CN116406283A - 用于使用有核细胞刺激对蛋白质的hla未知免疫应答的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了包括蛋白质或其片段的有核细胞、制备此类包括所述蛋白质或其片段的有核细胞的方法以及使用此类经修饰的有核细胞(例如，免疫细胞)以HLA未知的方式刺激免疫应答的方法。
Description
相关申请交叉引用
本申请要求于2020年9月2日提交的美国临时申请第63/073,910号和于2021年2月9日提交的美国临时申请第63/147,473号的权益，所述美国临时申请中的每个美国临时申请的全部内容通过引用并入本文中。
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技术领域
本公开总体上涉及包括蛋白质或其片段的有核细胞、制备此类经修饰的有核细胞的方法以及使用此类经修饰的有核细胞以刺激免疫应答的方法。
背景技术
表位疫苗的开发面临着各种挑战。几十年来，对这些疫苗的研究一直是该领域的焦点，尽管治疗癌症和预防传染性疾病的HLA限制性表位疫苗的研究和开发已经取得了实质性的进展，但是已知只有一种基于肽的肾细胞癌疫苗(IMA901,9,10，由Immatics生物制药公司(Immatics biotechnologies GmbH)开发)已经进入III期临床试验(万维网immatics.com)。还参见Zhao,L等人,《人疫苗免疫治疗学(Hum Vaccin Immunother)》2013年12月1日；9(12):2566-2577。
虽然有效，但HLA限制性表位疫苗的局限性在于，由于MHC限制的规则，其限制患者群体的覆盖。例如，在大多数情况下，限于HLA-A*02的单一肽表位疫苗将仅用于治疗表达HLA-A*02的患者(约40％的人群体)。产生不具有这些HLA限制并且因此是HLA未知的疫苗将允许治疗所有患者，而不管HLA表达如何。HLA未知的疫苗可以通过将靶抗原的全长蛋白包含为疫苗的一部分来实现。全长蛋白可以通过递送蛋白质本身、编码全长蛋白的mRNA和/或使用重叠合成长肽(SLP)来实现。
目前用于以HLA未知的方式诱导内源性CD8+T细胞应答的方法依赖于将抗原靶向树突细胞以进行交叉呈递。将抗原靶向树突细胞和后续交叉呈递具有复合的低效率，所述复合的低效率通常已经引发CD4 T细胞应答，同时避免CD8 T细胞应答。因此，需要在表位疫苗领域取得进展。由疾病相关抗原刺激的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和CD4+辅助性T(Th)细胞具有靶向和破坏患病细胞的潜力。
在本文中引用的所有文献，包含专利申请和出版物，通过引用整体并入本文。专利公开WO 2016070136、US 20180142198、WO 2017008063、US 20180201889、WO 2019178005以及WO 2019178006和PCT/US2020/020194特此通过引用整体并入本文。
发明内容
在一些方面，本发明提供了用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些方面，本发明提供了用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
在一些方面，本发明提供了用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些方面，本发明提供了用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，所述mRNA的核苷酸序列被密码子优化以在所述有核细胞中表达。在一些实施例中，所述mRNA的一个或多个残基被修饰。在一些实施例中，所述mRNA的一个或多个残基是硫代磷酸酯残基、假尿苷残基、N1-甲基腺苷残基、5-甲基胞苷残基或吗啉代残基。
在一些实施例中，所述蛋白质或其片段是包括所述蛋白质或其片段和一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序的融合蛋白。在一些实施例中，所述mRNA包括一个或多个编码免疫蛋白酶体靶向基序的核酸序列，其中所述mRNA的翻译产生所述蛋白质与所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序的融合蛋白。在一些实施例中，与在不存在免疫蛋白酶体靶向基序的情况下所述细胞中的所述蛋白质的降解和/或源自所述蛋白质的肽在所述细胞的表面上的呈递相比，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序增强所述细胞中的所述蛋白质的降解和/或源自所述蛋白质的肽在所述细胞的表面上的呈递。在一些实施例中，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序位于所述融合蛋白的N末端和/或C末端。在一些实施例中，其中所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序是破坏盒(D-盒)结构域、KEKE结构域和/或sec/MITD结构域。
在一些方面，本发明提供了用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括源自蛋白质的两种或更多种抗原；其中所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，本发明提供了用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括源自蛋白质的两种或更多种抗原；其中所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，所述细胞包括源自所述蛋白质的三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或多于十种抗原。在一些实施例中，所述抗原中的至少两种抗原包括部分重叠的氨基酸序列。在一些实施例中，所有抗原的组合氨基酸序列与所述蛋白质的氨基酸序列重叠约90％或更多。在一些实施例中，所述抗原是多肽，所述多肽包括所述蛋白质的两个或更多个表位。在一些实施例中，所述抗原是多肽，所述多肽包括所述蛋白质的一个或多个表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，一个或多个表位在N末端和/或C末端上侧接有一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，N末端和/或C末端侧接多肽源自免疫原性合成长肽(SLP)。在一些实施例中，所述N末端和/或C末端侧接多肽源自疾病相关免疫原性SLP。在一些实施例中，所述一种或多种抗原是与大于约90％的蛋白质的氨基酸序列或约100％的蛋白质的氨基酸序列相对应的一系列重叠的SLP。
在本发明的一些实施例中，其中所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、癌基因、新抗原、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白的产物。在一些实施例中，刺激个体的免疫应答用于治疗癌症、传染性疾病或病毒相关疾病。在一些实施例中，所述病毒相关疾病是与人乳头瘤病毒(HPV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、单纯疱疹病毒(HSV-2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、人疱疹病毒6(HHV-6)、人疱疹病毒7(HHV-7)、人疱疹病毒8(HHV-8)、巨细胞病毒(CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus，EBV)或流感相关的疾病。在一些实施例中，所述蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。在一些实施例中，所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施例中，所述蛋白质是HPV E6或HPV E7蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。在一些实施例中，所述HBV蛋白是核心蛋白、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
在本发明的一些实施例中，所述组合物进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述组合物与佐剂结合施用。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR 9激动剂。
在本发明的一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞通过以下制备：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段的有核细胞。在一些实施例中，包括编码所述蛋白质或其片段的mRNA的所述有核细胞通过以下制备：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的有核细胞。在一些实施例中，包括两种或更多种抗原的所述有核细胞通过以下制备：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述两种或更多种抗原通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育，以允许所述两种或更多种抗原进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括两种或更多种抗原的有核细胞。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3.0μm至约4.2μm、或约3.0μm至约4.8μm、或约3.0μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3.5μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约4.5μm或约4.0μm。在一些实施例中，包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
在本发明的一些实施例中，所述有核细胞对于所述个体是自体的或同种异体的。在一些实施例中，所述有核细胞是免疫细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。在一些实施例中，所述有核细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。在一些实施例中，用佐剂调节所述有核细胞以形成经调节的细胞。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时至约24小时、约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以对所述细胞进行调节。在一些实施例中，在将所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA引入到所述有核细胞中之前或之后调节所述有核细胞。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR 9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909。
在本发明的一些实施例中，所述经调节的细胞是经调节的多个PBMC。在一些实施例中，所述多个PBMC被修饰以增加共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的表达。在一些实施例中，所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些实施例中，所述多个PBMC被修饰以增加一种或多种细胞因子的表达。在一些实施例中，所述多个PBMC被修饰以包括嵌合膜结合细胞因子。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子是包括所述细胞因子和跨膜结构域的融合蛋白。在一些实施例中，所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。在一些实施例中，所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。在一些实施例中，所述细胞因子是I型细胞因子。在一些实施例中，所述细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β或IL-21或其功能变体。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列。
在一些实施例中，与多个未经调节的PBMC中的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个PBMC的所述B细胞中上调，其中所述共刺激分子是CD80和/或CD86。在一些实施例中，与多个未经调节的PBMC相比，所述多个PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的增加的表达。在一些实施例中，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达比所述多个未经调节的PBMC的表达增加超过约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超过10倍。
在本发明的一些实施例中，包括有核细胞的所述组合物被施用多次。在一些实施例中，所述组合物被静脉内施用。在一些实施例中，所述个体是人。在一些实施例中，在施用另一种疗法之前、同时或之后施用所述组合物。在一些实施例中，另一种疗法是用于免疫肿瘤疗法的化学疗法、放射疗法、抗体、细胞因子、免疫检查点抑制剂或双特异性多肽。
在一些方面，本发明提供了包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包括有核细胞，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些实施例中，所述mRNA的核苷酸序列被密码子优化以在所述有核细胞中表达。在一些实施例中，所述mRNA的一个或多个残基被修饰。在一些实施例中，所述mRNA的一个或多个残基是硫代磷酸酯残基、假尿苷残基、N1-甲基腺苷残基、5-甲基胞苷残基或吗啉代残基。
在一些实施例中，所述蛋白质或其片段是包括所述蛋白质或其片段和一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序的融合蛋白。在一些实施例中，所述mRNA包括一个或多个编码免疫蛋白酶体靶向基序的核酸序列，其中所述mRNA的翻译产生所述蛋白质与所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序的融合蛋白。在一些实施例中，与在不存在免疫蛋白酶体靶向基序的情况下所述细胞中的所述蛋白质的降解和/或源自所述蛋白质的肽在所述细胞的表面上的呈递相比，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序增强所述细胞中的所述蛋白质的降解和/或源自所述蛋白质的肽在所述细胞的表面上的呈递。在一些实施例中，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序位于所述融合蛋白的N末端和/或C末端。在一些实施例中，其中所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序是破坏盒(D-盒)结构域、KEKE结构域和/或sec/MITD结构域。
在一些实施例中，本发明提供了包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括源自蛋白质的两种或更多种抗原；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些实施例中，所述细胞包括源自所述蛋白质的三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或多于十种抗原。在一些实施例中，所述抗原中的至少两种抗原包括部分重叠的氨基酸序列。在一些实施例中，所有抗原的组合氨基酸序列与所述蛋白质的氨基酸序列重叠约90％或更多。在一些实施例中，所述抗原是多肽，所述多肽包括所述蛋白质的两个或更多个表位。在一些实施例中，所述抗原是多肽，所述多肽包括所述蛋白质的一个或多个表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，一个或多个表位在N末端和/或C末端上侧接有一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，N末端和/或C末端侧接多肽源自免疫原性合成长肽(SLP)。在一些实施例中，所述N末端和/或C末端侧接多肽源自疾病相关免疫原性SLP。在一些实施例中，所述一种或多种抗原是与大于约90％的蛋白质的氨基酸序列或约100％的蛋白质的氨基酸序列相对应的一系列重叠的SLP。
在本发明的一些实施例中，其中所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、癌基因、新抗原、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白的产物。在一些实施例中，刺激个体的免疫应答用于治疗癌症、传染性疾病或病毒相关疾病。在一些实施例中，所述病毒相关疾病是与人乳头瘤病毒(HPV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、单纯疱疹病毒(HSV-2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、人疱疹病毒6(HHV-6)、人疱疹病毒7(HHV-7)、人疱疹病毒8(HHV-8)、巨细胞病毒(CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)或流感相关的疾病。在一些实施例中，所述蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。在一些实施例中，所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施例中，所述蛋白质是HPV E6或HPV E7蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。在一些实施例中，所述HBV蛋白是核心蛋白、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是CMV蛋白质。在一些实施例中，所述蛋白质是CMV结构蛋白质。在一些实施例中，所述蛋白质是CMV pp65蛋白质。在一些实施例中，所述蛋白质是流感蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是流感基质蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是流感蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是流感基质蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是流感M1蛋白质。在一些实施例中，刺激个体的免疫应答用于治疗黑色素瘤。在一些实施例中，所述蛋白质是由T细胞识别的黑色素瘤相关抗原(MART-1)。
在本发明的一些实施例中，所述组合物进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述组合物与佐剂结合施用。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR 9激动剂。
在本发明的一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞通过以下制备：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段的有核细胞。在一些实施例中，包括编码所述蛋白质或其片段的mRNA的所述有核细胞通过以下制备：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的有核细胞。在一些实施例中，包括两种或更多种抗原的所述有核细胞通过以下制备：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述两种或更多种抗原通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育，以允许所述两种或更多种抗原进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括两种或更多种抗原的有核细胞。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3.0μm至约4.2μm、或约3.0μm至约4.8μm、或约3.0μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3.5μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约4.5μm或约4.0μm。在一些实施例中，包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
在本发明的一些实施例中，所述有核细胞对于所述个体是自体的或同种异体的。在一些实施例中，所述有核细胞是免疫细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。在一些实施例中，所述有核细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。在一些实施例中，用佐剂调节所述有核细胞以形成经调节的细胞。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时至约24小时、约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以对所述细胞进行调节。在一些实施例中，在将所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA引入到所述有核细胞中之前或之后调节所述有核细胞。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR 9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909。
在本发明的一些实施例中，所述经调节的细胞是经调节的多个PBMC。在一些实施例中，所述多个PBMC被修饰以增加共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的表达。在一些实施例中，所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些实施例中，所述多个PBMC被修饰以增加一种或多种细胞因子的表达。在一些实施例中，所述多个PBMC被修饰以包括嵌合膜结合细胞因子。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子是包括所述细胞因子和跨膜结构域的融合蛋白。在一些实施例中，所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。在一些实施例中，所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。在一些实施例中，所述细胞因子是I型细胞因子。在一些实施例中，所述细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β或IL-21或其功能变体。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列。
在一些实施例中，与多个未经调节的PBMC中的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个PBMC的所述B细胞中上调，其中所述共刺激分子是CD80和/或CD86。在一些实施例中，与多个未经调节的PBMC相比，所述多个PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的增加的表达。在一些实施例中，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达比所述多个未经调节的PBMC的表达增加超过约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超过10倍。
在一些方面，本发明提供了用于刺激个体的免疫应答的组合物，其中所述组合物包括有效量的如本文所描述的组合物；其中所述组合物以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些方面，本发明提供了用作药物的组合物，其中所述组合物包括有效量的如本文所描述的组合物；其中所述组合物以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些方面，本发明提供了用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的组合物，其中所述组合物包括有效量的如本文所描述的组合物；其中所述组合物以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些实施例中，所述组合物进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述组合物与佐剂结合施用。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，包括有核细胞的所述组合物被施用多次。在一些实施例中，所述组合物被静脉内施用。在一些实施例中，所述个体是人。在一些实施例中，在施用另一种疗法之前、同时或之后施用所述组合物。在一些实施例中，另一种疗法是用于免疫肿瘤疗法的化学疗法、放射疗法、抗体、细胞因子、免疫检查点抑制剂或双特异性多肽。
在一些方面，本发明提供了组合物用于在制备用于刺激个体的免疫应答的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的如本文所描述的组合物；其中所述组合物以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些方面，本发明提供了组合物在制备用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的如本文所描述的组合物；其中所述组合物以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些实施例中，所述组合物进一步包括佐剂。在一些实施例中，所述组合物被调配用于与佐剂结合施用。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，包括有核细胞的所述组合物被施用多次。在一些实施例中，所述组合物被静脉内施用。在一些实施例中，所述个体是人。在一些实施例中，在施用另一种疗法之前、同时或之后施用所述组合物。在一些实施例中，另一种疗法是用于免疫肿瘤疗法的化学疗法、放射疗法、抗体、细胞因子、免疫检查点抑制剂或双特异性多肽。
在一些实施例中，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒用于本文所描述的方法中的任何一种方法。在一些实施例中，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包括本文所描述的组合物中的任何组合物。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包括以下中一种或多种：缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器或具有用于向个体施用所述组合物来以HLA未知的方式刺激免疫应答的说明的包装插页。
在一些方面，本发明提供了用于产生包括蛋白质或其片段的有核细胞的方法；所述方法包括将所述蛋白质或其片段引入到所述有核细胞中，其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些方面，本发明提供了用于产生包括蛋白质或其片段的有核细胞的方法；所述方法包括将编码所述蛋白质或其片段的mRNA引入到所述有核细胞中，其中所述mRNA被表达以产生所述蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些方面，本发明提供了用于产生包括蛋白质的两种或更多种抗原的有核细胞的方法；所述方法包括将所述两种或更多种抗原引入到所述有核细胞中；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些实施例中，将所述蛋白质或其片段细胞内引入到所述有核细胞包括：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段的有核细胞。在本发明的一些实施例中，包括编码所述蛋白质或其片段的mRNA的所述有核细胞通过以下制备：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的有核细胞。在一些实施例中，包括两种或更多种抗原的所述有核细胞通过以下制备：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述两种或更多种抗原通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育，以允许所述两种或更多种抗原进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括两种或更多种抗原的有核细胞。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3.5μm至约4.2μm、或约3.5μm至约4.8μm、或约3.5μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3.5μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约4.5μm。在一些实施例中，包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。在一些实施例中，所述方法进一步包括用佐剂调节所述有核细胞以形成经调节的细胞。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时至约24小时、约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以对所述细胞进行调节。在一些实施例中，在将所述蛋白质或其片段、编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA或来自蛋白质的所述两种或更多种抗原引入到所述有核细胞中之前或之后调节所述有核细胞。
在一些方面，本发明提供了用于增强免疫细胞的活性的方法，所述方法包括在所述免疫细胞中表达编码嵌合膜结合细胞因子的核酸。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子是包括跨膜结构域和细胞因子的融合蛋白。在一些实施例中，所述跨膜结构域是转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)或肿瘤坏死因子跨膜结构域。在一些实施例中，所述细胞因子是I型细胞因子。在一些实施例中，所述细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β或IL-21或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。在一些实施例中，所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述免疫细胞进一步包括抗原。在一些实施例中，所述免疫细胞进一步包括编码抗原的mRNA。在一些实施例中，所述抗原是蛋白质或其片段，其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，所述免疫细胞进一步包括源自蛋白质的两种或更多种抗原。在一些实施例中，所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、癌基因、新抗原、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白的产物。在一些实施例中，所述蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。在一些实施例中，所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施例中，所述蛋白质是HPV E6或HPV E7蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。在一些实施例中，所述HBV蛋白是核心蛋白、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
在本发明的一些实施例中，所述免疫细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。在一些实施例中，所述免疫细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。在一些实施例中，用佐剂调节所述有核细胞以形成经调节的细胞。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时至约24小时、约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以对所述细胞进行调节。在一些实施例中，在将所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA引入到所述有核细胞中之前或之后调节所述有核细胞。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。
在本发明的一些实施例中，包括所述嵌合膜结合细胞因子的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子的免疫细胞。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸是编码所述嵌合膜结合细胞因子的mRNA。在一些实施例中，包括所述嵌合膜结合细胞因子和抗原的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸和所述抗原进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。在一些实施例中，包括所述嵌合膜结合细胞因子和编码蛋白质或其片段的mRNA的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸和编码所述抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和/或编码所述抗原的所述核酸是mRNA。在一些实施例中，包括所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3.5μm至约4.2μm、或约3.5μm至约4.8μm、或约3.5μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3.5μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约4.5μm。在一些实施例中，包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
在一些方面，本发明提供了用于增强免疫细胞的活性的组合物，所述组合物包括所述免疫细胞中的嵌合膜结合细胞因子。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子是包括跨膜结构域和细胞因子的融合蛋白。在一些实施例中，所述跨膜结构域是转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)或肿瘤坏死因子跨膜结构域。在一些实施例中，所述细胞因子是I型细胞因子。在一些实施例中，所述细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β或IL-21或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。在一些实施例中，所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述免疫细胞进一步包括抗原。在一些实施例中，所述免疫细胞进一步包括编码抗原的mRNA。在一些实施例中，所述抗原是蛋白质或其片段，其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，所述免疫细胞进一步包括源自蛋白质的两种或更多种抗原。在一些实施例中，所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、癌基因、新抗原、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白的产物。在一些实施例中，所述蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。在一些实施例中，所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施例中，所述蛋白质是HPV E6或HPV E7蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。在一些实施例中，所述HBV蛋白是核心蛋白、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
在本发明的一些实施例中，所述免疫细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。在一些实施例中，所述免疫细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。在一些实施例中，用佐剂调节所述有核细胞以形成经调节的细胞。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时至约24小时、约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以对所述细胞进行调节。在一些实施例中，在将所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA引入到所述有核细胞中之前或之后调节所述有核细胞。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。
在本发明的一些实施例中，包括所述嵌合膜结合细胞因子的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子的免疫细胞。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸是编码所述嵌合膜结合细胞因子的mRNA。在一些实施例中，包括所述嵌合膜结合细胞因子和抗原的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸和所述抗原进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。在一些实施例中，包括所述嵌合膜结合细胞因子和编码蛋白质或其片段的mRNA的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸和编码所述抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和/或编码所述抗原的所述核酸是mRNA。在一些实施例中，包括所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3.5μm至约4.2μm、或约3.5μm至约4.8μm、或约3.5μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3.5μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约4.5μm。在一些实施例中，包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
在一些方面，本发明提供了用作药物的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括细胞的组合物，所述细胞包括如本文所描述的嵌合膜结合细胞因子。在一些方面，本发明提供了用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括细胞的组合物，所述细胞包括如本文所描述的嵌合膜结合细胞因子。
在一些方面，本发明提供了用于产生免疫细胞的方法，所述免疫细胞包括嵌合膜结合细胞因子，所述方法包括将编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸引入到所述免疫细胞。在一些实施例中，包括所述嵌合膜结合细胞因子的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子的免疫细胞。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸是编码所述嵌合膜结合细胞因子的mRNA。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3.5μm至约4.2μm、或约3.5μm至约4.8μm、或约3.5μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3.5μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约4.5μm。在一些实施例中，包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
附图说明
图1是示出了挤压装载有编码膜结合细胞因子的mRNA的PBMC中的膜结合细胞因子(IL-12、IFN-α2a)的表面表达的荧光图。(G4S)3是SEQ ID NO:73。
图2是示出了挤压装载有编码膜结合细胞因子的mRNA的PBMC中的膜结合细胞因子(IL-12、IFN-α2a)的细胞因子信号传导活性的图。(G4S)3是SEQ ID NO:73。
图3是示出了挤压装载有编码膜结合IL-2的mRNA的PBMC中的膜结合IL-2的表面表达的持续时间的图。(G4S)3是SEQ ID NO:73、(EA3K)3是SEQ ID NO:74。
图4是示出了挤压装载有编码膜结合IL-2的mRNA的PBMC中的膜结合IL-2的细胞因子信号传导活性的图。(G4S)3是SEQ ID NO:86、(G4S)3是SEQ ID NO:73、(EA3K)3是SEQ IDNO:74。
图5是示出了E711-20应答者T细胞在与装载有重组E7蛋白或E7.6 SLP的PBMC共培养时的IFN-γ分泌量的图。
图6是示出了挤压装载有天然E6 mRNA或密码子优化的E6 mRNA的PBMC的E6蛋白表达量的蛋白质印迹。
图7是示出了挤压装载有密码子优化的E6 mRNA的PBMC的E6蛋白的翻译和表达的动力学的蛋白质印迹。
图8是示出了挤压装载有天然E7 mRNA、密码子优化的E7 mRNA或进一步编码D-盒结构域的E7 mRNA的PBMC的E6蛋白的动力学的蛋白质印迹。
图9是示出了E711-20应答者T细胞在与挤压装载有天然E7 mRNA、密码子优化的E7mRNA或进一步编码D-盒结构域的E7 mRNA的PBMC共培养时的IFN-γ分泌量的图。
图10A和10B是示出了E711-20应答者T细胞在与挤压装载有编码E7蛋白或E7 SLP的指定mRNA的PBMC分别共培养6小时或过夜时的IFN-γ分泌量的图。
图11A和11B是示出了E711-20应答者T细胞在与挤压装载有编码E7蛋白的指定mRNA的PBMC分别共培养6小时或过夜时的IFN-γ分泌量的图。
图12A、B含有示出了PBMC中的CD-86表达和挤压装载有指定量的编码CMV pp65抗原、CD86和/或膜结合IL-12(mbIL-12)的mRNA的PBMC内的成分细胞类型的图。
图13A、B含有示出了PBMC中的膜结合IL-12(mbIL-12)表达和挤压装载有指定量的编码CMV pp65抗原、CD86和/或mbIL-12的mRNA的PBMC内的成分细胞类型的图。
图14是示出了当PBMC挤压装载有指定量的编码CMV pp65抗原、CD86和/或mbIL-12的mRNA时，CD3+CD8+应答者T细胞群体内的IFN-γ+CD45RO+群体的百分比的图。
图15是示出了当PBMC挤压装载有指定量的编码CMV pp65抗原、CD86和/或mbIL-12的mRNA并且随后用1μM的pp65抗原进一步再刺激时，CD3+CD8+应答者T细胞群体内的IFN-γ+CD45RO+群体的百分比的图。
图16A-E示出了当PBMC挤压装载有指定量的编码CMV pp65抗原、CD86和/或mbIL-12的mRNA并且随后用1μM的pp65抗原进一步再刺激时，功能性标志物IFN-γ、IL-2、TNF-α、颗粒酶B、PD-1分别在激活的应答者T细胞群体内的表达量。
图17A、B含有示出了PBMC中的CD-86表达和挤压装载有指定量的编码CMV pp65抗原、CD86和/或膜结合IL-12(mbIL-12)的mRNA的PBMC内的成分细胞类型的图。
图18A、B含有示出了PBMC中的膜结合IL-12(mbIL-12)表达和挤压装载有指定量的编码CMV pp65抗原、CD86和/或mbIL-12的mRNA的PBMC内的成分细胞类型的图。
图19含有示出了当PBMC挤压装载有指定量的编码CMV pp65抗原、CD86和/或mbIL-12的mRNA并在有或没有CpG佐剂激活的情况下进一步培养时，CMV pp65四聚体阳性应答者T细胞量以及CD3+CD8+应答者T细胞内的CMV pp65四聚体阳性群体的百分比的图。
图20含有示出了当PBMC挤压装载有指定量的编码CMV pp65抗原、CD86和/或mbIL-12的mRNA，在有或没有1μM的pp65抗原再刺激的情况下处理并在有或没有CpG佐剂的调节的情况下进一步培养时，CMV pp65四聚体阳性应答者T细胞量以及CD3+CD8+应答者T细胞内的CMV pp65四聚体阳性群体的百分比的图。
图21A、B、C、D、E含有示出了当PBMC挤压装载有指定量的编码CMV pp65抗原、CD86和/或mbIL-12的mRNA时，功能性标志物颗粒酶B、IFN-γ、IL-2、TNF-α、PD-1分别在激活的应答者T细胞群体内的表达量的图。
图22A、B含有分别示出了PBMC中的CD86表达细胞的百分比和CD86表达量以及挤压装载有编码CMV pp65抗原、CD86、膜结合IL-2(mbIL-2)和/或膜结合IL-12(mbIL-12)的指定mRNA的PBMC内的成分细胞类型的图。
图22A、B含有分别示出了PBMC中的CD86表达细胞的百分比和CD86表达量以及挤压装载有编码CMV pp65抗原、CD86、膜结合IL-2(mbIL-2)和/或膜结合IL-12(mbIL-12)的指定mRNA的PBMC内的成分细胞类型的图。
图23A、B含有分别示出了PBMC中的膜结合IL-2(mbIL-2)表达细胞的百分比和mbIL-2表达量以及挤压装载有编码CMV pp65抗原、CD86、膜结合IL-2(mbIL-2)和/或膜结合IL-12(mbIL-12)的指定mRNA的PBMC内的成分细胞类型的图。
图24A、B含有分别示出了PBMC中的膜结合IL-12(mbIL-12)表达细胞的百分比和mbIL-12表达量以及挤压装载有编码CMV pp65抗原、CD86、膜结合IL-2(mbIL-2)和/或膜结合IL-12(mbIL-12)的指定mRNA的PBMC内的成分细胞类型的图。
图25含有示出了当PBMC挤压装载有编码CMV pp65抗原、CD86、mbIL-2和/或mbIL-12的指定mRNA，在有或没有1μM的HLA-B*07限制性pp65抗原肽的情况下进一步再刺激(B07肽再刺激)时，CD3+CD8+应答者T细胞内的IFN-γ+群体量的图。
图26是示出了当PBMC挤压装载有编码CMV pp65抗原、CD86、mbIL-2和/或mbIL-12的指定mRNA，在有或没有1μM的HLA-B*07限制性pp65抗原肽的情况下进一步再刺激(B07肽再刺激)时，CD3+CD8+应答者T细胞内的IFN-γ+CD45RO+群体量的图。
图27A、B是分别示出了挤压装载有编码CMV pp65抗原、CD86、膜结合IL-2(mbIL-2)和/或膜结合IL-12(mbIL-12)的指定mRNA的PBMC中的CD86表达量和CD86表达细胞的百分比的图。
图27C、D是分别示出了挤压装载有编码CMV pp65抗原、CD86、膜结合IL-2(mbIL-2)和/或膜结合IL-12(mbIL-12)的指定mRNA的PBMC中的膜结合IL-2(mbIL-2)表达量和mbIL-2表达细胞的百分比的图。
图27E、F是分别示出了挤压装载有编码CMV pp65抗原、CD86、膜结合IL-2(mbIL-2)和/或膜结合IL-12(mbIL-12)的指定mRNA的PBMC中的膜结合IL-2(mbIL-2)表达量和mbIL-2表达细胞的百分比的图。
图28含有示出了当PBMC挤压装载有编码CMV pp65抗原、CD86、mbIL-2和/或mbIL-12的指定mRNA，在有或没有对HLA-A*01或HLA-B*07限制(YSE(A01)、TPR(B07)或RPH(B07))具有特异性的1μM的pp65抗原肽的情况下进一步再刺激时，CD3+CD8+应答者T细胞内的IFN-γ+CD45RO+群体量的图。
图29A、B是分别示出了挤压装载有指定量的编码流感M1抗原、CD86、膜结合IL-2(mbIL-2)和/或膜结合IL-12(mbIL-12)的mRNA的PBMC中的CD86表达细胞的百分比和CD86表达量的图。
图29C、D是分别示出了挤压装载有指定量的编码流感M1抗原、CD86、膜结合IL-2(mbIL-2)和/或膜结合IL-12(mbIL-12)的mRNA的PBMC中的膜结合IL-2(mbIL-2)表达细胞的百分比和mbIL-2表达量的图。
图29E、F是分别示出了挤压装载有指定量的编码流感M1抗原、CD86、膜结合IL-2(mbIL-2)和/或膜结合IL-12(mbIL-12)的mRNA的PBMC中的膜结合IL-12(mbIL-12)表达细胞的百分比和mbIL-12表达量的图。
图30是示出了当PBMC挤压装载有指定量的编码流感M1抗原、CD86、mbIL-2和/或mbIL-12的mRNA，在有1μM的M1抗原肽的情况下进一步再刺激时，IFN-γ+CD45RO+CD8 T细胞量的图。
图31是示出了当PBMC挤压装载有指定量的编码流感M1抗原、CD86、mbIL-2和/或mbIL-12的mRNA，在有1μM的M1抗原肽的情况下进一步再刺激时，CD3+CD8+应答者T细胞内的IFN-γ+CD45RO+群体量的图。
图32含有示出了当PBMC挤压装载有指定量的编码M1抗原、CD86、mbIL-2和/或mbIL-12的mRNA，在有或没有1μM的pp65抗原再刺激的情况下处理并在有或没有CpG佐剂的调节的情况下进一步培养时，CD3+CD8+应答者T细胞内的流感M1四聚体阳性T细胞群体量的图。
图33是示出了确定挤压装载有编码HPV16 E6的mRNA的特异性HLA单倍型的PBMC是否可以诱导抗原特异性T细胞应答的实验的示意图。
图34是与E6 mRNA挤压装载的PBMC(E6 mRNA)、未经处理的PBMC(无接触)、模拟挤压装载的PBMC(空挤压)或掺有1mM E615-24肽的无接触PBMC(阳性对照)共培养，并根据制造商的方案开发的E615-24应答者T细胞的ELISPOT板的图像。
图35示出了对与E6 mRNA挤压装载的PBMC(E6 mRNA)、掺有1mM E615-24肽的未经处理的PBMC(阳性对照)共培养，并根据制造商的方案开发的E615-24应答者T细胞的IFN-γELISPOT测定中的每个细胞的斑块形成单位(SFU)的平均量。
图36示出了对与E6 mRNA挤压装载的PBMC(E6 mRNA)、未经处理的PBMC(空挤压)、模拟挤压装载的PBMC(空挤压)或掺有1mM E615-24肽的未处理的PBMC(阳性对照)共培养，并根据制造商的方案开发的E615-24应答者T细胞的IFN-γELISPOT测定的平均斑块大小。
图37是示出了挤压装载有E7 mRNA的特异性HLA单倍型的PBMC可以引发抗原特异性T细胞应答的时间长度的示意图。
图38A是示出了在与挤压装载有(i)E7 mRNA、(ii)E7 mRNA和E6mRNA、(iv)E7.6合成长肽(SLP)或(v)无货物(空挤压)的PBMC，或与在存在E711-20肽(E7最小表位)的情况下的未处理的PBMC共培养的E711-20应答者T细胞上的IFN-γELISA的结果的图。
图38B是示出了在与挤压装载有(i)E7 mRNA、(ii)E7 mRNA和E6mRNA、(iv)E7.6合成长肽(SLP)或(v)无货物(空挤压)的PBMC，或与在存在E711-20肽(E7最小表位)的情况下的未处理的PBMC共培养的E711-20应答者T细胞上的IFN-γELISA的结果的图，其中将所述PBMC在共培养之前培养指定的时间段。
图39A是示出了在与挤压装载有(i)E7 mRNA、(ii)E7 mRNA和E6mRNA、(iv)E7.6合成长肽(SLP)或(v)无货物(空挤压)的PBMC，或与在存在E711-20肽(E7最小表位)的情况下的未处理的PBMC共培养的E711-20应答者T细胞上的IFN-γELISA的结果的图。
图39B是示出了在与挤压装载有(i)E7 mRNA、(ii)E7 mRNA和E6mRNA、(iv)E7.6合成长肽(SLP)或(v)无货物(空挤压)的PBMC，或与在存在E711-20肽(E7最小表位)的情况下的未处理的PBMC共培养的E711-20应答者T细胞上的IFN-γELISA的结果的图，其中将所述PBMC在共培养之前培养指定的时间段。
图40是示出了对与PBMC挤压装载有(i)500μg/ml E6 mRNA和500μg/ml E7 mRNA，(ii)编码CD86、膜结合IL-2(mbIL-2)和膜结合IL-12(mbIL-12)的mRNA，(iii)E6和E7 mRNA以及编码CD86、mbIL-2和mbIL-12的mRNA，(iv)E6和E7合成长肽(SLP)或(v)无货物(空挤压)的PBMC，或与在存在E629-38肽(E6最小表位)和/或E7最小肽(E7最小表位)的情况下的未处理的PBMC共培养的E629-38 TCR Jurkat Lucia NFAT细胞的QUANTI-Luc GOLD荧光素酶测定的发光的图。
图41A、B是示出了对与PBMC挤压装载有(i)E6 mRNA和E7 mRNA，(ii)E7.6和E6合成长肽(SLP)或(iii)无货物(空挤压)的PBMC，或与在存在E629-38肽(E6最小表位)和/或E7最小肽(E7最小表位)的情况下的未处理的PBMC共培养的E629-38 TCR Jurkat Lucia NFAT细胞的QUANTI-Luc GOLD荧光素酶测定的发光的图。
图42A是示出了在转导E619-28 TCR或E711-19 TCR后的E6或E7特异性T细胞的FAC分析的图。图42B、C是示出了在与以下共培养时的E6或E7特异性T细胞的增加的图：E6+E7+信号2/3mRNA细胞(挤压装载有编码E6、E7和信号2/3介体的mRNA的PBMC)、仅E6+E7 mRNA细胞(挤压装载有编码E6、E7的mRNA的PBMC)、信号2/3mRNA(挤压装载有信号2/3介体的mRNA的PBMC)或对照PBMC(空挤压)。图42D、E、F、G、H、I是示出了在与以下共培养时的经E6或E7-TCR转导的T细胞中的产生IFNγ的T细胞或产生TNF-α的T细胞的刺激的图：E6+E7+信号2/3mRNA细胞(挤压装载有编码E6、E7和信号2/3介体的mRNA的PBMC)、仅E6+E7 mRNA细胞(挤压装载有编码E6、E7的mRNA的PBMC)、信号2/3mRNA(挤压装载有信号2/3介体的mRNA的PBMC)或对照PBMC(空挤压)，并且在用E6或E7最小表位再刺激时。
图43A、B、C、D和E是示出了用以下免疫的小鼠中的pp65抗原特异性T细胞的增加的图：eAPC-CMV细胞(挤压装载有编码pp65和信号2/信号3介体的mRNA的PBMC)、仅pp65细胞(挤压装载有编码pp65的mRNA的PBMC)或未处理的PBMC(无接触)。图43F、G、H和图43I、J、K是示出了用以下免疫的小鼠中的产生IFNγ的T细胞、产生TNF-α的T细胞或产生IL-2T的细胞的刺激的图：eAPC-CMV细胞(挤压装载有编码pp65和信号2/信号3介体的mRNA的PBMC)、仅pp65细胞(挤压装载有编码pp65的mRNA的PBMC)或未处理的PBMC(无接触)。
具体实施方式
在一些方面，本发明提供了用于刺激个体的免疫应答和/或对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述个体施用包括有核细胞(例如，PBMC)的组合物，所述有核细胞包括蛋白质或其片段，其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些方面，本发明提供了用于刺激个体的免疫应答和/或对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，所述有核细胞包括细胞内递送的蛋白质或其片段；其中所述有核细胞通过以下制备：首先使包括输入细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成扰动的输入有核细胞；以及然后将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育足够长的时间，以允许所述蛋白质或其片段进入所述扰动的输入细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段的所述经修饰的有核细胞，其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些方面，本发明提供了用于刺激个体的免疫应答和/或对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，所述有核细胞包括细胞内递送的蛋白质或其片段；其中所述有核细胞通过以下制备：首先使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA在所述有核细胞中表达，由此产生包括所述蛋白质或其片段的所述经修饰的有核细胞，其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。本公开的某些方面涉及用于产生包括有核细胞的组合物的方法，所述有核细胞包括细胞内递送的蛋白质或其片段，其中有核细胞通过收缩部，其中所述收缩部使所述细胞变形，由此使得所述细胞扰动，使得蛋白质或其片段进入要修饰的所述免疫细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是多个PBMC。在一些实施例中，通过与一种或多种佐剂一起温育来调节所述有核细胞。在一些实施例中，细胞内引入的蛋白质或片段包括全部或大部分天然蛋白质序列。在一些实施例中，由细胞内引入的mRNA编码的蛋白质或片段包括全部或大部分天然蛋白质序列。
本文所述或所引用的技术和程序总体上被本领域的技术人员充分理解并通常用于使用常规方法，例如，以下中描述的广泛使用的方法：《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:A Laboratory Manual》(Sambrook等人,第4版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.),2012)；《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编辑,2003)；丛书《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社公司(Academic Press,Inc.))；《聚合酶链反应2：一种实用方法(PCR 2:A Practical Approach)》(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑,1995)；《抗体实验室手册(Antibodies,ALaboratory Manual)》(Harlow和Lane编辑,1988)；《动物细胞的培养：基础技术和专门应用手册(Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique and SpecializedApplications)》(R.I.Freshney,第6版,约翰威利父子出版公司(J.Wiley和Sons),2010)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编辑,1984)；《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,胡马纳出版社(Humana Press)；《细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:ALaboratory Notebook)》(J.E.Cellis编辑,学术出版社(AcademicPress),1998)；《细胞和组织培养概论(Introduction to Cell and Tissue Culture)》(J.P.Mather和P.E.Roberts,普莱纽姆出版社(Plenum Press),1998)；《细胞和组织培养：实验室程序(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures)》(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,约翰威利父子出版公司,1993-8)；《实验免疫学手册(Handbook ofExperimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑,1996)；《哺乳动物细胞的基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》,(Mullis等人编辑,1994)；《当代免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编辑,1991)；《精编分子生物学实验指南(Short Protocols inMolecular Biology)》(Ausubel等人编辑,约翰威利父子出版公司,2002)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway等人,2004)；《抗体(Antibodies)》(P.Finch,1997)；《抗体：实用方法(Antibodies:APractical Approach)》(D.Catty.编辑,IRL出版社(IRLPress),1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonal Antibodies:APracticalApproach)》(P.Shepherd和C.Dean编辑,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)；《使用抗体：实验室手册(Using Antibodies:ALaboratory Manual)》(E.Harlow和D.Lane,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1999)；《抗体(The Antibodies)》(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,哈伍德学术出版社(Harwood AcademicPublishers),1995)；以及《癌症：肿瘤学原理和实践(Cancer:Principles and Practiceof Oncology)》(V.T.DeVita等人编辑,J.B.利平科特出版公司(J.B.LippincottCompany),2011)。
定义
出于解释本说明书的目的，以下定义将适用并且每当适当时，以单数形式使用的术语也将包含复数形式，并且反之亦然。如果以下阐述的任何定义与通过引用并入本文的任何文件相冲突，则以以下阐述的定义为准。
除非另有说明，否则如本文所使用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指示物。
应当理解，本文所描述的本发明的方面和实施例包含“包括方面和实施例”、“由方面和实施例组成”以及“基本上由方面和实施例组成”。
如本文所使用的术语“约”是指所属技术领域的技术人员易于知晓的相应值的常见偏差范围。本文中提到“约”一个值或参数包含(并且描述)针对所述值或参数本身的实施例。
如本文所使用的，“治疗”是用于获得有益或期望的临床结果的方法。如本文所使用的，“治疗”覆盖对于哺乳动物(包含人类)的疾病的治疗剂的任何施用或应用。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包含但不限于以下中的任何一种或多种：缓解一种或多种症状、减轻疾病程度、预防或延缓疾病的扩散(例如，转移，例如转移到肺或淋巴结)、预防或延缓疾病的复发、延缓或减慢疾病进展、改善疾病状态、抑制疾病或疾病的进展、抑制或减慢疾病或疾病的进展、控制疾病的发展以及缓解(无论是部分还是全部的)。“治疗”还涵盖减少增殖性疾病的病理学结果。本发明的方法设想了治疗的这些方面中的任何一个或多个。
如本文所使用的，术语“预防性治疗”是指治疗，其中已知或怀疑个体患有某种病症或处于患有所述病症的风险，但没有表现出所述病症的症状或轻微症状。接受预防性治疗的个体可以在症状发作之前接受治疗。在一些实施例中，如果个体患有癌前病变，则可以对所述个体进行治疗。
如本文所使用的，“组合疗法”意指第一药剂与另一种药剂联合施用。“与…联合”是指除了另一种治疗模式之外还施用一种治疗模式，如除了对同一个体施用如本文所描述的免疫缀合物之外还施用如本文所描述的有核细胞的组合物。因此，“与…联合”是指在向个体递送另一种治疗模式之前、期间或之后施用一种治疗模式。
如本文所使用的术语“同时施用”意指组合疗法中的第一疗法和第二疗法的施用时间间隔不超过约15分钟，如不超过约10、5或1分钟中的任一个。当同时施用第一疗法和第二疗法时，第一疗法和第二疗法可以包含在相同组合物(例如，包括第一疗法和第二疗法两者的组合物)中或包含在单独的组合物中(例如，第一疗法包含在一种组合物中并且第二疗法包含在另一种组合物中)。
如本文所使用的，术语“顺序施用”是指组合疗法中的第一疗法和第二疗法的施用时间间隔超过约15分钟，如超过约20、30、40、50、60或更多分钟中的任一个。可以首先施用第一疗法或第二疗法。第一疗法和第二疗法包含在单独的组合物中，所述单独的组合物可以包含在相同或不同的包装或试剂盒中。
如本文所使用的，术语“同时施用”意指在组合疗法中的第一疗法的施用和第二疗法的施用相互重叠。
在癌症的情况下，术语“治疗”包含杀伤癌细胞、抑制癌细胞生长、抑制癌细胞复制、减轻整体肿瘤负担和改善一种或多种与疾病相关的症状中的任何一种或全部。
如本文所使用的术语“孔”是指开口，包含但不限于材料内的洞、裂缝、空腔、开孔、裂缝、间隙或穿孔。在一些实例中，(在所指示的地方)所述术语是指本公开的表面内的孔。在其它实例中，(在所指示的地方)孔可以指细胞膜中的孔。
如本文所使用的术语“膜”是指含有孔的选择性屏障或薄片。所述术语包含作为边界或衬里的柔韧片状结构。在一些实例中，所述术语是指含有孔的表面或过滤器。该术语不同于术语“细胞膜”。
如本文所使用的术语“过滤器”是指允许选择性通过孔的多孔制品。在一些实例中，所述术语是指含有孔的表面或膜。
术语“外源”在用于指如抗原或佐剂等与细胞相关的药剂时，是指细胞外的药剂或从细胞外递送至细胞内的药剂。所述细胞可能已经存在或可能不存在药剂，并且在外源药剂被递送后可能产生或可能不产生药剂。
如本文所使用的术语“异质”是指在结构或组成上混合或不均匀的物质。在一些实例中，所述术语是指在给定表面内具有不同大小、形状或分布的孔。
如本文所使用的术语“同质”是指在结构或组成上始终一致或均匀的物质。在一些实例中，所述术语是指在给定表面内具有一致大小、形状或分布的孔。
如本文所使用的术语“同源”是指源自相同生物体的分子。在一些实例中，所述术语是指通常在给定生物体内发现或表达的核酸或蛋白质。
术语“异源”在其涉及如编码序列和控制序列等核酸序列时表示通常不接合在一起和/或通常不与特定细胞相关的序列。因此，核酸构建体或载体的“异源”区域是在另一个核酸分子内或附着于其上的核酸片段，未发现其在自然界中与其它分子相关。例如，核酸构建体的异源区域可以包含编码序列，其两侧是未在自然界中发现与编码序列相关的序列。异源编码序列的另一实例是其中编码序列本身未在自然界中发现的构建体(例如，具有不同于天然基因的密码子的合成序列)。类似地，对于本发明的目的，将用通常不存在于细胞中的构建体转化的细胞视为异源的。如本文所使用的，等位基因变异或天然存在的突变事件不会产生异源DNA。
术语“异源”在其涉及如肽序列和多肽序列等氨基酸序列时表示通常不接合在一起和/或通常不与特定细胞相关的序列。因此，肽序列的“异源”区是在另一个氨基酸分子内或与其连接的氨基酸片段，未发现其在自然界中与其它分子相关。例如，肽构建体的异源区可以包含肽的氨基酸序列，所述肽侧接未发现与自然界中的肽的氨基酸序列相关的序列。异源肽序列的另一实例是其中肽序列本身未在自然界中发现的构建体(例如，具有不同于天然基因编码的氨基酸的合成序列)。类似地，对于本发明的目的，将用表达通常不存在于细胞中的氨基酸构建体的载体转化的细胞视为异源的。如本文所使用的，等位基因变异或天然存在的突变事件不会产生异源肽。
如本文所使用的，术语“抑制”可以指阻断、减少、消除或以其它方式拮抗特定靶标的存在或活性的行为。抑制可以指部分抑制或完全抑制。例如，抑制免疫应答可以指引起免疫应答的阻断、减少、消除或任何其它拮抗作用的任何行为。在其它实例中，核酸表达的抑制可以包含但不限于核酸转录的减少、mRNA丰度的减少(例如，沉默mRNA转录)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制等。在另一个实例中，抑制可以指减缓或停止生长的行为；例如，延缓或防止肿瘤细胞的生长。
如本文所使用的，术语“压制”可以指降低、减少、禁止、限制、减轻或以其它方式减弱特定靶标的存在或活动的行为。压制可以指部分压制或完全压制。例如，压制免疫应答可以指引起降低、减少、禁止、限制、减轻或以其它方式减弱免疫应答的任何行为。在其它实例中，核酸表达的压制可以包含但不限于核酸转录的减少、mRNA丰度的减少(例如，沉默mRNA转录)、mRNA的降解、mRNA翻译的抑制等。
如本文所使用的，术语“增强”可以指改善、加强、提高或以其它方式增加特定靶标的存在或活性的行为。例如，增强免疫应答可以指引起改善、加强、提高或以其它方式增加免疫应答的任何行为。在一个示例性实例中，增强免疫应答可以指使用抗原和/或佐剂来改善、加强、提高或以其它方式增加免疫应答。在其它实例中，核酸表达的增强可以包含但不限于核酸转录的增加、mRNA丰度的增加(例如，增加mRNA转录)、mRNA降解的减少、mRNA翻译的增加等。
如本文所使用的，术语“调节”可以指更改、改变、变化或以其它方式修饰特定靶标的存在或活性的行为。例如，调节免疫应答可以指引起更改、改变、变化或以其它方式修饰免疫应答的任何行为。在一些实例中，“调节”是指增强特定靶标的存在或活性。在一些实例中，“调节”是压制特定靶标的存在或活性。在其它实例中，调节核酸表达可以包含但不限于核酸转录的变化、mRNA丰度的变化(例如，增加mRNA转录)、mRNA降解的对应变化、mRNA翻译的变化等。
如本文所使用的，术语“诱导”可以指引发、提示、刺激、建立或以其它方式产生结果的行为。例如，诱导免疫应答可以指引起引发、促使、刺激、建立或以其它方式产生期望的免疫应答的任何行为。在其它实例中，诱导核酸表达可以包含但不限于引发核酸转录、引发mRNA翻译等。
如本文所使用的，“外周血单核细胞”或“PBMC”是指具有圆形细胞核的异质血细胞群体。可以在PBMC群体中发现的细胞的实例包含淋巴细胞，如T细胞、B细胞、NK细胞(包含自然杀伤T细胞(NKT细胞)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞))和单核细胞，如巨噬细胞和树突细胞。如本文所使用的“多个PBMC”是指包括至少两种类型血细胞的细胞的PBMC的制剂。在一些实施例中，多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞中的两种或更多种。在一些实施例中，多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞中的三种或更多种。在一些实施例中，多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞或树突细胞中的四种或更多种。在一些实施例中，多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突细胞。
PBMC可以通过本领域已知的方式分离。例如，基于PBMC与其它血细胞相比的密度，PBMC可以源自个体的外周血。在一些实施例中，使用Ficoll(例如，ficoll梯度)，PBMC源自个体的外周血。在一些实施例中，使用
细胞分离系统，PBMC源自个体的外周血。PBMC可以获自接受单采术的个体。
在一些实施例中，PBMC群体从个体中分离。在一些实施例中，多个PBMC是PBMC的自体群体，其中所述群体源自特定个体，通过本文所描述的方法中的任何方法操纵，并返回给特定个体。在一些实施例中，多个PBMC是PBMC的同种异体群体，其中所述群体源自一个个体，通过本文所描述的方法中的任何方法操纵，并施用于第二个体。
在一些实施例中，多个PBMC是PBMC的重构制剂。在一些实施例中，所述多个PBMC可以通过混合通常在PBMC群体中发现的细胞来产生；例如，通过混合T细胞、B细胞、NK细胞或单核细胞中的两种或更多种的群体。
如本文所使用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的聚合物形式。因此，该术语包含但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂交体或包括嘌呤和嘧啶碱基或其它天然的、经化学或生化修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸的主链可以包括糖和磷酸基(如通常可以存在于RNA或DNA中的)，或经修饰的或经取代的糖或磷酸基。可替代地，多核苷酸的主链可以包括合成亚基的聚合物，如氨基磷酸酯和硫代磷酸酯，并且因此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(P-NH2)、混合的硫代磷酸酯-磷酸二酯低聚物或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯低聚物。另外，通过合成互补链并在适当条件下退火链，或通过使用具有适当引物的DNA聚合酶从头合成互补链，可以从化学合成的单链多核苷酸产物中获得双链多核苷酸。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。此类氨基酸残基的聚合物可以含有天然或非天然的氨基酸残基，并且包含但不限于氨基酸残基的肽、寡肽、二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖了全长蛋白和其片段两者。所述术语还包含多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，为了本发明的目的，“多肽”是指包含对天然序列进行如缺失、添加和取代等修饰的蛋白质，(通常本质上是保守的)，只要所述蛋白质维持期望的活性。这些修饰可能是故意的，如通过定点诱变，或者可能是偶然的，如通过产生蛋白质的宿主突变或由于PCR扩增而产生的错误。
如本文所使用的，术语“佐剂”是指调节和/或产生免疫应答的物质。通常，与抗原单独施用相比，佐剂与抗原联合施用增强对抗原的免疫应答。本文描述了各种佐剂。
术语“CpG寡脱氧核苷酸”和“CpG ODN”在本文中是指长度为10至30个核苷酸的DNA分子，含有由磷酸盐分离的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸(在本文中也被称为“CpG”二核苷酸或“CpG”)。本公开的CpG ODN含有至少一个未甲基化的CpG二核苷酸。也就是说，CpG二核苷酸中的胞嘧啶没有甲基化(即，不是5-甲基胞嘧啶)。CpG ODN可以具有部分或完全的硫代磷酸酯(PS)主链。
如本文所使用的，“药学上可接受的”或“药理上相容的”是指非生物学上或其它方面不期望的材料，例如，所述材料可以并入到施用于患者的药物组合物中，而不会引起任何显著的不期望的生物学效应或以有害的方式与含有所述材料的组合物中的任何其它组分相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂优选地符合毒理学和制造测试的所需标准和/或包含在由美国食品和药物管理局(U.S.Food and Drug administration)编写的《非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)》中。
对于本文所描述的结构和功能特性中的任何结构和功能特性，确定这些特性的方法是本领域已知的。
刺激免疫应答的方法，而与宿主HLA单倍型无关
在一些方面，提供了用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞(例如，PBMC)的组合物，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，所述方法包括施用有效量的本文所描述的组合物中的任何组合物。在一些实施例中，所述个体患有癌症。
在一些方面，提供了用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
在一些方面，提供了用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA(例如，外源mRNA)；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
在一些方面，提供了用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA(例如，外源mRNA)；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
在一些实施例中，提供了用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括源自蛋白质的两种或更多种抗原；其中所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，提供了用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括源自蛋白质的两种或更多种抗原；其中所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
在一些实施例中，所述细胞包括源自所述蛋白质的两种或更多种抗原。在一些实施例中，所述细胞包括以下中的任一种：源自所述蛋白质的约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、70个、75个、80个、90个、100个或更多个抗原。在一些实施例中，所述抗原中的至少两种抗原包括部分重叠的氨基酸序列。在一些实施例中，所有抗原的组合氨基酸序列与所述蛋白质的氨基酸序列重叠约90％或更多。在一些实施例中，所有抗原的组合氨基酸序列与以下中的任一种重叠：所述蛋白质的约50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列。在一些实施例中，所述蛋白质的约80％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少两种抗原重叠。在一些实施例中，所述蛋白质的约80％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少三种抗原重叠。在一些实施例中，所述蛋白质的约90％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少两种抗原重叠。在一些实施例中，所述蛋白质的约90％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少三种抗原重叠。在一些实施例中，所述蛋白质的约95％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少两种抗原重叠。在一些实施例中，所述蛋白质的约95％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少三种抗原重叠。
在一些实施例中，所述抗原是多肽，所述多肽包括所述蛋白质的两个或更多个表位。在一些实施例实施例中，所述免疫原性肽表位与N末端侧接多肽和/或C末端侧接多肽融合。在一些实施例中，所述抗原是所述蛋白质的一个或多个表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述一个或多个表位在所述N末端和/或所述C末端侧接异源肽序列。在一些实施例中，侧接异源肽序列源自疾病相关免疫原性肽。在一些实施例中，侧接异源肽序列是非天然存在的序列。在一些实施例中，侧接异源肽序列源自免疫原性合成长肽(SLP)。在一些实施例中，N末端侧接多肽包括SEQ ID NO:5-10中的任一个的氨基酸序列和/或C末端侧接多肽包括SEQ ID NO:11-17中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
在一些实施例中，所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质(例如，但不限于新抗原)、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。在一些实施例中，所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施例中，所述蛋白质是HPV E6或HPV E7蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。
在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞通过以下制备：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段的有核细胞。在一些实施例中，包括编码所述蛋白质或其片段的mRNA的所述有核细胞通过以下制备：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的有核细胞。
在一些实施例中，所述输入细胞悬浮液可以包括所述输入有核细胞和抗原。在一些实施例中，所述输入细胞悬浮液包括所述输入有核细胞和所述蛋白质或其片段。在一些实施例中，所述输入细胞悬浮液包括所述输入有核细胞和编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA。在一些实施例中，所述方法包括在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育。在一些实施例中，所述方法包括在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育。
在一些实施例中，提供了用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括：a)使包括输入有核细胞(例如，PBMC)的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成扰动的输入有核细胞；b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段的有核细胞；以及(c)向所述个体施用包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞。在一些实施例中，提供了用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中所述mRNA被表达，由此产生包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞；以及(c)向所述个体施用包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞。在一些实施例中，所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
在一些实施例中，提供了用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括：a)使包括输入有核细胞(例如，PBMC)的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成扰动的输入有核细胞；b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段的有核细胞；以及(c)向所述个体施用包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞。在一些实施例中，提供了用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中所述mRNA被表达，由此产生包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞；以及(c)向所述个体施用包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞。在一些实施例中，所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
在一些实施例中，所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为在有核细胞群体中具有最小直径的所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为在有核细胞群体中具有最小直径的所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约2μm至约5μm、约3μm至约5μm、约2μm至约2.2μm、约2.2μm至约2.5μm、约2.5μm至约3μm、约3μm至约3.5μm、约3.5μm至约4μm、约4μm至约4.5μm、约3.2μm至约3.8μm、约3.8μm至约4.3μm、约4.2μm至约6μm或约4.2μm至约4.8μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约4.5μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约或小于2μm、2.2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、10.5μm、11μm、11.5μm、12μm、12.5μm、13μm、13.5μm、14μm、14.5μm或15μm中的任一个。在一些实施例中，包括所述输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何一种方法、用途或组合物的一些实施例中，将所述有核细胞(例如，PBMC)与所述佐剂一起温育足够长的时间以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1至约24小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约2至约10小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约3至约6小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时、2小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20小时或24小时中的任一个以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约4小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，在将所述蛋白质或其片段或所述编码蛋白质或其片段的核酸引入到所述有核细胞中之前调节所述有核细胞。在一些实施例中，在将所述蛋白质或其片段或所述编码所述蛋白质或其片段的核酸引入到所述有核细胞中之后调节所述有核细胞。在一些实施例中，用于调节的所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。示例性佐剂包含但不限于CpGODN、干扰素-α(IFN-α)、聚肌:聚胞苷酸(polyI:C)、咪喹莫特(imiquimod)(R837)、瑞喹莫德(resiquimod)(R848)或脂多糖(LPS)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909(也被称为CpG ODN 2006)。
在一些实施例中，其中所述有核细胞包括B细胞，与未经调节的有核细胞的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的有核细胞的所述B细胞中上调。在一些实施例中，所述有核细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，其中所述有核细胞是多个PBMC，与所述未经调节的多个PBMC的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个PBMC的所述B细胞中上调。在一些实施例中，所述共刺激分子是CD80和/或CD86。在一些实施例中，与未经调节的多个PBMC相比，所述经调节的多个PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的增加的表达。在一些实施例中，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达比未经调节的多个PBMC的表达增加超过约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超过10倍。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何一种方法、用途或组合物的一些实施例中，所述有核细胞是免疫细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是人细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是具有HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16的单倍型的人细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是多个PBMC。在一些实施例中，所述经调节的有核细胞是经调节的多个经修饰的PBMC。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。在一些实施例中，所述有核细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。
在一些实施例中，所述多个PBMC被进一步修饰以增加共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的表达。在一些实施例中，所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些实施例中，所述多个PBMC被进一步修饰以增加一种或多种细胞因子的表达。在一些实施例中，所述细胞因子是IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞因子是IFN-α2或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞因子是变体细胞因子(如经修饰的细胞因子)。在一些实施例中，所述多个PBMC被进一步修饰以增加一种或多种嵌合膜结合细胞因子的表达。在一些实施例中，所述细胞因子被修饰，并且所述经修饰的细胞因子是包括所述细胞因子和跨膜结构域的融合蛋白。在一些实施例中，所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。在一些实施例中，所述多个PBMC被进一步修饰以增加一种或多种嵌合膜结合细胞因子的表达。在一些实施例中，所述细胞因子被修饰，并且所述经修饰的细胞因子是包括所述细胞因子和跨膜结构域的融合蛋白。在一些实施例中，所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。在一些实施例中，所述跨膜结构域是转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)或肿瘤坏死因子(例如，FasL)跨膜结构域。在一些实施例中，所述跨膜结构域包括SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82的氨基酸序列。在一些实施例中，所述肽连接子是G4S连接子或EAAAK连接子。在实施例中，所述G4S连接子包括G4S序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复序列中的任一个。在一些实施例中，所述EAAAK连接子包括EAAAK序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复序列中的任一个。在一些实施例中，所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述多个经修饰的PBMC包括导致所述一种或多种细胞因子的表达和/或分泌增加的核酸。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸包括SEQ ID NO:71或72的核苷酸序列。在一些实施例中，所述细胞因子是刺激T细胞激活的信号3效应子。在一些实施例中，所述细胞因子诱导CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的激活。在一些实施例中，所述细胞因子诱导抗原特异性CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的激活。在一些实施例中，与非膜结合细胞因子相比，所述嵌合膜结合细胞因子增强所述细胞因子在个体中的半衰期。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子的半衰期比非膜结合细胞因子的半衰期大约增加以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，与包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞相比，所述膜结合细胞因子将所述细胞因子与由引入有所述蛋白质或其片段的所述有核细胞呈递的所述抗原的空间缀合大约延长以下中的任一者：1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96个小时或更多个小时。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括膜结合细胞因子的有核细胞表现出的局部细胞因子浓度比包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞表现出的局部细胞因子浓度大约高以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括膜结合细胞因子的有核细胞可以以比包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些实施例中，膜系细胞因子是膜系趋化因子。
在一些实施例中，所述方法包括多次施用包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞。在一些实施例中，所述方法包括约3至约9次施用包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞。在一些实施例中，所述方法包括约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15次中的任一种施用包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞。在一些实施例中，所述方法包括根据需要连续施用所述有核细胞。在一些实施例中，两次连续施用包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞之间的时间间隔为约1天至约30天。在一些实施例中，两次连续施用包括所述蛋白质或其片段的有核细胞之间的时间间隔为约21天。在一些实施例中，两次连续施用包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞之间的时间时间间隔为约1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或150天中的任一种。在一些实施例中，首次两次连续施用包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞之间的时间间隔为1天或2天。在一些实施例中，首次两次连续施用包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞之间的时间间隔为1天或2天，其中所述方法包括超过2次施用包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞(如但不限于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15次或更多次施用)。在一些实施例中，静脉内、肿瘤内和/或皮下施用包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞。在一些实施例中，静脉内施用包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞。
在一些实施例中，所述组合物进一步包括佐剂。在一些实施例中酸性，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFNγ、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、α-半乳糖神经酰胺、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。示例性佐剂包含但不限于CpG ODN、干扰素-α(IFN-α)、聚肌:聚胞苷酸(polyI:C)、咪喹莫特(R837)、瑞喹莫德(R848)或脂多糖(LPS)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909。
在一些实施例中，同时施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和所述佐剂。在一些实施例中，顺序施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和所述佐剂。在一些实施例中，静脉内、肿瘤内和/或皮下施用所述佐剂和/或包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞。在一些实施例中，静脉内施用所述佐剂和/或包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞。
在一些实施例中，在施用所述佐剂之前施用包括包含所述蛋白质或其片段的有核细胞的所述组合物。例如，在施用所述佐剂之前约1小时至约1周施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述佐剂之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述佐剂之前约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述佐剂之后施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在施用所述佐剂之后约1小时至约1周施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述佐剂之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述佐剂之后约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。
在一些实施例中，所述个体对HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16的表达呈阳性。在一些实施例中，所述个体对HLA-A*02、HLA-A*11和/或HLA-B*07的表达呈阳性。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞中的至少一个细胞对HLA-A*02、HLA-A*11和/或HLA-B*07的表达呈阳性。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％的所述有核细胞中的任一种对HLA-A*02、HLA-A*11和/或HLA-B*07的表达呈阳性。在一些实施例中，其中所述有核细胞是多个PBMC，包括所述蛋白质或其片段的所述经修饰的PBMC中的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％的T细胞中的任一种对HLA-A*02、HLA-A*11和/或HLA-B*07的表达呈阳性。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段的所述经修饰的PBMC中的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％的B细胞中的任一种对HLA-A*02、HLA-A*11和/或HLA-B*07的表达呈阳性。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段的所述经修饰的PBMC中的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％的NK细胞中的任一种对HLA-A*02、HLA-A*11和/或HLA-B*07的表达呈阳性。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段的所述经修饰的PBMC中的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或99％的单核细胞中的任一种对HLA-A*02、HLA-A*11和/或HLA-B*07的表达呈阳性。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何一种方法、用途或组合物的一些实施例中，在施用治疗剂之前、同时或之后施用包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞。在一些实施例中，所述治疗剂包括免疫检查点抑制剂、化学疗法或放射疗法中的一种或多种。在一些实施例中，所述治疗剂包括一种或多种细胞因子。在一些实施例中，所述治疗剂包括一种或多种抗体。在一些实施例中，所述治疗剂包括用于免疫肿瘤学的一种或多种双特异性多肽(例如，免疫缀合物)。
免疫检查点是所述免疫系统的调节器并且保持免疫应答处于检查。免疫检查点抑制剂可以用于促进免疫应答的增强。在一些实施例中，包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物与免疫检查点抑制剂的施用组合施用。在一些实施例中，同时施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，顺序施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和所述免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，静脉内、肿瘤内和/或皮下施用所述免疫检查点抑制剂和/或包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞。在一些实施例中，静脉内施用所述免疫检查点抑制剂和/或包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞。
在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之前施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在施用所述免疫检查点抑制剂之前约1小时至约1周施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之前约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之前约7天、约10天、约14天、约18天、约21天、约24天、约28天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之前约7天至约10天、约10天至约14天、约14天至约18天、约18天至约21天、约21天至约24天、约24天至约28天、约28天至约30天、约30天至约35天、约35天至约40天、约40天至约45天或约45天至约50天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在施用所述免疫检查点抑制剂之后约1小时至约1周施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后约7天、约10天、约14天、约18天、约21天、约24天、约28天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述免疫检查点抑制剂之后约7天至约10天、约10天至约14天、约14天至约18天、约18天至约21天、约21天至约24天、约24天至约28天、约28天至约30天、约30天至约35天、约35天至约40天、约40天至约45天或约45天至约50天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。
在一些实施例中，所述方法包括多次施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和/或多次施用所述免疫检查点抑制剂。例如，在一些实施例中，所述方法包括两次施用、三次施用、四次施用、五次施用、六次施用、七次施用、八次施用、九次施用、十次施用、十一次施用、十二次施用、十三次施用、十四次施用或十五次施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和/或所述免疫检查点抑制剂。例如，在一些实施例中，所述方法包括少于五次施用、少于十次施用、少于十五次施用、少于二十次施用、少于二十五次施用、少于三十次施用、少于五十次施用、少于七十五次施用、少于一百次施用或少于两百次施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和/或所述免疫检查点抑制剂。
示例性免疫检查点抑制剂靶向但不限于PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一个或多个。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是以下中的一种或多种：与PD-1结合的抗体、与PD-L1结合的抗体、与CTLA-4结合的抗体、与LAG3结合的抗体、或与TIM-3结合的抗体、与TIGIT结合的抗体、与VISTA结合的抗体、与TIM-1结合的抗体、与B7-H4结合的抗体或与BTLA结合的抗体。在另外的实施例中，所述抗体可以是全长抗体或任何变体，例如但不限于抗体片段、单链可变片段(ScFv)或抗原结合片段(Fab)。在另外的实施例中，所述抗体可以是双特异性的、三特异性的或多特异性的。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是与PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一个或多个结合和/或抑制其的一种或多种化学化合物。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂是与PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA、TIM1、B7-H4(VTCN1)或BTLA中的一个或多个结合和/或抑制其的一种或多种肽。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-1。在一些实施例中，所述免疫检查点抑制剂靶向PD-L1。
细胞因子可以与本文所描述的所述多个经修饰的PBMC中的任一个组合使用以实现针对癌症，例如与突变的蛋白质相关的癌症的累加或协同效应。在一些实施例中，包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物与一种或多种细胞因子的施用组合施用。在一些实施例中，同时施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和所述细胞因子。在一些实施例中，顺序施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和所述细胞因子。
在一些实施例中，在施用所述细胞因子之前施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述细胞因子之后施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在施用所述细胞因子之前约1小时至约1周施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述细胞因子之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述细胞因子之前约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述细胞因子之前约7天、约10天、约14天、约18天、约21天、约24天、约28天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述细胞因子之前约7天至约10天、约10天至约14天、约14天至约18天、约18天至约21天、约21天至约24天、约24天至约28天、约28天至约30天、约30天至约35天、约35天至约40天、约40天至约45天或约45天至约50天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述细胞因子之后施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在施用所述细胞因子之后约1小时至约1周施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述细胞因子之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述细胞因子之后约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。
示例性细胞因子包含但不限于趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子或其功能衍生物。在一些实施例中，所述细胞因子增强细胞免疫应答。在一些实施例中，所述细胞因子增强抗体应答。在一些实施例中，所述细胞因子是I型细胞因子。在一些实施例中，所述细胞因子是2型细胞因子。在一些实施例中，所述细胞因子包括以下中的一种或多种：IL-2、IL-15、IL-10、IL-12、IFN-α或IL-21。在一些实施例中，所述细胞因子包括IL-15。
在一些实施例中，在施用包括细胞因子部分的双特异性多肽之前施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用包括细胞因子部分和免疫检查点抑制剂部分的双特异性多肽之前施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，所述双特异性多肽包括CD3靶向部分和肿瘤抗原靶向部分。在一些实施例中，双特异性多肽包括靶向两个免疫检查点的部分。在一些实施例中，双特异性多肽包括靶向在间质中发现的或在癌症相关成纤维细胞上表达的抗原的部分。在一些实施例中，双特异性多肽包括靶向在间质中发现的或在癌症相关成纤维细胞上表达的抗原的部分和细胞因子部分。
化学疗法可以与本文所描述的所述多个经修饰的PBMC中的任一个组合使用以实现针对癌症，例如与突变的蛋白质相关的癌症的累加或协同效应。在一些实施例中，包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物与化学疗法的施用组合施用。在一些实施例中，同时施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和所述化学疗法。在一些实施例中，顺序施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和所述化学疗法。
在一些实施例中，在施用所述化学疗法之前施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述化学疗法之后施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在施用所述化学疗法之前约1小时至约1周施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述化学疗法之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述化学疗法之前约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述化学疗法之后施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在施用所述化学疗法之后约1小时至约1周施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述化学疗法之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述化学疗法之后约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述化学疗法之后约7天、约10天、约14天、约18天、约21天、约24天、约28天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述化学疗法之后约7天至约10天、约10天至约14天、约14天至约18天、约18天至约21天、约21天至约24天、约24天至约28天、约28天至约30天、约30天至约35天、约35天至约40天、约40天至约45天或约45天至约50天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。
在一些实施例中，所述方法包括多次施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和/或多次施用所述化学疗法。例如，在一些实施例中，所述方法包括两次施用、三次施用、四次施用、五次施用、六次施用、七次施用、八次施用、九次施用、十次施用、十一次施用、十二次施用、十三次施用、十四次施用或十五次施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和/或所述化学疗法。例如，在一些实施例中，所述方法包括少于五次施用、少于十次施用、少于十五次施用、少于二十次施用、少于二十五次施用、少于三十次施用、少于五十次施用、少于七十五次施用、少于一百次施用或少于两百次施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和/或所述化学疗法。
示例性化学疗法可以是细胞周期依赖性的或细胞周期非依赖性的。在一些实施例中，所述化学疗法包括一种或多种化学治疗剂。在一些实施例中，化学治疗剂可以靶向癌症中的细胞分裂、DNA或代谢中的一种或多种。在一些实施例中，所述化学治疗剂是基于铂的药剂，如但不限于顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(奥沙利铂)或卡铂(carboplatin)。在一些实施例中，所述化学治疗剂是紫杉烷(taxane)(如多西他赛(docetaxel)或紫杉醇(paclitaxel))。在一些实施例中，所述化学治疗剂是5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、阿霉素(doxorubicin)或伊立替康(irinotecan)。在一些实施例中，所述化学治疗剂是以下中的一种或多种：烷化剂、抗代谢剂、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂或有丝分裂抑制剂。在一些实施例中，所述化学疗法包括顺铂。
放射疗法可以与本文所描述的所述多个经修饰的PBMC中的任一个组合使用以实现针对癌症，例如与突变的蛋白质或其片段相关的癌症的累加或协同效应片段。在一些实施例中，包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物与放射疗法的施用组合施用。在一些实施例中，同时施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和所述放射疗法。在一些实施例中，顺序施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和所述放射疗法。在一些实施例中，包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物与放射疗法的施用组合施用、与化学疗法的施用组合施用和/或与免疫检查点抑制剂的施用组合施用。
在一些实施例中，在施用所述放射疗法之前施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述放射疗法之后施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在施用所述放射疗法之前约1小时至约1周施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述放射疗法之前约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述放射疗法之前约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述放射疗法之后施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在施用所述放射疗法之后约1小时至约1周施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。例如，在一些实施例中，在施用所述放射疗法之后约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时、约14小时、约16小时、约18小时、约20小时、约24小时、约30小时、约36小时、约42小时、约48小时、约60小时、约3天、约4天、约5天、约6天或约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述放射疗法之后约1小时至约2小时、约2小时至约3小时、约3小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、约10小时至约12小时、约12小时至约14小时、约14小时至约16小时、约16小时至约18小时、约18小时至约20小时、约20小时至约24小时、约24小时至约30小时、约30小时至约36小时、约36小时至约42小时、约42小时至约48小时、约48小时至约60小时、约60小时至约3天、约3天至约4天、约4天至约5天、约5天至约6天、约6天至约7天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。
在一些实施例中，在施用所述放射疗法之后约7天、约10天、约14天、约18天、约21天、约24天、约28天、约30天、约35天、约40天、约45天或约50天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，在施用所述放射疗法之后约7天至约10天、约10天至约14天、约14天至约18天、约18天至约21天、约21天至约24天、约24天至约28天、约28天至约30天、约30天至约35天、约35天至约40天、约40天至约45天或约45天至约50天施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物。
在一些实施例中，所述方法包括多次施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和/或多次施用所述放射疗法。例如，在一些实施例中，所述方法包括两次施用、三次施用、四次施用、五次施用、六次施用、七次施用、八次施用、九次施用、十次施用、十一次施用、十二次施用、十三次施用、十四次施用或十五次施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和/或所述放射疗法。例如，在一些实施例中，所述方法包括少于五次施用、少于十次施用、少于十五次施用、少于二十次施用、少于二十五次施用、少于三十次施用、少于五十次施用、少于七十五次施用、少于一百次施用或少于两百次施用包括包含所述蛋白质或其片段的所述有核细胞的所述组合物和/或所述放射疗法。
在一些实施例中，本文提供了包括蛋白质或其片段的多个有核细胞(例如PBMC)，用于根据本文所描述的方法中的任何一种方法刺激个体的免疫应答的方法。
在一些实施例中，本文提供了一种用于刺激对个体的蛋白质或其片段的免疫应答的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括有核细胞的组合物中的任何一种，所述有核细胞包括本文所描述的蛋白质片段。在一些实施例中，本文提供了一种用于减少肿瘤生长的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括有核细胞的组合物中的任何一种，所述有核细胞包括本文所描述的蛋白质或片段。在一些实施例中，所述个体患有癌症和/或感染。在一些实施例中，本文提供了一种用于治疗个体的癌症和/或感染的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括有核细胞的组合物中的任何一种，所述有核细胞包括本文所描述的蛋白质或片段。在一些实施例中，所述癌症是HPV相关癌症或HBV相关癌症。在一些实施例中，所述个体感染HPV和/或HBV。
编码蛋白质或其片段的mRNA
在一些实施例中，提供了用于刺激个体的免疫应答和/或对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，所述有核细胞包括细胞内递送的蛋白质或其片段；其中所述有核细胞通过以下制备：首先使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA在所述有核细胞中表达，由此产生包括所述蛋白质或其片段的所述经修饰的有核细胞，其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
在一些实施例中，所述mRNA的核苷酸序列被密码子优化以在所述有核细胞中表达。在一些实施例中，所述mRNA的核苷酸序列被密码子优化以在PBMC中表达。在一些实施例中，mRNA的密码子优化不影响或不显著影响所表达蛋白质的构象和功能。在一些实施例中，mRNA的密码子优化不影响或不显著影响由所表达蛋白质加工的抗原的构象和功能。在一些实施例中，所述mRNA是非自身mRNA。在一些实施例中，所述mRNA是外源mRNA。在一些实施例中，所述mRNA是体外转录的(IVT)mRNA。在一些实施例中，所述外源mRNA是体外转录的(IVT)mRNA。在一些实施例中，所述mRNA编码重组蛋白。
在一些实施例中，所述mRNA包括一个或多个修饰以增强抗原加工和所表达蛋白质的呈递。
如本文所使用的，免疫蛋白酶体靶向基序是在蛋白质降解速率的调节中很重要的蛋白质的一部分。在一些实施例中，免疫蛋白酶体靶向基序增强抗原加工通路中蛋白质的降解。在一些实施例中，免疫蛋白酶体靶向基序有助于蛋白质定位于抗原加工通路。在一些实施例中，免疫蛋白酶体靶向基序增强免疫蛋白酶体复合物中蛋白质的加工。免疫蛋白酶体靶向基序的实例是降解决定子。已知被后期促进复合体或细胞周期体(APC/C)靶向的降解决定子包含破坏盒(D盒)、KEN盒和ABBA基序。含有这些基序的蛋白质与APC/C相互作用，导致蛋白质泛素化并被蛋白酶体破坏。包含KEKE基序的其它示例性免疫蛋白酶体靶向基序，
在一些实施例中，所述mRNA进一步包括一个或多个编码免疫蛋白酶体靶向基序的核酸序列，其中所述mRNA的翻译产生所述蛋白质与所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序的融合蛋白。在一些实施例中，与在不存在免疫蛋白酶体靶向基序的情况下所述细胞中的所述蛋白质的降解和/或源自所述蛋白质的肽在所述细胞的表面上的呈递相比，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序增强所述细胞中的所述蛋白质的降解和/或源自所述蛋白质的肽在所述细胞的表面上的呈递。
在一些实施例中，由包括编码免疫蛋白酶体靶向基序的所述一个或多个核酸序列的mRNA编码的所述蛋白质的降解量比由不包括编码免疫蛋白酶体靶向基序的核酸的mRNA编码的蛋白质的降解量大约增加以下中的任一者：10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，由包括编码免疫蛋白酶体靶向基序的所述一个或多个核酸序列的mRNA编码的所述蛋白质的降解速率比由不包括编码免疫蛋白酶体靶向基序的核酸的mRNA编码的蛋白质的降解速率大约增加以下中的任一者：10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些实施例中，源自由包括编码免疫蛋白酶体靶向基序的所述一个或多个核酸序列的mRNA编码的所述蛋白质的肽的细胞表面呈递量比由不包括编码免疫蛋白酶体靶向基序的核酸的mRNA编码的蛋白质的肽的细胞表面呈递量大约增加以下中的任一者：10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，源自由包括编码免疫蛋白酶体靶向基序的所述一个或多个核酸序列的mRNA编码的所述蛋白质的肽的细胞表面呈递速率比由不包括编码免疫蛋白酶体靶向基序的核酸的mRNA编码的所述蛋白质的肽的细胞表面呈递速率大约增加以下中的任一者：10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些实施例中，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序位于所述融合蛋白的N末端。在一些实施例中，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序位于所述融合蛋白的C末端。在一些实施例中，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序位于所述融合蛋白的N末端和/或C末端。
在一些实施例中，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序包括以下中的一种或多种:D-盒结构域、sec/MITD结构域、KEKE基序。
在一些实施例中，所述mRNA编码所述天然HPV E6蛋白。在一些实施例中，所述mRNA编码所述天然HPV E6蛋白，并且包括SEQ ID NO:59的序列。在一些实施例中，所述mRNA是编码所述天然HPV E6蛋白的密码子优化的mRNA。在一些实施例中，所述mRNA是编码所述天然HPV E6蛋白的密码子优化的mRNA，其中所述密码子优化的mRNA包括SEQ ID NO:60的序列。在一些实施例中，所述mRNA编码所述天然HPV E7蛋白。在一些实施例中，所述mRNA编码所述天然HPV E7蛋白，并且包括SEQ ID NO:61的序列。在一些实施例中，所述mRNA是编码所述天然HPV E7蛋白的密码子优化的mRNA。在一些实施例中，所述mRNA是编码所述天然HPV E7蛋白的密码子优化的mRNA，其中所述密码子优化的mRNA包括SEQ ID NO:63或64的序列。在一些实施例中，所述mRNA是编码包括HPV E7蛋白和KEKE结构域的融合蛋白的密码子优化的mRNA。在一些实施例中，所述mRNA是编码包括HPV E7蛋白和KEKE结构域的融合蛋白的密码子优化的mRNA，其中所述mRNA包括SEQ ID NO:67的序列。在一些实施例中，所述mRNA是编码包括HPV E7蛋白和D-盒结构域的融合蛋白的mRNA。在一些实施例中，所述mRNA是编码包括HPV E7蛋白和D-盒结构域的融合蛋白的mRNA，其中所述mRNA包括SEQ ID NO:62的序列。在一些实施例中，所述mRNA是编码包括HPV E7蛋白和D-盒结构域的融合蛋白的密码子优化的mRNA。在一些实施例中，所述mRNA是编码包括HPV E7蛋白和D-盒结构域的融合蛋白的密码子优化的mRNA，其中所述mRNA包括SEQ ID NO:66的序列。在一些实施例中，所述mRNA是编码包括具有突变的核定位序列(NLS)的HPV E7蛋白的融合蛋白的密码子优化的mRNA。在一些实施例中，所述mRNA是编码包括具有突变的NLS的HPV E7蛋白的融合蛋白的密码子优化的mRNA，其中所述mRNA包括SEQ ID NO:70的序列。在一些实施例中，所述mRNA是编码HPV E7.6蛋白质的密码子优化的mRNA。在一些实施例中，所述mRNA是编码HPV E7.6蛋白质的密码子优化的mRNA，其中所述mRNA包括SEQ ID NO:68的序列。在一些实施例中，所述mRNA是编码包括HPV E7.6的6个重复序列的融合蛋白的密码子优化的mRNA。在一些实施例中，所述mRNA是编码包括HPV E7.6的6个重复序列的融合蛋白的密码子优化的mRNA，其中所述mRNA包括SEQID NO:69的序列。
在一些实施例中，所述mRNA编码所述天然流感M1蛋白质。在一些实施例中，所述mRNA编码所述天然流感M1蛋白质，并且包括SEQ ID NO:83的序列。在一些实施例中，所述mRNA是编码所述天然流感M1蛋白质的密码子优化的mRNA。在一些实施例中，所述mRNA是编码所述天然流感M1蛋白质的密码子优化的mRNA，其中所述密码子优化的mRNA包括SEQ IDNO:84的序列。
在一些实施例中，所述mRNA编码所述天然CMV pp65蛋白质。在一些实施例中，所述mRNA是编码所述天然CMV pp65蛋白质的密码子优化的mRNA。在一些实施例中，所述mRNA是编码所述天然CMV pp65蛋白质的密码子优化的mRNA，其中所述密码子优化的mRNA包括SEQID NO:85的序列。
在一些实施例中，所述mRNA编码所述MART-1抗原。在一些实施例中，所述mRNA是编码所述MART-1抗原的密码子优化的mRNA。
在根据本文所描述的mRNA中的任一个的一些实施例中，所述mRNA的一个或多个残基被修饰。在一些实施例中，所述mRNA的一个或多个残基是以下中的一个或多个：硫代磷酸酯残基、假尿苷残基、N1-甲基腺苷残基、5-甲基胞苷残基或吗啉代残基。
蛋白质和其片段以及抗原
在根据本文所描述的方法、组合物或多种经修饰的PBMC中的任一个的一些实施例中，所述蛋白质是疾病相关蛋白质。在一些实施例中，所述蛋白质是非自身蛋白质。在一些实施例中，所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质源自裂解物，如疾病细胞的裂解物。在一些实施例中，所述蛋白质源自肿瘤裂解物。在一些实施例中，所述蛋白质包括肿瘤抗原或肿瘤相关抗原中的一种或多种。在一些实施例中，所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质。在一些实施例中，所述癌症是头颈癌、宫颈癌、外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌、肛周癌、肛门生殖器癌、口腔癌或唾液腺癌。在一些实施例中，所述蛋白质包括一种或多种抗原，其中所述抗原是头颈癌抗原、宫颈癌抗原、外阴癌抗原、阴道癌抗原、阴茎癌抗原、肛门癌抗原、肛周癌抗原、肛门生殖器癌抗原、口腔癌抗原、唾液腺癌抗原、乳腺癌抗原、皮肤癌抗原、膀胱癌抗原、结肠癌、直肠癌抗原、子宫内膜癌抗原、肾癌抗原、白血病抗原、肺癌抗原、黑色素瘤抗原、非霍奇金淋巴瘤抗原、胰腺癌抗原、前列腺癌抗原或甲状腺癌抗原。在一些实施例中，所述癌症是实体癌。在一些实施例中，所述癌症是血液癌。
在一些实施例中，所述癌症是病毒相关癌症。在一些实施例中，所述癌症是HPV相关癌症。在一些实施例中，所述癌症是局限性癌症。在一些实施例中，所述癌症是转移性癌症。在一些实施例中，所述抗原与传染性疾病相关。在一些实施例中，所述传染性疾病是病毒传染性疾病、真菌传染性疾病和/或细菌传染性疾病。在一些实施例中，所述传染性疾病与流感、CMV、HIV、HPV、EBV、MCV、HAV、HBV、HCV、HSV-1、HSV-2、VSV、HHV-6、HHV-7或HHV-8相关。
在根据本文所描述的方法、组合物或多种经修饰的PBMC中的任一个的一些实施例中，所述蛋白质包括一种或多种抗原。在一些实施例中，所述抗原由一种或多种核酸编码并以一种或多种核酸的形式进入所述PBMC，如但不限于DNA、cDNA、mRNA和质粒。在一些实施例中，所述抗原由一种或多种mRNA编码并以一种或多种mRNA的形式进入所述PBMC。在一些实施例中，所述一种或多种mRNA包括本文所描述的修饰中的任一种。在一些实施例中，所述一种或多种mRNA包括本文所描述的基序中的任何一种，包含但不限于本文所描述的任何一种免疫蛋白酶体靶向基序中的任何一种。
在根据本文所描述的方法、组合物或多种经修饰的PBMC中的任一个的一些实施例中，所述抗原是人乳头瘤病毒(HPV)抗原。乳头瘤病毒是病毒粒子大小的直径约为55nm的小的无包膜DNA病毒。超过100种HPV基因型被完全表征，并且推测存在更多的基因型。HPV是宫颈癌以及一些外阴癌、阴道癌、阴茎癌、口咽癌、肛门癌和直肠癌的已知原因。尽管大多数HPV感染是无症状的并且是自发清除的，但是具有致癌性HPV类型之一的持续感染可以进展为癌前病变或癌症。其它HPV相关疾病可以包含寻常疣、跖疣、扁平疣、肛门生殖器疣、肛门病变、表皮发育不良、局灶性上皮增生、口腔乳头状瘤、疣状囊肿、喉乳头状瘤病、鳞状上皮内病变(SIL)、宫颈上皮内瘤变(CIN)、外阴上皮内瘤变(VIN)和阴道上皮内瘤变(VAIN)。许多已知的人乳头瘤病毒(HPV)类型导致良性病变，其中一部分是致癌的。基于流行病学和系统发育关系，将HPV类型分类为十五种“高风险类型”(HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82)和三种“可能的高风险类型”(HPV 26、53和66)，已知其一起表现为低度和高度宫颈病变和癌症，以及其它非生殖器癌症，如外阴癌、阴道癌、阴茎癌、肛门癌和肛周癌，以及头颈癌。最近，也描述了高风险类型HPV 16和18与乳腺癌的关联。已知分类为“低风险类型”的十一种HPV类型(HPV 6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81)表现为良性低度宫颈病变、生殖器疣和复发性呼吸道乳头状瘤病。皮肤HPV 5型、8型和92型与皮肤癌症相关。在一些HPV相关癌症中，免疫系统被抑制并且相应地，抗肿瘤应答被显著削弱。参见Suresh和Burtness,《美国血液学与肿瘤学杂志(Am J Hematol Oncol)》13(6):20-27(2017)。在一些实施例中，所述抗原是多个多肽的池，所述多个多肽引发针对相同和或不同抗原的应答。在一些实施例中，多抗原的池中的抗原不会降低针对多抗原的池中的其它抗原的免疫应答。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述HPV抗原与其自身、其它抗原或所述佐剂复合。在一些实施例中，所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施例中，所述HPV抗原由HLA-A*02特异性表位组成。在一些实施例中，所述HPV抗原由HLA-B*07特异性表位组成。在一些实施例中，所述HPV抗原由HLA-B*35特异性表位组成。在一些实施例中，所述HPV抗原由HLA-A*01特异性表位组成。在一些实施例中，所述HPV抗原是HPV E6抗原或HPV E7抗原。在一些实施例中，所述抗原包括源自HPV E6和/或E7的肽。在一些实施例中，所述抗原包括源自HPV E6和/或E7的HLA-A*02限制性肽。在一些实施例中，所述HPV蛋白质是HPV E6。在一些实施例中，所述HPV蛋白质是HPV E7。在一些实施例中，所述蛋白质包括源自HPV E6的肽。在一些实施例中，所述蛋白质包括源自HPV E7的肽。在一些实施例中，所述HPV蛋白质是包括以下中的任一种的蛋白质：天然(包含野生型、天然存在的和/或剪接变体)HPV E6的约50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV蛋白质是包括天然HPV E6的100％的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施例中，所述HPV蛋白质是包括以下中的任一种的蛋白质：天然(包含野生型、天然存在的和/或剪接变体)HPV E7的约50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HPV蛋白质是包括天然HPV E7的约100％的氨基酸序列的蛋白质。
世界范围内分离的乙型肝炎病毒(HBV)毒株已经被分类为六个基因组组，所述六个基因组组从基因组比较中推断并被称为HBV基因型A至F。被称为乙型肝炎表面抗原(HBsAg)亚型的九个血清组也已经基于不同的血清进行了定义并被命名为adw2、adw4、adr、adrq-、ayw1、ayw2、ayw3、ayw4和ayr。在一些实施例中，所述HPV抗原是多肽，所述多肽包括抗原性HPV表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述HPV抗原与其自身、其它抗原或所述佐剂复合。在一些实施例中，所述HBV具有以下中的任一种的基因型/亚型：A/adw2、B/adw2、C/adr、C/adw2、D/ayw3、D/ayw2、E/ayw4、F/adw2、F/adw4或F/ayw4。在一些实施例中，所述HBV蛋白由HLA-A*02特异性表位组成。在一些实施例中，所述HBV蛋白是HBsAg。在一些实施例中，所述HBV蛋白是HBc。在一些实施例中，所述HBV蛋白是HBV核心蛋白、HBV表面蛋白、HBV聚合酶和/或HBV X蛋白质中的一种或多种。在一些实施例中，所述HBV蛋白是HBeAg。在一些实施例中，所述蛋白质包括源自HBsAg的肽。在一些实施例中，所述蛋白质包括源自HBc的肽。在一些实施例中，所述蛋白质包括源自HBeAg的肽。在一些实施例中，所述HBV蛋白是包括以下中的任一种的蛋白质：天然(包含野生型、天然存在的和/或剪接变体)HBsAg的约50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HBV蛋白是包括天然HBsAg的100％的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施例中，所述HBV蛋白是包括以下中的任一种的蛋白质：天然(包含野生型、天然存在的和/或剪接变体)HBeAg的约50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HBV蛋白是包括天然HBeAg的100％的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施例中，所述HBV蛋白是包括以下中的任一种的蛋白质：天然(包含野生型、天然存在的和/或剪接变体)HBc的约50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列。在一些实施例中，所述HBV蛋白是包括天然HBc的100％的氨基酸序列的蛋白质。在一些实施例中，所述HBV蛋白是包括以下中的任一种的蛋白质：HBV核心蛋白、HBV表面蛋白、HBV聚合酶和/或HBV X蛋白质中的一种或多种的约50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的天然氨基酸序列。在一些实施例中，所述HBV蛋白是包括HBV核心蛋白、HBV表面蛋白、HBV聚合酶和/或HBV X蛋白质中的一种或多种的100％的天然氨基酸序列的蛋白质。
在一些实施例中，所述蛋白质是流感蛋白。在一些实施例中，所述流感蛋白源自甲型流感和/或乙型流感。在一些实施例中，所述蛋白质是流感M1蛋白质。在一些实施例中，所述蛋白质包括源自流感M1蛋白质的肽。在一些实施例中，所述流感蛋白是包括以下中的任一种的蛋白质：天然(包含野生型、天然存在的和/或剪接变体)流感M1蛋白质的约50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列。在一些实施例中，所述蛋白质是经修饰的流感M1蛋白质。在一些实施例中，所述流感蛋白是包括天然流感M1蛋白质的100％的氨基酸序列的蛋白质。
在根据本文所描述的方法、组合物或多种有核细胞中的任一个的一些实施例中，所述经修饰的有核细胞包括多个抗原(例如源自蛋白质的两种或更多种抗原)，所述多个抗原包括多个免疫原性表位。在另外的实施例中，在向个体施用包括包含所述多个免疫原性表位的所述多个抗原的所述经修饰的有核细胞之后，所述多个免疫原性表位中没有一个降低所述个体对其它免疫原性表位中的任何免疫原性表位的免疫应答。在一些实施例中，所述抗原是多肽并且所述免疫原性表位是免疫原性肽表位。在一些实施例中，所述免疫原性肽表位与N末端侧接多肽和/或C末端侧接多肽融合。在一些实施例中，所述抗原是多肽，所述多肽包括免疫原性肽表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述抗原是多肽，所述多肽包括免疫原性肽表位，所述免疫原性肽表位在N末端和/或C末端侧接异源肽序列。在一些实施例中，侧接异源肽序列源自疾病相关免疫原性肽。在一些实施例中，侧接异源肽序列是非天然存在的序列。在一些实施例中，侧接异源肽序列源自免疫原性合成长肽(SLP)。在一些实施例中，N末端侧接多肽包括SEQ ID NO:5-10中的任一个的氨基酸序列和/或C末端侧接多肽包括SEQ ID NO:11-17中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
在一些实施例中，所述蛋白质和/或所述抗原包括一个或多个修饰以增强抗原加工和所述蛋白质和/或所述抗原的呈递。
如本文所使用的，免疫蛋白酶体靶向基序是在蛋白质降解速率的调节中很重要的蛋白质的一部分。在一些实施例中，免疫蛋白酶体靶向基序增强抗原加工通路中蛋白质的降解。在一些实施例中，免疫蛋白酶体靶向基序有助于蛋白质定位于抗原加工通路。在一些实施例中，免疫蛋白酶体靶向基序增强免疫蛋白酶体复合物中蛋白质的加工。免疫蛋白酶体靶向基序的实例是降解决定子。已知被后期促进复合体或细胞周期体(APC/C)靶向的降解决定子包含破坏盒(D盒)、KEN盒和ABBA基序。含有这些基序的蛋白质与APC/C相互作用，导致蛋白质泛素化并被蛋白酶体破坏。其它示例性免疫蛋白酶体靶向基序包含但不限于KEKE基序。
在一些实施例中，所述蛋白质或其片段进一步包括一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序，从而产生所述蛋白质与所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序的融合蛋白。在一些实施例中，与在不存在免疫蛋白酶体靶向基序的情况下所述细胞中的所述蛋白质的降解和/或源自所述蛋白质的肽在所述细胞的表面上的呈递相比，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序增强所述细胞中的所述蛋白质的降解和/或源自所述蛋白质的肽在所述细胞的表面上的呈递。
在一些实施例中，包括一个或多个蛋白质免疫蛋白酶体靶向基序的所述融合蛋白的降解量比不包括所述免疫蛋白酶体靶向基序的对应的蛋白质的降解量大约增加以下中的任一者：10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，由包括编码免疫蛋白酶体靶向基序的所述一个或多个核酸序列的mRNA编码的所述蛋白质的降解速率比不包括免疫蛋白酶体靶向基序的对应的蛋白质的降解速率大约增加以下中的任一者：10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些实施例中，源自包括所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序的所述蛋白质的肽的细胞表面呈递量比不包括所述免疫蛋白酶体靶向基序的对应的蛋白质的肽的细胞表面呈递量大约增加以下中的任一者：10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，源自包括所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序的所述蛋白质的肽的细胞表面呈递速率比不包括所述免疫蛋白酶体靶向基序的对应的蛋白质的肽的细胞表面呈递速率大约增加以下中的任一者：10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些实施例中，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序位于所述融合蛋白的N末端。在一些实施例中，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序位于所述融合蛋白的C末端。在一些实施例中，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序位于所述融合蛋白的N末端和/或C末端。
在一些实施例中，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序包括以下中的一种或多种:D-盒结构域、sec/MITD结构域、KEKE基序。
在一些实施例中，所述蛋白质是天然全长HPV E7蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是包括SEQ ID NO:52的氨基酸序列的天然全长HPV E7蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质从编码所述天然HPV E7蛋白的密码子优化的mRNA翻译而来。在一些实施例中，所述蛋白质从编码所述天然HPV E7蛋白的密码子优化的mRNA翻译而来，其中所述蛋白质包括SEQ IDNO:52的氨基酸序列。在一些实施例中，所述蛋白质是天然全长HPV E6蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列的天然全长HPV E6蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质从编码所述天然HPV E6蛋白的密码子优化的mRNA翻译而来。在一些实施例中，所述蛋白质从编码所述天然HPV E6蛋白的密码子优化的mRNA翻译而来，其中蛋白质包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一些实施例中，所述蛋白质是包括HPV E7蛋白和KEKE结构域的融合蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是包括HPV E7蛋白和KEKE结构域的融合蛋白，其中所述蛋白质包括SEQ ID NO:56的氨基酸序列。在一些实施例中，所述蛋白质是包括HPV E7蛋白和D-盒结构域的融合蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是包括HPV E7蛋白和D-盒结构域的融合蛋白，其中所述蛋白质包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在一些实施例中，所述蛋白质是包括具有突变的NLS的HPV E7蛋白的融合蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是包括具有突变的NLS的HPV E7蛋白的融合蛋白，其中所述蛋白质包括SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在一些实施例中，所述蛋白质是HPV E7.6蛋白质。在一些实施例中，所述蛋白质是HPV E7.6蛋白质，其中所述蛋白质包括SEQ ID NO:57的氨基酸序列。在一些实施例中，所述蛋白质是包括HPV E7.6的6个重复序列的融合蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是包括HPV E7.6的6个重复序列的融合蛋白，其中所述蛋白质包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
产生包括蛋白质或其片段的有核细胞的组合物的方法
在一些方面，提供了用于产生包括蛋白质或其片段的有核细胞的方法；所述方法包括将所述蛋白质或其片段引入到所述有核细胞中，其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
在一些方面，提供了用于产生包括蛋白质或其片段的有核细胞的方法；所述方法包括将编码所述蛋白质或其片段的mRNA引入到所述有核细胞中，其中所述mRNA被表达以产生所述蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
在一些方面，提供了用于产生包括蛋白质的两种或更多种抗原的有核细胞的方法；所述方法包括将所述两种或更多种抗原引入到所述有核细胞中；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
在一些方面，提供了用于产生包括蛋白质或其片段的经调节的有核细胞的方法；所述方法包括将所述蛋白质或其片段引入到所述经调节的有核细胞中，其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
在一些方面，提供了用于产生包括蛋白质或其片段的经调节的有核细胞的方法；所述方法包括将编码所述蛋白质或其片段的mRNA引入到所述经调节的有核细胞中，其中所述mRNA被表达以产生所述蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
在一些方面，提供了用于产生包括蛋白质的两种或更多种抗原的经调节的有核细胞的方法；所述方法包括将所述两种或更多种抗原引入到所述经调节的有核细胞中；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
在一些实施例中，提供了用于产生包括源自蛋白质的两种或更多种抗原的有核细胞的方法；其中所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，提供了用于产生包括源自蛋白质的两种或更多种抗原的有核细胞的方法；其中所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
在一些实施例中，所述细胞包括源自所述蛋白质的两种或更多种抗原。在一些实施例中，所述细胞包括以下中的任一种：源自所述蛋白质的约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、70个、75个、80个、90个、100个或更多个抗原。在一些实施例中，所述抗原中的至少两种抗原包括部分重叠的氨基酸序列。在一些实施例中，所有抗原的组合氨基酸序列与所述蛋白质的氨基酸序列重叠约90％或更多。在一些实施例中，所有抗原的组合氨基酸序列与以下中的任一种重叠：所述蛋白质的约50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列。在一些实施例中，所述蛋白质的约80％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少两种抗原重叠。在一些实施例中，所述蛋白质的约80％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少三种抗原重叠。在一些实施例中，所述蛋白质的约90％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少两种抗原重叠。在一些实施例中，所述蛋白质的约90％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少三种抗原重叠。在一些实施例中，所述蛋白质的约95％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少两种抗原重叠。在一些实施例中，所述蛋白质的约95％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少三种抗原重叠。
在一些实施例中，所述抗原是多肽，所述多肽包括所述蛋白质的两个或更多个表位。在一些实施例实施例中，所述免疫原性肽表位与N末端侧接多肽和/或C末端侧接多肽融合。在一些实施例中，所述抗原是所述蛋白质的一个或多个表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述一个或多个表位在所述N末端和/或所述C末端侧接异源肽序列。在一些实施例中，侧接异源肽序列源自疾病相关免疫原性肽。在一些实施例中，侧接异源肽序列是非天然存在的序列。在一些实施例中，侧接异源肽序列源自免疫原性合成长肽(SLP)。在一些实施例中，N末端侧接多肽包括SEQ ID NO:5-10中的任一个的氨基酸序列和/或C末端侧接多肽包括SEQ ID NO:11-17中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
在一些实施例中，所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。在一些实施例中，所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施例中，所述蛋白质是HPV E6或HPV E7蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。
在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞通过以下制备：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段的有核细胞，其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些实施例中，包括编码所述蛋白质或其片段的mRNA的所述有核细胞通过以下制备：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的有核细胞。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞通过以下制备：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中所述mRNA被表达以产生所述蛋白质或其片段，由此产生包括所述蛋白质或其片段的有核细胞，其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
在一些实施例中，所述输入细胞悬浮液可以包括所述输入有核细胞和抗原。在一些实施例中，所述输入细胞悬浮液包括所述输入有核细胞和所述蛋白质或其片段。在一些实施例中，所述输入细胞悬浮液包括所述输入有核细胞和编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA。在一些实施例中，所述方法包括在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育。在一些实施例中，所述方法包括在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为在有核细胞群体中具有最小直径的所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为在有核细胞群体中具有最小直径的所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约2μm至约5μm、约3μm至约5μm、约2μm至约2.5μm、约2.2μm至约2.5、约2.5μm至约3μm、约3μm至约3.5μm、约3.5μm至约4μm、约4μm至约4.5μm、约3.2μm至约3.8μm、约3.8μm至约4.3μm、约4.2μm至约6μm或约4.2μm至约4.8μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约4.5μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约或小于2μm、2.2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、10.5μm、11μm、11.5μm、12μm、12.5μm、13μm、13.5μm、14μm、14.5μm或15μm中的任一个。在一些实施例中，包括所述输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何一种方法、用途或组合物的一些实施例中，将所述有核细胞(例如，PBMC)与所述佐剂一起温育足够长的时间以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1至约24小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约2至约10小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约3至约6小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时、2小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20小时或24小时中的任一个以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约4小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，在将所述蛋白质或其片段或所述编码蛋白质或其片段的核酸引入到所述有核细胞中之前调节所述有核细胞。在一些实施例中，在将所述蛋白质或其片段或所述编码所述蛋白质或其片段的核酸引入到所述有核细胞中之后调节所述有核细胞。在一些实施例中，用于调节的所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。示例性佐剂包含但不限于CpGODN、干扰素-α(IFN-α)、聚肌:聚胞苷酸(polyI:C)、咪喹莫特(R837)、瑞喹莫德(R848)或脂多糖(LPS)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909。
在一些实施例中，其中所述有核细胞包括B细胞，与未经调节的有核细胞的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的有核细胞的所述B细胞中上调。在一些实施例中，所述有核细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，其中所述有核细胞是多个PBMC，与所述未经调节的多个PBMC的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个PBMC的所述B细胞中上调。在一些实施例中，所述共刺激分子是CD80和/或CD86。在一些实施例中，与未经调节的多个PBMC相比，所述经调节的多个PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的增加的表达。在一些实施例中，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达比未经调节的多个PBMC的表达增加超过约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超过10倍。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何一种方法、用途或组合物的一些实施例中，所述有核细胞是免疫细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是人细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是具有HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16的单倍型的人细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是多个PBMC。在一些实施例中，所述经调节的有核细胞是经调节的多个经修饰的PBMC。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。在一些实施例中，所述有核细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。
在一些实施例中，所述多个PBMC被进一步修饰以增加共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的表达。在一些实施例中，所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些实施例中，所述多个PBMC被进一步修饰以增加一种或多种细胞因子的表达。在一些实施例中，所述细胞因子是IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞因子是IFN-α2或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞因子是变体细胞因子(如经修饰的细胞因子)。在一些实施例中，所述多个PBMC被进一步修饰以增加一种或多种嵌合膜结合细胞因子的表达。在一些实施例中，所述细胞因子被修饰，并且所述经修饰的细胞因子是包括所述细胞因子和跨膜结构域的融合蛋白。在一些实施例中，所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。在一些实施例中，所述跨膜结构域是转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)或肿瘤坏死因子(例如，FasL)跨膜结构域。在一些实施例中，所述跨膜结构域包括SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82的氨基酸序列。在一些实施例中，所述肽连接子是G4S连接子或EAAAK连接子。在实施例中，所述G4S连接子包括G4S序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复序列中的任一个。在一些实施例中，所述EAAAK连接子包括EAAAK序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复序列中的任一个。在一些实施例中，所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQID NO:74)。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述多个经修饰的PBMC包括导致所述一种或多种细胞因子的表达和/或分泌增加的核酸。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸包括SEQ ID NO:71或72的核苷酸序列。在一些实施例中，所述细胞因子是刺激T细胞激活的信号3效应子。在一些实施例中，与非膜结合细胞因子相比，所述嵌合膜结合细胞因子增强所述细胞因子在个体中的半衰期。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子的半衰期比非膜结合细胞因子的半衰期大约增加以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，与包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞相比，所述膜结合细胞因子将所述细胞因子与由引入有所述蛋白质或其片段的所述有核细胞呈递的所述抗原的空间缀合大约延长以下中的任一者：1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96个小时或更多个小时。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括膜结合细胞因子的有核细胞表现出的局部细胞因子浓度比包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞表现出的局部细胞因子浓度大约高以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括膜结合细胞因子的有核细胞可以以比包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
包括蛋白质或其片段的有核细胞的组合物
在一些方面，本文提供了一种组合物，所述组合物包括有核细胞，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些方面，本文提供了一种用于刺激个体的免疫应答的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括蛋白质或其片段的有核细胞；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些实施例中，提供了包括有效量的有核细胞的组合物在制备用于刺激个体的免疫应答的药物中的用途，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
在一些方面，本文提供了一种组合物，所述组合物包括有核细胞，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些方面，本文提供了一种用于刺激个体的免疫应答的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括编码蛋白质或其片段的mRNA的有核细胞；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些实施例，提供了包括有效量的有核细胞的组合物在制备用于刺激个体的免疫应答的药物中的用途，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
在一些方面，本文通过了一种组合物，所述组合物包括有核细胞，其中所述有核细胞包括源自蛋白质的两种或更多种抗原；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些方面，本文提供了一种用于刺激个体的免疫应答的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括源自蛋白质的两种或更多种抗原的有核细胞；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些实施例，提供了包括有效量的有核细胞的组合物在制备用于刺激个体的免疫应答的药物中的用途，其中所述有核细胞包括源自蛋白质的两种或更多种抗原；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
在一些方面，本文提供了一种组合物，所述组合物包括经调节的有核细胞，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些方面，本文提供了一种用于刺激个体的免疫应答的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括蛋白质或其片段的经调节的有核细胞；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些实施例中，提供了包括有效量的有核细胞的组合物在制备用于刺激个体的免疫应答的药物中的用途，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
在一些方面，本文提供了一种组合物，所述组合物包括经调节的有核细胞，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些方面，本文提供了一种用于刺激个体的免疫应答的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括编码蛋白质或其片段的mRNA的经调节的有核细胞；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些实施例，提供了包括有效量的有核细胞的组合物在制备用于刺激个体的免疫应答的药物中的用途，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
在一些方面，本文通过了一种组合物，所述组合物包括经调节的有核细胞，其中所述有核细胞包括源自蛋白质的两种或更多种抗原；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些方面，本文提供了一种用于刺激个体的免疫应答的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括源自蛋白质的两种或更多种抗原的经调节的有核细胞；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些实施例，提供了包括有效量的有核细胞的组合物在制备用于刺激个体的免疫应答的药物中的用途，其中所述有核细胞包括源自蛋白质的两种或更多种抗原；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
在一些方面，本发明提供了一种用作药物的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括其蛋白质片段的无核细胞的组合物，其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些方面，本发明提供了一种用作药物的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括编码其蛋白质片段的mRNA的无核细胞的组合物，其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些方面，本发明提供了一种用作药物的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括蛋白质的两种或更多种抗原的无核细胞的组合物，其中所述两种或更多种抗原以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
在一些实施例中，所述细胞包括源自所述蛋白质的两种或更多种抗原。在一些实施例中，所述细胞包括以下中的任一种：源自所述蛋白质的约2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、22个、24个、26个、28个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、70个、75个、80个、90个、100个或更多个抗原。在一些实施例中，所述抗原中的至少两种抗原包括部分重叠的氨基酸序列。在一些实施例中，所有抗原的组合氨基酸序列与所述蛋白质的氨基酸序列重叠约90％或更多。在一些实施例中，所有抗原的组合氨基酸序列与以下中的任一种重叠：所述蛋白质的约50％、60％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列。在一些实施例中，所述蛋白质的约80％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少两种抗原重叠。在一些实施例中，所述蛋白质的约80％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少三种抗原重叠。在一些实施例中，所述蛋白质的约90％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少两种抗原重叠。在一些实施例中，所述蛋白质的约90％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少三种抗原重叠。在一些实施例中，所述蛋白质的约95％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少两种抗原重叠。在一些实施例中，所述蛋白质的约95％的氨基酸序列的每个氨基酸与源自所述蛋白质的至少三种抗原重叠。
在一些实施例中，所述抗原是多肽，所述多肽包括所述蛋白质的两个或更多个表位。在一些实施例实施例中，所述免疫原性肽表位与N末端侧接多肽和/或C末端侧接多肽融合。在一些实施例中，所述抗原是所述蛋白质的一个或多个表位和一个或多个异源肽序列。在一些实施例中，所述一个或多个表位在所述N末端和/或所述C末端侧接异源肽序列。在一些实施例中，侧接异源肽序列源自疾病相关免疫原性肽。在一些实施例中，侧接异源肽序列是非天然存在的序列。在一些实施例中，侧接异源肽序列源自免疫原性合成长肽(SLP)。在一些实施例中，N末端侧接多肽包括SEQ ID NO:5-10中的任一个的氨基酸序列和/或C末端侧接多肽包括SEQ ID NO:11-17中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗原能够被加工成MHC I类限制性肽和/或MHC II类限制性肽。
在一些实施例中，所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。在一些实施例中，所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施例中，所述蛋白质是HPV E6或HPV E7蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。
在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞通过以下制备：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段的有核细胞。在一些实施例中，包括编码所述蛋白质或其片段的mRNA的所述有核细胞通过以下制备：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的有核细胞。
在一些实施例中，所述输入细胞悬浮液可以包括所述输入有核细胞和抗原。在一些实施例中，所述输入细胞悬浮液包括所述输入有核细胞和所述蛋白质或其片段。在一些实施例中，所述输入细胞悬浮液包括所述输入有核细胞和编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA。在一些实施例中，所述方法包括在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育。在一些实施例中，所述方法包括在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为在有核细胞群体中具有最小直径的所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为在有核细胞群体中具有最小直径的所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约2μm至约5μm、约3μm至约5μm、约2μm至约2.5μm、约2.2μm至约2.5、约2.5μm至约3μm、约3μm至约3.5μm、约3.5μm至约4μm、约4μm至约4.5μm、约3.2μm至约3.8μm、约3.8μm至约4.3μm、约4.2μm至约6μm或约4.2μm至约4.8μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约4.5μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约或小于2μm、2.2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、10.5μm、11μm、11.5μm、12μm、12.5μm、13μm、13.5μm、14μm、14.5μm或15μm中的任一个。在一些实施例中，包括所述输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何一种方法、用途或组合物的一些实施例中，将所述有核细胞(例如，PBMC)与所述佐剂一起温育足够长的时间以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1至约24小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约2至约10小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约3至约6小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时、2小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20小时或24小时中的任一个以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约4小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，在将所述蛋白质或其片段或所述编码蛋白质或其片段的核酸引入到所述有核细胞中之前调节所述有核细胞。在一些实施例中，在将所述蛋白质或其片段或所述编码所述蛋白质或其片段的核酸引入到所述有核细胞中之后调节所述有核细胞。在一些实施例中，用于调节的所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。示例性佐剂包含但不限于CpGODN、干扰素-α(IFN-α)、聚肌:聚胞苷酸(polyI:C)、咪喹莫特(R837)、瑞喹莫德(R848)或脂多糖(LPS)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909。
在一些实施例中，其中所述有核细胞包括B细胞，与未经调节的有核细胞的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的有核细胞的所述B细胞中上调。在一些实施例中，所述有核细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，其中所述有核细胞是多个PBMC，与所述未经调节的多个PBMC的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个PBMC的所述B细胞中上调。在一些实施例中，所述共刺激分子是CD80和/或CD86。在一些实施例中，与未经调节的多个PBMC相比，所述经调节的多个PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的增加的表达。在一些实施例中，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达比未经调节的多个PBMC的表达增加超过约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超过10倍。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何一种方法、用途或组合物的一些实施例中，所述有核细胞是免疫细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是人细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是具有HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08和/或HLA-C*16的单倍型的人细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是多个PBMC。在一些实施例中，所述经调节的有核细胞是经调节的多个经修饰的PBMC。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。在一些实施例中，所述有核细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。
在一些实施例中，所述多个PBMC被进一步修饰以增加共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的表达。在一些实施例中，所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些实施例中，所述多个PBMC被进一步修饰以增加一种或多种细胞因子的表达。在一些实施例中，所述细胞因子是IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞因子是IFN-α2或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞因子是变体细胞因子(如经修饰的细胞因子)。在一些实施例中，所述多个PBMC被进一步修饰以增加一种或多种嵌合膜结合细胞因子的表达。在一些实施例中，所述细胞因子被修饰，并且所述经修饰的细胞因子是包括所述细胞因子和跨膜结构域的融合蛋白。在一些实施例中，所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。在一些实施例中，所述跨膜结构域是转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)或肿瘤坏死因子(例如，FasL)跨膜结构域。在一些实施例中，所述跨膜结构域包括SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82的氨基酸序列。在一些实施例中，所述肽连接子是G4S连接子或EAAAK连接子。在实施例中，所述G4S连接子包括G4S序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复序列中的任一个。在一些实施例中，所述EAAAK连接子包括EAAAK序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复序列中的任一个。在一些实施例中，所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQID NO:74)。在一些实施例中，嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述多个经修饰的PBMC包括导致所述一种或多种细胞因子的表达和/或分泌增加的核酸。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸包括SEQ ID NO:71或72的核苷酸序列。在一些实施例中，所述细胞因子是刺激T细胞激活的信号3效应子。在一些实施例中，与非膜结合细胞因子相比，所述嵌合膜结合细胞因子增强所述细胞因子在个体中的半衰期。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子的半衰期比非膜结合细胞因子的半衰期大约增加以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，与包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞相比，所述膜结合细胞因子将所述细胞因子与由引入有所述蛋白质或其片段的所述有核细胞呈递的所述抗原的空间缀合大约延长以下中的任一者：1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96个小时或更多个小时。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括膜结合细胞因子的有核细胞表现出的局部细胞因子浓度比包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞表现出的局部细胞因子浓度大约高以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括膜结合细胞因子的有核细胞可以以比包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，所述膜系细胞因子是膜结合趋化因子。
增强免疫细胞的活性的方法和其组合物
在一些方面，提供了用于增强免疫细胞的活性的方法，所述方法包括在所述免疫细胞中表达编码嵌合膜结合细胞因子的核酸。在一些实施例中，所述细胞因子被修饰，并且所述经修饰的细胞因子是包括所述细胞因子和跨膜结构域的融合蛋白。在一些实施例中，所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。在一些实施例中，所述跨膜结构域是转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)或肿瘤坏死因子(例如，FasL)跨膜结构域。在一些实施例中，所述跨膜结构域包括SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82的氨基酸序列。在一些实施例中，所述肽连接子是G4S连接子或EAAAK连接子。在实施例中，所述G4S连接子包括G4S序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复序列中的任一个。在一些实施例中，所述EAAAK连接子包括EAAAK序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复序列中的任一个。在一些实施例中，所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列。在一些实施例中，所述多个经修饰的PBMC包括导致所述一种或多种细胞因子的表达和/或分泌增加的核酸。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸包括SEQ ID NO:71或72的核苷酸序列。在一些实施例中，所述细胞因子是刺激T细胞激活的信号3效应子。在一些实施例中，与非膜结合细胞因子相比，所述嵌合膜结合细胞因子增强所述细胞因子在个体中的半衰期。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子的半衰期比非膜结合细胞因子的半衰期大约增加以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，与包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞相比，所述膜结合细胞因子将所述细胞因子与由引入有所述蛋白质或其片段的所述有核细胞呈递的所述抗原的空间缀合大约延长以下中的任一者：1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96个小时或更多个小时。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括膜结合细胞因子的有核细胞表现出的局部细胞因子浓度比包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞表现出的局部细胞因子浓度大约高以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括膜结合细胞因子的有核细胞可以以比包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些实施例中，所述膜结合细胞因子是膜结合趋化因子。
在一些方面，本文提供了用于增强免疫细胞的活性的组合物，所述组合物包括所述免疫细胞中的嵌合膜结合细胞因子。在一些实施例中，所述细胞因子被修饰，并且所述经修饰的细胞因子是包括所述细胞因子和跨膜结构域的融合蛋白。在一些实施例中，所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。在一些实施例中，所述跨膜结构域是转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)或肿瘤坏死因子(例如，FasL)跨膜结构域。在一些实施例中，所述跨膜结构域包括SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82的氨基酸序列。在一些实施例中，所述肽连接子是G4S连接子或EAAAK连接子。在实施例中，所述G4S连接子包括G4S序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复序列中的任一个。在一些实施例中，所述EAAAK连接子包括EAAAK序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复序列中的任一个。在一些实施例中，所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述多个经修饰的PBMC包括导致所述一种或多种细胞因子的表达和/或分泌增加的核酸。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸包括SEQ ID NO:71或72的核苷酸序列。在一些实施例中，所述细胞因子是刺激T细胞激活的信号3效应子。在一些实施例中，与非膜结合细胞因子相比，所述嵌合膜结合细胞因子增强所述细胞因子在个体中的半衰期。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子的半衰期比非膜结合细胞因子的半衰期大约增加以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，与包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞相比，所述膜结合细胞因子将所述细胞因子与由引入有所述蛋白质或其片段的所述有核细胞呈递的所述抗原的空间缀合大约延长以下中的任一者：1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96个小时或更多个小时。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括膜结合细胞因子的有核细胞表现出的局部细胞因子浓度比包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞表现出的局部细胞因子浓度大约高以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括膜结合细胞因子的有核细胞可以以比包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些实施例中，所述膜结合细胞因子是膜结合趋化因子。
在一些实施例中，所述多个PBMC被修饰以增加一种或多种细胞因子的表达。在一些实施例中，所述细胞因子是IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞因子是IFN-α2或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞因子是变体细胞因子(如经修饰的细胞因子)，如嵌合膜结合细胞因子。在一些实施例中，所述多个PBMC被进一步修饰以增加一种或多种嵌合膜结合细胞因子(如膜结合IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21)的表达。
在一些实施例中，所述免疫细胞进一步包括抗原。在一些实施例中，所述免疫细胞进一步包括编码抗原的mRNA。在一些实施例中，所述抗原是蛋白质或其片段，其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，所述免疫细胞进一步包括源自蛋白质的两种或更多种抗原。在一些实施例中，所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。在一些实施例中，所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施例中，所述蛋白质是HPV E6或HPV E7蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。
在一些实施例中，提供了用于增强免疫细胞的活性的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子的免疫细胞。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸是编码所述嵌合膜结合细胞因子的mRNA。
在一些实施例中，提供了用于增强免疫细胞的活性的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子并且进一步包括抗原的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸和所述抗原进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的免疫细胞。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸是编码所述嵌合膜结合细胞因子的mRNA。
在一些实施例中，提供了用于增强免疫细胞的活性的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子并且进一步包括抗原的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸和编码所述抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸被表达；由此产生包括所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的免疫细胞。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和/或编码所述抗原的所述核酸是mRNA。
在一些实施例中，提供了用于增强免疫细胞的活性的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的免疫细胞。
在一些方面，本文提供了一种用作药物的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括嵌合膜结合细胞因子的免疫细胞。在一些方面，提供了用于用组合物治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括嵌合膜结合细胞因子的免疫细胞。在一些方面，提供了用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包括有效量的包括嵌合膜结合细胞因子的免疫细胞的组合物。在一些实施例中，提供了包括有效量的包括嵌合膜结合细胞因子的免疫细胞的组合物在制备用于刺激个体的免疫应答和/或治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的药物中的用途。在根据本文所描述的方法、组合物或用途的一些实施例中，包括所述嵌合膜结合细胞因子的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子的免疫细胞。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸是编码所述嵌合膜结合细胞因子的mRNA。
在一些方面，本文提供了一种用作药物的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。在一些方面，提供了用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。在一些方面，提供了用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包括有效量的包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞的组合物。在一些实施例中，提供了包括有效量的包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞的组合物在制备用于刺激个体的免疫应答和/或治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的药物中的用途。在根据本文所描述的方法、组合物或用途的一些实施例中，包括所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸和所述抗原进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的免疫细胞。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸是编码所述嵌合膜结合细胞因子的mRNA。
在一些方面，本文提供了一种用作药物的组合物，其中所述组合物包括有效量的免疫细胞、嵌合膜结合细胞因子和抗原。在一些方面，提供了用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。在一些方面，提供了用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包括有效量的包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞的组合物。在一些实施例中，提供了包括有效量的包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞的组合物在制备用于刺激个体的免疫应答和/或治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的药物中的用途。在根据本文所描述的方法、组合物或用途的一些实施例中，包括所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸和编码所述抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸被表达；由此产生包括所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的免疫细胞。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和/或编码所述抗原的所述核酸是mRNA。
在一些方面，本文提供了一种用作药物的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的两种或更多种抗原的免疫细胞。在一些方面，提供了用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的两种或更多种抗原的免疫细胞。在一些方面，提供了用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用包括有效量的包括嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的两种或更多种抗原的免疫细胞的组合物。在一些实施例中，提供了包括有效量的包括嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的两种或更多种抗原的免疫细胞的组合物在制备用于刺激个体的免疫应答和/或治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的药物中的用途。在根据本文所描述的方法、组合物或用途的一些实施例中，包括所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的免疫细胞。
在一些实施例中，所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为在有核细胞群体中具有最小直径的所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约2μm至约5μm、约3μm至约5μm、约2μm至约2.5μm、约2.2μm至约2.5、约2.5μm至约3μm、约3μm至约3.5μm、约3.5μm至约4μm、约4μm至约4.5μm、约3.2μm至约3.8μm、约3.8μm至约4.3μm、约4.2μm至约6μm或约4.2μm至约4.8μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约4.5μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约或小于2μm、2.2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、10.5μm、11μm、11.5μm、12μm、12.5μm、13μm、13.5μm、14μm、14.5μm或15μm中的任一个。在一些实施例中，包括所述输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何一种方法、用途或组合物的一些实施例中，将所述有核细胞(例如，PBMC)与所述佐剂一起温育足够长的时间以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1至约24小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约2至约10小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约3至约6小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时、2小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20小时或24小时中的任一个以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约4小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，在将所述蛋白质或其片段或所述编码蛋白质或其片段的核酸引入到所述有核细胞中之前调节所述有核细胞。在一些实施例中，在将所述蛋白质或其片段或所述编码所述蛋白质或其片段的核酸引入到所述有核细胞中之后调节所述有核细胞。在一些实施例中，用于调节的所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。示例性佐剂包含但不限于CpGODN、干扰素-α(IFN-α)、聚肌:聚胞苷酸(polyI:C)、咪喹莫特(R837)、瑞喹莫德(R848)或脂多糖(LPS)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909。
在一些实施例中，其中所述有核细胞包括B细胞，与未经调节的有核细胞的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的有核细胞的所述B细胞中上调。在一些实施例中，所述有核细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，其中所述有核细胞是多个PBMC，与所述未经调节的多个PBMC的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个PBMC的所述B细胞中上调。在一些实施例中，所述共刺激分子是CD80和/或CD86。在一些实施例中，与未经调节的多个PBMC相比，所述经调节的多个PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的增加的表达。在一些实施例中，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达比未经调节的多个PBMC的表达增加超过约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超过10倍。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何一种方法、用途或组合物的一些实施例中，所述有核细胞是免疫细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是人细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是具有HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16的单倍型的人细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是多个PBMC。在一些实施例中，所述经调节的有核细胞是经调节的多个经修饰的PBMC。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。在一些实施例中，所述有核细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。
输入有核细胞内的成分细胞
在一些实施例中，本文所公开的方法提供了向有需要的个体施用有效量的包括蛋白质或其片段的有核细胞的组合物，其中所述蛋白质或其片段是细胞内递送的。在一些实施例中，有核细胞的所述组合物是免疫细胞的组合物。在一些实施例中，有核细胞的所述组合物包括多个PBMC。在一些实施例中，所述有核细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。
在本发明的特定实施例中，包括所述组合物的蛋白质或其片段的所述有核细胞是PBMC。如本文所使用的，PBMC可以通过如白细胞去除术等单采术从获自个体的全血中分离。还提供了通过混合来自相同个体或不同个体的不同PBMC池而重构的PBMC组合物。在其它实例中，PBMC也可以通过将不同的细胞群体混合成具有产生的分布图的混合细胞组合物来重构。在一些实施例中，用于重构PBMC的所述细胞群体是混合细胞群体(如T细胞、B细胞、NK细胞或单核细胞中的一种或多种的混合物)。在一些实施例中，用于重构PBMC的所述细胞群体是纯化细胞群体(如纯化T细胞、B细胞、NK细胞或单核细胞)。在另外的实例中，用于重构PBMC组合物的所述不同的细胞群体可以从相同个体(例如自体)中分离或从不同个体(例如同种异体和/或异源)中分离。
因此，在根据本文所描述的方法的一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的一种或多种。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞。在一些实施例中，所述多个PBMC包括CD3+T细胞、CD20+B细胞、CD14+单核细胞、CD56+NK细胞中的一种或多种。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与所述多个PBMC中的PBMC总数的比率与T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与全血中的PBMC总数的比率基本上相同。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与所述多个PBMC中的PBMC总数的比率与T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与来自全血的白细胞去除术产物中的PBMC总数的比率基本上相同。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与所述多个PBMC中的PBMC总数的比率与T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与全血中的PBMC总数的比率相差不超过1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％中的任一个。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与所述多个PBMC中的PBMC总数的比率与T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与全血中的PBMC总数的比率相差不超过10％中的任一个。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与所述多个PBMC中的PBMC总数的比率与T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与来自全血的白细胞去除术产物中的PBMC总数的比率相差不超过1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％或50％中的任一个。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞，并且T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与所述多个PBMC中的PBMC总数的比率与T细胞、B细胞、NK细胞和单核细胞与来自全血的白细胞去除术产物中的PBMC总数的比率相差不超过10％中的任一个。
在根据本文所描述的方法的一些实施例中，约25％至约70％的所述经修饰的PBMC是T细胞。在一些实施例中，约2.5％至约14％的所述经修饰的PBMC是B细胞。在一些实施例中，约3.5％至约35％的所述经修饰的PBMC是NK细胞。在一些实施例中，约4％至约25％的所述经修饰的PBMC是NK细胞。
在根据本文所描述的方法的一些实施例中，至少约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％的所述PBMC中的任一种是T细胞。在一些实施例中，至少约25％的所述PBMC是T细胞。在一些实施例中，至少约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、6％、7％、7.5％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％或30％的所述PBMC中的任一种是B细胞。在一些实施例中，至少约2.5％的所述PBMC是B细胞。在一些实施例中，至少约0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、6％、7％、7.5％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％或30％的所述PBMC中的任一种是NK细胞。在一些实施例中，至少约3.5％的所述PBMC是NK细胞。在一些实施例中，至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、25％、30％、35％或40％的所述PBMC中的任一种是单核细胞。在一些实施例中，至少约4％的所述PBMC是单核细胞。在一些实施例中，至少约25％的所述PBMC是T细胞；至少约2.5％的所述PBMC是B细胞；至少约3.5％的所述PBMC是NK细胞；并且至少约4％的所述PBMC是单核细胞。
在根据本文所描述的方法的一些实施例中，不超过约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的所述PBMC中的任一种是T细胞。在一些实施例中，不超过约70％的所述PBMC是T细胞。在一些实施例中，不超过约5％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、25％、30％、35％、40％或50％的所述PBMC中的任一种是B细胞。在一些实施例中，不超过约14％的所述PBMC是B细胞。在一些实施例中，不超过约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或60％的所述PBMC中的任一种是NK细胞。在一些实施例中，不超过约35％的所述PBMC是NK细胞。在一些实施例中，不超过约5％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％、25％、30％、35％、40％或50％的所述PBMC中的任一种是单核细胞。在一些实施例中，不超过约4％的所述PBMC是单核细胞。在一些实施例中，不超过约25％的所述PBMC是T细胞；不超过约2.5％的所述PBMC是B细胞；不超过约3.5％的所述PBMC是NK细胞；并且不超过约4％的所述PBMC是单核细胞。
在根据本文所描述的方法的一些实施例中，约20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％或70％至75％的所述经修饰的PBMC中的任一种是T细胞。在一些实施例中，约25％至约70％的所述经修饰的PBMC是T细胞。在一些实施例中，约1％至2.5％、2.5％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至20％或20％至25％的所述经修饰的PBMC中的任一种是B细胞。在一些实施例中，约2.5％至约14％的所述经修饰的PBMC是B细胞。在一些实施例中，约1％至2％、2％至3.5％、3.5％至5％、5％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％或35％至40％的所述经修饰的PBMC中的任一种是NK细胞。在一些实施例中，约3.5％至约35％的所述经修饰的PBMC是NK细胞。在一些实施例中，约2％至4％、4％至6％、6％至8％、8％至10％、10％至12％、12％至14％、14％至16％、16％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％或35％至40％的所述经修饰的PBMC中的任一种是单核细胞。在一些实施例中，约4％至约25％的所述经修饰的PBMC是单核细胞。在一些实施例中，约25％至约70％的所述经修饰的PBMC是T细胞；约2.5％至约14％的所述经修饰的PBMC是B细胞；约3.5％至约35％的所述经修饰的PBMC是NK细胞；并且约4％至约25％的所述经修饰的PBMC是NK细胞。
如本文所使用的，PBMC也可以在处理单核血细胞(如淋巴细胞和单核细胞)的混合细胞群体的组合物之后产生。在一些情况下，PBMC是在单核血细胞的混合细胞群体中减少(如耗尽)某些亚群体(如B细胞)之后产生的。可以操纵个体中的单核血细胞的混合细胞群体中的组成，以使得细胞群体更接近同一个体中的全血中的白细胞去除术产物。在其它实施例中，单核血细胞(例如，小鼠脾细胞)的混合细胞群体中的组成也可以被操纵，以使得细胞群体更接近于从来自人全血的白细胞去除术产物分离的人PBMC。
在本发明的一些实施例中，包括蛋白质或其片段的有核细胞的所述组合物是在PBMC中发现的细胞群体。在一些实施例中，包括蛋白质或其片段的有核细胞的所述组合物包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的一种或多种。在一些实施例中，包括蛋白质或其片段的有核细胞的所述组合物包括CD3+T细胞、CD20+B细胞、CD14+单核细胞、CD56+NK细胞中的一种或多种。在一些实施例中，包括蛋白质或其片段的有核细胞的所述组合物包括至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％ T细胞中的任一种。在一些实施例中，包括蛋白质或其片段的有核细胞的所述组合物包括100％ T细胞。在一些实施例中，包括蛋白质或其片段的有核细胞的所述组合物包括至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％ B细胞中的任一种。在一些实施例中，包括蛋白质或其片段的有核细胞的所述组合物包括100％ B细胞。在一些实施例中，包括蛋白质或其片段的有核细胞的所述组合物包括至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％ NK细胞中的任一种。在一些实施例中，包括蛋白质或其片段的有核细胞的所述组合物包括100％ NK细胞。在一些实施例中，包括蛋白质或其片段的有核细胞的所述组合物包括至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％单核细胞中的任一种。在一些实施例中，包括蛋白质或其片段的有核细胞的所述组合物包括100％单核细胞。在一些实施例中，包括蛋白质或其片段的有核细胞的所述组合物包括至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％树突细胞中的任一种。在一些实施例中，包括蛋白质或其片段的有核细胞的所述组合物包括100％树突细胞。在一些实施例中，包括蛋白质或其片段的有核细胞的所述组合物包括至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％ NK-T细胞中的任一种。在一些实施例中，包括蛋白质或其片段的有核细胞的所述组合物包括100％ NK-T细胞。
包括蛋白质或其片段的有核细胞的另外的修饰
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，有核细胞(例如，PBMC)的所述组合物进一步包括药剂，与不包括所述药剂的对应的有核细胞的组合物相比，所述药剂增强所述有核细胞的活力和/或功能。在一些实施例中，有核细胞的所述组合物进一步包括药剂，与不包括所述药剂的对应的有核细胞的组合物相比，所述药剂增强冻融循环后所述有核细胞的活力和/或功能。在一些实施例中，所述药剂是冷冻保存剂和/或低温保存剂。在一些实施例中，与在任何冻融循环之前不包括所述药剂的对应的有核细胞的组合物相比，冷冻保存剂和低温保存剂都不会导致包括所述药剂的有核细胞的组合物中不超过10％或20％的细胞死亡。在一些实施例中，在至多1、2、3、4、5次冻融循环之后，至少约70％、约80％或约90％的所述有核细胞是活的。在一些实施例中，所述药剂是增强胞吞作用的化合物、稳定剂或辅因子。在一些实施例中，所述药剂是白蛋白。在一些实施例中，所述白蛋白是小鼠、牛或人白蛋白。在一些实施例中，所述药剂是人白蛋白。在一些实施例中，所述药剂是以下中的一种或多种：二价金属阳离子、葡萄糖、ATP、钾、甘油、海藻糖、D-蔗糖、PEG1500、L-精氨酸、L-谷氨酰胺或EDTA。在一些实施例中，所述二价金属阳离子是Mg2+、Zn2+或Ca2+中的一种或多种。在一些实施例中，所述药剂是以下中的一种或多种：丙酮酸钠、腺嘌呤、海藻糖、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、DMSO、HEPES、甘油、谷胱甘肽、肌苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、钠金属离子、钾金属离子、镁金属离子、氯化物、乙酸盐、谷氨酸盐、蔗糖、氢氧化钾或氢氧化钠。在一些实施例中，所述药剂是以下中的一种或多种：丙酮酸钠、腺嘌呤、
海藻糖、右旋糖、甘露糖、蔗糖、人血清白蛋白(HSA)、
DMSO、/>
CS2、/>
CS5、/>
CS10、/>
CS15、HEPES、甘油、谷胱甘肽、/>
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，有核细胞的所述组合物包括被进一步修饰以增加共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的表达的多个经修饰的PBMC。在一些实施例中，所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。在一些实施例中，所述多个经修饰的PBMC包括导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的核酸。在一些实施例中，所述多个经修饰的PBMC包括导致所述一种或多种共刺激分子的表达增加的mRNA。在一些实施例中，所述共刺激分子是刺激T细胞激活的信号2介体。
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，所述经修饰的PBMC被进一步修饰以增加一种或多种细胞因子的表达。在一些实施例中，所述细胞因子是IL-2、IL-12、IL-21或IFNα2中的一种或多种。在一些实施例中，所述多个经修饰的PBMC包括导致所述一种或多种细胞因子的表达和/或分泌增加的核酸。在一些实施例中，所述细胞因子是刺激T细胞激活的信号3效应子。
T细胞激活启动细胞内信号传导级联，最终导致增殖、效应子功能或死亡，这取决于TCR信号和相关信号的强度。为了防止过早或过度激活，T细胞需要两个独立的信号才能完全激活。信号1是由TCR与和MHC复合的抗原肽的结合提供的抗原特异性信号。信号2由细胞因子或如抗原呈递细胞(APC)上的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)等共刺激分子的参与介导。信号3由如IL-2、IL-12和IFN-α等炎性细胞因子介导。
在根据本文所描述的方法或组合物中的任何一种方法或组合物的一些实施例中，其中所述有核细胞(如PBMC)包括蛋白质或其片段，所述有核细胞进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)。在一些实施例中，其中所述有核细胞(如PBMC)包括蛋白质或其片段，所述有核细胞进一步包括介导信号3的一种或多种药剂(如信号3效应子)。在一些实施例中，其中所述有核细胞(如PBMC)包括蛋白质或其片段，所述有核细胞进一步包括介导信号2的一种或多种试剂(如信号2介体)和介导信号3的一种或多种试剂(如信号3效应子)。
在一些实施例中，介导信号2的所述一种或多种药剂包括B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112中的一种或多种。在一些实施例中，介导信号2的所述一种或多种药剂包括B7-1(CD80)和/或B7-2(CD86)。在一些实施例中，介导信号2的所述一种或多种药剂包括编码B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112的一种或多种mRNA。在一些实施例中，介导信号2的所述一种或多种药剂包括编码B7-1(CD80)和/或B7-2(CD86)的一种或多种mRNA。
在一些实施例中，介导信号3的所述一种或多种药剂包括一种或多种细胞因子。在一些实施例中，介导信号3的所述一种或多种药剂包括IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、IFNα2中的一种或多种。在一些实施例中，介导信号3的所述一种或多种药剂包括IL-2和/或IL-12。在一些实施例中，介导信号3的所述一种或多种药剂包括IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IFNα2的变体中的一种或多种。在一些实施例中，介导信号3的所述一种或多种药剂包括IL-2和/或IL-12的变体。在一些实施例中，介导信号3的所述一种或多种药剂包括IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IFNα2的变体中的一种或多种。在一些实施例中，介导信号3的所述一种或多种药剂包括膜结合IL-2和/或膜结合IL-12。在一些实施例中，介导信号3的所述一种或多种药剂包括IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21、IFNα2的变体中的一种或多种。在一些实施例中，介导信号3的所述一种或多种药剂包括IL-2和/或IL12的变体。
在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的药剂的有核细胞可以以比不包括介导信号2的药剂的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号3的药剂的有核细胞可以以比不包括介导信号3的药剂的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的药剂和/或介导信号3的药剂的有核细胞可以以比不包括介导信号2或信号3的药剂的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，增强的抗原特异性T细胞激活是HLA未知的。在一些实施例中，增强的抗原特异性T细胞激活包括依赖于HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08和/或HLA-C*16单倍型中的一种或多种的限制的T细胞激活。
在一些实施例中，所述多个PBMC被进一步修饰以增加一种或多种细胞因子的表达。在一些实施例中，所述细胞因子是IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞因子是IFN-α2或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞因子是变体细胞因子(如经修饰的细胞因子)，如嵌合膜结合细胞因子。在一些实施例中，所述多个PBMC被进一步修饰以增加一种或多种嵌合膜结合细胞因子(如膜结合IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21)的表达。在一些实施例中，所述细胞因子被修饰，并且所述经修饰的细胞因子是包括所述细胞因子和跨膜结构域的融合蛋白。在一些实施例中，所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。在一些实施例中，所述跨膜结构域是转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)或肿瘤坏死因子(例如，FasL)跨膜结构域。在一些实施例中，所述跨膜结构域包括SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82的氨基酸序列。在一些实施例中，所述肽连接子是G4S连接子或EAAAK连接子。在实施例中，所述G4S连接子包括G4S序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复序列中的任一个。在一些实施例中，所述EAAAK连接子包括EAAAK序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复序列中的任一个。在一些实施例中，所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述多个经修饰的PBMC包括导致所述一种或多种细胞因子的表达和/或分泌增加的核酸。在一些实施例中，所述编码嵌合膜结合细胞因子的核酸包括SEQ ID NO:71或72的核苷酸序列。在一些实施例中，所述细胞因子是刺激T细胞激活的信号3效应子。在一些实施例中，与非膜结合细胞因子相比，所述嵌合膜结合细胞因子增强所述细胞因子在个体中的半衰期。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子的半衰期比非膜结合细胞因子的半衰期大约增加以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，与包括非膜系细胞因子的对应的有核细胞相比，所述膜结合细胞因子将所述细胞因子与由引入有所述蛋白质或其片段的所述有核细胞呈递的所述抗原的空间缀合大约延长以下中的任一者：1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96个小时或更多个小时。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括膜结合细胞因子的有核细胞表现出的局部细胞因子浓度比包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞表现出的局部细胞因子浓度大约高以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括膜结合细胞因子的有核细胞可以以比包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些实施例中，所述膜结合细胞因子是膜结合趋化因子。
在一些实施例中，所述经修饰的PBMC包括调节MHC II类表达的另外的修饰。在一些实施例中，与响应于在同种异体上下文中施用不包括另外的修饰的对应的修饰的PBMC而在个体中安装的先天免疫应答相比，响应于在同种异体上下文中施用修饰的PBMC而在个体中安装的先天免疫应答降低。在一些实施例中，与不包括进一步修饰的对应的修饰的PBMC在施用其的个体中的循环半衰期相比，修饰的PBMC在施用其的个体中的循环半衰期增加。在一些实施例中，修饰的PBMC在施用其的个体中的循环半衰期比不包括进一步修饰的对应的修饰的PBMC在施用其的个体中的循环半衰期大约增加10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍中的任一者。在一些实施例中，修饰的PBMC在施用其的个体中的循环半衰期增加与不包括进一步修饰的对应的修饰的PBMC在施用其的个体中的循环半衰期基本上相同。
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，所述方法进一步包括将有核细胞的所述组合物与药剂一起温育的步骤，与没有另外的温育步骤而制备的对应的有核细胞相比，所述药剂增强所述有核细胞的活力和/或功能。
以HLA未知的方式进一步修饰有核细胞以增强抗原特异性应答
T细胞激活启动细胞内信号传导级联，最终导致增殖、效应子功能或死亡，这取决于TCR信号和相关信号的强度。为了防止过早或过度激活，T细胞需要两个独立的信号才能完全激活。信号1是由TCR与和MHC复合的抗原肽的结合提供的抗原特异性信号。信号2由细胞因子或如抗原呈递细胞(APC)上的B7.1(CD80)和B7.2(CD86)等共刺激分子的参与介导。信号3由如IL-2、IL-12和IFN-α等炎性细胞因子介导。
在一些方面，提供了用于增强免疫细胞的活性的方法，所述方法包括在所述免疫细胞中表达介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)。在一些方面，提供了用于增强免疫细胞的活性的方法，所述方法包括在所述免疫细胞中表达介导信号3的一种或多种药剂(如信号3介体)。在一些方面，提供了用于增强免疫细胞的活性的方法，所述方法包括在所述免疫细胞中表达介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)和介导信号3的一种或多种药剂(如信号3介体)。在一些实施例中，介导刺激T细胞激活的信号3的所述药剂(如信号3效应子)是细胞因子。在一些实施例中，所述细胞因子包括IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-21、IFNα2中的一种或多种。在一些实施例中，所述细胞因子包括IL-2和/或IL-12。在一些实施例中，提供了用于增强免疫细胞的活性的方法，所述方法包括在所述免疫细胞中表达编码嵌合膜结合细胞因子的核酸。在一些实施例中，所述细胞因子被修饰，并且所述经修饰的细胞因子是包括所述细胞因子和跨膜结构域的融合蛋白。在一些实施例中，所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。在一些实施例中，所述跨膜结构域是转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)或肿瘤坏死因子(例如，FasL)跨膜结构域。在一些实施例中，所述跨膜结构域包括SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82的氨基酸序列。在一些实施例中，所述肽连接子是G4S连接子或EAAAK连接子。在实施例中，所述G4S连接子包括G4S序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复序列中的任一个。在一些实施例中，所述EAAAK连接子包括EAAAK序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复序列中的任一个。在一些实施例中，所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列。在一些实施例中，所述多个经修饰的PBMC包括导致所述一种或多种细胞因子的表达和/或分泌增加的核酸。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸包括SEQ ID NO:71或72的核苷酸序列。在一些实施例中，所述细胞因子是刺激T细胞激活的信号3效应子。在一些实施例中，与非膜结合细胞因子相比，所述嵌合膜结合细胞因子增强所述细胞因子在个体中的半衰期。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子的半衰期比非膜结合细胞因子的半衰期大约增加以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，与包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞相比，所述膜结合细胞因子将所述细胞因子与由引入有所述蛋白质或其片段的所述有核细胞呈递的所述抗原的空间缀合大约延长以下中的任一者：1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96个小时或更多个小时。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括膜结合细胞因子的有核细胞表现出的局部细胞因子浓度比包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞表现出的局部细胞因子浓度大约高以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括膜结合细胞因子的有核细胞可以以比包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些方面，本发明提供了用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述mRNA被表达，并且其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些方面，本发明提供了用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，所述mRNA的核苷酸序列被密码子优化以在所述有核细胞中表达。
在一些实施例中，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段，所述蛋白质或其片段包括抗原。在一些实施例中，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA，所述蛋白质或其片段是抗原。在一些实施例中，所述抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，所述有核细胞包括源自蛋白质的两种或更多种抗原。在一些实施例中，所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。在一些实施例中，所述HPV是HPV-16或HPV-18。在一些实施例中，所述蛋白质是HPV E6或HPV E7蛋白。在一些实施例中，所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。在一些实施例中，所述有核细胞包括蛋白质或其片段，或编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段被加工成与MHC复合的抗原肽，由此介导T细胞激活中的信号1。
在一些实施例中，信号1是由T细胞受体与和MHC复合的抗原肽的结合提供的抗原特异性信号。在一些实施例中，所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA，其中mRNA被表达，其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，所述有核细胞包括蛋白质或其片段，其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。在一些实施例中，所述有核细胞包括蛋白质或其片段，或编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段被加工成与MHC复合的抗原肽，由此介导T细胞激活中的信号1。
在根据上文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，所述有核细胞(如PBMC)包括另外的修饰以进一步增强对所述蛋白质或其片段的免疫应答。在一些实施例中，进一步修饰所述有核细胞(如PBMC)的方法以HLA未知的方式进一步增强了对所述蛋白质或其片段的免疫应答。在一些实施例中，进一步修饰所述有核细胞(如PBMC)的方法进一步增强了对所述蛋白质或其片段的免疫应答，其中增强的免疫应答包括依赖于一种或多种HLA单倍型的限制的免疫应答。在一些实施例中，进一步修饰所述有核细胞(如PBMC)的方法进一步增强对所述蛋白质或其片段的免疫应答，其中增强的免疫应答包括依赖于HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16单倍型中的一种或多种的限制的免疫应答。在一些实施例中，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段，或编码蛋白质或其片段的mRNA；所述蛋白质或其片段被加工成与MHC复合的抗原肽，由此介导T细胞激活中的信号1。在一些实施例中，所述进一步修饰所述有核细胞包括引入介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)。在一些实施例中，所述进一步修饰所述有核细胞包括引入介导信号3的一种或多种药剂(如信号3效应子)。在一些实施例中，所述进一步修饰所述有核细胞包括引入介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)和介导信号3的一种或多种药剂(如信号3介体)。
在根据本文所描述的方法或组合物中的任何一种方法或组合物的一些实施例中，介导信号2的所述药剂(如信号2介体)包括B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112中的一种或多种。在一些实施例中，介导信号2的所述药剂包括CD70、B7-1(CD80)和/或B7-2(CD86)。在一些实施例中，所述经修饰的有核细胞包括导致B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112中的一种或多种的表达增加的核酸。在一些实施例中，所述经修饰的有核细胞包括编码B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112中的一种或多种的一种或多种核酸。在一些实施例中，所述多个经修饰的有核细胞包括编码CD70、B7-1(CD80)和/或B7-2(CD86)的一种或多种核酸。
在根据本文所描述的方法或组合物中的任何一种方法或组合物的一些实施例中，介导信号3的所述药剂(如信号3效应子)是细胞因子或其功能变体。在一些实施例中，介导信号3的所述药剂是编码细胞因子或其功能变体的mRNA。在一些实施例中，所述细胞因子是IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞因子是IFN-α2或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞因子是变体细胞因子(如经修饰的细胞因子)，如嵌合膜结合细胞因子。在一些实施例中，所述细胞因子被修饰，并且所述经修饰的细胞因子是包括所述细胞因子和跨膜结构域的融合蛋白。在一些实施例中，所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。在一些实施例中，所述跨膜结构域是转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)或肿瘤坏死因子(例如，FasL)跨膜结构域。在一些实施例中，所述跨膜结构域包括SEQ ID NO:81或SEQ ID NO:82的氨基酸序列。在一些实施例中，所述肽连接子是G4S连接子或EAAAK连接子。在实施例中，所述G4S连接子包括G4S序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复序列中的任一个。在一些实施例中，所述EAAAK连接子包括EAAAK序列的2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个重复序列中的任一个。在一些实施例中，所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80中的任一个的氨基酸序列。在一些实施例中，所述多个经修饰的有核细胞包括导致所述一种或多种细胞因子的表达和/或分泌增加的核酸。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸包括SEQ ID NO:71或72的核苷酸序列。在一些实施例中，所述细胞因子是刺激T细胞激活的信号3效应子。在一些实施例中，与非膜结合细胞因子相比，所述嵌合膜结合细胞因子增强所述细胞因子在个体中的半衰期。在一些实施例中，所述嵌合膜结合细胞因子的半衰期比非膜结合细胞因子的半衰期大约增加以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，与包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞相比，所述膜结合细胞因子将所述细胞因子与由引入有所述蛋白质或其片段的所述有核细胞呈递的所述抗原的空间缀合大约延长以下中的任一者：1、2、3、4、6、8、12、16、20、24、28、32、36、48、72、96个小时或更多个小时。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括膜结合细胞因子的有核细胞表现出的局部细胞因子浓度比包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞表现出的局部细胞因子浓度大约高以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括膜结合细胞因子的有核细胞可以以比包括非膜结合细胞因子的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，所述细胞因子是IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-21或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞因子是IFN-α2或其功能变体。在一些实施例中，所述细胞因子是变体细胞因子(如经修饰的细胞因子)，如嵌合膜结合细胞因子。在一些实施例中，所述有核细胞被进一步修饰以增加一种或多种嵌合膜结合细胞因子(如膜结合IL-10、IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-γ和/或IL-21)的表达。在一些实施例中，所述有核细胞进一步包括编码一种或多种嵌合膜结合细胞因子的一种或多种核酸。在一些实施例中，所述有核细胞进一步包括编码膜结合IL-12的核酸。在一些实施例中，所述有核细胞进一步包括编码膜结合IL-2的核酸。在一些实施例中，所述有核细胞进一步包括编码膜结合IL-2和膜结合IL-12的核酸。
在一些实施例中，提供了用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何；并且其中用介导信号2的药剂和/或介导信号3的药剂进一步修饰所述有核细胞。在一些方面，本发明提供了用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何；并且其中用介导信号2的药剂和/或介导信号3的药剂进一步修饰所述有核细胞。在一些实施例中，所述mRNA的核苷酸序列被密码子优化以在所述有核细胞中表达。
在根据本文所提供的方法、有核细胞或组合物中的任何一种方法、有核细胞或组合物的一些实施例中，包括蛋白质或其片段和介导信号2和/或信号3的一种或多种抗原的所述有核细胞通过包括以下的方法制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使得所述输入免疫细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段和介导信号2和/或信号3的所述一种或多种抗原形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与所述蛋白质或其片段和介导信号2和/或信号3的所述一种或多种抗原一起温育，以允许所述蛋白质或其片段和介导信号2和/或信号3的所述一种或多种抗原进入所述扰动的输入免疫细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段和介导信号2和/或信号3的所述一种或多种抗原的免疫细胞。
在一些实施例中，介导信号2的所述药剂包括CD86并且介导信号3的所述药剂包括IL-2。在根据本文所提供的方法、有核细胞或组合物中的任何一种方法、有核细胞或组合物的一些实施例中，包括蛋白质或其片段以及CD86和IL-2的所述有核细胞通过包括以下的方法制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使得所述输入免疫细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段以及CD86和IL-2形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与所述蛋白质或其片段以及CD86和IL-2一起温育，以允许所述蛋白质或其片段以及素数CD86和IL-2进入所述扰动的输入免疫细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段以及CD86和IL-2的免疫细胞。
在一些实施例中，介导信号3的所述药剂是膜结合细胞因子。在根据本文所提供的方法、有核细胞或组合物中的任何一种方法、有核细胞或组合物的一些实施例中，包括蛋白质或其片段和膜结合细胞因子的所述有核细胞通过包括以下的方法制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使得所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸和编码所述蛋白质或其片段的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和所述编码所述蛋白质或其片段的核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和所述编码所述蛋白质或其片段的核酸被表达；由此产生包括所述嵌合膜结合细胞因子和所述蛋白质或其片段的免疫细胞。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和/或所述编码所述蛋白质或其片段的核酸是mRNA。在一些实施例中，所述蛋白质或其片段包括一种或多种抗原。
在一些实施例中，介导信号2的所述药剂包括嵌合膜结合细胞因子。在一些实施例中，提供了用于增强免疫细胞在刺激对抗原的免疫应答中的活性的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子并且进一步包括抗原的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使得所述输入免疫细胞的扰动足够大以使所述抗原和编码嵌合膜结合细胞因子的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸和所述抗原进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的免疫细胞。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸是编码所述嵌合膜结合细胞因子的mRNA。
在一些实施例中，提供了用于增强免疫细胞在刺激对抗原的免疫应答中的活性的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子并且进一步包括抗原的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸和编码所述抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸被表达；由此产生包括所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的免疫细胞。在一些实施例中，编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和/或编码所述抗原的所述核酸是mRNA。
在一些实施例中，提供了一种用于增强免疫细胞在刺激对抗原的免疫应答中的活性的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述免疫细胞通过以下制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的免疫细胞。
在一些方面，本文提供了一种用作药物的组合物，其中所述组合物包括有效量包括蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2和/或信号3的一种或多种药剂的有核细胞。在一些方面，提供了用于用组合物治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的组合物，其中所述组合物包括有效量的包括蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2和/或信号3的一种或多种药剂的有核细胞。在一些方面，提供了用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的方法，所述方法包括施用包括有效量的包括蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2和/或信号3的一种或多种药剂的有核细胞的组合物。在一些实施例中，提供了包括有效量的包括蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2和/或信号3的一种或多种药剂的有核细胞的组合物在制备用于刺激个体的免疫应答和/或治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的药物中的用途。
在一些实施例中，介导信号3的所述药剂包括一种或多种膜结合细胞因子。在一些实施例中，介导信号3的所述药剂包括膜结合IL-12。在一些实施例中，介导信号3的所述药剂包括膜结合IL-2。在一些实施例中，介导信号3的所述药剂包括膜结合IL-2和膜结合IL-12。在一些实施例中，介导信号2的所述药剂包括CD80。在一些实施例中，介导信号3的所述药剂包括CD86。在一些实施例中，介导信号2的所述药剂包括CD80和CD86。在一些实施例中，所述有核细胞包括蛋白质或其片段，或编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段被加工成与MHC复合的抗原肽，由此介导T细胞激活中的信号1。
在根据本文所描述的方法、有核细胞或组合物中的任何一种方法、有核细胞或组合物的一些实施例中，所述有核细胞包括蛋白质或其片段、CD86和膜结合IL-12，其中所述有核细胞通过包括以下的方法制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使得所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码CD86的核酸、编码膜结合IL-12的核酸和编码所述蛋白质或其片段的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与所述编码CD86的核酸、所述编码膜结合IL-12的核酸和所述编码所述蛋白质或其片段的核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中所述编码CD86的核酸、所述编码膜结合IL-12的核酸和所述编码所述蛋白质或其片段的核酸被表达；由此产生包括所述蛋白质或其片段、CD86和膜结合IL-12的免疫细胞。在一些实施例中，所述编码CD86的核酸、所述编码膜结合IL-12的核酸和/或所述编码所述蛋白质或其片段的核酸是mRNA。在一些实施例中，所述蛋白质或其片段包括一种或多种抗原。
在根据本文所描述的方法、有核细胞或组合物中的任何一种方法、有核细胞或组合物的一些实施例中，所述有核细胞包括蛋白质或其片段、CD86和膜结合IL-2，其中所述有核细胞通过包括以下的方法制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使得所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码CD86的核酸、编码膜结合IL-2的核酸和编码所述蛋白质或其片段的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与所述编码CD86的核酸、所述编码膜结合IL-2的核酸和所述编码所述蛋白质或其片段的核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中所述编码CD86的核酸、所述编码膜结合IL-2的核酸和所述编码所述蛋白质或其片段的核酸被表达；由此产生包括所述蛋白质或其片段、CD86和膜结合IL-2的免疫细胞。在一些实施例中，所述编码CD86的核酸、所述编码膜结合IL-2的核酸和/或所述编码所述蛋白质或其片段的核酸是mRNA。在一些实施例中，所述蛋白质或其片段包括一种或多种抗原。
在根据本文所描述的方法、有核细胞或组合物中的任何一种方法、有核细胞或组合物的一些实施例中，所述有核细胞包括蛋白质或其片段、CD86、膜结合IL-2和膜结合IL-12，其中所述有核细胞通过包括以下的方法制备：a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使得所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码CD86的核酸、编码膜结合IL-2的核酸、编码膜结合IL-12的核酸和编码所述蛋白质或其片段的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及b)将所述扰动的输入免疫细胞与所述编码CD86的核酸、所述编码膜结合IL-2的核酸、所述编码膜结合IL-12的核酸和所述编码所述蛋白质或其片段的核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中所述编码CD86的核酸、所述编码膜结合IL-2的核酸、所述编码膜结合IL-12的核酸和所述编码所述蛋白质或其片段的核酸被表达；由此产生包括所述蛋白质或其片段、CD86、膜结合IL-2和膜结合IL-12的免疫细胞。在一些实施例中，所述编码CD86的核酸、所述编码膜结合IL-2的核酸、所述编码膜结合IL-12的核酸和/或所述编码所述蛋白质或其片段的核酸是mRNA。在一些实施例中，所述蛋白质或其片段包括一种或多种抗原。
在一些实施例中，所述输入细胞悬浮液可以包括所述输入有核细胞和抗原。在一些实施例中，所述输入细胞悬浮液包括所述输入有核细胞和所述蛋白质或其片段。在一些实施例中，所述输入细胞悬浮液包括所述输入有核细胞和编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA。在一些实施例中，所述方法包括在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育。在一些实施例中，所述方法包括在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育。
在一些实施例中，所述输入细胞悬浮液包括所述输入有核细胞和所述蛋白质或其片段以及介导信号2的所述药剂和/或介导信号3的所述药剂。在一些实施例中，所述输入细胞悬浮液包括所述输入有核细胞和所述蛋白质或其片段以及编码介导信号2的药剂和/或介导信号3的所述药剂的mRNA。在一些实施例中，所述输入细胞悬浮液包括所述输入有核细胞和编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA以及所述编码介导信号2的药剂和/或介导信号3的所述药剂的mRNA。在一些实施例中，所述方法包括在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述编码介导信号2的药剂和/或介导信号3的所述药剂的所述mRNA，以及所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育。在一些实施例中，所述方法包括在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述编码介导信号2的药剂和/或介导信号3的所述药剂的所述mRNA，以及所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育。
在根据本文所描述的方法、组合物或有核细胞中的任一种的一些实施例中，所述mRNA(如编码信号2介体的mRNA和编码信号3介体的mRNA)是外源mRNA。在一些实施例中，所述mRNA是体外转录的(IVT)mRNA。在一些实施例中，所述外源mRNA是体外转录的(IVT)mRNA。在一些实施例中，所述mRNA编码重组蛋白。在一些实施例中，所述mRNA被密码子优化以在有核细胞中表达。
在一些实施例中，所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为在有核细胞群体中具有最小直径的所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约2μm至约5μm、约3μm至约5μm、约2μm至约2.5μm、约2.2μm至约2.5、约2.5μm至约3μm、约3μm至约3.5μm、约3.5μm至约4μm、约4μm至约4.5μm、约3.2μm至约3.8μm、约3.8μm至约4.3μm、约4.2μm至约6μm或约4.2μm至约4.8μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约4.5μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约或小于2μm、2.2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、10.5μm、11μm、11.5μm、12μm、12.5μm、13μm、13.5μm、14μm、14.5μm或15μm中的任一个。在一些实施例中，包括所述输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何一种方法、用途或组合物的一些实施例中，将所述有核细胞(例如，PBMC)与所述佐剂一起温育足够长的时间以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1至约24小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约2至约10小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约3至约6小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时、2小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20小时或24小时中的任一个以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约4小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，在将所述蛋白质或其片段或所述编码蛋白质或其片段的核酸引入到所述有核细胞中之前调节所述有核细胞。在一些实施例中，在将所述蛋白质或其片段或所述编码所述蛋白质或其片段的核酸引入到所述有核细胞中之后调节所述有核细胞。在一些实施例中，用于调节的所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸(poly I:C)、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。示例性佐剂包含但不限于CpGODN、干扰素-α(IFN-α)、聚肌:聚胞苷酸(polyI:C)、咪喹莫特(R837)、瑞喹莫德(R848)或脂多糖(LPS)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909。
在一些实施例中，其中所述有核细胞包括B细胞，与未经调节的有核细胞的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的有核细胞的所述B细胞中上调。在一些实施例中，所述有核细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施例中，其中所述有核细胞是多个PBMC，与所述未经调节的多个PBMC的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个PBMC的所述B细胞中上调。在一些实施例中，所述共刺激分子是CD80和/或CD86。在一些实施例中，与未经调节的多个PBMC相比，所述经调节的多个PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的增加的表达。在一些实施例中，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达比未经调节的多个PBMC的表达增加超过约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超过10倍。
在根据本文所描述的方法、用途或组合物中的任何一种方法、用途或组合物的一些实施例中，所述有核细胞是免疫细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是人细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是具有HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16的单倍型的人细胞。在一些实施例中，所述有核细胞是多个PBMC。在一些实施例中，所述经调节的有核细胞是经调节的多个经修饰的PBMC。在一些实施例中，所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。在一些实施例中，所述有核细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。
在一些实施例中，所述有核细胞包括蛋白质或其片段，或编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段被加工成与MHC复合的抗原肽，由此介导T细胞激活中的信号1。在一些实施例中，如与不包括介导信号2的药剂的对应的有核细胞相比，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)的有核细胞可以以增强的水平诱导抗原特异性免疫应答。在一些实施例中，如与不包括介导信号2的药剂的对应的有核细胞相比，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)的有核细胞可以以HLA未知的方式以增强的水平诱导抗原特异性免疫应答。在一些实施例中，如与不包括介导信号2的药剂的对应的有核细胞相比，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)的有核细胞可以以增强的水平诱导抗原特异性免疫应答，其中增强的免疫应答包括依赖于HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16单倍型中的一种或多种的限制的免疫应答。
在一些实施例中，所述有核细胞包括蛋白质或其片段，或编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段被加工成与MHC复合的抗原肽，由此介导T细胞激活中的信号1。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)的有核细胞可以以比不包括介导信号2的药剂的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)的有核细胞可以以HLA未知的方式以比与不包括介导信号2的药剂的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)的有核细胞可以以比与不包括介导信号2的药剂的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍，其中增强的T细胞激活包括依赖于HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16单倍型中的一种或多种的限制的T细胞激活。在一些实施例中，如与由不进一步包括介导信号2的药剂的有核细胞激活的抗原特异性CD8+T细胞相比，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)的有核细胞可以诱导抗原特异性CD8+T细胞激活，其中所述CD8+T细胞的一种或多种多功能标志物大约增加以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，所述一种或多种多功能标志物包括：颗粒酶B、IFN-α、IL-2、PD-1和/或IFN-γ。在一些实施例中，如与由不进一步包括介导信号2的药剂的有核细胞激活的抗原特异性CD8+T细胞相比，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)的有核细胞可以诱导抗原特异性CD8+T细胞激活，其中所述CD8+T细胞的增殖和/或存活大约增加以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些实施例中，所述有核细胞包括蛋白质或其片段，或编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段被加工成与MHC复合的抗原肽，由此介导T细胞激活中的信号1。在一些实施例中，如与不包括介导信号3的药剂的对应的有核细胞相比，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号3的一种或多种药剂(如信号3效应子)的有核细胞可以以增强的水平诱导抗原特异性免疫应答。在一些实施例中，如与不包括介导信号3的药剂的对应的有核细胞相比，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号3的一种或多种药剂(如信号3效应子)的有核细胞可以以HLA未知的方式以增强的水平诱导抗原特异性免疫应答。在一些实施例中，如与不包括介导信号3的药剂的对应的有核细胞相比，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号3的一种或多种药剂(如信号3效应子)的有核细胞可以以增强的水平诱导抗原特异性免疫应答，其中增强的免疫应答包括依赖于HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16单倍型中的一种或多种的限制的免疫应答。
在一些实施例中，所述有核细胞包括蛋白质或其片段，或编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段被加工成与MHC复合的抗原肽，由此介导T细胞激活中的信号1。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号3的一种或多种药剂(如信号3效应子)的有核细胞可以以比不包括介导信号3的药剂的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号3的一种或多种药剂(如信号3效应子)的有核细胞可以以HLA未知的方式以比不包括介导信号3的药剂的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，如与不包括介导信号3的药剂的对应的有核细胞相比，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号3的一种或多种药剂(如信号3效应子)的有核细胞可以以增强的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞，其中增强的T细胞激活包括依赖于HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16单倍型中的一种或多种的限制的T细胞激活。在一些实施例中，如与由不进一步包括介导信号3的药剂的有核细胞激活的抗原特异性CD8+T细胞相比，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号3的一种或多种药剂(如信号3介体)的有核细胞可以诱导抗原特异性CD8+T细胞激活，其中所述CD8+T细胞的所述一种或多种多功能标志物大约增加以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，所述一种或多种多功能标志物包括：颗粒酶B、IFN-α、IL-2、PD-1和/或IFN-γ。在一些实施例中，如与由不进一步包括介导信号3的药剂的有核细胞激活的抗原特异性CD8+T细胞相比，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号3的一种或多种药剂(如信号3介体)的有核细胞可以诱导抗原特异性CD8+T细胞激活，其中所述CD8+T细胞的增殖和/或存活大约增加以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
在一些实施例中，如与不包括介导信号2或信号3的药剂的对应的有核细胞相比，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)和介导信号3的一种或多种药剂(如信号3效应子)的有核细胞可以以增强的水平诱导抗原特异性免疫应答。在一些实施例中，如与不包括介导信号2或信号3的药剂的对应的有核细胞相比，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)和介导信号3的一种或多种药剂(如信号3介体)的有核细胞可以以HLA未知的方式以增强的水平诱导抗原特异性免疫应答。
在一些实施例中，所述有核细胞包括蛋白质或其片段，或编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段被加工成与MHC复合的抗原肽，由此介导T细胞激活中的信号1。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)和介导信号3的一种或多种药剂(如信号3效应子)的有核细胞可以以比不包括介导信号2或信号3的药剂的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性免疫应答：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)和介导信号3的一种或多种药剂(如信号3效应子)的有核细胞可以以HLA未知的方式以比不包括介导信号2或信号3的药剂的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性免疫应答：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)和介导信号3的一种或多种药剂(如信号3效应子)的有核细胞可以以比不包括介导信号2或信号3的药剂的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性免疫应答：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍，其中增强的免疫应答包括依赖于HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16单倍型中的一种或多种的限制的免疫应答。
在一些实施例中，所述有核细胞包括蛋白质或其片段，或编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段被加工成与MHC复合的抗原肽，由此介导T细胞激活中的信号1。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)和介导信号3的一种或多种药剂(如信号3介体)的有核细胞可以以比不包括介导信号2或信号3的药剂的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2效应子)和介导信号3的一种或多种药剂(如信号3效应子)的有核细胞可以以HLA未知的方式以比不包括介导信号2或信号3的药剂的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)和介导信号3的一种或多种药剂(如信号3介体)的有核细胞可以以比不包括介导信号2或信号3的药剂的对应的有核细胞大约高以下中的任一者的水平诱导抗原特异性CD8+T细胞激活：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍，其中增强的T细胞激活包括依赖于HLA-A*02、HLA-A*01、HLA-A*03、HLA-A*24、HLA-A*11、HLA-A*26、HLA-A*32、HLA-A*31、HLA-A*68、HLA-A*29、HLA-A*23、HLA-B*07、HLA-B*44、HLA-B*08、HLA-B*35、HLA-B*15、HLA-B*40、HLA-B*27、HLA-B*18、HLA-B*51、HLA-B*14、HLA-B*13、HLA-B*57、HLA-B*38、HLA-C*07、HLA-C*04、HLA-C*03、HLA-C*06、HLA-C*05、HLA-C*12、HLA-C*02、HLA-C*01、HLA-C*08或HLA-C*16单倍型中的一种或多种的限制的T细胞激活。在一些实施例中，如与由不进一步包括介导信号2或信号3的药剂的有核细胞激活的抗原特异性CD8+T细胞相比，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)和介导信号3的一种或多种药剂(如信号3介体)的有核细胞可以诱导抗原特异性CD8+T细胞激活，其中所述CD8+T细胞的所述一种或多种多功能标志物大约增加以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。在一些实施例中，所述一种或多种多功能标志物包括：颗粒酶B、IFN-α、IL-2、PD-1和/或IFN-γ。在一些实施例中，如与由不进一步包括介导信号2或信号3的药剂的有核细胞激活的抗原特异性CD8+T细胞相比，包括所述蛋白质或其片段并且进一步包括介导信号2的一种或多种药剂(如信号2介体)和介导信号3的一种或多种药剂(如信号3介体)的有核细胞可以诱导抗原特异性CD8+T细胞激活，其中所述CD8+T细胞的增殖和/或存活大约增加以下中的任一者：10％、25％、50％、75％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、200倍或500倍或更多倍。
佐剂
如本文所使用的，术语“佐剂”可以指直接或间接调节和/或产生免疫应答的物质。在本发明的一些实施例中，佐剂用于调节有核细胞群体，如PBMC群体(即，在施用于个体之前将细胞与佐剂一起温育)。在一些情况下，如与蛋白质或其片段单独施用相比，所述佐剂与蛋白质或其片段联合施用以增强对所述蛋白质或其片段的免疫应答。因此，佐剂可以用于加强对蛋白质或其片段的免疫细胞应答(例如T细胞应答)的引发。示例性佐剂包含但不限于干扰素基因刺激因子(STING)激动剂、维甲酸诱导基因I(RIG-I)激动剂和TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9的激动剂。示例性佐剂包含但不限于CpG ODN、干扰素-α(IFN-α)、聚肌:聚胞苷酸(polyI:C)、咪喹莫特(R837)、瑞喹莫德(R848)或脂多糖(LPS)。在一些实施例中，所述佐剂是CpG ODN、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、R837、R848、TLR3激动剂、TLR4激动剂或TLR9激动剂。在特定实施例中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施例中，所述佐剂是CpG ODN。在一些实施例中，所述CpG ODN是A类CpG ODN、B类CpG ODN或C类CpG ODN。在一些实施例中，所述CpG ODN佐剂包括选自CpG ODN 1018、CpG ODN 1585、CpG ODN 2216、CpG ODN 2336、CpGODN 1668、CpG ODN 1826、CPG ODN 2006、CpG ODN 2007、CpG ODN BW006、CpG ODN D-SL01、CpG ODN 2395、CpG ODN M362、CpG ODN D-SL03的组。在一些实施例中，所述CpG ODN佐剂是CpG ODN 1826(TCCATGACGTTCCTGACGTT(SEQ ID NO:30))或CpG ODN 2006(也被称为CpG7909)(TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:31))寡核苷酸。在一些实施例中，所述佐剂是CpG 7909。在一些实施例中，所述RIG-I激动剂包括聚肌:聚胞苷酸(polyI:C)。多种佐剂也可以与所述抗原联合使用以增强免疫应答的引发。在一些实施例中，所述修饰的PBMC包括多于一种佐剂。多种佐剂也可以与所述抗原联合使用以增强免疫应答的引发。在一些实施例中，所述修饰的PBMC包括多于一种佐剂。在一些实施例中，所述修饰的PBMC包括所述佐剂CpG ODN、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂的任何组合。
用于产生包括蛋白质或其片段的有核细胞的组合物的收缩部
在一些实施例中，本发明提供了包括用于刺激免疫应答的蛋白质或其片段的有核细胞的组合物。在一些实施例中，所述有核细胞是免疫细胞；例如，多个PBMC或T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的一种或多种。在一些实施例中，所述蛋白质或其片段被细胞内递送至所述有核细胞。
在一些实施例中，所述蛋白质或其片段通过使所述细胞通过收缩部而被引入到所述有核细胞中，使得瞬时孔被引入所述细胞膜，由此允许所述蛋白质或其片段进入所述细胞。WO 2013/059343、WO 2015/023982、WO 2016/070136、WO 2017041050、WO 2017008063、WO 2017/192785、WO 2017/192786、WO 2019/178005、WO 2019/178006、WO 2020/072833、PCT/US2020/15098和PCT/US2020/020194提供了基于收缩将化合物递送到细胞中的实例。
在一些实施例中，通过使包括所述有核细胞(例如，PBMC)的细胞悬浮液通过收缩部，将所述蛋白质或其片段递送到所述有核细胞中以产生本发明的有核细胞，其中所述收缩部使所述细胞变形，由此使得所述细胞扰动，使得蛋白质或其片段进入所述细胞。在一些实施例中，所述收缩部包含在微流体通道内。在一些实施例中，可以在微流体通道内并联和/或串联放置多个收缩部。
在一些实施例中，所述微流体通道内的所述收缩部包含入口部分、中心点和出口部分。在一些实施例中，所述微流体通道内的所述收缩部的长度、深度和宽度可以变化。在一些实施例中，所述微流体通道内的所述收缩部的宽度是所述有核细胞的直径的函数。确定有核细胞的直径的方法是本领域已知的；例如，高含量成像、细胞计数器或流式细胞术。
在基于收缩将蛋白质或其片段递送到有核细胞的一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3μm至约15μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3μm至约10μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3μm至约6μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约4.2μm至约6μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约4.2μm至约4.8μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3μm至约5μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3μm至约3.5μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3.5μm至约4μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约4μm至约4.5μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3.2μm至约3.8μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约3.8μm至约4.3μm。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约或小于2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm、5μm、5.5μm、6μm、6.5μm、7μm、7.5μm、8μm、8.5μm、9μm、9.5μm、10μm、10.5μm、11μm、11.5μm、12μm、12.5μm、13μm、13.5μm、14μm、14.5μm或15μm中的任一个。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约或小于3.0μm、3.1μm、3.2μm、3.3μm、3.4μm、3.5μm、3.6μm、3.7μm、3.8μm、3.9μm、4.0μm、4.1μm、4.2μm、4.3μm、4.4μm、4.5μm、4.6μm、4.7μm、4.8μm、4.9μm或5.0μm中的任一个。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为约4.5μm。
在本发明的一些实施例中，所述组合物包括有核细胞群体内的多个有核细胞(例如，多个PBMC)。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为在有核细胞群体中具有最小直径的有核细胞亚群体的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为在有核细胞群中具有最小直径的有核细胞亚群体的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约50％至约99％、约50％至约90％、约50％至约80％、约50％至约70％、约60％至约90％、约60％至约80％或约60％至约70％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为在有核细胞群中具有最小直径的有核细胞亚群体的平均直径的约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％或约90％至约99％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为在有核细胞群中具有最小直径的有核细胞亚群体的平均直径的约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％中的任一个。在一些实施例中，在多个输入PBMC中具有最小平均直径的有核细胞亚群体是淋巴细胞群体，其中所述淋巴细胞群体的直径为约6μm至约10μm。在一些实施例中，所述淋巴细胞群体的平均直径为约7μm。在一些实施例中，所述淋巴细胞群体是T细胞群体。在一些实施例中，所述淋巴细胞是T细胞。在一些实施例中，在多个输入PBMC中具有最小平均直径的有核细胞亚群体是T细胞。
在本发明的一些实施例中，所述组合物包括有核细胞群体内的多个有核细胞(例如，多个PBMC)。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为在有核细胞群体中具有最大直径的有核细胞亚群体的平均直径的约10％至约99％。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为在有核细胞群中具有最大直径的有核细胞亚群体的平均直径的约10％至约90％、约10％至约80％、约10％至约70％、约20％至约60％、约40％至约60％、约30％至约45％、约15％至约30％、约15％至约20％、约20％至约25％、约25％至约30％、约20％至约30％、约30％至约70％或约30％至约60％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为在有核细胞群中具有最大直径的有核细胞亚群体的平均直径的约5％至约10％、约10％至约20％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％或约90％至约99％中的任一个。在一些实施例中，所述收缩部的宽度为在有核细胞群中具有最大直径的有核细胞亚群体的平均直径的约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％中的任一个。在一些实施例中，在多个输入PBMC中具有最大平均直径的有核细胞亚群体是单核细胞群体，其中所述单核细胞群体的直径为约15μm至约25μm。在一些实施例中，所述单核细胞群体的平均直径为约18μm。在一些实施例中，在多个输入PBMC中具有最大平均直径的有核细胞亚群体是单核细胞。
许多参数可以影响通过本文所描述的方法将化合物递送至用于刺激免疫应答的有核细胞。在一些实施例中，所述细胞悬浮液在通过所述收缩部之前、同时或之后与所述化合物接触。所述有核细胞可以通过悬浮于包含要递送的所述化合物的溶液中的所述收缩部，尽管在所述有核细胞通过所述收缩部之后可以将所述化合物添加到所述细胞悬浮液中。在一些实施例中，待递送化合物涂覆在收缩部上。
可能影响将所述化合物递送到所述有核细胞中的参数的实例包含但不限于收缩部的尺寸、收缩部的进入角度、收缩部的表面性质(例如，粗糙度、化学修饰、亲水性、疏水性等)、操作流速(例如，细胞通过所述收缩部的时间)、细胞浓度、细胞悬浮液中的化合物的浓度、细胞悬浮液中的缓冲液以及有核细胞在通过收缩部之后恢复或温育的时间量可以影响递送的化合物进入有核细胞的通道。影响将所述化合物递送到所述有核细胞中的另外的参数可以包含有核细胞在收缩部中的速度、收缩部中的剪切速率、细胞悬浮液的粘度、垂直于流速的速度分量以及收缩部中的时间。另外，包括串联和/或并联通道的多个芯片可能影响对有核细胞的递送。并联的多个芯片可能有助于增强吞吐量。这些参数可以设计成控制化合物的递送。在一些实施例中，细胞浓度的范围为约10至至少约1012个细胞/mL或其间的任何浓度或浓度范围。在一些实施例中，递送化合物浓度的范围可以为约10ng/mL至约1g/mL或其间的任何浓度或浓度范围。在一些实施例中，递送化合物浓度的范围可以为约1pM至至少约2M或其间的任何浓度或浓度范围。
在一些实施例中，与所述有核细胞一起温育的蛋白质或其片段的浓度为约0.01μM至约10mM。例如，在一些实施例中，与所述有核细胞一起温育的蛋白质或其片段的浓度为小于约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM中的任一种。在一些实施例中，与所述有核细胞一起温育的蛋白质或其片段的浓度大于约10mM。在一些实施例中，与所述有核细胞一起温育的蛋白质或其片段的浓度为约0.01μM至约0.1μM、约0.1μM至约1μM、约1μM至约10μM、约10μM至约100μM、约100μM至约1mM或1mM至约10mM中的任一种。在一些实施例中，与所述有核细胞一起温育的蛋白质或其片段的浓度为约0.1μM至约1mM。在一些实施例中，与所述有核细胞一起温育的蛋白质或其片段的浓度为约0.1μM至约10μM。在一些实施例中，与所述有核细胞一起温育的蛋白质或其片段的浓度为1μM。
在一些实施例中，所述有核细胞包括浓度为约1nM至约1mM的所述编码所述蛋白质或其片段的核酸。在一些实施例中，所述有核细胞包括浓度为小于约0.1nM、约1nM、约0.01μM、约0.1μM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM或约10mM中的任一种的所述编码所述蛋白质或其片段的核酸。在一些实施例中，所述有核细胞包括浓度大于约10mM的所述编码所述蛋白质或其片段的核酸。在一些实施例中，所述有核细胞包括浓度为约0.1nM至约1nM、约1nM至约10nM、约10nM至约100nM、约0.1μM至约1μM、约1μM至约10μM、约10μM至约100μM、约100μM至约1mM或1mM至约10mM中的任一种的所述编码所述蛋白质或其片段的核酸。在一些实施例中，所述有核细胞包括浓度为约10nM至约100nM的所述编码所述蛋白质或其片段的核酸。在一些实施例中，所述有核细胞包括浓度为约1nM至约10nM的所述编码所述蛋白质或其片段的核酸。在一些实施例中，所述有核细胞包括浓度为约50nM的所述蛋白质或其片段。在一些实施例中，所述核酸是mRNA。
有核细胞的调节
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中；调节包括蛋白质或其片段的所述有核细胞(例如，PBMC)。在另外的实施例中，所述有核细胞是成熟的。在一些实施例中，在收缩介导的递送之后调节所述有核细胞。在一些实施例中，将包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞与佐剂一起温育足够长的时间，以使包括所述收缩递送的蛋白质或其片段的所述细胞进行调节，由此产生包括所述蛋白质或其片段的经调节的细胞的组合物。在一些实施例中，在收缩介导的递送之后调节所述有核细胞。在一些实施例中，将包括所述收缩递送的蛋白质或其片段的所述有核细胞与佐剂一起温育足够长的时间，以使包括所述收缩递送的蛋白质或其片段的所述有核细胞进行调节，由此产生包括所述蛋白质或其片段的经调节的有核细胞的组合物。在一些方面，本文提供了一种包括蛋白质或其片段的经调节的有核细胞的组合物，所述组合物通过包括以下步骤的过程制备：a)使细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的宽度是所述悬浮液中的所述有核细胞的函数，由此使所述有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成扰动的有核细胞；b)将所述扰动的有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育足够长的时间，以允许所述蛋白质或其片段进入所述扰动的有核细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段的修饰的有核细胞；以及c)将包括所述收缩递送的蛋白质或其片段的所述经修饰的有核细胞与佐剂一起温育足够长的时间，以使包括所述收缩递送的蛋白质或其片段的所述经修饰的有核细胞进行调节，由此产生包括所述蛋白质或其片段的经调节的有核细胞的所述组合物。在一些方面，本文提供了一种包括蛋白质或其片段的经调节的有核细胞的组合物，所述组合物通过包括以下步骤的过程制备：a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞，由此产生包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的有核细胞；以及c)将包括收缩递送的mRNA的所述经修饰的有核细胞与佐剂一起温育足够长的时间，以使包括其所述收缩递送的mRNA的所述经修饰的有核细胞进行调节，其中所述mRNA被表达以产生所述蛋白质或其片段；由此产生包括所述蛋白质或其片段的经调节的有核细胞的所述组合物。在一些实施例中，所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些实施例中，所述过程进一步包括在与所述佐剂一起温育以调节所述经修饰的有核细胞之前，从所述细胞悬浮液中分离包括所述蛋白质或其片段的所述经修饰的有核细胞。
在一些实施例中，在收缩介导的递送之前调节所述有核细胞(例如，PBMC)。在一些实施例中，将所述有核细胞与佐剂一起温育足够长的时间以使所述有核细胞进行调节，由此调节有核细胞。在一些实施例中，本文提供了一种包括蛋白质或其片段的经调节的有核细胞的组合物，所述组合物通过包括以下步骤的过程制备：a)将有核细胞与佐剂一起温育足够长的时间以使所述有核细胞进行调节，由此产生经调节的有核细胞；b)使包括所述经调节的有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的宽度是所述悬浮液中的所述有核细胞的直径的函数，由此使所述有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成经调节的扰动的有核细胞；以及c)将所述经调节的扰动的有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育足够长的时间，以允许所述蛋白质或其片段进入所述经调节的扰动的有核细胞，由此产生包括所述蛋白质或其片段的所述经调节的有核细胞。在一些方面，本文提供了一种包括蛋白质或其片段的经调节的有核细胞的组合物，所述组合物通过包括以下步骤的过程制备：a)将有核细胞与佐剂一起温育足够长的时间以使所述有核细胞进行调节，由此产生经调节的有核细胞；b)使包括所述经调节的有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的宽度是所述悬浮液中的所述有核细胞的直径的函数，由此使得所述有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成经调节的扰动的有核细胞；以及c)将所述经调节的扰动的有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育足够长的时间，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述经调节的扰动的有核细胞，其中所述mRNA被表达以产生所述蛋白质或其片段，由此产生包括所述蛋白质或其片段的所述经调节的有核细胞。在一些实施例中，所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。在一些实施例中，所述过程进一步包括在使所述经调节的有核细胞通过细胞变形收缩部之前，将所述经调节的有核细胞与所述佐剂分离。
在根据本文所描述的方法中的任何一种方法的一些实施例中，将包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞(例如，PBMC)与所述佐剂一起温育约1至约24小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约2至约10小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约3至约6小时以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时、2小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20小时或24小时中的任一个以使所述有核细胞进行调节。在一些实施例中，将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约4小时以使所述有核细胞进行调节。
在一些实施例中，本文提供了包括蛋白质或其片段的经调节的多个PBMC，其通过将包括所述蛋白质或其片段的所述多个PBMC与佐剂温育足够长的时间以使所述PBMC进行调节来制备，由此产生包括所述蛋白质或其片段的所述经调节的多个PBMC。在一些实施例中，本文提供了包括蛋白质或其片段的经调节的多个PBMC，其通过在将所述蛋白质或其片段引入所述PBMC之前将所述多个PBMC与佐剂温育足够长的时间以使所述PBMC进行调节来制备，由此产生包括所述蛋白质或其片段的所述经调节的多个PBMC。
在根据本文所描述的所述经调节的多个PBMC中的任一个的一些实施例中，将所述多个PBMC与所述佐剂一起温育约1至约24小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述多个PBMC与所述佐剂一起温育约2至约10小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述多个PBMC与所述佐剂一起温育约3至约6小时以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述多个PBMC与所述佐剂一起温育约1小时、2小时、3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时、5.5小时、6小时、8小时、12小时、16小时、20小时或24小时中的任一个以使所述PBMC进行调节。在一些实施例中，将所述多个PBMC与所述佐剂一起温育约4小时以使所述PBMC进行调节。
在根据本文所描述的经调节的多个PBMC中的任一个的一些实施例中，与未经调节的多个经修饰的PBMC相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个经修饰的PBMC中上调。在一些实施例中，与未经调节的多个经修饰的PBMC中的细胞亚群体相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个经修饰的PBMC中的细胞亚群体中上调。在一些实施例中，与未经调节的多个经修饰的PBMC中的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个经修饰的PBMC的所述B细胞中上调。在一些实施例中，所述共刺激分子是CD80和/或CD86。在一些实施例中，所述共刺激分子是CD86。在一些实施例中，所述经调节的多个经修饰的PBMC中的所述B细胞中的CD80和/或CD86比未经调节的多个经修饰的PBMC中的所述B细胞中的CD80和/或CD86上调超过约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超过10倍。在一些实施例中，所述经调节的多个经修饰的PBMC中的所述B细胞中的CD80和/或CD86比未经调节的多个经修饰的PBMC中的所述B细胞中的CD80和/或CD86上调约1.2倍至约1.5倍、约1.5倍至约1.8倍、约1.8倍至约2倍、约2倍至约3倍、约3倍至约4倍、约4倍至约5倍、约5倍至约8倍、约8倍至约10倍、约10倍至约20倍、约20倍至约50倍、约50倍至约100倍、约100倍至约200倍、约200倍至约500倍或大于约500倍中的任一者。在一些实施例中，与未经调节的多个PBMC相比，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达在所述经调节的多个经修饰的PBMC中增加。在一些实施例中，与未经调节的多个经修饰的PBMC中的细胞亚群体相比，IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达在所述经调节的多个经修饰的PBMC中的细胞亚群中增加。在一些实施例中，所述经调节的多个经修饰的PBMC中的IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达比未经调节的多个经修饰的PBMC中的IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达增加约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超过10倍。在一些实施例中，所述经调节的多个经修饰的PBMC中的IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达比未经调节的多个经修饰的PBMC中的IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达增加约1.2倍至约1.5倍、约1.5倍至约1.8倍、约1.8倍至约2倍、约2倍至约3倍、约3倍至约4倍、约4倍至约5倍、约5倍至约8倍、约8倍至约10倍、约10倍至约20倍、约20倍至约50倍、约50倍至约100倍、约100倍至约200倍、约200倍至约500倍或大于约500倍中的任一者。
系统和试剂盒
在一些方面，本发明提供了一种系统，所述系统包括用于本文所公开的方法的收缩部、免疫细胞悬浮液、蛋白质或其片段或佐剂中的一种或多种。所述系统可以包含针对上文所公开的方法描述的任何实施例，包含微流体通道或具有孔的表面，以提供细胞变形收缩部、细胞悬浮液、细胞扰动、递送参数、化合物和/或应用等。在一些实施例中，细胞变形收缩部的大小适于递送至免疫细胞。在一些实施例中，优化递送参数，如操作流速、细胞和化合物浓度、收缩部中的细胞的速度和细胞悬浮液的组成(例如，渗透压、盐浓度、血清含量、细胞浓度、pH等)用于压制免疫应答或诱导耐受性的化合物的最大应答。
还提供了用于治疗患有癌症或感染的个体的试剂盒或制品。在一些实施例中，所述试剂盒包括经修饰的免疫细胞，所述经修饰的免疫细胞包括细胞内蛋白质或其片段和细胞内佐剂。在一些实施例中，所述试剂盒包含收缩部、免疫细胞悬浮液、蛋白质或其片段或佐剂中的一种或多种，用于生成经修饰的免疫细胞，所述经修饰的免疫细胞用于治疗患有癌症或感染的个体。在一些实施例中，所述试剂盒包括在合适包装中的本文所描述的组合物(例如含有孔、细胞悬浮液和/或化合物的微流体通道或表面)。合适包装材料在本领域中是已知的，并且包含例如小瓶(如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、软包装(例如，密封的聚酯薄膜或塑料袋)等。可以进一步灭菌和/或密封这些制品。
本发明还提供了包含本文所描述的方法的组合物的试剂盒并且可以进一步包括用于实施治疗有需要的个体的所述方法的说明书和/或用于将蛋白质或其片段和佐剂引入到免疫细胞中的说明书。本文所描述的试剂盒可以进一步包含其它材料，包含其它缓冲液、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有本文所描述的任何方法的执行说明的包装插页；例如，用于治疗有需要的个体的说明书或用于修饰免疫细胞以含有细胞内蛋白质或其片段和细胞内佐剂的说明书。
示例性实施例
实施例1.一种用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
实施例2.一种用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
实施例3.根据实施例1或2所述的方法，其中所述蛋白质或其片段进一步包括一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序，从而产生所述蛋白质与所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序的融合蛋白。
实施例4.一种用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
实施例5.一种用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
实施例6.根据实施例4或5所述的方法，其中所述mRNA的核苷酸序列被密码子优化以在所述有核细胞中表达。
实施例7.根据实施例4至6中任一项所述的方法，其中所述mRNA包括一个或多个编码免疫蛋白酶体靶向基序的核酸序列，其中所述mRNA的翻译产生所述蛋白质与所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序的融合蛋白。
实施例8.根据实施例3或6所述的方法，其中与在不存在免疫蛋白酶体靶向基序的情况下所述细胞中的所述蛋白质的降解和/或源自所述蛋白质的肽在所述细胞的表面上的呈递相比，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序增强所述细胞中的所述蛋白质的降解和/或源自所述蛋白质的肽在所述细胞的表面上的呈递。
实施例9.根据实施例8所述的方法，其中所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序位于所述融合蛋白的N末端和/或C末端。
实施例10.根据实施例7至9所述的方法，其中所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序是破坏盒(D-盒)结构域、KEKE结构域和/或sec/MITD结构域。
实施例11.根据实施例4至10中任一项所述的方法，其中所述mRNA的一个或多个残基被修饰。
实施例12.根据实施例11所述的方法，其中所述mRNA的一个或多个残基是硫代磷酸酯残基、假尿苷残基、N1-甲基腺苷残基、5-甲基胞苷残基或吗啉代残基。
实施例13.一种用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括源自蛋白质的两种或更多种抗原；其中所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
实施例14.一种用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括源自蛋白质的两种或更多种抗原；其中所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
实施例15.根据实施例13或14所述的方法，其中所述细胞包括源自所述蛋白质的三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或多于十种抗原。
实施例16.根据实施例13至15中任一项所述的方法，其中所述抗原中的至少两种抗原包括部分重叠的氨基酸序列。
实施例17.根据实施例16所述的方法，其中所有抗原的组合氨基酸序列与所述蛋白质的氨基酸序列重叠约90％或更多。
实施例18.根据实施例13至17中任一项所述的方法，其中所述抗原是多肽，所述多肽包括所述蛋白质的两个或更多个表位。
实施例19.根据实施例13至18中任一项所述的方法，其中所述抗原是多肽，所述多肽包括所述蛋白质的一个或多个表位和一个或多个异源肽序列。
实施例20.根据实施例13至19中任一项所述的方法，其中一个或多个表位在N末端和/或C末端上侧接有一个或多个异源肽序列。
实施例21.根据实施例20所述的方法，其中N末端和/或C末端侧接多肽源自免疫原性合成长肽(SLP)。
实施例22.根据实施例21所述的方法，其中所述N末端和/或C末端侧接多肽源自疾病相关免疫原性SLP。
实施例23.根据实施例1至22中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、癌基因、新抗原、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白的产物。
实施例24.根据实施例1、3、4、6至13、15至23中任一项所述的方法，其中所述刺激个体的免疫应答用于治疗癌症、传染性疾病或病毒相关疾病。
实施例25.根据实施例24所述的方法，其中所述病毒相关疾病是与人乳头瘤病毒(HPV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、单纯疱疹病毒(HSV-2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、人疱疹病毒6(HHV-6)、人疱疹病毒7(HHV-7)、人疱疹病毒8(HHV-8)、巨细胞病毒(CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)或流感相关的疾病。
实施例26.根据实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。
实施例27.根据实施例26所述的方法，其中所述HPV是HPV-16或HPV-18。
实施例28.根据实施例26或27所述的方法，其中所述蛋白质是HPV E6或HPV E7蛋白。
实施例29.根据实施例1至24中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。
实施例30.根据实施例29所述的方法，其中所述HBV蛋白是核心蛋白、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
实施例31.根据实施例1至30中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括佐剂。
实施例32.根据实施例1至31中任一项所述的方法，其中所述组合物与佐剂结合施用。
实施例33.根据实施例31或32所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR 9激动剂。
实施例34.根据实施例1至3和23至33中任一项所述的方法，其中包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞通过以下制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段的有核细胞。
实施例35.根据实施例4至11中任一项所述的方法，其中包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的所述有核细胞通过以下制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的有核细胞。
实施例36.根据实施例12至33中任一项所述的方法，其中包括两种或更多种抗原的所述有核细胞通过以下制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述两种或更多种抗原通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育，以允许所述两种或更多种抗原进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括两种或更多种抗原的有核细胞。
实施例37.根据实施例34至36中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育。
实施例38.根据实施例34至36中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育。
实施例39.根据实施例34至38中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。
实施例40.根据实施例34至39中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约3.0μm至约4.2μm、或约3.0μm至约4.8μm、或约3.0μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。
实施例41.根据实施例34至40中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm。
实施例42.根据实施例34至41中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约4.5μm或约4.0μm。
实施例43.根据实施例34至42中任一项所述的方法，其中包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
实施例44.根据实施例1至43中任一项所述的方法，其中所述有核细胞对于所述个体是自体的或同种异体的。
实施例45.根据实施例1至44中任一项所述的方法，其中所述有核细胞是免疫细胞。
实施例46.根据实施例1至45中任一项所述的方法，其中所述有核细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。
实施例47.根据实施例46所述的方法，其中所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。
实施例48.根据实施例1至47中任一项所述的方法，其中所述有核细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。
实施例49.根据实施例1至48中任一项所述的方法，其中用佐剂调节所述有核细胞以形成经调节的细胞。
实施例50.根据实施例49所述的方法，其中将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时至约24小时、约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以对所述细胞进行调节。
实施例51.根据实施例49或50所述的方法，其中在将所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA引入到所述有核细胞中之前或之后调节所述有核细胞。
实施例52.根据实施例49至51中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR 9激动剂。
实施例53.根据实施例48至51中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。
实施例54.根据实施例49至53中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG 7909。
实施例55.根据实施例49至54中任一项所述的方法，其中所述经调节的细胞是经调节的多个PBMC。
实施例56.根据实施例55所述的方法，其中所述多个PBMC被修饰以增加共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的表达。
实施例57.根据实施例56所述的方法，其中所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。
实施例58.根据实施例56所述的方法，其中所述共刺激分子是CD86。
实施例59.根据实施例55至58中任一项所述的方法，其中所述多个PBMC被修饰以增加一种或多种细胞因子的表达。
实施例60.根据实施例55至59中任一项所述的方法，其中所述多个PBMC被修饰以包括嵌合膜结合细胞因子。
实施例61.根据实施例60所述的方法，其中所述嵌合膜结合细胞因子是包括所述细胞因子和跨膜结构域的融合蛋白。
实施例62.根据实施例61所述的方法，其中所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。
实施例63.根据实施例62所述的方法，其中所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。
实施例64.根据实施例59至63中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是I型细胞因子。
实施例65.根据实施例59至64中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β或IL-21或其功能变体。
实施例66.根据实施例65所述的方法，其中所述细胞因子是IL-2或其功能变体和/或IL-12或其功能变体。
实施例67.根据实施例60至65中任一项所述的方法，其中所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列。
实施例68.根据实施例56至67中任一项所述的方法，其中所述多个PBMC被修饰以增加一种或多种细胞因子和/或一种或多种共刺激分子的表达。
实施例69.根据实施例68所述的方法，其中所述多个PBMC包括一种或多种细胞因子和/或共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的增加的表达，其中所述多个PBMC通过包括以下的方法制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中所述mRNA被表达，由此产生包括所述蛋白质或其片段、所述一种或多种细胞因子和/或所述一种或多种共刺激分子的有核细胞。
实施例70.根据实施例68所述的方法，其中所述多个PBMC包括一种或多种细胞因子和/或共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的增加的表达，其中所述多个PBMC通过包括以下的方法制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中所述mRNA被表达，由此产生包括所述蛋白质或其片段、所述一种或多种细胞因子和/或所述一种或多种共刺激分子的有核细胞。
实施例71.根据实施例68所述的方法，其中所述多个PBMC包括一种或多种细胞因子和/或共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的增加的表达，其中所述多个PBMC通过包括以下的方法制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述两种或更多种抗原以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述两种或更多种抗原以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA一起温育，以允许所述两种或更多种抗原以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中所述mRNA被表达，由此产生包括两种或更多种抗原、所述一种或多种细胞因子和/或所述一种或多种共刺激分子的有核细胞。
实施例72.根据实施例69至71中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述两种或更多种抗原、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育。
实施例73.根据实施例69至71中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述两种或更多种抗原、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育。
实施例74.根据实施例55至73中任一项所述的方法，其中与多个未经调节的PBMC中的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个PBMC的所述B细胞中上调，其中所述共刺激分子是CD80和/或CD86。
实施例75.根据实施例55至74中任一项所述的方法，其中与多个未经调节的PBMC相比，所述多个PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的增加的表达。
实施例76.根据实施例75所述的方法，其中IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达比所述多个未经调节的PBMC的表达增加超过约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超过10倍。
实施例77.根据实施例1至76中任一项所述的方法，其中包括有核细胞的所述组合物被施用多次。
实施例78.根据实施例1至77中任一项所述的方法，其中所述组合物被静脉内施用。
实施例79.根据实施例1至78中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
实施例80.根据实施例1至79中任一项所述的方法，其中在施用另一种疗法之前、同时或之后施用所述组合物。
实施例81.根据实施例80所述的方法，其中另一种疗法是用于免疫肿瘤疗法的化学疗法、放射疗法、抗体、细胞因子、免疫检查点抑制剂或双特异性多肽。
实施例82.一种组合物，其包括有核细胞，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
实施例83.根据实施例82所述的组合物，其中所述蛋白质或其片段进一步包括一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序，从而产生所述蛋白质与所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序的融合蛋白。
实施例84.一种组合物，其包括有核细胞，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
实施例85.根据实施例84所述的组合物，其中所述mRNA的核苷酸序列被密码子优化以在所述有核细胞中表达。
实施例86.根据实施例84或85所述的组合物，其中所述mRNA包括一个或多个编码免疫蛋白酶体靶向基序的核酸序列，其中所述mRNA的翻译产生所述蛋白质与所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序的融合蛋白。
实施例87.根据实施例83或86所述的组合物，其中与在不存在免疫蛋白酶体靶向基序的情况下所述细胞中的所述蛋白质的降解和/或源自所述蛋白质的肽在所述细胞的表面上的呈递相比，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序增强所述细胞中的所述蛋白质的降解和/或源自所述蛋白质的肽在所述细胞的表面上的呈递。
实施例88.根据实施例87所述的组合物，其中所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序位于所述融合蛋白的N末端和/或C末端。
实施例89.根据实施例86至88所述的组合物，其中所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序是破坏盒(D-盒)结构域、KEKE结构域和/或sec/MITD结构域。
实施例90.根据实施例84至89中任一项所述的组合物，其中所述mRNA的一个或多个残基被修饰。
实施例91.根据实施例90所述的组合物，其中所述mRNA的一个或多个残基是硫代磷酸酯残基、假尿苷残基、N1-甲基腺苷残基、5-甲基胞苷残基或吗啉代残基。
实施例92.一种组合物，其包括有核细胞，其中所述有核细胞包括源自蛋白质的两种或更多种抗原；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
实施例93.根据实施例92所述的组合物，其中所述细胞包括源自所述蛋白质的三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或多于十种抗原。
实施例94.根据实施例92或93所述的组合物，其中所述抗原中的至少两种抗原包括部分重叠的氨基酸序列。
实施例95.根据实施例94所述的组合物，其中所有抗原的组合氨基酸序列与所述蛋白质的氨基酸序列重叠约90％或更多。
实施例96.根据实施例92至95中任一项所述的组合物，其中抗原是多肽，所述多肽包括所述蛋白质的两个或更多个表位。
实施例97.根据实施例92至96中任一项所述的组合物，其中抗原是多肽，所述多肽包括所述蛋白质的一个或多个表位和一个或多个异源肽序列。
实施例98.根据实施例92至97中任一项所述的组合物，其中一个或多个表位在N末端和/或C末端上侧接有一个或多个异源肽序列。
实施例99.根据实施例98所述的组合物，其中N末端和/或C末端侧接多肽源自免疫原性合成长肽(SLP)。
实施例100.根据实施例99所述的组合物，其中所述N末端和/或C末端侧接多肽源自疾病相关免疫原性SLP。
实施例101.根据实施例82至100中任一项所述的组合物，其中所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、癌基因、新抗原、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白的产物。
实施例102.根据实施例82至101中任一项所述的组合物，其中所述刺激个体的免疫应答用于治疗癌症、传染性疾病或病毒相关疾病。
实施例103.根据实施例102所述的组合物，其中所述病毒相关疾病是与人乳头瘤病毒(HPV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、单纯疱疹病毒(HSV-2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、人疱疹病毒6(HHV-6)、人疱疹病毒7(HHV-7)、人疱疹病毒8(HHV-8)、巨细胞病毒(CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)或流感相关的疾病。
实施例104.根据实施例82至103中任一项所述的组合物，其中蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。
实施例105.根据实施例104所述的组合物，其中所述HPV是HPV-16或HPV-18。
实施例106.根据实施例104或105所述的组合物，其中所述蛋白质是HPV E6或HPVE7蛋白。
实施例107.根据实施例82至103中任一项所述的组合物，其中所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。
实施例108.根据实施例107所述的组合物，其中所述HBV蛋白是核心蛋白、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
实施例109.根据实施例82至108中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括佐剂。
实施例110.根据实施例109所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR 9激动剂。
实施例111.根据实施例82和101至110中任一项所述的组合物，其中包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞通过以下制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段的有核细胞。
实施例112.根据实施例84至91和101至110中任一项所述的组合物，其中包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的所述有核细胞通过以下制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的有核细胞。
实施例113.根据实施例92至110中任一项所述的组合物，其中包括两种或更多种抗原的所述有核细胞通过以下制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述两种或更多种抗原通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育，以允许所述两种或更多种抗原进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括两种或更多种抗原的有核细胞。
实施例114.根据实施例111至113中任一项所述的组合物，其中制备所述有核细胞的方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育。
实施例115.根据实施例111至113中任一项所述的方法，其中制备所述有核细胞的方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育。
实施例116.根据实施例111至115中任一项所述的组合物，其中所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。
实施例117.根据实施例111至116中任一项所述的组合物，其中所述收缩部的宽度为约3.0μm至约4.2μm、或约3.0μm至约4.8μm、或约3.0μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。
实施例118.根据实施例111至117中任一项所述的组合物，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm。
实施例119.根据实施例111至118中任一项所述的组合物，其中所述收缩部的宽度为约4.5μm或约4.0μm。
实施例120.根据实施例111至119中任一项所述的组合物，其中包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
实施例121.根据实施例82至120中任一项所述的组合物，其中所述有核细胞对于所述个体是自体的或同种异体的。
实施例122.根据实施例82至121中任一项所述的组合物，其中所述有核细胞是免疫细胞。
实施例123.根据实施例82至122中任一项所述的组合物，其中所述有核细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。
实施例124.根据实施例123所述的组合物，其中所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。
实施例125.根据实施例82至124中任一项所述的组合物，其中所述有核细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。
实施例126.根据实施例82至125中任一项所述的组合物，其中用佐剂调节所述有核细胞以形成经调节的细胞。
实施例127.根据实施例126所述的组合物，其中将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时至约24小时、约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以对所述细胞进行调节。
实施例128.根据实施例126或127所述的组合物，其中在将所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA引入到所述有核细胞中之前或之后调节所述有核细胞。
实施例129.根据实施例126至128中任一项所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR 9激动剂。
实施例130.根据实施例126至129中任一项所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。
实施例131.根据实施例126至130中任一项所述的组合物，其中所述佐剂是CpG7909。
实施例132.根据实施例126至131中任一项所述的组合物，其中所述经调节的细胞是经调节的多个PBMC。
实施例133.根据实施例132所述的组合物，其中所述多个PBMC被修饰以增加共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的表达。
实施例134.根据实施例133所述的组合物，其中所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。
实施例135.根据实施例134所述的组合物，其中所述共刺激分子是CD86。
实施例136.根据实施例132至135中任一项所述的组合物，其中所述多个PBMC被修饰以增加一种或多种细胞因子的表达。
实施例137.根据实施例132至136中任一项所述的组合物，其中所述多个PBMC被修饰以包括嵌合膜结合细胞因子。
实施例138.根据实施例137所述的组合物，其中所述嵌合膜结合细胞因子是包括所述细胞因子和跨膜结构域的融合蛋白。
实施例139.根据实施例138所述的组合物，其中所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。
实施例140.根据实施例139所述的组合物，其中所述肽连接子是(G4S)3(SEQ IDNO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。
实施例141.根据实施例136至140中任一项所述的组合物，其中所述细胞因子是I型细胞因子。
实施例142.根据实施例136至141中任一项所述的组合物，其中所述细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β或IL-21或其功能变体。
实施例143.根据实施例142所述的方法，其中所述细胞因子是IL-2或其功能变体和/或IL-12或其功能变体。
实施例144.根据实施例137至143中任一项所述的组合物，其中所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列。
实施例145.根据实施例133至144中任一项所述的组合物，其中所述多个PBMC被修饰以增加一种或多种细胞因子和/或一种或多种共刺激分子的表达。
实施例146.根据实施例145所述的组合物，其中所述多个PBMC包括一种或多种细胞因子和/或共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的增加的表达，其中所述多个PBMC通过包括以下的方法制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中所述mRNA被表达，由此产生包括所述蛋白质或其片段、所述一种或多种细胞因子和/或所述一种或多种共刺激分子的有核细胞。
实施例147.根据实施例145所述的组合物，其中所述多个PBMC包括一种或多种细胞因子和/或共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的增加的表达，其中所述多个PBMC通过包括以下的方法制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中所述mRNA被表达，由此产生包括所述蛋白质或其片段、所述一种或多种细胞因子和/或所述一种或多种共刺激分子的有核细胞。
实施例148.根据实施例145所述的组合物，其中所述多个PBMC包括一种或多种细胞因子和/或共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的增加的表达，其中所述多个PBMC通过包括以下的方法制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述两种或更多种抗原以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述两种或更多种抗原以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA一起温育，以允许所述两种或更多种抗原以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中所述mRNA被表达，由此产生包括两种或更多种抗原、所述一种或多种细胞因子和/或所述一种或多种共刺激分子的有核细胞。
实施例149.根据实施例146至148中任一项所述的组合物，其中所述制备所述多个PBMC的方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述多个PBMC与所述蛋白质或其片段、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述多个PBMC与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述多个PBMC与所述两种或更多种抗原、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育。
实施例150.根据实施例146至148中任一项所述的组合物，其中所述制备所述多个PBMC的方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述多个PBMC与所述蛋白质或其片段、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述多个PBMC与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述多个PBMC与所述两种或更多种抗原、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育。
实施例151.根据实施例132至150中任一项所述的组合物，其中与多个未经调节的PBMC中的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个PBMC的所述B细胞中上调，其中所述共刺激分子是CD80和/或CD86。
实施例152.根据实施例132至151中任一项所述的组合物，其中与多个未经调节的PBMC相比，所述多个PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的增加的表达。
实施例153.根据实施例152所述的组合物，其中IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达比所述多个未经调节的PBMC的表达增加超过约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超过10倍。
实施例154.一种用于刺激个体的免疫应答的组合物，其中所述组合物包括有效量的根据实施例82至153中任一项所述的组合物；其中所述组合物以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
实施例155.一种用作药物的组合物，其中所述组合物包括有效量的根据实施例82至153中任一项所述的组合物。
实施例156.一种用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的组合物，其中所述组合物包括有效量的根据实施例82至153中任一项所述的组合物。
实施例157.根据实施例154至156中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括佐剂。
实施例158.根据实施例154至157中任一项所述的组合物，其中所述组合物与佐剂结合施用。
实施例159.根据实施例157或158所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。
实施例160.根据实施例157至159中任一项所述的组合物，其中包括有核细胞的所述组合物被施用多次。
实施例161.根据实施例157至160中任一项所述的组合物，其中所述组合物被静脉内施用。
实施例162.根据实施例157至161中任一项所述的组合物，其中所述个体是人。
实施例163.根据实施例157至162中任一项所述的组合物，其中在施用另一种疗法之前、同时或之后施用所述组合物。
实施例164.根据实施例163所述的组合物，其中另一种疗法是用于免疫肿瘤疗法的化学疗法、放射疗法、抗体、细胞因子、免疫检查点抑制剂或双特异性多肽。
实施例165.一种组合物在制备用于刺激个体的免疫应答的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的根据实施例82至153中任一项所述的组合物；其中所述组合物以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
实施例166.一种组合物在制备用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的根据实施例82至153中任一项所述的组合物。
实施例167.根据实施例165或166所述的用途，其中所述组合物进一步包括佐剂。
实施例168.根据实施例165至167中任一项所述的组合物，其中所述组合物被调配用于与佐剂结合施用。
实施例169.根据实施例167或168所述的用途，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。
实施例170.根据实施例167至169中任一项所述的用途，其中包括有核细胞的所述组合物被施用多次。
实施例171.根据实施例167至170中任一项所述的用途，其中所述组合物被静脉内施用。
实施例172.根据实施例167至171中任一项所述的用途，其中所述个体是人。
实施例173.根据实施例167至172中任一项所述的用途，其中在施用另一种疗法之前、同时或之后施用所述组合物。
实施例174.根据实施例173所述的用途，其中另一种疗法是用于免疫肿瘤疗法的化学疗法、放射疗法、抗体、细胞因子、免疫检查点抑制剂或双特异性多肽。
实施例175.一种试剂盒，其在根据实施例1至81中任一项所述的方法中使用。
实施例176.一种试剂盒，其包括根据实施例82至153中任一项所述的组合物。
实施例177.根据实施例175或176所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括以下中一种或多种：缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器或具有用于向个体施用所述组合物来以HLA未知的方式刺激免疫应答的说明的包装插页。
实施例178.一种用于产生有核细胞的方法，所述有核细胞包括蛋白质或其片段；所述方法包括将所述蛋白质或其片段引入到所述有核细胞中，其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
实施例179.一种用于产生有核细胞的方法，所述有核细胞包括蛋白质或其片段；所述方法包括将编码所述蛋白质或其片段的mRNA引入到所述有核细胞中，其中所述mRNA被表达以产生所述蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
实施例180.一种用于产生有核细胞的方法，所述有核细胞包括来自蛋白质的两种或更多种抗原；所述方法包括将所述两种或更多种抗原引入到所述有核细胞中；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
实施例181.根据实施例178所述的方法，其中将所述蛋白质或其片段细胞内引入到所述有核细胞包括：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段的有核细胞。
实施例182.根据实施例179所述的方法，其中包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的所述有核细胞通过以下制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的有核细胞。
实施例183.根据实施例180所述的方法，其中包括两种或更多种抗原的所述有核细胞通过以下制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述两种或更多种抗原通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育，以允许所述两种或更多种抗原进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括两种或更多种抗原的有核细胞。
实施例184.根据实施例181至183中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育。
实施例185.根据实施例181至183中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育。
实施例186.根据实施例181至185中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。
实施例187.根据实施例181至186中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm至约4.2μm、或约3.5μm至约4.8μm、或约3.5μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。
实施例188.根据实施例181至187中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm。
实施例189.根据实施例181至188中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约4.5μm。
实施例190.根据实施例181至189中任一项所述的方法，其中包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
实施例191.根据实施例178至190中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括用佐剂调节所述有核细胞以形成经调节的细胞。
实施例192.根据实施例191所述的方法，其中将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时至约24小时、约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以对所述细胞进行调节。
实施例193.根据实施例191或192所述的方法，其中在将所述蛋白质或其片段、编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA或来自蛋白质的所述两种或更多种抗原引入到所述有核细胞中之前或之后调节所述有核细胞。
实施例194.一种用于增强免疫细胞的活性的方法，所述方法包括在所述免疫细胞中表达编码嵌合膜结合细胞因子的核酸。
实施例195.根据实施例193所述的方法，其中所述嵌合膜结合细胞因子是包括跨膜结构域和细胞因子的融合蛋白。
实施例196.根据实施例194或195所述的方法，其中所述跨膜结构域是转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)或肿瘤坏死因子跨膜结构域。
实施例197.根据实施例194至196中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是I型细胞因子。
实施例198.根据实施例194至197中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β或IL-21或其功能变体。
实施例199.根据实施例194至198中任一项所述的方法，其中所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。
实施例200.根据实施例199所述的方法，其中所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。
实施例201.根据实施例194至200中任一项所述的方法，其中所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列。
实施例202.根据实施例194至201中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞进一步包括抗原。
实施例203.根据实施例194至201中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞进一步包括编码抗原的mRNA。
实施例204.根据实施例202或203所述的方法，其中所述抗原是蛋白质或其片段，其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
实施例205.根据实施例194至201中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞进一步包括源自蛋白质的两种或更多种抗原。
实施例206.根据实施例205所述的方法，其中所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
实施例207.根据实施例204至206中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、癌基因、新抗原、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白的产物。
实施例208.根据实施例204至207中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。
实施例209.根据实施例208所述的方法，其中所述HPV是HPV-16或HPV-18。
实施例210.根据实施例208或209所述的方法，其中所述蛋白质是HPV E6或HPV E7蛋白。
实施例211.根据实施例204至207中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。
实施例212.根据实施例211所述的方法，其中所述HBV蛋白是核心蛋白、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
实施例213.根据实施例194至212中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。
实施例214.根据实施例213所述的方法，其中所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。
实施例215.根据实施例194至214中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。
实施例216.根据实施例194至215中任一项所述的方法，其中用佐剂调节所述有核细胞以形成经调节的细胞。
实施例217.根据实施例216所述的方法，其中将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时至约24小时、约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以对所述细胞进行调节。
实施例218.根据实施例216或217所述的方法，其中在将所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA引入到所述有核细胞中之前或之后调节所述有核细胞。
实施例219.根据实施例216至218中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。
实施例220.根据实施例216至219中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。
实施例221.根据实施例194至220中任一项所述的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子的免疫细胞。
实施例222.根据实施例221所述的方法，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸是编码所述嵌合膜结合细胞因子的mRNA。
实施例223.根据实施例202、204和207至222中任一项所述的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子和抗原的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸和所述抗原进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。
实施例224.根据实施例203、204和207至222所述的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子和编码蛋白质或其片段的mRNA的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸和编码所述抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。
实施例225.根据实施例223或224所述的方法，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和/或编码所述抗原的所述核酸是mRNA。
实施例226.根据实施例202、204和207至222中任一项所述的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。
实施例227.根据实施例221至226中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育；
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育；或
(d)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育。
实施例228.根据实施例221至226中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育；
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育；或
(d)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育。
实施例229.根据实施例221至228中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。
实施例230.根据实施例221至229中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm至约4.2μm、或约3.5μm至约4.8μm、或约3.5μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。
实施例231.根据实施例221至230中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm。
实施例232.根据实施例221至231中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约4.5μm。
实施例233.根据实施例221至232中任一项所述的方法，其中包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
实施例234.一种用于增强免疫细胞的活性的组合物，所述组合物包括所述免疫细胞中的嵌合膜结合细胞因子。
实施例235.根据实施例234所述的组合物，其中所述嵌合膜结合细胞因子是包括跨膜结构域和细胞因子的融合蛋白。
实施例236.根据实施例234至235中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域是转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)或肿瘤坏死因子跨膜结构域。
实施例237.根据实施例234至236中任一项所述的组合物，其中所述细胞因子是I型细胞因子。
实施例238.根据实施例234至237中任一项所述的组合物，其中所述细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β或IL-21或其功能变体。
实施例239.根据实施例234至238中任一项所述的组合物，其中所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。
实施例240.根据实施例239所述的组合物，其中所述肽连接子是(G4S)3(SEQ IDNO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。
实施例241.根据实施例234至240中任一项所述的组合物，其中所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列。
实施例242.根据实施例234至241中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞进一步包括抗原。
实施例243.根据实施例234至242中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞进一步包括编码抗原的mRNA。
实施例244.根据实施例242或243所述的组合物，其中所述抗原是蛋白质或其片段，其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
实施例245.根据实施例233至241中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞进一步包括源自蛋白质的两种或更多种抗原。
实施例246.根据实施例245所述的组合物，其中所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
实施例247.根据实施例244至246中任一项所述的组合物，其中所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、癌基因、新抗原、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白的产物。
实施例248.根据实施例244至247中任一项所述的组合物，其中蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。
实施例249.根据实施例248所述的组合物，其中所述HPV是HPV-16或HPV-18。
实施例250.根据实施例248或249所述的组合物，其中所述蛋白质是HPV E6或HPVE7蛋白。
实施例251.根据实施例244至247中任一项所述的组合物，其中所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。
实施例252.根据实施例251所述的组合物，其中所述HBV蛋白是核心蛋白、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
实施例253.根据实施例233至252中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。
实施例254.根据实施例253所述的组合物，其中所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。
实施例255.根据实施例233至254中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。
实施例256.根据实施例233至255中任一项所述的组合物，其中用佐剂调节所述有核细胞以形成经调节的细胞。
实施例257.根据实施例256所述的组合物，其中将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时至约24小时、约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以对所述细胞进行调节。
实施例258.根据实施例256或257所述的组合物，其中在将所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA引入到所述有核细胞中之前或之后调节所述有核细胞。
实施例259.根据实施例256至258中任一项所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR 9激动剂。
实施例260.根据实施例256至259中任一项所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。
实施例261.根据实施例234至260中任一项所述的组合物，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子的免疫细胞。
实施例262.根据实施例261所述的组合物，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸是编码所述嵌合膜结合细胞因子的mRNA。
实施例263.根据实施例242、244和247至262中任一项所述的组合物，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。
实施例264.根据实施例243、244和247至262所述的组合物，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸和编码所述抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。
实施例265.根据实施例263或264所述的组合物，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和/或编码所述抗原的所述核酸是mRNA。
实施例266.根据实施例245至262中任一项所述的组合物，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和两种或更多种抗原的免疫细胞。
实施例267.根据实施例261至266中任一项所述的组合物，其中产生所述免疫细胞的方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育；
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育；或
(d)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育。
实施例268.根据实施例261至266中任一项所述的方法，其中产生所述免疫细胞的方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育；
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育；或
(d)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育。
实施例269.根据实施例261至268中任一项所述的组合物，其中所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。
实施例270.根据实施例261至269中任一项所述的组合物，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm至约4.2μm、或约3.5μm至约4.8μm、或约3.5μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。
实施例271.根据实施例261至270中任一项所述的组合物，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm。
实施例272.根据实施例261至271中任一项所述的组合物，其中所述收缩部的宽度为约4.5μm。
实施例273.根据实施例261至272中任一项所述的组合物，其中包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
实施例274.一种用作药物的组合物，其中所述组合物包括有效量的根据实施例234至273中任一项所述的组合物。
实施例275.一种用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的组合物，其中所述组合物包括有效量的根据实施例210至248中任一项所述的组合物。
实施例276.一种试剂盒，其在根据实施例194至233中任一项所述的方法中使用。
实施例277.一种试剂盒，其包括根据实施例234至275中任一项所述的组合物。
实施例278.根据实施例250或249所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器或具有用于增强免疫细胞的活性的说明的包装插页中一种或多种。
实施例279.一种产生免疫细胞的方法，所述免疫细胞包括嵌合膜结合细胞因子，所述方法包括将编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸引入到所述免疫细胞。
实施例280.根据实施例279所述的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子的免疫细胞。
实施例281.根据实施例280所述的方法，其中所述方法包括在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码其嵌合膜结合细胞因子的核酸一起温育。
实施例282.根据实施例280所述的方法，其中所述方法包括在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育。
实施例283.根据实施例280、281或282所述的方法，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸是编码所述嵌合膜结合细胞因子的mRNA。
实施例284.根据实施例280至283中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。
实施例285.根据实施例280至284中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm至约4.2μm、或约3.5μm至约4.8μm、或约3.5μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。
实施例286.根据实施例280至285中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm。
实施例287.根据实施例280至286中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约4.5μm。
实施例288.根据实施例280至287中任一项所述的方法，其中包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
实例
本领域技术人员将认识到，在本发明的范围和精神内若干个实施例是可能的。将参考以下非限制性实例更详细地描述本发明。以下实例进一步说明了本发明，但是当然不应被解释为以任何方式限制其范围。
实例1
为了确定编码嵌合膜结合细胞因子的mRNA是否可以被翻译并运输到免疫细胞膜，将人供体PBMC挤压挤压装载有编码嵌合膜结合细胞因子的RNA并通过流式细胞术监测细胞因子在免疫细胞的表面上的存在。
方法
以2×107/mL的密度制备人PBMC，并在室温下通过3.5μm宽、10μm长、70μm深的收缩部在60psi下用250μg/ml的编码嵌合膜结合细胞因子(TFRC-(G4S)3-IL-12或TFRC-(G4S)3-IFN-α2a)的相应mRNA或用Opti-MEM培养基中的无货物(空挤压挤压)进行挤压挤压处理。在挤压挤压处理之后，将挤压挤压装载的PBMC离心，并且弃去上清液。随后将细胞在R10+培养基(RPMI，10％ FBS，1％ Pen/Strep，1x ITS-A，50μMβ-ME，1x MEM NEAA)中洗涤两次，然后重悬于新鲜R10+培养基中。将细胞在37℃下温育四小时并且然后与相应荧光抗体(AF488抗人IL-2、V450抗人IFN-α2b或太平洋蓝抗人p40[IL-12])一起温育。为了评估mRNA翻译和到膜表面的运输，使用Attune NxT声聚焦细胞仪分析与免疫细胞结合的抗体的荧光强度。
结果
如图1所示，与空挤压样品相比，挤压装载有编码TFRC-(G4S)3-IL-12或TFRC-(G4S)3-IFN-α2a的mRNA的人PBMC导致挤压装载的样品中的活免疫细胞的IL-12和IFN-α2a的平均荧光强度(MFI)增加。结果表明，挤压装载有编码嵌合膜结合细胞因子的mRNA的人PBMC可以翻译mRNA并将经编码的蛋白质运输到免疫细胞的表面。
实例2
为了确定嵌合膜结合细胞因子是否保留其信号传导功能，将人供体PBMC挤压装载有编码嵌合膜结合细胞因子的mRNA并与细胞因子特异性HEK-Blue报告基因细胞(英杰公司(InvivoGen))共培养。
方法
以2×107/mL的密度制备人PBMC，并在室温下通过3.5μm宽、10μm长、70μm深的收缩部在60psi下用250μg/ml的编码嵌合膜结合细胞因子(TFRC-(G4S)3-IL-12或TFRC-(G4S)3-IFN-α2a)的相应mRNA或用Opti-MEM培养基中的无货物(空挤压)进行挤压处理。在挤压处理之后，将挤压装载的PBMC离心，并且弃去上清液。随后将细胞在测试培养基(DMEM，10％FBS，1x Pen/Strep，2mM L-谷氨酰胺)中洗涤两次，然后重悬于新鲜测试培养基中。
通过将烧瓶用PBS冲洗并与96孔板中的相应挤压装载的PBMC或空挤压PBMC共培养，从培养烧瓶中收获对数生长的HEK-Blue IL-12、HEK-Blue IL-2和HEK-Blue IFN-α/β(英杰公司)报告基因细胞。在收获培养物上清液之前，将共培养物在37℃下温育过夜。相应细胞因子与受体的结合和HEK-Blue报告基因细胞中的相应信号传导通路的激活导致培养物上清液中的碱性磷酸酶的分泌。根据制造商的方案，通过QUANTI-blue测定检测分泌型碱性磷酸酶(SEAP)。从空挤压和挤压装载的样品的OD630值中减去单独的HEK-Blue报告基因细胞的OD630。
结果
如图2所示，挤压装载有编码TFRC-(G4S)3-IL-12或TFRC-(G4S)3-IFN-α2a的mRNA的人PBMC能够激活相应信号传导通路，如分别与HEK-Blue IL-2、HEK-Blue IL-12和HEK-BlueIFN-α/β共培养时培养物上清液中的SEAP增加所示。结果表明，挤压装载有编码嵌合膜结合细胞因子的mRNA的人PBMC产生在功能上能够与其同源受体结合并通过所述同源受体进行信号传导的嵌合细胞因子。
实例3
为了确定编码膜结合IL-2的mRNA是否可以被翻译、运输到免疫细胞膜，将人供体PBMC挤压装载有编码膜结合IL-2的RNA并通过流式细胞术在50小时的时间过程内监测IL-2在免疫细胞的表面上的存在。
方法
以2×107/mL的密度制备人PBMC，并在室温下通过3.5μm宽、10μm长、70μm深的收缩部在60psi下用250μg/ml的编码膜结合IL-2(TFRC-(G4S)3-IL-2、TFRC-(EA3K)3-IL-2、FasL-(G4S)3-IL-2或FasL-(EA3K)3-IL-2)的相应mRNA或Opti-MEM培养基中的未接触的PBMC(无接触)进行挤压处理。在挤压处理之后，将挤压装载的PBMC离心，并且弃去上清液。随后将细胞在X-VIVO 15+培养基(X-VIVO 15，5％人血清，和1x ITS-A)中洗涤两次，然后重悬于新鲜X-VIVO 15+培养基中。将细胞在37℃下温育48小时。在挤压处理后4、18、24和48小时收获单独的培养物。为了评估膜结合IL-2的表达，将细胞与相应BV421抗人IL-2抗体一起温育并使用Attune NxT声聚焦细胞仪分析与免疫细胞结合的抗体的荧光强度。
结果
如图3所示，与空挤压样品相比，在每个时间点(挤压后4、18、24和48小时)，挤压装载有编码膜结合IL-2的mRNA的人PBMC导致挤压装载的样品中的活免疫细胞的IL-2的平均荧光强度(MFI)增加。结果表明，挤压装载有编码嵌合膜结合细胞因子的mRNA的人PBMC可以翻译经编码的蛋白质并将其运输到免疫细胞的表面，并且在挤压处理后可以在免疫细胞的表面上检测到IL-2持续>24小时。
实例4
为了确定嵌合膜结合细胞因子是否保留其信号传导功能，将人供体PBMC挤压装载有编码膜结合IL-2的mRNA并与细胞因子特异性HEK-Blue IL-2报告基因细胞(英杰公司)共培养。
方法
以2×107/mL的密度制备人PBMC，并在室温下通过3.5μm宽、10μm长、70μm深的收缩部在60psi下用250μg/ml的编码膜结合IL-2(TFRC-(G4S)3-IL-2、TFRC-(EA3K)3-IL-2、FasL-(G4S)3-IL-2或FasL-(EA3K)3-IL-2)的相应mRNA或用Opti-MEM培养基中的无货物(空挤压)进行挤压处理。在挤压处理之后，将挤压装载的PBMC离心，并且弃去上清液。随后将细胞在测试培养基(DMEM，10％ FBS，1x Pen/Strep，2mM L-谷氨酰胺)中洗涤两次，然后重悬于新鲜测试培养基中。
通过将烧瓶用PBS冲洗并与96孔板中的挤压装载的PBMC或空挤压PBMC共培养，从培养烧瓶中收获对数生长的HEK-Blue IL-2报告基因细胞(英杰公司)。在收获培养物上清液之前，将共培养物在37℃下温育过夜。IL-2与其受体的结合和HEK-Blue IL-2报告基因细胞中的IL-2信号传导通路的激活导致培养物上清液中的碱性磷酸酶的分泌。根据制造商的方案，通过QUANTI-blue测定检测分泌型碱性磷酸酶(SEAP)。从空挤压和挤压装载的样品的OD640值中减去单独的HEK-Blue报告基因细胞的OD640。
结果
如图4所示，与空挤压PBMC的非激活相比，挤压装载有编码TFRC-(G4S)3-IL-2、TFRC-(EA3K)3-IL-2、FasL-(G4S)3-IL-2或FasL-(EA3K)3-IL-2的mRNA的人PBMC能够激活IL-2信号传导途径，如与HEK Blue IL-2报告基因细胞共培养时培养物上清液中的SEAP增加所示。结果表明，挤压装载有编码膜结合IL-2的mRNA的人PBMC在免疫细胞的表面上产生在功能上能够与IL-2受体结合并通过所述受体进行信号传导的嵌合IL-2。
实例5
为了确定挤压装载有重组E7(HPV16)蛋白质的免疫细胞是否可以引发抗原特异性T细胞应答，将人供体HLA-A*02+PBMC挤压装载有E7蛋白并且通过IFN-γELISA测量刺激E7特异性T细胞的能力。
方法
以10×106/mL的密度制备来自HLA-A*02+供体的人PBMC，并通过4.5μm宽、10μm长和70μm深的收缩部在60psi下用32μg/ml的重组E7蛋白(艾博抗贸易有限公司(Abcamplc.))、50μM E7.6合成长肽(SLP)，或用RPMI 1640培养基中的无货物(空挤压)进行挤压处理。在挤压处理之前，将微流体挤压装置在冰上冷却15分钟。在挤压处理之后，将挤压装载的PBMC离心，并且弃去上清液。随后将细胞在共培养培养基(X-VIVO 15+5％人血清)中洗涤两次，然后重悬于新鲜共培养培养基中。
然后将1.2×105个挤压装载的PBMC与3×104个HLA-A*02+E711-20应答者T细胞(Cellero公司)放置在96孔板中共培养。作为阳性对照，将0.02μM的最小表位E711-20直接添加到96孔板中的未处理的PBMC和应答者细胞(E711-20肽掺加)中。在将共培养物在37℃下温育6小时之后，收获共培养物上清液。根据制造商的方案进行IFNγELISA以确定每个样品的培养物上清液中的IFNγ的浓度。
结果
如图5所示，与空挤压对照相比，挤压装载有重组E7蛋白并与E711-20应答者T细胞共培养的人PBMC导致IFNγ产生增加。结果表明，挤压装载有全长重组E7蛋白的人PBMC可以引发E711-20肽特异性T细胞应答。
实例6
为了确定由天然或密码子优化的E6 mRNA产生的E6蛋白的量，将人PBMC挤压装载有相应天然或密码子优化的E6 mRNA，并用蛋白质印迹测量表达水平。
方法
以2×107/mL的密度制备来自两个不同HLA-A*02+供体(237和246)的人PBMC，并在室温下通过3.5μm宽、10μm长和70μm深的收缩部在60psi下用Opti-MEM培养基中的250μg/mL的相应E6 mRNA(天然的或密码子优化的)进行挤压处理。在挤压处理之后，将挤压装载的hPBMC离心，并且弃去上清液。随后将细胞在含有5％人血清的XVIVO 15培养基中洗涤两次，然后重悬于含有5％人血清的新鲜XVIVO 15培养基中。
然后将2.5×106个细胞放置在96孔ULA板中并在37℃下温育90分钟。在90分钟温育之后，收获细胞并进行离心。产生细胞裂解物并用于蛋白质印迹。通过使用针对E6的特异性抗体来检测E6蛋白的存在。
结果
如图6所示，在90分钟的挤压装载之后，在来自两个不同HLA-A*02+供体(237和246)的挤压装载的PBMC中成功检测到E6蛋白。此外，与天然E6 mRNA相比，E6 mRNA的密码子优化增加mRNA翻译。
实例7
为了确定密码子优化的E6 mRNA的翻译动力学，将人PBMC挤压装载有相应天然或密码子优化的E6 mRNA，并用蛋白质印迹在24小时的时间过程内测量表达水平。
方法
以2×107/mL的密度制备来自两个不同HLA-A*02+供体(224和239)的人PBMC，并在室温下通过3.5μm宽、10μm长和70μm深的收缩部在60psi下用Opti-MEM培养基中的250μg/mL的密码子优化的E6 mRNA进行挤压处理。在挤压处理之后，将挤压装载的hPBMC离心，并且弃去上清液。随后将细胞在含有5％人血清的XVIVO 15培养基中洗涤两次，然后重悬于含有5％人血清的新鲜XVIVO 15培养基中。
然后将2.5×106个细胞放置在96孔ULA板中并在37℃下温育不同的时间点(2、6和24小时)。在每个时间点之后，收获细胞并进行离心。产生细胞裂解物并用于蛋白质印迹。通过使用针对E6的特异性抗体来检测E6蛋白的存在。
结果
如图7所示，在该研究评估的每个时间点，在来自两个不同HLA-A*02+供体(224和239)的挤压装载的PBMC中成功检测到E6蛋白。这些结果表明密码子优化可以用于促进或增强E6的mRNA翻译。
实例8
为了确定在递送编码E7的经修饰的mRNA之后的E7蛋白的动力学，将人PBMC挤压装载有带有或不带有免疫蛋白酶体靶向基序的相应天然或密码子优化的E7 mRNA，并用蛋白质印迹在6小时的时间过程内测量表达水平。
方法
以2×107/mL的密度制备来自HLA-A*02+供体的人PBMC，并在室温下通过3.5μm宽、10μm长和70μm深的收缩部在60psi下用Opti-MEM培养基中的250μg/mL的相应E7 mRNA(天然的、D-盒免疫蛋白酶体靶向基序、密码子优化的两种不同版本)进行挤压处理。在挤压处理之后，将挤压装载的hPBMC离心，并且弃去上清液。随后将细胞在含有5％人血清的XVIVO 15培养基中洗涤两次，然后重悬于含有5％人血清的新鲜XVIVO 15培养基中。
然后将2.5×106个细胞放置在96孔ULA板中并在37℃下温育至多6小时。在1小时和6小时的时间点之后，收获细胞并进行离心。产生细胞裂解物并用于蛋白质印迹。通过使用针对E7的特异性抗体来检测E7蛋白的存在。
结果
如图8所示，在挤压装载1小时之后，在来自HLA-A*02+供体的挤压装载的PBMC中成功检测到每个样品(天然的、D-盒、密码子优化的版本1和版本2)的E7蛋白。此外，与天然E7mRNA相比，E7 mRNA的密码子优化增加mRNA翻译。另外，与天然E7 mRNA相比，含有E7 mRNA的D-盒基序表现出更快的蛋白质降解。在挤压装载之后6小时检测不到E7蛋白。
实例9
为了确定挤压装载有E7 mRNA的特异性HLA单倍型的免疫细胞是否可以诱导抗原特异性T细胞应答，将人供体HLA-A*02+PBMC挤压装载有编码全长E7的各种mRNA构建体并且使用IFN-γELISA测定测量刺激E711-20特异性应答者T细胞的能力。
方法
以2×107/mL的密度制备来自HLA-A*02+供体的人PBMC，并在室温下通过3.5μm宽、10μm长和70μm深的收缩部在60psi下用Opti-MEM培养基中的250μg/mL的不同E7 mRNA进行挤压处理。在挤压处理之后，将挤压装载的PBMC离心，并且弃去上清液。随后将细胞在含有5％人血清的XVIVO 15培养基中洗涤两次，然后重悬于含有5％人血清的XVIVO 15培养基中。
然后将1.2×105个挤压装载的PBMC与3×104个购自Cellero公司的E711-20应答者T细胞放置在96孔ULA板中共培养。作为阳性对照，将20nM E711-20最小表位肽直接添加到共培养板中的未处理的PBMC和应答者细胞(肽掺加)中。将板在37℃下温育6小时或过夜并且然后根据制造商的说明进行显影/定量。
结果
如图9所示，在共培养6小时后，挤压装载有各种E7 mRNA构建体的HLA-A*02+人PBMC导致E711-20特异性应答者T细胞的IFNγ分泌增加。此外，与天然E7 mRNA构建体相比，进一步编码免疫蛋白酶体靶向基序(D-盒E7)或具有密码子优化(CO v1和CO v2)的E7 mRNA构建体导致IFNγ分泌增加。这些结果表明，挤压装载有E7 mRNA的HLA-A*02+人PBMC可以诱导抗原特异性T细胞应答并且这可以通过密码子优化或向E7 mRNA添加免疫蛋白酶体靶向基序来进一步增强。
实例10
为了确定挤压装载有E7 mRNA的特异性HLA单倍型的免疫细胞是否可以诱导抗原特异性T细胞应答，将人供体HLA-A*02+PBMC挤压装载有编码全长E7的各种mRNA构建体并且使用IFN-γELISA测定测量刺激E711-20特异性应答者T细胞的能力。
方法
以2×107/mL的密度制备来自HLA-A*02+供体的人PBMC，并在室温下通过3.5μm宽、10μm长和70μm深的收缩部在60psi下用Opti-MEM培养基中的250μg/mL的不同E7 mRNA进行挤压处理。在挤压处理之后，将挤压装载的PBMC离心，并且弃去上清液。随后将细胞在含有5％人血清的XVIVO 15培养基中洗涤两次，然后重悬于含有5％人血清的XVIVO 15培养基中。
然后将1.2×105个挤压装载的PBMC与3×104个购自Cellero公司的E711-20应答者T细胞放置在96孔ULA板中共培养。作为阳性对照，将20nM E711-20最小表位肽直接添加到共培养板中的未处理的PBMC和应答者细胞(肽掺加)中。将板在37℃下温育6小时或过夜并且然后根据制造商的说明进行显影/定量。
结果
如图10A和10B所示，挤压装载有各种E7 mRNA构建体(E7 CO：密码子优化的E7mRNA；NLS E7 CO：进一步编码突变的NLS的密码子优化的E7 mRNA；sec/MITD E7 CO：进一步编码sec/MITD定位结构域的密码子优化的E7 mRNA；C-ter KEKE E7 CO：进一步编码C末端KEKE免疫蛋白酶体靶向基序的密码子优化的E7 mRNA；编码E7.6 SLP的mRNA；编码E7.6 SLP的6x重复序列的mRNA)的HLA-A*02+人PBMC导致在共培养6小时和过夜之后检测到IFNγ分泌。
实例11
为了确定挤压装载有E7 mRNA的特异性HLA单倍型的免疫细胞是否可以诱导抗原特异性T细胞应答，将人供体HLA-A*02+PBMC挤压装载有编码全长E7的各种mRNA构建体并且使用IFN-γELISA测定测量刺激E711-20特异性应答者T细胞的能力。
方法
以2×107/mL的密度制备来自HLA-A*02+供体的人PBMC，并在室温下通过3.5μm宽、10μm长和70μm深的收缩部在60psi下用Opti-MEM培养基中的250μg/mL的不同E7 mRNA进行挤压处理。在挤压处理之后，将挤压装载的PBMC离心，并且弃去上清液。随后将细胞在含有5％人血清的XVIVO 15培养基中洗涤两次，然后重悬于含有5％人血清的XVIVO 15培养基中。
然后将1.2×105个挤压装载的PBMC与3×104个购自Cellero公司的E711-20应答者T细胞放置在96孔ULA板中共培养。作为阳性对照，将20nM E711-20最小表位肽直接添加到共培养板中的未处理的PBMC和应答者细胞(肽掺加)中。将板在37℃下温育6小时或过夜并且然后根据制造商的说明进行显影/定量。
结果
如图11A和11B所示，在共培养6小时或过夜后，挤压装载有各种E7mRNA构建体的HLA-A*02+人PBMC导致E711-20特异性应答者T细胞的IFNγ分泌。此外，这种E711-20特异性T细胞应答的诱导可以从挤压装载有各种E7 mRNA构建体的多个HLA-A*02+人PBMC供体中一致地观察到。结果表明，挤压装载有E7 mRNA的不同HLA-A*02+人PBMC可以诱导抗原特异性T细胞应答。
实例12
为了确定信号2和信号3介体的共递送是否可以增强通过挤压装载有抗原的抗原呈递细胞刺激T细胞应答的能力，将人供体HLA-A*02+PBMC挤压装载有编码分别介导信号1、信号2和/或信号3的效应子的不同mRNA。通过细胞内细胞因子染色(ICS)测量CD3+CD8+应答者细胞的激活。将用肽再刺激的各种mRNA挤压装载的细胞的效果与用CMV pp65肽(肽掺加对照)温育的细胞的效果进行比较。
方法
用对NLVPMVATV(495-503aa；SEQ ID NO:88)具有特异性的CMVpp65四聚体对从CMV+HLA-A*02+leukopak中分离的人PBMC进行染色以确定这些PBMC具有预先存在的pp65特异性CD8 T细胞。随后以2×107个细胞/mL的密度制备PBMC并将其与编码CMV pp65(信号1)的mRNA、编码CD86(信号2)的mRNA和/或编码膜结合白细胞介素-12(mbIL-12)(信号3)的mRNA组合。在存在mRNA的情况下，在室温下使用细胞
系统和芯片通过3.5μm宽、10μm长和70μm深的收缩部在60psi下在RPMI培养基中对细胞进行挤压处理。用空有效载荷(空挤压)挤压处理并进一步与10nM CMV pp65肽一起温育的PBMC用作对照。测试每种mRNA的下列浓度和混合物。
表1.
例如，对于样品G，将细胞悬浮液中的总体积为225μL的细胞用以下浓度的mRNA进行挤压处理：25μg/mL的CMV pp65 mRNA、250μg/mL的CD86 mRNA和/或250μg/mL的膜结合白细胞介素-12mRNA。
在挤压处理之后，将挤压装载的PBMC转移到RPMI+10％胎牛血清中并在37℃下温育5天。在温育的最后一天，用1μM CMV pp65肽再刺激所得细胞，或者不进行再刺激，并通过ICS测量其激活和活性。在CD3+CD8+应答者细胞中评估TNF-α、IFN-γ、IL-2、PD-1和颗粒酶B。
结果
如细胞内染色所示，在挤压介导的分别编码CD86或mbIL-12的mRNA递送后24小时，成功翻译CD86 mRNA(图12A、B)和mbIL-12mRNA(图13A、B)。
图14示出了CMV pp65 mRNA对装载mRNA的PBMC在激活抗原特异性T细胞而不进行再刺激时的浓度效应。图15示出了CMV pp65 mRNA对装载mRNA的PBMC在用1μM的抗原再刺激激活抗原特异性T细胞时的浓度效应。如图15所示，在所有50μg/mL和100μg/mL的挤压装载的pp65 mRNA中观察到T细胞激活，如通过在CD3+CD8+应答者内诱导IFNγ+CD45RO+群体表明的。两个图示出了当CMV pp65 mRNA与CD86mRNA和mbIL-12mRNA一起挤压时，IFNγ+CD45RO+CD3+CD8+细胞的更高百分比。
图16A-E示出了抗原特异性CD8 T细胞是多功能的，如IFNg、IL-2、TNFa、颗粒酶B、PD-1表达所示。与单独的抗原(即，将单独的pp65 mRNA挤压装载到PBMC中)相比，在PBMC中进一步引入编码信号2/3mRNA的mRNA进一步上调这些功能标志物。
实例13
为了测量CpG成熟对挤压细胞的影响，将人供体HLA-A*02+PBMC挤压装载有编码分别介导信号1、信号2和/或信号3的效应子的不同mRNA。对于每个PBMC样品，将一半的细胞用1μM的CpG 7909成熟4小时。在4小时成熟结束时，洗涤过量的CpG 7909并且对细胞进行铺板并在37℃下温育5天。在第5天，通过ICS以及四聚体分析测量CD3+CD8+细胞的激活和活性。将用CpG 7909成熟的各种mRNA挤压装载的细胞的效果与用空有效载荷挤压处理并掺有CMVpp65肽的PBMC的效果以及用PMA/离子霉素处理的PBMC的效果进行比较。
方法
用对NLVPMVATV(495-503aa；SEQ ID NO:88)具有特异性的CMVpp65四聚体对从CMV+HLA-A*02+leukopak中分离的人PBMC进行染色以确定这些PBMC具有预先存在的pp65特异性CD8 T细胞。随后以2×107个细胞/mL的密度制备PBMC并将其与编码CMV pp65(信号1)、CD86(信号2)和/或膜结合白细胞介素-12(mbIL-12)(信号3)的mRNA组合。在存在相应mRNA的情况下，在室温下使用细胞
系统和芯片通过3.5μm宽、10μm长和70μm深的收缩部在60psi下在RPMI培养基中对细胞进行挤压处理。用空有效载荷(空挤压)并进一步用10nM CMV pp65肽挤压处理的PBMC用作对照。测试每种mRNA的下列浓度和混合物。
表2
例如，对于样品G，将细胞悬浮液中的总体积为500μL的细胞用以下浓度的mRNA进行挤压处理：10μg/mL的CMV pp65 mRNA、250μg/mL的CD86 mRNA和250μg/mL的膜结合白细胞介素-12mRNA。对于每个样品，将细胞的子集用1μM的CpG 7909成熟4小时，然后洗涤并培养。
将细胞进一步再温育5天。在温育的最后一天，用1μM CMV pp65肽再刺激所得细胞，并通过ICS测量其激活和活性。在CD3+CD8+应答者细胞中评估TNF-α、IFN-γ、IL-2、PD-1和颗粒酶B。
除了ICS评估之外，用CMVpp65四聚体对细胞进行染色以确定在第5天扩增之后抗原特异性CD8 T细胞的数量。
结果
如细胞内染色所示，在挤压介导的分别编码CD86或mbIL-12的mRNA递送后24小时，成功翻译CD86 mRNA(图17A、17B)和mbIL-12mRNA(图18A、18B)。
图19示出了如与用单独的pp65 mRNA挤压装载PBMC相比，在具有CpG成熟和不具有CpG成熟的条件下用pp65和CD86和/或mbIL-12mRNA挤压装载PBMC之后，CMV pp65四聚体特异性(TET特异性)CD3+CD8+应答者细胞的扩增增加。该实例表明，虽然CpG成熟导致四聚体+细胞的百分比略有下降(图19的上图)，但导致比不具有CpG成熟时更高的四聚体+计数(图19的下图)。进一步地，与单独挤压CMV pp65 mRNA相比，CD86和/或mbIL-12mRNA的共递送进一步增加了四聚体特异性应答者细胞的数量和百分比。
如图20所示，在具有和不具有CpG成熟的条件下，当编码信号1mRNA的介体的mRNA与编码信号2和/或3的介体的mRNA共递送时，应答者T细胞的激活增加，如CD3+CD8+应答者内的IFNγ+CD45RO+群体增加表明的。
如图21A-E所示，如与不具有抗原的挤压处理的PBMC相比，当PBMC挤压装载有pp65mRNA时，T细胞应答者中的TNF-α、IFN-γ、IL-2、PD-1和颗粒酶B的功能标志物上调。结果表明激活的抗原特异性T细胞是多功能的。
实例14
为了评估在T细胞激活中分别编码信号1、2或3的介体的各种mRNA的共挤压(同时挤压-装载)、其处理多种不同HLA单倍型的能力以及由此产生的增强的T细胞应答，将人供体HLA-A*02+PBMC(HLA-A*02+、HLA-B*07+、HLA-B*35+)挤压装载有分别编码T细胞激活中的信号1、2或3的介体的mRNA的组合。
方法
用对NLVPMVATV(495-503aa；SEQ ID NO:88)具有特异性的CMVpp65四聚体对从CMV+HLA-A*02+leukopak中分离的人PBMC进行染色以确定这些PBMC具有预先存在的pp65特异性CD8 T细胞。随后以4×107个细胞/mL的密度制备PBMC并将其与编码CMV pp65(信号1)、CD86(信号2)、膜结合白细胞介素-2(mbIL-2)和/或膜结合白细胞介素-12(mbIL-12)(信号3)的mRNA组合。在存在mRNA的情况下，在室温下使用细胞
系统和芯片通过3.5μm宽、10μm长和70μm深的收缩部在60psi下在RPMI培养基中对细胞进行挤压处理。用空有效载荷挤压处理并掺有10nM CMV pp65肽的PBMC以及用1X PMA/离子霉素处理的PBMC用作对照。测试每种mRNA的下列浓度和混合物。
表3
例如，对于样品F，将细胞悬浮液中的总体积为500μL的细胞用以下浓度的mRNA进行挤压处理：50μg/mL pp65 mRNA(信号1)、250μg/mL的CD86和/或250μg/mL的mbIL-12mRNA。然后将每个样品中的细胞用1μM CpG 7909成熟4小时，之后，将一部分细胞洗涤并且然后冷冻保存4天解冻后，将其放置在培养物中5天以评估ICS应答。将一些细胞立即新鲜培养5天以比较ICS应答。在第5天，在三种不同的条件下对这些细胞进行再刺激：1)具有HLA-A*02限制性pp65最小表位(NLVPMVATV；SEQ ID NO:88)，2)具有HLA-B*07限制性pp65最小抗原表位(RPHERNGFTVL；SEQ ID NO:89)，或(3)HLA-B*35限制性pp65最小表位(TPRVTGGGAM；SEQ IDNO:90)。抗原特异性应答将通过ICS通过评估CD3+CD8+应答者细胞中的TNF-α、IFN-γ表达来测量。另外，在挤压后24小时以及解冻后24小时评估mRNA表达。
结果
如细胞内染色所示，在挤压介导的对应的mRNA递送后24小时，成功翻译CD86 mRNA(图22A、22B)、mb-IL2(图23A、23B)和mbIL-12mRNA(图24A、24B)。
如图25所示，在具有和不具有HLA-B*07限制性pp65最小表位再刺激的条件下，用CD86和mbIL2 mRNA挤压的PBMC以及也用CD86和mbIL12mRNA挤压的PBMC的抗原特异性T细胞应答者的激活增强。另外，在用HLA-B*07限制性pp65最小表位进行肽再刺激的情况下，T细胞应答者激活显著增强，如图26所示，由肽再刺激组中的CD3+CD8+应答者细胞内的IFN-γ+CD45RO+群体的百分比显著更高表明的。
为了显示这些抗原特异性CD8 T细胞的多功能性，还通过细胞内染色测量TNFa产生。再刺激后，可以检测到产生TNFa的CD8 T细胞。值得注意的是，当PBMC挤压装载有CD86、mbIL-2和/或mbIL-12mRNA时，TNFa水平增加。
实例15
为了评估在T细胞激活中分别编码MHC信号1、2或3的效应子的各种mRNA的共挤压(同时挤压-装载)、其处理多种不同HLA单倍型的能力以及由此产生的增强的应答，将人供体HLA-A*02+PBMC挤压装载有分别编码T细胞激活中的信号1、2或3的介体的mRNA的组合。
方法
用对NLVPMVATV(495-503aa；SEQ ID NO:88)具有特异性的CMVpp65四聚体对从CMV+HLA-A*02+leukopak中分离的人PBMC进行染色以确定这些PBMC具有预先存在的pp65特异性CD8 T细胞。随后以5×107个细胞/mL的密度制备PBMC并将其与编码CMV pp65(信号1)、CD86(信号2)、膜结合白细胞介素-2(mbIL-2)和/或膜结合白细胞介素-12(mbIL-12)(信号3)的mRNA组合。在存在mRNA的情况下，在室温下使用细胞
系统和芯片通过3.5μm宽、10μm长和70μm深的收缩部在60psi下在RPMI培养基中对细胞进行挤压处理。掺有10nMCMV pp65肽的空挤压处理的细胞和用1X PMA/离子霉素处理的细胞用作对照。测试每种mRNA的下列浓度和混合物。
表4
例如，对于样品H，将细胞悬浮液中的总体积为500μL的细胞用以下浓度的mRNA进行挤压处理：50μg/mL pp65 mRNA(信号1)、250μg/mL的CD86、250μg/mL的mbIL-2mRNA和/或250μg/mL的mbIL-12mRNA。将每个样品中的细胞收集到RPMI+10％人血清和1μM CpG 7909中并在37℃下温育4小时。温育之后，通过离心将细胞洗涤并重悬于RPMI+10％胎牛血清中并在37℃下温育5天。
在第1天，收集每个样品的等分试样，用于通过流式细胞术分析mRNA表达。通过对细胞特异性标志物(CD3、CD19、CD14和CD56)进行染色来定义PBMC成分细胞组合物并通过对CD86、IL-2和IL-12进行染色来测量每种相应RNA的表达。
在第5天，在存在golgi stop和golgi plug的情况下，用A1限制性pp65表位(YSEHPTFTSQY；SEQ ID NO:91)、B7限制性pp65表位(RPHERNGFTVL；SEQ ID NO:89)或B7限制性pp65表位(TPRVTGGGAM；SEQ ID NO:90)分别对每个细胞样品组的12个孔进行铺板并再刺激每个样品组5小时。
然后对细胞进行染色以表达：CD3+CD8+应答者细胞中的IFN-γ、TNF-α、IL-2、颗粒酶B和PD-1。
通过流式细胞术分析细胞并通过IFNg产生鉴定表位特异性细胞。
结果
在第1天测量CD86、mbIL-2和mbIL-12MFI表达，如图27所示。这些结果表明装载到PBMC中的所有三种mRNA的成功翻译。
CD86、mbIL-2和mbIL-12的表达也作为第1天PBMC内的T细胞的百分比进行测量。这些结果表明，超过75％的总T细胞成功翻译细胞内挤压装载的mRNA。
如图28所示，当pp65装载的PBMC与膜结合细胞因子和/或共刺激分子共递送若干种不同的单倍型时，存在增强的T细胞激活，如通过存在每种相应再刺激(YSE(A01)、TPR(B07)或RPH(B07))以分别扩增HLA-*A01、HLA-*B07或HLA-*B07应答者T细胞所观察到的增强的T细胞激活所表明的。
实例16
为了确定信号2和信号3介体的共递送是否可以增强通过挤压装载有流感M1抗原的抗原呈递细胞刺激T细胞应答的能力，将人供体HLA-A*02+PBMC挤压装载有编码分别介导信号1、信号2和/或信号3的效应子的不同mRNA。通过ICS和四聚体分析测量CD3+CD8+细胞的激活和活性。将用肽再刺激的各种mRNA挤压装载的细胞的效果与用M1肽(肽掺加对照)温育的对照PBMC的效果进行比较。
方法
用M1四聚体对从流感M1+HLA-A*02+leukopak中分离的人PBMC进行染色以确定这些PBMC具有预先存在的M1特异性CD8 T细胞。随后以4×107个细胞/mL的密度制备PBMC并将其与编码流感M1(信号1)、CD86(信号2)和/或膜结合白细胞介素-12(mbIL-12)(信号3)的mRNA组合。在存在相应mRNA的情况下，在室温下使用细胞
系统和芯片通过3.5μm宽、10μm长和70μm深的收缩部在60psi下在RPMI培养基中对细胞进行挤压处理。用空有效载荷挤压处理并掺有100nM流感M1肽的PBMC用作对照。测试每种mRNA的下列浓度和混合物。
表5
例如，对于样品G，将细胞悬浮液中的总体积为200μL的细胞用以下浓度的mRNA进行挤压处理：50μg/mL的流感M1 mRNA、250μg/mL的CD86 mRNA和/或250μg/mL的mbIL-12mRNA。
在挤压处理之后，将挤压装载的PBMC转移到RPMI+10％胎牛血清中并在37℃下温育5天。
在温育的最后一天，用1μM流感M1肽再刺激所得细胞，并通过ICS测量其激活和活性。在CD3+CD8+应答者细胞中评估TNF-α、IFN-γ、IL-2、PD-1和颗粒酶B。另外地，对细胞进行对GILGFVFTL肽(58-66aa；SEQ ID NO:92)具有特异性的流感M1四聚体染色。
结果
如细胞内染色所示，在挤压介导的相应mRNA递送后24小时，成功翻译CD86 mRNA、mbIL-2mRNA和mbIL-12mRNA(图29)。
图30示出了当与1μM的抗原再刺激偶联时，用流感M1 mRNA挤压装载PBMC对抗原特异性T细胞激活的浓度效应。如图31所示，对于挤压装载有三种浓度的流感M1中的每一种的PBMC，观察到抗原特异性T细胞的激活。图30和31两者示出了当流感M1 mRNA与CD86 mRNA和mbIL-12mRNA共递送时，CD3+CD8+应答者细胞内的IFNγ+CD45RO+群体的更高百分比。
如图32所示，用CD86和mbIL-2或mbIL-12mRNA挤压的组合产生流感M1 CD8 T细胞的显著扩增，如四聚体阳性CD8 T细胞所测量的。此外，当mbIL-12存在时，这些细胞没有抗原非依赖性扩增。另一方面，mbIL-2mRNA导致这些细胞的一些抗原非依赖性扩增。
对于多功能标志物，颗粒酶B表达增加并且IFNg、IL-2和TNFa细胞因子上调，表明更高多功能性。与单独的抗原(即，单独的M1 mRNA)相比，PBMC中的信号2和3mRNA的存在使其进一步上调(数据未显示)。
实例17
为了确定挤压装载有编码HPV16 E6的mRNA的特异性HLA单倍型的免疫细胞是否可以诱导抗原特异性T细胞应答，将人供体HLA-B*07+PBMC挤压装载有E6 mRNA。使用IFN-γELISpot测定测量E6 mRNA装载的PBMC刺激HLA-B*07限制性E6特异性T应答者细胞的能力。将挤压装载有E6mRNA的PBMC的效果与未处理和模拟挤压装载的(空)对照的效果进行比较。
方法
为了产生E615-24特异性T细胞，HLA-B*07转基因小鼠每隔2周用E615-24肽、乙型肝炎病毒核心肽(TPPAYRPPNAPIL；SEQ ID NO:93)和不完全弗氏佐剂的乳剂接种疫苗两次3次(初始/加强/加强)。最后一次接种后一周，对小鼠实施安乐死并提取脾脏和引流淋巴结。将组织提取物解离成单细胞悬浮液。在存在E615-24肽和IL-2的情况下，将细胞在37℃下培养6天。在6天结束时，将细胞冷冻保存直到与PBMC共培养的当天为止。
以5×107个细胞/mL的密度制备来自HLA-B*07+供体的人PBMC并将其与0.5mg/ml的E6 mRNA组合。在存在E6 mRNA的情况下，使用细胞
系统和芯片通过3.5μm宽、10μm长和70μm深的收缩部在60psi下在RPMI培养基中对PBMC进行挤压处理。未处理的PBMC(无接触)和在不存在E6 mRNA的情况下的挤压处理的PBMC(空挤压)用作阴性对照。
在挤压处理之后，将挤压装载的PMBC转移到含有1μM CpG ODN 2006的RPMI+10％人血清中并在37℃下温育4小时。然后将挤压装载的PBMC用CTL培养基+1％ L-谷氨酰胺洗涤两次，然后重悬于CTL培养基+1％ L-谷氨酸胺中。
将5×104个E6 mRNA挤压装载的PBMC(E6 mRNA)、未处理的PBMC(无接触)、模拟挤压装载的PBMC(空挤压)或掺有1mM E615-24肽的无接触PBMC(阳性对照)放置在96孔INF-γELISpot板中与5×105个E615-24应答者T细胞(在HLA-B*07转基因小鼠中产生)共培养。将板在37℃下温育过夜并且然后根据制造商的说明进行显影。
结果
如图34所示，挤压装载有E6 mRNA的HLA-B*07+人PBMC在共培养时导致HLA-B*07E615-24特异性T细胞中的IFN-γ应答增加，如ELISPOT测定中的IFN-γ斑块形成单位(SFU)(图35)和IFN-γ平均斑块大小(图36)的增加所表明的。与无接触和空挤压对照相比，在E6mRNA装载的PBMC中，HLA-B*07E615-24特异性T细胞中的这些IFN-γ应答显著增加。这些结果表明，挤压装载有E6 mRNA的HLA-B*07+PBMC可以处理和呈递E615-24表位并诱导HLA-B*07限制性E6特异性T细胞应答。
实例18
为了确定挤压装载有E7 mRNA的免疫细胞可以引发抗原特异性T细胞应答的时间长度，在通过IFN-γELISA评估刺激E7特异性T细胞的能力之前将人供体HLA-A*02+PBMC挤压装载有E7 mRNA并温育各种时间长度。
方法
以5×107/mL的密度制备来自HLA-A*02+供体的人PBMC，并使用细胞
系统和芯片通过3.5μm宽、10μm长、70μm深的收缩部在60psi下用(i)0.5mg/ml的E7 mRNA、(ii)0.5mg/ml E6 mRNA、(iii)0.5mg/ml E7 mRNA和0.25mg/ml E6 mRNA、(iv)E7.6合成长肽(SLP)或(v)用RPMI 1640培养基中的无货物(空挤压)进行挤压处理。在挤压处理之后，将挤压装载的PMBC转移到含有1μM CpG ODN 2006的RPMI+10％人血清中并在37℃下温育4小时。随后将挤压装载的PBMC在共培养培养基(X-VIVO 15+5％人血清)中洗涤两次，然后重悬于新鲜共培养培养基中。将一部分细胞留出，用于立即与E711-20应答者T细胞(Cellero公司)共培养并将剩余的细胞冷冻保存。
然后将3×105个挤压装载的PBMC与3×104个HLA-A*02+E711-20应答者T细胞(Cellero公司)放置在96孔板中共培养。作为阳性对照，将0.1μM的E711-20肽直接添加到96孔板中的未处理的PBMC和应答者细胞中。在将共培养物在37℃下温育18小时之后，收获共培养物上清液。根据制造商的方案进行IFNγELISA以确定每个样品的培养物上清液中的IFNγ的浓度。
在添加E711-20应答者T细胞之前，将冷冻保存的挤压装载的PBMC解冻并在培养物中放置8、4或0小时。在培养8、4或0小时之后，在96孔板中将3×105个挤压装载的PBMC与3×104个HLA-A*02+E711-20应答者T细胞(Cellero公司)共培养。在将共培养物在37℃下温育18小时之后，收获共培养物上清液。根据制造商的方案进行IFNγELISA以确定每个样品的培养物上清液中的IFNγ的浓度。
结果
如图38A和39A所示，挤压装载有E7 mRNA的人PBMC能够引发免疫应答，如通过在挤压装载E7 mRNA后立即共培养时来自E711-20应答者T细胞的IFN-γ产生所测量的。如图38B和39B所示，挤压装载有E7 mRNA的人PBMC能够在挤压处理后引发至少免疫应答至少长达8小时，如通过来自E711-20应答者T细胞的IFN-γ产生所测量。这些结果表明，挤压装载有E7mRNA的HLA-A*02+人PBMC在挤压处理后可以引发E7特异性T细胞应答至少8小时。
实例19
为了确定挤压装载有E6 mRNA的免疫细胞是否可以引发E6特异性免疫应答，将人供体HLA-A*02+PBMC挤压装载有E6 mRNA，并通过发光评估刺激E629-38 TCR Jurkat-LuciaNFAT报告基因细胞的能力。
方法
E6 TCR Jurkat-Lucia NFAT报告基因细胞是通过将表达E629-38 TCR的慢病毒转导到已敲除其内源性TCRα/β的Jurkat Lucia NFAT细胞(英杰公司)中而产生的。这些细胞具有整合的NFAT诱导型Lucia报告基因，所述报告基因可以通过E629-38 TCR与和同源E629-38表位结合的MHC-I(HLA-A*02限制性)的接合而激活。
以4×107/mL的密度制备来自HLA-A*02+供体的人PBMC，并在室温下通过3.5μm宽、10μm长和70μm深的收缩部在60psi下用(i)500μg/ml E6 mRNA和500μg/ml E7 mRNA，(ii)编码CD86、膜结合IL-2(mbIL-2)和膜结合IL-12(mbIL-12)的mRNA，(iii)E6和E7 mRNA以及编码CD86、mbIL-2和mbIL-12的mRNA，(iv)E6和E7 SLP或(v)用RPMI 1640培养基中的无货物(空挤压)进行挤压处理。在挤压处理之后，将挤压装载的PMBC转移到含有1μM CpG ODN2006的RPMI+10％人血清中并在37℃下温育4小时。随后将挤压装载的PBMC在共培养培养基(X-VIVO 15+5％人血清)中洗涤两次，然后重悬于新鲜共培养培养基中。
然后将4×105个挤压装载的PBMC与1×105个E629-38 TCR Jurkat-Lucia NFAT细胞放置在96孔板中共培养。作为阳性对照，将1μM的E629-38肽直接添加到96孔板中的未处理的PBMC和E629-38 TCR Jurkat-Lucia NFAT细胞中。在将共培养物在37℃下温育16-18小时之后，收获共培养物上清液。根据制造商的方案，用培养物上清液进行QUANTI-Luc Gold测定(英杰公司)，以通过由于NFAT诱导型Lucia报告基因的激活而发光来测量Lucia荧光素酶。
结果
如图40、41A和41B所示，与空挤压对照相比，挤压装载有E6 mRNA并与E629-38 TCRJurkat-Lucia NFAT报告基因细胞共培养的人PBMC导致NFAT激活和发光增加。结果表明，挤压装载有E6 mRNA的HLA-A*02+人PBMC可以引发E629-38免疫应答。
实例20
该研究评估了经E711-19 TCR或E629-38 TCR转导的CD8 T细胞在与挤压装载有编码HPV16抗原和信号2/3介体的mRNA(SQZ-eAPC-HPV细胞)的自体PBMC共培养时的扩增。
方法
从HLA-A*02+leukopak中分离人PBMC。在第0天通过阴性选择分离CD8+T细胞。制备补充有100IU/mL的IL-2(R10+IL-2)的R10培养基(RPMI 1640+10％胎牛血清+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素)。将T细胞在室温下以500rcf离心5分钟。抽吸上清液并且将细胞以2×106个细胞/mL的细胞浓度重悬于R10+IL-2中。将抗CD3/CD28 Dynabeads洗涤并以2×106个动力珠/ml的珠浓度重悬于R10+IL-2中。将3mL的T细胞和3mL的动力珠在烧瓶中组合，最终细胞和动力珠浓度等于1×106个细胞/mL，并放置在37℃、5％ CO2的温育箱中2天。
在第2天，用表达E711-19 TCR或E629-38 TCR的慢病毒转导CD8+T细胞。制备包括X-VIVO 15+5％人血清+300IU/ml IL-2的40mL T细胞培养基。收获CD8+T细胞并将其以1×106个细胞/mL重悬于T细胞培养基中。在24孔板中，将500μL的CD8+T细胞与50μL的LentiBOOST和84.7μL的E7TCR慢病毒(1×107TU)或49.5μL的E6 TCR慢病毒(1×107TU)组合。将T细胞培养基添加到每个转导物中，使总体积达到1mL。将细胞通过在32℃下以2,000rcf离心2小时进行旋转接种。将板放置在37℃、5％ CO2的温育箱中过夜。在第3天，按照与第一慢病毒转导相同的方案进行第二慢病毒转导。
在第4天，将慢病毒去除并且将T细胞在R10+300IU/mL IL-2中以1×106个细胞/mL培养4天。在第7天，进行E711-19五聚体和E629-38四聚体染色以确定表达E6或E7 TCR的细胞的百分比(图42A)。还添加新鲜R10培养基以使细胞浓度返回到1×106个细胞/mL。
然后将经E7或E6-TCR转导的T细胞以0.1％五聚体/四聚体+T细胞的浓度与已经用编码E6和E7的mRNA和/或信号2mRNA(CD86 mRNA)/信号3mRNA(mbIL-2和mbIL-12mRNA)挤压的自体PBMC共培养总共6天。
在第8天，将来自同一供体的PBMC解冻并且根据以下时间表制备四组挤压装载的自体PBMC。具体地，在室温下使用微流体收缩部(10μm深、3.5μm宽和70μm长)在60psi下在RPMI培养基中对PBMC进行挤压处理。
表6
然后将经E7或E6-TCR转导的T细胞以某个细胞浓度与已经用E6和E7 mRNA和/或信号2介体mRNA(CD86 mRNA)/信号3介体RNA(mbIL-2和mbIL-12mRNA)挤压处理的自体PBMC共培养。将共培养物铺板在总细胞数为2×105的96孔板中；其中5×104个细胞是挤压处理的PBMC并且剩余的1.5×105个细胞是0.1％ E6或E7 TCR表达T细胞和未处理的自体PBMC的组合。将共培养物在37℃、5％ CO2下温育6天。
在第14天(在开始共培养之后6天)，进行E711-19五聚体染色和E629-38四聚体染色，以及细胞内细胞因子染色(ICS)。对于ICS，首先在存在GolgiPlug和GolgiStop的情况下，用E711-19或E629-38最小表位再刺激细胞6小时。然后对细胞进行IFNγ、TFNα、IL-2表达的染色。
结果
如图42D至42I所示，对于两种共培养设置(E7 TCR T细胞或E6 TCR T细胞)，如与仅挤压装载有E6+E7 mRNA或仅挤压装载有信号2/3mRNA的PBMC共培养相比，在与挤压装载有E6、E7、CD86、mbIL-2和mbIL-12mRNA(E6+E7+信号2/3mRNA)的PBMC共培养中观察到最高百分比的产生IFNγ、TNF-α或IL-2的T细胞。如图42B和42C所示，E7五聚体和E6四聚体染色也证实了ICS结果，其中如与仅挤压装载有E6+E7 mRNA或仅挤压装载有信号2/3mRNA的PBMC的共培养相比，在与挤压装载有E6+E7+信号2/3mRNA的PBMC的共培养中观察到E6四聚体+或E7五聚体+T细胞的最高增殖。
这些结果表明，如与单独挤压装载有编码抗原的mRNA或编码信号2/3介体的mRNA的PBMC相比，挤压装载有编码HPV16 E6和E7抗原的mRNA和信号2/3介体的PBMC刺激更强的T细胞激活和增殖。
实例21
该研究评估了在用挤压装载有编码CMV抗原和信号2/3介体(SQZ-eAPC-CMV细胞)的mRNA的人PBMC免疫之后，pp65特异性人CD8+T细胞在NSG-(KbDb)无效(IA)无效小鼠(NSG MHC-I/II DKO小鼠)中的激活和扩增。
方法
将从HLA-A*02+leukopak中分离的冷冻保存的人PBMC解冻，用于该研究。在第0天，将8小瓶的HLA-A*02+CMV+冷冻保存的PBMC在水浴中解冻。将含有细胞的小瓶在室温下以200rcf离心10分钟。抽吸上清液并且将细胞以约1×107个细胞/mL的细胞浓度重悬于R10(RPMI 1640+10％胎牛血清+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素)中。将细胞在37℃下放置1小时，之后，将细胞在室温下以500rcf离心5分钟。抽吸上清液并且将细胞重悬于25mL的PBS中。将细胞在室温下以500rcf离心5分钟。抽吸上清液并且将细胞以1×108个细胞/mL的最终细胞浓度重悬于PBS中。
根据以下制备两组挤压装载的PBMC：
在室温下使用微流体收缩部(10μm深、3.5μm宽和70μm长)在60psi下在RPMI培养基中对PBMC进行挤压处理。具体地，PBMC(1)用500μg/mL的编码pp65的mRNA(仅pp65)挤压处理，或者(2)用500μg/mL的编码pp65的mRNA和250μg/mL的以下中的每一种挤压装载：编码信号2介体的mRNA(CD86)、编码信号3介体的mRNA(mbIL-2)和编码另一种信号3介体的mRNA(mbIL-12)(eAPC-CMV或eAPC-pp65)。
根据以下时间表，将两组挤压处理的细胞分别分成两个施用子组。第五组A组表示包括未处理(无接触)的细胞的对照组。
表7
如表8所示，对于初始施用(第0天)，在第0天的早晨，对所有组中的每组五只小鼠进行指定量的未处理的PBMC(无接触PBMC)的眶后(R.O.)注射，并且在第0日的下午，对B-E组的每组五只鼠进行指定量的挤压处理的PBMC的相应R.O.注射。
在第7天，根据上文所描述的类似程序对PBMC进行解冻和挤压处理，并制备两组处理的PBMC(仅eAPC-CMV，pp65)用于加强施用，浓度根据上表7。
如表8所示，对于加强施用(第7天)，对A组的每组5只小鼠进行指定量的未处理的PBMC(无接触PBMC)的R.O.注射，或对B-E组的小鼠进行指定量的处理的PBMC的R.O.注射。
表8
在第12天，通过下颌下血液收集(SMB)将血液从小鼠体内收集到无菌EDTA真空采血管中。用FACS缓冲液中的HLA-A*02pp65四聚体(NLVPMVATV；SEQ ID NO:88)按以下比率进行2x表面染色：
●1:25稀释度的小鼠FcR阻断
●1:100稀释度的抗体
●1:20稀释度的HLA-A*02pp65四聚体(NLVPMVATV；SEQ ID NO:88)
具体来，将100μL的全血和100μL的2x表面染色剂添加到14ml FAC管中，并在室温下在黑暗中温育30分钟。将2mL的1x BDTMFAC裂解溶液(具有diH2O的1:10稀释度)添加到每个管中。然后将管轻轻涡旋并在室温下在黑暗中温育10分钟。随后将细胞在室温下以400rcf离心5分钟。抽吸上清液并且将细胞重悬于0.2mL的FACS缓冲液中。将细胞在室温下以500rcf再次离心4分钟。倾析上清液并将其重悬于0.2mL的FACS缓冲液中。用如上文所描述的药剂进行pp65四聚体染色。
在第14天，将小鼠处死，通过末端放血收集血液并收获脾脏。对于收集的样品，进行pp65四聚体染色，如同细胞内细胞因子染色(ICS)一样。将脾脏收集在含有1mL的R10培养基的管中。将单个脾脏放置在50mL锥形管上的40um细胞过滤器上方。使用注射器的活塞将脾脏压过过滤器。用冷FACS隔离缓冲液通过过滤器洗涤所得材料。然后用FACS隔离缓冲液填充每个管，达到15mL。将细胞在室温下以500rcf离心5分钟。抽吸上清液并且将细胞重悬于0.5mL的R10培养基中。
在染色之前，将pp65四聚体在4℃下以14000rcf离心5分钟。将100μL浓度为2×107个细胞/mL的细胞转移至96孔V形底板。将板在室温下以500rcf离心4分钟。倾析上清液并且将细胞用200μL的PBS洗涤。倾析上清液并使用具有在PBS(1:1000)中稀释的50μL的活/死近IR的活/死可固定近IR死细胞染色试剂盒将细胞重悬。将细胞在室温下在黑暗中温育10分钟。用1:25稀释度的FAC缓冲液制备pp65四聚体和FcR阻断混合物的混合物。类似地，在FACS缓冲液中以1:25的稀释度制备仅FcR阻断的混合物并用于荧光减一(FMO)对照。将细胞在黑暗中温育30分钟。在FACS缓冲液中，以1:75稀释度比率制备下列每种抗体的抗体表面染色混合物：
抗小鼠CD45
抗人CD45
抗人CD3
抗人CD8
抗人CD45RO
将50μL的表面染色混合物添加到细胞悬浮液中并在室温下在黑暗中温育15分钟。然后，向每个孔中添加50μL的FACS缓冲液。将细胞在室温下以500rcf离心4分钟。倾析上清液并且将细胞用200μL的FACS缓冲液洗涤。将细胞在室温下以500rcf离心4分钟。倾析上清液并且将细胞重悬于200μL的FACS缓冲液中。将150μL的样品以100微升/分钟在Attune NxT流式细胞仪上运行。
对于ICS，细胞(1)没有再刺激；(2)用pp65最小表位再次刺激；或(3)在存在GolgiPlugTM和GolgiStopTM的情况下，用1μM的PMA/离子霉素在37℃、5％ CO2的温育箱中再刺激6小时。在总共6小时的再刺激之后，将细胞转移至96孔V形底板。将细胞在室温下以500rcf离心4分钟。倾析上清液并且将细胞重悬于200μL的PBS中。将细胞在室温下以500rcf离心4分钟。在PBS中制备在PBS(1:1000)中稀释的活/死近IR。添加GolgiplugTM(1:500)和GolgistopTM(1:750)。倾析上清液并且将细胞重悬于50μL的在PBS(1:1000)和GolgiplugTM和GolgistopTM混合物中稀释的活/死近IR中。将细胞在室温下在黑暗中温育10分钟。
用人FcR阻断(1:50稀释度)以及GolgiplugTM(1:500)和GolgistopTM(1:750)以1:100稀释度比率制备以下列出的每种抗体的抗体表面染色混合物：
抗小鼠CD45
抗人CD45
抗人CD3
抗人CD8
抗人CD45RO
除了在PBS(1:1000)染色中稀释的活/死近IR之外，还添加50μL的表面抗体染色。将细胞在室温下在黑暗中温育15分钟。添加100μL的FACS缓冲液并且将细胞在室温下以500rcf离心4分钟。将细胞用200μL的FACS缓冲液洗涤并在室温下以500rcf离心4分钟。倾析上清液并且将细胞重悬于100μL的BD CytoFix/CytoPermTM固定和透化溶液中。将细胞在4C下在室温下在黑暗中温育20分钟。在温育之后，添加100μL的1x Perm/洗涤缓冲液。将细胞在室温下以500rcf离心4分钟。倾析上清液并且将细胞重悬于200μL的1x Perm/洗涤缓冲液中。将细胞在室温下以500rcf离心4分钟。倾析上清液并且将细胞重悬于200μL的1xBDTMPerm/洗涤缓冲液中。将板在4C下温育过夜。
然后第二天对细胞进行IFNγ、TFNα和IL-2表达的染色。将细胞在室温下以500crf离心4分钟。以1:100稀释度比率在1x Perm/洗涤缓冲液中制备抗IFNγ、抗TFNα或抗IL-2的抗体表面染色混合物。将细胞重悬于50μL的抗体染色混合物中。将细胞在4C下在黑暗中温育30分钟。在温育之后，添加150μL的1x Perm/洗涤缓冲液并且将细胞在室温下以500rcf再次离心4分钟。将细胞重悬于200μL的FACS缓冲液中。将150μL的样品以100微升/分钟的流速在Attune NxT流式细胞仪上运行。
结果
如图43A、B、C、D、E所示，与用未处理的PBMC(无接触)免疫的小鼠相比，用eAPC-CMV细胞(用挤压装载有编码pp65和信号2/信号3介体的mRNA的PBMC)免疫的小鼠中的pp65抗原特异性T细胞显著增加。如图43E所示，当将用1×106个与5×106个eAPC-CMV细胞免疫的NSGMHC-I/II DKO小鼠进行比较时，pp65四聚体+T细胞的百分比的剂量依赖性增加。当在用pp65最小表位的池再刺激之后测量产生TNF-α和IFNγ的T细胞的百分比时，观察到类似的剂量依赖性(图43H和K)。另外，与仅用5×106个pp65 mRNA细胞(仅挤压装载有编码pp65的mRNA的PBMC)免疫的小鼠相比，用5×106个eAPC-CMV细胞免疫的小鼠趋向于具有更高百分比的pp65四聚体+细胞(图43A、C、D)，以及更高百分比的产生TNF和产生IFNγ的T细胞(图43F、G、I、J)。总的来说，这些数据表明，在体内人源化小鼠模型中，用编码pp65、CD86、mbIL-2和mbIL-12的mRNA挤压的人PBMC可以刺激和扩增抗原特异性T细胞。
序列表
序列表
<110> SQZ生物技术公司
<120> 用于使用有核细胞刺激对蛋白质的HLA未知免疫应答的方法
<130> 75032-20029.40
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> US 63/147,473
<151> 2021-02-09
<150> US 63/073,910
<151> 2020-09-02
<160> 93
<170> Windows的FastSEQ 4.0版
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu Cys Val
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 2
Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu
1 5 10
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr
1 5 10
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 4
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Thr
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 7
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg
1 5
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 8
Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg
1 5 10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu
1 5 10
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 10
Gly Gln Ala Glu Pro Asp
1 5
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe
1 5 10 15
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 12
Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 13
Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
1 5
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 14
Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Ser Asp Lys
1 5 10 15
<210> 15
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 15
Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu
1 5 10 15
<210> 16
<211> 20
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 16
Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His
1 5 10 15
Val Asp Ile Arg
20
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 17
Ser Ser Lys Ser Asp Ser Thr Leu Arg Leu Ser Val Gln Ser Thr His
1 5 10 15
Val Asp Ile Arg
20
<210> 18
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 18
Leu Pro Gln Leu Ser Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile
1 5 10 15
Leu Glu Cys Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr
20 25 30
Asp Phe Ala Phe
35
<210> 19
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 19
Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile Leu Glu
1 5 10 15
Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
20 25
<210> 20
<211> 25
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 20
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp
1 5 10 15
Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
20 25
<210> 21
<211> 35
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 21
Val Tyr Ser Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala
1 5 10 15
Phe Arg Asp Leu Ser Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val
20 25 30
Ser Asp Lys
35
<210> 22
<211> 35
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 22
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu
35
<210> 23
<211> 25
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 23
Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu
1 5 10 15
Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
20 25
<210> 24
<211> 35
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 24
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
1 5 10 15
Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35
<210> 25
<211> 35
<212> PRT
<213> 小家鼠（Mus musculus）
<400> 25
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Ser
1 5 10 15
Ser Lys Ser Asp Ser Thr Leu Arg Leu Ser Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
ggggtcaacg ttgagggggg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
gggggacgat cgtcgggggg 20
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
ggggacgacg tcgtgggggg g 21
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
tccatgacgt tcctgatgct 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
tcgtcgttgt cgttttgtcg tt 22
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
tcgacgttcg tcgttcgtcg ttc 23
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
tcgcgacgtt cgcccgacgt tcggta 26
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
tcgtcgtttt cggcgcgcgc cg 22
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
tcgtcgtcgt tcgaacgacg ttgat 25
<210> 37
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 37
tcgcgaacgt tcgccgcgtt cgaacgcgg 29
<210> 38
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 38
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu
35
<210> 39
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 39
Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu
1 5 10 15
Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn
20 25 30
Ile Val Thr
35
<210> 40
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 40
Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys
1 5 10 15
Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val
20 25 30
Asp Ile Arg
35
<210> 41
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 41
Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu
1 5 10 15
Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser
20 25 30
Gln Lys Pro
35
<210> 42
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 42
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
<210> 43
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 43
Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp Ile Ile
1 5 10 15
Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr
20 25 30
<210> 44
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 44
Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp
1 5 10 15
Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn
20 25
<210> 45
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 45
Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Ala Val Cys
1 5 10 15
Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
20 25
<210> 46
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 46
Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr
1 5 10 15
Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu
20 25
<210> 47
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 47
His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn
1 5 10 15
Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg
20 25
<210> 48
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 48
Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu
1 5 10 15
Leu Ile Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys
20 25 30
<210> 49
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 49
Arg Cys Ile Asn Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg
1 5 10 15
His Leu Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr
20 25 30
<210> 50
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 50
Asp Lys Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg
1 5 10 15
Cys Met Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
20 25 30
<210> 51
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 51
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Arg Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu
35 40 45
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly
50 55 60
Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
65 70 75 80
Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Leu Tyr Gly Thr Thr Leu Glu
85 90 95
Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn
100 105 110
Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys
115 120 125
Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met
130 135 140
Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
145 150 155
<210> 52
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 52
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210> 53
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 53
Met Arg Thr Ala Leu Gly Asp Ile Gly Asn Met His Gly Asp Thr Pro
1 5 10 15
Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu
20 25 30
Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile
35 40 45
Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile
50 55 60
Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln
65 70 75 80
Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
85 90 95
Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro
100 105
<210> 54
<211> 179
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 54
Met Arg Val Thr Ala Pro Arg Thr Leu Ile Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser Met His Gly Asp Thr Pro
20 25 30
Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Asp Leu
35 40 45
Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser Glu Glu Glu Asp Glu Ile
50 55 60
Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp Arg Ala His Tyr Asn Ile
65 70 75 80
Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr Leu Arg Leu Cys Val Gln
85 90 95
Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu Asp Leu Leu Met Gly Thr
100 105 110
Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln Lys Pro Ile Val Gly Ile
115 120 125
Val Ala Gly Leu Ala Val Leu Ala Val Val Val Ile Gly Ala Val Val
130 135 140
Ala Thr Val Met Cys Arg Arg Lys Ser Ser Gly Gly Lys Gly Gly Ser
145 150 155 160
Tyr Ser Gln Ala Ala Ser Ser Asp Ser Ala Gln Gly Ser Asp Val Ser
165 170 175
Leu Thr Ala
<210> 55
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 55
Met His Gly Asp Ala Pro Ala Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro
<210> 56
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 56
Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln
1 5 10 15
Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser
20 25 30
Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp
35 40 45
Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu
65 70 75 80
Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln
85 90 95
Lys Pro Lys Glu Lys Glu Lys Asn Lys Leu Lys Arg Lys Lys Leu Glu
100 105 110
Asn Lys Asp Lys Lys Asp Glu Glu Arg Asn Lys Ile Arg Glu Glu
115 120 125
<210> 57
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 57
Met Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro
1 5 10 15
Glu Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
20 25
<210> 58
<211> 176
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 58
Met Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro
1 5 10 15
Glu Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gln
20 25 30
Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr
35 40 45
Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys
50 55 60
Thr Glu Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Cys Lys Gln Gln Leu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Thr Glu
85 90 95
Leu Gln Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Tyr Cys Lys
100 105 110
Gln Gln Leu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln
115 120 125
Thr Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln
130 135 140
Leu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Tyr
145 150 155 160
Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr Thr Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu
165 170 175
<210> 59
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 59
atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60
cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120
aagcaacagt tactgcgacg tgaggtatat gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180
tatagagatg ggaatccata tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240
agtgagtata gacattattg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 300
aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaactgtc aaaagccact gtgtcctgaa 360
gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa agattccata atataagggg tcggtggacc 420
ggtcgatgta tgtcttgttg cagatcatca agaacacgta gagaaaccca gctgtaa 477
<210> 60
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 60
atgcaccaga aacggaccgc catgttccag gatcctcaag agaggcccag aaagctgcct 60
cagctgtgta ccgagctgca gaccaccatc cacgacatca tcctggaatg cgtgtactgc 120
aagcagcagc tcctgcggag agaggtgtac gatttcgcct tccgggacct gtgcatcgtg 180
tacagagatg gcaaccccta cgccgtgtgc gacaagtgcc tgaagttcta cagcaagatc 240
agcgagtacc ggcactactg ctacagcctg tacggcacca cactggaaca gcagtacaac 300
aagcccctgt gcgacctgct gatccggtgc atcaactgcc agaaacctct gtgccccgag 360
gaaaagcagc ggcacctgga caagaagcag cggttccaca acatcagagg ccggtggacc 420
ggcagatgca tgagctgttg tcggagcagc agaaccagac gggaaaccca gctgtga 477
<210> 61
<211> 297
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 61
atgcatggag atacacctac attgcatgaa tatatgttag atttgcaacc agagacaact 60
gatctctact gttatgagca attaaatgac agctcagagg aggaggatga aatagatggt 120
ccagctggac aagcagaacc ggacagagcc cattacaata ttgtaacctt ttgttgcaag 180
tgtgactcta cgcttcggtt gtgcgtacaa agcacacacg tagacattcg tactttggaa 240
gacctgttaa tgggcacact aggaattgtg tgccccatct gttctcagaa accataa 297
<210> 62
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 62
atgagaacag ctcttgggga cattggtaac catggagata cacctacatt gcatgaatat 60
atgttagatt tgcaaccaga gacaactgat ctctactgtt atgagcaatt aaatgacagc 120
tcagaggagg aggatgaaat agatggtcca gctggacaag cagaaccgga cagagcccat 180
tacaatattg taaccttttg ttgcaagtgt gactctacgc ttcggttgtg cgtacaaagc 240
acacacgtag acattcgtac tttggaagac ctgttaatgg gcacactagg aattgtgtgc 300
cccatctgtt ctcagaaacc ataa 324
<210> 63
<211> 296
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 63
atgcacggcg acacccctac cctgcacgag tacatgctgg acctgcagcc tgagacaacc 60
gacctgtact gctacgagca gctgaacgac agcagcgagg aagaggacga gatcgacggc 120
cctgccggcc aggccgagcc tgatagagcc cactacaaca tcgtgacctt ctgctgcaag 180
tgcgacagca ccctgagact gtgcgtgcag agcacacacg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcacctt gggcatcgtg tgccccatct gcagccagaa gccttg 296
<210> 64
<211> 297
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 64
atgcacggcg atacccctac actgcacgag tacatgctgg acctgcagcc tgagacaacc 60
gacctgtact gctacgagca gctgaacgac agcagcgagg aagaggacga gattgacgga 120
cctgccggac aggccgaacc tgatagagcc cactacaata tcgtgacctt ctgctgcaag 180
tgcgacagca ccctgagact gtgtgtgcag agcacccacg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg tgccctatct gtagccagaa gccttga 297
<210> 65
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 65
atgagagtga cagcccctcg gacactgatc ctgctgcttt ctggtgccct ggctctgaca 60
gaaacatggg ccggatctat gcacggcgat acccctacac tgcacgagta catgctggac 120
ctgcagcctg agacaaccga cctgtactgc tacgagcagc tgaacgacag cagcgaggaa 180
gaggacgaga ttgacggacc tgccggacag gccgaacctg atagagccca ctacaatatc 240
gtgaccttct gctgcaagtg cgacagcacc ctgagactgt gtgtgcagag cacccacgtg 300
gacatcagaa ccctggaaga tctgctgatg ggcaccctgg gcatcgtgtg ccctatctgt 360
agccagaagc ctatcgtggg aatcgtggcc ggactggctg tgctggcagt ggtggttatt 420
ggagccgtgg tggccacagt gatgtgcaga agaaagagca gcggcggcaa aggcggcagc 480
tattctcagg ccgcctctag cgattctgcc cagggaagtg atgtgtccct gacagcttga 540
<210> 66
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 66
atgagaacag ctctcggcga catcggcaac atgcacggcg atacccctac actgcacgag 60
tacatgctgg acctgcagcc tgagacaacc gacctgtact gctacgagca gctgaacgac 120
agcagcgagg aagaggacga gattgacgga cctgccggac aggccgaacc tgatagagcc 180
cactacaata tcgtgacctt ctgctgcaag tgcgacagca ccctgagact gtgtgtgcag 240
agcacccacg tggacatcag aaccctggaa gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg 300
tgccctatct gtagccagaa gccttga 327
<210> 67
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 67
atgcacggcg atacccctac actgcacgag tacatgctgg acctgcagcc tgagacaacc 60
gacctgtact gctacgagca gctgaacgac agcagcgagg aagaggacga gattgacgga 120
cctgccggac aggccgaacc tgatagagcc cactacaata tcgtgacctt ctgctgcaag 180
tgcgacagca ccctgagact gtgtgtgcag agcacccacg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg tgccctatct gtagccagaa gcctaaagag 300
aaagagaaga acaagctgaa gcggaagaag ctcgagaaca aggacaagaa ggacgaggaa 360
cggaacaaga tccgggaaga gtga 384
<210> 68
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 68
atgcagctgt gtaccgagct gcagacctac atgctggacc tgcagcctga gacaacctac 60
tgcaagcagc aactgctttg a 81
<210> 69
<211> 531
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 69
atgcagctgt gtaccgagct gcagacctac atgctggacc tgcagcctga gacaacctac 60
tgcaagcagc aactgcttgg cggcggaggc tctcagctct gtactgaact ccagacatat 120
atgctcgatc tccagccaga aaccacgtac tgtaaacagc agctcctcgg aggcggcgga 180
tctcaactgt gcaccgaact gcaaacttat atgttggatc tgcaacccga aaccacatat 240
tgcaagcaac agttgctcgg tggcggtggc agtcagttgt gcacagaact tcagacttac 300
atgcttgatc ttcagcccga aacgacctat tgcaaacagc agcttcttgg cggaggcggc 360
agccagttgt gtactgagct tcaaacttat atgcttgacc tccaaccaga gactacttac 420
tgcaaacaac aactcctcgg cggtggtgga agccagctct gcacggaatt gcagacctat 480
atgctcgact tgcaaccgga aacgacgtac tgcaaacaac agctgctgtg a 531
<210> 70
<211> 297
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 70
atgcacggcg atgcccctgc cctgcacgag tacatgctgg acctgcagcc tgagacaacc 60
gacctgtact gctacgagca gctgaacgac agcagcgagg aagaggacga gattgacgga 120
cctgccggac aggccgaacc tgatagagcc cactacaata tcgtgacctt ctgctgcaag 180
tgcgacagca ccctgagact gtgtgtgcag agcacccacg tggacatcag aaccctggaa 240
gatctgctga tgggcaccct gggcatcgtg tgccctatct gtagccagaa gccttga 297
<210> 71
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 71
atgatggtgg acggcgacaa cagccacgtg gaaatgaagc tggccgtgga cgaggaagag 60
aacgccgaca acaacaccaa ggccaacgtg accaagccta agagatgcag cggcagcatc 120
tgctacggca caatcgccgt gatcgtgttc ttcctgatcg gctttatgat cggctacctg 180
ggctactgca agagcagtga tggacctggc gaaacaggcg gaggcggagg atctggtggc 240
ggaggaagcg gtggcggcgg atcttgtgat ctgcctcaga cacacagcct gggcagcaga 300
cgaacactga tgctgctggc ccagatgcgg aagatcagcc tgttcagctg cctgaaggac 360
cggcacgatt tcggcttccc tcaagaggaa ttcggcaacc agttccagaa ggccgagaca 420
atccctgtgc tgcacgagat gatccagcag atcttcaacc tgttctccac caaggacagc 480
agcgccgcct gggatgagac actgctggac aagttctaca ccgagctgta ccagcagctg 540
aatgacctgg aagcctgcgt gatccaaggc gtgggagtga cagagacacc cctgatgaag 600
gaagatagca tcctggccgt gcgcaagtac ttccagcgga tcaccctgta cctgaaagag 660
aagaagtaca gcccctgcgc ctgggaagtc gtgcgggccg aaatcatgag aagcttcagc 720
ctgagcacca acctgcaaga gagcctgcgg agcaaagagt ga 762
<210> 72
<211> 1836
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 72
atgatggtgg acggcgacaa cagccacgtg gaaatgaagc tggccgtgga cgaggaagag 60
aacgccgaca acaacaccaa ggccaacgtg accaagccta agagatgcag cggcagcatc 120
tgctacggca caatcgccgt gatcgtgttc ttcctgatcg gctttatgat cggctacctg 180
ggctactgca agagcagtga tggacctggc gaaacaggcg gaggcggagg atctggtggc 240
ggaggaagtg gcggcggagg ttctatttgg gagctgaaga aagacgtgta cgtggtggaa 300
ctggactggt atcccgatgc tcctggcgag atggtggtgc tgacctgcga tacccctgaa 360
gaggacggca tcacctggac actggatcag tctagcgagg tgctcggcag cggcaagacc 420
ctgaccatcc aagtgaaaga gtttggcgac gccggccagt acacctgtca caaaggcgga 480
gaagtgctga gccacagcct gctgctgctc cacaagaaag aggatggcat ttggagcacc 540
gacatcctga aggaccagaa agagcccaag aacaagacct tcctgagatg cgaggccaag 600
aactacagcg gccggttcac atgttggtgg ctgaccacca tcagcaccga cctgaccttc 660
agcgtgaagt ccagcagagg cagcagtgat cctcagggcg ttacatgtgg cgccgctaca 720
ctgtctgccg aaagagtgcg gggcgataac aaagaatacg agtacagcgt ggaatgccaa 780
gaggacagcg cctgtccagc cgccgaagag tctctgccta tcgaagtgat ggtcgacgcc 840
gtgcacaagc tgaagtacga gaactacacc agcagctttt tcatccggga catcatcaag 900
cccgatcctc caaagaacct gcagctgaag cctctgaaga acagcagaca ggtggaagtg 960
tcctgggagt accccgacac ctggtctaca ccccacagct acttcagcct gaccttttgc 1020
gtgcaagtgc agggcaagtc caagcgcgag aaaaaggacc gggtgttcac cgacaagacc 1080
agcgccaccg tgatctgcag aaagaacgcc agcatcagcg tcagagccca ggaccggtac 1140
tacagcagct cttggagcga atgggccagc gtgccatgta gcggaggtgg tggtagcgga 1200
ggcggcggaa gcggcggtgg tggatcaggt ggtggtggct ctagaaacct gccagtggct 1260
acccctgatc ctggcatgtt cccttgtctg caccacagcc agaacctgct gagagccgtg 1320
tccaacatgc tgcagaaggc cagacagacc ctggaattct acccctgcac cagcgaggaa 1380
atcgaccacg aggacatcac caaggataag accagcaccg tggaagcctg cctgcctctg 1440
gaactgacca agaacgagag ctgcctgaac agccgggaaa cctccttcat caccaacggc 1500
tcttgcctgg ccagcagaaa gacaagcttc atgatggccc tgtgcctgag cagcatctac 1560
gaggacctga agatgtacca ggtggaattc aagaccatga acgccaagct gctgatggac 1620
cccaagcggc agatcttcct ggaccagaac atgctggctg tgatcgacga gctgatgcag 1680
gccctgaact tcaacagcga gacagtgccc cagaagtcta gcctggaaga acccgacttc 1740
tacaagacca agatcaagct gtgcatcctg ctgcacgcct tccggatcag agccgtgacc 1800
atcgacagag tgatgagcta cctgaacgcc tcctga 1836
<210> 73
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 73
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 74
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 74
Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
<210> 75
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> VARIANT
<222> 1, 2, 3, 4, 5
<223> 可以以任何数量的重复序列存在
<400> 75
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 76
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> VARIANT
<222> 1, 2, 3, 4, 5
<223> 可以以任何数量的重复序列存在
<400> 76
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 77
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 77
Met Met Val Asp Gly Asp Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val
1 5 10 15
Asp Glu Glu Glu Asn Ala Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys
20 25 30
Pro Lys Arg Cys Ser Gly Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile
35 40 45
Val Phe Phe Leu Ile Gly Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys
50 55 60
Ser Ser Asp Gly Pro Gly Glu Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys
85 90 95
Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile
100 105 110
Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu
115 120 125
Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu
130 135 140
Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu
145 150 155 160
Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn
165 170 175
Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met
180 185 190
Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg
195 200 205
Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu
210 215 220
<210> 78
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 78
Met Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly Leu Cys Leu Leu Val
1 5 10 15
Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Gly Leu Gly Met
20 25 30
Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser
50 55 60
Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln
65 70 75 80
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg
85 90 95
Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys
100 105 110
His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu
115 120 125
Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile
130 135 140
Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
145 150 155 160
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu
165 170 175
Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
180 185 190
<210> 79
<211> 611
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 79
Met Met Val Asp Gly Asp Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val
1 5 10 15
Asp Glu Glu Glu Asn Ala Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys
20 25 30
Pro Lys Arg Cys Ser Gly Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile
35 40 45
Val Phe Phe Leu Ile Gly Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys
50 55 60
Ser Ser Asp Gly Pro Gly Glu Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val
85 90 95
Tyr Val Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val
100 105 110
Val Leu Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu
115 120 125
Asp Gln Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln
130 135 140
Val Lys Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly
145 150 155 160
Glu Val Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly
165 170 175
Ile Trp Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys
180 185 190
Thr Phe Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys
195 200 205
Trp Trp Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser
210 215 220
Ser Arg Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr
225 230 235 240
Leu Ser Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser
245 250 255
Val Glu Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu
260 265 270
Pro Ile Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn
275 280 285
Tyr Thr Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro
290 295 300
Lys Asn Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val
305 310 315 320
Ser Trp Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser
325 330 335
Leu Thr Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys
340 345 350
Asp Arg Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys
355 360 365
Asn Ala Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser
370 375 380
Trp Ser Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
385 390 395 400
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn
405 410 415
Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His
420 425 430
Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg
435 440 445
Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu
450 455 460
Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu
465 470 475 480
Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe
485 490 495
Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met
500 505 510
Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val
515 520 525
Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln
530 535 540
Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln
545 550 555 560
Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu
565 570 575
Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His
580 585 590
Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu
595 600 605
Asn Ala Ser
610
<210> 80
<211> 253
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 80
Met Met Val Asp Gly Asp Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val
1 5 10 15
Asp Glu Glu Glu Asn Ala Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys
20 25 30
Pro Lys Arg Cys Ser Gly Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile
35 40 45
Val Phe Phe Leu Ile Gly Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys
50 55 60
Ser Ser Asp Gly Pro Gly Glu Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser
85 90 95
Leu Gly Ser Arg Arg Thr Leu Met Leu Leu Ala Gln Met Arg Lys Ile
100 105 110
Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln
115 120 125
Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln Lys Ala Glu Thr Ile Pro Val Leu
130 135 140
His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser
145 150 155 160
Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu
165 170 175
Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly
180 185 190
Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg
195 200 205
Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser
210 215 220
Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser
225 230 235 240
Leu Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu
245 250
<210> 81
<211> 73
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 81
Met Met Val Asp Gly Asp Asn Ser His Val Glu Met Lys Leu Ala Val
1 5 10 15
Asp Glu Glu Glu Asn Ala Asp Asn Asn Thr Lys Ala Asn Val Thr Lys
20 25 30
Pro Lys Arg Cys Ser Gly Ser Ile Cys Tyr Gly Thr Ile Ala Val Ile
35 40 45
Val Phe Phe Leu Ile Gly Phe Met Ile Gly Tyr Leu Gly Tyr Cys Lys
50 55 60
Ser Ser Asp Gly Pro Gly Glu Thr Gly
65 70
<210> 82
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 82
Met Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly Leu Cys Leu Leu Val
1 5 10 15
Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly Leu Gly Leu Gly Met
20 25 30
Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Thr Gly
35 40
<210> 83
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 83
atgagcctgc tgaccgaagt ggaaacctat gtgctgagca ttgtgccgag cggcccgctg 60
aaagcggaaa ttgcgcagcg cctggaagat gtgtttgcgg gcaaaaacac cgatctggaa 120
gtgctgatgg aatggctgaa aacccgcccg attctgagcc cgctgaccaa aggcattctg 180
ggctttgtgt ttaccctgac cgtgccgagc gaacgcggcc tgcagcgccg ccgctttgtg 240
cagaacgcgc tgaacggcaa cggcgatccg aacaacatgg ataaagcggt gaaactgtat 300
cgcaaactga aacgcgaaat tacctttcat ggcgcgaaag aaattgcgct gagctatagc 360
gcgggcgcgc tggcgagctg catgggcctg atttataacc gcatgggcgc ggtgaccacc 420
gaagtggcgt ttggcctggt gtgcgcgacc tgcgaacaga ttgcggatag ccagcatcgc 480
agccatcgcc agatggtgac caccaccaac ccgctgattc gccatgaaaa ccgcatggtg 540
ctggcgagca ccaccgcgaa agcgatggaa cagatggcgg gcagcagcga acaggcggcg 600
gaagcgatgg atattgcgag ccaggcgcgc cagatggtgc aggcgatgcg caccattggc 660
acccatccga gcagcagcgc gggcctgaaa gatgatctgc tggaaaacct gcaggcgtat 720
cagaaacgca tgggcgtgca gatgcagcgc tttaaa 756
<210> 84
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 84
atgtctctgc tgaccgaggt cgagacatac gtgctgagca tcgtgcctag cggccctctg 60
aaggccgaga tcgcccagag actggaagat gtgttcgccg gcaagaacac cgacctggaa 120
gtgctgatgg aatggctgaa aaccagacct atcctgagcc ccctgacaaa gggcatcctg 180
ggcttcgtgt tcaccctgac cgtgccaagc gagagaggcc tgcagcgcag aaggttcgtg 240
cagaacgccc tcaacggcaa tggcgacccc aacaacatgg ataaggctgt gaagctgtat 300
agaaagctga aaagagagat cacatttcac ggcgctaaag agattgccct ctcctacagc 360
gccggagccc tggcttcttg tatgggactg atctacaaca gaatgggagc cgtgaccacc 420
gaggtggcct tcggcctggt gtgcgccaca tgcgagcaaa tcgcagatag ccagcacaga 480
agccatcggc agatggtcac cacaacaaac cctctgatcc ggcacgagaa ccggatggtg 540
ctggccagca ccaccgccaa ggccatggaa cagatggccg gcagctctga gcaggccgct 600
gaagccatgg acatcgccag ccaggctaga cagatggttc aggccatgag aaccatcggc 660
acccaccctt ctagctccgc cggactgaag gacgacctgc tggaaaatct gcaagcctac 720
cagaagcgga tgggcgtgca gatgcagcgg tttaagtag 759
<210> 85
<211> 1686
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 85
atggaaagca gaggcagacg gtgccccgag atgatctctg tgctgggccc tatctctggc 60
cacgtgctga aggccgtgtt cagcagaggc gatacacctg tgctgcccca cgagacaaga 120
ctgctgcaga caggcatcca tgtgcgggtg tcacagccta gcctgatcct ggtgtctcag 180
tacacccctg acagcacccc ttgtcacaga ggcgacaatc agctgcaggt ccagcacacc 240
tacttcaccg gcagcgaggt ggaaaacgtg tccgtgaacg tgcacaatcc caccggcaga 300
tccatctgtc ccagccaaga gcctatgagc atctacgtgt acgccctgcc tctgaagatg 360
ctgaacatcc ccagcatcaa tgtgcatcac tacccctctg ccgccgagcg gaaacacaga 420
catctgcctg tggccgatgc cgtgattcac gcctctggca aacagatgtg gcaggccaga 480
ctgacagtgt ccggactggc ttggaccaga cagcagaacc agtggaaaga acccgacgtg 540
tactacacca gcgccttcgt gttccccacc aaggatgtgg ccctgagaca cgttgtgtgc 600
gcccacgaac tcgtgtgcag catggaaaac acccgggcca ccaagatgca agtgatcggc 660
gaccagtacg tgaaggtgta cctggaaagc ttctgcgagg atgtgcccag cggcaagctg 720
ttcatgcacg tgacactggg ctccgacgtg gaagaggacc tgaccatgac cagaaatccc 780
cagcctttca tgcggcctca cgagagaaat ggcttcaccg tgctgtgccc caagaacatg 840
atcatcaagc ccggcaagat cagccacatc atgctggacg tggccttcac cagccacgag 900
cactttggac tgctgtgtcc taagagcatc cccggcctga gcatcagcgg caacctgctg 960
atgaatggcc agcagatctt cctggaagtg caggccatcc gggaaaccgt ggaactgaga 1020
cagtacgacc ctgtggctgc cctgttcttc ttcgacatcg acctgctgct ccagagaggc 1080
cctcagtact ctgagcaccc cacctttacc agccagtacc ggatccaggg aaagctggaa 1140
taccggcaca cctgggatag acacgatgaa ggtgctgccc agggcgacga tgatgtgtgg 1200
acaagcggca gcgatagcga cgaggaactg gtcaccaccg agagaaagac ccctagagtt 1260
acaggcggag gcgctatggc tggcgcctct acatctgccg gacggaagag aaagagcgcc 1320
tcttctgcca ccgcctgtac aagcggcgtg atgacaagag gcaggctgaa agccgagagc 1380
acagtggccc ctgaagagga cacagacgag gacagcgaca acgagattca caaccccgcc 1440
gtgtttacct ggcctccttg gcaggctgga atcctggcca gaaacctggt gcctatggtg 1500
gccacagtgc agggccagaa cctgaagtac caagagttct tctgggacgc caacgacatc 1560
taccggatct tcgccgaact ggaaggcgtg tggcaaccag ccgctcagcc taagagaaga 1620
aggcacagac aagacgctct gcccggacct tgtatcgcca gcactcccaa gaagcacaga 1680
ggctga 1686
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 86
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 87
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 87
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 88
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 89
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 89
Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe Thr Val Leu
1 5 10
<210> 90
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 90
Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met
1 5 10
<210> 91
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 91
Tyr Ser Glu His Pro Thr Phe Thr Ser Gln Tyr
1 5 10
<210> 92
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 92
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5
<210> 93
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 93
Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
1 5 10
Claims (288)
1.一种用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
2.一种用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白质或其片段进一步包括一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序，从而产生所述蛋白质与所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序的融合蛋白。
4.一种用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
5.一种用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述mRNA的核苷酸序列被密码子优化以在所述有核细胞中表达。
7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中所述mRNA包括一个或多个编码免疫蛋白酶体靶向基序的核酸序列，其中所述mRNA的翻译产生所述蛋白质与所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序的融合蛋白。
8.根据权利要求3或6所述的方法，其中与在不存在免疫蛋白酶体靶向基序的情况下所述细胞中的所述蛋白质的降解和/或源自所述蛋白质的肽在所述细胞的表面上的呈递相比，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序增强所述细胞中的所述蛋白质的降解和/或源自所述蛋白质的肽在所述细胞的表面上的呈递。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序位于所述融合蛋白的N末端和/或C末端。
10.根据权利要求7至9所述的方法，其中所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序是破坏盒(D-盒)结构域、KEKE结构域和/或sec/MITD结构域。
11.根据权利要求4至10中任一项所述的方法，其中所述mRNA的一个或多个残基被修饰。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述mRNA的一个或多个残基是硫代磷酸酯残基、假尿苷残基、N1-甲基腺苷残基、5-甲基胞苷残基或吗啉代残基。
13.一种用于刺激个体的免疫应答的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括源自蛋白质的两种或更多种抗原；其中所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
14.一种用于对有需要的个体进行疫苗接种的方法，所述方法包括向个体施用有效量的包括有核细胞的组合物，其中所述有核细胞包括源自蛋白质的两种或更多种抗原；其中所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述细胞包括源自所述蛋白质的三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或多于十种抗原。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，其中所述抗原中的至少两种抗原包括部分重叠的氨基酸序列。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所有抗原的组合氨基酸序列与所述蛋白质的氨基酸序列重叠约90％或更多。
18.根据权利要求13至17中任一项所述的方法，其中所述抗原是多肽，所述多肽包括所述蛋白质的两个或更多个表位。
19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述抗原是多肽，所述多肽包括所述蛋白质的一个或多个表位和一个或多个异源肽序列。
20.根据权利要求13至19中任一项所述的方法，其中一个或多个表位在N末端和/或C末端上侧接有一个或多个异源肽序列。
21.根据权利要求20所述的方法，其中N末端和/或C末端侧接多肽源自免疫原性合成长肽(SLP)。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述N末端和/或C末端侧接多肽源自疾病相关免疫原性SLP。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、癌基因、新抗原、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白的产物。
24.根据权利要求1、3、4、6至13、15至23中任一项所述的方法，其中所述刺激个体的免疫应答用于治疗癌症、传染性疾病或病毒相关疾病。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述病毒相关疾病是与人乳头瘤病毒(HPV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、单纯疱疹病毒(HSV-2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、人疱疹病毒6(HHV-6)、人疱疹病毒7(HHV-7)、人疱疹病毒8(HHV-8)、巨细胞病毒(CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein Barr virus，EBV)或流感相关的疾病。
26.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述HPV是HPV-16或HPV-18。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中所述蛋白质是HPV E6或HPV E7蛋白。
29.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述HBV蛋白是核心蛋白、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述组合物进一步包括佐剂。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述组合物与佐剂结合施用。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR 9激动剂。
34.根据权利要求1至3和23至33中任一项所述的方法，其中包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞通过以下制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段的有核细胞。
35.根据权利要求4至11中任一项所述的方法，其中包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的所述有核细胞通过以下制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的有核细胞。
36.根据权利要求12至33中任一项所述的方法，其中包括两种或更多种抗原的所述有核细胞通过以下制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述两种或更多种抗原通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育，以允许所述两种或更多种抗原进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括两种或更多种抗原的有核细胞。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育。
38.根据权利要求34至36中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育。
39.根据权利要求34至38中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。
40.根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约3.0μm至约4.2μm、或约3.0μm至约4.8μm、或约3.0μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。
41.根据权利要求34至40中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm。
42.根据权利要求34至41中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约4.5μm或约4.0μm。
43.根据权利要求34至42中任一项所述的方法，其中包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其中所述有核细胞对于所述个体是自体的或同种异体的。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的方法，其中所述有核细胞是免疫细胞。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其中所述有核细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的方法，其中所述有核细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。
49.根据权利要求1至48中任一项所述的方法，其中用佐剂调节所述有核细胞以形成经调节的细胞。
50.根据权利要求49所述的方法，其中将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时至约24小时、约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以对所述细胞进行调节。
51.根据权利要求49或50所述的方法，其中在将所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA引入到所述有核细胞中之前或之后调节所述有核细胞。
52.根据权利要求49至51中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR 9激动剂。
53.根据权利要求48至51中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。
54.根据权利要求49至53中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG7909。
55.根据权利要求49至54中任一项所述的方法，其中所述经调节的细胞是经调节的多个PBMC。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述多个PBMC被修饰以增加共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的表达。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。
58.根据权利要求56所述的方法，其中所述共刺激分子是CD86。
59.根据权利要求55至58中任一项所述的方法，其中所述多个PBMC被修饰以增加一种或多种细胞因子的表达。
60.根据权利要求55至59中任一项所述的方法，其中所述多个PBMC被修饰以包括嵌合膜结合细胞因子。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述嵌合膜结合细胞因子是包括所述细胞因子和跨膜结构域的融合蛋白。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述肽连接子是(G4S)3(SEQ IDNO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。
64.根据权利要求59至63中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是I型细胞因子。
65.根据权利要求59至64中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β或IL-21或其功能变体。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述细胞因子是IL-2或其功能变体和/或IL-12或其功能变体。
67.根据权利要求60至65中任一项所述的方法，其中所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQID NO:77-80的氨基酸序列。
68.根据权利要求56至67中任一项所述的方法，其中所述多个PBMC被修饰以增加一种或多种细胞因子和/或一种或多种共刺激分子的表达。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述多个PBMC包括一种或多种细胞因子和/或共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的增加的表达，其中所述多个PBMC通过包括以下的方法制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中所述mRNA被表达，由此产生包括所述蛋白质或其片段、所述一种或多种细胞因子和/或所述一种或多种共刺激分子的有核细胞。
70.根据权利要求68所述的方法，其中所述多个PBMC包括一种或多种细胞因子和/或共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的增加的表达，其中所述多个PBMC通过包括以下的方法制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中所述mRNA被表达，由此产生包括所述蛋白质或其片段、所述一种或多种细胞因子和/或所述一种或多种共刺激分子的有核细胞。
71.根据权利要求68所述的方法，其中所述多个PBMC包括一种或多种细胞因子和/或共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的增加的表达，其中所述多个PBMC通过包括以下的方法制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述两种或更多种抗原以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述两种或更多种抗原以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA一起温育，以允许所述两种或更多种抗原以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中所述mRNA被表达，由此产生包括两种或更多种抗原、所述一种或多种细胞因子和/或所述一种或多种共刺激分子的有核细胞。
72.根据权利要求69至71中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述两种或更多种抗原、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育。
73.根据权利要求69至71中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述两种或更多种抗原、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育。
74.根据权利要求55至73中任一项所述的方法，其中与多个未经调节的PBMC中的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个PBMC的所述B细胞中上调，其中所述共刺激分子是CD80和/或CD86。
75.根据权利要求55至74中任一项所述的方法，其中与多个未经调节的PBMC相比，所述多个PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的增加的表达。
76.根据权利要求75所述的方法，其中IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达比所述多个未经调节的PBMC的表达增加超过约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超过10倍。
77.根据权利要求1至76中任一项所述的方法，其中包括有核细胞的所述组合物被施用多次。
78.根据权利要求1至77中任一项所述的方法，其中所述组合物被静脉内施用。
79.根据权利要求1至78中任一项所述的方法，其中所述个体是人。
80.根据权利要求1至79中任一项所述的方法，其中在施用另一种疗法之前、同时或之后施用所述组合物。
81.根据权利要求80所述的方法，其中另一种疗法是用于免疫肿瘤疗法的化学疗法、放射疗法、抗体、细胞因子、免疫检查点抑制剂或双特异性多肽。
82.一种组合物，其包括有核细胞，其中所述有核细胞包括蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
83.根据权利要求82所述的组合物，其中所述蛋白质或其片段进一步包括一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序，从而产生所述蛋白质与所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序的融合蛋白。
84.一种组合物，其包括有核细胞，其中所述有核细胞包括编码蛋白质或其片段的mRNA；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
85.根据权利要求84所述的组合物，其中所述mRNA的核苷酸序列被密码子优化以在所述有核细胞中表达。
86.根据权利要求84或85所述的组合物，其中所述mRNA包括一个或多个编码免疫蛋白酶体靶向基序的核酸序列，其中所述mRNA的翻译产生所述蛋白质与所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序的融合蛋白。
87.根据权利要求83或86所述的组合物，其中与在不存在免疫蛋白酶体靶向基序的情况下所述细胞中的所述蛋白质的降解和/或源自所述蛋白质的肽在所述细胞的表面上的呈递相比，所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序增强所述细胞中的所述蛋白质的降解和/或源自所述蛋白质的肽在所述细胞的表面上的呈递。
88.根据权利要求87所述的组合物，其中所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序位于所述融合蛋白的N末端和/或C末端。
89.根据权利要求86至88所述的组合物，其中所述一个或多个免疫蛋白酶体靶向基序是破坏盒(D-盒)结构域、KEKE结构域和/或sec/MITD结构域。
90.根据权利要求84至89中任一项所述的组合物，其中所述mRNA的一个或多个残基被修饰。
91.根据权利要求90所述的组合物，其中所述mRNA的一个或多个残基是硫代磷酸酯残基、假尿苷残基、N1-甲基腺苷残基、5-甲基胞苷残基或吗啉代残基。
92.一种组合物，其包括有核细胞，其中所述有核细胞包括源自蛋白质的两种或更多种抗原；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
93.根据权利要求92所述的组合物，其中所述细胞包括源自所述蛋白质的三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或多于十种抗原。
94.根据权利要求92或93所述的组合物，其中所述抗原中的至少两种抗原包括部分重叠的氨基酸序列。
95.根据权利要求94所述的组合物，其中所有抗原的组合氨基酸序列与所述蛋白质的氨基酸序列重叠约90％或更多。
96.根据权利要求92至95中任一项所述的组合物，其中抗原是多肽，所述多肽包括所述蛋白质的两个或更多个表位。
97.根据权利要求92至96中任一项所述的组合物，其中抗原是多肽，所述多肽包括所述蛋白质的一个或多个表位和一个或多个异源肽序列。
98.根据权利要求92至97中任一项所述的组合物，其中一个或多个表位在N末端和/或C末端上侧接有一个或多个异源肽序列。
99.根据权利要求98所述的组合物，其中N末端和/或C末端侧接多肽源自免疫原性合成长肽(SLP)。
100.根据权利要求99所述的组合物，其中所述N末端和/或C末端侧接多肽源自疾病相关免疫原性SLP。
101.根据权利要求82至100中任一项所述的组合物，其中所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、癌基因、新抗原、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白的产物。
102.根据权利要求82至101中任一项所述的组合物，其中所述刺激个体的免疫应答用于治疗癌症、传染性疾病或病毒相关疾病。
103.根据权利要求102所述的组合物，其中所述病毒相关疾病是与人乳头瘤病毒(HPV)、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、单纯疱疹病毒(HSV-2)、水痘-带状疱疹病毒(VZV)、人疱疹病毒6(HHV-6)、人疱疹病毒7(HHV-7)、人疱疹病毒8(HHV-8)、巨细胞病毒(CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)或流感相关的疾病。
104.根据权利要求82至103中任一项所述的组合物，其中蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。
105.根据权利要求104所述的组合物，其中所述HPV是HPV-16或HPV-18。
106.根据权利要求104或105所述的组合物，其中所述蛋白质是HPV E6或HPV E7蛋白。
107.根据权利要求82至103中任一项所述的组合物，其中所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。
108.根据权利要求107所述的组合物，其中所述HBV蛋白是核心蛋白、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
109.根据权利要求82至108中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括佐剂。
110.根据权利要求109所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR 9激动剂。
111.根据权利要求82和101至110中任一项所述的组合物，其中包括所述蛋白质或其片段的所述有核细胞通过以下制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段的有核细胞。
112.根据权利要求84至91和101至110中任一项所述的组合物，其中包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的所述有核细胞通过以下制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的有核细胞。
113.根据权利要求92至110中任一项所述的组合物，其中包括两种或更多种抗原的所述有核细胞通过以下制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述两种或更多种抗原通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育，以允许所述两种或更多种抗原进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括两种或更多种抗原的有核细胞。
114.根据权利要求111至113中任一项所述的组合物，其中制备所述有核细胞的方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育。
115.根据权利要求111至113中任一项所述的组合物，其中所述制备所述有核细胞的方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育。
116.根据权利要求111至115中任一项所述的组合物，其中所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。
117.根据权利要求111至116中任一项所述的组合物，其中所述收缩部的宽度为约3.0μm至约4.2μm、或约3.0μm至约4.8μm、或约3.0μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。
118.根据权利要求111至117中任一项所述的组合物，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm。
119.根据权利要求111至118中任一项所述的组合物，其中所述收缩部的宽度为约4.5μm或约4.0μm。
120.根据权利要求111至119中任一项所述的组合物，其中包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
121.根据权利要求82至120中任一项所述的组合物，其中所述有核细胞对于所述个体是自体的或同种异体的。
122.根据权利要求82至121中任一项所述的组合物，其中所述有核细胞是免疫细胞。
123.根据权利要求82至122中任一项所述的组合物，其中所述有核细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。
124.根据权利要求123所述的组合物，其中所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。
125.根据权利要求82至124中任一项所述的组合物，其中所述有核细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。
126.根据权利要求82至125中任一项所述的组合物，其中用佐剂调节所述有核细胞以形成经调节的细胞。
127.根据权利要求126所述的组合物，其中将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时至约24小时、约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以对所述细胞进行调节。
128.根据权利要求126或127所述的组合物，其中在将所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA引入到所述有核细胞中之前或之后调节所述有核细胞。
129.根据权利要求126至128中任一项所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR 9激动剂。
130.根据权利要求126至129中任一项所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。
131.根据权利要求126至130中任一项所述的组合物，其中所述佐剂是CpG 7909。
132.根据权利要求126至131中任一项所述的组合物，其中所述经调节的细胞是经调节的多个PBMC。
133.根据权利要求132所述的组合物，其中所述多个PBMC被修饰以增加共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的表达。
134.根据权利要求133所述的组合物，其中所述共刺激分子是B7-H2(ICOSL)、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD70、LIGHT、HVEM、CD40、4-1BBL、OX40L、TL1A、GITRL、CD30L、TIM4、SLAM、CD48、CD58、CD155或CD112。
135.根据权利要求134所述的组合物，其中所述共刺激分子是CD86。
136.根据权利要求132至135中任一项所述的组合物，其中所述多个PBMC被修饰以增加一种或多种细胞因子的表达。
137.根据权利要求132至136中任一项所述的组合物，其中所述多个PBMC被修饰以包括嵌合膜结合细胞因子。
138.根据权利要求137所述的组合物，其中所述嵌合膜结合细胞因子是包括所述细胞因子和跨膜结构域的融合蛋白。
139.根据权利要求138所述的组合物，其中所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。
140.根据权利要求139所述的组合物，其中所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。
141.根据权利要求136至140中任一项所述的组合物，其中所述细胞因子是I型细胞因子。
142.根据权利要求136至141中任一项所述的组合物，其中所述细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β或IL-21或其功能变体。
143.根据权利要求142所述的方法，其中所述细胞因子是IL-2或其功能变体和/或IL-12或其功能变体。
144.根据权利要求137至143中任一项所述的组合物，其中所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列。
145.根据权利要求133至144中任一项所述的组合物，其中所述多个PBMC被修饰以增加一种或多种细胞因子和/或一种或多种共刺激分子的表达。
146.根据权利要求145所述的组合物，其中所述多个PBMC包括一种或多种细胞因子和/或共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的增加的表达，其中所述多个PBMC通过包括以下的方法制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中所述mRNA被表达，由此产生包括所述蛋白质或其片段、所述一种或多种细胞因子和/或所述一种或多种共刺激分子的有核细胞。
147.根据权利要求145所述的组合物，其中所述多个PBMC包括一种或多种细胞因子和/或共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的增加的表达，其中所述多个PBMC通过包括以下的方法制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中所述mRNA被表达，由此产生包括所述蛋白质或其片段、所述一种或多种细胞因子和/或所述一种或多种共刺激分子的有核细胞。
148.根据权利要求145所述的组合物，其中所述多个PBMC包括一种或多种细胞因子和/或共刺激分子中的一种或多种共刺激分子的增加的表达，其中所述多个PBMC通过包括以下的方法制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述两种或更多种抗原以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述两种或更多种抗原以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA一起温育，以允许所述两种或更多种抗原以及编码一种或多种细胞因子的一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的一种或多种mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；其中所述mRNA被表达，由此产生包括两种或更多种抗原、所述一种或多种细胞因子和/或所述一种或多种共刺激分子的有核细胞。
149.根据权利要求146至148中任一项所述的组合物，其中所述制备所述多个PBMC的方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述多个PBMC与所述蛋白质或其片段、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述多个PBMC与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述多个PBMC与所述两种或更多种抗原、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育。
150.根据权利要求146至148中任一项所述的组合物，其中所述制备所述多个PBMC的方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述多个PBMC与所述蛋白质或其片段、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述多个PBMC与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述多个PBMC与所述两种或更多种抗原、编码一种或多种细胞因子的所述一种或多种mRNA和/或编码一种或多种共刺激分子的所述一种或多种mRNA一起温育。
151.根据权利要求132至150中任一项所述的组合物，其中与多个未经调节的PBMC中的所述B细胞相比，一种或多种共刺激分子在所述经调节的多个PBMC的所述B细胞中上调，其中所述共刺激分子是CD80和/或CD86。
152.根据权利要求132至151中任一项所述的组合物，其中与多个未经调节的PBMC相比，所述多个PBMC具有IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的增加的表达。
153.根据权利要求152所述的组合物，其中IFN-γ、IL-6、MCP-1、MIP-1β、IP-10或TNF-α中的一种或多种的表达比所述多个未经调节的PBMC的表达增加超过约1.2倍、1.5倍、1.8倍、2倍、3倍、4倍、5倍、8倍或超过10倍。
154.一种用于刺激个体的免疫应答的组合物，其中所述组合物包括有效量的根据权利要求82至153中任一项所述的组合物；其中所述组合物以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
155.一种用作药物的组合物，其中所述组合物包括有效量的根据权利要求82至153中任一项所述的组合物。
156.一种用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的组合物，其中所述组合物包括有效量的根据权利要求82至153中任一项所述的组合物。
157.根据权利要求154至156中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包括佐剂。
158.根据权利要求154至157中任一项所述的组合物，其中所述组合物与佐剂结合施用。
159.根据权利要求157或158所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。
160.根据权利要求157至159中任一项所述的组合物，其中包括有核细胞的所述组合物被施用多次。
161.根据权利要求157至160中任一项所述的组合物，其中所述组合物被静脉内施用。
162.根据权利要求157至161中任一项所述的组合物，其中所述个体是人。
163.根据权利要求157至162中任一项所述的组合物，其中在施用另一种疗法之前、同时或之后施用所述组合物。
164.根据权利要求163所述的组合物，其中另一种疗法是用于免疫肿瘤疗法的化学疗法、放射疗法、抗体、细胞因子、免疫检查点抑制剂或双特异性多肽。
165.一种组合物在制备用于刺激个体的免疫应答的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的根据权利要求82至153中任一项所述的组合物；其中所述组合物以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
166.一种组合物在制备用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的药物中的用途，其中所述组合物包括有效量的根据权利要求82至153中任一项所述的组合物。
167.根据权利要求165或166所述的用途，其中所述组合物进一步包括佐剂。
168.根据权利要求165至167中任一项所述的组合物，其中所述组合物被调配用于与佐剂结合施用。
169.根据权利要求167或168所述的用途，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、α-半乳糖神经酰胺、STING激动剂、环状二核苷酸(CDN)、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。
170.根据权利要求167至169中任一项所述的用途，其中包括有核细胞的所述组合物被施用多次。
171.根据权利要求167至170中任一项所述的用途，其中所述组合物被静脉内施用。
172.根据权利要求167至171中任一项所述的用途，其中所述个体是人。
173.根据权利要求167至172中任一项所述的用途，其中在施用另一种疗法之前、同时或之后施用所述组合物。
174.根据权利要求173所述的用途，其中另一种疗法是用于免疫肿瘤疗法的化学疗法、放射疗法、抗体、细胞因子、免疫检查点抑制剂或双特异性多肽。
175.一种试剂盒，其在根据权利要求1至81中任一项所述的方法中使用。
176.一种试剂盒，其包括根据权利要求82至153中任一项所述的组合物。
177.根据权利要求175或176所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括以下中的一种或多种：缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器或具有用于向个体施用所述组合物来以HLA未知的方式刺激免疫应答的说明的包装插页。
178.一种用于产生有核细胞的方法，所述有核细胞包括蛋白质或其片段；所述方法包括将所述蛋白质或其片段引入到所述有核细胞中，其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
179.一种用于产生有核细胞的方法，所述有核细胞包括蛋白质或其片段；所述方法包括将编码所述蛋白质或其片段的mRNA引入到所述有核细胞中，其中所述mRNA被表达以产生所述蛋白质或其片段；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
180.一种用于产生有核细胞的方法，所述有核细胞包括来自蛋白质的两种或更多种抗原；所述方法包括将所述两种或更多种抗原引入到所述有核细胞中；其中所述蛋白质或其片段以HLA未知的方式刺激个体的免疫应答。
181.根据权利要求178所述的方法，其中将所述蛋白质或其片段细胞内引入到所述有核细胞包括：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述蛋白质或其片段通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育，以允许所述蛋白质或其片段进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括所述蛋白质或其片段的有核细胞。
182.根据权利要求179所述的方法，其中包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的所述有核细胞通过以下制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育，以允许编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA的有核细胞。
183.根据权利要求180所述的方法，其中包括两种或更多种抗原的所述有核细胞通过以下制备：
a)使包括输入有核细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入有核细胞的直径的函数，由此使所述输入有核细胞的扰动足够大以使所述两种或更多种抗原通过以形成扰动的输入有核细胞；以及
b)将所述扰动的输入有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育，以允许所述两种或更多种抗原进入所述扰动的输入有核细胞；由此产生包括两种或更多种抗原的有核细胞。
184.根据权利要求181至183中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育。
185.根据权利要求181至183中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述蛋白质或其片段一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA一起温育；或
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述有核细胞与所述两种或更多种抗原一起温育。
186.根据权利要求181至185中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。
187.根据权利要求181至186中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm至约4.2μm、或约3.5μm至约4.8μm、或约3.5μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。
188.根据权利要求181至187中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm。
189.根据权利要求181至188中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约4.5μm。
190.根据权利要求181至189中任一项所述的方法，其中包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
191.根据权利要求178至190中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括用佐剂调节所述有核细胞以形成经调节的细胞。
192.根据权利要求191所述的方法，其中将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时至约24小时、约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以对所述细胞进行调节。
193.根据权利要求191或192所述的方法，其中在将所述蛋白质或其片段、编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA或来自蛋白质的所述两种或更多种抗原引入到所述有核细胞中之前或之后调节所述有核细胞。
194.一种用于增强免疫细胞的活性的方法，所述方法包括在所述免疫细胞中表达编码嵌合膜结合细胞因子的核酸。
195.根据权利要求193所述的方法，其中所述嵌合膜结合细胞因子是包括跨膜结构域和细胞因子的融合蛋白。
196.根据权利要求194或195所述的方法，其中所述跨膜结构域是转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)或肿瘤坏死因子跨膜结构域。
197.根据权利要求194至196中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是I型细胞因子。
198.根据权利要求194至197中任一项所述的方法，其中所述细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β或IL-21或其功能变体。
199.根据权利要求194至198中任一项所述的方法，其中所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。
200.根据权利要求199所述的方法，其中所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。
201.根据权利要求194至200中任一项所述的方法，其中所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列。
202.根据权利要求194至201中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞进一步包括抗原。
203.根据权利要求194至201中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞进一步包括编码抗原的mRNA。
204.根据权利要求202或203所述的方法，其中所述抗原是蛋白质或其片段，其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
205.根据权利要求194至201中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞进一步包括源自蛋白质的两种或更多种抗原。
206.根据权利要求205所述的方法，其中所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
207.根据权利要求204至206中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、癌基因、新抗原、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白的产物。
208.根据权利要求204至207中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。
209.根据权利要求208所述的方法，其中所述HPV是HPV-16或HPV-18。
210.根据权利要求208或209所述的方法，其中所述蛋白质是HPV E6或HPV E7蛋白。
211.根据权利要求204至207中任一项所述的方法，其中所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。
212.根据权利要求211所述的方法，其中所述HBV蛋白是核心蛋白、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
213.根据权利要求194至212中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。
214.根据权利要求213所述的方法，其中所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。
215.根据权利要求194至214中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。
216.根据权利要求194至215中任一项所述的方法，其中用佐剂调节所述有核细胞以形成经调节的细胞。
217.根据权利要求216所述的方法，其中将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时至约24小时、约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以对所述细胞进行调节。
218.根据权利要求216或217所述的方法，其中在将所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA引入到所述有核细胞中之前或之后调节所述有核细胞。
219.根据权利要求216至218中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR9激动剂。
220.根据权利要求216至219中任一项所述的方法，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。
221.根据权利要求194至220中任一项所述的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子的免疫细胞。
222.根据权利要求221所述的方法，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸是编码所述嵌合膜结合细胞因子的mRNA。
223.根据权利要求202、204和207至222中任一项所述的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子和抗原的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸和所述抗原进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。
224.根据权利要求203、204和207至222所述的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子和编码蛋白质或其片段的mRNA的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸和编码所述抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。
225.根据权利要求223或224所述的方法，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和/或编码所述抗原的所述核酸是mRNA。
226.根据权利要求202、204和207至222中任一项所述的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。
227.根据权利要求221至226中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育；
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育；或
(d)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育。
228.根据权利要求221至226中任一项所述的方法，其中所述方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育；
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育；或
(d)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育。
229.根据权利要求221至228中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。
230.根据权利要求221至229中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm至约4.2μm、或约3.5μm至约4.8μm、或约3.5μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。
231.根据权利要求221至230中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm。
232.根据权利要求221至231中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约4.5μm。
233.根据权利要求221至232中任一项所述的方法，其中包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
234.一种用于增强免疫细胞的活性的组合物，所述组合物包括所述免疫细胞中的嵌合膜结合细胞因子。
235.根据权利要求234所述的组合物，其中所述嵌合膜结合细胞因子是包括跨膜结构域和细胞因子的融合蛋白。
236.根据权利要求234至235中任一项所述的组合物，其中所述跨膜结构域是转铁蛋白受体蛋白1(TFRC)或肿瘤坏死因子跨膜结构域。
237.根据权利要求234至236中任一项所述的组合物，其中所述细胞因子是I型细胞因子。
238.根据权利要求234至237中任一项所述的组合物，其中所述细胞因子是IL-15、IL-12、IL-2、IFN-α、IFN-β或IL-21或其功能变体。
239.根据权利要求234至238中任一项所述的组合物，其中所述细胞因子通过肽连接子与所述跨膜结构域连接。
240.根据权利要求239所述的组合物，其中所述肽连接子是(G4S)3(SEQ ID NO:73)或(EAAAK)3(SEQ ID NO:74)。
241.根据权利要求234至240中任一项所述的组合物，其中所述嵌合膜结合细胞因子包括SEQ ID NO:77-80的氨基酸序列。
242.根据权利要求234至241中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞进一步包括抗原。
243.根据权利要求234至242中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞进一步包括编码抗原的mRNA。
244.根据权利要求242或243所述的组合物，其中所述抗原是蛋白质或其片段，其中所述蛋白质或其片段刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
245.根据权利要求233至241中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞进一步包括源自蛋白质的两种或更多种抗原。
246.根据权利要求245所述的组合物，其中所述两种或更多种抗原刺激免疫应答，无论所述个体的HLA单倍型如何。
247.根据权利要求244至246中任一项所述的组合物，其中所述蛋白质是与癌症相关的突变的蛋白质、癌基因、新抗原、病毒蛋白、细菌蛋白或真菌蛋白的产物。
248.根据权利要求244至247中任一项所述的组合物，其中蛋白质是人乳头瘤病毒(HPV)蛋白。
249.根据权利要求248所述的组合物，其中所述HPV是HPV-16或HPV-18。
250.根据权利要求248或249所述的组合物，其中所述蛋白质是HPV E6或HPV E7蛋白。
251.根据权利要求244至247中任一项所述的组合物，其中所述蛋白质是乙型肝炎病毒(HBV)蛋白。
252.根据权利要求251所述的组合物，其中所述HBV蛋白是核心蛋白、小表面抗原、中表面抗原、大表面抗原、e抗原、X抗原或聚合酶蛋白。
253.根据权利要求233至252中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞是多个外周血单核细胞(PBMC)。
254.根据权利要求253所述的组合物，其中所述多个PBMC包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞或NK-T细胞中的两种或更多种。
255.根据权利要求233至254中任一项所述的组合物，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞和/或NK-T细胞中的一种或多种。
256.根据权利要求233至255中任一项所述的组合物，其中用佐剂调节所述有核细胞以形成经调节的细胞。
257.根据权利要求256所述的组合物，其中将所述有核细胞与所述佐剂一起温育约1小时至约24小时、约2小时至约10小时、约3小时至约6小时或约4小时以对所述细胞进行调节。
258.根据权利要求256或257所述的组合物，其中在将所述蛋白质或其片段或编码所述蛋白质或其片段的所述mRNA引入到所述有核细胞中之前或之后调节所述有核细胞。
259.根据权利要求256至258中任一项所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)、LPS、IFN-α、STING激动剂、RIG-I激动剂、聚肌-聚胞苷酸、TLR3激动剂、TLR4激动剂、TLR7激动剂、TLR8激动剂或TLR 9激动剂。
260.根据权利要求256至259中任一项所述的组合物，其中所述佐剂是CpG寡脱氧核苷酸(ODN)。
261.根据权利要求234至260中任一项所述的组合物，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子的免疫细胞。
262.根据权利要求261所述的组合物，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸是编码所述嵌合膜结合细胞因子的mRNA。
263.根据权利要求242、244和247至262中任一项所述的组合物，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。
264.根据权利要求243、244和247至262所述的组合物，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸和编码所述抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和抗原的免疫细胞。
265.根据权利要求263或264所述的组合物，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和/或编码所述抗原的所述核酸是mRNA。
266.根据权利要求245至262中任一项所述的组合物，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和源自蛋白质的所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子和两种或更多种抗原的免疫细胞。
267.根据权利要求261至266中任一项所述的组合物，其中产生所述免疫细胞的方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育；
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育；或
(d)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育。
268.根据权利要求261至266中任一项所述的方法，其中所述产生所述免疫细胞的方法包括：
(a)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育；
(b)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述抗原的所述核酸一起温育；
(c)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸和编码所述抗原的所述核酸一起温育；或
(d)在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子和所述两种或更多种抗原的所述核酸一起温育。
269.根据权利要求261至268中任一项所述的组合物，其中所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。
270.根据权利要求261至269中任一项所述的组合物，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm至约4.2μm、或约3.5μm至约4.8μm、或约3.5μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。
271.根据权利要求261至270中任一项所述的组合物，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm。
272.根据权利要求261至271中任一项所述的组合物，其中所述收缩部的宽度为约4.5μm。
273.根据权利要求261至272中任一项所述的组合物，其中包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
274.一种用作药物的组合物，其中所述组合物包括有效量的根据权利要求234至273中任一项所述的组合物。
275.一种用于治疗个体的癌症、传染性疾病或病毒相关疾病的组合物，其中所述组合物包括有效量的根据权利要求210至248中任一项所述的组合物。
276.一种试剂盒，其在根据权利要求194至233中任一项所述的方法中使用。
277.一种试剂盒，其包括根据权利要求234至275中任一项所述的组合物。
278.根据权利要求250或249所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括以下中的一种或多种：缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器或具有用于增强免疫细胞的活性的说明的包装插页。
279.一种产生免疫细胞的方法，所述免疫细胞包括嵌合膜结合细胞因子，所述方法包括将编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸引入到所述免疫细胞。
280.根据权利要求279所述的方法，其中包括所述嵌合膜结合细胞因子的所述免疫细胞通过以下制备：
a)使包括输入免疫细胞的细胞悬浮液通过细胞变形收缩部，其中所述收缩部的直径是所述悬浮液中的所述输入免疫细胞的直径的函数，由此使所述输入免疫细胞的扰动足够大以使编码所述嵌合膜结合细胞因子的核酸通过以形成扰动的输入免疫细胞；以及
b)将所述扰动的输入免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育，以允许所述核酸进入所述扰动的输入免疫细胞，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸被表达；由此产生包括嵌合膜结合细胞因子的免疫细胞。
281.根据权利要求280所述的方法，其中所述方法包括在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前、期间和/或之后将所述免疫细胞与编码其嵌合膜结合细胞因子的核酸一起温育。
282.根据权利要求280所述的方法，其中所述方法包括在使所述细胞悬浮液通过所述细胞变形收缩部之前将所述免疫细胞与编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸一起温育。
283.根据权利要求280、281或282所述的方法，其中编码所述嵌合膜结合细胞因子的所述核酸是编码所述嵌合膜结合细胞因子的mRNA。
284.根据权利要求280至283中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为所述输入有核细胞的平均直径的约10％至约99％。
285.根据权利要求280至284中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm至约4.2μm、或约3.5μm至约4.8μm、或约3.5μm至约6μm、或约4.2μm至约4.8μm或约4.2μm至约6μm。
286.根据权利要求280至285中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约3.5μm。
287.根据权利要求280至286中任一项所述的方法，其中所述收缩部的宽度为约4.5μm。
288.根据权利要求280至287中任一项所述的方法，其中包括多个输入有核细胞的所述细胞悬浮液通过多个收缩部，其中所述多个收缩部串联和/或并联布置。
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