CN113265378A - 利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法，属于细胞生物学技术领域。利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法，主要包括以下步骤：细胞外泌体提纯；细胞外泌体联合细胞因子的免疫细胞激活；特异免疫细胞亚型体外培养：血液PBMC提取；CD3+CA56+细胞激活：依次添加细胞外泌体与细胞因子组合成分；对细胞产物进行培养：根据细胞的生产状态添加培养基、扩充培养体积、补充细胞因子；本发明能够对于细胞培养过程中的产出废物进行了再利用，减少了细胞外源性因子用料的投入，更真实的模拟免疫细胞体内激活状态，使胞内信号更为有序的启动或阻遏，提高细胞安全性，降低细胞因子非正常释放可能。
Description
方法领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其涉及利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法。
背景方法
双重机制杀伤细胞其分子鉴定实质CD3+CD56+双阳性免疫细胞群体。
外泌体是细胞通过胞吐过程分泌的一类粒径在30～150nm的囊泡，其组成包括脂质双分子层以及其内部包裹的细胞来源的蛋白质、核糖核苷酸RNA和脱氧核糖核苷酸DNA等生物分子，作为细胞间交流的重要方式，外泌体在一系列生理和病理过程中起着至关重要的作用。
近年对于肿瘤相关外泌体的研究主要集中在肿瘤外泌体，肿瘤外泌体能够帮助肿瘤细胞实现免疫逃逸，促进肿瘤细胞转移，其作为肿瘤鉴别诊断的标志物被广泛研究。
然而目前研究以证实，除能促进肿瘤发展的肿瘤外泌体外，还存在对于肿瘤起抑制作用的其他免疫相关外泌体，某些特定细胞分泌的外泌体中所包含多种免疫调控成分，可起到调控人体免疫系统的作用。
细胞免疫治疗是过去数十年的肿瘤免疫治疗的前沿热点，其领域发展也获得了不俗的成绩，如Car-T细胞目前已成功成药，但特异性细胞免疫治疗，因MHC限制，大多有效的方法手段只能以自体细胞作为种子细胞来源，制备成本高，量产难度极大。在高风险的影响下，行业规则建立缓慢、审批困难。
随着免疫检查点抑制剂的成功，免疫疗法成为了目前最为火热免疫治疗手段，免疫疗法，相对传统化疗和靶向治疗，有一个本质逻辑区别：免疫疗法针对的是免疫细胞功能的调节，而不是直接杀伤癌细胞。
利用外泌体的信息传导功能可模拟免疫细胞在体内被激活的途径，利用非基因改造手段获得对癌细胞有抑制作用的细胞群体。
在CD3+56+细胞群体的培养方面，现有工艺主要为单纯因子激活方案，通过工程菌或工程细胞获得大量细胞激活用细胞因子，再根据免疫细胞激活通路途径，调整不同因子浓度，以刺激PBMC活化、分化增值出所需的细胞群体，该方案调控途径单一，进依靠细胞因子刺激PBMC未完全模拟细胞在体内激活启动的通路途径，可能造成细胞内信号紊乱；单纯利用因子浓度分化PBMC对PBMC活化方向控制有限，通过因子刺激的体外培养的免疫细胞，通常可以获得良好的增值能力，但对于目的亚群的获得控制能力较弱，均一性差，主亚群控制指标浮动范围大。
发明内容
本发明的目的是为了解决方案调控途径单一，进依靠细胞因子刺激PBMC未完全模拟细胞在体内激活启动的通路途径，可能造成细胞内信号紊乱；单纯利用因子浓度分化PBMC对PBMC活化方向控制有限，通过因子刺激的体外培养的免疫细胞，通常可以获得良好的增值能力，但对于目的亚群的获得控制能力较弱，均一性差，主亚群控制指标浮动范围大的问题，而提出的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下方法方案：
利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法，主要包括以下步骤：
S1、细胞外泌体提纯；
S2、细胞外泌体联合细胞因子的免疫细胞激活；
S3、特异免疫细胞亚型体外培养；
其中，步骤S3主要包括：
A、血液PBMC提取；
B、CD3+CA56+细胞激活：依次添加细胞外泌体与细胞因子组合成分；
C、对B步骤的细胞产物进行培养：根据细胞的生产状态添加培养基、扩充培养体积、补充细胞因子。
优选的，步骤C中培养基每次添加量不超过原体积。
优选的，步骤C中扩充培养体积范围为1000-8000ml。
优选的，步骤C中扩充培养体积范围为2000-4000ml。
优选的，步骤S1中细胞外泌体提纯主要包括以下步骤：
a、低速离心，排除大颗粒杂质；
b、膜过滤，排除0.22um以上粒径杂质；
c、切向流(TFF)过滤，浓缩；
d、超离提纯，进一步浓缩，进一步提纯。
e、利用纳米流式检测仪对提纯后获得的外泌体进行检测。
f、对提纯后的细胞因子含量进行检测。
优选的，步骤b中膜过滤采用垂直过滤，其中垂直过滤的第一步膜孔径为0.45um、第二步膜孔径为0.22um。
优选的，d步骤中超离方法为利用高速离心机进行预离心，在10000G、温度为4℃的条件下离心30min，预离心结束后利用超速离心机进行超速离心，在100000G、温度为4℃的条件下离心70min，重复进行一次，离心时间均为设置离心力保持时间不含增速与减速过程。
优选的，细胞外泌体来源为CD3+CD56+双阳性细胞培养液，且其阳性表达量高于60％，并要求培养液为在1/2体积补液后3-5日内的细胞培养液，未经任何处理。
优选的，步骤S2中细胞外泌体联合细胞因子的免疫细胞激活主要包括以下步骤：
①、利用商品化细胞因子补全免疫细胞激活所需剂量缺少的因子成分和/或补全所缺的膜泡信号的替代因子剂量；
②、将外泌体、补充因子根据细胞激活通路顺序分为两组，依次进行添加。
优选的，步骤②中的分组方法为：根据CD3+CD56+性细胞发育条件，对外泌体有效激活成分包含CD1d、SLAM以及DICER。
与现有方法相比，本发明提供了利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法，具备以下有益效果：
1、发明将利用外泌体信号与细胞因子刺激相结合的方式，在激活方式上除原有细胞因子浓度调控外，还提供如外泌体膜蛋白信号CD1d，外泌体包裹核酸信号miR-150，miR-155，miR-181，miR-17-92等，通过以上途径的联合刺激，最终可获得高表达CD3+CD56+的细胞群体，该细胞群体表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体NKR的特殊淋巴细胞亚群，能大量产生细胞因子，且具备多种途径激活的细胞毒效应，该细胞群体可以通过以下途径对肿瘤细胞产生抑制作用：
细胞毒效应：NKT细胞可通过穿孔素途径、TRAIL途径和Fas/FasL途径来实现抗肿瘤的细胞毒效应。
抗肿瘤的活化因子分泌：NKT细胞分泌细胞因子间接杀伤肿瘤细胞，NKT细胞被激活后产生Th1类(IFN-γ、TNF-α等)及Th2类(IL-4、IL-13等)细胞因子，介导多种免疫应答。
免疫调节作用：NKT细胞可增强CTL细胞效应，刺激Th1细胞介导细胞免疫反应，发挥抑制肿瘤的作用；
该装置中未涉及部分均与现有方法相同或可采用现有方法加以实现，本发明能够对于细胞培养过程中的产出废物进行了再利用，减少了细胞外源性因子用料的投入，更真实的模拟免疫细胞体内激活状态，使胞内信号更为有序的启动或阻遏，提高细胞安全性，降低细胞因子非正常释放可能，使得主亚群控制指标浮动范围大。
附图说明
图1为本发明提出的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法的细胞外泌体粒径检测的示意图；
图2为本发明提出的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法的细胞外泌体及免疫细胞激活相关因子表达检测的示意图；
图3为本发明提出的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法的细胞增殖曲线图一；
图4为本发明提出的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法的细胞增殖曲线图二；
图5为本发明提出的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法的细胞增殖曲线图三；
图6为本发明提出的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法的细胞表型流式检测图一；
图7为本发明提出的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法的细胞表型流式检测图二；
图8为本发明提出的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法的细胞表型流式检测图三。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的方法方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
在本发明的描述，仅是为了便于描述本发明和简化描述，所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有方法中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得，下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有方法中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1：
参照图1-8，利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法，主要包括以下步骤：
先进行细胞外泌体提纯，具体提纯操作为：
先选取细胞外泌体：细胞外泌体来源为CD3+CD56+双阳性细胞培养液，且其阳性表达量高于60％，并要求培养液为在1/2体积补液后3-5日内的细胞培养液，未经任何处理；
低速离心，排除大颗粒杂质：将选取的细胞培养液添加至离心机中进行低俗离心，此时大颗粒杂质受离心力较大，易被分离，而小颗粒杂质所受离心力小，不受影响；
膜过滤：膜过滤采用垂直过滤，其中垂直过滤的第一步膜孔径为0.45um、第二步膜孔径为0.22um，能够排除0.22um以上粒径杂质：
对除杂的细胞培养液切向流过滤、浓缩；
超离提纯，进一步浓缩，进一步提纯：利用高速离心机进行预离心，在10000G、温度为4℃的条件下离心30min，预离心结束后利用超速离心机进行超速离心，在100000G、温度为4℃的条件下离心70min，重复进行一次，离心时间均为设置离心力保持时间不含增速与减速过程。
利用纳米流式检测仪对提纯后获得的外泌体进行检测。
对提纯后的细胞因子含量进行检测；
在对细胞外泌体联合细胞因子的免疫细胞激活：
利用商品化细胞因子补全免疫细胞激活所需剂量缺少的因子成分和/或补全所缺的膜泡信号的替代因子剂量；
将外泌体、补充因子根据细胞激活通路顺序分为两组，分组依据为CD3+CD56+性细胞发育条件，对外泌体有效激活成分包含CD1d、SLAM以及DICER，依次进行添加。
最后对特异免疫细胞亚型体外培养，主要包括以下步骤：
血液PBMC提取：取外周血5ml，放置于含有肝素的抗凝管，混匀10余次；然后将5ml外周血用无血清1640培养基稀释一倍，混匀，取另一离心管，加入5ml淋巴细胞分离液，然后将稀释后的外周血缓慢的沿离心管壁加入，入2000转离心机进行离心20min；
CD3+CA56+细胞激活：依次添加细胞外泌体与细胞因子组合成分；
对细胞产物进行培养：根据细胞的生产状态添加培养基、补充细胞因子、扩充培养体积，扩充培养体积的范围为1000-8000ml，需要注意的是，培养基每次添加量不超过原体积。
优选的，步骤C中扩充培养体积范围为2000-4000ml。
实施例2：
参照图1-8，利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法，主要包括以下步骤：
先进行细胞外泌体提纯，具体提纯操作为：
先选取细胞外泌体：细胞外泌体来源为CD3+CD56+双阳性细胞培养液，且其阳性表达量高于60％，并要求培养液为在1/2体积补液后3-5日内的细胞培养液，未经任何处理；
低速离心，排除大颗粒杂质：将选取的细胞培养液添加至离心机中进行低俗离心，此时大颗粒杂质受离心力较大，易被分离，而小颗粒杂质所受离心力小，不受影响；
膜过滤：膜过滤采用垂直过滤，其中垂直过滤的第一步膜孔径为0.45um、第二步膜孔径为0.22um，能够排除0.22um以上粒径杂质：
对除杂的细胞培养液切向流过滤、浓缩；
超离提纯，进一步浓缩，进一步提纯：利用高速离心机进行预离心，在10000G、温度为4℃的条件下离心30min，预离心结束后利用超速离心机进行超速离心，在100000G、温度为4℃的条件下离心70min，重复进行一次，离心时间均为设置离心力保持时间不含增速与减速过程。
利用纳米流式检测仪对提纯后获得的外泌体进行检测。
通过Elisa、Elispot方法，对提纯后的细胞因子含量进行检测；
在对细胞外泌体联合细胞因子的免疫细胞激活：
利用商品化细胞因子补全免疫细胞激活所需剂量缺少的因子成分和/或补全所缺的膜泡信号的替代因子剂量；
将外泌体、补充因子根据细胞激活通路顺序分为两组，分组依据为CD3+CD56+性细胞发育条件，对外泌体有效激活成分包含CD1d、SLAM以及DICER，依次进行添加。
最后对特异免疫细胞亚型体外培养，主要包括以下步骤：
血液PBMC提取：取外周血5ml，放置于含有肝素的抗凝管，混匀10余次；然后将5ml外周血用无血清1640培养基稀释一倍，混匀，取另一离心管，加入5ml淋巴细胞分离液，然后将稀释后的外周血缓慢的沿离心管壁加入，入2000转离心机进行离心20min；
CD3+CA56+细胞激活：依次添加细胞外泌体与细胞因子组合成分；对细胞产物进行培养：根据细胞的生产状态添加培养基、补充细胞因子、扩充培养体积，扩充培养体积的范围为2000-4000ml，需要注意的是，培养基每次添加量不超过原体积。
本发明将利用外泌体信号与细胞因子刺激相结合的方式，在激活方式上除原有细胞因子浓度调控外，还提供如外泌体膜蛋白信号CD1d，外泌体包裹核酸信号miR-150，miR-155，miR-181，miR-17-92等，通过以上途径的联合刺激，最终可获得高表达CD3+CD56+的细胞群体，该细胞群体表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体NKR的特殊淋巴细胞亚群，能大量产生细胞因子，且具备多种途径激活的细胞毒效应，该细胞群体可以通过以下途径对肿瘤细胞产生抑制作用：
细胞毒效应：NKT细胞可通过穿孔素途径、TRAIL途径和Fas/FasL途径来实现抗肿瘤的细胞毒效应；
抗肿瘤的活化因子分泌：NKT细胞分泌细胞因子间接杀伤肿瘤细胞，NKT细胞被激活后产生Th1类(IFN-γ、TNF-α等)及Th2类(IL-4、IL-13等)细胞因子，介导多种免疫应答；
免疫调节作用：NKT细胞可增强CTL细胞效应，刺激Th1细胞介导细胞免疫反应，发挥抑制肿瘤的作用；
本发明能够对于细胞培养过程中的产出废物进行了再利用，减少了细胞外源性因子用料的投入，更真实的模拟免疫细胞体内激活状态，使胞内信号更为有序的启动或阻遏，提高细胞安全性，降低细胞因子非正常释放可能。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本方法领域的方法人员在本发明揭露的方法范围内，根据本发明的方法方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
S1、细胞外泌体提纯；
S2、细胞外泌体联合细胞因子的免疫细胞激活；
S3、特异免疫细胞亚型体外培养；
其中，步骤S3主要包括：
A、血液PBMC提取；
B、CD3+CA56+细胞激活：依次添加细胞外泌体与细胞因子组合成分；
C、对B步骤的细胞产物进行培养：根据细胞的生产状态添加培养基、扩充培养体积、补充细胞因子。
2.根据权利要求1所述的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，步骤C中培养基每次添加量不超过原体积。
3.根据权利要求1所述的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，步骤C中扩充培养体积范围为1000-8000ml。
4.根据权利要求3所述的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，步骤C中扩充培养体积范围为2000-4000ml。
5.根据权利要求1所述的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，步骤S1中细胞外泌体提纯主要包括以下步骤：
a、低速离心，排除大颗粒杂质；
b、膜过滤，排除0.22um以上粒径杂质；
c、切向流(TFF)过滤，浓缩；
d、超离提纯，进一步浓缩，进一步提纯。
e、利用纳米流式检测仪对提纯后获得的外泌体进行检测。
f、对提纯后的细胞因子含量进行检测。
6.根据权利要求5所述的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，步骤b中膜过滤采用垂直过滤，其中垂直过滤的第一步膜孔径为0.45um、第二步膜孔径为0.22um。
7.根据权利要求5所述的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，d步骤中超离方法为利用高速离心机进行预离心，在10000G、温度为4℃的条件下离心30min，预离心结束后利用超速离心机进行超速离心，在100000G、温度为4℃的条件下离心70min，重复进行一次，离心时间均为设置离心力保持时间不含增速与减速过程。
8.根据权利要求5所述的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，细胞外泌体来源为CD3+CD56+双阳性细胞培养液，且其阳性表达量高于60％，并要求培养液为在1/2体积补液后3-5日内的细胞培养液，未经任何处理。
9.根据权利要求1所述的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，步骤S2中细胞外泌体联合细胞因子的免疫细胞激活主要包括以下步骤：
①、利用商品化细胞因子补全免疫细胞激活所需剂量缺少的因子成分和/或补全所缺的膜泡信号的替代因子剂量；
②、将外泌体、补充因子根据细胞激活通路顺序分为两组，依次进行添加。
10.根据权利要求9所述的利用细胞外泌体激活的双重机制杀伤细胞的体外扩增方法，其特征在于，步骤②中的分组方法为：根据CD3+CD56+性细胞发育条件，对外泌体有效激活成分包含CD1d、SLAM以及DICER。
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