，有核細胞係複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。在其中有核細胞係複數個PBMC之一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC之B細胞，一或多種共刺激分子在複數個經調節PBMC之B細胞中上調。在一些實施例中，共刺激分子為CD80及/或CD86。在一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC，複數個經調節PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者之增加的表現。在一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者的表現增加超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
在根據本文所描述之方法、用途或組合物中之任一者的一些實施例中，有核細胞係免疫細胞。在一些實施例中，有核細胞係人類細胞。在一些實施例中，有核細胞為具有以下單倍型之人類細胞：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16。在一些實施例中，有核細胞係複數個PBMC。在一些實施例中，經調節有核細胞為經調節的複數個經修飾PBMC。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。在一些實施例中，有核細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。
在一些實施例中，複數個PBMC經進一步修飾以增加共刺激分子中之一或多者的表現。在一些實施例中，共刺激分子為B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些實施例中，複數個PBMC經進一步修飾以增加一或多種細胞介素之表現。在一些實施例中，細胞介素為IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21或其功能變異體。在一些實施例中，細胞介素為IFN-α2或其功能變異體。在一些實施例中，細胞介素係變異細胞介素(諸如經修飾細胞介素)。在一些實施例中，複數個PBMC經進一步修飾以增加一或多種嵌合膜結合細胞介素之表現。在一些實施例中，細胞介素經修飾，且經修飾細胞介素為包含細胞介素及跨膜域之融合蛋白。在一些實施例中，細胞介素藉由肽連接子接合至跨膜域。在一些實施例中，跨膜域為運鐵蛋白受體蛋白1 (TFRC)或腫瘤壞死因子(例如FasL)跨膜域。在一些實施例中，跨膜域包含SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。在一些實施例中，肽連接子為G
4S連接子或EAAAK連接子。在實施例中，G
4S連接子包含G
4S序列之2、3、4、5、6、7、8、9或10個重複序列中之任一者。在一些實施例中，EAAAK連接子包含EAAAK序列之2、3、4、5、6、7、8、9或10個重複序列中之任一者。在一些實施例中，肽連接子為(G
4S)
3(SEQ ID NO: 73)或(EAAAK)
3(SEQ ID NO: 74)。在一些實施例中，嵌合膜結合細胞介素包含SEQ ID NO: 77-80中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，複數個經修飾PBMC包含引起一或多種細胞介素之表現及/或分泌增加的核酸。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸包含SEQ ID NO: 71或72之核苷酸序列。在一些實施例中，細胞介素為刺激T細胞活化之信號3效應子。在一些實施例中，相比於非膜結合細胞介素，嵌合膜結合細胞介素增強個體中之細胞介素半衰期。在一些實施例中，相比於非膜結合細胞介素，嵌合膜結合細胞介素之半衰期增加約以下中之任一者：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，膜結合細胞介素使細胞介素與抗原的空間關聯延長約1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96小時或更多小時中之任一者，該等抗原由與蛋白質或其片段一起引入之有核細胞呈現。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含膜結合細胞介素之有核細胞呈現高出約以下中之任一者的局部細胞介素濃度：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含膜結合細胞介素之有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
包含蛋白質或其片段之有核細胞之組合物
在一些態樣中，提供一種包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含蛋白質或其片段；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些態樣中，提供一種用於刺激個體之免疫反應的組合物，其中該組合物包含有效量之包含蛋白質或其片段之有核細胞；其中蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些實施例中，提供包含有效量之有核細胞之組合物在製造用於刺激個體之免疫反應之藥劑中的用途，其中該等有核細胞包含蛋白質或其片段；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
在一些態樣中，提供一種包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些態樣中，提供一種用於刺激個體之免疫反應的組合物，其中該組合物包含有效量之有核細胞，該等有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些實施例中，提供包含有效量之有核細胞之組合物在製造用於刺激個體之免疫反應之藥劑中的用途，其中該等有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
在一些態樣中，提供一種包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些態樣中，提供一種用於刺激個體之免疫反應的組合物，其中該組合物包含有效量之包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原的有核細胞；其中蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些實施例中，提供包含有效量之有核細胞之組合物在製造用於刺激個體之免疫反應的藥劑中的用途，其中有核細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原；其中蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
在一些態樣中，提供一種包含經調節有核細胞之組合物，其中有核細胞包含蛋白質或其片段；其中蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些態樣中，提供一種用於刺激個體之免疫反應的組合物，其中該組合物包含有效量之包含蛋白質或其片段之經調節有核細胞；其中蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些實施例中，提供包含有效量之有核細胞之組合物在製造用於刺激個體之免疫反應之藥劑中的用途，其中該等有核細胞包含蛋白質或其片段；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
在一些態樣中，提供一種包含經調節有核細胞之組合物，其中該有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些態樣中，提供一種刺激個體之免疫反應的組合物，其中該組合物包含有效量之包含編碼蛋白質或其片段之mRNA的經調節有核細胞；其中蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些實施例中，提供包含有效量之有核細胞之組合物在製造用於刺激個體之免疫反應之藥劑中的用途，其中該等有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
在一些態樣中，提供一種包含經調節有核細胞之組合物，其中該有核細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些態樣中，提供一種用於刺激個體之免疫反應的組合物，其中該組合物包含有效量之包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原的經調節有核細胞；其中蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些實施例中，提供包含有效量之有核細胞之組合物在製造用於刺激個體之免疫反應的藥劑中的用途，其中有核細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原；其中蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
在一些態樣中，本發明提供一種用作藥物之組合物，其中該組合物包含有效量的包含蛋白質或其片段之有核細胞之組合物，其中蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些態樣中，本發明提供一種用作藥物之組合物，其中該組合物包含有效量的包含編碼蛋白質或其片段之mRNA的有核細胞之組合物，其中蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些態樣中，本發明提供一種用作藥物之組合物，其中該組合物包含有效量之包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原的有核細胞之組合物；其中兩種或更多種抗原以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
在一些實施例中，細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原。在一些實施例中，細胞包含約以下中之任一者：2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、70、75、80、90、100種或更多種源於蛋白質之抗原。在一些實施例中，抗原中之至少兩個包含部分重疊之胺基酸序列。在一些實施例中，所有抗原之組合胺基酸序列與蛋白質之胺基酸序列重疊約90%或更多。在一些實施例中，所有抗原之組合胺基酸序列與約以下中之任一者重疊：50%、60%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%蛋白質之胺基酸序列。在一些實施例中，蛋白質之約80%胺基酸序列之各胺基酸與至少兩種源於蛋白質之抗原重疊。在一些實施例中，蛋白質之約80%胺基酸序列之各胺基酸與至少三種源於蛋白質之抗原重疊。在一些實施例中，蛋白質之約90%胺基酸序列之各胺基酸與至少兩種源於蛋白質之抗原重疊。在一些實施例中，蛋白質之約90%胺基酸序列之各胺基酸與至少三種源於蛋白質之抗原重疊。在一些實施例中，蛋白質之約95%胺基酸序列之各胺基酸與至少兩種源於蛋白質之抗原重疊。在一些實施例中，蛋白質之約95%胺基酸序列之各胺基酸與至少三種源於蛋白質之抗原重疊。
在一些實施例中，抗原為包含蛋白質之兩個或更多個抗原決定基之多肽。在一些實施例中，免疫原性肽抗原決定基融合至N端側接多肽及/或C端側接多肽。在一些實施例中，抗原為一或多個蛋白質抗原決定基及一或多個異源肽序列。在一些實施例中，一或多個抗原決定基在N端及/或C端上側接異源肽序列。在一些實施例中，側接異源肽序列源於疾病相關之免疫原性肽。在一些實施例中，側接異源肽序列為非天然存在之序列。在一些實施例中，側接異源肽序列源於免疫原性合成長肽(SLP)。在一些實施例中，N端側接多肽包含SEQ ID NO: 5-10中之任一者之胺基酸序列，及/或C端側接多肽包含SEQ ID NO: 11-17中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，抗原能夠經加工成I類MHC限制性肽及/或II類MHC限制性肽。
在一些實施例中，蛋白質為與癌症、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白相關的突變蛋白。在一些實施例中，蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。在一些實施例中，HPV為HPV-16或HPV-18。在一些實施例中，蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。在一些實施例中，蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白質。
在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含該蛋白質或其片段之有核細胞。在一些實施例中，包含編碼蛋白質或其片段之mRNA的有核細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的有核細胞。
在一些實施例中，輸入細胞懸浮液可包含輸入有核細胞及抗原。在一些實施例中，輸入細胞懸浮液包含輸入有核細胞及蛋白質或其片段。在一些實施例中，輸入細胞懸浮液包含輸入有核細胞及編碼蛋白質或其片段之mRNA。在一些實施例中，該方法包含在使細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將有核細胞與蛋白質或其片段或與編碼蛋白質或其片段之mRNA一起培育。在一些實施例中，該方法包含在使細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部之前，將有核細胞與蛋白質或其片段或與編碼蛋白質或其片段之mRNA一起培育。在一些實施例中，收縮部寬度為輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，收縮部寬度為在有核細胞群內具有最小直徑的輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，收縮部寬度為輸入有核細胞平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%、約30%至約45%、約50%至約99%、約50%至約90%、約50%至約80%、約50%至約70%、約60%至約90%、約60%至約80%或約60%至約70%中之任一者。在一些實施例中，收縮部寬度為有核細胞群內具有最小直徑之輸入有核細胞的平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%、約30%至約45%、約50%至約99%、約50%至約90%、約50%至約80%、約50%至約70%、約60%至約90%、約60%至約80%或約60%至約70%中之任一者。在一些實施例中，收縮部寬度為約2 µm至約5 µm、約3 µm至約5 µm、約2 µm至約2.5 µm、約2.2 µm至約2.5、約2.5 µm至約3 µm、約3 µm至約3.5 µm、約3.5 µm至約4 µm、約4 µm至約4.5 µm、約3.2 µm至約3.8 µm、約3.8 µm至約4.3 µm、約4.2 µm至約6 µm或約4.2 µm至約4.8 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約4.5 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約以下中之任一者或小於以下中之任一者：2 µm、2.2 µm、2.5 µm、3 µm、3.5 µm、4 µm、4.5 µm、5 µm、5.5 µm、6 µm、6.5 µm、7 µm、7.5 µm、8 µm、8.5 µm、9 µm、9.5 µm、10 µm、10.5 µm、11 µm、11.5 µm、12 µm、12.5 µm、13 µm、13.5 µm、14 µm、14.5 µm或15 µm。在一些實施例中，包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中多個收縮部串聯及/或並聯配置。
在根據本文所描述之方法、用途或組合物中之任一者的一些實施例中，有核細胞(例如PBMC)與佐劑一起培育足夠的時間以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約1至約24小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約2至約10小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約3至約6小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約1小時、2小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時、5.5小時、6小時、8小時、12小時、16小時、20小時或24小時中之任一者以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約4小時以調節有核細胞。在一些實施例中，在將蛋白質或其片段或編碼核酸之蛋白質或其片段引入有核細胞中之前調節有核細胞。在一些實施例中，在將蛋白質或其片段或編碼蛋白質或其片段之核酸引入有核細胞中之後，調節有核細胞。在一些實施例中，用於調節之佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖苷腦醯胺、STING激動劑、環二核苷酸(CDN)、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸(聚I:C)、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。例示性佐劑包括但不限於CpG ODN、干擾素-α (IFN-α)、多聚肌苷酸:多聚胞苷酸(聚I:C)、咪喹莫特(R837)、雷西莫特(R848)或脂多醣(LPS)。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。在一些實施例中，佐劑為CpG 7909。
在其中有核細胞包含B細胞之一些實施例中，相比於未經調節有核細胞之B細胞，一或多種共刺激分子在經調節有核細胞之B細胞中上調。在一些實施例中，有核細胞係複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。在其中有核細胞係複數個PBMC之一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC之B細胞，一或多種共刺激分子在複數個經調節PBMC之B細胞中上調。在一些實施例中，共刺激分子為CD80及/或CD86。在一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC，複數個經調節PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者之增加的表現。在一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者的表現增加超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
在根據本文所描述之方法、用途或組合物中之任一者的一些實施例中，有核細胞係免疫細胞。在一些實施例中，有核細胞係人類細胞。在一些實施例中，有核細胞為具有以下單倍型之人類細胞：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08及/或HLA-C*16。在一些實施例中，有核細胞係複數個PBMC。在一些實施例中，經調節有核細胞為經調節的複數個經修飾PBMC。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。在一些實施例中，有核細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。
在一些實施例中，複數個PBMC經進一步修飾以增加共刺激分子中之一或多者的表現。在一些實施例中，共刺激分子為B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些實施例中，複數個PBMC經進一步修飾以增加一或多種細胞介素之表現。在一些實施例中，細胞介素為IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21或其功能變異體。在一些實施例中，細胞介素為IFN-α2或其功能變異體。在一些實施例中，細胞介素係變異細胞介素(諸如經修飾細胞介素)。在一些實施例中，複數個PBMC經進一步修飾以增加一或多種嵌合膜結合細胞介素之表現。在一些實施例中，細胞介素經修飾，且經修飾細胞介素為包含細胞介素及跨膜域之融合蛋白。在一些實施例中，細胞介素藉由肽連接子接合至跨膜域。在一些實施例中，跨膜域為運鐵蛋白受體蛋白1 (TFRC)或腫瘤壞死因子(例如FasL)跨膜域。在一些實施例中，跨膜域包含SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。在一些實施例中，肽連接子為G
4S連接子或EAAAK連接子。在實施例中，G
4S連接子包含G
4S序列之2、3、4、5、6、7、8、9或10個重複序列中之任一者。在一些實施例中，EAAAK連接子包含EAAAK序列之2、3、4、5、6、7、8、9或10個重複序列中之任一者。在一些實施例中，肽連接子為(G
4S)
3(SEQ ID NO: 73)或(EAAAK)
3(SEQ ID NO: 74)。在一些實施例中，嵌合膜結合細胞介素包含SEQ ID NO: 77-80中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，複數個經修飾PBMC包含引起一或多種細胞介素之表現及/或分泌增加的核酸。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸包含SEQ ID NO: 71或72之核苷酸序列。在一些實施例中，細胞介素為刺激T細胞活化之信號3效應子。在一些實施例中，相比於非膜結合細胞介素，嵌合膜結合細胞介素增強個體中之細胞介素半衰期。在一些實施例中，相比於非膜結合細胞介素，嵌合膜結合細胞介素之半衰期增加約以下中之任一者：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，膜結合細胞介素使細胞介素與抗原的空間關聯延長約1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96小時或更多小時中之任一者，該等抗原由與蛋白質或其片段一起引入之有核細胞呈現。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含膜結合細胞介素之有核細胞呈現高出約以下中之任一者的局部細胞介素濃度：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含膜結合細胞介素之有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，膜繫栓細胞介素為膜結合趨化介素。
增強免疫細胞活性之方法以及其組合物
在一些態樣中，提供增強免疫細胞活性之方法，該等方法包含表現編碼免疫細胞中之嵌合膜結合細胞介素之核酸。在一些實施例中，細胞介素經修飾，且經修飾細胞介素為包含細胞介素及跨膜域之融合蛋白。在一些實施例中，細胞介素藉由肽連接子接合至跨膜域。在一些實施例中，跨膜域為運鐵蛋白受體蛋白1 (TFRC)或腫瘤壞死因子(例如FasL)跨膜域。在一些實施例中，跨膜域包含SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。在一些實施例中，肽連接子為G
4S連接子或EAAAK連接子。在實施例中，G
4S連接子包含G
4S序列之2、3、4、5、6、7、8、9或10個重複序列中之任一者。在一些實施例中，EAAAK連接子包含EAAAK序列之2、3、4、5、6、7、8、9或10個重複序列中之任一者。在一些實施例中，肽連接子為(G
4S)
3(SEQ ID NO: 73)或(EAAAK)
3(SEQ ID NO: 74)。在一些實施例中，嵌合膜結合細胞介素包含SEQ ID NO: 77-80之胺基酸序列。在一些實施例中，複數個經修飾PBMC包含引起一或多種細胞介素之表現及/或分泌增加的核酸。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸包含SEQ ID NO: 71或72之核苷酸序列。在一些實施例中，細胞介素為刺激T細胞活化之信號3效應子。在一些實施例中，相比於非膜結合細胞介素，嵌合膜結合細胞介素增強個體中之細胞介素半衰期。在一些實施例中，相比於非膜結合細胞介素，嵌合膜結合細胞介素之半衰期增加約以下中之任一者：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，膜結合細胞介素使細胞介素與抗原的空間關聯延長約1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96小時或更多小時中之任一者，該等抗原由與蛋白質或其片段一起引入之有核細胞呈現。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含膜結合細胞介素之有核細胞呈現高出約以下中之任一者的局部細胞介素濃度：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含膜結合細胞介素之有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些實施例中，膜結合細胞介素為膜結合趨化介素。
在一些態樣中，提供用於增強免疫細胞活性之組合物，該組合物包含免疫細胞中之嵌合膜結合細胞介素。在一些實施例中，細胞介素經修飾，且經修飾細胞介素為包含細胞介素及跨膜域之融合蛋白。在一些實施例中，細胞介素藉由肽連接子接合至跨膜域。在一些實施例中，跨膜域為運鐵蛋白受體蛋白1 (TFRC)或腫瘤壞死因子(例如FasL)跨膜域。在一些實施例中，跨膜域包含SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。在一些實施例中，肽連接子為G
4S連接子或EAAAK連接子。在實施例中，G
4S連接子包含G
4S序列之2、3、4、5、6、7、8、9或10個重複序列中之任一者。在一些實施例中，EAAAK連接子包含EAAAK序列之2、3、4、5、6、7、8、9或10個重複序列中之任一者。在一些實施例中，肽連接子為(G
4S)
3(SEQ ID NO: 73)或(EAAAK)
3(SEQ ID NO: 74)。在一些實施例中，嵌合膜結合細胞介素包含SEQ ID NO: 77-80中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，複數個經修飾PBMC包含引起一或多種細胞介素之表現及/或分泌增加的核酸。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸包含SEQ ID NO: 71或72之核苷酸序列。在一些實施例中，細胞介素為刺激T細胞活化之信號3效應子。在一些實施例中，相比於非膜結合細胞介素，嵌合膜結合細胞介素增強個體中之細胞介素半衰期。在一些實施例中，相比於非膜結合細胞介素，嵌合膜結合細胞介素之半衰期增加約以下中之任一者：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，膜結合細胞介素使細胞介素與抗原的空間關聯延長約1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96小時或更多小時中之任一者，該等抗原由與蛋白質或其片段一起引入之有核細胞呈現。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含膜結合細胞介素之有核細胞呈現高出約以下中之任一者的局部細胞介素濃度：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含膜結合細胞介素之有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些實施例中，膜結合細胞介素為膜結合趨化介素。
在一些實施例中，複數個PBMC經修飾以增加一或多種細胞介素之表現。在一些實施例中，細胞介素為IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21或其功能變異體。在一些實施例中，細胞介素為IFN-α2或其功能變異體。在一些實施例中，細胞介素係變異細胞介素(諸如經修飾細胞介素)，諸如嵌合膜結合細胞介素。在一些實施例中，複數個PBMC經進一步修飾以增加一或多種嵌合膜結合細胞介素(諸如膜結合IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21)之表現。
在一些實施例中，免疫細胞進一步包含抗原。在一些實施例中，免疫細胞進一步包含編碼抗原之mRNA。在一些實施例中，抗原為蛋白質或其片段，其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，免疫細胞進一步包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原。在一些實施例中，兩種或更多種抗原均刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，蛋白質為與癌症、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白相關的突變蛋白。在一些實施例中，蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。在一些實施例中，HPV為HPV-16或HPV-18。在一些實施例中，蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。在一些實施例中，蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白質。
在一些實施例中，提供增強免疫細胞活性之方法，其中包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸為編碼嵌合膜結合細胞介素之mRNA。
在一些實施例中，提供增強免疫細胞活性之方法，其中包含嵌合膜結合細胞介素且進一步包含抗原之免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的輸入免疫細胞之擾動以供編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將經擾動之輸入免疫細胞與編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及抗原一起培育，使得核酸及抗原能夠進入經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸為編碼嵌合膜結合細胞介素之mRNA。
在一些實施例中，提供增強免疫細胞活性之方法，其中包含嵌合膜結合細胞介素且進一步包含抗原之免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼該抗原之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將經擾動之輸入免疫細胞與編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼抗原之核酸一起培育，使得核酸能夠進入經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼抗原之核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及/或編碼抗原之核酸為mRNA。
在一些實施例中，提供增強免疫細胞活性之方法，其中包含嵌合膜結合細胞介素及兩種或更多種源於蛋白質之抗原的免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將經擾動之輸入免疫細胞與編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及兩種或更多種源於蛋白質之抗原一起培育，使得核酸能夠進入經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及兩種或更多種源於蛋白質之抗原的免疫細胞。
在一些態樣中，提供一種用作藥物之組合物，其中該組合物包含有效量之包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞。在一些態樣中，提供用於用組合物治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的組合物，其中該組合物包含有效量之包含嵌合膜結合細胞介素的免疫細胞。在一些態樣中，提供治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的方法，其包含向個體投與包含有效量之免疫細胞的組合物，該等免疫細胞包含嵌合膜結合細胞介素。在一些實施例中，提供包含有效量之包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞的組合物的用途，其用於製造用於刺激個體之免疫反應及/或治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的藥劑。在根據本文所述之方法、組合物或用途的一些實施例中，包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸為編碼嵌合膜結合細胞介素之mRNA。
在一些態樣中，提供一種用作藥物之組合物，其中該組合物包含有效量之免疫細胞，該等免疫細胞包含嵌合膜結合細胞介素及抗原。在一些態樣中，提供用於治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的組合物，其中該組合物包含有效量之免疫細胞，該等免疫細胞包含嵌合膜結合細胞介素及抗原。在一些態樣中，提供治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的方法，其包含向個體投與包含有效量之免疫細胞的組合物，該等免疫細胞包含嵌合膜結合細胞介素及抗原。在一些實施例中，提供包含有效量之包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞的組合物的用途，其用於製造用於刺激個體之免疫反應及/或治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的藥劑。在根據本文所述之方法、組合物或用途的一些實施例中，包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及該抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將經擾動之輸入免疫細胞與編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及抗原一起培育，使得核酸及抗原能夠進入經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸為編碼嵌合膜結合細胞介素之mRNA。
在一些態樣中，提供一種用作藥物之組合物，其中該組合物包含有效量之免疫細胞，該等免疫細胞包含嵌合膜結合細胞介素及抗原。在一些態樣中，提供用於治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的組合物，其中該組合物包含有效量之免疫細胞，該等免疫細胞包含嵌合膜結合細胞介素及抗原。在一些態樣中，提供治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的方法，其包含向個體投與包含有效量之免疫細胞的組合物，該等免疫細胞包含嵌合膜結合細胞介素及抗原。在一些實施例中，提供包含有效量之包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞的組合物的用途，其用於製造用於刺激個體之免疫反應及/或治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的藥劑。在根據本文所述之方法、組合物或用途的一些實施例中，包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼該抗原之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將經擾動之輸入免疫細胞與編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼抗原之核酸一起培育，使得核酸能夠進入經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼抗原之核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及/或編碼抗原之核酸為mRNA。
在一些態樣中，提供一種用作藥物之組合物，其中該組合物包含有效量之免疫細胞，該等免疫細胞包含嵌合膜結合細胞介素及兩種或更多種源於蛋白質之抗原。在一些態樣中，提供用於治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的組合物，其中該組合物包含有效量之免疫細胞，該等免疫細胞包含嵌合膜結合細胞介素及兩種或更多種源於蛋白質之抗原。在一些態樣中，提供治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的方法，其包含向個體投與包含有效量之免疫細胞的組合物，該等免疫細胞包含嵌合膜結合細胞介素及兩種或更多種源於蛋白質之抗原。在一些實施例中，提供包含有效量之包含嵌合膜結合細胞介素及兩種或更多種源於蛋白質之抗原的免疫細胞的組合物之用途，其用於製造用於刺激個體之免疫反應及/或治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的藥劑。在根據本文所述之方法、組合物或用途的一些實施例中，包含嵌合膜結合細胞介素及兩種或更多種源於蛋白質之抗原的免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將經擾動之輸入免疫細胞與編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及兩種或更多種源於蛋白質之抗原一起培育，使得核酸能夠進入經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及兩種或更多種源於蛋白質之抗原的免疫細胞。
在一些實施例中，收縮部寬度為輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，收縮部寬度為有核細胞群內具有最小直徑之輸入有核細胞的平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%、約30%至約45%、約50%至約99%、約50%至約90%、約50%至約80%、約50%至約70%、約60%至約90%、約60%至約80%或約60%至約70%中之任一者。在一些實施例中，收縮部寬度為約2 µm至約5 µm、約3 µm至約5 µm、約2 µm至約2.5 µm、約2.2 µm至約2.5、約2.5 µm至約3 µm、約3 µm至約3.5 µm、約3.5 µm至約4 µm、約4 µm至約4.5 µm、約3.2 µm至約3.8 µm、約3.8 µm至約4.3 µm、約4.2 µm至約6 µm或約4.2 µm至約4.8 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約4.5 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約以下中之任一者或小於以下中之任一者：2 µm、2.2 µm、2.5 µm、3 µm、3.5 µm、4 µm、4.5 µm、5 µm、5.5 µm、6 µm、6.5 µm、7 µm、7.5 µm、8 µm、8.5 µm、9 µm、9.5 µm、10 µm、10.5 µm、11 µm、11.5 µm、12 µm、12.5 µm、13 µm、13.5 µm、14 µm、14.5 µm或15 µm。在一些實施例中，包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中多個收縮部串聯及/或並聯配置。
在根據本文所描述之方法、用途或組合物中之任一者的一些實施例中，有核細胞(例如PBMC)與佐劑一起培育足夠的時間以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約1至約24小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約2至約10小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約3至約6小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約1小時、2小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時、5.5小時、6小時、8小時、12小時、16小時、20小時或24小時中之任一者以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約4小時以調節有核細胞。在一些實施例中，在將蛋白質或其片段或編碼核酸之蛋白質或其片段引入有核細胞中之前調節有核細胞。在一些實施例中，在將蛋白質或其片段或編碼蛋白質或其片段之核酸引入有核細胞中之後，調節有核細胞。在一些實施例中，用於調節之佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖苷腦醯胺、STING激動劑、環二核苷酸(CDN)、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸(聚I:C)、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。例示性佐劑包括但不限於CpG ODN、干擾素-α (IFN-α)、多聚肌苷酸:多聚胞苷酸(聚I:C)、咪喹莫特(R837)、雷西莫特(R848)或脂多醣(LPS)。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。在一些實施例中，佐劑為CpG 7909。
在其中有核細胞包含B細胞之一些實施例中，相比於未經調節有核細胞之B細胞，一或多種共刺激分子在經調節有核細胞之B細胞中上調。在一些實施例中，有核細胞係複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。在其中有核細胞係複數個PBMC之一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC之B細胞，一或多種共刺激分子在複數個經調節PBMC之B細胞中上調。在一些實施例中，共刺激分子為CD80及/或CD86。在一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC，複數個經調節PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者之增加的表現。在一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者的表現增加超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
在根據本文所描述之方法、用途或組合物中之任一者的一些實施例中，有核細胞係免疫細胞。在一些實施例中，有核細胞係人類細胞。在一些實施例中，有核細胞為具有以下單倍型之人類細胞：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16。在一些實施例中，有核細胞係複數個PBMC。在一些實施例中，經調節有核細胞為經調節的複數個經修飾PBMC。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。在一些實施例中，有核細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。
輸入有核細胞內之構成細胞
在一些實施例中，本文所揭示之方法提供向有需要之個體投與有效量之包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物，其中該蛋白質或片段係胞內遞送。在一些實施例中，有核細胞之組合物為免疫細胞之組合物。在一些實施例中，有核細胞之組合物包含複數個PBMC。在一些實施例中，有核細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。
在本發明之一特定實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞係PBMC。如本文所用，PBMC可藉由血球分離術，諸如白血球分離術與自個體獲得之全血分離。亦提供藉由混合來自相同個體或不同個體之不同PBMC池重構的PBMC組合物。在其他實例中，PBMC亦可藉由將不同細胞群混合至具有產生概況的混合細胞組合物中來重構。在一些實施例中，用於重構PBMC之細胞群為混合細胞群(諸如T細胞、B細胞、NK細胞或單核球中之一或多者之混合物)。在一些實施例中，用於重構PBMC之細胞群為純化細胞群(諸如純化T細胞、B細胞、NK細胞或單核球)。在其他實例中，用於重構PBMC組合物之不同細胞群可自相同個體(例如自體)分離或自不同個體(例如同種異體及/或異源)分離。
因此，在根據本文所描述之方法的一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之一或多者。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞。在一些實施例中，複數個PBMC包含CD3+ T細胞、CD20+ B細胞、CD14+單核球、CD56+ NK細胞中之一或多者。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且T細胞、B細胞、NK細胞及單核球與複數個PBMC中之PBMC總數的比率同T細胞、B細胞、NK細胞及單核球與全血中之PBMC總數的比率基本上相同。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且複數個PBMC中之T細胞、B細胞、NK細胞及單核球與PBMC總數的比率同來自全血之白血球分離產物中的T細胞、B細胞、NK細胞及單核球與PBMC總數的比率基本上相同。在一些實施例中，該複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且複數個PBMC中之T細胞、B細胞、NK細胞及單核球與PBMC總數的比率同全血中T細胞、B細胞、NK細胞及單核球與PBMC總數的比率相差不超過1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%中之任一者。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且複數個PBMC中之T細胞、B細胞、NK細胞及單核球與PBMC總數的比率同全血中之T細胞、B細胞、NK細胞及單核球與PBMC總數的比率中之任一者相差不超過10%。在一些實施例中，該複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且複數個PBMC中之T細胞、B細胞、NK細胞及單核球與PBMC總數的比率同來自全血之白血球分離產物中的T細胞、B細胞、NK細胞及單核球與PBMC總數的比率相差不超過1%、2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%中之任一者。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞及單核球，且複數個PBMC中之T細胞、B細胞、NK細胞及單核球與PBMC總數的比率同來自全血之白血球分離產物中的T細胞、B細胞、NK細胞及單核球與PBMC總數的比率中之任一者相差不超過10%。
在根據本文所描述之方法的一些實施例中，約25%至約70%經修飾PBMC為T細胞。在一些實施例中，約2.5%至約14%經修飾PBMC為B細胞。在一些實施例中，約3.5%至約35%經修飾PBMC為NK細胞。在一些實施例中，約4%至約25%經修飾PBMC為NK細胞。
在根據本文所述方法的一些實施例中，至少約15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%之PBMC中之任一者為T細胞。在一些實施例中，至少約25%之PBMC為T細胞。在一些實施例中，至少約0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%、7%、7.5%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%或30%之PBMC中之任一者為B細胞。在一些實施例中，至少約2.5%之PBMC為B細胞。在一些實施例中，至少約0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%、7%、7.5%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%或30%之PBMC中之任一者為NK細胞。在一些實施例中，至少約3.5%之PBMC為NK細胞。在一些實施例中，至少約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、25%、30%、35%或40%之PBMC中之任一者為單核球。在一些實施例中，至少約4%之PBMC為單核球。在一些實施例中，至少約25%之PBMC為T細胞；至少約2.5%之PBMC為B細胞；至少約3.5%之PBMC為NK細胞；且至少約4%之PBMC為單核球。
在根據本文所述方法的一些實施例中，不超過約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%之PBMC中之任一者為T細胞。在一些實施例中，不超過約70%之PBMC為T細胞。在一些實施例中，不超過約5%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、25%、30%、35%、40%或50%之PBMC中之任一者為B細胞。在一些實施例中，不超過約14%之PBMC為B細胞。在一些實施例中，不超過約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%或60%之PBMC中之任一者為NK細胞。在一些實施例中，不超過約35%之PBMC為NK細胞。在一些實施例中，不超過約5%、10%、12%、14%、16%、18%、20%、22%、25%、30%、35%、40%或50%之PBMC中之任一者為單核球。在一些實施例中，不超過約4%之PBMC為單核球。在一些實施例中，不超過約25%之PBMC為T細胞；不超過約2.5%之PBMC為B細胞；不超過約3.5%之PBMC為NK細胞；且不超過約4%之PBMC為單核球。
在根據本文所述方法的一些實施例中，約20%至25%、25%至30%、30%至35%、35%至40%、40%至45%、45%至50%、50%至55%、55%至60%、60%至65%、65%至70%或70%至75%經修飾PBMC中之任一者為T細胞。在一些實施例中，約25%至約70%經修飾PBMC為T細胞。在一些實施例中，約1%至2.5%、2.5%至4%、4%至6%、6%至8%、8%至10%、10%至12%、12%至14%、14%至16%、16%至20%或20%至25%經修飾PBMC中之任一者為B細胞。在一些實施例中，約2.5%至約14%經修飾PBMC為B細胞。在一些實施例中，約1%至2%、2%至3.5%、3.5%至5%、5%至8%、8%至10%、10%至12%、12%至14%、14%至16%、16%至20%、20%至25%、25%至30%、30%至35%或35%至40%經修飾PBMC中之任一者為NK細胞。在一些實施例中，約3.5%至約35%經修飾PBMC為NK細胞。在一些實施例中，約2%至4%、4%至6%、6%至8%、8%至10%、10%至12%、12%至14%、14%至16%、16%至20%、20%至25%、25%至30%、30%至35%或35%至40%經修飾PBMC中之任一者為單核球。在一些實施例中，約4%至約25%經修飾PBMC為單核球。在一些實施例中，約25%至約70%經修飾PBMC為T細胞，約2.5%至約14%經修飾PBMC為B細胞，約3.5%至約35%經修飾PBMC為NK細胞，且約4%至約25%經修飾PBMC為NK細胞。
如本文所用，亦可在操縱單核血細胞(諸如淋巴球及單核球)之混合細胞群的組合物之後產生PBMC。在一些情況下，在減少(諸如耗乏)單核血細胞之混合細胞群內之某些亞群(諸如B細胞)之後產生PBMC。可操縱個體中單核血細胞之混合細胞群中的組合物以使細胞群更近似於來自相同個體之全血的白血球分離產物。在其他實例中，亦可操縱單核血細胞(例如小鼠脾細胞)之混合細胞群中之組合物以使細胞群更近似於自人類全血白血球分離產物分離之人類PBMC。
在本發明之一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物為在PBMC中發現之細胞群。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之一或多者。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物包含CD3+ T細胞、CD20+ B細胞、CD14+單核球、CD56+ NK細胞中之一或多者。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物包含至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%或99% T細胞中之任一者。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物包含100% T細胞。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物包含至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%或99% B細胞中之任一者。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物包含100% B細胞。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物包含至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%或99% NK細胞中之任一者。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物包含100% NK細胞。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物包含至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%單核球中之任一者。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物包含100%單核球。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物包含至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%樹突狀細胞中之任一者。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物包含100%樹突狀細胞。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物包含至少約70%、75%、80%、85%、90%、95%或99% NK-T細胞中之任一者。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物包含100% NK-T細胞。
包含蛋白質或其片段之有核細胞之進一步修飾
在根據本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，相比於不包含藥劑的有核細胞之對應組合物，有核細胞(例如PBMC)之組合物進一步包含增強有核細胞存活率及/或功能的藥劑。在一些實施例中，相比於不包含藥劑的有核細胞之對應組合物，有核細胞之組合物進一步包含增強有核細胞在凍融循環後之存活率及/或功能的藥劑。在一些實施例中，藥劑為冷凍保存藥劑及/或低溫保存藥劑。在一些實施例中，冷凍保存藥劑或低溫保存藥劑在包含該藥劑之有核細胞的組合物中，相比於不包含該藥劑的有核細胞之對應組合物中，在任何凍融循環之前引起不超過10%或20%的細胞死亡。在一些實施例中，在至多1、2、3、4、5次凍融循環之後，至少約70%、約80%或約90%之有核細胞為活細胞。在一些實施例中，該藥劑為增強胞吞作用之化合物、穩定劑或輔因子。在一些實施例中，藥劑為白蛋白。在一些實施例中，白蛋白為小鼠、牛或人類白蛋白。在一些實施例中，藥劑為人類白蛋白。在一些實施例中，藥劑為以下中之一或多者：二價金屬陽離子、葡萄糖、ATP、鉀、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精胺酸、L-麩醯胺酸或EDTA。在一些實施例中，二價金屬陽離子為Mg2+、Zn2+或Ca2+中之一或多者。在一些實施例中，藥劑為以下中之一或多者：丙酮酸鈉、腺嘌呤、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人類血清白蛋白(HSA)、DMSO、HEPES、甘油、麩胱甘肽、肌苷、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鈉金屬離子、鉀金屬離子、鎂金屬離子、氯化物、乙酸鹽、葡萄糖酸鹽、蔗糖、氫氧化鉀或氫氧化鈉。在一些實施例中，藥劑為以下中之一或多者：丙酮酸鈉、腺嘌呤、Rejuvesol®、海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人類血清白蛋白(HSA)、PlasmaLyte®、DMSO、Cryostor® CS2、Cryostor® CS5、Cryostor® CS10、Cryostor® CS15、HEPES、甘油、麩胱甘肽、HypoThermosol®。
在根據本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，有核細胞之組合物包含複數個經修飾PBMC，該等經修飾PBMC經進一步修飾以增加共刺激分子中之一或多者之表現。在一些實施例中，共刺激分子為B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些實施例中，該複數個經修飾PBMC包含引起一或多種共刺激分子之表現增加的核酸。在一些實施例中，該複數個經修飾PBMC包含引起一或多種共刺激分子之表現增加的mRNA。在一些實施例中，共刺激分子為刺激T細胞活化之信號2介體。
在根據本文所述方法中之任一者的一些實施例中，經修飾PBMC經進一步修飾以增加一或多種細胞介素之表現。在一些實施例中，細胞介素為IL-2、IL-12、IL-21或IFNα2中之一或多者。在一些實施例中，複數個經修飾PBMC包含引起一或多種細胞介素之表現及/或分泌增加的核酸。在一些實施例中，細胞介素為刺激T細胞活化之信號3效應子。
T細胞活化起始細胞內信號級聯，視TCR信號及相關信號之強度而定，最終產生增殖、效應功能或死亡。為了防止過早或過度活化，T細胞需要兩個用於完全活化的獨立信號。信號1為藉由TCR與抗原肽之結合提供的抗原特異性信號，該抗原肽與MHC複合。信號2係藉由細胞介素或共刺激分子(諸如B7.1 (CD80)及B7.2 (CD86)在抗原呈現細胞(APC)上之接合介導。信號3係藉由發炎細胞介素，諸如IL-2、IL-12及IFN-α介導。
在根據本文所描述之方法或組合物中之任一者的一些實施例中，其中有核細胞(諸如PBMC)包含蛋白質或其片段，有核細胞進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)。在一些實施例中，其中有核細胞(諸如PBMC)包含蛋白質或其片段，有核細胞進一步包含一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)。在一些實施例中，其中有核細胞(諸如PBMC)包含蛋白質或其片段，有核細胞進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)及一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)。
在一些實施例中，一或多種介導信號2之藥劑包含B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112中之一或多者。在一些實施例中，一或多種介導信號2之藥劑包含B7-1 (CD80)及/或B7-2 (CD86)。在一些實施例中，一或多種介導信號2之藥劑包含一或多種編碼B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112之mRNA，在一些實施例中，一或多種介導信號2之藥劑包含一或多種編碼B7-1 (CD80)及/或B7-2 (CD86)之mRNA。
在一些實施例中，一或多種介導信號3之藥劑包含一或多種細胞介素。在一些實施例中，一或多種介導信號3之藥劑包含IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、IFNα2中之一或多者。在一些實施例中，一或多種介導信號3之藥劑包含IL-2及/或IL-12。在一些實施例中，一或多種介導信號3之藥劑包含IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IFNα2之變異體中之一或多者。在一些實施例中，一或多種介導信號3之藥劑包含IL-2及/或IL-12之變異體。在一些實施例中，一或多種介導信號3之藥劑包含IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IFNα2之變異體中之一或多者。在一些實施例中，一或多種介導信號3之藥劑包含膜結合IL-2及/或膜結合IL-12。在一些實施例中，一或多種介導信號3之藥劑包含IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IFNα2之變異體中之一或多者。在一些實施例中，一或多種介導信號3之藥劑包含IL-2及/或IL12之變異體。
在一些實施例中，相比於不包含介導信號2之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含介導信號2之藥劑的有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於不包含介導信號3之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含介導信號3之藥劑的有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於不包含介導信號2或信號3之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含介導信號2之藥劑及/或介導信號3之藥劑的有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，增強之抗原特異性T細胞活化為HLA不可知的。在一些實施例中，增強之抗原特異性T細胞活化包含取決於由以下中之一或多者限制的T細胞活化：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08及/或HLA-C*16單倍型。
在一些實施例中，複數個PBMC經進一步修飾以增加一或多種細胞介素之表現。在一些實施例中，細胞介素為IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21或其功能變異體。在一些實施例中，細胞介素為IFN-α2或其功能變異體。在一些實施例中，細胞介素係變異細胞介素(諸如經修飾細胞介素)，諸如嵌合膜結合細胞介素。在一些實施例中，複數個PBMC經進一步修飾以增加一或多種嵌合膜結合細胞介素(諸如膜結合IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21)之表現。在一些實施例中，細胞介素經修飾，且經修飾細胞介素為包含細胞介素及跨膜域之融合蛋白。在一些實施例中，細胞介素藉由肽連接子接合至跨膜域。在一些實施例中，跨膜域為運鐵蛋白受體蛋白1 (TFRC)或腫瘤壞死因子(例如FasL)跨膜域。在一些實施例中，跨膜域包含SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。在一些實施例中，肽連接子為G
4S連接子或EAAAK連接子。在實施例中，G
4S連接子包含G
4S序列之2、3、4、5、6、7、8、9或10個重複序列中之任一者。在一些實施例中，EAAAK連接子包含EAAAK序列之2、3、4、5、6、7、8、9或10個重複序列中之任一者。在一些實施例中，肽連接子為(G
4S)
3(SEQ ID NO: 73)或(EAAAK)
3(SEQ ID NO: 74)。在一些實施例中，嵌合膜結合細胞介素包含SEQ ID NO: 77-80中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，複數個經修飾PBMC包含引起一或多種細胞介素之表現及/或分泌增加的核酸。在一些實施例中，核酸編碼嵌合膜結合細胞介素，包含SEQ ID NO: 71或72之核苷酸序列。在一些實施例中，細胞介素為刺激T細胞活化之信號3效應子。在一些實施例中，相比於非膜結合細胞介素，嵌合膜結合細胞介素增強個體中之細胞介素半衰期。在一些實施例中，相比於非膜結合細胞介素，嵌合膜結合細胞介素之半衰期增加約以下中之任一者：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於包含非膜繫栓細胞介素之對應有核細胞，膜結合細胞介素使細胞介素與抗原的空間關聯延長約1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96小時或更多小時中之任一者，該等抗原由與蛋白質或其片段一起引入之有核細胞呈現。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含膜結合細胞介素之有核細胞呈現高出約以下中之任一者的局部細胞介素濃度：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含膜結合細胞介素之有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些實施例中，膜結合細胞介素為膜結合趨化介素。
在一些實施例中，經修飾PBMC包含進一步修飾以調節II類MHC表現。在一些實施例中，在經修飾PBMC之同種異體情形中響應於投與而在個體中增多的先天性免疫反應與在不包含進一步修飾的對應經修飾PBMC之同種異體情形中響應於投與而在個體中增多的先天性免疫反應相比有所減少。在一些實施例中，經修飾PBMC在其所投與之個體中的循環半衰期與不包含進一步修飾的對應經修飾PBMC在其所投與之個體中的循環半衰期相比有所延長。在一些實施例中，經修飾PBMC在其所投與之個體中的循環半衰期與不包含進一步修飾的對應經修飾PBMC在其所投與之個體中的循環半衰期相比延長約以下中之任一者：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，經修飾PBMC在其所投與之個體中的循環半衰期基本上與不包含進一步修飾的對應經修飾PBMC在其所投與之個體中的循環半衰期相同。
在根據本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，相比於無進一步培育步驟製備的對應有核細胞，該製程進一步包含將有核細胞之組合物與增強有核細胞存活率及/或功能之藥劑一起培育的步驟。
以 HLA- 不可知 方式增強抗原特異性反應的有核細胞之進一步修飾
T細胞活化起始細胞內信號級聯，視TCR信號及相關信號之強度而定，最終產生增殖、效應功能或死亡。為了防止過早或過度活化，T細胞需要兩個用於完全活化的獨立信號。信號1為藉由TCR與抗原肽之結合提供的抗原特異性信號，該抗原肽與MHC複合。信號2係藉由細胞介素或共刺激分子(諸如B7.1 (CD80)及B7.2 (CD86)在抗原呈現細胞(APC)上之接合介導。信號3係藉由發炎細胞介素，諸如IL-2、IL-12及IFN-α介導。
在一些態樣中，提供增強免疫細胞活性之方法，該等方法包含表現一或多種在免疫細胞中介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)。在一些態樣中，提供增強免疫細胞活性之方法，該等方法包含表現一或多種在免疫細胞中介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)。在一些態樣中，提供增強免疫細胞活性之方法，該等方法包含表現在免疫細胞中的一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)及一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)。在一些實施例中，介導信號3 (諸如信號3效應子)刺激T細胞活化之藥劑為細胞介素。在一些實施例中，細胞介素包含IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、IFNα2中之一或多者。在一些實施例中，細胞介素包含IL-2及/或IL-12。在一些實施例中，提供增強免疫細胞活性之方法，該等方法包含表現編碼免疫細胞中之嵌合膜結合細胞介素之核酸。在一些實施例中，細胞介素經修飾，且經修飾細胞介素為包含細胞介素及跨膜域之融合蛋白。在一些實施例中，細胞介素藉由肽連接子接合至跨膜域。在一些實施例中，跨膜域為運鐵蛋白受體蛋白1 (TFRC)或腫瘤壞死因子(例如FasL)跨膜域。在一些實施例中，跨膜域包含SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。在一些實施例中，肽連接子為G
4S連接子或EAAAK連接子。在實施例中，G
4S連接子包含G
4S序列之2、3、4、5、6、7、8、9或10個重複序列中之任一者。在一些實施例中，EAAAK連接子包含EAAAK序列之2、3、4、5、6、7、8、9或10個重複序列中之任一者。在一些實施例中，肽連接子為(G
4S)
3(SEQ ID NO: 73)或(EAAAK)
3(SEQ ID NO: 74)。在一些實施例中，嵌合膜結合細胞介素包含SEQ ID NO: 77-80之胺基酸序列。在一些實施例中，複數個經修飾PBMC包含引起一或多種細胞介素之表現及/或分泌增加的核酸。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸包含SEQ ID NO: 71或72之核苷酸序列。在一些實施例中，細胞介素為刺激T細胞活化之信號3效應子。在一些實施例中，相比於非膜結合細胞介素，嵌合膜結合細胞介素增強個體中之細胞介素半衰期。在一些實施例中，相比於非膜結合細胞介素，嵌合膜結合細胞介素之半衰期增加約以下中之任一者：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，膜結合細胞介素使細胞介素與抗原的空間關聯延長約1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96小時或更多小時中之任一者，該等抗原由與蛋白質或其片段一起引入之有核細胞呈現。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含膜結合細胞介素之有核細胞呈現高出約以下中之任一者的局部細胞介素濃度：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含膜結合細胞介素之有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些態樣中，本發明提供刺激個體之免疫反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中mRNA經表現，且其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些態樣中，本發明提供對有需要之個體進行疫苗接種的方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中該蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，mRNA之核苷酸序列經密碼子最佳化以在有核細胞中表現。
在一些實施例中，其中有核細胞包含蛋白質或其片段，蛋白質或其片段包含抗原。在一些實施例中，其中有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA，蛋白質或其片段係抗原。在一些實施例中，該抗原刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，有核細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原。在一些實施例中，兩種或更多種抗原均刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，蛋白質為與癌症、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白相關的突變蛋白。在一些實施例中，蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。在一些實施例中，HPV為HPV-16或HPV-18。在一些實施例中，蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。在一些實施例中，蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白質。在一些實施例中，有核細胞包含蛋白質或其片段，或編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中蛋白質或其片段經加工成與MHC複合之抗原肽，由此在T細胞活化中介導信號1。
在一些實施例中，信號1為由T細胞受體與抗原肽之結合提供的抗原特異性信號，該抗原肽與MHC複合。在一些實施例中，有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中mRNA經表現，其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，有核細胞包含蛋白質或其片段，其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何。在一些實施例中，有核細胞包含蛋白質或其片段，或編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中蛋白質或其片段經加工成與MHC複合之抗原肽，由此在T細胞活化中介導信號1。
在根據上述方法中之任一者的一些實施例中，有核細胞(諸如PBMC)包含進一步修飾以進一步增強對蛋白質或其片段之免疫反應。在一些實施例中，對有核細胞(諸如PBMC)進一步修飾之方法進一步以HLA不可知方式增強對蛋白質或其片段之免疫反應。在一些實施例中，對有核細胞(諸如PBMC)進一步修飾之方法進一步增強對蛋白質或其片段之免疫反應，其中增強之免疫反應包含取決於由一或多種HLA單倍型限制的免疫反應。在一些實施例中，對有核細胞(諸如PBMC)之進一步修飾之方法進一步增強對蛋白質或其片段之免疫反應，其中增強之免疫反應包含取決於由一或多種以下中之一或多者限制的免疫反應：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16單倍型。在一些實施例中，有核細胞包含蛋白質或其片段，或編碼蛋白質或其片段之mRNA；蛋白質或其片段經加工成與MHC複合之抗原肽，由此在T細胞活化中介導信號1。在一些實施例中，對有核細胞之進一步修飾包含引入一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)。在一些實施例中，對有核細胞之進一步修飾包含引入一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)。在一些實施例中，對有核細胞之進一步修飾包含引入一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)及一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3介體)。
在根據本文所述之方法或組合物中之任一者的一些實施例中，介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)包含以下中之一或多者：B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些實施例中，介導信號2之藥劑包含CD70、B7-1 (CD80)及/或B7-2 (CD86)。在一些實施例中，經修飾有核細胞包含引起以下中之一或多者的表現增加之核酸：B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些實施例中，經修飾有核細胞包含一或多種編碼以下中之一或多者的核酸：B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些實施例中，複數個經修飾有核細胞包含一或多種編碼CD70、B7-1 (CD80)及/或B7-2 (CD86)之核酸。
在根據本文所描述之方法或組合物中之任一者的一些實施例中，介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)為細胞介素或其功能變異體。在一些實施例中，介導信號3之藥劑為編碼細胞介素或其功能變異體之mRNA。在一些實施例中，細胞介素為IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21或其功能變異體。在一些實施例中，細胞介素為IFN-α2或其功能變異體。在一些實施例中，細胞介素係變異細胞介素(諸如經修飾細胞介素)，諸如嵌合膜結合細胞介素。在一些實施例中，細胞介素經修飾，且經修飾細胞介素為包含細胞介素及跨膜域之融合蛋白。在一些實施例中，細胞介素藉由肽連接子接合至跨膜域。在一些實施例中，跨膜域為運鐵蛋白受體蛋白1 (TFRC)或腫瘤壞死因子(例如FasL)跨膜域。在一些實施例中，跨膜域包含SEQ ID NO: 81或SEQ ID NO: 82之胺基酸序列。在一些實施例中，肽連接子為G
4S連接子或EAAAK連接子。在實施例中，G
4S連接子包含G
4S序列之2、3、4、5、6、7、8、9或10個重複序列中之任一者。在一些實施例中，EAAAK連接子包含EAAAK序列之2、3、4、5、6、7、8、9或10個重複序列中之任一者。在一些實施例中，肽連接子為(G
4S)
3(SEQ ID NO: 73)或(EAAAK)
3(SEQ ID NO: 74)。在一些實施例中，嵌合膜結合細胞介素包含SEQ ID NO: 77-80中之任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，複數個經修飾有核細胞包含引起一或多種細胞介素之表現及/或分泌增加的核酸。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸包含SEQ ID NO: 71或72之核苷酸序列。在一些實施例中，細胞介素為刺激T細胞活化之信號3效應子。在一些實施例中，相比於非膜結合細胞介素，嵌合膜結合細胞介素增強個體中之細胞介素半衰期。在一些實施例中，相比於非膜結合細胞介素，嵌合膜結合細胞介素之半衰期增加約以下中之任一者：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，膜結合細胞介素使細胞介素與抗原的空間關聯延長約1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96小時或更多小時中之任一者，該等抗原由與蛋白質或其片段一起引入之有核細胞呈現。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含膜結合細胞介素之有核細胞呈現高出約以下中之任一者的局部細胞介素濃度：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於包含非膜結合細胞介素之對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含膜結合細胞介素之有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，細胞介素為IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21或其功能變異體。在一些實施例中，細胞介素為IFN-α2或其功能變異體。在一些實施例中，細胞介素係變異細胞介素(諸如經修飾細胞介素)，諸如嵌合膜結合細胞介素。在一些實施例中，有核細胞經進一步修飾以增加一或多種嵌合膜結合細胞介素(諸如膜結合IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ及/或IL-21)之表現。在一些實施例中，有核細胞進一步包含編碼一或多種嵌合膜結合細胞介素之一或多種核酸。在一些實施例中，有核細胞進一步包含編碼膜結合IL-12之核酸。在一些實施例中，有核細胞進一步包含編碼膜結合IL-2之核酸。在一些實施例中，有核細胞進一步包含編碼膜結合IL-2及膜結合IL-12之核酸。
在一些實施例中，提供刺激個體之免疫反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何；且其中有核細胞進一步用介導信號2之藥劑及/或介導信號3之藥劑修飾。在一些態樣中，本發明提供對有需要之個體進行疫苗接種之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論個體之HLA單倍型如何；且其中有核細胞進一步用介導信號2之藥劑及/或介導信號3之藥劑修飾。在一些實施例中，mRNA之核苷酸序列經密碼子最佳化以在有核細胞中表現。
在根據本文所提供之方法、有核細胞或組合物中之任一者的一些實施例中，包含蛋白質或其片段及一或多種介導信號2及/或信號3之藥劑的有核細胞係藉由包含以下之製程製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中收縮部直徑係懸浮液中輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的輸入免疫細胞之擾動以供蛋白質或其片段及一或多種介導信號2及/或信號3之藥劑穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將經擾動之輸入免疫細胞與蛋白質或其片段及一或多種介導信號2及/或信號3之藥劑一起培育，使得蛋白質或其片段及一或多種介導信號2及/或信號3之藥劑能夠進入經擾動之輸入免疫細胞；由此產生包含蛋白質或其片段及一或多種介導信號2及/或信號3之藥劑的免疫細胞。
在一些實施例中，介導信號2之藥劑包含CD86且介導信號3之藥劑包含IL-2。在根據本文所提供之方法、有核細胞或組合物中之任一者的一些實施例中，包含蛋白質或其片段及CD86及IL-2的有核細胞係藉由包含以下之製程製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中收縮部直徑係懸浮液中輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的輸入免疫細胞之擾動以供蛋白質或其片段及CD86及IL-2穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將經擾動之輸入免疫細胞與蛋白質或其片段及CD86及IL-2一起培育，使得蛋白質或其片段及CD86及IL-2能夠進入經擾動之輸入免疫細胞；由此產生包含蛋白質或其片段及CD86及IL-2之免疫細胞。
在一些實施例中，介導信號3之藥劑為膜結合細胞介素。在根據本文所提供之方法、有核細胞或組合物中之任一者的一些實施例中，包含蛋白質或其片段及膜結合細胞介素的有核細胞係藉由包含以下之製程製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼蛋白質或其片段之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將經擾動之輸入免疫細胞與編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼蛋白質或其片段之核酸一起培育，使得核酸能夠進入經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼蛋白質或其片段之核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及蛋白質或其片段之免疫細胞。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及/或編碼蛋白質或其片段之核酸為mRNA。在一些實施例中，蛋白質或其片段包含一或多種抗原。
在一些實施例中，介導信號2之藥劑包含嵌合膜結合細胞介素。在一些實施例中，提供增強免疫細胞在刺激對抗原之免疫反應中之活性的方法，其中包含嵌合膜結合細胞介素且進一步包含抗原之免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供抗原及編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將經擾動之輸入免疫細胞與編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及抗原一起培育，使得核酸及抗原能夠進入經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸為編碼嵌合膜結合細胞介素之mRNA。
在一些實施例中，提供增強免疫細胞在刺激對抗原之免疫反應中之活性的方法，其中包含嵌合膜結合細胞介素且進一步包含抗原之免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼該抗原之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將經擾動之輸入免疫細胞與編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼抗原之核酸一起培育，使得核酸能夠進入經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼抗原之核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。在一些實施例中，編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及/或編碼抗原之核酸為mRNA。
在一些實施例中，提供增強免疫細胞在刺激對抗原之免疫反應中之活性的方法，其中包含嵌合膜結合細胞介素及兩種或更多種源於蛋白質之抗原的免疫細胞係藉由以下製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將經擾動之輸入免疫細胞與編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸及兩種或更多種源於蛋白質之抗原一起培育，使得核酸能夠進入經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼嵌合膜結合細胞介素之核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及兩種或更多種源於蛋白質之抗原的免疫細胞。
在一些態樣中，提供一種用作藥物之組合物，其中該組合物包含有效量之包含蛋白質或其片段之有核細胞且進一步包含一或多種介導信號2及/或信號3之藥劑。在一些態樣中，提供用於用組合物治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的組合物，其中該組合物包含有效量之有核細胞，該等有核細胞包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2及/或信號3之藥劑。在一些態樣中，提供治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病之方法，其包含投與包含有效量之有核細胞的組合物，該等有核細胞包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2及/或信號3之藥劑。在一些實施例中，提供一種包含有效量之有核細胞的組合物在製造用於刺激個體之免疫反應及/或治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病之藥劑中的用途，該等有核細胞包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2及/或信號3之藥劑。
在一些實施例中，介導信號3之藥劑包含一或多種膜結合細胞介素。在一些實施例中，介導信號3之藥劑包含膜結合IL-12。在一些實施例中，介導信號3之藥劑包含膜結合IL-2。在一些實施例中，介導信號3之藥劑包含膜結合IL-2及膜結合IL-12。在一些實施例中，介導信號2之藥劑包含CD80。在一些實施例中，介導信號3之藥劑包含CD86。在一些實施例中，介導信號2之藥劑包含CD80及CD86。在一些實施例中，有核細胞包含蛋白質或其片段，或編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中蛋白質或其片段經加工成與MHC複合之抗原肽，由此在T細胞活化中介導信號1。
在根據本文所述之方法、有核細胞或組合物中之任一者的一些實施例中，有核細胞包含蛋白質或其片段、CD86及膜結合IL-12，其中有核細胞係藉由包含以下之製程製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼CD86之核酸、編碼膜結合IL-12之核酸及編碼蛋白質或其片段之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將經擾動之輸入免疫細胞與編碼CD86之核酸、編碼膜結合IL-12之核酸及編碼蛋白質或其片段之核酸一起培育，使得核酸能夠進入經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼CD86之核酸、編碼膜結合IL-12之核酸及編碼蛋白質或其片段之核酸經表現；由此產生包含蛋白質或其片段、CD86及膜結合IL-12之免疫細胞。在一些實施例中，編碼CD86之核酸、編碼膜結合IL-12之核酸及/或編碼蛋白質或其片段之核酸為mRNA。在一些實施例中，蛋白質或其片段包含一或多種抗原。
在根據本文所述之方法、有核細胞或組合物中之任一者的一些實施例中，有核細胞包含蛋白質或其片段、CD86及膜結合IL-2，其中有核細胞係藉由包含以下之製程製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼CD86之核酸、編碼膜結合IL-2之核酸及編碼蛋白質或其片段之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將經擾動之輸入免疫細胞與編碼CD86之核酸、編碼膜結合IL-2之核酸及編碼蛋白質或其片段之核酸一起培育，使得核酸能夠進入經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼CD86之核酸、編碼膜結合IL-2之核酸及編碼蛋白質或其片段之核酸經表現；由此產生包含蛋白質或其片段、CD86及膜結合IL-2之免疫細胞。在一些實施例中，編碼CD86之核酸、編碼膜結合IL-2之核酸及/或編碼蛋白質或其片段之核酸為mRNA。在一些實施例中，蛋白質或其片段包含一或多種抗原。
在根據本文所述之方法、有核細胞或組合物中之任一者的一些實施例中，有核細胞包含蛋白質或其片段、CD86、膜結合IL-2及膜結合IL-12，其中有核細胞係藉由包含以下之製程製備：a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中收縮部直徑係懸浮液中輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的輸入免疫細胞之擾動以供編碼CD86之核酸、編碼膜結合IL-2之核酸、編碼膜結合IL-12之核酸及編碼蛋白質或其片段之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及b)將經擾動之輸入免疫細胞與編碼CD86之核酸、編碼膜結合IL-2之核酸、編碼膜結合IL-12之核酸及編碼蛋白質或其片段之核酸一起培育，使得核酸能夠進入經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼CD86之核酸、編碼膜結合IL-2之核酸、編碼膜結合IL-12之核酸及編碼蛋白質或其片段之核酸經表現；由此產生包含蛋白質或其片段、CD86、膜結合IL-2及膜結合IL-12之免疫細胞。在一些實施例中，編碼CD86之核酸、編碼膜結合IL-2之核酸、編碼膜結合IL-12之核酸及/或編碼蛋白質或其片段之核酸為mRNA。在一些實施例中，蛋白質或其片段包含一或多種抗原。
在一些實施例中，輸入細胞懸浮液可包含輸入有核細胞及抗原。在一些實施例中，輸入細胞懸浮液包含輸入有核細胞及蛋白質或其片段。在一些實施例中，輸入細胞懸浮液包含輸入有核細胞及編碼蛋白質或其片段之mRNA。在一些實施例中，該方法包含在使細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將有核細胞與蛋白質或其片段或與編碼蛋白質或其片段之mRNA一起培育。在一些實施例中，該方法包含在使細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部之前，將有核細胞與蛋白質或其片段或與編碼蛋白質或其片段之mRNA一起培育。
在一些實施例中，輸入細胞懸浮液包含輸入有核細胞及蛋白質或其片段以及介導信號2之藥劑及/或介導信號3之藥劑。在一些實施例中，輸入細胞懸浮液包含輸入有核細胞及蛋白質或其片段以及編碼介導信號2之藥劑及/或介導信號3之藥劑的mRNA。在一些實施例中，輸入細胞懸浮液包含輸入有核細胞及編碼蛋白質或其片段之mRNA以及編碼介導信號2之藥劑及/或介導信號3之藥劑的mRNA。在一些實施例中，該方法包含在使細胞懸浮液通過細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將有核細胞與編碼介導信號2之藥劑及/或介導信號3之藥劑的mRNA，以及與蛋白質或其片段或編碼蛋白質或其片段之mRNA一起培育。在一些實施例中，該方法包含在使細胞懸浮液通過細胞變形收縮部之前，將有核細胞與編碼介導信號2之藥劑及/或介導信號3之藥劑的mRNA，以及與蛋白質或其片段或編碼蛋白質或其片段之mRNA一起培育。
在根據本文所描述之方法、組合物或有核細胞中之任一者的一些實施例中，mRNA (諸如編碼信號2介體之mRNA及編碼信號3介體之mRNA)為外源性mRNA。在一些實施例中，mRNA為活體外轉錄(IVT) mRNA。在一些實施例中，外源性mRNA為活體外轉錄(IVT) mRNA。在一些實施例中，mRNA編碼重組蛋白。在一些實施例中，mRNA經密碼子最佳化以用於在有核細胞中表現。
在一些實施例中，收縮部寬度為輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，收縮部寬度為有核細胞群內具有最小直徑之輸入有核細胞的平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%、約30%至約45%、約50%至約99%、約50%至約90%、約50%至約80%、約50%至約70%、約60%至約90%、約60%至約80%或約60%至約70%中之任一者。在一些實施例中，收縮部寬度為約2 µm至約5 µm、約3 µm至約5 µm、約2 µm至約2.5 µm、約2.2 µm至約2.5、約2.5 µm至約3 µm、約3 µm至約3.5 µm、約3.5 µm至約4 µm、約4 µm至約4.5 µm、約3.2 µm至約3.8 µm、約3.8 µm至約4.3 µm、約4.2 µm至約6 µm或約4.2 µm至約4.8 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約4.5 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約以下中之任一者或小於以下中之任一者：2 µm、2.2 µm、2.5 µm、3 µm、3.5 µm、4 µm、4.5 µm、5 µm、5.5 µm、6 µm、6.5 µm、7 µm、7.5 µm、8 µm、8.5 µm、9 µm、9.5 µm、10 µm、10.5 µm、11 µm、11.5 µm、12 µm、12.5 µm、13 µm、13.5 µm、14 µm、14.5 µm或15 µm。在一些實施例中，包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中多個收縮部串聯及/或並聯配置。
在根據本文所描述之方法、用途或組合物中之任一者的一些實施例中，有核細胞(例如PBMC)與佐劑一起培育足夠的時間以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約1至約24小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約2至約10小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約3至約6小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約1小時、2小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時、5.5小時、6小時、8小時、12小時、16小時、20小時或24小時中之任一者以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約4小時以調節有核細胞。在一些實施例中，在將蛋白質或其片段或編碼核酸之蛋白質或其片段引入有核細胞中之前調節有核細胞。在一些實施例中，在將蛋白質或其片段或編碼蛋白質或其片段之核酸引入有核細胞中之後，調節有核細胞。在一些實施例中，用於調節之佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖苷腦醯胺、STING激動劑、環二核苷酸(CDN)、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸(聚I:C)、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。例示性佐劑包括但不限於CpG ODN、干擾素-α (IFN-α)、多聚肌苷酸:多聚胞苷酸(聚I:C)、咪喹莫特(R837)、雷西莫特(R848)或脂多醣(LPS)。在一些實施例中，佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。在一些實施例中，佐劑為CpG 7909。
在其中有核細胞包含B細胞之一些實施例中，相比於未經調節有核細胞之B細胞，一或多種共刺激分子在經調節有核細胞之B細胞中上調。在一些實施例中，有核細胞係複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。在其中有核細胞係複數個PBMC之一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC之B細胞，一或多種共刺激分子在複數個經調節PBMC之B細胞中上調。在一些實施例中，共刺激分子為CD80及/或CD86。在一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC，複數個經調節PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者之增加的表現。在一些實施例中，相比於複數個未經調節PBMC，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者的表現增加超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
在根據本文所描述之方法、用途或組合物中之任一者的一些實施例中，有核細胞係免疫細胞。在一些實施例中，有核細胞係人類細胞。在一些實施例中，有核細胞為具有以下單倍型之人類細胞：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16。在一些實施例中，有核細胞係複數個PBMC。在一些實施例中，經調節有核細胞為經調節的複數個經修飾PBMC。在一些實施例中，複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。在一些實施例中，有核細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。
在一些實施例中，有核細胞包含蛋白質或其片段，或編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中蛋白質或其片段經加工成與MHC複合之抗原肽，由此在T細胞活化中介導信號1。在一些實施例中，相比於不包含介導信號2之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)的有核細胞可在增強之水準下誘導抗原特異性免疫反應。在一些實施例中，相比於不包含介導信號2之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)的有核細胞可以HLA不可知方式在增強之水準下誘導抗原特異性免疫反應。在一些實施例中，相比於不包含介導信號2之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)的有核細胞可在增強之水準下誘導抗原特異性免疫反應，其中增強之免疫反應包含取決於由以下中之一或多者限制的免疫反應：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16單倍型。
在一些實施例中，有核細胞包含蛋白質或其片段，或編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中蛋白質或其片段經加工成與MHC複合之抗原肽，由此在T細胞活化中介導信號1。在一些實施例中，相比於不包含介導信號2之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)的有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於不包含介導信號2之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)的有核細胞可以HLA-不可知方式在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於不包含介導信號2之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)的有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍，其中增強之T細胞活化包含取決於由以下中之一或多者限制的T細胞活化：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16單倍型。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)的有核細胞可誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化，其中CD8+ T細胞之一或多種多功能標記與由不進一步包含介導信號2之藥劑的有核細胞活化的抗原特異性CD8+ T細胞相比增加以下中之任一者：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，一或多種多功能標記包含：顆粒酶B、IFN-α、IL-2、PD-1及/或IFN-γ。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)的有核細胞可誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化，其中CD8+ T細胞之增殖及/或存活與由不進一步包含介導信號2之藥劑的有核細胞活化的抗原特異性CD8+ T細胞相比增加以下中之任一者：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些實施例中，有核細胞包含蛋白質或其片段，或編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中蛋白質或其片段經加工成與MHC複合之抗原肽，由此在T細胞活化中介導信號1。在一些實施例中，相比於不包含介導信號3之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)的有核細胞可在增強之水準下誘導抗原特異性免疫反應。在一些實施例中，相比於不包含介導信號3之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)的有核細胞可以HLA不可知方式在增強之水準下誘導抗原特異性免疫反應。在一些實施例中，相比於不包含介導信號3之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)的有核細胞可在增強之水準下誘導抗原特異性免疫反應，其中增強之免疫反應包含取決於由以下中之一或多者限制的免疫反應：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16單倍型。
在一些實施例中，有核細胞包含蛋白質或其片段，或編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中蛋白質或其片段經加工成與MHC複合之抗原肽，由此在T細胞活化中介導信號1。在一些實施例中，相比於不包含介導信號3之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)的有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於不包含介導信號3之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)的有核細胞可以HLA-不可知方式在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於不包含介導信號3之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)的有核細胞可在增強之水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化，其中增強之T細胞活化包含取決於由以下中之一或多者限制的T細胞活化：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16單倍型。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3介體)的有核細胞可誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化，其中CD8+ T細胞之一或多種多功能標記與由不進一步包含介導信號3之藥劑的有核細胞活化的抗原特異性CD8+ T細胞相比增加以下中之任一者：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，一或多種多功能標記包含：顆粒酶B、IFN-α、IL-2、PD-1及/或IFN-γ。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3介體)的有核細胞可誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化，其中CD8+ T細胞之增殖及/或存活與由不進一步包含介導信號3之藥劑的有核細胞活化的抗原特異性CD8+ T細胞相比增加以下中之任一者：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些實施例中，相比於不包含介導信號2或信號3之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)及一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)的有核細胞可在增強之水準下誘導抗原特異性免疫反應。在一些實施例中，相比於不包含介導信號2或信號3之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)及一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3介體)的有核細胞可以HLA不可知方式在增強之水準下誘導抗原特異性免疫反應。
在一些實施例中，有核細胞包含蛋白質或其片段，或編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中蛋白質或其片段經加工成與MHC複合之抗原肽，由此在T細胞活化中介導信號1。在一些實施例中，相比於不包含介導信號2或信號3之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)及一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)的有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性免疫反應：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於不包含介導信號2或信號3之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)及一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)的有核細胞可以HLA-不可知方式在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性免疫反應：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於不包含介導信號2或信號3之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)及一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)的有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性免疫反應：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍，其中增強之免疫反應包含取決於由以下中之一或多者限制的免疫反應：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16單倍型。
在一些實施例中，有核細胞包含蛋白質或其片段，或編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中蛋白質或其片段經加工成與MHC複合之抗原肽，由此在T細胞活化中介導信號1。在一些實施例中，相比於不包含介導信號2或信號3之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)及一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3介體)的有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於不包含介導信號2或信號3之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2效應子)及一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3效應子)的有核細胞可以HLA-不可知方式在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，相比於不包含介導信號2或信號3之藥劑的對應有核細胞，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)及一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3介體)的有核細胞可在高出約以下中之任一者的水準下誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍，其中增強之T細胞活化包含取決於由以下中之一或多者限制的T細胞活化：HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16單倍型。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)及一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3介體)的有核細胞可誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化，其中CD8+ T細胞之一或多個多功能標記與由不進一步包含介導信號2或信號3之藥劑的有核細胞活化的抗原特異性CD8+ T細胞相比增加以下中之任一者：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些實施例中，一或多種多功能標記包含：顆粒酶B、IFN-α、IL-2、PD-1及/或IFN-γ。在一些實施例中，包含蛋白質或其片段且進一步包含一或多種介導信號2之藥劑(諸如信號2介體)及一或多種介導信號3之藥劑(諸如信號3介體)的有核細胞可誘導抗原特異性CD8+ T細胞活化，其中CD8+ T細胞之增殖及/或存活與由不進一步包含介導信號2或信號3之藥劑的有核細胞活化的抗原特異性CD8+ T細胞相比增加以下中之任一者增加：10%、25%、50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
佐劑
如本文所用，術語「佐劑」可指直接或間接調節及/或引起免疫反應之物質。在本發明之一些實施例中，佐劑用於調節諸如PBMC群體之有核細胞群(亦即，細胞在向個體投與之前與佐劑一起培育)。在一些情況下，佐劑與蛋白質或其片段結合投與以實現與僅蛋白質或其片段相比對蛋白質或其片段增強之免疫反應。因此，佐劑可用於促進引發對蛋白質或其片段之免疫細胞反應(例如T細胞反應)。例示性佐劑包括但不限於干擾素基因刺激蛋白(STING)激動劑、視黃酸誘導基因I (RIG-I)激動劑及TLR3、TLR4、TLR7、TLR8及/或TLR9之激動劑。例示性佐劑包括但不限於CpG ODN、干擾素-α (IFN-α)、多聚肌苷酸:多聚胞苷酸(聚I:C)、咪喹莫特(R837)、雷西莫特(R848)或脂多醣(LPS)。在一些實施例中，佐劑為CpG ODN、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖苷腦醯胺、STING激動劑、環二核苷酸(CDN)、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激動劑、TLR4激動劑或TLR9激動劑。在特定實施例中，佐劑為CpG ODN。在一些實施例中，佐劑為CpG ODN。在一些實施例中，CpG ODN為A類CpG ODN、B類CpG ODN或C類CpG ODN。在一些實施例中，CpG ODN佐劑包含自以下之群中之選擇：CpG ODN 1018、CpG ODN 1585、CpG ODN 2216、CpG ODN 2336、CpG ODN 1668、CpG ODN 1826、CPG ODN 2006、CpG ODN 2007、CpG ODN BW006、CpG ODN D-SL01、CpG ODN 2395、CpG ODN M362、CpG ODN D-SL03。在一些實施例中，CpG ODN佐劑為CpG ODN 1826 (TCCATGACGTTCCTGACGTT (SEQ ID NO:30))或CpG ODN 2006 (也被稱作CpG 7909) (TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO:31))寡核苷酸。在一些實施例中，佐劑為CpG 7909。在一些實施例中，RIG-I激動劑包含多聚肌苷酸:多聚胞苷酸(聚肌I:C)。多種佐劑亦可與抗原結合使用以增強引發免疫反應。在一些實施例中，經修飾PBMC包含一種以上佐劑。多種佐劑亦可與抗原結合使用以增強引發免疫反應。在一些實施例中，經修飾PBMC包含一種以上佐劑。在一些實施例中，經修飾PBMC包含佐劑CpG ODN、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖苷腦醯胺、STING激動劑、環二核苷酸(CDN)、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑之任何組合。
在產生包含蛋白質或其片段之有核細胞的組合物中使用之收縮部
在一些實施例中，本發明提供用於刺激免疫反應的包含蛋白質或其片段之有核細胞之組合物。在一些實施例中，有核細胞為免疫細胞；例如複數個PBMC或T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之一或多者。在一些實施例中，將蛋白質或其片段遞送至有核細胞內。
在一些實施例中，藉由使細胞穿過收縮部而將蛋白質或其片段引入有核細胞中，使得短暫孔被引入至細胞膜，由此使得蛋白質或其片段能夠進入細胞。化合物至細胞中之基於收縮部之遞送的實例由WO 2013/059343、WO 2015/023982、WO 2016/070136、WO2017041050、WO2017008063、WO 2017/192785、WO 2017/192786、WO 2019/178005、WO 2019/178006、WO 2020/072833、PCT/US2020/15098及PCT/US2020/020194提供。
在一些實施例中，將蛋白質或其片段遞送至有核細胞中以藉由使包含有核細胞(例如PBMC)之細胞懸浮液穿過收縮部來產生本發明之有核細胞，其中該收縮部使細胞變形，由此引起細胞擾動，使得蛋白質或其片段進入細胞。在一些實施例中，收縮部含於微流體通道內。在一些實施例中，多個收縮部可平行及/或串聯置放於微流體通道內。
在一些實施例中，微流體通道內之收縮部包括入口部分、中心點及出口部分。在一些實施例中，微流體通道內收縮部之長度、深度及寬度可不同。在一些實施例中，微流體通道內收縮部之寬度隨有核細胞之直徑而變化。測定有核細胞之直徑的方法為此項技術中已知的；例如，高含量成像、細胞計數器或流式細胞量測術。
在蛋白質或其片段至有核細胞之基於收縮部之遞送的一些實施例中，收縮部寬度為約3 µm至約15 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約3 µm至約10 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約3 µm至約6 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約4.2 µm至約6 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約4.2 µm至約4.8 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約3 µm至約5 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約3 µm至約3.5 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約3.5 µm至約4 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約4 µm至約4.5 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約3.2 µm至約3.8 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約3.8 µm至約4.3 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約以下中之任一者或小於以下中之任一者：2 µm、2.5 µm、3 µm、3.5 µm、4 µm、4.5 µm、5 µm、5.5 µm、6 µm、6.5 µm、7 µm、7.5 µm、8 µm、8.5 µm、9 µm、9.5 µm、10 µm、10.5 µm、11 µm、11.5 µm、12 µm、12.5 µm、13 µm、13.5 µm、14 µm、14.5 µm或15 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約以下中之任一者或小於以下中之任一者：3.0 µm、3.1 µm、3.2 µm、3.3 µm、3.4 µm、3.5 µm、3.6 µm、3.7 µm、3.8 µm、3.9 µm、4.0 µm、4.1 µm、4.2 µm、4.3 µm、4.4 µm、4.5 µm、4.6 µm、4.7 µm、4.8 µm、4.9 µm或5.0 µm。在一些實施例中，收縮部寬度為約4.5 µm。
在本發明之一些實施例中，組合物包含有核細胞群內之複數個有核細胞(例如複數個PBMC)。在一些實施例中，收縮部寬度為在有核細胞群內具有最小直徑之有核細胞亞群之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，收縮部寬度為在有核細胞群內具有最小直徑之有核細胞亞群之平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%、約30%至約45%、約50%至約99%、約50%至約90%、約50%至約80%、約50%至約70%、約60%至約90%、約60%至約80%或約60%至約70%中之任一者。在一些實施例中，收縮部寬度為在有核細胞群內具有最小直徑之有核細胞亞群之平均直徑的約10%至約20%、約20%至約30%、約30%至約40%、約40%至約50%、約50%至約60%、約60%至約70%、約70%至約80%、約80%至約90%或約90%至約99%中之任一者。在一些實施例中，收縮部寬度為在有核細胞群內具有最小直徑之有核細胞亞群之平均直徑的約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%中之任一者。在一些實施例中，在複數個輸入PBMC內具有最小平均直徑之有核細胞亞群為淋巴球群，其中淋巴球群之直徑為約6 µm至約10 µm。在一些實施例中，淋巴球群之平均直徑為約7 µm。在一些實施例中，淋巴球群為T細胞群。在一些實施例中，淋巴球為T細胞。在一些實施例中，在複數個輸入PBMC內具有最小平均直徑之有核細胞亞群為T細胞。
在本發明之一些實施例中，組合物包含有核細胞群內之複數個有核細胞(例如複數個PBMC)。在一些實施例中，收縮部寬度為在有核細胞群內具有最大直徑之有核細胞亞群之平均直徑的約10%至約99%。在一些實施例中，收縮部寬度為在有核細胞群內具有最大直徑之有核細胞亞群之平均直徑的約10%至約90%、約10%至約80%、約10%至約70%、約20%至約60%、約40%至約60%、約30%至約45%、約15%至約30%、約15%至約20%、約20%至約25%、約25%至約30%、約20%至約30%、約30%至約70%或約30%至約60%中之任一者。在一些實施例中，收縮部寬度為在有核細胞群內具有最大直徑之有核細胞亞群之平均直徑的約5%至約10%、約10%至約20%、約20%至約30%、約30%至約40%、約40%至約50%、約50%至約60%、約60%至約70%、約70%至約80%、約80%至約90%或約90%至約99%中之任一者。在一些實施例中，收縮部寬度為在有核細胞群內具有最大直徑之有核細胞亞群之平均直徑的約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%中之任一者。在一些實施例中，在複數個輸入PBMC內具有最大平均直徑之有核細胞亞群為單核球群，其中單核球群之直徑為約15 µm至約25 µm。在一些實施例中，單核球群之平均直徑為約18 µm。在一些實施例中，在複數個輸入PBMC內具有最大平均直徑之有核細胞亞群為單核球。
多種參數可影響化合物至有核細胞之遞送以藉由本文所描述之方法刺激免疫反應。在一些實施例中，細胞懸浮液在穿過收縮部之前、同時或之後與化合物接觸。有核細胞可穿過懸浮於包括待遞送化合物之溶液中的收縮部，不過該化合物可在有核細胞穿過收縮部之後添加至細胞懸浮液中。在一些實施例中，待遞送之化合物經塗佈於收縮部上。
可影響化合物至有核細胞之遞送的參數之實例包括但不限於收縮部尺寸、收縮部入口角度、收縮部表面特性(例如粗糙度、化學改質、親水性、疏水性等)、操作流程速度(例如細胞經過收縮部之通過時間)、細胞濃度、化合物在細胞懸浮液中之濃度、細胞懸浮液中之緩衝劑及在穿過收縮部之後有核細胞回收或培育可影響所遞送化合物至有核細胞之通過的時間量。影響將化合物遞送至有核細胞中之額外參數可包括有核細胞在收縮部中之速度、收縮部中之剪切率、細胞懸浮液之黏度、垂直於流速之速度分量及收縮部中之時間。另外，包含串聯及/或並聯通道之多個晶片可影響至有核細胞之遞送。並聯之多個晶片可適用於增強輸送量。此類參數可經設計以控制化合物之遞送。在一些實施例中，細胞濃度在約10至至少約10
12個細胞/毫升或其間之任何濃度或濃度範圍內。在一些實施例中，遞送化合物濃度可在約10 ng/mL至約1 g/mL或其間之任何濃度或濃度範圍內。在一些實施例中，遞送化合物濃度可在約1 pM至至少約2 M範圍內或在其間之任何濃度或濃度範圍內。
在一些實施例中，與有核細胞一起培育之蛋白質或其片段之濃度在約0.01 µM與約10 mM之間。舉例而言，在一些實施例中，與有核細胞一起培育的蛋白質或其片段之濃度小於約0.01 µM、約0.1 µM、約1 µM、約10 µM、約100 µM、約1 mM或約10 mM中之任一者。在一些實施例中，與有核細胞一起培育之蛋白質或其片段的濃度大於約10 mM。在一些實施例中，與有核細胞一起培育的蛋白質或其片段之濃度為以下中之任一者：約0.01 µM與約0.1 µM之間、約0.1 µM與約1 µM之間、約1 µM與約10 µM之間、約10 µM與約100 µM之間、約100 µM與約1 mM或1 mM與約10 mM之間。在一些實施例中，與有核細胞一起培育之蛋白質或其片段之濃度在約0.1 µM與約1 mM之間。在一些實施例中，與有核細胞一起培育之蛋白質或其片段之濃度在約0.1 µM與約10 µM之間。在一些實施例中，與有核細胞一起培育之蛋白質或其片段之濃度為1 µM。
在一些實施例中，有核細胞包含編碼濃度在約1 nM與約1 mM之間的蛋白質或其片段之核酸。在一些實施例中，有核細胞包含編碼濃度為以下中之任一者的蛋白質或其片段之核酸：小於約0.1 nM、約1 nM、約0.01 µM、約0.1 µM、約1 µM、約10 µM、約100 µM、約1 mM或約10 mM。在一些實施例中，有核細胞包含編碼濃度大於約10 mM之蛋白質或其片段的核酸。在一些實施例中，有核細胞包含編碼濃度為以下中之任一者的蛋白質或其片段之核酸：約0.1 nM至約1 nM、約1 nM至約10 nM、約10 nM至約100 nM、約0.1 µM與約1 µM、約1 µM與約10 µM之間、約10 µM與約100 µM之間、約100 µM與約1 mM或約1 mM與約10 mM之間。在一些實施例中，有核細胞包含編碼濃度在約10 nM與約100 nM之間的蛋白質或其片段之核酸。在一些實施例中，有核細胞包含編碼濃度在約1 nM與約10 nM之間的蛋白質或其片段之核酸。在一些實施例中，有核細胞包含濃度為約50 nM之蛋白質或其片段。在一些實施例中，核酸為mRNA。
有核細胞之調節
在一些實施例中，根據本文所描述之方法中之任一者；調節包含蛋白質或其片段之有核細胞(例如PBMC)。在其他實施例中，有核細胞係成熟的。在一些實施例中，在收縮部介導遞送之後調節有核細胞。在一些實施例中，將包含蛋白質或其片段之有核細胞與佐劑一起培育足夠的時間以調節包含收縮部遞送蛋白質或其片段的細胞，由此產生包含蛋白質或其片段的經調節細胞之組合物。在一些實施例中，在收縮部介導遞送之後調節有核細胞。在一些實施例中，將包含收縮部遞送蛋白質或其片段的有核細胞與佐劑一起培育足夠的時間以調節包含收縮部遞送蛋白質或其片段的有核細胞，由此產生包含蛋白質或其片段的經調節有核細胞的組合物。在一些態樣中，提供包含蛋白質或其片段之經調節有核細胞的組合物，其藉由包含以下步驟之製程製備：a)使細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中收縮部寬度係懸浮液中有核細胞的函數，由此引起足夠大的有核細胞之擾動以供蛋白質或其片段穿過，形成經擾動之有核細胞；b)將經擾動之有核細胞與蛋白質或其片段一起培育，使得蛋白質或其片段能夠進入經擾動之有核細胞，由此產生包含該蛋白質或其片段之經修飾有核細胞。及c)將包含收縮部遞送蛋白質或其片段的經修飾有核細胞與佐劑一起培育足夠的時間以調節包含收縮部遞送蛋白質或其片段的經修飾有核細胞，由此產生包含蛋白質或其片段的經調節有核細胞之該組合物。在一些態樣中，提供包含蛋白質或其片段之經調節有核細胞的組合物，其藉由包含以下步驟之製程製備：a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞，由此產生包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的有核細胞；及c)將包含收縮部遞送mRNA的經修飾有核細胞與佐劑一起培育足夠的時間以調節包含其收縮部遞送mRNA的經修飾有核細胞，其中mRNA經表現以產生蛋白質或其片段；由此產生包含該蛋白質或其片段的經調節有核細胞之該組合物。在一些實施例中，蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些實施例中，該製程進一步包含自細胞懸浮液分離包含蛋白質或其片段之經修飾有核細胞，隨後與佐劑一起培育以調節經修飾有核細胞。
在一些實施例中，有核細胞(例如PBMC)在收縮部介導遞送之前經調節。在一些實施例中，為調節有核細胞，將有核細胞與佐劑一起培育足夠的時間，由此調節有核細胞。在一些實施例中，提供一種包含蛋白質或其片段之經調節有核細胞的組合物，其藉由包含以下步驟之製程製備：a)將有核細胞與佐劑一起培育足夠的時間以調節有核細胞，由此產生經調節有核細胞；b)使包含經調節有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中收縮部寬度係懸浮液中有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的有核細胞之擾動以供蛋白質或其片段穿過，形成經調節經擾動之有核細胞；及c)將經調節經擾動之有核細胞與蛋白質或其片段一起培育足夠的時間，使得蛋白質或其片段能夠進入經調節經擾動之有核細胞，由此產生包含蛋白質或其片段之經調節有核細胞。在一些態樣中，提供一種包含蛋白質或其片段之經調節有核細胞的組合物，其藉由包含以下步驟之製程製備：a)將有核細胞與佐劑一起培育足夠的時間以調節有核細胞，由此產生經調節有核細胞；b)使包含經調節有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中收縮部寬度係懸浮液中有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的有核細胞之擾動以供編碼蛋白質或其片段之mRNA穿過，形成經調節經擾動之有核細胞；及c)將經調節經擾動之有核細胞與編碼蛋白質或其片段之mRNA一起培育足夠的時間，使得編碼蛋白質或其片段之mRNA能夠進入經調節經擾動之有核細胞，其中mRNA經表現以產生蛋白質或其片段，由此產生包含蛋白質或其片段之經調節有核細胞。在一些實施例中，蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。在一些實施例中，該製程進一步包含自佐劑分離經調節有核細胞，隨後使經調節有核細胞穿過細胞變形收縮部。
在根據本文所描述之方法中之任一者的一些實施例中，將包含蛋白質或其片段之有核細胞(例如PBMC)與佐劑一起培育約1至約24小時以條件有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約2至約10小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約3至約6小時以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約1小時、2小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時、5.5小時、6小時、8小時、12小時、16小時、20小時或24小時中之任一者以調節有核細胞。在一些實施例中，有核細胞與佐劑一起培育約4小時以調節有核細胞。
在一些實施例中，提供包含蛋白質或其片段之複數個經調節PBMC，其藉由將包含蛋白質或其片段之複數個PBMC與佐劑一起培育足夠的時間以調節PBMC，由此產生包含蛋白質或其片段之複數個經調節PBMC來製備。在一些實施例中，提供包含蛋白質或其片段之複數個經調節PBMC，其藉由將複數個PBMC與佐劑一起培育足夠的時間以調節PBMC，隨後將蛋白質或其片段引入PBMC，由此產生包含蛋白質或其片段之複數個經調節PBMC來製備。
在根據本文所述之複數個經調節PBMC中之任一者的一些實施例中，複數個PBMC與佐劑一起培育約1至約24小時以調節PBMC。在一些實施例中，複數個PBMC與佐劑一起培育約2至約10小時以調節PBMC。在一些實施例中，複數個PBMC與佐劑一起培育約3至約6小時以調節PBMC。在一些實施例中，複數個PBMC與佐劑一起培育約1小時、2小時、3小時、3.5小時、4小時、4.5小時、5小時、5.5小時、6小時、8小時、12小時、16小時、20小時或24小時中之任一者以調節PBMC。在一些實施例中，複數個PBMC與佐劑一起培育約4小時以調節PBMC。
在根據本文所述之複數個經調節PBMC中之任一者的一些實施例中，相比於未經調節的複數個經修飾PBMC，經調節的複數個經修飾PBMC中之一或多種共刺激分子經上調。在一些實施例中，相比於未經調節的複數個經修飾PBMC中之細胞亞群，經調節的複數個經修飾PBMC中之細胞亞群中的一或多種共刺激分子經上調。在一些實施例中，相比於未經調節的複數個經修飾PBMC中之B細胞，經調節的複數個經修飾PBMC中之B細胞中的一或多種共刺激分子經上調。在一些實施例中，共刺激分子為CD80及/或CD86。在一些實施例中，共刺激分子為CD86。在一些實施例中，相比於未經調節的複數個經修飾PBMC中之B細胞，經調節的複數個經修飾PBMC之B細胞中之CD80及/或CD86經上調超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。在一些實施例中，相比於未經調節的複數個經修飾PBMC中之B細胞，經調節的複數個經修飾PBMC中之B細胞中的CD80及/或CD86經上調約1.2倍至約1.5倍、約1.5倍至約1.8倍、約1.8倍至約2倍、約2倍至約3倍、約3倍至約4倍、約4倍至約5倍、約5倍至約8倍、約8倍至約10倍、約10倍至約20倍、約20倍至約50倍、約50倍至約100倍、約100倍至約200倍、約200倍至約500倍或超過約500倍中之任一者。在一些實施例中，相比於未經調節的複數個經修飾PBMC，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者的表現在經調節的複數個經修飾PBMC中增加。在一些實施例中，相比於未經調節的複數個經修飾PBMC中之細胞亞群，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者的表現在經調節的複數個細胞亞群中增加。在一些實施例中，相比於未經調節之複數個經修飾PBMC，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者的表現在經調節之複數個經修飾PBMC中增加約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。在一些實施例中，與未經調節的複數個經修飾PBMC相比，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者的表現在經調節的複數個經修飾PBMC中增加約1.2倍至約1.5倍、約1.5倍至約1.8倍、約1.8倍至約2倍、約2倍至約3倍、約3倍至約4倍、約4倍至約5倍、約5倍至約8倍、約8倍至約10倍、約10倍至約20倍、約20倍至約50倍、約50倍至約100倍、約100倍至約200倍、約200倍至約500倍或超過約500倍中之任一者。
系統及套組
在一些態樣中，本發明提供一種用於本文所揭示之方法中之系統，其包含收縮部、免疫細胞懸浮液、蛋白質或其片段或佐劑中之一或多者。系統可包括針對上文所揭示之方法描述的任何實施例，包括微流體通道或具有孔以提供細胞變形收縮部之表面、細胞懸浮液、細胞擾動、遞送參數、化合物及/或應用等。在一些實施例中，細胞變形收縮部尺寸經設定以遞送至免疫細胞。在一些實施例中，為獲得化合物遏制免疫反應或誘導耐受性的最大反應，諸如操作流程速度、細胞及化合物濃度、收縮部中細胞速度及細胞懸浮液之組合物(例如容積滲透濃度、鹽濃度、血清含量、細胞濃度、pH等)之遞送參數經最佳化。
亦提供用於治療患有癌症或感染之個體的套組或製品。在一些實施例中，套組包含有胞內包含蛋白質或其片段及胞內包含佐劑的經修飾免疫細胞。在一些實施例中，套組包含以下中之一或多者：收縮部、免疫細胞懸浮液、蛋白質或其片段或佐劑，以用於產生經修飾免疫細胞而在治療患有癌症或感染之個體中使用。在一些實施例中，套組包含呈適合的包裝形式的本文所述之組合物(例如微流體通道或含有孔之表面、細胞懸浮液及/或化合物)。適合之包裝材料為此項技術中已知的，且包括例如小瓶(諸如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶子、罐、軟包裝(例如密封Mylar或塑膠袋)及其類似物。此等製品可進一步經滅菌及/或密封。
本發明亦提供包含本文所描述之方法之組分的套組，且可進一步包含關於執行該等方法治療有需要之個體的說明書及/或關於將蛋白質或其片段及佐劑引入免疫細胞中的說明書。本文所述之套組可進一步包括其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器及關於執行本文所述任何方法之說明的藥品說明書；例如關於治療有需要之個體的說明或關於修飾免疫細胞以胞內含有蛋白質或其片段及胞內含有佐劑之說明。
例示性實施例
實施例1.一種刺激個體之免疫反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含蛋白質或其片段；其中該蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
實施例2.一種對有需要之個體進行疫苗接種之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含蛋白質或其片段；其中該蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
實施例3.如實施例1或2之方法，其中該蛋白質或其片段進一步包含一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體，產生該蛋白質與該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體的融合蛋白。
實施例4.一種刺激個體之免疫反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含編碼蛋白質或其片段的mRNA；其中該蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
實施例5.一種對有需要之個體進行疫苗接種之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含編碼蛋白質或其片段的mRNA；其中該蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
實施例6.如實施例4或5之方法，其中該mRNA之核苷酸序列經密碼子最佳化以用於在該有核細胞中表現。
實施例7.如實施例4至6中任一項之方法，其中該mRNA包含一或多個編碼靶向免疫蛋白酶體之模體的核酸序列，其中該mRNA之轉譯產生該蛋白質與該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體的融合蛋白。
實施例8.如實施例3或6之方法，其中相比於在不存在靶向免疫蛋白酶體之模體的情況下該蛋白質在該細胞中之降解及/或源於該蛋白質之肽在該細胞表面上之呈現，該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體增強該蛋白質在該細胞中之降解及/或源於該蛋白質之肽在該細胞表面上之呈現。
實施例9.如實施例8之方法，其中該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體位於該融合蛋白之N端及/或C端處。
實施例10.如實施例7至9之方法，其中該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體為破壞盒(D-盒)域、KEKE域及/或sec/MITD域。
實施例11.如實施例4至10中任一項之方法，其中該mRNA之一或多個殘基經修飾。
實施例12.如實施例11之方法，其中該mRNA之一或多個殘基為硫代磷酸酯殘基、假尿苷殘基、N1-甲基腺苷殘基、5-甲基胞苷殘基或N-𠰌啉基殘基。
實施例13.一種刺激個體之免疫反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原；其中該等兩種或更多種抗原刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
實施例14.一種對有需要之個體進行疫苗接種之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原；其中該等兩種或更多種抗原刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
實施例15.如實施例13或14之方法，其中該等細胞包含三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或超過十個源於該蛋白質之抗原。
實施例16.如實施例13至15中任一項之方法，其中該等抗原中之至少兩者包含部分重疊胺基酸序列。
實施例17.如實施例16之方法，其中所有該等抗原之組合胺基酸序列與該蛋白質之胺基酸序列重疊約90%或更多。
實施例18.如實施例13至17中任一項之方法，其中該抗原為包含該蛋白質之兩個或更多個抗原決定基之多肽。
實施例19.如實施例13至18中任一項之方法，其中該抗原為包含該蛋白質之一或多個抗原決定基及一或多個異源肽序列的多肽。
實施例20.如實施例13至19中任一項之方法，其中一或多個抗原決定基在N端及/或C端上側接一或多個異源肽序列。
實施例21.如實施例20之方法，其中該等N端及/或C端側接多肽源於免疫原性合成長肽(SLP)。
實施例22.如實施例21之方法，其中該等N端及/或C端側接多肽源於疾病相關之免疫原性SLP。
實施例23.如實施例1至22中任一項之方法，其中該蛋白質為與癌症相關之突變蛋白、致癌基因產物、新抗原、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白。
實施例24.如實施例1、3、4、6至13、15至23中任一項之方法，其中該刺激個體之免疫反應係用於治療癌症、感染性疾病或病毒相關疾病。
實施例25.如實施例24之方法，其中該病毒相關疾病係與以下各者相關之疾病：人類乳突狀瘤病毒(HPV)、A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、單純疱疹病毒1 (HSV-1)、單純疱疹病毒(HSV-2)、水痘帶狀疱疹病毒(VZV)、人類疱疹病毒6 (HHV-6)、人類疱疹病毒7 (HHV-7)、人類疱疹病毒8 (HHV-8)、巨細胞病毒(CMV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)、EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)或流感。
實施例26.如實施例1至24中任一項之方法，其中該蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。
實施例27.如實施例26之方法，其中該HPV為HPV-16或HPV-18。
實施例28.如實施例26或27之方法，其中該蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。
實施例29.如實施例1至24中任一項之方法，其中該蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白質。
實施例30.如實施例29之方法，其中該HBV蛋白為核心蛋白、小表面抗原、中等表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
實施例31.如實施例1至30中任一項之方法，其中該組合物進一步包含佐劑。
實施例32.如實施例1至31中任一項之方法，其中該組合物與佐劑結合投與。
實施例33.如實施例31或32之方法，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
實施例34.如實施例1至3及23至33中任一項之方法，其中包含該蛋白質或其片段之該等有核細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及
b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含該蛋白質或其片段之有核細胞。
實施例35.如實施例4至11中任一項之方法，其中包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的該等有核細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及
b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的有核細胞。
實施例36.如實施例12至33中任一項之方法，其中包含兩種或更多種抗原之該等有核細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及
b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育，使得該等兩種或更多種抗原能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含兩種或更多種抗原之有核細胞。
實施例37.如實施例34至36中任一項之方法，其中該方法包含
(a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育；
(b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育；或
(c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育。
實施例38.如實施例34至36中任一項之方法，其中該方法包含
(a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育；
(b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育；或
(c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育。
實施例39.如實施例34至38中任一項之方法，其中該收縮部寬度為該等輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。
實施例40.如實施例34至39中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約3.0 µm至約4.2 µm，或約3.0 µm至約4.8 µm，或約3.0 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。
實施例41.如實施例34至40中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約3.5 µm。
實施例42.如實施例34至41中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約4.5 µm或約4.0 µm。
實施例43.如實施例34至42中任一項之方法，其中包含該複數個輸入有核細胞之該細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中該等多個收縮部串聯及/或並聯配置。
實施例44.如實施例1至43中任一項之方法，其中該等有核細胞對於該個體而言為自體或同種異體的。
實施例45.如實施例1至44中任一項之方法，其中該等有核細胞係免疫細胞。
實施例46.如實施例1至45中任一項之方法，其中該等有核細胞係複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。
實施例47.如實施例46之方法，其中該複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。
實施例48.如實施例1至47中任一項之方法，其中該等有核細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。
實施例49.如實施例1至48中任一項之方法，其中該等有核細胞係用佐劑調節，形成經調節細胞。
實施例50.如實施例49之方法，其中將該等有核細胞與該佐劑一起培育約1小時至約24小時、約2小時至約10小時、約3小時至約6小時或約4小時以調節該等細胞。
實施例51.如實施例49或50之方法，其中在將該蛋白質或其片段或編碼該蛋白質或其片段之該mRNA引入該等有核細胞中之前或之後，調節該等有核細胞。
實施例52.如實施例49至51中任一項之方法，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
實施例53.如實施例48至51中任一項之方法，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。
實施例54.如實施例49至53中任一項之方法，其中該佐劑為CpG 7909。
實施例55.如實施例49至54中任一項之方法，其中該等經調節細胞為複數個經調節PBMC。
實施例56.如實施例55之方法，其中該複數個PBMC經修飾以增加共刺激分子中之一或多者的表現。
實施例57.如實施例56之方法，其中該共刺激分子為B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。
實施例58.如實施例56之方法，其中該共刺激分子為CD86。
實施例59.如實施例55至58中任一項之方法，其中該複數個PBMC經修飾以增加一或多種細胞介素之表現。
實施例60.如實施例55至59中任一項之方法，其中該複數個PBMC經修飾以包含嵌合膜結合細胞介素。
實施例61.如實施例60之方法，其中該嵌合膜結合細胞介素為包含該細胞介素及跨膜域之融合蛋白。
實施例62.如實施例61之方法，其中該細胞介素藉由肽連接子接合至該跨膜域。
實施例63.如實施例62之方法，其中該肽連接子為(G
4S)
3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)
3(SEQ ID NO:74)。
實施例64.如實施例59至63中任一項之方法，其中該細胞介素為I型細胞介素。
實施例65.如實施例59至64中任一項之方法，其中該細胞介素為IL-15、IL-12、IL-2、IFN α、IFN β或IL-21或其功能變異體。
實施例66.如實施例65之方法，其中該細胞介素為IL-2或其功能變異體及/或IL-12或其功能變異體。
實施例67.如實施例60至65中任一項之方法，其中該嵌合膜結合細胞介素包含胺基酸序列SEQ ID NO: 77-80。
實施例68.如實施例56至67中任一項之方法，其中該複數個PBMC經修飾以增加一或多種細胞介素及/或一或多種共刺激分子之表現。
實施例69.如實施例68之方法，其中該複數個PBMC包含一或多種細胞介素及/或一或多種共刺激分子之增加的表現，其中該複數個PBMC係藉由包含以下之製程製備：
a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及
b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中該等mRNA經表現，由此產生包含該蛋白質或其片段、該一或多種細胞介素及/或該一或多種共刺激分子的有核細胞。
實施例70.如實施例68之方法，其中該複數個PBMC包含一或多種細胞介素及/或一或多種共刺激分子之增加的表現，其中該複數個PBMC係藉由包含以下之製程製備：
a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段之該mRNA及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及
b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中該等mRNA經表現，由此產生包含該蛋白質或其片段、該一或多種細胞介素及/或該一或多種共刺激分子的有核細胞。
實施例71.如實施例68之方法，其中該複數個PBMC包含一或多種細胞介素及/或一或多種共刺激分子之增加的表現，其中該複數個PBMC係藉由包含以下之製程製備：
a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該等兩種或更多種抗原及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及
b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該等兩種或更多種抗原及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA一起培育，使得該等兩種或更多種抗原及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中該等mRNA經表現，由此產生包含兩種或更多種抗原、該一或多種細胞介素及/或該一或多種共刺激分子的有核細胞。
實施例72.如實施例69至71中任一項之方法，其中該方法包含
(a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與該蛋白質或其片段、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育；
(b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育；或
(c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與該等兩種或更多種抗原、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育。
實施例73.如實施例69至71中任一項之方法，其中該方法包含
(a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與該蛋白質或其片段、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育；
(b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育；或
(c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與該等兩種或更多種抗原、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育。
實施例74.如實施例55至73中任一項之方法，其中相比於複數個未經調節PBMC中的該等B細胞，一或多種共刺激分子在該複數個經調節PBMC的該等B細胞中經上調，其中該共刺激分子為CD80及/或CD86。
實施例75.如實施例55至74中任一項之方法，其中相比於複數個未經調節PBMC，該複數個PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者之增加的表現。
實施例76.如實施例75之方法，其中相比於該複數個未經調節PBMC，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者的該表現增加超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
實施例77.如實施例1至76中任一項之方法，其中包含有核細胞之該組合物經複數次投與。
實施例78.如實施例1至77中任一項之方法，其中該組合物經靜脈內投與。
實施例79.如實施例1至78中任一項之方法，其中該個體為人類。
實施例80.如實施例1至79中任一項之方法，其中該組合物在投與另一種療法之前、同時或之後投與。
實施例81.如實施例80之方法，其中另一種療法為化學療法、輻射療法、抗體、細胞介素、免疫檢查點抑制劑或免疫腫瘤學療法中所用之雙特異性多肽。
實施例82.一種包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含蛋白質或其片段；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
實施例83.如實施例82之組合物，其中該蛋白質或其片段進一步包含一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體，產生該蛋白質與該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體的融合蛋白。
實施例84.一種包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
實施例85.如實施例84之組合物，其中該mRNA之核苷酸序列經密碼子最佳化以用於在該有核細胞中表現。
實施例86.如實施例84或85之組合物，其中該mRNA包含一或多個編碼靶向免疫蛋白酶體之模體的核酸序列，其中該mRNA之轉譯產生該蛋白質與該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體的融合蛋白。
實施例87.如實施例83或86之組合物，其中相比於在不存在靶向免疫蛋白酶體之模體的情況下該蛋白質在該細胞中之降解及/或源於該蛋白質之肽在該細胞表面上之呈現，該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體增強該蛋白質在該細胞中之降解及/或源於該蛋白質之肽在該細胞表面上之呈現。
實施例88.如實施例87之組合物，其中該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體位於該融合蛋白之N端及/或C端處。
實施例89.如實施例86至88之組合物，其中該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體為破壞盒(D-盒)域、KEKE域及/或sec/MITD域。
實施例90.如實施例84至89中任一項之組合物，其中該mRNA之一或多個殘基經修飾。
實施例91.如實施例90之組合物，其中該mRNA之一或多個殘基為硫代磷酸酯殘基、假尿苷殘基、N1-甲基腺苷殘基、5-甲基胞苷殘基或N-𠰌啉基殘基。
實施例92.一種包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
實施例93.如實施例92之組合物，其中該等細胞包含三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或超過十個源於該蛋白質之抗原。
實施例94.如實施例92或93之組合物，其中該等抗原中之至少兩者包含部分重疊胺基酸序列。
實施例95.如實施例94之組合物，其中所有該等抗原之組合胺基酸序列與該蛋白質之胺基酸序列重疊約90%或更多。
實施例96.如實施例92至95中任一項之組合物，其中抗原為包含該蛋白質之兩個或更多個抗原決定基之多肽。
實施例97.如實施例92至96中任一項之組合物，其中抗原為包含該蛋白質之一或多個抗原決定基及一或多個異源肽序列的多肽。
實施例98.如實施例92至97中任一項之組合物，其中一或多個抗原決定基在N端及/或C端上側接一或多個異源肽序列。
實施例99.如實施例98之組合物，其中該等N端及/或C端側接多肽源於免疫原性合成長肽(SLP)。
實施例100.如實施例99之組合物，其中該等N端及/或C端側接多肽源於疾病相關之免疫原性SLP。
實施例101.如實施例82至100中任一項之組合物，其中該蛋白質為與癌症相關之突變蛋白、致癌基因產物、新抗原、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白。
實施例102.如實施例82至101中任一項之組合物，其中該刺激個體之免疫反應係用於治療癌症、感染性疾病或病毒相關疾病。
實施例103.如實施例102之組合物，其中該病毒相關疾病係與以下各者相關之疾病：人類乳突狀瘤病毒(HPV)、A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、單純疱疹病毒1 (HSV-1)、單純疱疹病毒(HSV-2)、水痘帶狀疱疹病毒(VZV)、人類疱疹病毒6 (HHV-6)、人類疱疹病毒7 (HHV-7)、人類疱疹病毒8 (HHV-8)、巨細胞病毒(CMV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)、EB病毒(EBV)或流感。
實施例104.如實施例82至103中任一項之組合物，其中蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。
實施例105.如實施例104之組合物，其中該HPV為HPV-16或HPV-18。
實施例106.如實施例104或105之組合物，其中該蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。
實施例107.如實施例82至103中任一項之組合物，其中蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白質。
實施例108.如實施例107之組合物，其中該HBV蛋白質為核心蛋白、小表面抗原、中等表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
實施例109.如實施例82至108中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含佐劑。
實施例110.如實施例109之組合物，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
實施例111.如實施例82及101至110中任一項之組合物，其中包含該蛋白質或其片段之該等有核細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及
b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含該蛋白質或其片段之有核細胞。
實施例112.如實施例84至91及101至110中任一項之組合物，其中包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的該等有核細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及
b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的有核細胞。
實施例113.如實施例92至110中任一項之組合物，其中包含兩種或更多種抗原之該等有核細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及
b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育，使得該等兩種或更多種抗原能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含兩種或更多種抗原之有核細胞。
實施例114.如實施例111至113中任一項之組合物，其中製備該等有核細胞之製程包含：
(a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育；
(b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育；或
(c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育。
實施例115.如實施例111至113中任一項之方法，其中製備該等有核細胞之製程包含：
(a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育；
(b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育；或
(c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育。
實施例116.如實施例111至115中任一項之組合物，其中該收縮部寬度為該等輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。
實施例117.如實施例111至116中任一項之組合物，其中該收縮部寬度為約3.0 µm至約4.2 µm，或約3.0 µm至約4.8 µm，或約3.0 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。
實施例118.如實施例111至117中任一項之組合物，其中該收縮部寬度為約3.5 µm。
實施例119.如實施例111至118中任一項之組合物，其中該收縮部寬度為約4.5 µm或約4.0 µm。
實施例120.如實施例111至119中任一項之組合物，其中使包含該複數個輸入有核細胞之該細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中該等多個收縮部串聯及/或並聯配置。
實施例121.如實施例82至120中任一項之組合物，其中該等有核細胞對於該個體而言為自體或同種異體的。
實施例122.如實施例82至121中任一項之組合物，其中該等有核細胞係免疫細胞。
實施例123.如實施例82至122中任一項之組合物，其中該等有核細胞係複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。
實施例124.如實施例123之組合物，其中該複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。
實施例125.如實施例82至124中任一項之組合物，其中該等有核細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。
實施例126.如實施例82至125中任一項之組合物，其中該等有核細胞係用佐劑調節，形成經調節細胞。
實施例127.如實施例126之組合物，其中將該等有核細胞與該佐劑一起培育約1小時至約24小時、約2小時至約10小時、約3小時至約6小時或約4小時以調節該等細胞。
實施例128.如實施例126或127之組合物，其中在將該蛋白質或其片段或編碼該蛋白質或其片段之該mRNA引入該等有核細胞中之前或之後，調節該等有核細胞。
實施例129.如實施例126至128中任一項之組合物，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
實施例130.如實施例126至129中任一項之組合物，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。
實施例131.如實施例126至130中任一項之組合物，其中該佐劑為CpG 7909。
實施例132.如實施例126至131中任一項之組合物，其中該等經調節細胞為複數個經調節PBMC。
實施例133.如實施例132之組合物，其中該複數個PBMC經修飾以增加共刺激分子中之一或多者的表現。
實施例134.如實施例133之組合物，其中該共刺激分子為B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。
實施例135.如實施例134之組合物，其中該共刺激分子為CD86。
實施例136.如實施例132至135中任一項之組合物，其中該複數個PBMC經修飾以增加一或多種細胞介素之表現。
實施例137.如實施例132至136中任一項之組合物，其中該複數個PBMC經修飾以包含嵌合膜結合細胞介素。
實施例138.如實施例137之組合物，其中該嵌合膜結合細胞介素為包含該細胞介素及跨膜域之融合蛋白。
實施例139.如實施例138之組合物，其中該細胞介素藉由肽連接子接合至該跨膜域。
實施例140.如實施例139之組合物，其中該肽連接子為(G
4S)
3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)
3(SEQ ID NO:74)。
實施例141.如實施例136至140中任一項之組合物，其中該細胞介素為I型細胞介素。
實施例142.如實施例136至141中任一項之組合物，其中該細胞介素為IL-15、IL-12、IL-2、IFN α、IFN β或IL-21或其功能變異體。
實施例143.如實施例142之方法，其中該細胞介素為IL-2或其功能變異體及/或IL-12或其功能變異體。
實施例144.如實施例137至143中任一項之組合物，其中該嵌合膜結合細胞介素包含胺基酸序列SEQ ID NO: 77-80。
實施例145.如實施例133至144中任一項之組合物，其中該複數個PBMC經修飾以增加一或多種細胞介素及/或一或多種共刺激分子之表現。
實施例146.如實施例145之組合物，其中該複數個PBMC包含一或多種細胞介素及/或一或多種共刺激分子之增加的表現，其中該複數個PBMC係藉由包含以下之製程製備：
a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及
b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中該等mRNA經表現，由此產生包含該蛋白質或其片段、該一或多種細胞介素及/或該一或多種共刺激分子的有核細胞。
實施例147.如實施例145之組合物，其中該複數個PBMC包含一或多種細胞介素及/或一或多種共刺激分子之增加的表現，其中該複數個PBMC係藉由包含以下之製程製備：
a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段之該mRNA及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及
b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中該等mRNA經表現，由此產生包含該蛋白質或其片段、該一或多種細胞介素及/或該一或多種共刺激分子的有核細胞。
實施例148.如實施例145之組合物，其中該複數個PBMC包含一或多種細胞介素及/或一或多種共刺激分子之增加的表現，其中該複數個PBMC係藉由包含以下之製程製備：
a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該等兩種或更多種抗原及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及
b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該等兩種或更多種抗原及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA一起培育，使得該等兩種或更多種抗原及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中該等mRNA經表現，由此產生包含兩種或更多種抗原、該一或多種細胞介素及/或該一或多種共刺激分子的有核細胞。
實施例149.如實施例146至148中任一項之組合物，其中製備該複數個PBMC之製程包含：
(a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該複數個PBMC與該蛋白質或其片段、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育；
(b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該複數個PBMC與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育；或
(c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該複數個PBMC與該等兩種或更多種抗原、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育。
實施例150.如實施例146至148中任一項之組合物，其中製備該複數個PBMC之製程包含：
(a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該複數個PBMC與該蛋白質或其片段、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育；
(b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該複數個PBMC與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育；或
(c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該複數個PBMC與該等兩種或更多種抗原、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育。
實施例151.如實施例132至150中任一項之組合物，其中相比於該複數個未經調節PBMC中的該等B細胞，一或多種共刺激分子在該複數個經調節PBMC的該等B細胞中經上調，其中該共刺激分子為CD80及/或CD86。
實施例152.如實施例132至151中任一項之組合物，其中相比於複數個未經調節PBMC，該複數個PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者之增加的表現。
實施例153.如實施例152之組合物，其中相比於該複數個未經調節PBMC，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者的該表現增加超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
實施例154.一種用於刺激個體之免疫反應的組合物，其中該組合物包含有效量之如實施例82至153中任一項之組合物；其中該組合物以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
實施例155.一種用作藥物之組合物，其中該組合物包含有效量之如實施例82至153中任一項之組合物。
實施例156.一種用於治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的組合物，其中該組合物包含有效量之如實施例82至153中任一項之組合物。
實施例157.如實施例154至156中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含佐劑。
實施例158.如實施例154至157中任一項之組合物，其中該組合物與佐劑結合投與。
實施例159.如實施例157或158之組合物，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖苷腦醯胺、STING激動劑、環二核苷酸(CDN)、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
實施例160.如實施例157至159中任一項之組合物，其中包含有核細胞之該組合物經複數次投與。
實施例161.如實施例157至160中任一項之組合物，其中該組合物經靜脈內投與。
實施例162.如實施例157至161中任一項之組合物，其中該個體為人類。
實施例163.如實施例157至162中任一項之組合物，其中該組合物在投與另一種療法之前、同時或之後投與。
實施例164.如實施例163之組合物，其中另一種療法為化學療法、輻射療法、抗體、細胞介素、免疫檢查點抑制劑或免疫腫瘤學療法中所用之雙特異性多肽。
實施例165.一種組合物之用途，其用於製造用於刺激個體之免疫反應之藥劑，其中該組合物包含有效量之如實施例82至153中任一項之組合物；其中該組合物以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
實施例166.一種組合物之用途，其用於製造用於治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病之藥劑，其中該組合物包含有效量之如實施例82至153中任一項之組合物。
實施例167.如實施例165或166之用途，其中該組合物進一步包含佐劑。
實施例168.如實施例165至167中任一項之組合物，其中該組合物經調配以與佐劑結合投與。
實施例169.如實施例167或168之用途，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖苷腦醯胺、STING激動劑、環二核苷酸(CDN)、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
實施例170.如實施例167至169中任一項之用途，其中包含有核細胞之該組合物經複數次投與。
實施例171.如實施例167至170中任一項之用途，其中該組合物經靜脈內投與。
實施例172.如實施例167至171中任一項之用途，其中該個體為人類。
實施例173.如實施例167至172中任一項之用途，其中該組合物在投與另一種療法之前、同時或之後投與。
實施例174.如實施例173之用途，其中另一種療法為化學療法、輻射療法、抗體、細胞介素、免疫檢查點抑制劑或免疫腫瘤學療法中所用之雙特異性多肽。
實施例175.一種套組，其用於如實施例1至81中任一項之方法中。
實施例176.一種套組，其包含如實施例82至153中任一項之組合物。
實施例177.如實施例175或176之套組，其中該套組進一步包含緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器或關於向個體投與該組合物以HLA不可知方式刺激免疫反應之說明的藥品說明書中之一或多者。
實施例178.一種產生包含蛋白質或其片段之有核細胞的方法；該方法包含將該蛋白質或其片段引入該等有核細胞中，其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
實施例179.一種產生包含蛋白質或其片段之有核細胞的方法；該方法包含將編碼該蛋白質或其片段之mRNA引入該等有核細胞中，其中該mRNA經表現以產生該蛋白質或其片段；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
實施例180.一種產生包含兩種或更多種來自蛋白質之抗原的有核細胞之方法；該方法包含將該等兩種或更多種抗原引入該等有核細胞中；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
實施例181.如實施例178之方法，其中將該蛋白質或其片段引入該有核細胞內包含
a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及
b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含該蛋白質或其片段之有核細胞。
實施例182.如實施例179之方法，其中包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的該等有核細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及
b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的有核細胞。
實施例183.如實施例180之方法，其中包含兩種或更多種抗原之該等有核細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及
b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育，使得該等兩種或更多種抗原能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含兩種或更多種抗原之有核細胞。
實施例184.如實施例181至183中任一項之方法，其中該方法包含：
(a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育；
(b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育；或
(c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育。
實施例185.如實施例181至183中任一項之方法，其中該方法包含：
(a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育；
(b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育；或
(c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育。
實施例186.如實施例181至185中任一項之方法，其中該收縮部寬度為該等輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。
實施例187.如實施例181至186中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約3.5 µm至約4.2 µm，或約3.5 µm至約4.8 µm，或約3.5 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。
實施例188.如實施例181至187中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約3.5 µm。
實施例189.如實施例181至188中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約4.5 µm。
實施例190.如實施例181至189中任一項之方法，其中包含該複數個輸入有核細胞之該細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中該等多個收縮部串聯及/或並聯配置。
實施例191.如實施例178至190中任一項之方法，其中該方法進一步包含用佐劑調節該等有核細胞，形成經調節細胞。
實施例192.如實施例191之方法，其中將該等有核細胞與該佐劑一起培育約1小時至約24小時、約2小時至約10小時、約3小時至約6小時或約4小時以調節該等細胞。
實施例193.如實施例191或192之方法，其中在將該蛋白質或其片段、編碼該蛋白質或其片段之該mRNA或來自蛋白質之該等兩種或更多種抗原引入該等有核細胞中之前或之後，調節該等有核細胞。
實施例194.一種增強免疫細胞活性之方法，該等方法包含表現編碼該免疫細胞中之嵌合膜結合細胞介素的核酸。
實施例195.如實施例193之方法，其中該嵌合膜結合細胞介素為包含跨膜域及細胞介素之融合蛋白。
實施例196.如實施例194或195之方法，其中該跨膜域為運鐵蛋白受體蛋白1 (TFRC)或腫瘤壞死因子跨膜域。
實施例197.如實施例194至196中任一項之方法，其中該細胞介素為I型細胞介素。
實施例198.如實施例194至197中任一項之方法，其中該細胞介素為IL-15, IL-12, IL-2, IFN α, IFN β或IL-21或其功能變異體。
實施例199.如實施例194至198中任一項之方法，其中該細胞介素藉由肽連接子接合至該跨膜域。
實施例200.如實施例199之方法，其中該肽連接子為(G
4S)
3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)
3(SEQ ID NO:74)。
實施例201.如實施例194至200中任一項之方法，其中該嵌合膜結合細胞介素包含胺基酸序列SEQ ID NO: 77-80。
實施例202.如實施例194至201中任一項之方法，其中該免疫細胞進一步包含抗原。
實施例203.如實施例194至201中任一項之方法，其中該免疫細胞進一步包含編碼抗原之mRNA。
實施例204.如實施例202或203之方法，其中該抗原為蛋白質或其片段，其中該蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
實施例205.如實施例194至201中任一項之方法，其中該免疫細胞進一步包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原。
實施例206.如實施例205之方法，其中該等兩種或更多種抗原刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
實施例207.如實施例204至206中任一項之方法，其中該蛋白質為與癌症相關之突變蛋白、致癌基因產物、新抗原、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白。
實施例208.如實施例204至207中任一項之方法，其中該蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。
實施例209.如實施例208之方法，其中該HPV為HPV-16或HPV-18。
實施例210.如實施例208或209之方法，其中該蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。
實施例211.如實施例204至207中任一項之方法，其中該蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白質。
實施例212.如實施例211之方法，其中該HBV蛋白為核心蛋白、小表面抗原、中等表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
實施例213.如實施例194至212中任一項之方法，其中該等免疫細胞為複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。
實施例214.如實施例213之方法，其中該複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。
實施例215.如實施例194至214中任一項之方法，其中該等免疫細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。
實施例216.如實施例194至215中任一項之方法，其中該等有核細胞係用佐劑調節，形成經調節細胞。
實施例217.如實施例216之方法，其中將該等有核細胞與該佐劑一起培育約1小時至約24小時、約2小時至約10小時、約3小時至約6小時或約4小時以調節該等細胞。
實施例218.如實施例216或217之方法，其中在將該蛋白質或其片段或編碼該蛋白質或其片段之該mRNA引入該等有核細胞中之前或之後，調節該等有核細胞。
實施例219.如實施例216至218中任一項之方法，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
實施例220.如實施例216至219中任一項之方法，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。
實施例221.如實施例194至220中任一項之方法，其中包含該嵌合膜結合細胞介素之該等免疫細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及
b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞。
實施例222.如實施例221之方法，其中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸為編碼該嵌合膜結合細胞介素之mRNA。
實施例223.如實施例202、204及207至222中任一項之方法，其中包含該嵌合膜結合細胞介素及抗原之該等免疫細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及該抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及
b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該抗原一起培育，使得該核酸及該抗原能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。
實施例224.如實施例203、204及207至222之方法，其中包含該嵌合膜結合細胞介素及編碼蛋白質或其片段之mRNA的該等免疫細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼該抗原之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及
b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。
實施例225.如實施例223或224之方法，其中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及/或編碼該抗原之該核酸為mRNA。
實施例226.如實施例202、204及207至222中任一項之方法，其中包含該嵌合膜結合細胞介素及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原的該等免疫細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及
b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。
實施例227.如實施例221至226中任一項之方法，其中該方法包含：
(a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育
(b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該抗原一起培育；
(c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸一起培育；或
(d)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該等兩種或更多種抗原一起培育。
實施例228.如實施例221至226中任一項之方法，其中該方法包含：
(a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育；
(b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該抗原一起培育；
(c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸一起培育；或
(d)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該等兩種或更多種抗原一起培育。
實施例229.如實施例221至228中任一項之方法，其中該收縮部寬度為該等輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。
實施例230.如實施例221至229中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約3.5 µm至約4.2 µm，或約3.5 µm至約4.8 µm，或約3.5 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。
實施例231.如實施例221至230中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約3.5 µm。
實施例232.如實施例221至231中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約4.5 µm。
實施例233.如實施例221至232中任一項之方法，其中包含該複數個輸入有核細胞之該細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中該等多個收縮部串聯及/或並聯配置。
實施例234.一種用於增強免疫細胞活性的組合物，該組合物包含該免疫細胞中之嵌合膜結合細胞介素。
實施例235.如實施例234之組合物，其中該嵌合膜結合細胞介素為包含跨膜域及細胞介素之融合蛋白。
實施例236.如實施例234至235中任一項之組合物，其中該跨膜域為運鐵蛋白受體蛋白1 (TFRC)或腫瘤壞死因子跨膜域。
實施例237.如實施例234至236中任一項之組合物，其中該細胞介素為I型細胞介素。
實施例238.如實施例234至237中任一項之組合物，其中該細胞介素為IL-15、IL-12、IL-2、IFN α、IFN β或IL-21或其功能變異體。
實施例239.如實施例234至238中任一項之組合物，其中該細胞介素藉由肽連接子接合至該跨膜域。
實施例240.如實施例239之組合物，其中該肽連接子為(G
4S)
3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)
3(SEQ ID NO:74)。
實施例241.如實施例234至240中任一項之組合物，其中該嵌合膜結合細胞介素包含胺基酸序列SEQ ID NO: 77-80。
實施例242.如實施例234至241中任一項之組合物，其中該免疫細胞進一步包含抗原。
實施例243.如實施例234至242中任一項之組合物，其中該免疫細胞進一步包含編碼抗原之mRNA。
實施例244.如實施例242或243之組合物，其中該抗原為蛋白質或其片段，其中該蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
實施例245.如實施例233至241中任一項之組合物，其中該免疫細胞進一步包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原。
實施例246.如實施例245之組合物，其中該等兩種或更多種抗原刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
實施例247.如實施例244至246中任一項之組合物，其中該蛋白質為與癌症相關之突變蛋白、致癌基因產物、新抗原、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白。
實施例248.如實施例244至247中任一項之組合物，其中蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。
實施例249.如實施例248之組合物，其中該HPV為HPV-16或HPV-18。
實施例250.如實施例248或249之組合物，其中該蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。
實施例251.如實施例244至247中任一項之組合物，其中蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白。
實施例252.如實施例251之組合物，其中該HBV蛋白質為核心蛋白、小表面抗原、中等表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
實施例253.如實施例233至252中任一項之組合物，其中該等免疫細胞係複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。
實施例254.如實施例253之組合物，其中該複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。
實施例255.如實施例233至254中任一項之組合物，其中該等免疫細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。
實施例256.如實施例233至255中任一項之組合物，其中該等有核細胞係用佐劑調節，形成經調節細胞。
實施例257.如實施例256之組合物，其中將該等有核細胞與該佐劑一起培育約1小時至約24小時、約2小時至約10小時、約3小時至約6小時或約4小時以調節該等細胞。
實施例258.如實施例256或257之組合物，其中在將該蛋白質或其片段或編碼該蛋白質或其片段之該mRNA引入該等有核細胞中之前或之後，調節該等有核細胞。
實施例259.如實施例256至258中任一項之組合物，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
實施例260.如實施例256至259中任一項之組合物，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。
實施例261.如實施例234至260中任一項之組合物，其中包含該嵌合膜結合細胞介素之該等免疫細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及
b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞。
實施例262.如實施例261之組合物，其中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸為編碼該嵌合膜結合細胞介素之mRNA。
實施例263.如實施例242、244及247至262中任一項之組合物，其中包含該嵌合膜結合細胞介素之該等免疫細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及該抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及
b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該抗原一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。
實施例264.如實施例243、244及247至262之組合物，其中包含該嵌合膜結合細胞介素之該等免疫細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼該抗原之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及
b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。
實施例265.如實施例263或264之組合物，其中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及/或編碼該抗原之該核酸為mRNA。
實施例266.如實施例245至262中任一項之組合物，其中包含該嵌合膜結合細胞介素及該等兩種或更多種源於蛋白質之抗原的該等免疫細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及
b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及兩種或更多種抗原之免疫細胞。
實施例267.如實施例261至266中任一項之組合物，其中得到該等免疫細胞之製程包含：
(a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育
(b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該抗原一起培育；
(c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸一起培育；或
(d)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該等兩種或更多種抗原一起培育。
實施例268.如實施例261至266中任一項之方法，其中得到該等免疫細胞之製程包含：
(a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育；
(b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該抗原一起培育；
(c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸一起培育；或
(d)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該等兩種或更多種抗原一起培育。
實施例269.如實施例261至268中任一項之組合物，其中該收縮部寬度為該等輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。
實施例270.如實施例261至269中任一項之組合物，其中該收縮部寬度為約3.5 µm至約4.2 µm，或約3.5 µm至約4.8 µm，或約3.5 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。
實施例271.如實施例261至270中任一項之組合物，其中該收縮部寬度為約3.5 µm。
實施例272.如實施例261至271中任一項之組合物，其中該收縮部寬度為約4.5 µm。
實施例273.如實施例261至272中任一項之組合物，其中使包含該複數個輸入有核細胞之該細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中該等多個收縮部串聯及/或並聯配置。
實施例274.一種用作藥物之組合物，其中該組合物包含有效量之如實施例234至273中任一項之組合物。
實施例275.一種用於治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的組合物，其中該組合物包含有效量之如實施例210至248中任一項之組合物。
實施例276.一種套組，其用於如實施例194至233中任一項之方法中。
實施例277.一種套組，其包含如實施例234至275中任一項之組合物。
實施例278.如實施例250或249之套組，其中該套組進一步包含緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器或關於增強免疫細胞活性之說明的藥品說明書中之一或多者。
實施例279.一種產生包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞的方法，該方法包含將編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸引入該等免疫細胞中。
實施例280.如實施例279之方法，其中包含該嵌合膜結合細胞介素之該等免疫細胞係藉由以下製備：
a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及
b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞。
實施例281.如實施例280之方法，其中該方法包含在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與其編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育。
實施例282.如實施例280之方法，其中該方法包含在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育。
實施例283.如實施例280、281或282之方法，其中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸為編碼該嵌合膜結合細胞介素之mRNA。
實施例284.如實施例280至283中任一項之方法，其中該收縮部寬度為該等輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。
實施例285.如實施例280至284中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約3.5 µm至約4.2 µm，或約3.5 µm至約4.8 µm，或約3.5 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。
實施例286.如實施例280至285中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約3.5 µm。
實施例287.如實施例280至286中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約4.5 µm。
實施例288.如實施例280至287中任一項之方法，其中包含該複數個輸入有核細胞之該細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中該等多個收縮部串聯及/或並聯配置。
實例
熟習此項技術者將認識到，在本發明之範疇及精神內，若干實施例為可能的。現將參照以下非限制性實例來更詳細地描述本發明。以下實例進一步說明本發明，但當然不應解釋為以任何方式限制其範疇。
實例1
為確定編碼嵌合膜結合細胞介素之mRNA是否可經轉譯及運輸至免疫細胞膜，使人類供體PBMC擠壓擠壓裝載有編碼嵌合膜結合細胞介素之mRNA，且免疫細胞表面上細胞介素之存在藉由流動式細胞量測術監測。
方法
人類PBMC以2×10
7個/毫升之密度製備，且在室溫下60 psi下經由寬3.5 µm、長10 µm及深70 µm之收縮部，用250 µg/ml編碼嵌合膜結合細胞介素(TFRC-(G
4S)
3-IL-12或TFRC-(G
4S)
3-IFN-α2a))之相應mRNA或在無負荷(空擠壓擠壓)之情況下在Opti-MEM培養基中經擠壓擠壓加工。在擠壓擠壓加工後，將擠壓擠壓裝載PBMC離心，且棄去上清液。隨後細胞在再懸浮於新鮮R10+培養基中之前，在R10+培養基(RPMI，10% FBS，1% Pen/Strep，1x ITS-A，50 µM β-ME，1x MEM NEAA)中洗滌兩次。細胞在37℃下培育四小時且接著與相應螢光抗體(AF488抗人類IL-2、V450抗人類IFN-α2b或太平洋藍抗人類p40 [IL-12])一起培育。為評定mRNA轉譯及至膜表面之運輸，使用Attune NxT聲學聚焦細胞計數器分析結合於免疫細胞之抗體之螢光強度。
結果
如圖1中所示，相比於空擠壓樣品，人類PBMC擠壓裝載有編碼TFRC-(G
4S)
3-IL-12或TFRC-(G
4S)
3-IFN-α2a之mRNA引起擠壓裝載樣品中活免疫細胞的IL-12及IFN-α2a之平均螢光強度(MFI)增加。結果表明，擠壓裝載有編碼嵌合膜結合細胞介素之mRNA的人類PBMC可轉譯mRNA及將所編碼蛋白質運輸至免疫細胞表面。
實例2
為確定嵌合膜結合細胞介素是否保持其信號傳導功能性，使人類供體PBMC擠壓裝載有編碼嵌合膜結合細胞介素之mRNA，且與細胞介素特異性HEK-Blue報導細胞(InvivoGen)共培養。
方法
人類PBMC以2×10
7個/毫升之密度製備，且在室溫下60 psi下經由寬3.5 µm、長10 µm及深70 µm之收縮部，用250 µg/ml編碼嵌合膜結合細胞介素(TFRC-(G
4S)
3-IL-12或TFRC-(G
4S)
3-IFN-α2a))之相應mRNA或在無負荷(空擠壓)之情況下在Opti-MEM培養基中經擠壓加工。在擠壓加工之後，將擠壓裝載PBMC離心，且棄去上清液。隨後在測試培養基(DMEM，10% FBS，1x Pen/Strep，2 mM L-麩醯胺酸)中洗滌細胞兩次，隨後再懸浮於新鮮測試培養基中。
對數性生長之HEK-Blue IL-12、HEK-Blue IL-2及HEK-Blue IFN-α/β (InvivoGen)報導細胞藉由用PBS沖洗燒瓶自培養燒瓶收集，且在96孔盤中與相應擠壓裝載PBMC或空擠壓PBMC一起共培養。在37℃下培育共培養物隔夜，隨後收穫培養物上清液。HEK-Blue報導細胞中相應細胞介素與受體之結合及相應信號傳導路徑之活化引起培養物上清液中鹼性磷酸酶之分泌。根據製造商方案，經由QUANTI-blue分析偵測分泌性鹼性磷酸酶(SEAP)。自空擠壓及擠壓裝載樣品之OD
630值僅減除HEK-Blue報導細胞之OD
630。
結果
如圖2中所示，擠壓裝載有編碼TFRC-(G
4S)
3-IL-12或TFRC-(G
4S)
3-IFN-α2a之mRNA的人類PBMC能夠活化相應信號傳導路徑，如藉由在分別與HEK-Blue IL-2、HEK-Blue IL-12及HEK-Blue IFN-α/β共培養之後培養物上清液中SEAP增加所示。結果表明，擠壓裝載有編碼嵌合膜結合細胞介素之mRNA的人類PBMC產生嵌合細胞介素，該等嵌合細胞介素在功能上能夠結合至其同源受體且經由其同源受體傳導信號。
實例3
為確定編碼膜結合IL-2之mRNA是否可經轉譯、運輸至免疫細胞膜，使人類供體PBMC擠壓裝載有編碼膜結合IL-2之mRNA，且歷經50小時之時程藉由流式細胞量測術監測免疫細胞表面上IL-2之存在。
方法
人類PBMC以2×10
7個/毫升之密度製備，且在室溫下60 psi下經由寬3.5 µm、長10 µm及深70 µm之收縮部，用250 µg/ml編碼膜結合IL-2 (TFRC-(G
4S)
3-IL-2、TFRC-(EA
3K)
3-IL-2、FasL-(G
4S)
3-IL-2或FasL-(EA
3K)
3-IL-2)之相應mRNA或在沒有接觸的PBMC (無接觸)之情況下在Opti-MEM培養基中經擠壓加工。在擠壓加工後，將擠壓裝載PBMC離心，且丟棄上清液。細胞隨後在X-VIVO 15+培養基(X-VIVO 15、5%人類血清及1x ITS-A)中洗滌兩次，隨後再懸浮於新鮮X-VIVO 15+培養基中。將細胞在37℃下培育48小時。在擠壓後處理後4、18、24及48小時收集獨立培養物。為評定膜結合IL-2之表現，將細胞與相應BV421抗人類IL-2抗體一起培育，且使用Attune NxT聲學聚焦細胞計數器分析結合於免疫細胞之抗體之螢光強度。
如圖3中所示，在各時間點(擠壓後4、18、24及48小時)，相比於空擠壓樣品，擠壓裝載有編碼膜結合IL-2之mRNA的人類PBMC引起擠壓裝載樣品中活免疫細胞的IL-2之平均螢光強度(MFI)增加。結果表明，擠壓裝載有編碼嵌合膜結合細胞介素之mRNA的人類PBMC可轉譯且將所編碼蛋白質運輸至免疫細胞表面，且可在擠壓加工之後在＞24小時內偵測到免疫細胞表面IL-2。
實例4
為確定嵌合膜結合細胞介素是否保留其信號傳導功能性，使人類供體PBMC擠壓裝載有編碼膜結合IL-2之mRNA且與HEK-Blue IL-2報導細胞共培養。
方法
人類PBMC以2×10
7個/毫升之密度製備，且在室溫下60 psi下經由寬3.5 µm、長10 µm及深70 µm之收縮部，用250 µg/ml編碼膜結合IL-2 (TFRC-(G
4S)
3-IL-2、TFRC-(EA
3K)
3-IL-2、FasL-(G
4S)
3-IL-2或FasL-(EA
3K)
3-IL-2)之相應mRNA或在無負荷(空擠壓)之情況下在Opti-MEM培養基中經擠壓加工。在擠壓加工之後，將擠壓裝載PBMC離心，且棄去上清液。隨後在測試培養基(DMEM，10% FBS，1x Pen/Strep，2 mM L-麩醯胺酸)中洗滌細胞兩次，隨後再懸浮於新鮮測試培養基中。
對數性生長之HEK-Blue IL-2報導細胞(InvivoGen)藉由用PBS沖洗燒瓶自培養燒瓶收集，且與擠壓裝載PBMC或空擠壓PBMC在96孔盤中共培養。在37℃下培育共培養物隔夜，隨後收穫培養物上清液。HEK-Blue IL-2報導細胞中IL-2與其受體之結合及IL-2信號傳導路徑之活化引起培養物上清液中鹼性磷酸酶之分泌。根據製造商方案，經由QUANTI-blue分析偵測分泌性鹼性磷酸酶(SEAP)。自空擠壓及擠壓裝載樣品之OD
640值僅減除HEK-Blue報導細胞之OD
640。
結果
如圖4中所示，相比於藉由空擠壓PBMC之未活化，擠壓裝載有編碼TFRC-(G
4S)
3-IL-2、TFRC-(EA
3K)
3-IL-2、FasL-(G
4S)
3-IL-2或FasL-(EA
3K)
3-IL-2之mRNA的人類PBMC能夠活化IL-2信號傳導路徑，如藉由在與HEK Blue IL-2報導細胞共培養之後培養物上清液中SEAP之增加所示。結果表明，擠壓裝載有編碼膜結合IL-2之mRNA的人類PBMC在免疫細胞表面上產生嵌合IL-2，該等嵌合細胞介素在功能上能夠結合至IL-2受體且經由該受體傳導信號。
實例5
為確定擠壓裝載有重組E7 (HPV16)蛋白質的免疫細胞是否可引發抗原特異性T細胞反應，使人類供體HLA-A*02+ PBMC擠壓裝載有E7蛋白，且藉由IFN-γ ELISA量測刺激E7特異性T細胞的能力。
方法
來自HLA-A*02+供體之人類PBMC以10×10
6個/毫升之密度製備，且在60 psi下經由寬4.5 µm、長10 µm及深70 µm之收縮部，用32 µg/ml重組E7蛋白(Abcam plc.)、50 μM E7.6合成長肽(SLP)或在無負荷(空擠壓)之情況下在RPMI 1640培養基中經擠壓加工。在擠壓加工之前使微流擠壓裝置在冰上冷卻15分鐘。在擠壓加工之後，將擠壓裝載PBMC離心，且棄去上清液。細胞隨後在共培養介質(X-VIVO 15 + 5%人類血清)中洗滌兩次，隨後再懸浮於新鮮共培養基中。
隨後將1.2×10
5個擠壓裝載PBMC置放於96孔盤中與3×10
4個HLA-A*02+ E7
11-20反應T細胞(Cellero)共培養。作為陽性對照，0.02 µM最小抗原決定基E7
11-20被直接添加到96孔盤(E7
11-20肽外加)中之未經處理PBMC及反應細胞中。在37℃下培育共培養物6小時之後，收集共培養物上清液。IFNγ ELISA根據製造商方案進行以測定各樣品之培養物上清液中IFNγ之濃度。
結果
如圖5中所示，相比於空擠壓對照，擠壓裝載有重組E7蛋白且與E7
11-20反應T細胞共培養的人類PBMC引起IFNγ產量增加。結果表明，擠壓裝載有全長重組E7蛋白的人類PBMC可引發E7
11-20肽特異性T細胞反應。
實例6
為測定由天然或密碼子最佳化E6 mRNA產生之E6蛋白之量，使人類PBMC擠壓裝載有相應天然或密碼子最佳化E6 mRNA，且用西方墨點法量測表現量。
方法
來自兩個不同HLA-A*02+供體(237及246)之人類PBMC以2×10
7個/毫升之密度製備，且在室溫下60 psi下經由寬3.5 μm、長10 μm及深70 μm之收縮部，用250 μg/mL相應E6 mRNA (天然或經密碼子最佳化)在Opti-MEM培養基中經擠壓加工。在擠壓加工後，將擠壓裝載hPBMC離心，且丟棄上清液。細胞隨後在含有5%人類血清之XVIVO 15培養基中洗滌兩次，隨後再懸浮於含有5%人類血清之新鮮XVIVO 15培養基中。
隨後將2.5×10
6個細胞置放於96孔ULA盤中且在37℃下培育90分鐘。在培育90分鐘後，收集細胞且離心。產生細胞裂解物且用於西方墨點法。經由使用針對E6之特異性抗體偵測E6蛋白之存在。
結果
如圖6中所示，在擠壓裝載90分鐘之後，在來自兩個不同HLA-A*02+供體(237及246)之擠壓裝載PBMC中成功偵測到E6蛋白。此外，E6 mRNA之密碼子最佳化相比於天然E6 mRNA增加mRNA轉譯。
實例7
為測定密碼子最佳化E6 mRNA之轉譯動力學，使人類PBMC擠壓裝載有相應天然或密碼子最佳化E6 mRNA，且用西方墨點法量測歷經24小時之時程的表現量。
方法
來自兩個不同HLA-A*02+供體(224及239)之人類PBMC以2×10
7個/毫升之密度製備，且在室溫下60 psi下經由寬3.5 μm、長10 μm及深70 μm之收縮部，用250 μg/ml密碼子最佳化E6 mRNA在Opti-MEM培養基中經擠壓加工。在擠壓加工後，將擠壓裝載hPBMC離心，且丟棄上清液。細胞隨後在含有5%人類血清之XVIVO 15培養基中洗滌兩次，隨後再懸浮於含有5%人類血清之新鮮XVIVO 15培養基中。
隨後將2.5×10
6個細胞置放於96孔ULA盤中且在37℃下培育不同時間點(2、6及24小時)。在各時間點之後，收集細胞且離心。產生細胞裂解物且用於西方墨點法。經由使用針對E6之特異性抗體偵測E6蛋白之存在。
結果
如圖7中所示，在此研究中評定之各時間點，在來自兩個不同HLA-A*02+供體(224及239)之擠壓裝載PBMC中成功偵測到E6蛋白。此等結果指示，密碼子最佳化可用於促進或增強E6之mRNA轉譯。
實例8
為測定在遞送編碼E7之經修飾mRNA後的E7蛋白動力學，使人類PBMC擠壓裝載有具有或不具有靶向免疫蛋白酶體之模體的相應天然或密碼子最佳化E7 mRNA，且用西方墨點法量測6小時之時程內之表現量。
方法
來自HLA-A*02+供體之人類PBMC以2×10
7個/毫升之密度製備，且在室溫下經由60 psi下經由寬3.5 μm、長10 μm及深70 μm之收縮部，用250 μg/ml相應E7 mRNA (天然，D-盒靶向免疫蛋白酶體之模體，兩個不同密碼子最佳化版本)在Opti-MEM培養基中經擠壓加工。在擠壓加工後，將擠壓裝載hPBMC離心，且丟棄上清液。細胞隨後在含有5%人類血清之XVIVO 15培養基中洗滌兩次，隨後再懸浮於含有5%人類血清之新鮮XVIVO 15培養基中。
隨後將2.5×10
6個細胞置放於96孔ULA盤中且在37℃下培育至多6小時。在1小時及6小時之時間點之後，收集細胞且離心。產生細胞裂解物且用於西方墨點法。E7蛋白之存在經由使用針對E7之特異性抗體偵測。
結果
如圖8中所示，在擠壓裝載1小時之後，針對各樣品(天然，D-盒，密碼子最佳化第1版及第2版)在來自HLA-A*02+供體之擠壓裝載PBMC中成功偵測到E7蛋白。此外，E7 mRNA之密碼子最佳化相比於天然E7 mRNA增加mRNA轉譯。另外，含有E7 mRNA之D-盒模體呈現比天然E7 mRNA快的蛋白質降解。E7蛋白在擠壓裝載之後6小時不可被偵測到。
實例9
為確定擠壓裝載有E7 mRNA之特異性HLA單倍型之免疫細胞是否可誘導抗原特異性T細胞反應，使人類供體HLA-A*02+ PBMC擠壓裝載有編碼全長E7之各種mRNA構築體，且使用IFN-γ ELISA分析量測刺激E7
11-20特異性反應T細胞之能力。
方法
來自HLA-A*02+供體之人類PBMC以2×10
7個/毫升之密度製備，且在室溫下60 psi下經由寬3.5 μm、長10 μm及深70 μm之收縮部，用250 μg/ml各種E7 mRNA在Opti-MEM培養基中經擠壓加工。在擠壓加工之後，將擠壓裝載PBMC離心，且棄去上清液。細胞隨後在含有5%人類血清之XVIVO 15培養基中洗滌兩次，隨後在含有5%人類血清之XVIVO 15培養基中再懸浮。
隨後將1.2×10
5個擠壓裝載PBMC置放於96孔ULA盤中與購自Cellero之3×10
4個E7
11-20反應T細胞共培養。作為陽性對照，20 nM E7
11-20最小抗原決定基被直接添加至共培養盤(肽外加)中之未經處理PBMC及反應細胞中。將盤在37℃下培育6小時或隔夜，且接著根據製造商說明進行顯影/定量。
結果
如圖9中所示，擠壓裝載有各種E7 mRNA構築體的HLA-A*02+人類PBMC在共培養6小時後藉由E7
11-20特異性反應T細胞引起IFNγ分泌增加。此外，與天然E7 mRNA構築體相比，進一步編碼靶向免疫蛋白酶體之模體(D-盒E7)或經密碼子最佳化(CO v1及CO v2)的E7 mRNA構築體引起IFNγ分泌增加。此等結果表明，擠壓裝載有E7 mRNA之HLA-A*02+人類PBMC可誘導抗原特異性T細胞反應，且此可進一步藉由密碼子最佳化或將靶向免疫蛋白酶體之模體添加至E7 mRNA來增強。
實例10
為確定擠壓裝載有E7 mRNA之特異性HLA單倍型之免疫細胞是否可誘導抗原特異性T細胞反應，使人類供體HLA-A*02+ PBMC擠壓裝載有編碼全長E7之各種mRNA構築體，且使用IFN-γ ELISA分析量測刺激E7
11-20特異性反應T細胞之能力。
方法
來自HLA-A*02+供體之人類PBMC以2×10
7個/毫升之密度製備，且在室溫下60 psi下經由寬3.5 μm、長10 μm及深70 μm之收縮部，用250 μg/ml各種E7 mRNA在Opti-MEM培養基中經擠壓加工。在擠壓加工之後，將擠壓裝載PBMC離心，且棄去上清液。細胞隨後在含有5%人類血清之XVIVO 15培養基中洗滌兩次，隨後在含有5%人類血清之XVIVO 15培養基中再懸浮。
隨後將1.2×10
5個擠壓裝載PBMC置放於96孔ULA盤中與購自Cellero之3×10
4個E7
11-20反應T細胞共培養。作為陽性對照，20 nM E7
11-20最小抗原決定基被直接添加至共培養盤(肽外加)中之未經處理PBMC及反應細胞中。將盤在37℃下培育6小時或隔夜，且接著根據製造商說明進行顯影/定量。
結果
如圖10A及圖10B中所示，擠壓裝載有各種E7 mRNA構築體(E7 CO：密碼子最佳化E7 mRNA；NLS E7 CO：進一步編碼突變NLS之密碼子最佳化E7 mRNA；進一步編碼sec/MITD定位域的sec/MITD E7 CO密碼子最佳化E7 mRNA；C端KEKE E7 CO：進一步編碼C端KEKE靶向免疫蛋白酶體之模體的密碼子最佳化E7 mRNA；編碼E7.6 SLP之mRNA，編碼E7.6 SLP之6×重複序列的mRNA)之HLA-A*02+人類PBMC引起IFNγ分泌，該IFNγ分泌在共培養6小時後及隔夜被偵測到。
實例11
為確定擠壓裝載有E7 mRNA之特異性HLA單倍型之免疫細胞是否可誘導抗原特異性T細胞反應，使人類供體HLA-A*02+ PBMC擠壓裝載有編碼全長E7之各種mRNA構築體，且使用IFN-γ ELISA分析量測刺激E7
11-20特異性反應T細胞之能力。
方法
來自HLA-A*02+供體之人類PBMC以2×10
7個/毫升之密度製備，且在室溫下60 psi下經由寬3.5 μm、長10 μm及深70 μm之收縮部，用250 μg/ml各種E7 mRNA在Opti-MEM培養基中經擠壓加工。在擠壓加工之後，將擠壓裝載PBMC離心，且棄去上清液。細胞隨後在含有5%人類血清之XVIVO 15培養基中洗滌兩次，隨後在含有5%人類血清之XVIVO 15培養基中再懸浮。
隨後將1.2×10
5個擠壓裝載PBMC置放於96孔ULA盤中與購自Cellero之3×10
4個E7
11-20反應T細胞共培養。作為陽性對照，20 nM E7
11-20最小抗原決定基被直接添加至共培養盤(肽外加)中之未經處理PBMC及反應細胞中。將盤在37℃下培育6小時或隔夜，且接著根據製造商說明進行顯影/定量。
結果
如圖11A及圖11B中所示，擠壓裝載有各種E7 mRNA構築體的HLA-A*02+人類PBMC在共培養6小時或隔夜後藉由E7
11-20特異性反應T細胞引起IFN γ分泌。此外，可自多個擠壓裝載有各種E7 mRNA構築體之HLA-A*02+人類PBMC供體持續觀測到E7
11-20特異性T細胞反應之此誘導。結果表明，擠壓裝載有E7 mRNA之不同HLA-A*02+人類PBMC供體可誘導抗原特異性T細胞反應。
實例12
為確定信號2及信號3介體之共遞送是否可增強藉由擠壓裝載有抗原之抗原呈現細胞刺激T細胞反應的能力，使人類供體HLA-A*02+ PBMC擠壓裝載有編碼分別介導信號1、信號2及/或信號3之效應子的不同mRNA。CD3+ CD8+反應細胞之活化經由胞內細胞介素染色(ICS)量測。將用肽再刺激之各種mRNA擠壓裝載細胞之作用與用CMV pp65肽(肽外加對照)培育之細胞的作用相比較。
方法
自CMV+ HLA-A*02+白血球採集物(leukopak)分離之人類PBMC用對NLVPMVATV (495-503 aa；SEQ ID NO:88)具有特異性之CMVpp65四聚體染色，以確定此等PBMC具有預先存在之pp65特異性CD8 T細胞。隨後，PBMC以2×10
7個細胞/毫升之密度製備，且與編碼CMV pp65 (信號1)之mRNA、編碼CD86 (信號2)之mRNA及/或編碼膜結合介白素-12 (mbIL-12) (信號3)之mRNA組合。在mRNA存在下，在室溫下60 psi下，使用Cell Squeeze®系統及晶片在RPMI培養基中經由寬3.5 μm、長10 μm及之深70 μm之收縮部將細胞擠壓加工。用空有效裝載(空擠壓)擠壓加工且進一步與10 nM CMV pp65肽一起培育之PBMC係用作對照。測試以下各mRNA之濃度及混合物。
表1
| 樣品 | 信號1 (CO pp65 mRNA) | 信號2 (CO CD86 mRNA) | 信號3 (CO mbIL-12 mRNA) |
| 空擠壓(空SQZ) | - | - | - |
| A | 25 µg/mL | - | - |
| B | 50 µg/mL | - | - |
| C | 100 µg/mL | - | - |
| D | 25 µg/mL | 250 µg/mL | - |
| E | 50 µg/mL | 250 µg/mL | - |
| F | 100 µg/mL | 250 µg/mL | - |
| G | 25 µg/mL | 250 µg/mL | 250 µg/mL |
| H | 50 µg/mL | 250 µg/mL | 250 µg/mL |
| I | 100 µg/mL | 250 µg/mL | 250 µg/mL |
| J | 空SQZ細胞 + 10 nM pp65 CMV肽外加 |
舉例而言，對於樣品G，將總體積225 μL含細胞之細胞懸浮液用mRNA以以下濃度擠壓加工：25 μg/mL CMV pp65 mRNA、250 μg/mL CD86 mRNA及/或250 μg/mL膜結合介白素-12 mRNA。
在擠壓加工之後，將擠壓裝載PBMC轉移至RPMI+10%胎牛血清中且在37℃下培育5天。在培育最後一天，所得細胞用1 μM CMV pp65肽再刺激，或保持不再刺激，且其活化及活性經由ICS量測。評定CD3+ CD8+反應細胞中之TNF-α、IFN-γ、IL-2、PD-1及顆粒酶B。
結果
如藉由胞內染色所示，在分別編碼CD86或mbIL-12之mRNA的擠壓介導之遞送之後24小時成功轉譯CD86 mRNA (圖12A，圖12B)及mbIL-12 mRNA (圖13A，圖13B)。
圖14展示在無再刺激下活化抗原特異性T細胞中mRNA裝載PBMC的CMV pp65 mRNA之濃度效應。圖15展示在1 μM之抗原再刺激下活化抗原特異性T細胞中mRNA裝載PBMC的CMV pp65 mRNA mRNA之濃度效應。如圖15中所示，如藉由在CD3+CD8+反應細胞內誘導IFNγ + CD45RO+群體所表明，在全部50 µg/mL及100 µg/mL擠壓裝載pp65 mRNA下觀測到T細胞活化。當用CD86 mRNA及mbIL-12 mRNA擠壓CMV pp65 mRNA時，兩幅圖展示較高之IFNγ + CD45RO+ CD3+CD8+細胞百分比。
圖16A-圖16E展示抗原特異性CD8 T細胞為多功能性的，如由IFNg、IL-2、TNFa、顆粒酶B、PD-1表現所示。相比於僅抗原(亦即，僅將pp65 mRNA擠壓裝載至PBMC中)，進一步引入在PBMC中編碼信號2/3 mRNA之mRNA進一步上調此等功能標記。
實例13
為量測CpG成熟對擠壓細胞之影響，使人類供體HLA-A*02+ PBMC擠壓裝載有分別編碼介導信號1、信號2及/或信號3之效應子的不同mRNA。對於各PBMC樣品，一半的細胞用1 μM CpG 7909成熟4小時。在4小時成熟結束時，洗滌過量CpG 7909，且該等細胞經塗鋪並在37℃下培育5天。在第5天，CD3+ CD8+細胞之活化及活性經由ICS以及四聚體分析量測。將用CpG 7909成熟化之各種mRNA擠壓裝載細胞的作用與用空有效裝載進行擠壓加工且外加CMV pp65肽之PBMC的作用以及與用PMA/離子黴素(Ionomycin)處理之PBMC的作用相比較。
方法
自CMV+ HLA-A*02+白血球採集物(leukopak)分離之人類PBMC用對NLVPMVATV (495-503 aa；SEQ ID NO:88)具有特異性之CMVpp65四聚體染色，以確定此等PBMC具有預先存在之pp65特異性CD8 T細胞。隨後，PBMC以2×10
7個細胞/毫升之密度製備，且與編碼CMV pp65 (信號1)、CD86 (信號2)及/或膜結合介白素-12 (mbIL-12) (信號3)之mRNA組合。在相應mRNA存在下，在室溫下60 psi下，使用Cell Squeeze®系統及晶片在RPMI培養基中經由寬3.5 μm、長10 μm及之深70 μm之收縮部將細胞擠壓加工。用空有效裝載(空擠壓)擠壓加工且進一步與10 nM CMV pp65肽一起之PBMC係用作對照。測試以下各mRNA之濃度及混合物。
表2
| 樣品 | 信號1 (CO pp65 mRNA) | 信號2 (CO CD86 mRNA) | 信號3 (CO mbIL-12 mRNA) |
| 空SQZ | - | - | - |
| A | 10 µg/mL | - | - |
| B | 50 µg/mL | - | - |
| C | 10 µg/mL | 250 µg/mL | - |
| D | 50 µg/mL | 250 µg/mL | - |
| E | 10 µg/mL | - | 250 µg/mL |
| F | 50 µg/mL | - | 250 µg/mL |
| G | 10 µg/mL | 250 µg/mL | 250 µg/mL |
| H | 50 µg/mL | 250 µg/mL | 250 µg/mL |
| I | 空SQZ細胞 + 10 nM pp65 CMV肽外加 | ||
| J | 在第6天，空SQZ細胞 + PMA/離子黴素 |
舉例而言，對於樣品G，將總體積500 μL含細胞之細胞懸浮液用mRNA以以下濃度擠壓加工：10 μg/mL CMV pp65 mRNA、250 μg/mL CD86 mRNA及250 μg/mL膜結合介白素-12 mRNA。對於各樣品，細胞亞群用1 μM CpG 7909成熟4小時，隨後洗滌且培養。
將細胞再培育5天。在培育最後一天，用1 μM CMV pp65肽再刺激所得細胞，且經由ICS量測其活化及活性。評定CD3+ CD8+反應細胞中之TNF-α、IFN-γ、IL-2、PD-1及顆粒酶B。
除ICS評估以外，細胞用CMVpp65四聚體染色以測定在第5天擴增之後抗原特異性CD8 T細胞數。
結果
如藉由胞內染色所示，在分別編碼CD86或mbIL-12之mRNA的擠壓介導之遞送之後24小時成功轉譯CD86 mRNA (圖17A，圖17B)及mbIL-12 mRNA (圖18A，圖18B)。
圖19展示相比於僅用pp65 mRNA之擠壓裝載PBMC，在CpG成熟及無CpG成熟之條件下用pp65及CD86及/或mbIL-12 mRNA擠壓裝載PBMC之後，CMV pp65四聚體特異性(TET特異性) CD3+CD8+反應細胞擴增增加。此實例表明，雖然CpG成熟引起Tet+細胞百分比稍微下降(圖19頂部圖)，其得到的Tet+計數比無CpG成熟之情況下的更高(圖19底部圖)。此外，相比於僅擠壓CMV pp65 mRNA，CD86及/或mbIL-12 mRNA之共遞送進一步增大Tet特異性反應細胞之數目及百分比。
如圖20中所示，如藉由CD3+CD8+反應細胞內增加之IFNγ + CD45RO+群體所表明，在CpG成熟或不成熟之條件下，當編碼信號1 mRNA介體之mRNA與編碼信號2及/或3介體之mRNA共遞送時，反應T細胞活化增加。
如圖21A-圖21E中所示，相比於在無抗原情況下擠壓加工之PBMC，當PBMC用pp65 mRNA擠壓裝載時，TNF-α、IFN-γ、IL-2、PD-1及顆粒酶B之功能標記在反應T細胞中經上調。結果指示經活化抗原特異性T細胞為多功能性的。
實例14
為評定分別編碼信號1、2或3之介體的各種mRNA在T細胞活化中之共擠壓(同時擠壓裝載)、其解決多種不同HLA單倍型之能力及所得增強之T細胞反應，使人類供體HLA-A*02+ PBMC (HLA-A*02+、HLA-B*07+、HLA-B*35+)在T細胞活化中擠壓裝載有分別編碼信號1、2或3之介體的mRNA之組合。
方法
自CMV+ HLA-A*02+白血球採集物(leukopak)分離之人類PBMC用對NLVPMVATV (495-503 aa；SEQ ID NO:88)具有特異性之CMVpp65四聚體染色，以確定此等PBMC具有預先存在之pp65特異性CD8 T細胞。隨後，PBMC以4×10
7個細胞/毫升之密度製備，且與編碼CMV pp65 (信號1)、CD86 (信號2)、膜結合介白素-2 (mbIL-2)及/或膜結合介白素-12 (mbIL-12) (信號3)之mRNA組合。在mRNA存在下，在室溫下60 psi下，使用Cell Squeeze®系統及晶片在RPMI培養基中經由寬3.5 μm、長10 μm及之深70 μm之收縮部將細胞擠壓加工。用空有效裝載擠壓加工且外加10 nM CMV pp65肽的PBMC及用1×PMA/離子黴素處理之PBMC係用作對照。測試以下各mRNA之濃度及混合物。
表3
| 樣品 | 信號1 (CO pp65 mRNA) | 信號2 (CO CD86 mRNA) | 信號3 (CO mbIL-2 mRNA) | 信號3 (CO mbIL-12 mRNA) |
| A | - | - | - | - |
| B | - | 250 µg/mL | 250 µg/mL | - |
| C | - | 250 µg/mL | - | 250 µg/mL |
| D | 50 µg/mL | - | - | - |
| E | 50 µg/mL | 250 µg/mL | 250 µg/mL | - |
| F | 50 µg/mL | 250 µg/mL | - | 250 µg/mL |
| G | 空SQZ細胞 + 10 nM pp65 495-503肽外加 | |||
| H | 在第5天，空SQZ細胞 + PMA/離子黴素 |
舉例而言，對於樣品F，將總體積500 μL含細胞之細胞懸浮液用mRNA以以下濃度擠壓加工：50 μg/mL pp65 mRNA (信號1)、250 μg/mL CD86及/或250 μg/mL mbIL-12 mRNA。隨後在4小時內用1 µM CpG 7909使各樣品中之細胞成熟，其後，一部分細胞經洗滌且接著冷凍保存4天。解凍後，使其保持培養5天以評估ICS反應。一些細胞趁新鮮立即培養5天以比較ICS反應。在第5天，在三種不同條件下再刺激此等細胞：1)用HLA-A*02限制性pp65最小抗原決定基(NLVPMVATV；SEQ ID NO:88)，2)用HLA-B*07限制性pp65最小抗原決定基(RPHERNGFTVL；SEQ ID NO:89)，或(3)HLA-B*35限制性pp65最小抗原決定基(TPRVTGGGAM；SEQ ID NO:90)。抗原特異性反應將經由ICS藉由評定CD3+ CD8+反應細胞中之TNF-α、IFN-γ表現來量測。另外，在擠壓後24小時以及解凍後24小時評定mRNA表現。
結果
如藉由胞內染色所示，在對應mRNA的擠壓介導之遞送之後24小時成功轉譯CD86 mRNA (圖22A，圖22B)、mbIL-2 (圖23A，圖23B)及mbIL-12 mRNA (圖24A，圖24B)。
如圖25中所示，對於用CD86及mbIL2 mRNA擠壓之PBMC且亦對於用CD86及mbIL12 mRNA擠壓之PBMC，在HLA-B*07限制性pp65最小抗原決定基之再刺激及不再刺激的條件下，對抗原特異性反應T細胞的活化增強。另外，如圖26中所示，如藉由用肽再刺激之組中的CD3+ CD8+反應細胞內之IFN-γ+ CD45RO+群體之顯著較高百分比所表明，在用HLA-B*07限制性pp65最小抗原決定基進行之肽再刺激之情況下，存在實質上增強的反應T細胞活化。
為展示此等抗原特異性CD8 T細胞之多功能性，亦藉由胞內染色量測TNFa產量。再刺激後，可偵測產生TNFa之CD8 T細胞。值得注意的是，當PBMC擠壓裝載有CD86、mbIL-2及/或mbIL-12 mRNA時，TNFa含量增加。
實例15
為評定分別編碼MHC信號1、2或3之效應子的各種mRNA在T細胞活化中之共擠壓(同時擠壓裝載)、其解決多種不同HLA單倍型之能力及所得增強之T細胞反應，使人類供體HLA-A*02+ PBMC在T細胞活化中擠壓裝載有分別編碼信號1、2或3之介體的mRNA之組合。
方法
自CMV+ HLA-A*02+白血球採集物(leukopak)分離之人類PBMC用對NLVPMVATV (495-503 aa；SEQ ID NO:88)具有特異性之CMVpp65四聚體染色，以確定此等PBMC具有預先存在之pp65特異性CD8 T細胞。隨後，PBMC以5×10
7個細胞/毫升之密度製備，且與編碼CMV pp65 (信號1)、CD86 (信號2)、膜結合介白素-2 (mbIL-2)及/或膜結合介白素-12 (mbIL-12) (信號3)之mRNA組合。在mRNA存在下，在室溫下60 psi下，使用Cell Squeeze®系統及晶片在RPMI培養基中經由寬3.5 μm、長10 μm及之深70 μm之收縮部將細胞擠壓加工。外加10 nM CMV pp65肽之經空擠壓加工細胞及經1×PMA/離子黴素處理之細胞係用作對照。測試以下各mRNA之濃度及混合物。
表4
| 樣品 | 信號1 (CO pp65 mRNA) | 信號2 (CO CD86 mRNA) | 信號3 (CO mbIL-2 mRNA) | 信號3 (CO mbIL-12 mRNA) |
| A | - | - | - | - |
| B | - | 250 µg/mL | 250 µg/mL | - |
| C | - | 250 µg/mL | - | 250 µg/mL |
| D | 50 µg/mL | - | - | - |
| E | 50 µg/mL | 250 µg/mL | - | - |
| F | 50 µg/mL | 250 µg/mL | 250 µg/mL | - |
| G | 50 µg/mL | 250 µg/mL | - | 250 µg/mL |
| H | 50 µg/mL | 250 µg/mL | 250 µg/mL | 250 µg/mL |
| I | 空SQZ細胞 + 10 nM pp65肽池外加(5種不同肽) | |||
| J | PMA/離子黴素 |
舉例而言，對於樣品H，將總體積500 μL含細胞之細胞懸浮液用mRNA以以下濃度擠壓加工：50 μg/mL pp65 mRNA (信號1)、250 μg/mL CD86、250 μg/mL mbIL-2 mRNA及/或250 μg/mL mbIL-12 mRNA。將各樣品中之細胞收集於RPMI+10%人類血清及1 µM CpG 7909中且在37℃下培育4小時。在培育之後，細胞藉由離心洗滌且再懸浮於RPMI+10%胎牛血清中且在37℃下培育5天。
在第1天，收集各樣品之等分試樣以藉由流式細胞量測術分析mRNA表現。PBMC構成細胞組成藉由對細胞特異性標記(CD3、CD19、CD14及CD56)染色來界定且各相應RNA之表現藉由對CD86、IL-2及IL-12染色來量測。
在第5天，塗鋪細胞各樣品組之12個孔，且在高爾基體阻滯(golgi stop)及高爾基體栓塞(golgi plug)存在下各樣品組分別用A1-限制性pp65抗原決定基(YSEHPTFTSQY；SEQ ID NO:91)、B7-限制性pp65抗原決定基(RPHERNGFTVL；SEQ ID NO:89)或B7-限制性pp65抗原決定基(TPRVTGGGAM；SEQ ID NO:90)再刺激5小時。
細胞隨後染色用於表現：CD3+ CD8+反應細胞中之IFN-γ、TNF-α、IL-2、顆粒酶B及PD-1。
藉由流式細胞量測術分析細胞且藉由IFNg產生鑑別抗原決定基特異性細胞。
結果
如圖27中所示，在第1天量測CD86、mbIL-2及mbIL-12 MFI表現。此等結果指示所有三種擠壓裝載至PBMC中之mRNA之成功轉譯。
亦在第1天量測CD86、mbIL-2及mbIL-12的表現，以T細胞在PBMC內之百分比形式表示。此等結果指示超過75%之總T細胞成功轉譯擠壓裝載於細胞內部之mRNA。
如圖28中所示，當針對若干不同單倍型共遞送具有膜結合細胞介素及/或共刺激分子的pp65裝載PBMC時，存在增強之T細胞活化，如藉由在用以分別擴增HLA-*A01、HLA-*B07或HLA-*B07反應T細胞的各相應再刺激(YSE(A01)、TPR(B07)或RPH(B07))存在下所觀測到的增強之T細胞活化所指示。
實例16
為確定信號2及信號3介體之共遞送是否可增強藉由擠壓裝載有流感M1抗原之抗原呈現細胞刺激T細胞反應的能力，使人類供體HLA-A*02+ PBMC擠壓裝載有編碼分別介導信號1、信號2及/或信號3之效應子的不同mRNA。CD3+ CD8+細胞之活化及活性經由ICS以及四聚體分析量測。將用肽再刺激之各種mRNA擠壓裝載細胞之作用與用M1肽(肽外加對照)培育之對照PBMC的作用相比較。
方法
自流感M1 + HLA-A*02+白血球採集物分離之人類PBMC用M1四聚體染色以確定此等PBMC具有預先存在之M1特異性CD8 T細胞。隨後，PBMC以4×10
7個細胞/毫升之密度製備，且與編碼流感M1 (信號1)、CD86 (信號2)及/或膜結合介白素-12 (mbIL-12) (信號3)之mRNA組合。在相應mRNA存在下，在室溫下60 psi下，使用Cell Squeeze®系統及晶片在RPMI培養基中經由寬3.5 μm、長10 μm及之深70 μm之收縮部將細胞擠壓加工。用空有效裝載擠壓加工且外加100 nM流感M1肽之PBMC係用作對照。測試以下各mRNA之濃度及混合物。
表5
| 樣品 | 條件 | 信號1 mRNA濃度 | 信號2 mRNA濃度 | 信號3 mRNA濃度 |
| A | 空SQZ | - | - | - |
| B | M1 mRNA SQZ | 10 µg/mL | - | - |
| C | M1 + CD86 + mbIL-2 mRNA SQZ | 250 µg/mL | 250 µg/mL | |
| D | M1 + CD86 + mbIL-12 mRNA SQZ | |||
| E | M1 mRNA SQZ | 50 µg/mL | - | - |
| F | M1 + CD86 + mbIL-2 mRNA SQZ | 250 µg/mL | 250 µg/mL | |
| G | M1 + CD86 + mbIL-12 mRNA SQZ | |||
| H | M1 mRNA SQZ | 250 µg/mL | - | - |
| I | M1 + CD86 + mbIL-2 mRNA SQZ | 250 µg/mL | 250 µg/mL | |
| J | M1 + CD86 + mbIL-12 mRNA SQZ | |||
| K | CD86 + mbIL-2 mRNA SQZ | - | 250 µg/mL | 250 µg/mL |
| L | CD86 + mbIL-12 mRNA SQZ | - | 250 µg/mL | 250 µg/mL |
| M | 空SQZ (100nM肽外加) | - | - | - |
舉例而言，對於樣品G，總體積200 μL含細胞之細胞懸浮液用mRNA以以下濃度擠壓加工：50 μg/mL流感M1 mRNA、250 μg/mL CD86 mRNA及/或250 μg/mL mbIL-12 mRNA。
在擠壓加工之後，將擠壓裝載PBMC轉移至RPMI+10%胎牛血清中且在37℃下培育5天。
在培育最後一天，用1 μM流感M1肽再刺激所得細胞，且經由ICS量測其活化及活性。評定CD3+ CD8+反應細胞中之TNF-α、IFN-γ、IL-2、PD-1及顆粒酶B。另外，針對對GILGFVFTL肽(58-66 aa; SEQ ID NO:92)具有特異性之流感M1四聚體染色細胞。
結果
如藉由胞內染色所示，在相應mRNA的擠壓介導之遞送之後24小時成功轉譯CD86 mRNA、mbIL-2 mRNA及mbIL-12 mRNA (圖29)。
圖30展示具有流感M1 mRNA之擠壓裝載PBMC當與1 μM抗原再刺激結合時，對抗原特異性T細胞活化之濃度影響。如圖31中所示，對於擠壓裝載有三種濃度之流感M1中之每一者的PBMC，觀測到抗原特異性T細胞之活化。兩幅圖30及31展示當流感M1 mRNA與CD86 mRNA及mbIL-12 mRNA共遞送時，IFNγ + CD45RO+群體在CD3+CD8+反應細胞內之較高百分比。
如圖32中所示，用CD86及mbIL-2或mbIL-12 mRNA擠壓之組合產生流感M1 CD8 T細胞之顯著擴增，如藉由四聚體陽性CD8 T細胞所量測。此外，當存在mbIL-12時，此等細胞不存在抗原非依賴性擴增。另一方面，mbIL-2 mRNA引起此等細胞之一些抗原非依賴性擴增。
對於多功能標記，顆粒酶B表現之增加且IFNg、IL-2及TNFa細胞介素之上調表明多功能性較高。與僅抗原(亦即僅M1 mRNA)相比，該等多功能標記藉由PBMC中信號2及3 mRNA之存在進一步上調(資料未示出)。
實例17
為確定擠壓裝載有編碼HPV16 E6之mRNA的特異性HLA單倍型之免疫細胞是否可誘導抗原特異性T細胞反應，使人類供體HLA-B*07+ PBMC擠壓裝載有E6 mRNA。E6 mRNA裝載PBMC刺激HLA-B*07限制性E6特異性T反應細胞的能力使用IFN-γ ELISpot分析來量測。將擠壓裝載有E6 mRNA之PBMC的作用與未經處理且模擬擠壓裝載(空)之對照的作用相比較。
方法
為產生E6
15-24特異性T細胞，以2週時間間隔用E6
15-24肽、B型肝炎病毒核心肽(TPPAYRPPNAPIL；SEQ ID NO:93)及不完全弗氏佐劑之乳液對HLA-B*07轉殖基因小鼠疫苗接種兩遍3次(初打/加打/加打)。在最後一次疫苗接種之後一週，使小鼠安樂死且提取脾及引流淋巴結。將組織提取物解離成單細胞懸浮液。細胞接著在37℃下在E6
15-24肽及IL-2存在下培養6天。在6天結束時，將細胞冷凍保存直至與PBMC共培養之日。
來自HLA-B*07+供體之人類PBMC以5×10
7個細胞/毫升之密度製備且與0.5 mg/ml E6 mRNA組合。在E6 mRNA存在下，使用Cell Squeeze®系統及晶片在RPMI培養基中在60 psi下經由寬3.5 μm、長10 μm及之深70 μm之收縮部將PBMC擠壓加工。未經處理PBMC (無接觸)及在E6 mRNA不存在下經擠壓加工(空擠壓)之PBMC係用作陰性對照。
在擠壓加工之後，將擠壓裝載PMBC轉移至具有1 μM CpG ODN 2006之RPMI + 10%人類血清中且在37℃下培育4小時。接著擠壓裝載PBMC用CTL培養基+1% L-麩醯胺酸洗滌兩次，隨後再懸浮於CTL培養基+1% L-麩醯胺酸中。
將5×10
4個E6 mRNA擠壓裝載PBMC (E6 mRNA)、未經處理PBMC (無接觸)、模擬擠壓裝載PBMC (空擠壓)或外加有1 mM E6
15-24肽之無接觸PBMC (陽性對照)置放於96孔INF-γ ELISpot盤中與5×10
5個E6
15-24反應T細胞(產生於HLA-B*07轉殖基因小鼠中)共培養。將盤在37℃下培育隔夜且接著根據製造商說明進行顯影。
結果
如圖34中所示，擠壓裝載有E6 mRNA的HLA-B*07+人類PBMC在共培養後引起HLA-B*07 E6
15-24特異性T細胞中IFN-γ反應增加，如藉由ELISPOT分析中IFN-γ斑點形成單元(SFU) (圖35)及IFN-γ平均斑點尺寸(圖36)之增加所指示。在E6 mRNA裝載PBMC中，相比於無接觸及空擠壓對照，HLA-B*07 E6
15-24特異性T細胞中之此等IFN-γ反應顯著增加。此等結果表明，擠壓裝載有E6 mRNA之HLA-B*07+ PBMC可加工且呈現E6
15-24抗原決定基，並且誘導HLA-B*07限制性E6特異性T細胞反應。
實例18
為確定擠壓裝載有E7 mRNA的免疫細胞可引發抗原特異性T細胞反應之時長，使人類供體HLA-A*02+ PBMC擠壓裝載有E7 mRNA，且培育各種時長，隨後藉由IFN-γ ELISA評定刺激E7特異性T細胞的能力。
方法
來自HLA-A*02+供體之人類PBMC以5×10
7個/毫升之密度製備，且使用Cell Squeeze®系統及晶片在RPMI 1640培養基中在60 psi下經由寬3.5 μm、長10 μm及之深70 μm之收縮部用以下將其擠壓加工：(i) 0.5 mg/ml E7 mRNA，(ii) 0.5 mg/ml E6 mRNA，(iii) 0.5 mg/ml E7 mRNA及0.25 mg/ml E6 mRNA，(iv)E7.6合成長肽(SLP)或(v)無負荷(空擠壓)。在擠壓加工之後，將擠壓裝載PMBC轉移至具有1 μM CpG ODN 2006之RPMI + 10%人類血清中且在37℃下培育4小時。擠壓裝載PBMC隨後在共培養介質(X-VIVO 15 + 5%人類血清)中洗滌兩次，隨後再懸浮於新鮮共培養基中。將一部分細胞擱置一旁以用於與E7
11-20反應T細胞(Cellero)立即共培養且將其餘細胞冷凍保存。
隨後將3×10
5個擠壓裝載PBMC置放於96孔盤中與3×10
4個HLA-A*02+ E7
11-20反應T細胞(Cellero)共培養。作為陽性對照，0.1 µM E7
11-20肽被直接添加至96孔盤中之未經處理PBMC及反應細胞中。在37℃下培育共培養物18小時之後，收集共培養物上清液。IFNγ ELISA根據製造商方案進行以測定各樣品之培養物上清液中IFNγ之濃度。
將冷凍保存之擠壓裝載PBMC解凍且靜置培養8、4或0小時，隨後添加E7
11-20反應T細胞。在培養8、4或0小時之後，將裝載3×10
5個擠壓裝載PBMC與3×10
4個HLA-A*02+ E7
11-20反應T細胞(Cellero)在96孔盤中共培養。在37℃下培育共培養物18小時之後，收集共培養物上清液。IFNγ ELISA根據製造商方案進行以測定各樣品之培養物上清液中IFNγ之濃度。
結果
如圖38A及39A中所示，擠壓裝載有E7 mRNA之人類PBMC能夠引發免疫反應，如藉由緊接在擠壓裝載E7 mRNA之後在共培養時自E7
11-20反應T細胞之IFN-γ產生所量測。如圖38B及圖39B中所示，擠壓裝載有E7 mRNA之人類PBMC能夠在擠壓加工後引發免疫反應至少高達8小時，如藉由IFN-γ自E7
11-20反應T細胞產生所量測。此等結果表明，擠壓裝載有E7 mRNA之HLA-A*02+人類PBMC可在擠壓加工後引發E7特異性T細胞反應至少8小時。
實例19
為確定擠壓裝載有E6 mRNA之免疫細胞是否可引發E6特異性免疫反應，使人類供體HLA-A*02+ PBMC擠壓裝載有E6 mRNA，且刺激E6
29-38TCR Jurkat-Lucia NFAT報導細胞之能力藉由發光情況評定。
方法
藉由將表現慢病毒之E6
29-38TCR轉導至其內源性TCR α/β已剔除之Jurkat-Lucia NFAT細胞(InvivoGen)中來產生E6 TCR Jurkat-Lucia NFAT報導細胞。此等細胞具有完整的NFAT誘導型Lucia報導細胞，該等報導細胞可經由E6
29-38TCR與MHC-I (HLA-A*02限制性)接合而活化，該MHC-I與同源E6
29-38抗原決定基結合。
來自HLA-A*02+供體之人類PBMC以4×10
7個/毫升之密度製備，且在室溫下60 psi下經由寬3.5 µm、長10 µm及深70 µm之收縮部在RPMI 1640培養基中用以下擠壓加工：(i) 500 μg/ml E6 mRNA及500 μg/ml E7 mRNA，(ii)編碼CD86、膜結合IL-2 (mbIL-2)及膜結合IL-12 (mbIL-12)之mRNA，(iii)E6及E7 mRNA，及編碼CD86、mbIL-2及mbIL-12之mRNA，(iv)E6及E7 SLP或(v)無負荷(空擠壓)。在擠壓加工之後，將擠壓裝載PMBC轉移至具有1 μM CpG ODN 2006之RPMI + 10%人類血清中且在37℃下培育4小時。擠壓裝載PBMC隨後在共培養介質(X-VIVO 15 + 5%人類血清)中洗滌兩次，隨後再懸浮於新鮮共培養基中。
隨後將4×10
5個擠壓裝載PBMC置放於96孔盤中與1×10
5個E6
29-38TCR Jurkat-Lucia NFAT細胞共培養。作為陽性對照，1 µM E6
29-38抗原決定基被直接添加至96孔盤中之未經處理PBMC及E6
29-38TCR Jurkat-Lucia NFAT細胞中。在37℃下培育共培養物16-18小時之後，收集共培養物上清液。根據製造商方案，用培養物上清液進行QUANTI-Luc Gold分析(InvivoGen)，由於NFAT誘導型Lucia螢光素酶之活化，經由發光情況量測Lucia螢光素酶。
結果
如圖40、圖41A及圖41B中所示，相比於空擠壓對照，擠壓裝載有E6 mRNA且與E6
29-38TCR Jurkat-Lucia NFAT報導細胞共培養的人類PBMC引起NFAT活化及發光增加。結果表明，擠壓裝載有E6 mRNA之HLA-A*02+人類PBMC可引發E6
29-38免疫反應。
實例20
此研究評估E7
11-19TCR轉導或E6
29-38TCR轉導之CD8 T細胞在與自體PBMC共培養時的擴增，該等自體PBMC擠壓裝載有編碼HPV16抗原及信號2/3介體之mRNA (SQZ-eAPC-HPV細胞)。
方法
HLA-A*02+白血球採集物分離人類PBMC。在第0天經由陰性選擇分離CD8
+T細胞。製備補充有100 IU/mL IL-2 (R10+IL-2)的R10 (RPMI 1640 + 10%胎牛血清 + 100 U/mL青黴素 + 100 μg/mL鏈黴素)之介質。將T細胞在室溫下在500 rcf下離心5分鐘。抽吸上清液，且細胞以2×10
6個細胞/毫升之細胞濃度再懸浮於R10+IL-2中。洗滌抗CD3/CD28戴諾磁珠(Dynabead)且以2×10
6個戴諾磁珠/毫升之珠粒濃度再懸浮於R10+IL-2中。將3 mL T細胞及3 mL戴諾磁珠組合於燒瓶中，其中最終細胞及戴諾磁珠濃度等於1×10
6個細胞/毫升，且將燒瓶置放於37℃、5% CO
2培育箱中2天。
在第2天，CD8
+T細胞用E7
11-19TCR表現或E6
29-38TCR表現慢病毒轉導。製備40 mL T細胞介質，其包含X-VIVO 15 + 5%人類血清 + 300 IU/ml IL-2。收集CD8
+T細胞且以1×10
6個細胞/毫升再懸浮於T細胞培養基中。在24孔盤中，將500 μL CD8
+T細胞與50 μL LentiBOOST及84.7 μL E7 TCR慢病毒(1×10
7個TU)或49.5 μL E6 TCR慢病毒(1×10
7個TU)組合。將T細胞介質添加至轉導中之每一者以使體積總計為1 mL。在32℃下藉由離心機使細胞在2,000 rcf下旋轉培育2小時。將盤置放於37℃、5% CO
2培育箱中隔夜。遵循與第一慢病毒轉導相同之方案，在第3天進行第二慢病毒轉導。
在第4天，移除慢病毒且將T細胞以1×10
6個細胞/毫升在R10 + 300 IU/mL IL-2中培養4天。在第7天，E7
11-19五聚體及E6
29-38四聚體染色以測定表現E6或E7 TCR之細胞的百分比(圖42A)。亦添加新鮮R10介質以使得細胞濃度回至1×10
6個細胞/毫升。
E6-TCR及E7-TCR轉導T細胞隨後以0.1%五/四聚體+ T細胞之濃度與已用編碼E6及E7之mRNA及/或信號2 mRNA (CD86 mRNA)/信號3 mRNA (mbIL-2及mbIL-12 mRNA)擠壓之自體PBMC共培養總共6天。
在第8天，將來自同一供體之PBMC解凍且根據以下時程製備四組擠壓裝載自體PBMC。特定言之，在室溫下60 psi下，在RPMI培養基中使用微流收縮部(10 μm深、3.5 μm寬及70 μm長)擠壓加工PBMC。
表6
| 組 | 擠壓條件 | 擠壓體積 |
| A | 空擠壓 | 300 µL |
| B | 500 µg/mL E6 mRNA及500 µg/mL E7 mRNA | 300 µL |
| C | 250 µg/mL CD86 mRNA、250 µg/mL mbIL-2 mRNA及250 µg/mL mbIL-12 mRNA | 300 µL |
| D | 500 µg/mL E6 mRNA、500 µg/mL E7 mRNA、250 µg/mL CD86 mRNA、250 µg/mL mbIL-2 mRNA及250 µg/mL mbIL-12 mRNA | 300 µL |
E7-TCR或E6-TCR轉導T細胞隨後以一定細胞濃度與已用E6及E7 mRNA及/或信號2介體mRNA (CD86 mRNA)/信號3介體mRNA (mbIL-2及mbIL-12 mRNA)擠壓加工之自體PBMC共培養。將共培養物塗鋪於具有總共2×10
5個細胞之96孔盤中；其中細胞中之5×10
4個為經擠壓加工PBMC，且其餘1.5×10
5個細胞為0.1% E6或E7 TCR表現T細胞及未加工自體PBMC的組合。在37℃、5% CO
2下培育共培養物6天。
在第14天(起始共培養後6天)，進行E7
11-19五聚體染色及E6
29-38四聚體染色，以及胞內細胞介素染色(ICS)。對於ICS，細胞首先在高爾基體阻滯及高爾基體栓塞之存在下用E7
11-19或E6
29-38最小抗原決定基再刺激6小時。接著將細胞染色用於IFNγ、TFNα、IL-2之表現。
結果
如圖42D至42I中所示，對於兩種共培養設置(E7 TCR T細胞或E6 TCR T細胞)，相比於與擠壓裝載有僅E6+E7 mRNA或僅信號2/3 mRNA之PBMC共培養，在與擠壓裝載有E6、E7、CD86、mbIL-2及mbIL-12 mRNA (E6+E7+信號2/3 mRNA)之PBMC共培養中觀測到IFNγ、TNF-α或IL-2產生T細胞之最高百分比。如圖42B及42C中所示，E7五聚體及E6四聚體染色亦證實ICS結果，其中相比於與擠壓裝載有僅E6+E7 mRNA或僅信號2/3 mRNA之PBMC共培養，在與擠壓裝載有E6+E7+信號2/3 mRNA之PBMC共培養中，觀測到E6四聚體+或E7五聚體+ T細胞之最高增殖。
此等結果指示，相比於擠壓裝載有編碼抗原之mRNA或僅編碼信號2/3介體之mRNA的PBMC，擠壓裝載有編碼HPV16 E6及E7抗原及信號2/3介體之mRNA的PBMC刺激更強的T細胞活化及增殖。
實例21
此研究評估在用擠壓裝載有編碼CMV抗原及信號2/3介體(SQZ-eAPC-CMV細胞)之mRNA的人類PBMC免疫接種之後，NSG-(K
bD
b)
零(IA)
零小鼠(NSG MHC-I/II DKO小鼠)中之pp65特異性人類CD8
+T細胞的活化及擴增。
方法
冷凍保存的自HLA-A*02+白血球採集物分離之人類PBMC經解凍以用於此研究。在第0天，將8個小瓶HLA-A*02+ CMV+冷凍保存之PBMC在水浴中解凍。將含有細胞之小瓶在室溫下在200rcf下離心10分鐘。抽吸上清液，且將細胞以約1×10
7個細胞/毫升之細胞濃度再懸浮於R10 (RPMI 1640 + 10%胎牛血清 + 100 U/mL青黴素 + 100 μg/mL鏈黴素)中。細胞在37℃下靜置1小時，此後，細胞在室溫下在500rcf下離心5分鐘。抽吸上清液且將細胞再懸浮於25 mL PBS中。在室溫下在500rcf下將細胞離心5分鐘。抽吸上清液且使細胞以1×10
8個細胞/毫升之最終細胞濃度再懸浮於PBS中。
兩組擠壓裝載PBMC係根據以下製備：
在室溫下60 psi下，使用微流收縮部(10 μm深、3.5 μm寬及70 μm長)在RPMI培養基中擠壓加工PBMC。特定言之，PBMC (1)用500 μg/mL編碼pp65 (僅pp65)之mRNA擠壓加工，或(2)用500 μg/mL編碼pp65之mRNA及250 μg/mL以下中之每一者擠壓裝載：編碼信號2介體(CD86)之mRNA、編碼信號3介體(mbIL-2)之mRNA及編碼另一信號3介體(mbIL-12) (eAPC-CMV或eAPC-pp65)之mRNA。
將兩組經擠壓加工細胞根據以下時程各自分成兩個投與子組。組A (第五組)表示包含未經處理(無接觸)細胞之對照組。
表7
| 組 | 樣品 | 濃度 |
| A | 無接觸 | 130 μL無接觸細胞 + 520 μL PBS (第0天：1×10 7個細胞/100 μL注射液)； (第7天：5×10 6個細胞/100 μL注射液) |
| B | eAPC-CMV | 130 μL eAPC細胞 + 520 μL PBS (1×10 6個細胞/100 μL注射液) |
| C | eAPC-CMV | 650 μL eAPC細胞 5×10 6個細胞/100 μL注射液 |
| D | 僅pp65 | 130 μL pp65細胞 + 520 μL PBS 1×10 6個細胞/100 μL注射液 |
| E | 僅pp65 | 650 μL pp65細胞 5×10 6個細胞/100 μL注射液 |
如表8中所示，對於初打(第0天)，所有組中每組五隻小鼠在第0天上午給與指定量未加工PBMC (無接觸PBMC)之眶後(R.O.)注射，且B-E組之每組五隻小鼠在第0天下午給與指示量經擠壓加工PBMC之相應R.O注射。
在第7天，將PBMC解凍且根據上文所述之類似程序進行擠壓加工，且製備兩組經加工PBMC (eAPC-CMV，僅pp65)以便以根據上表7之濃度進行加打投與。
如表8中所示，針對加打(第7天)，A組每組5隻小鼠給予指定量未加工PBMC (無接觸PBMC)或B-E組給予指定量經加工PBMC之R.O.注射。
表8
| 組 | hPBMC移植(第0天) | 初打條件(第0天) | 加打條件(第7天) | NSG dKO小鼠之數目 | 注射體積 |
| A | 10M無接觸PBMC | - | 5M無接觸PBMC | 5 | 100 µL/小鼠 |
| B | 9M無接觸PBMC | 1M eAPC-pp65 PBMC | 1M eAPC-pp65 PBMC | 5 | |
| C | 5M無接觸PBMC | 5M eAPC-pp65 PBMC | 1M eAPC-pp65 PBMC | 5 | |
| D | 9M無接觸PBMC | 1M pp65 mRNA PBMC | 1M pp65 mRNA PBMC | 5 | |
| E | 5M無接觸PBMC | 5M pp65 mRNA PBMC | 5M pp65 mRNA PBMC | 5 |
在第12天，藉由頜下血液收集(SMB)向無菌EDTA真空管中放血，自小鼠收集血液。用含HLA-A*02 pp65四聚體(NLVPMVATV；SEQ ID NO:88)之FACS緩衝液以以下比率進行2×表面染色：
● 1:25稀釋小鼠FcR嵌段
● 1:100稀釋抗體
● 1:20稀釋HLA-A*02 pp65四聚體(NLVPMVATV；SEQ ID NO:88)
特定言之，將100 μL全血及100 μL 2×表面染色添加至14 ml FACs管中，且在黑暗中在室溫下培育30分鐘。將2 mL 1×BD™ FACS裂解溶液(用diH
2O1:10稀釋)添加至各管中。接著將試管輕緩地渦旋且在室溫下在黑暗中培育10分鐘。隨後在室溫下在400 rcf下將細胞離心5分鐘。抽吸上清液且將細胞再懸浮於0.2 mL FACS緩衝液中。再次在室溫下在500 rcf下將細胞離心4分鐘。傾析上清液且再懸浮於0.2 mL FACS緩衝液中。用如上文所描述之試劑進行pp65四聚體染色。
在第14天，使小鼠安樂死，藉由末端放血收集血液且收集脾臟。如胞內細胞介素染色(ICS)，用收集之樣品進行pp65四聚體染色。在具有1 mL R10介質之管中收集脾臟。將個別脾臟置放在50 mL錐形管上之40 μm細胞過濾器上。使用注射器活塞壓迫脾臟通過過濾器。所得材料用冷FACS分離緩衝液洗滌洗滌通過過濾器。隨後用至多15 mL之FACS分離緩衝液填充各管。將細胞在室溫下在500 rcf下離心5分鐘。抽吸上清液且將細胞再懸浮於0.5 mL R10培養基中。
在染色之前，在4℃下使pp65四聚體在14000 rcf下離心5分鐘。將100 μL濃度為2×10
7個細胞/毫升之細胞轉移至96孔V形底盤中。使培養盤在室溫下在500 rcf下離心4分鐘。傾析上清液且用200 μL PBS洗滌細胞。傾析上清液且使用50 μL活/死近紅外稀釋於PBS (1:1000)中的活/死可固定近紅外死細胞染色套組使細胞再懸浮。將細胞在室溫下在黑暗中培育10分鐘。pp65四聚體及FcR嵌段混合物之混合物用各自在FACs緩衝液中之1:25稀釋液製備。類似地，僅FcR嵌段之混合物在FACS緩衝液中以1:25之稀釋度製備且用於螢光減一(FMO)對照。將細胞在黑暗中培育30分鐘。針對下文所列之FACS緩衝液中抗體中之每一者，以1:75稀釋比製備抗體表面染色混合物：
抗小鼠CD45
抗人類CD45
抗人類CD3
抗人類CD8
抗人類CD45RO
將50 μL表面染色混合物添加至細胞懸浮液中且在黑暗中在室溫下培育15分鐘。隨後，將50 μL FACS緩衝液添加至各孔中。將細胞在室溫下在500 rcf下離心4分鐘。傾析上清液且用200 μL FACS緩衝液洗滌細胞。將細胞在室溫下在500 rcf下離心4分鐘。傾析上清液且將細胞再懸浮於200 μL FACS緩衝液中。以100 μL/min在Attune NxT流式細胞儀上運行150 μL樣品。
對於ICS，細胞(1)未經再刺激；(2)用pp65最小抗原決定基再刺激；或(3)在GolgiPlug™及GolgiStop™存在下，在37℃、5% CO
2培育箱中用1 μM PMA/離子黴素再刺激6小時。在再刺激總共6小時之後，將細胞轉移至96孔V形底盤中。將細胞在室溫下在500 rcf下離心4分鐘。傾析上清液且將細胞用200 μL PBS再懸浮。將細胞在室溫下在500 rcf下離心4分鐘。活/死近紅外稀釋於PBS (1:1000)中在PBS中製備。添加Golgiplug™ (1:500)及Golgistop™ (1:750)。傾析上清液且將細胞再懸浮於稀釋50 μL活/死近紅外稀釋於PBS (1:1000)中及Golgiplug™及Golgistop™混合物中。將細胞在黑暗中在室溫下培育10分鐘。
對於下文所列之抗體中之每一者，以1:100稀釋比製備抗體表面染色混合物，其中人類FcR阻斷(1:50稀釋)及Golgiplug™ (1:500)及Golgistop™ (1:750)：
抗小鼠CD45
抗人類CD45
抗人類CD3
抗人類CD8
抗人類CD45RO
除活/死近紅外稀釋於PBS (1:1000)染色中以外，添加50 μL表面抗體染色。將細胞在黑暗中在室溫下培育15分鐘。添加100 μL FACS緩衝液且細胞在室溫下以500 rcf離心4分鐘。細胞用200 μL FACS緩衝液洗滌且在室溫下在500 rcf下離心4分鐘。傾析上清液且將細胞再懸浮於100 μL BD CytoFix/CytoPerm™固定及滲透溶液中。將細胞在黑暗中在4℃下培育20分鐘。培育之後，添加100 μL 1×滲透/洗滌緩衝液。將細胞在室溫下在500 rcf下離心4分鐘。傾析上清液且將細胞再懸浮於200 μL 1×滲透/洗滌緩衝液中。將細胞在室溫下在500 rcf下離心4分鐘。傾析上清液且將細胞再懸浮於200 μL 1×BD™滲透/洗滌緩衝液中。培養盤在4℃下培育隔夜。
接著次日將細胞染色以表現IFNγ、TFNα、IL-2。在室溫下在500crf下使細胞離心4分鐘。在1×滲透/洗滌緩衝液中針對抗IFNγ、抗TFNα或抗IL-2以1:100稀釋比製備抗體表面染色混合物。將細胞再懸浮於50 μL抗體染色混合物中。將細胞在黑暗中在4℃下培育30分鐘。在培育之後，添加150 μL 1×滲透/洗滌緩衝液，且將細胞再次在室溫下以500 rcf離心4分鐘。將細胞再懸浮於200 μL FACS緩衝液中。以100 μL/min之流動速率對Attune NxT流式細胞儀上運行150 μL樣品。
結果
如圖43A、圖43B、圖43C、圖43D、圖43E中所示，與用未加工PBMC (無接觸)免疫接種之小鼠相比，用eAPC-CMV細胞(擠壓裝載有編碼pp65及信號2/3介體之mRNA的PBMC)免疫接種之小鼠中pp65抗原特異性T細胞顯著增加。如圖43E中所示，在比較用1×10
6相對於5×10
6eAPC-CMV細胞免疫接種之NSG MHC-I/II DKO小鼠時，pp65四聚體+ T細胞百分比存在劑量依賴性增加。當量測在用pp65最小抗原決定基池再刺激之後TNF-α及IFNγ產生T細胞的百分比時，觀測到類似劑量依賴性(圖43H及圖43K)。另外，與用僅5×10
6個pp65 mRNA細胞(擠壓裝載有編碼僅pp65之mRNA的PBMC)免疫接種之小鼠相比，用5×10
6個eAPC-CMV細胞免疫接種之小鼠傾向於具有較高百分比之pp65四聚體+細胞(圖43A，圖43C，圖43D)以及較高百分比之TNF產生及IFNγ產生T細胞(圖43F，圖43G，圖43I，圖43J)總體而言，此資料表明用編碼pp65、CD86、mbIL-2及mbIL-12之mRNA擠壓的人類PBMC可刺激及擴增活體內人類化小鼠模型中之抗原特異性T細胞。
序列表
| SEQ ID NO | 序列 | 描述 |
| 1 | TIHDIILECV | HPV16-E6(29-38)，人類抗原決定基 |
| 2 | EVYDFAFRDL | HPV16-E6(48-57)，鼠類抗原決定基 |
| 3 | YMLDLQPETT | HPV16-E7(11-20)，人類抗原決定基 |
| 4 | RAHYNIVTF | HPV16-E7(49-57)，鼠類抗原決定基 |
| 5 | LPQL S TELQT | HPV16-E6(19-28) N端多肽，人類 |
| 6 | QLCTELQT | HPV16-E6(21-28) N端多肽，人類 |
| 7 | KQQLLRR | HPV16-E6(41-47) N端多肽，天然鼠類 |
| 8 | VYSKQQLLRR | HPV16-E6(38-47) N端多肽，經典鼠類 |
| 9 | MHGDTPTLHE | HPV16-E7(1-10) N端多肽，人類 |
| 10 | GQAEPD | HPV16-E7(43-48) N端多肽，鼠類 |
| 11 | Y S KQQLLRREVYDFAF | HPV16-E6(39-54) C端多肽，人類 |
| 12 | YCKQQLL | HPV16-E6(39-45) C端多肽，人類 |
| 13 | CIVYRDGN | HPV16-E6(58-65) C端多肽，天然鼠類 |
| 14 | SIVYRDGNPYAVSDK | HPV16-E6(58-72) C端多肽，經典鼠類 |
| 15 | DLYCYEQLNDSSEEE | HPV16-E7(21-35) C端多肽，人類 |
| 16 | CCKCDSTLRLCVQSTHVDIR | HPV16-E7(58-77 C端多肽，天然鼠類 |
| 17 | SSKSDSTLRLSVQSTHVDIR | HPV16-E7(58-77) C端多肽，經典鼠類 |
| 18 | LPQLSTELQTTIHDIILECVYSKQQLLRREVYDFAF | HPV16-E6(19-54) SLP，人類 |
| 19 | QLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLL | HPV16-E6(21-45) SLP，人類 |
| 20 | KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN | HPV16-E6(41-65) SLP，天然鼠類 |
| 21 | VYSKQQLLRREVYDFAFRDLSIVYRDGNPYAVSDK | HPV16-E6(38-72) SLP，經典鼠類 |
| 22 | MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE | HPV16-E7(1-35) SLP，人類 |
| 23 | QLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL | HPV16-E7.6 SLP，人類 |
| 24 | GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR | HPV16-E7(43-77) SLP，天然鼠類 |
| 25 | GQAEPDRAHYNIVTFSSKSDSTLRLSVQSTHVDIR | HPV16-E7(43-77) SLP，經典鼠類 |
| 26 | ggGGTCAACGTTGAgggggg 大寫字母中展示之鹼基為磷酸二酯，且在小寫字母中展示之鹼基為硫代磷酸酯 | ODN 1585 (A類，小鼠特異性) |
| 27 | ggGGGACGA:TCGTCgggggg 大寫字母中展示之鹼基為磷酸二酯，且在小寫字母中展示之鹼基為硫代磷酸酯 | ODN 2216 (A類，人類選擇性) |
| 28 | gggGACGAC:GTCGTGgggggg 大寫字母中展示之鹼基為磷酸二酯，且在小寫字母中展示之鹼基為硫代磷酸酯 | ODN 2336 (A類，人類較佳) |
| 29 | tccatgacgttcctgatgct 大寫字母中展示之鹼基為磷酸二酯，且在小寫字母中展示之鹼基為硫代磷酸酯 | ODN 1668 (B類，小鼠特異性) |
| 30 | tccatgacgttcctgacgtt 鹼基為硫代磷酸酯 | ODN 1826 (B類，小鼠特異性) |
| 31 | tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt 鹼基為硫代磷酸酯 | ODN 2006 (B類，人類選擇性) |
| 32 | tcg tcg ttg tcg ttt tgt cgt t 鹼基為硫代磷酸酯 | ODN 2007 (B類，牛/豬) |
| 33 | tcg acg ttc gtc gtt cgt cgt tc 鹼基為硫代磷酸酯 | ODN BW006 (B類，人類及小鼠) |
| 34 | tcg cga cgt tcg ccc gac gtt cgg ta 鹼基為硫代磷酸酯 | ODN D-SL01 (B類，多物種) |
| 35 | tcgtcgttttcggcgc:gcgccg 鹼基為硫代磷酸酯 | ODN 2395 (C類，人類/小鼠) |
| 36 | tcgtcgtcgttc:gaacgacgttgat 鹼基為硫代磷酸酯 | ODN M362 (C類，人類/小鼠) |
| 37 | tcg cga acg ttc gcc gcg ttc gaa cgc gg 鹼基為硫代磷酸酯 | ODN D-SL03 (C類，多物種) |
| 38 | MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEE | E7 |
| 39 | LYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVT | E7 |
| 40 | GQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIR | E7 |
| 41 | TLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | E7 |
| 42 | MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHD | E6 |
| 43 | LPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVY | E6 |
| 44 | KQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGN | E6 |
| 45 | RDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKI | E6 |
| 46 | DKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTL | E6 |
| 47 | HYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIR | E6 |
| 48 | YGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEK | E6 |
| 49 | RCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWT | E6 |
| 50 | DKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL | E6 |
| 51 | MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIV YRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPE EKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL | E6蛋白(全長) |
| 52 | MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | E7蛋白(全長) |
| 53 | MRTALGDIGNMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | 具有D-盒破壞模體之E7蛋白(D-盒E7) |
| 54 | MRVTAPRTLILLLSGALALTETWAGSMHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKPIVGIVAGLAVLAVVVIGAVVATVMCRRKSSGGKGGSYSQAASSDSAQGSDVSLTA | 具有sec/MITD域之E7蛋白(sec/MITD E7) |
| 55 | MHGDAPALHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP | 具有推定NLS突變之E7蛋白(NLS E7) |
| 56 | MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKPKEKEKNKLKRKKLENKDKKDEERNKIREE | 具有C端KEKE模體之E7蛋白(C端KEKE E7) |
| 57 | MQLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL | E7.6 SLP |
| 58 | MQLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLLGGGGSQLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLLGGGGSQLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLLGGGGSQLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLLGGGGSQLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLLGGGGSQLCTELQTYMLDLQPETTYCKQQLL | 具有6重複序列之E7.6 SLP |
| 59 | ATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACAGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAATATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTTGCTTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAATCCATATGCTGTATGTGATAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACATTATTGTTATAGTTTGTATGGAACAACATTA GAACAGCAATACAACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATTAGGTGTATTAACTGTCAA AAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGACAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGTGGACCGGTCGATGTATGTCTTGTTGCAGATCATCAAGAACACGTAGAGAAACCCAGCTGTAA | E6天然mRNA |
| 60 | ATGCACCAGAAACGGACCGCCATGTTCCAGGATCCTCAAGAGAGGCCCAGAAAGCTGCCTCAGCTGTGTACCGAGCTGCAGACCACCATCCACGACATCATCCTGGAATGCGTGTACTGCAAGCAGCAGCTCCTGCGGAGAGAGGTGTACGATTTCGCCTTCCGGGACCTGTGCATCGTGTACAGAGATGGCAACCCCTACGCCGTGTGCGACAAGTGCCTGAAGTTCTACAGCAAGATCAGCGAGTACCGGCACTACTGCTACAGCCTGTACGGCACCACACTGGAACAGCAGTACAACAAGCCCCTGTGCGACCTGCTGATCCGGTGCATCAACTGCCAGAAACCTCTGTGCCCCGAGGAAAAGCAGCGGCACCTGGACAAGAAGCAGCGGTTCCACAACATCAGAGGCCGGTGGACCGGCAGATGCATGAGCTGTTGTCGGAGCAGCAGAACCAGACGGGAAACCCAGCTGTGA | 密碼子最佳化E6 mRNA |
| 61 | ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAA | 天然E7 mRNA |
| 62 | ATGAGAACAGCTCTTGGGGACATTGGTAACCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAGGATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAA | D-盒E7 mRNA |
| 63 | ATGCACGGCGACACCCCTACCCTGCACGAGTACATGCTGGACCTGCAGCCTGAGACAACCGACCTGTACTGCTACGAGCAGCTGAACGACAGCAGCGAGGAAGAGGACGAGATCGACGGCCCTGCCGGCCAGGCCGAGCCTGATAGAGCCCACTACAACATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACAGCACCCTGAGACTGTGCGTGCAGAGCACACACGTGGACATCAGAACCCTGGAAGATCTGCTGATGGGCACCTTGGGCATCGTGTGCCCCATCTGCAGCCAGAAGCCTTG | 密碼子最佳化E7 mRNA v1 (CO v1) |
| 64 | ATGCACGGCGATACCCCTACACTGCACGAGTACATGCTGGACCTGCAGCCTGAGACAACCGACCTGTACTGCTACGAGCAGCTGAACGACAGCAGCGAGGAAGAGGACGAGATTGACGGACCTGCCGGACAGGCCGAACCTGATAGAGCCCACTACAATATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACAGCACCCTGAGACTGTGTGTGCAGAGCACCCACGTGGACATCAGAACCCTGGAAGATCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATCGTGTGCCCTATCTGTAGCCAGAAGCCTTGA | 密碼子最佳化E7 mRNA v2 (CO v2) |
| 65 | ATGAGAGTGACAGCCCCTCGGACACTGATCCTGCTGCTTTCTGGTGCCCTGGCTCTGACAGAAACATGGGCCGGATCTATGCACGGCGATACCCCTACACTGCACGAGTACATGCTGGACCTGCAGCCTGAGACAACCGACCTGTACTGCTACGAGCAGCTGAACGACAGCAGCGAGGAAGAGGACGAGATTGACGGACCTGCCGGACAGGCCGAACCTGATAGAGCCCACTACAATATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACAGCACCCTGAGACTGTGTGTGCAGAGCACCCACGTGGACATCAGAACCCTGGAAGATCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATCGTGTGCCCTATCTGTAGCCAGAAGCCTATCGTGGGAATCGTGGCCGGACTGGCTGTGCTGGCAGTGGTGGTTATTGGAGCCGTGGTGGCCACAGTGATGTGCAGAAGAAAGAGCAGCGGCGGCAAAGGCGGCAGCTATTCTCAGGCCGCCTCTAGCGATTCTGCCCAGGGAAGTGATGTGTCCCTGACAGCTTGA | 具有sec/MITD域mRNA之E7密碼子opt v2 (sec/MITD E7 CO) |
| 66 | ATGAGAACAGCTCTCGGCGACATCGGCAACATGCACGGCGATACCCCTACACTGCACGAGTACATGCTGGACCTGCAGCCTGAGACAACCGACCTGTACTGCTACGAGCAGCTGAACGACAGCAGCGAGGAAGAGGACGAGATTGACGGACCTGCCGGACAGGCCGAACCTGATAGAGCCCACTACAATATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACAGCACCCTGAGACTGTGTGTGCAGAGCACCCACGTGGACATCAGAACCCTGGAAGATCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATCGTGTGCCCTATCTGTAGCCAGAAGCCTTGA | 具有D-盒模體mRNA之E7密碼子opt. v2 (D-盒E7 CO) |
| 67 | ATGCACGGCGATACCCCTACACTGCACGAGTACATGCTGGACCTGCAGCCTGAGACAACCGACCTGTACTGCTACGAGCAGCTGAACGACAGCAGCGAGGAAGAGGACGAGATTGACGGACCTGCCGGACAGGCCGAACCTGATAGAGCCCACTACAATATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACAGCACCCTGAGACTGTGTGTGCAGAGCACCCACGTGGACATCAGAACCCTGGAAGATCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATCGTGTGCCCTATCTGTAGCCAGAAGCCTAAAGAGAAAGAGAAGAACAAGCTGAAGCGGAAGAAGCTCGAGAACAAGGACAAGAAGGACGAGGAACGGAACAAGATCCGGGAAGAGTGA | 具有C端KEKE mRNA v2之E7密碼子opt. v2 (C端KEKE E7 CO) |
| 68 | ATGCAGCTGTGTACCGAGCTGCAGACCTACATGCTGGACCTGCAGCCTGAGACAACCTACTGCAAGCAGCAACTGCTTTGA | E7.6 SLP mRNA |
| 69 | ATGCAGCTGTGTACCGAGCTGCAGACCTACATGCTGGACCTGCAGCCTGAGACAACCTACTGCAAGCAGCAACTGCTTGGCGGCGGAGGCTCTCAGCTCTGTACTGAACTCCAGACATATATGCTCGATCTCCAGCCAGAAACCACGTACTGTAAACAGCAGCTCCTCGGAGGCGGCGGATCTCAACTGTGCACCGAACTGCAAACTTATATGTTGGATCTGCAACCCGAAACCACATATTGCAAGCAACAGTTGCTCGGTGGCGGTGGCAGTCAGTTGTGCACAGAACTTCAGACTTACATGCTTGATCTTCAGCCCGAAACGACCTATTGCAAACAGCAGCTTCTTGGCGGAGGCGGCAGCCAGTTGTGTACTGAGCTTCAAACTTATATGCTTGACCTCCAACCAGAGACTACTTACTGCAAACAACAACTCCTCGGCGGTGGTGGAAGCCAGCTCTGCACGGAATTGCAGACCTATATGCTCGACTTGCAACCGGAAACGACGTACTGCAAACAACAGCTGCTGTGA | E7.6 SLP重複序列x6 mRNA |
| 70 | ATGCACGGCGATGCCCCTGCCCTGCACGAGTACATGCTGGACCTGCAGCCTGAGACAACCGACCTGTACTGCTACGAGCAGCTGAACGACAGCAGCGAGGAAGAGGACGAGATTGACGGACCTGCCGGACAGGCCGAACCTGATAGAGCCCACTACAATATCGTGACCTTCTGCTGCAAGTGCGACAGCACCCTGAGACTGTGTGTGCAGAGCACCCACGTGGACATCAGAACCCTGGAAGATCTGCTGATGGGCACCCTGGGCATCGTGTGCCCTATCTGTAGCCAGAAGCCTTGA | 具有NLS突變之E7密碼子Opt. v2 (NLS E7 CO) |
| 71 | ATGATGGTGGACGGCGACAACAGCCACGTGGAAATGAAGCTGGCCGTGGACGAGGAAGAGAACGCCGACAACAACACCAAGGCCAACGTGACCAAGCCTAAGAGATGCAGCGGCAGCATCTGCTACGGCACAATCGCCGTGATCGTGTTCTTCCTGATCGGCTTTATGATCGGCTACCTGGGCTACTGCAAGAGCAGTGATGGACCTGGCGAAACAGGCGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGCGGTGGCGGCGGATCTTGTGATCTGCCTCAGACACACAGCCTGGGCAGCAGACGAACACTGATGCTGCTGGCCCAGATGCGGAAGATCAGCCTGTTCAGCTGCCTGAAGGACCGGCACGATTTCGGCTTCCCTCAAGAGGAATTCGGCAACCAGTTCCAGAAGGCCGAGACAATCCCTGTGCTGCACGAGATGATCCAGCAGATCTTCAACCTGTTCTCCACCAAGGACAGCAGCGCCGCCTGGGATGAGACACTGCTGGACAAGTTCTACACCGAGCTGTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGCGTGATCCAAGGCGTGGGAGTGACAGAGACACCCCTGATGAAGGAAGATAGCATCCTGGCCGTGCGCAAGTACTTCCAGCGGATCACCCTGTACCTGAAAGAGAAGAAGTACAGCCCCTGCGCCTGGGAAGTCGTGCGGGCCGAAATCATGAGAAGCTTCAGCCTGAGCACCAACCTGCAAGAGAGCCTGCGGAGCAAAGAGTGA | TFRC_G4S_IFN-a2a mRNA |
| 72 | ATGATGGTGGACGGCGACAACAGCCACGTGGAAATGAAGCTGGCCGTGGACGAGGAAGAGAACGCCGACAACAACACCAAGGCCAACGTGACCAAGCCTAAGAGATGCAGCGGCAGCATCTGCTACGGCACAATCGCCGTGATCGTGTTCTTCCTGATCGGCTTTATGATCGGCTACCTGGGCTACTGCAAGAGCAGTGATGGACCTGGCGAAACAGGCGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGCGGAGGTTCTATTTGGGAGCTGAAGAAAGACGTGTACGTGGTGGAACTGGACTGGTATCCCGATGCTCCTGGCGAGATGGTGGTGCTGACCTGCGATACCCCTGAAGAGGACGGCATCACCTGGACACTGGATCAGTCTAGCGAGGTGCTCGGCAGCGGCAAGACCCTGACCATCCAAGTGAAAGAGTTTGGCGACGCCGGCCAGTACACCTGTCACAAAGGCGGAGAAGTGCTGAGCCACAGCCTGCTGCTGCTCCACAAGAAAGAGGATGGCATTTGGAGCACCGACATCCTGAAGGACCAGAAAGAGCCCAAGAACAAGACCTTCCTGAGATGCGAGGCCAAGAACTACAGCGGCCGGTTCACATGTTGGTGGCTGACCACCATCAGCACCGACCTGACCTTCAGCGTGAAGTCCAGCAGAGGCAGCAGTGATCCTCAGGGCGTTACATGTGGCGCCGCTACACTGTCTGCCGAAAGAGTGCGGGGCGATAACAAAGAATACGAGTACAGCGTGGAATGCCAAGAGGACAGCGCCTGTCCAGCCGCCGAAGAGTCTCTGCCTATCGAAGTGATGGTCGACGCCGTGCACAAGCTGAAGTACGAGAACTACACCAGCAGCTTTTTCATCCGGGACATCATCAAGCCCGATCCTCCAAAGAACCTGCAGCTGAAGCCTCTGAAGAACAGCAGACAGGTGGAAGTGTCCTGGGAGTACCCCGACACCTGGTCTACACCCCACAGCTACTTCAGCCTGACCTTTTGCGTGCAAGTGCAGGGCAAGTCCAAGCGCGAGAAAAAGGACCGGGTGTTCACCGACAAGACCAGCGCCACCGTGATCTGCAGAAAGAACGCCAGCATCAGCGTCAGAGCCCAGGACCGGTACTACAGCAGCTCTTGGAGCGAATGGGCCAGCGTGCCATGTAGCGGAGGTGGTGGTAGCGGAGGCGGCGGAAGCGGCGGTGGTGGATCAGGTGGTGGTGGCTCTAGAAACCTGCCAGTGGCTACCCCTGATCCTGGCATGTTCCCTTGTCTGCACCACAGCCAGAACCTGCTGAGAGCCGTGTCCAACATGCTGCAGAAGGCCAGACAGACCCTGGAATTCTACCCCTGCACCAGCGAGGAAATCGACCACGAGGACATCACCAAGGATAAGACCAGCACCGTGGAAGCCTGCCTGCCTCTGGAACTGACCAAGAACGAGAGCTGCCTGAACAGCCGGGAAACCTCCTTCATCACCAACGGCTCTTGCCTGGCCAGCAGAAAGACAAGCTTCATGATGGCCCTGTGCCTGAGCAGCATCTACGAGGACCTGAAGATGTACCAGGTGGAATTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTGATGGACCCCAAGCGGCAGATCTTCCTGGACCAGAACATGCTGGCTGTGATCGACGAGCTGATGCAGGCCCTGAACTTCAACAGCGAGACAGTGCCCCAGAAGTCTAGCCTGGAAGAACCCGACTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGCATCCTGCTGCACGCCTTCCGGATCAGAGCCGTGACCATCGACAGAGTGATGAGCTACCTGAACGCCTCCTGA | TFRC_G4S_IL-12 mRNA |
| 73 | (G 4S) 3 | G 4S連接子 |
| 74 | (EAAAK)3 | EAAAK連接子 |
| 75 | (G 4S) n | G 4S連接子 |
| 76 | (EAAAK)n | EAAAK連接子 |
| 77 | MMVDGDNSHVEMKLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIAVIVFFLIGFMIGYLGYCKSSDGPGETG GGGGSGGGGSGGGGS APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTL | TFRC_G4S_IL-2 |
| 78 | MLKKRGNHSTGLCLLVMFFMVLVALVGLGLGMFQLFHLQKETG GGGGSGGGGSGGGGS APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT | FasL_G4S_IL-2 |
| 79 | MMVDGDNSHVEMKLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIAVIVFFLIGFMIGYLGYCKSSDGPGETG GGGGSGGGGSGGGGS IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS | TFRC_G4S_IL-12 |
| 80 | MMVDGDNSHVEMKLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIAVIVFFLIGFMIGYLGYCKSSDGPGETG GGGGSGGGGSGGGGS CDLPQTHSLGSRRTLMLLAQMRKISLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQFQKAETIPVLHEMIQQIFNLFSTKDSSAAWDETLLDKFYTELYQQLNDLEACVIQGVGVTETPLMKEDSILAVRKYFQRITLYLKEKKYSPCAWEVVRAEIMRSFSLSTNLQESLRSKE | TFRC_G4S_IFN-a2a |
| 81 | MMVDGDNSHVEMKLAVDEEENADNNTKANVTKPKRCSGSICYGTIAVIVFFLIGFMIGYLGYCKSSDGPGETG | TFRC域 |
| 82 | MLKKRGNHSTGLCLLVMFFMVLVALVGLGLGMFQLFHLQKETG | FasL域 |
| 83 | ATGAGCCTGCTGACCGAAGTGGAAACCTATGTGCTGAGCATTGTGCCGAGCGGCCCGCTGAAAGCGGAAATTGCGCAGCGCCTGGAAGATGTGTTTGCGGGCAAAAACACCGATCTGGAAGTGCTGATGGAATGGCTGAAAACCCGCCCGATTCTGAGCCCGCTGACCAAAGGCATTCTGGGCTTTGTGTTTACCCTGACCGTGCCGAGCGAACGCGGCCTGCAGCGCCGCCGCTTTGTGCAGAACGCGCTGAACGGCAACGGCGATCCGAACAACATGGATAAAGCGGTGAAACTGTATCGCAAACTGAAACGCGAAATTACCTTTCATGGCGCGAAAGAAATTGCGCTGAGCTATAGCGCGGGCGCGCTGGCGAGCTGCATGGGCCTGATTTATAACCGCATGGGCGCGGTGACCACCGAAGTGGCGTTTGGCCTGGTGTGCGCGACCTGCGAACAGATTGCGGATAGCCAGCATCGCAGCCATCGCCAGATGGTGACCACCACCAACCCGCTGATTCGCCATGAAAACCGCATGGTGCTGGCGAGCACCACCGCGAAAGCGATGGAACAGATGGCGGGCAGCAGCGAACAGGCGGCGGAAGCGATGGATATTGCGAGCCAGGCGCGCCAGATGGTGCAGGCGATGCGCACCATTGGCACCCATCCGAGCAGCAGCGCGGGCCTGAAAGATGATCTGCTGGAAAACCTGCAGGCGTATCAGAAACGCATGGGCGTGCAGATGCAGCGCTTTAAA | 流感M1 mRNA (天然序列) |
| 84 | ATGTCTCTGCTGACCGAGGTCGAGACATACGTGCTGAGCATCGTGCCTAGCGGCCCTCTGAAGGCCGAGATCGCCCAGAGACTGGAAGATGTGTTCGCCGGCAAGAACACCGACCTGGAAGTGCTGATGGAATGGCTGAAAACCAGACCTATCCTGAGCCCCCTGACAAAGGGCATCCTGGGCTTCGTGTTCACCCTGACCGTGCCAAGCGAGAGAGGCCTGCAGCGCAGAAGGTTCGTGCAGAACGCCCTCAACGGCAATGGCGACCCCAACAACATGGATAAGGCTGTGAAGCTGTATAGAAAGCTGAAAAGAGAGATCACATTTCACGGCGCTAAAGAGATTGCCCTCTCCTACAGCGCCGGAGCCCTGGCTTCTTGTATGGGACTGATCTACAACAGAATGGGAGCCGTGACCACCGAGGTGGCCTTCGGCCTGGTGTGCGCCACATGCGAGCAAATCGCAGATAGCCAGCACAGAAGCCATCGGCAGATGGTCACCACAACAAACCCTCTGATCCGGCACGAGAACCGGATGGTGCTGGCCAGCACCACCGCCAAGGCCATGGAACAGATGGCCGGCAGCTCTGAGCAGGCCGCTGAAGCCATGGACATCGCCAGCCAGGCTAGACAGATGGTTCAGGCCATGAGAACCATCGGCACCCACCCTTCTAGCTCCGCCGGACTGAAGGACGACCTGCTGGAAAATCTGCAAGCCTACCAGAAGCGGATGGGCGTGCAGATGCAGCGGTTTAAGTAG | 流感M1 mRNA (密碼子最佳化) |
| 85 | ATGGAAAGCAGAGGCAGACGGTGCCCCGAGATGATCTCTGTGCTGGGCCCTATCTCTGGCCACGTGCTGAAGGCCGTGTTCAGCAGAGGCGATACACCTGTGCTGCCCCACGAGACAAGACTGCTGCAGACAGGCATCCATGTGCGGGTGTCACAGCCTAGCCTGATCCTGGTGTCTCAGTACACCCCTGACAGCACCCCTTGTCACAGAGGCGACAATCAGCTGCAGGTCCAGCACACCTACTTCACCGGCAGCGAGGTGGAAAACGTGTCCGTGAACGTGCACAATCCCACCGGCAGATCCATCTGTCCCAGCCAAGAGCCTATGAGCATCTACGTGTACGCCCTGCCTCTGAAGATGCTGAACATCCCCAGCATCAATGTGCATCACTACCCCTCTGCCGCCGAGCGGAAACACAGACATCTGCCTGTGGCCGATGCCGTGATTCACGCCTCTGGCAAACAGATGTGGCAGGCCAGACTGACAGTGTCCGGACTGGCTTGGACCAGACAGCAGAACCAGTGGAAAGAACCCGACGTGTACTACACCAGCGCCTTCGTGTTCCCCACCAAGGATGTGGCCCTGAGACACGTTGTGTGCGCCCACGAACTCGTGTGCAGCATGGAAAACACCCGGGCCACCAAGATGCAAGTGATCGGCGACCAGTACGTGAAGGTGTACCTGGAAAGCTTCTGCGAGGATGTGCCCAGCGGCAAGCTGTTCATGCACGTGACACTGGGCTCCGACGTGGAAGAGGACCTGACCATGACCAGAAATCCCCAGCCTTTCATGCGGCCTCACGAGAGAAATGGCTTCACCGTGCTGTGCCCCAAGAACATGATCATCAAGCCCGGCAAGATCAGCCACATCATGCTGGACGTGGCCTTCACCAGCCACGAGCACTTTGGACTGCTGTGTCCTAAGAGCATCCCCGGCCTGAGCATCAGCGGCAACCTGCTGATGAATGGCCAGCAGATCTTCCTGGAAGTGCAGGCCATCCGGGAAACCGTGGAACTGAGACAGTACGACCCTGTGGCTGCCCTGTTCTTCTTCGACATCGACCTGCTGCTCCAGAGAGGCCCTCAGTACTCTGAGCACCCCACCTTTACCAGCCAGTACCGGATCCAGGGAAAGCTGGAATACCGGCACACCTGGGATAGACACGATGAAGGTGCTGCCCAGGGCGACGATGATGTGTGGACAAGCGGCAGCGATAGCGACGAGGAACTGGTCACCACCGAGAGAAAGACCCCTAGAGTTACAGGCGGAGGCGCTATGGCTGGCGCCTCTACATCTGCCGGACGGAAGAGAAAGAGCGCCTCTTCTGCCACCGCCTGTACAAGCGGCGTGATGACAAGAGGCAGGCTGAAAGCCGAGAGCACAGTGGCCCCTGAAGAGGACACAGACGAGGACAGCGACAACGAGATTCACAACCCCGCCGTGTTTACCTGGCCTCCTTGGCAGGCTGGAATCCTGGCCAGAAACCTGGTGCCTATGGTGGCCACAGTGCAGGGCCAGAACCTGAAGTACCAAGAGTTCTTCTGGGACGCCAACGACATCTACCGGATCTTCGCCGAACTGGAAGGCGTGTGGCAACCAGCCGCTCAGCCTAAGAGAAGAAGGCACAGACAAGACGCTCTGCCCGGACCTTGTATCGCCAGCACTCCCAAGAAGCACAGAGGCTGA | CMV pp65 mRNA (密碼子最佳化) |
圖1為展示膜結合細胞介素(IL-12、IFN-α2a)在擠壓裝載有編碼膜結合細胞介素之mRNA的PBMC中之表面表現的螢光圖。(G
4S)
3係SEQ ID NO: 73。
圖2為展示膜結合細胞介素(IL-12、IFN-α2a)在擠壓裝載有編碼膜結合細胞介素之mRNA的PBMC中之細胞介素信號傳導活性的圖式。(G
4S)
3係SEQ ID NO: 73。
圖3為展示膜結合IL-2在擠壓裝載有編碼膜結合IL-2之mRNA的PBMC中之表面表現持續時間的圖式。(G
4S)
3係SEQ ID NO: 73，(EA
3K)
3係SEQ ID NO:74。
圖4為展示膜結合IL-2在擠壓裝載有編碼膜結合IL-2之mRNA的PBMC中之細胞介素信號傳導活性的圖式。(G
4S)
3係SEQ ID NO: 86，(G
4S)
3係SEQ ID NO: 73，(EA
3K)
3係SEQ ID NO:74。
圖5為展示E7
11-20反應T細胞在與裝載有重組E7蛋白或E7.6 SLP之PBMC共培養後的IFN-γ分泌量的圖式。
圖6為西方墨點分析，展示擠壓裝載有天然E6 mRNA或密碼子最佳化E6 mRNA之PBMC的E6蛋白表現量。
圖7為西方墨點分析，展示擠壓裝載有密碼子最佳化E6 mRNA之PBMC的E6蛋白轉譯及表現之動力學。
圖8為西方墨點分析，展示藉由擠壓裝載有進一步編碼D-盒域的天然E7 mRNA、密碼子最佳化E7 mRNA或E7 mRNA之PBMC的E6蛋白動力學。
圖9為展示E7
11-20反應T細胞在與PBMC共培養後的IFN-γ分泌量的圖式，該等PBMC擠壓裝載有天然E7 mRNA、密碼子最佳化E7 mRNA或進一步編碼D-盒域之E7 mRNA。
圖10A及圖10B為展示E7
11-20反應T細胞在與PBMC分別共培養6小時或隔夜後的IFN-γ分泌量的圖式，該等PBMC擠壓裝載有編碼E7蛋白或E7 SLP之指定mRNA。
圖11A及圖11B為展示E7
11-20反應T細胞在與PBMC分別共培養6小時或隔夜後的IFN-γ分泌量的圖式，該等PBMC擠壓裝載有編碼E7蛋白之指定mRNA。
圖12A、圖12B含有展示PBMC中之CD-86表現及PBMC內之構成細胞類型的圖式，該等PBMC擠壓裝載有指定量的編碼CMV pp65抗原、CD86及/或膜結合IL-12 (mbIL-12)之mRNA。
圖13A、圖13B含有展示PBMC中之膜結合IL-12 (mbIL-12)表現及PBMC內之構成細胞類型的圖式，該等PBMC擠壓裝載有指定量的編碼CMV pp65抗原、CD86及/或mbIL-12之mRNA。
圖14為展示當PBMC擠壓裝載有指定量的編碼CMV pp65抗原、CD86及/或mbIL-12之mRNA時，CD3+CD8+反應T細胞群內IFN-γ+CD45RO+群體之百分比的圖式。
圖15為展示當PBMC擠壓裝載有指定量的編碼CMV pp65抗原、CD86及/或mbIL-12之mRNA且隨後經1 µM pp65抗原進一步再刺激時，CD3+CD8+反應T細胞群內IFN-γ+CD45RO+群體之百分比的圖式。
圖16A-圖16E展示當PBMC擠壓裝載有指定量的編碼CMV pp65抗原、CD86及/或mbIL-12之mRNA且隨後經1 µM pp65抗原進一步再刺激時，功能標記IFN-γ、IL-2、TNF-α、顆粒酶B、PD-1分別在活化反應T細胞群內之表現量的圖式。
圖17A、圖17B含有展示PBMC中之CD-86表現及PBMC內之構成細胞類型的圖式，該等PBMC擠壓裝載有指定量的編碼CMV pp65抗原、CD86及/或膜結合IL-12 (mbIL-12)之mRNA。
圖18A、圖18B含有展示PBMC中之膜結合IL-12 (mbIL-12)表現及PBMC內之構成細胞類型的圖式，該等PBMC擠壓裝載有指定量的編碼CMV pp65抗原、CD86及/或mbIL-12之mRNA。
圖19含有展示當PBMC擠壓裝載有指定量之編碼CMV pp65抗原、CD86及/或mbIL-12之mRNA且在存在或不存在CpG佐劑活化的情況下經進一步培養時，在CD3+CD8+反應T細胞內CMV pp65四聚體陽性反應T細胞之量及CMV pp65四聚體陽性群體之百分比的圖式。
圖20含有展示當PBMC擠壓裝載有指定量的編碼CMV pp65抗原、CD86及/或mbIL-12之mRNA，在用或不用1 µM pp65抗原再刺激的情況下經處理且在用或不用CpG佐劑調節的情況下經進一步培養時，在CD3+CD8+反應T細胞內CMV pp65四聚體陽性反應T細胞之量及CMV pp65四聚體陽性群體之百分比的圖式。
圖21A、圖21B、圖21C、圖21D、圖21E展示當PBMC擠壓裝載有指定量的編碼CMV pp65抗原、CD86及/或mbIL-12之mRNA時，功能標記顆粒酶B、IFN-γ、IL-2、TNF-α、PD-1分別在活化反應T細胞群內之表現量的圖式。
圖22A、圖22B含有展示分別在PBMC中之CD86表現細胞百分比及CD86表現量以及PBMC內之構成細胞類型的圖式，該等PBMC擠壓裝載有編碼CMV pp65抗原、CD86、膜結合IL-2 (mbIL-2)及/或膜結合IL-12 (mbIL-12)之指定mRNA。
圖23A、圖23B含有展示分別在PBMC中之膜結合IL-2 (mbIL-2)表現細胞百分比及mbIL-2表現量以及PBMC內之構成細胞類型的圖式，該等PBMC擠壓裝載有編碼CMV pp65抗原、CD86、膜結合IL-2 (mbIL-2)及/或膜結合IL-12 (mbIL-12)之指定mRNA。
圖24A、圖24B含有展示分別在PBMC中之膜結合IL-12 (mbIL-12)表現細胞百分比及mbIL-12表現量以及PBMC內之構成細胞類型的圖式，該等PBMC擠壓裝載有編碼CMV pp65抗原、CD86、膜結合IL-2 (mbIL-2)及/或膜結合IL-12 (mbIL-12)之指定mRNA。
圖25含有展示當PBMC擠壓裝載有編碼CMV pp65抗原、CD86、mbIL-2及/或mbIL-12之指定mRNA，在用或不用1 µM HLA-B*07限制性pp65抗原肽(B07肽再刺激)進一步再刺激時，CD3+CD8+反應T細胞內IFN-γ+群體量的圖式。
圖26為展示當PBMC擠壓裝載有編碼CMV pp65抗原、CD86、mbIL-2及/或mbIL-12之指定mRNA，在用或不用1 µM HLA-B*07限制性pp65抗原肽(B07肽再刺激)進一步再刺激時，CD3+CD8+反應T細胞內IFN-γ+CD45RO+群體量的圖式。
圖27A、圖27B為展示分別在PBMC中之CD86表現量及CD86表現細胞百分比的圖式，該等PBMC擠壓裝載有編碼CMV pp65抗原、CD86、膜結合IL-2 (mbIL-2)及/或膜結合IL-12 (mbIL-12)之指定mRNA。
圖27C、圖27D為展示分別在PBMC中之膜結合IL-2 (mbIL-2)表現量及mbIL-2表現細胞百分比的圖式，該等PBMC擠壓裝載有編碼CMV pp65抗原、CD86、膜結合IL-2 (mbIL-2)及/或膜結合IL-12 (mbIL-12)之指定mRNA。
圖27E、圖27F為展示分別在PBMC中之膜結合IL-2 (mbIL-2)表現量及mbIL-2表現細胞百分比的圖式，該等PBMC擠壓裝載有編碼CMV pp65抗原、CD86、膜結合IL-2 (mbIL-2)及/或膜結合IL-12 (mbIL-12)之指定mRNA。
圖28含有展示當PBMC擠壓裝載有編碼CMV pp65抗原、CD86、mbIL-2及/或mbIL-12之指定mRNA，在用或不用對HLA-A*01或HLA-B*07的限制(YSE(A01)、TPR(B07)或RPH(B07))具有特異性的1 µM pp65抗原肽進一步再刺激時，CD3+CD8+反應T細胞內IFN-γ+CD45RO+群體量的圖式。
圖29A、圖29B為展示分別在PBMC中之CD86表現細胞百分比及CD86表現量的圖式，該等PBMC擠壓裝載有指定量的編碼流感M1抗原、CD86、膜結合IL-2 (mbIL-2)及/或膜結合IL-12 (mbIL-12)之mRNA。
圖29C、圖29D為展示分別在PBMC中之膜結合IL-2 (mbIL-2)表現細胞百分比及mbIL-2表現量的圖式，該等PBMC擠壓裝載有指定量的編碼流感M1抗原、CD86、膜結合IL-2 (mbIL-2)及/或膜結合IL-12 (mbIL-12)之mRNA。
圖29E、圖29F為展示分別在PBMC中之膜結合IL-12 (mbIL-12)表現細胞百分比及mbIL-12表現量的圖式，該等PBMC擠壓裝載有指定量的編碼流感M1抗原、CD86、膜結合IL-2 (mbIL-2)及/或膜結合IL-12 (mbIL-12)之mRNA。
圖30為展示當PBMC擠壓裝載有指定量的編碼流感M1抗原、CD86、mbIL-2及/或mbIL-12之mRNA，在1 µM M1抗原肽進一步再刺激之情況下時，IFN-γ+CD45RO+ CD8 T細胞之量的圖式。
圖31為展示當PBMC擠壓裝載有指定量的編碼流感M1抗原、CD86、mbIL-2及/或mbIL-12之mRNA，在經由1 µM M1抗原肽進一步再刺激時，CD3+CD8+反應T細胞內IFN-γ+CD45RO+群體量的圖式。
圖32含有展示當PBMC擠壓裝載有指定量的編碼M1抗原、CD86、mbIL-2及/或mbIL-12之mRNA，在用或不用1 µM pp65抗原再刺激的情況下經處理且在用或不用CpG佐劑調節的情況下經進一步培養時，CD3+CD8+反應T細胞內流感M1四聚體陽性T細胞群之量的圖式。
圖33為展示實驗的示意圖，該實驗用於確定具有特異性HLA單倍型的擠壓裝載有編碼HPV16 E6之mRNA的PBMC是否可誘導抗原特異性T細胞反應。
圖34為E6
15-24反應T細胞之ELISPOT盤的影像，該等細胞與E6 mRNA擠壓裝載PBMC (E6 mRNA)、未經處理PBMC (無接觸)、模擬擠壓裝載PBMC (空擠壓)或外加有1 mM E6
15-24肽之無接觸PBMC (陽性對照)共培養，且根據製造商方案研發。
圖35展示在關於E6
15-24反應T細胞之IFN-γ ELISPOT分析中每種細胞之斑點形成單位(SFU)的平均量，該等細胞與E6 mRNA擠壓裝載PBMC (E6 mRNA)、外加1 mM E6
15-24肽之未經處理PBMC (陽性對照)共培養，且根據製造商方案研發。
圖36展示關於E6
15-24反應T細胞之IFN-γ ELISPOT分析中的平均斑點尺寸，該等細胞與E6 mRNA擠壓裝載PBMC (E6 mRNA)、未經處理PBMC (空擠壓)、模擬擠壓裝載PBMC (空擠壓)或外加有1 mM E6
15-24肽之未經處理PBMC (陽性對照)共培養，且根據製造商方案研發。
圖37為展示具有特異性HLA單倍型的擠壓裝載有E7 mRNA之PBMC可引發抗原特異性T細胞反應之時長的示意圖。
圖38A為展示關於E7
11-20反應T細胞之IFN-γ ELISA之結果的圖式，該等細胞與擠壓裝載有以下之PBMC共培養：(i) E7 mRNA，(ii) E7 mRNA及E6 mRNA，(iv) E7.6合成長肽(SLP)或(v)無負荷(空擠壓)，或與未經處理PBMC在E7
11-20肽(E7 Min抗原決定基)存在下共培養。
圖38B為展示關於E7
11-20反應T細胞之IFN-γ ELISA之結果的圖式，該等細胞與擠壓裝載有以下之PBMC共培養：(i) E7 mRNA，(ii) E7 mRNA及E6 mRNA，(iv) E7.6合成長肽(SLP)或(v)無負荷(空擠壓)，或與未經處理PBMC在E7
11-20肽(E7 Min抗原決定基)存在下共培養，其中在共培養前培養PBMC一段指定時間。
圖39A為展示關於E7
11-20反應T細胞之IFN-γ ELISA之結果的圖式，該等細胞與擠壓裝載有以下之PBMC共培養：(i) E7 mRNA，(ii) E7 mRNA及E6 mRNA，(iv) E7.6合成長肽(SLP)或(v)無負荷(空擠壓)，或與未經處理PBMC在E7
11-20肽(E7 Min抗原決定基)存在下共培養。
圖39B為展示關於E7
11-20反應T細胞之IFN-γ ELISA之結果的圖式，該等細胞與擠壓裝載有以下之PBMC共培養：(i) E7 mRNA，(ii) E7 mRNA及E6 mRNA，(iv) E7.6合成長肽(SLP)或(v)無負荷(空擠壓)，或與未經處理PBMC在E7
11-20肽(E7 Min抗原決定基)存在下共培養，其中在共培養前培養PBMC一段指定時間。
圖40為展示關於E6
29-38TCR Jurkat-Lucia NFAT細胞之QUANTI-Luc GOLD螢光素酶分析中的發光情況的圖式，該等細胞與擠壓裝載有以下之PBMC共培養：(i) 500 μg/ml E6 mRNA及500 μg/ml E7 mRNA，(ii)編碼CD86、膜結合IL-2 (mbIL-2)及膜結合IL-12 (mbIL-12)之mRNA，(iii) E6及E7 mRNA以及編碼CD86、mbIL-2及mbIL-12之mRNA，(iv) E6及E7合成長肽(SLP)或(v)無負荷(空擠壓)，或與未經處理PBMC在E6
29-38肽(E6 min抗原決定基)及/或E7最小肽(E7 Min抗原決定基)存在下共培養。
圖41A、圖41B為展示關於E6
29-38TCR Jurkat-Lucia NFAT細胞之QUANTI-Luc GOLD螢光素酶分析中的發光情況的圖式，該等細胞與擠壓裝載有以下之PBMC共培養：(i) E6 mRNA及E7 mRNA，(ii) E7.6及E6合成長肽(SLP)或(iii)無負荷(空擠壓)，或與未經處理PBMC在E6
29-38肽(E6 min抗原決定基)及/或E7最少肽(E7 Min抗原決定基)存在下共培養。
圖42A為展示在轉導E6
19-28TCR或E7
11-19TCR之後對E6或E7特異性T細胞之FACs分析的圖式。圖42B、圖42C為展示E6或E7特異性T細胞在與以下共培養之後之增加的圖式：E6+E7+sig 2/3 mRNA細胞(擠壓裝載有編碼E6、E7及信號2/3介體之mRNA的PBMC)，僅E6+E7 mRNA細胞(擠壓裝載有編碼E6、E7之mRNA的PBMC)，sig 2/3 mRNA (擠壓裝載有編碼信號2/3介體之mRNA的PBMC)或對照PBMC (空擠壓)。圖42D、圖42E、圖42F、圖42G、圖42H、圖42I為展示E6-TCR或E7-TCR轉導T細胞中之IFNγ產生T細胞或TNF-α產生T細胞在與以下共培養後及在經E6或E7最小抗原決定基再刺激後的刺激情況的圖式：E6+E7+sig 2/3 mRNA細胞(擠壓裝載有編碼E6、E7及信號2/3介體之mRNA的PBMC)，僅E6+E7 mRNA細胞(擠壓裝載有編碼E6、E7之mRNA的PBMC)，sig 2/3 mRNA (擠壓裝載有編碼信號2/3介體之mRNA的PBMC)或對照PBMC (空擠壓)。
圖43A、圖43B、圖43C、圖43D及圖43E為展示免疫接種以下之小鼠中的pp65抗原特異性T細胞之增加的圖式：eAPC-CMV細胞(擠壓裝載有編碼pp65及sig2/sig3介體之mRNA的PBMC)，僅pp65細胞(擠壓裝載有編碼pp65之mRNA的PBMC)或未加工PBMC (無接觸)。圖43F、圖43G、圖43H及圖43I、圖43J、圖43K為展示免疫接種以下之小鼠中的IFNγ產生T細胞、TNF-α產生T細胞或IL-2產生T細胞之刺激的圖式：eAPC-CMV細胞(擠壓裝載有編碼pp65及sig2/sig3介體之mRNA的PBMC)，僅pp65細胞(擠壓裝載有編碼pp65之mRNA的PBMC)或未加工PBMC (無接觸)。
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Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu
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50 55 60
Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
65 70 75 80
Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu
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100 105 110
Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys
115 120 125
Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met
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Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
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Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
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Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
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Lys Pro
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Met Arg Thr Ala Leu Gly Asp Ile Gly Asn Met His Gly Asp Thr Pro
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Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu
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Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile
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Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
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Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro
100 105
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Met Arg Val Thr Ala Pro Arg Thr Leu Ile Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser Met His Gly Asp Thr Pro
20 25 30
Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu
35 40 45
Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile
50 55 60
Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile
65 70 75 80
Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln
85 90 95
Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
100 105 110
Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Ile Val Gly Ile
115 120 125
Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val Val Val Ile Gly Ala Val Val
130 135 140
Ala Thr Val Met Cys Arg Arg Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser
145 150 155 160
Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser
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Leu Thr Ala
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Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
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atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60
cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120
aagcaacagt tactgcgacg tgaggtatat gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180
tatagagatg ggaatccata tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240
agtgagtata gacattattg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300
aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaactgtc aaaagccact gtgtcctgaa 360
gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa agattccata atataagggg tcggtggacc 420
ggtcgatgta tgtcttgttg cagatcatca agaacacgta gagaaaccca gctgtaa 477
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atgcaccaga aacggaccgc catgttccag gatcctcaag agaggcccag aaagctgcct 60
cagctgtgta ccgagctgca gaccaccatc cacgacatca tcctggaatg cgtgtactgc 120
aagcagcagc tcctgcggag agaggtgtac gatttcgcct tccgggacct gtgcatcgtg 180
tacagagatg gcaaccccta cgccgtgtgc gacaagtgcc tgaagttcta cagcaagatc 240
agcgagtacc ggcactactg ctacagcctg tacggcacca cactggaaca gcagtacaac 300
aagcccctgt gcgacctgct gatccggtgc atcaactgcc agaaacctct gtgccccgag 360
gaaaagcagc ggcacctgga caagaagcag cggttccaca acatcagagg ccggtggacc 420
ggcagatgca tgagctgttg tcggagcagc agaaccagac gggaaaccca gctgtga 477
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atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60
gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120
ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180
tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240
gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 297
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atgagaacag ctcttgggga cattggtaac catggagata cacctacatt gcatgaatat 60
atgttagatt tgcaaccaga gacaactgat ctctactgtt atgagcaatt aaatgacagc 120
tcagaggagg aggatgaaat agatggtcca gctggacaag cagaaccgga cagagcccat 180
tacaatattg taaccttttg ttgcaagtgt gactctacgc ttcggttgtg cgtacaaagc 240
acacacgtag acattcgtac tttggaagac ctgttaatgg gcacactagg aattgtgtgc 300
cccatctgtt ctcagaaacc ataa 324
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cctgccggcc aggccgagcc tgatagagcc cactacaaca tcgtgacctt ctgctgcaag 180
tgcgacagca ccctgagact gtgcgtgcag agcacacacg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcacctt gggcatcgtg tgccccatct gcagccagaa gccttg 296
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atgcacggcg atacccctac actgcacgag tacatgctgg acctgcagcc tgagacaacc 60
gacctgtact gctacgagca gctgaacgac agcagcgagg aagaggacga gattgacgga 120
cctgccggac aggccgaacc tgatagagcc cactacaata tcgtgacctt ctgctgcaag 180
tgcgacagca ccctgagact gtgtgtgcag agcacccacg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg tgccctatct gtagccagaa gccttga 297
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atgagagtga cagcccctcg gacactgatc ctgctgcttt ctggtgccct ggctctgaca 60
gaaacatggg ccggatctat gcacggcgat acccctacac tgcacgagta catgctggac 120
ctgcagcctg agacaaccga cctgtactgc tacgagcagc tgaacgacag cagcgaggaa 180
gaggacgaga ttgacggacc tgccggacag gccgaacctg atagagccca ctacaatatc 240
gtgaccttct gctgcaagtg cgacagcacc ctgagactgt gtgtgcagag cacccacgtg 300
gacatcagaa ccctggaaga tctgctgatg ggcaccctgg gcatcgtgtg ccctatctgt 360
agccagaagc ctatcgtggg aatcgtggcc ggactggctg tgctggcagt ggtggttatt 420
ggagccgtgg tggccacagt gatgtgcaga agaaagagca gcggcggcaa aggcggcagc 480
tattctcagg ccgcctctag cgattctgcc cagggaagtg atgtgtccct gacagcttga 540
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atgagaacag ctctcggcga catcggcaac atgcacggcg atacccctac actgcacgag 60
tacatgctgg acctgcagcc tgagacaacc gacctgtact gctacgagca gctgaacgac 120
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cactacaata tcgtgacctt ctgctgcaag tgcgacagca ccctgagact gtgtgtgcag 240
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atgcacggcg atacccctac actgcacgag tacatgctgg acctgcagcc tgagacaacc 60
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gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg tgccctatct gtagccagaa gcctaaagag 300
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atgcagctgt gtaccgagct gcagacctac atgctggacc tgcagcctga gacaacctac 60
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atgcagctgt gtaccgagct gcagacctac atgctggacc tgcagcctga gacaacctac 60
tgcaagcagc aactgcttgg cggcggaggc tctcagctct gtactgaact ccagacatat 120
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tctcaactgt gcaccgaact gcaaacttat atgttggatc tgcaacccga aaccacatat 240
tgcaagcaac agttgctcgg tggcggtggc agtcagttgt gcacagaact tcagacttac 300
atgcttgatc ttcagcccga aacgacctat tgcaaacagc agcttcttgg cggaggcggc 360
agccagttgt gtactgagct tcaaacttat atgcttgacc tccaaccaga gactacttac 420
tgcaaacaac aactcctcgg cggtggtgga agccagctct gcacggaatt gcagacctat 480
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atgcacggcg atgcccctgc cctgcacgag tacatgctgg acctgcagcc tgagacaacc 60
gacctgtact gctacgagca gctgaacgac agcagcgagg aagaggacga gattgacgga 120
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gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg tgccctatct gtagccagaa gccttga 297
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atgatggtgg acggcgacaa cagccacgtg gaaatgaagc tggccgtgga cgaggaagag 60
aacgccgaca acaacaccaa ggccaacgtg accaagccta agagatgcag cggcagcatc 120
tgctacggca caatcgccgt gatcgtgttc ttcctgatcg gctttatgat cggctacctg 180
ggctactgca agagcagtga tggacctggc gaaacaggcg gaggcggagg atctggtggc 240
ggaggaagcg gtggcggcgg atcttgtgat ctgcctcaga cacacagcct gggcagcaga 300
cgaacactga tgctgctggc ccagatgcgg aagatcagcc tgttcagctg cctgaaggac 360
cggcacgatt tcggcttccc tcaagaggaa ttcggcaacc agttccagaa ggccgagaca 420
atccctgtgc tgcacgagat gatccagcag atcttcaacc tgttctccac caaggacagc 480
agcgccgcct gggatgagac actgctggac aagttctaca ccgagctgta ccagcagctg 540
aatgacctgg aagcctgcgt gatccaaggc gtgggagtga cagagacacc cctgatgaag 600
gaagatagca tcctggccgt gcgcaagtac ttccagcgga tcaccctgta cctgaaagag 660
aagaagtaca gcccctgcgc ctgggaagtc gtgcgggccg aaatcatgag aagcttcagc 720
ctgagcacca acctgcaaga gagcctgcgg agcaaagagt ga 762
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atgatggtgg acggcgacaa cagccacgtg gaaatgaagc tggccgtgga cgaggaagag 60
aacgccgaca acaacaccaa ggccaacgtg accaagccta agagatgcag cggcagcatc 120
tgctacggca caatcgccgt gatcgtgttc ttcctgatcg gctttatgat cggctacctg 180
ggctactgca agagcagtga tggacctggc gaaacaggcg gaggcggagg atctggtggc 240
ggaggaagtg gcggcggagg ttctatttgg gagctgaaga aagacgtgta cgtggtggaa 300
ctggactggt atcccgatgc tcctggcgag atggtggtgc tgacctgcga tacccctgaa 360
gaggacggca tcacctggac actggatcag tctagcgagg tgctcggcag cggcaagacc 420
ctgaccatcc aagtgaaaga gtttggcgac gccggccagt acacctgtca caaaggcgga 480
gaagtgctga gccacagcct gctgctgctc cacaagaaag aggatggcat ttggagcacc 540
gacatcctga aggaccagaa agagcccaag aacaagacct tcctgagatg cgaggccaag 600
aactacagcg gccggttcac atgttggtgg ctgaccacca tcagcaccga cctgaccttc 660
agcgtgaagt ccagcagagg cagcagtgat cctcagggcg ttacatgtgg cgccgctaca 720
ctgtctgccg aaagagtgcg gggcgataac aaagaatacg agtacagcgt ggaatgccaa 780
gaggacagcg cctgtccagc cgccgaagag tctctgccta tcgaagtgat ggtcgacgcc 840
gtgcacaagc tgaagtacga gaactacacc agcagctttt tcatccggga catcatcaag 900
cccgatcctc caaagaacct gcagctgaag cctctgaaga acagcagaca ggtggaagtg 960
tcctgggagt accccgacac ctggtctaca ccccacagct acttcagcct gaccttttgc 1020
gtgcaagtgc agggcaagtc caagcgcgag aaaaaggacc gggtgttcac cgacaagacc 1080
agcgccaccg tgatctgcag aaagaacgcc agcatcagcg tcagagccca ggaccggtac 1140
tacagcagct cttggagcga atgggccagc gtgccatgta gcggaggtgg tggtagcgga 1200
ggcggcggaa gcggcggtgg tggatcaggt ggtggtggct ctagaaacct gccagtggct 1260
acccctgatc ctggcatgtt cccttgtctg caccacagcc agaacctgct gagagccgtg 1320
tccaacatgc tgcagaaggc cagacagacc ctggaattct acccctgcac cagcgaggaa 1380
atcgaccacg aggacatcac caaggataag accagcaccg tggaagcctg cctgcctctg 1440
gaactgacca agaacgagag ctgcctgaac agccgggaaa cctccttcat caccaacggc 1500
tcttgcctgg ccagcagaaa gacaagcttc atgatggccc tgtgcctgag cagcatctac 1560
gaggacctga agatgtacca ggtggaattc aagaccatga acgccaagct gctgatggac 1620
cccaagcggc agatcttcct ggaccagaac atgctggctg tgatcgacga gctgatgcag 1680
gccctgaact tcaacagcga gacagtgccc cagaagtcta gcctggaaga acccgacttc 1740
tacaagacca agatcaagct gtgcatcctg ctgcacgcct tccggatcag agccgtgacc 1800
atcgacagag tgatgagcta cctgaacgcc tcctga 1836
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
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<![CDATA[<400> 74]]>
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
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Gly Gly Gly Gly Ser
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<![CDATA[<223> 可存在於任何數目個重複序列中]]>
<![CDATA[<400> 76]]>
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
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<![CDATA[<223> 合成構築體]]>
<![CDATA[<400> 77]]>
Met Met Val Asp Gly Asp Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val
1 5 10 15
Asp Glu Glu Glu Asn Ala Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys
20 25 30
Pro Lys Arg Cys Ser Gly Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile
35 40 45
Val Phe Phe Leu Ile Gly Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys
50 55 60
Ser Ser Asp Gly Pro Gly Glu Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys
85 90 95
Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile
100 105 110
Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu
115 120 125
Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu
130 135 140
Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu
145 150 155 160
Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn
165 170 175
Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met
180 185 190
Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg
195 200 205
Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
210 215 220
<![CDATA[<210> 78]]>
<![CDATA[<211> 191]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
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<![CDATA[<223> 合成構築體]]>
<![CDATA[<400> 78]]>
Met Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly Leu Cys Leu Leu Val
1 5 10 15
Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Gly Leu Gly Met
20 25 30
Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser
50 55 60
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln
65 70 75 80
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg
85 90 95
Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
100 105 110
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
115 120 125
Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
130 135 140
Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
145 150 155 160
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu
165 170 175
Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
180 185 190
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<![CDATA[<223> 合成構築體]]>
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Met Met Val Asp Gly Asp Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val
1 5 10 15
Asp Glu Glu Glu Asn Ala Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys
20 25 30
Pro Lys Arg Cys Ser Gly Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile
35 40 45
Val Phe Phe Leu Ile Gly Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys
50 55 60
Ser Ser Asp Gly Pro Gly Glu Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val
85 90 95
Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val
100 105 110
Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu
115 120 125
Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln
130 135 140
Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly
145 150 155 160
Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly
165 170 175
Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys
180 185 190
Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys
195 200 205
Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser
210 215 220
Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr
225 230 235 240
Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser
245 250 255
Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu
260 265 270
Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn
275 280 285
Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro
290 295 300
Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val
305 310 315 320
Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser
325 330 335
Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys
340 345 350
Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys
355 360 365
Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser
370 375 380
Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
385 390 395 400
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn
405 410 415
Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His
420 425 430
Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg
435 440 445
Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu
450 455 460
Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu
465 470 475 480
Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe
485 490 495
Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met
500 505 510
Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val
515 520 525
Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln
530 535 540
Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln
545 550 555 560
Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu
565 570 575
Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His
580 585 590
Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu
595 600 605
Asn Ala Ser
610
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<![CDATA[<223> 合成構築體]]>
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Met Met Val Asp Gly Asp Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val
1 5 10 15
Asp Glu Glu Glu Asn Ala Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys
20 25 30
Pro Lys Arg Cys Ser Gly Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile
35 40 45
Val Phe Phe Leu Ile Gly Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys
50 55 60
Ser Ser Asp Gly Pro Gly Glu Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser
85 90 95
Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile
100 105 110
Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln
115 120 125
Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu
130 135 140
His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser
145 150 155 160
Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu
165 170 175
Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly
180 185 190
Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg
195 200 205
Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser
210 215 220
Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser
225 230 235 240
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
245 250
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<![CDATA[<400> 81]]>
Met Met Val Asp Gly Asp Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val
1 5 10 15
Asp Glu Glu Glu Asn Ala Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys
20 25 30
Pro Lys Arg Cys Ser Gly Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile
35 40 45
Val Phe Phe Leu Ile Gly Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys
50 55 60
Ser Ser Asp Gly Pro Gly Glu Thr Gly
65 70
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<![CDATA[<223> 合成構築體]]>
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Met Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly Leu Cys Leu Leu Val
1 5 10 15
Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Gly Leu Gly Met
20 25 30
Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Thr Gly
35 40
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<![CDATA[<212> DNA]]>
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<![CDATA[<400> 83]]>
atgagcctgc tgaccgaagt ggaaacctat gtgctgagca ttgtgccgag cggcccgctg 60
aaagcggaaa ttgcgcagcg cctggaagat gtgtttgcgg gcaaaaacac cgatctggaa 120
gtgctgatgg aatggctgaa aacccgcccg attctgagcc cgctgaccaa aggcattctg 180
ggctttgtgt ttaccctgac cgtgccgagc gaacgcggcc tgcagcgccg ccgctttgtg 240
cagaacgcgc tgaacggcaa cggcgatccg aacaacatgg ataaagcggt gaaactgtat 300
cgcaaactga aacgcgaaat tacctttcat ggcgcgaaag aaattgcgct gagctatagc 360
gcgggcgcgc tggcgagctg catgggcctg atttataacc gcatgggcgc ggtgaccacc 420
gaagtggcgt ttggcctggt gtgcgcgacc tgcgaacaga ttgcggatag ccagcatcgc 480
agccatcgcc agatggtgac caccaccaac ccgctgattc gccatgaaaa ccgcatggtg 540
ctggcgagca ccaccgcgaa agcgatggaa cagatggcgg gcagcagcga acaggcggcg 600
gaagcgatgg atattgcgag ccaggcgcgc cagatggtgc aggcgatgcg caccattggc 660
acccatccga gcagcagcgc gggcctgaaa gatgatctgc tggaaaacct gcaggcgtat 720
cagaaacgca tgggcgtgca gatgcagcgc tttaaa 756
<![CDATA[<210> 84]]>
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<![CDATA[<212> DNA]]>
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<![CDATA[<220> ]]>
<![CDATA[<223> 合成構築體]]>
<![CDATA[<400> 84]]>
atgtctctgc tgaccgaggt cgagacatac gtgctgagca tcgtgcctag cggccctctg 60
aaggccgaga tcgcccagag actggaagat gtgttcgccg gcaagaacac cgacctggaa 120
gtgctgatgg aatggctgaa aaccagacct atcctgagcc ccctgacaaa gggcatcctg 180
ggcttcgtgt tcaccctgac cgtgccaagc gagagaggcc tgcagcgcag aaggttcgtg 240
cagaacgccc tcaacggcaa tggcgacccc aacaacatgg ataaggctgt gaagctgtat 300
agaaagctga aaagagagat cacatttcac ggcgctaaag agattgccct ctcctacagc 360
gccggagccc tggcttcttg tatgggactg atctacaaca gaatgggagc cgtgaccacc 420
gaggtggcct tcggcctggt gtgcgccaca tgcgagcaaa tcgcagatag ccagcacaga 480
agccatcggc agatggtcac cacaacaaac cctctgatcc ggcacgagaa ccggatggtg 540
ctggccagca ccaccgccaa ggccatggaa cagatggccg gcagctctga gcaggccgct 600
gaagccatgg acatcgccag ccaggctaga cagatggttc aggccatgag aaccatcggc 660
acccaccctt ctagctccgc cggactgaag gacgacctgc tggaaaatct gcaagcctac 720
cagaagcgga tgggcgtgca gatgcagcgg tttaagtag 759
<![CDATA[<210> 85]]>
<![CDATA[<211> 1686]]>
<![CDATA[<212> DNA]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220> ]]>
<![CDATA[<223> 合成構築體]]>
<![CDATA[<400> 85]]>
atggaaagca gaggcagacg gtgccccgag atgatctctg tgctgggccc tatctctggc 60
cacgtgctga aggccgtgtt cagcagaggc gatacacctg tgctgcccca cgagacaaga 120
ctgctgcaga caggcatcca tgtgcgggtg tcacagccta gcctgatcct ggtgtctcag 180
tacacccctg acagcacccc ttgtcacaga ggcgacaatc agctgcaggt ccagcacacc 240
tacttcaccg gcagcgaggt ggaaaacgtg tccgtgaacg tgcacaatcc caccggcaga 300
tccatctgtc ccagccaaga gcctatgagc atctacgtgt acgccctgcc tctgaagatg 360
ctgaacatcc ccagcatcaa tgtgcatcac tacccctctg ccgccgagcg gaaacacaga 420
catctgcctg tggccgatgc cgtgattcac gcctctggca aacagatgtg gcaggccaga 480
ctgacagtgt ccggactggc ttggaccaga cagcagaacc agtggaaaga acccgacgtg 540
tactacacca gcgccttcgt gttccccacc aaggatgtgg ccctgagaca cgttgtgtgc 600
gcccacgaac tcgtgtgcag catggaaaac acccgggcca ccaagatgca agtgatcggc 660
gaccagtacg tgaaggtgta cctggaaagc ttctgcgagg atgtgcccag cggcaagctg 720
ttcatgcacg tgacactggg ctccgacgtg gaagaggacc tgaccatgac cagaaatccc 780
cagcctttca tgcggcctca cgagagaaat ggcttcaccg tgctgtgccc caagaacatg 840
atcatcaagc ccggcaagat cagccacatc atgctggacg tggccttcac cagccacgag 900
cactttggac tgctgtgtcc taagagcatc cccggcctga gcatcagcgg caacctgctg 960
atgaatggcc agcagatctt cctggaagtg caggccatcc gggaaaccgt ggaactgaga 1020
cagtacgacc ctgtggctgc cctgttcttc ttcgacatcg acctgctgct ccagagaggc 1080
cctcagtact ctgagcaccc cacctttacc agccagtacc ggatccaggg aaagctggaa 1140
taccggcaca cctgggatag acacgatgaa ggtgctgccc agggcgacga tgatgtgtgg 1200
acaagcggca gcgatagcga cgaggaactg gtcaccaccg agagaaagac ccctagagtt 1260
acaggcggag gcgctatggc tggcgcctct acatctgccg gacggaagag aaagagcgcc 1320
tcttctgcca ccgcctgtac aagcggcgtg atgacaagag gcaggctgaa agccgagagc 1380
acagtggccc ctgaagagga cacagacgag gacagcgaca acgagattca caaccccgcc 1440
gtgtttacct ggcctccttg gcaggctgga atcctggcca gaaacctggt gcctatggtg 1500
gccacagtgc agggccagaa cctgaagtac caagagttct tctgggacgc caacgacatc 1560
taccggatct tcgccgaact ggaaggcgtg tggcaaccag ccgctcagcc taagagaaga 1620
aggcacagac aagacgctct gcccggacct tgtatcgcca gcactcccaa gaagcacaga 1680
ggctga 1686
<![CDATA[<210> 86]]>
<![CDATA[<211> 5]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220> ]]>
<![CDATA[<223> 合成構築體]]>
<![CDATA[<400> 86]]>
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
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<![CDATA[<211> 5]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
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<![CDATA[<223> 合成構築體]]>
<![CDATA[<400> 87]]>
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
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<![CDATA[<211> 9]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
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<![CDATA[<223> 合成構築體]]>
<![CDATA[<400> 88]]>
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
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<![CDATA[<211> 11]]>
<![CDATA[<212> PRT]]>
<![CDATA[<213> 人工序列]]>
<![CDATA[<220> ]]>
<![CDATA[<223> 合成構築體]]>
<![CDATA[<400> 89]]>
Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe Thr Val Leu
1 5 10
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<![CDATA[<400> 90]]>
Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met
1 5 10
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Tyr Ser Glu His Pro Thr Phe Thr Ser Gln Tyr
1 5 10
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<![CDATA[<400> 92]]>
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5
<![CDATA[<210> 93]]>
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<![CDATA[<220> ]]>
<![CDATA[<223> 合成構築體]]>
<![CDATA[<400> 93]]>
Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
1 5 10
Claims (288)
- 一種刺激個體之免疫反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含蛋白質或其片段；其中該蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
- 一種對有需要之個體進行疫苗接種之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含蛋白質或其片段；其中該蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
- 如請求項1或2之方法，其中該蛋白質或其片段進一步包含一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體，產生該蛋白質與該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體的融合蛋白。
- 一種刺激個體之免疫反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含編碼蛋白質或其片段的mRNA；其中該蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
- 一種對有需要之個體進行疫苗接種之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含編碼蛋白質或其片段的mRNA；其中該蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
- 如請求項4或5之方法，其中該mRNA之核苷酸序列經密碼子最佳化以用於在該有核細胞中表現。
- 如請求項4至6中任一項之方法，其中該mRNA包含一或多個編碼靶向免疫蛋白酶體之模體的核酸序列，其中該mRNA之轉譯產生該蛋白質與該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體的融合蛋白。
- 如請求項3或6之方法，其中相比於在不存在靶向免疫蛋白酶體之模體的情況下該蛋白質在該細胞中之降解及/或源於該蛋白質之肽在該細胞表面上之呈現，該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體增強該蛋白質在該細胞中之降解及/或源於該蛋白質之肽在該細胞表面上之呈現。
- 如請求項8之方法，其中該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體位於該融合蛋白之N端及/或C端處。
- 如請求項7至9之方法，其中該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體為破壞盒(D-盒)域、KEKE域及/或sec/MITD域。
- 如請求項4至10中任一項之方法，其中該mRNA之一或多個殘基經修飾。
- 如請求項11之方法，其中該mRNA之一或多個殘基為硫代磷酸酯殘基、假尿苷殘基、N1-甲基腺苷殘基、5-甲基胞苷殘基或N-𠰌啉基殘基。
- 一種刺激個體之免疫反應之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原；其中該等兩種或更多種抗原刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
- 一種對有需要之個體進行疫苗接種之方法，該方法包含向個體投與有效量之包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原；其中該等兩種或更多種抗原刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
- 如請求項13或14之方法，其中該等細胞包含三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或超過十個源於該蛋白質之抗原。
- 如請求項13至15中任一項之方法，其中該等抗原中之至少兩者包含部分重疊胺基酸序列。
- 如請求項16之方法，其中所有該等抗原之組合胺基酸序列與該蛋白質之胺基酸序列重疊約90%或更多。
- 如請求項13至17中任一項之方法，其中該抗原為包含該蛋白質之兩個或更多個抗原決定基之多肽。
- 如請求項13至18中任一項之方法，其中該抗原為包含該蛋白質之一或多個抗原決定基及一或多個異源肽序列的多肽。
- 如請求項13至19中任一項之方法，其中一或多個抗原決定基在N端及/或C端上側接一或多個異源肽序列。
- 如請求項20之方法，其中該等N端及/或C端側接多肽源於免疫原性合成長肽(SLP)。
- 如請求項21之方法，其中該等N端及/或C端側接多肽源於疾病相關之免疫原性SLP。
- 如請求項1至22中任一項之方法，其中該蛋白質為與癌症相關之突變蛋白、致癌基因產物、新抗原、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白。
- 如請求項1、3、4、6至13、15至23中任一項之方法，其中該刺激個體之免疫反應係用於治療癌症、感染性疾病或病毒相關疾病。
- 如請求項24之方法，其中該病毒相關疾病係與以下各者相關之疾病：人類乳突狀瘤病毒(HPV)、A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、單純疱疹病毒1 (HSV-1)、單純疱疹病毒(HSV-2)、水痘帶狀疱疹病毒(VZV)、人類疱疹病毒6 (HHV-6)、人類疱疹病毒7 (HHV-7)、人類疱疹病毒8 (HHV-8)、巨細胞病毒(CMV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)、EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)或流感。
- 如請求項1至24中任一項之方法，其中該蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。
- 如請求項26之方法，其中該HPV為HPV-16或HPV-18。
- 如請求項26或27之方法，其中該蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。
- 如請求項1至24中任一項之方法，其中該蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白質。
- 如請求項29之方法，其中該HBV蛋白為核心蛋白、小表面抗原、中等表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
- 如請求項1至30中任一項之方法，其中該組合物進一步包含佐劑。
- 如請求項1至31中任一項之方法，其中該組合物與佐劑結合投與。
- 如請求項31或32之方法，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
- 如請求項1至3及23至33中任一項之方法，其中包含該蛋白質或其片段之該等有核細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及 b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含該蛋白質或其片段之有核細胞。
- 如請求項4至11中任一項之方法，其中包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的該等有核細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及 b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的有核細胞。
- 如請求項12至33中任一項之方法，其中包含兩種或更多種抗原之該等有核細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及 b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育，使得該等兩種或更多種抗原能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含兩種或更多種抗原之有核細胞。
- 如請求項34至36中任一項之方法，其中該方法包含 (a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育； (b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育；或 (c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育。
- 如請求項34至36中任一項之方法，其中該方法包含 (a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育； (b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育；或 (c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育。
- 如請求項34至38中任一項之方法，其中該收縮部寬度為該等輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。
- 如請求項34至39中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約3.0 µm至約4.2 µm，或約3.0 µm至約4.8 µm，或約3.0 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。
- 如請求項34至40中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約3.5 µm。
- 如請求項34至41中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約4.5 µm或約4.0 µm。
- 如請求項34至42中任一項之方法，其中包含該複數個輸入有核細胞之該細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中該等多個收縮部串聯及/或並聯配置。
- 如請求項1至43中任一項之方法，其中該等有核細胞對於該個體而言為自體或同種異體的。
- 如請求項1至44中任一項之方法，其中該等有核細胞係免疫細胞。
- 如請求項1至45中任一項之方法，其中該等有核細胞係複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。
- 如請求項46之方法，其中該複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。
- 如請求項1至47中任一項之方法，其中該等有核細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。
- 如請求項1至48中任一項之方法，其中該等有核細胞係用佐劑調節，形成經調節細胞。
- 如請求項49之方法，其中將該等有核細胞與該佐劑一起培育約1小時至約24小時、約2小時至約10小時、約3小時至約6小時或約4小時以調節該等細胞。
- 如請求項49或50之方法，其中在將該蛋白質或其片段或編碼該蛋白質或其片段之該mRNA引入該等有核細胞中之前或之後，調節該等有核細胞。
- 如請求項49至51中任一項之方法，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
- 如請求項48至51中任一項之方法，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。
- 如請求項49至53中任一項之方法，其中該佐劑為CpG 7909。
- 如請求項49至54中任一項之方法，其中該等經調節細胞為複數個經調節PBMC。
- 如請求項55之方法，其中該複數個PBMC經修飾以增加共刺激分子中之一或多者的表現。
- 如請求項56之方法，其中該共刺激分子為B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。
- 如請求項56之方法，其中該共刺激分子為CD86。
- 如請求項55至58中任一項之方法，其中該複數個PBMC經修飾以增加一或多種細胞介素之表現。
- 如請求項55至59中任一項之方法，其中該複數個PBMC經修飾以包含嵌合膜結合細胞介素。
- 如請求項60之方法，其中該嵌合膜結合細胞介素為包含該細胞介素及跨膜域之融合蛋白。
- 如請求項61之方法，其中該細胞介素藉由肽連接子接合至該跨膜域。
- 如請求項62之方法，其中該肽連接子為(G 4S) 3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK) 3(SEQ ID NO:74)。
- 如請求項59至63中任一項之方法，其中該細胞介素為I型細胞介素。
- 如請求項59至64中任一項之方法，其中該細胞介素為IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β或IL-21或其功能變異體。
- 如請求項65之方法，其中該細胞介素為IL-2或其功能變異體及/或IL-12或其功能變異體。
- 如請求項60至65中任一項之方法，其中該嵌合膜結合細胞介素包含胺基酸序列SEQ ID NO: 77-80。
- 如請求項56至67中任一項之方法，其中該複數個PBMC經修飾以增加一或多種細胞介素及/或一或多種共刺激分子之表現。
- 如請求項68之方法，其中該複數個PBMC包含一或多種細胞介素及/或一或多種共刺激分子之增加的表現，其中該複數個PBMC係藉由包含以下之製程製備： a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及 b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中該等mRNA經表現，由此產生包含該蛋白質或其片段、該一或多種細胞介素及/或該一或多種共刺激分子的有核細胞。
- 如請求項68之方法，其中該複數個PBMC包含一或多種細胞介素及/或一或多種共刺激分子之增加的表現，其中該複數個PBMC係藉由包含以下之製程製備： a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段之該mRNA及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及 b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中該等mRNA經表現，由此產生包含該蛋白質或其片段、該一或多種細胞介素及/或該一或多種共刺激分子的有核細胞。
- 如請求項68之方法，其中該複數個PBMC包含一或多種細胞介素及/或一或多種共刺激分子之增加的表現，其中該複數個PBMC係藉由包含以下之製程製備： a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該等兩種或更多種抗原及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及 b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該等兩種或更多種抗原及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA一起培育，使得該等兩種或更多種抗原及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中該等mRNA經表現，由此產生包含兩種或更多種抗原、該一或多種細胞介素及/或該一或多種共刺激分子的有核細胞。
- 如請求項69至71中任一項之方法，其中該方法包含 (a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與該蛋白質或其片段、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育； (b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育；或 (c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與該等兩種或更多種抗原、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育。
- 如請求項69至71中任一項之方法，其中該方法包含 (a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與該蛋白質或其片段、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育； (b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育；或 (c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與該等兩種或更多種抗原、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育。
- 如請求項55至73中任一項之方法，其中相比於複數個未經調節PBMC中的該等B細胞，一或多種共刺激分子在該複數個經調節PBMC的該等B細胞中經上調，其中該共刺激分子為CD80及/或CD86。
- 如請求項55至74中任一項之方法，其中相比於複數個未經調節PBMC，該複數個PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者之增加的表現。
- 如請求項75之方法，其中相比於該複數個未經調節PBMC，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者的該表現增加超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
- 如請求項1至76中任一項之方法，其中包含有核細胞之該組合物經複數次投與。
- 如請求項1至77中任一項之方法，其中該組合物經靜脈內投與。
- 如請求項1至78中任一項之方法，其中該個體為人類。
- 如請求項1至79中任一項之方法，其中該組合物在投與另一種療法之前、同時或之後投與。
- 如請求項80之方法，其中另一種療法為化學療法、輻射療法、抗體、細胞介素、免疫檢查點抑制劑或免疫腫瘤學療法中所用之雙特異性多肽。
- 一種包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含蛋白質或其片段；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
- 如請求項82之組合物，其中該蛋白質或其片段進一步包含一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體，產生該蛋白質與該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體的融合蛋白。
- 一種包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含編碼蛋白質或其片段之mRNA；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
- 如請求項84之組合物，其中該mRNA之核苷酸序列經密碼子最佳化以用於在該有核細胞中表現。
- 如請求項84或85之組合物，其中該mRNA包含一或多個編碼靶向免疫蛋白酶體之模體的核酸序列，其中該mRNA之轉譯產生該蛋白質與該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體的融合蛋白。
- 如請求項83或86之組合物，其中相比於在不存在靶向免疫蛋白酶體之模體的情況下該蛋白質在該細胞中之降解及/或源於該蛋白質之肽在該細胞表面上之呈現，該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體增強該蛋白質在該細胞中之降解及/或源於該蛋白質之肽在該細胞表面上之呈現。
- 如請求項87之組合物，其中該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體位於該融合蛋白之N端及/或C端處。
- 如請求項86至88之組合物，其中該一或多個靶向免疫蛋白酶體之模體為破壞盒(D-盒)域、KEKE域及/或sec/MITD域。
- 如請求項84至89中任一項之組合物，其中該mRNA之一或多個殘基經修飾。
- 如請求項90之組合物，其中該mRNA之一或多個殘基為硫代磷酸酯殘基、假尿苷殘基、N1-甲基腺苷殘基、5-甲基胞苷殘基或N-𠰌啉基殘基。
- 一種包含有核細胞之組合物，其中該等有核細胞包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
- 如請求項92之組合物，其中該等細胞包含三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或超過十個源於該蛋白質之抗原。
- 如請求項92或93之組合物，其中該等抗原中之至少兩者包含部分重疊胺基酸序列。
- 如請求項94之組合物，其中所有該等抗原之組合胺基酸序列與該蛋白質之胺基酸序列重疊約90%或更多。
- 如請求項92至95中任一項之組合物，其中抗原為包含該蛋白質之兩個或更多個抗原決定基之多肽。
- 如請求項92至96中任一項之組合物，其中抗原為包含該蛋白質之一或多個抗原決定基及一或多個異源肽序列的多肽。
- 如請求項92至97中任一項之組合物，其中一或多個抗原決定基在N端及/或C端上側接一或多個異源肽序列。
- 如請求項98之組合物，其中該等N端及/或C端側接多肽源於免疫原性合成長肽(SLP)。
- 如請求項99之組合物，其中該等N端及/或C端側接多肽源於疾病相關之免疫原性SLP。
- 如請求項82至100中任一項之組合物，其中該蛋白質為與癌症相關之突變蛋白、致癌基因產物、新抗原、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白。
- 如請求項82至101中任一項之組合物，其中該刺激個體之免疫反應係用於治療癌症、感染性疾病或病毒相關疾病。
- 如請求項102之組合物，其中該病毒相關疾病係與以下各者相關之疾病：人類乳突狀瘤病毒(HPV)、A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、單純疱疹病毒1 (HSV-1)、單純疱疹病毒(HSV-2)、水痘帶狀疱疹病毒(VZV)、人類疱疹病毒6 (HHV-6)、人類疱疹病毒7 (HHV-7)、人類疱疹病毒8 (HHV-8)、巨細胞病毒(CMV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)、EB病毒(EBV)或流感。
- 如請求項82至103中任一項之組合物，其中蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。
- 如請求項104之組合物，其中該HPV為HPV-16或HPV-18。
- 如請求項104或105之組合物，其中該蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。
- 如請求項82至103中任一項之組合物，其中蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白質。
- 如請求項107之組合物，其中該HBV蛋白質為核心蛋白、小表面抗原、中等表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
- 如請求項82至108中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含佐劑。
- 如請求項109之組合物，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
- 如請求項82及101至110中任一項之組合物，其中包含該蛋白質或其片段之該等有核細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及 b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含該蛋白質或其片段之有核細胞。
- 如請求項84至91及101至110中任一項之組合物，其中包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的該等有核細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及 b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的有核細胞。
- 如請求項92至110中任一項之組合物，其中包含兩種或更多種抗原之該等有核細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及 b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育，使得該等兩種或更多種抗原能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含兩種或更多種抗原之有核細胞。
- 如請求項111至113中任一項之組合物，其中製備該等有核細胞之製程包含： (a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育； (b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育；或 (c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育。
- 如請求項111至113中任一項之方法，其中製備該等有核細胞之製程包含： (a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育； (b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育；或 (c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育。
- 如請求項111至115中任一項之組合物，其中該收縮部寬度為該等輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。
- 如請求項111至116中任一項之組合物，其中該收縮部寬度為約3.0 µm至約4.2 µm，或約3.0 µm至約4.8 µm，或約3.0 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。
- 如請求項111至117中任一項之組合物，其中該收縮部寬度為約3.5 µm。
- 如請求項111至118中任一項之組合物，其中該收縮部寬度為約4.5 µm或約4.0 µm。
- 如請求項111至119中任一項之組合物，其中使包含該複數個輸入有核細胞之該細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中該等多個收縮部串聯及/或並聯配置。
- 如請求項82至120中任一項之組合物，其中該等有核細胞對於該個體而言為自體或同種異體的。
- 如請求項82至121中任一項之組合物，其中該等有核細胞係免疫細胞。
- 如請求項82至122中任一項之組合物，其中該等有核細胞係複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。
- 如請求項123之組合物，其中該複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。
- 如請求項82至124中任一項之組合物，其中該等有核細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。
- 如請求項82至125中任一項之組合物，其中該等有核細胞係用佐劑調節，形成經調節細胞。
- 如請求項126之組合物，其中將該等有核細胞與該佐劑一起培育約1小時至約24小時、約2小時至約10小時、約3小時至約6小時或約4小時以調節該等細胞。
- 如請求項126或127之組合物，其中在將該蛋白質或其片段或編碼該蛋白質或其片段之該mRNA引入該等有核細胞中之前或之後，調節該等有核細胞。
- 如請求項126至128中任一項之組合物，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
- 如請求項126至129中任一項之組合物，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。
- 如請求項126至130中任一項之組合物，其中該佐劑為CpG 7909。
- 如請求項126至131中任一項之組合物，其中該等經調節細胞為複數個經調節PBMC。
- 如請求項132之組合物，其中該複數個PBMC經修飾以增加共刺激分子中之一或多者的表現。
- 如請求項133之組合物，其中該共刺激分子為B7-H2 (ICOSL)、B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。
- 如請求項134之組合物，其中該共刺激分子為CD86。
- 如請求項132至135中任一項之組合物，其中該複數個PBMC經修飾以增加一或多種細胞介素之表現。
- 如請求項132至136中任一項之組合物，其中該複數個PBMC經修飾以包含嵌合膜結合細胞介素。
- 如請求項137之組合物，其中該嵌合膜結合細胞介素為包含該細胞介素及跨膜域之融合蛋白。
- 如請求項138之組合物，其中該細胞介素藉由肽連接子接合至該跨膜域。
- 如請求項139之組合物，其中該肽連接子為(G 4S) 3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK) 3(SEQ ID NO:74)。
- 如請求項136至140中任一項之組合物，其中該細胞介素為I型細胞介素。
- 如請求項136至141中任一項之組合物，其中該細胞介素為IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β或IL-21或其功能變異體。
- 如請求項142之方法，其中該細胞介素為IL-2或其功能變異體及/或IL-12或其功能變異體。
- 如請求項137至143中任一項之組合物，其中該嵌合膜結合細胞介素包含胺基酸序列SEQ ID NO: 77-80。
- 如請求項133至144中任一項之組合物，其中該複數個PBMC經修飾以增加一或多種細胞介素及/或一或多種共刺激分子之表現。
- 如請求項145之組合物，其中該複數個PBMC包含一或多種細胞介素及/或一或多種共刺激分子之增加的表現，其中該複數個PBMC係藉由包含以下之製程製備： a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及 b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中該等mRNA經表現，由此產生包含該蛋白質或其片段、該一或多種細胞介素及/或該一或多種共刺激分子的有核細胞。
- 如請求項145之組合物，其中該複數個PBMC包含一或多種細胞介素及/或一或多種共刺激分子之增加的表現，其中該複數個PBMC係藉由包含以下之製程製備： a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段之該mRNA及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及 b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中該等mRNA經表現，由此產生包含該蛋白質或其片段、該一或多種細胞介素及/或該一或多種共刺激分子的有核細胞。
- 如請求項145之組合物，其中該複數個PBMC包含一或多種細胞介素及/或一或多種共刺激分子之增加的表現，其中該複數個PBMC係藉由包含以下之製程製備： a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該等兩種或更多種抗原及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及 b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該等兩種或更多種抗原及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA一起培育，使得該等兩種或更多種抗原及編碼一或多種細胞介素之一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之一或多種mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；其中該等mRNA經表現，由此產生包含兩種或更多種抗原、該一或多種細胞介素及/或該一或多種共刺激分子的有核細胞。
- 如請求項146至148中任一項之組合物，其中製備該複數個PBMC之製程包含： (a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該複數個PBMC與該蛋白質或其片段、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育； (b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該複數個PBMC與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育；或 (c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該複數個PBMC與該等兩種或更多種抗原、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育。
- 如請求項146至148中任一項之組合物，其中製備該複數個PBMC之製程包含： (a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該複數個PBMC與該蛋白質或其片段、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育； (b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該複數個PBMC與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育；或 (c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該複數個PBMC與該等兩種或更多種抗原、編碼一或多種細胞介素之該一或多種mRNA及/或編碼一或多種共刺激分子之該一或多種mRNA一起培育。
- 如請求項132至150中任一項之組合物，其中相比於該複數個未經調節PBMC中的該等B細胞，一或多種共刺激分子在該複數個經調節PBMC的該等B細胞中經上調，其中該共刺激分子為CD80及/或CD86。
- 如請求項132至151中任一項之組合物，其中相比於複數個未經調節PBMC，該複數個PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者之增加的表現。
- 如請求項152之組合物，其中相比於該複數個未經調節PBMC，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中之一或多者的該表現增加超過約1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超過10倍。
- 一種用於刺激個體之免疫反應的組合物，其中該組合物包含有效量之如請求項82至153中任一項之組合物；其中該組合物以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
- 一種用作藥物之組合物，其中該組合物包含有效量之如請求項82至153中任一項之組合物。
- 一種用於治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的組合物，其中該組合物包含有效量之如請求項82至153中任一項之組合物。
- 如請求項154至156中任一項之組合物，其中該組合物進一步包含佐劑。
- 如請求項154至157中任一項之組合物，其中該組合物與佐劑結合投與。
- 如請求項157或158之組合物，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖苷腦醯胺、STING激動劑、環二核苷酸(CDN)、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
- 如請求項157至159中任一項之組合物，其中包含有核細胞之該組合物經複數次投與。
- 如請求項157至160中任一項之組合物，其中該組合物經靜脈內投與。
- 如請求項157至161中任一項之組合物，其中該個體為人類。
- 如請求項157至162中任一項之組合物，其中該組合物在投與另一種療法之前、同時或之後投與。
- 如請求項163之組合物，其中另一種療法為化學療法、輻射療法、抗體、細胞介素、免疫檢查點抑制劑或免疫腫瘤學療法中所用之雙特異性多肽。
- 一種組合物之用途，其用於製造用於刺激個體之免疫反應之藥劑，其中該組合物包含有效量之如請求項82至153中任一項之組合物；其中該組合物以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
- 一種組合物之用途，其用於製造用於治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病之藥劑，其中該組合物包含有效量之如請求項82至153中任一項之組合物。
- 如請求項165或166之用途，其中該組合物進一步包含佐劑。
- 如請求項165至167中任一項之組合物，其中該組合物經調配以與佐劑結合投與。
- 如請求項167或168之用途，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖苷腦醯胺、STING激動劑、環二核苷酸(CDN)、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
- 如請求項167至169中任一項之用途，其中包含有核細胞之該組合物經複數次投與。
- 如請求項167至170中任一項之用途，其中該組合物經靜脈內投與。
- 如請求項167至171中任一項之用途，其中該個體為人類。
- 如請求項167至172中任一項之用途，其中該組合物在投與另一種療法之前、同時或之後投與。
- 如請求項173之用途，其中另一種療法為化學療法、輻射療法、抗體、細胞介素、免疫檢查點抑制劑或免疫腫瘤學療法中所用之雙特異性多肽。
- 一種套組，其用於如請求項1至81中任一項之方法中。
- 一種套組，其包含如請求項82至153中任一項之組合物。
- 如請求項175或176之套組，其中該套組進一步包含緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器或關於向個體投與該組合物以HLA不可知方式刺激免疫反應之說明的藥品說明書中之一或多者。
- 一種產生包含蛋白質或其片段之有核細胞的方法；該方法包含將該蛋白質或其片段引入該等有核細胞中，其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
- 一種產生包含蛋白質或其片段之有核細胞的方法；該方法包含將編碼該蛋白質或其片段之mRNA引入該等有核細胞中，其中該mRNA經表現以產生該蛋白質或其片段；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
- 一種產生包含兩種或更多種來自蛋白質之抗原的有核細胞之方法；該方法包含將該等兩種或更多種抗原引入該等有核細胞中；其中該蛋白質或其片段以HLA不可知方式刺激個體之免疫反應。
- 如請求項178之方法，其中將該蛋白質或其片段引入該有核細胞內包含 a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該蛋白質或其片段穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及 b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育，使得該蛋白質或其片段能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含該蛋白質或其片段之有核細胞。
- 如請求項179之方法，其中包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的該等有核細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供編碼該蛋白質或其片段的該mRNA穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及 b)將該等經擾動之輸入有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育，使得編碼該蛋白質或其片段之該mRNA能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含編碼該蛋白質或其片段之該mRNA的有核細胞。
- 如請求項180之方法，其中包含兩種或更多種抗原之該等有核細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入有核細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入有核細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入有核細胞之擾動以供該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入有核細胞；及 b)將該等經擾動之輸入有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育，使得該等兩種或更多種抗原能夠進入該等經擾動之輸入有核細胞；由此產生包含兩種或更多種抗原之有核細胞。
- 如請求項181至183中任一項之方法，其中該方法包含： (a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育； (b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育；或 (c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育。
- 如請求項181至183中任一項之方法，其中該方法包含： (a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與該蛋白質或其片段一起培育； (b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與編碼該蛋白質或其片段之該mRNA一起培育；或 (c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等有核細胞與該等兩種或更多種抗原一起培育。
- 如請求項181至185中任一項之方法，其中該收縮部寬度為該等輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。
- 如請求項181至186中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約3.5 µm至約4.2 µm，或約3.5 µm至約4.8 µm，或約3.5 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。
- 如請求項181至187中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約3.5 µm。
- 如請求項181至188中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約4.5 µm。
- 如請求項181至189中任一項之方法，其中包含該複數個輸入有核細胞之該細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中該等多個收縮部串聯及/或並聯配置。
- 如請求項178至190中任一項之方法，其中該方法進一步包含用佐劑調節該等有核細胞，形成經調節細胞。
- 如請求項191之方法，其中將該等有核細胞與該佐劑一起培育約1小時至約24小時、約2小時至約10小時、約3小時至約6小時或約4小時以調節該等細胞。
- 如請求項191或192之方法，其中在將該蛋白質或其片段、編碼該蛋白質或其片段之該mRNA或來自蛋白質之該等兩種或更多種抗原引入該等有核細胞中之前或之後，調節該等有核細胞。
- 一種增強免疫細胞活性之方法，該等方法包含表現編碼該免疫細胞中之嵌合膜結合細胞介素的核酸。
- 如請求項193之方法，其中該嵌合膜結合細胞介素為包含跨膜域及細胞介素之融合蛋白。
- 如請求項194或195之方法，其中該跨膜域為運鐵蛋白受體蛋白1 (TFRC)或腫瘤壞死因子跨膜域。
- 如請求項194至196中任一項之方法，其中該細胞介素為I型細胞介素。
- 如請求項194至197中任一項之方法，其中該細胞介素為IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β或IL-21或其功能變異體。
- 如請求項194至198中任一項之方法，其中該細胞介素藉由肽連接子接合至該跨膜域。
- 如請求項199之方法，其中該肽連接子為(G 4S) 3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK) 3(SEQ ID NO:74)。
- 如請求項194至200中任一項之方法，其中該嵌合膜結合細胞介素包含胺基酸序列SEQ ID NO: 77-80。
- 如請求項194至201中任一項之方法，其中該免疫細胞進一步包含抗原。
- 如請求項194至201中任一項之方法，其中該免疫細胞進一步包含編碼抗原之mRNA。
- 如請求項202或203之方法，其中該抗原為蛋白質或其片段，其中該蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
- 如請求項194至201中任一項之方法，其中該免疫細胞進一步包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原。
- 如請求項205之方法，其中該等兩種或更多種抗原刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
- 如請求項204至206中任一項之方法，其中該蛋白質為與癌症相關之突變蛋白、致癌基因產物、新抗原、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白。
- 如請求項204至207中任一項之方法，其中該蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。
- 如請求項208之方法，其中該HPV為HPV-16或HPV-18。
- 如請求項208或209之方法，其中該蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。
- 如請求項204至207中任一項之方法，其中該蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白質。
- 如請求項211之方法，其中該HBV蛋白為核心蛋白、小表面抗原、中等表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
- 如請求項194至212中任一項之方法，其中該等免疫細胞為複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。
- 如請求項213之方法，其中該複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。
- 如請求項194至214中任一項之方法，其中該等免疫細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。
- 如請求項194至215中任一項之方法，其中該等有核細胞係用佐劑調節，形成經調節細胞。
- 如請求項216之方法，其中將該等有核細胞與該佐劑一起培育約1小時至約24小時、約2小時至約10小時、約3小時至約6小時或約4小時以調節該等細胞。
- 如請求項216或217之方法，其中在將該蛋白質或其片段或編碼該蛋白質或其片段之該mRNA引入該等有核細胞中之前或之後，調節該等有核細胞。
- 如請求項216至218中任一項之方法，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
- 如請求項216至219中任一項之方法，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。
- 如請求項194至220中任一項之方法，其中包含該嵌合膜結合細胞介素之該等免疫細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及 b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞。
- 如請求項221之方法，其中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸為編碼該嵌合膜結合細胞介素之mRNA。
- 如請求項202、204及207至222中任一項之方法，其中包含該嵌合膜結合細胞介素及抗原之該等免疫細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及該抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及 b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該抗原一起培育，使得該核酸及該抗原能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。
- 如請求項203、204及207至222之方法，其中包含該嵌合膜結合細胞介素及編碼蛋白質或其片段之mRNA的該等免疫細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼該抗原之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及 b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。
- 如請求項223或224之方法，其中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及/或編碼該抗原之該核酸為mRNA。
- 如請求項202、204及207至222中任一項之方法，其中包含該嵌合膜結合細胞介素及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原的該等免疫細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及 b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。
- 如請求項221至226中任一項之方法，其中該方法包含： (a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育 (b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該抗原一起培育； (c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸一起培育；或 (d)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該等兩種或更多種抗原一起培育。
- 如請求項221至226中任一項之方法，其中該方法包含： (a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育； (b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該抗原一起培育； (c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸一起培育；或 (d)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該等兩種或更多種抗原一起培育。
- 如請求項221至228中任一項之方法，其中該收縮部寬度為該等輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。
- 如請求項221至229中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約3.5 µm至約4.2 µm，或約3.5 µm至約4.8 µm，或約3.5 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。
- 如請求項221至230中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約3.5 µm。
- 如請求項221至231中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約4.5 µm。
- 如請求項221至232中任一項之方法，其中包含該複數個輸入有核細胞之該細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中該等多個收縮部串聯及/或並聯配置。
- 一種用於增強免疫細胞活性的組合物，該組合物包含該免疫細胞中之嵌合膜結合細胞介素。
- 如請求項234之組合物，其中該嵌合膜結合細胞介素為包含跨膜域及細胞介素之融合蛋白。
- 如請求項234至235中任一項之組合物，其中該跨膜域為運鐵蛋白受體蛋白1 (TFRC)或腫瘤壞死因子跨膜域。
- 如請求項234至236中任一項之組合物，其中該細胞介素為I型細胞介素。
- 如請求項234至237中任一項之組合物，其中該細胞介素為IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β或IL-21或其功能變異體。
- 如請求項234至238中任一項之組合物，其中該細胞介素藉由肽連接子接合至該跨膜域。
- 如請求項239之組合物，其中該肽連接子為(G 4S) 3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK) 3(SEQ ID NO:74)。
- 如請求項234至240中任一項之組合物，其中該嵌合膜結合細胞介素包含胺基酸序列SEQ ID NO: 77-80。
- 如請求項234至241中任一項之組合物，其中該免疫細胞進一步包含抗原。
- 如請求項234至242中任一項之組合物，其中該免疫細胞進一步包含編碼抗原之mRNA。
- 如請求項242或243之組合物，其中該抗原為蛋白質或其片段，其中該蛋白質或其片段刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
- 如請求項233至241中任一項之組合物，其中該免疫細胞進一步包含兩種或更多種源於蛋白質之抗原。
- 如請求項245之組合物，其中該等兩種或更多種抗原刺激免疫反應，不論該個體之HLA單倍型如何。
- 如請求項244至246中任一項之組合物，其中該蛋白質為與癌症相關之突變蛋白、致癌基因產物、新抗原、病毒蛋白、細菌蛋白或真菌蛋白。
- 如請求項244至247中任一項之組合物，其中蛋白質為人類乳突狀瘤病毒(HPV)蛋白質。
- 如請求項248之組合物，其中該HPV為HPV-16或HPV-18。
- 如請求項248或249之組合物，其中該蛋白質為HPV E6或HPV E7蛋白。
- 如請求項244至247中任一項之組合物，其中蛋白質為B型肝炎病毒(HBV)蛋白。
- 如請求項251之組合物，其中該HBV蛋白質為核心蛋白、小表面抗原、中等表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
- 如請求項233至252中任一項之組合物，其中該等免疫細胞係複數個周邊血液單核細胞(PBMC)。
- 如請求項253之組合物，其中該複數個PBMC包含T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞或NK-T細胞中之兩者或更多者。
- 如請求項233至254中任一項之組合物，其中該等免疫細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、單核球、樹突狀細胞及/或NK-T細胞中之一或多者。
- 如請求項233至255中任一項之組合物，其中該等有核細胞係用佐劑調節，形成經調節細胞。
- 如請求項256之組合物，其中將該等有核細胞與該佐劑一起培育約1小時至約24小時、約2小時至約10小時、約3小時至約6小時或約4小時以調節該等細胞。
- 如請求項256或257之組合物，其中在將該蛋白質或其片段或編碼該蛋白質或其片段之該mRNA引入該等有核細胞中之前或之後，調節該等有核細胞。
- 如請求項256至258中任一項之組合物，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激動劑、RIG-I激動劑、多聚肌苷酸-多聚胞苷酸、TLR3激動劑、TLR4激動劑、TLR7激動劑、TLR8激動劑或TLR9激動劑。
- 如請求項256至259中任一項之組合物，其中該佐劑為CpG寡去氧核苷酸(ODN)。
- 如請求項234至260中任一項之組合物，其中包含該嵌合膜結合細胞介素之該等免疫細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及 b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞。
- 如請求項261之組合物，其中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸為編碼該嵌合膜結合細胞介素之mRNA。
- 如請求項242、244及247至262中任一項之組合物，其中包含該嵌合膜結合細胞介素之該等免疫細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及該抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及 b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該抗原一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。
- 如請求項243、244及247至262之組合物，其中包含該嵌合膜結合細胞介素之該等免疫細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及編碼該抗原之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及 b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及抗原之免疫細胞。
- 如請求項263或264之組合物，其中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及/或編碼該抗原之該核酸為mRNA。
- 如請求項245至262中任一項之組合物，其中包含該嵌合膜結合細胞介素及該等兩種或更多種源於蛋白質之抗原的該等免疫細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及 b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及源於蛋白質之該等兩種或更多種抗原一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素及兩種或更多種抗原之免疫細胞。
- 如請求項261至266中任一項之組合物，其中得到該等免疫細胞之製程包含： (a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育 (b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該抗原一起培育； (c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸一起培育；或 (d)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該等兩種或更多種抗原一起培育。
- 如請求項261至266中任一項之方法，其中得到該等免疫細胞之製程包含： (a)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育； (b)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該抗原一起培育； (c)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及編碼該抗原之該核酸一起培育；或 (d)在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸及該等兩種或更多種抗原一起培育。
- 如請求項261至268中任一項之組合物，其中該收縮部寬度為該等輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。
- 如請求項261至269中任一項之組合物，其中該收縮部寬度為約3.5 µm至約4.2 µm，或約3.5 µm至約4.8 µm，或約3.5 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。
- 如請求項261至270中任一項之組合物，其中該收縮部寬度為約3.5 µm。
- 如請求項261至271中任一項之組合物，其中該收縮部寬度為約4.5 µm。
- 如請求項261至272中任一項之組合物，其中使包含該複數個輸入有核細胞之該細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中該等多個收縮部串聯及/或並聯配置。
- 一種用作藥物之組合物，其中該組合物包含有效量之如請求項234至273中任一項之組合物。
- 一種用於治療個體之癌症、感染性疾病或病毒相關疾病的組合物，其中該組合物包含有效量之如請求項210至248中任一項之組合物。
- 一種套組，其用於如請求項194至233中任一項之方法中。
- 一種套組，其包含如請求項234至275中任一項之組合物。
- 如請求項250或249之套組，其中該套組進一步包含緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器或關於增強免疫細胞活性之說明的藥品說明書中之一或多者。
- 一種產生包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞的方法，該方法包含將編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸引入該等免疫細胞中。
- 如請求項279之方法，其中包含該嵌合膜結合細胞介素之該等免疫細胞係藉由以下製備： a)使包含輸入免疫細胞之細胞懸浮液穿過細胞變形收縮部，其中該收縮部直徑係該懸浮液中該等輸入免疫細胞直徑的函數，由此引起足夠大的該等輸入免疫細胞之擾動以供編碼該嵌合膜結合細胞介素之核酸穿過，形成經擾動之輸入免疫細胞；及 b)將該等經擾動之輸入免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育，使得該核酸能夠進入該等經擾動之輸入免疫細胞，在該等經擾動之輸入免疫細胞中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸經表現；由此產生包含嵌合膜結合細胞介素之免疫細胞。
- 如請求項280之方法，其中該方法包含在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前、期間及/或之後，將該等免疫細胞與其編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育。
- 如請求項280之方法，其中該方法包含在使該細胞懸浮液穿過該細胞變形收縮部之前，將該等免疫細胞與編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸一起培育。
- 如請求項280、281或282之方法，其中編碼該嵌合膜結合細胞介素之該核酸為編碼該嵌合膜結合細胞介素之mRNA。
- 如請求項280至283中任一項之方法，其中該收縮部寬度為該等輸入有核細胞之平均直徑的約10%至約99%。
- 如請求項280至284中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約3.5 µm至約4.2 µm，或約3.5 µm至約4.8 µm，或約3.5 µm至約6 µm，或約4.2 µm至約4.8 µm，或約4.2 µm至約6 µm。
- 如請求項280至285中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約3.5 µm。
- 如請求項280至286中任一項之方法，其中該收縮部寬度為約4.5 µm。
- 如請求項280至287中任一項之方法，其中包含該複數個輸入有核細胞之該細胞懸浮液穿過多個收縮部，其中該等多個收縮部串聯及/或並聯配置。
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