CN114621914B - 利用自体血清从脐血中获取多能血管祖细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种利用自体血清从脐血中获取多能血管祖细胞的方法，包括：从脐血中获取血清；用获取的血清制备第一培养基和第二培养基；从脐血中获取单核细胞；将获取的单核细胞重悬于第一培养基后接种于培养皿，多次更换第一培养基，直至细胞集落形成；所述细胞集落形成后，将第一培养基更换为第二培养基，多次更换第二培养基，制得表达CD146和NG2但不表达CD31的多能血管祖细胞。本发明制得的多能血管祖细胞既具有骨髓间充质干细胞与血管周细胞相似的表型，又具有骨髓间充质干细胞具有基本相同的中胚层细胞分化功能；还具有分化成成熟血管细胞和促进心血管系统修复再生的功能，并且具有良好的体外扩增能力。
Description
技术领域
本发明属于生物医学研究领域，具体涉及一种利用自体血清从脐血中获取表达CD146和NG2但不表达CD31多能血管祖细胞的方法。
背景技术
围产期组织是指怀孕28周到婴儿出生这段时间所产生的与胎儿发育相关的附属器官组织。脐血、脐带和胎盘是围产期组织的主要组成部分。脐血是胎儿出生时脐带及胎盘内残留的属于胎儿的血液。由于脐血含有多种干细胞和特定组织祖细胞亚群且脐血干细胞资源丰富，扩增能力强等众多优势，成为再生医学研究领域关注的焦点。
干细胞具有广阔的应用前景，但是实现临床治疗首要需要解决安全性的问题包括，第一，不含任何动物来源的可能污染了动物病原体的成分，比如目前广泛使用的胎牛学清成分仍不明确；第二，不会在移植后患者体内产生免疫排斥。这些问题的解决有赖于血管祖细胞分离培养方法和体系的进一步完善。
多能血管祖细胞是一类具有自我更新、自我复制能力和多分化潜能的血管相关组织来源细胞，既具有间充质干细胞特性和功能同时又具有向心血管细胞分化能力与心血管细胞支持能力，并具有高度的增殖潜能和中胚层细胞分化能力。这类细胞主要分布于骨髓和围产期组织中，通常与血管周细胞和血管干细胞的功能和特性相似。
由于成年人多能血管祖细胞极其稀少，并且难以获得。目前，获取多能血管祖细胞的方法有“从血管壁中提取并通过免疫磁珠法或流式细胞筛选法”提纯，这些采集方法具有两类缺点，第一：处理过程中使用的消化酶将会使目标细胞产生损伤；第二：这些获取方法均包括抗体筛选的步骤，因此成本较高。
发明内容
针对现有技术的缺点和局限，本发明提供一种利用自体血清从脐血中获取表达CD146及NG2但不表达CD31的多能血管祖细胞的方法，包括：步骤A.从脐血中获取血清；步骤B.用步骤A获取的血清制备第一培养基和第二培养基；步骤C.从脐血中获取单核细胞；步骤D.将步骤C获取的单核细胞重悬于步骤B制备的第一培养基后接种于培养皿，多次更换第一培养基，直至细胞集落形成；步骤E.步骤D所述细胞集落形成后，将第一培养基更换为步骤B制备的第二培养基，多次更换第二培养基，制得表达CD146及NG2但不表达CD31的多能血管祖细胞。
本发明优选的实施方式中，步骤A所述的脐血与步骤C所述的脐血为同一来源。本发明利用相同来源的自体脐血中的血清制备两种不同的培养基，通过第一培养基对脐血中单核细胞进行复苏，通过第二培养基对复苏得到的具有集落形成能力的细胞进行扩增，得到的血管祖细胞超过95%能够表达CD146及NG2表面抗原且不表达CD31表面抗原。所得多能血管祖细胞经流式细胞术分析证明其同时具有骨髓间充质干细胞与血管周细胞相似的表型，并通过成脂、成骨和成软骨的分化试验证明其与骨髓间充质干细胞具有基本相同的中胚层细胞分化功能；通过平滑肌分化与血管组织工程试验证明其具有分化成成熟血管细胞和促进心血管系统修复再生的功能，以及良好的体外扩增能力。
本发明非限制性的实施方式中，所述步骤A包括：使脐血自然凝固后进行离心，获取上层，即得血清。本领域的技术人员熟知，由于脐血中含有血小板、纤维蛋白原等凝血物质，能够促进脐血凝固。脐血自然凝固后，通过离心即可获得血清。本发明非限制性的实施方式中，申请人经过大量试验总结获知，当所述自然凝固的持续时间小于1小时；所述离心的离心力为1000-3000g；所述离心的持续时间为5-20分钟时，可使血清能够得到较好的分层，以更大限度的获得浓度较高且符合后续试验条件的血清。
本发明非限制性的实施方式中，所述培养皿为经胶原蛋白与纤维蛋白混合预处理的培养皿。申请人经过大量试验总结获知，经胶原蛋白与纤维蛋白混合预处理的培养皿能够影响细胞粘附及增殖活性。本领域技术人员可以从现有技术中选择已知的胶原蛋白与纤维蛋白按照合适的比例混合（常规比例），通过本领域常用的预处理（包括包被）方法制作胶原蛋白与纤维蛋白混合预处理的培养皿，进而用于细胞培养。
本发明优选的实施方式中，所述步骤B制备的第一培养基为含有5-20%血清的培养基，所述步骤B制备的第二培养基为含有低于第一培养基血清浓度的培养基。本实施方式制得的第一培养基和第二培养基均为液体状态。本领域技术人员可以通过本领域公知的培养基制备方法制备含有需要浓度血清的培养基，但申请人经过大量试验总结获知，当第一培养基含有血清的浓度为5-20%时更有利于细胞复苏，得到具有集落形成能力的细胞。在制备第二培养基时，由于第二培养基的目的是使复苏后具有集落形成能力的细胞进行扩增，因此申请人经过大量试验总结获知，当第二培养基含有血清的浓度低于第一培养基时，可以使细胞老化速度减慢，得到更高的细胞扩增量。
本发明优选的实施方式中，所述步骤C包括：步骤C1.将脐血加入到含有玻璃微珠的PBS溶液中震荡；步骤C2.去除玻璃微珠，获得含有脐血的PBS混合液；步骤C3.将含有脐血的PBS混合液加入到含有Ficoll细胞分离液中离心；步骤C4.获取血浆层和分离液层之间的白膜层，即得所述单核细胞。本实施方式步骤C1所述的含有玻璃微珠的PBS溶液可以选用本领域已知且市售的无菌玻璃微珠与无菌PBS溶液混合制成，注入无菌采血容器，可以使用该无菌采血容器直接采取脐血并立即混合；本实施方式用玻璃微珠吸附脐血溶液中的纤维蛋白原，在步骤C2去除玻璃微珠后获得未凝固的含有脐血的PBS混合液；在本发明优选的实施方式中，再将含有脐血的PBS混合液缓慢加入到含有Ficoll细胞分离液中进行离心。本实施方式通过用PBS溶液稀释，保持脐血细胞在混合液中的悬浮状态，再用玻璃微珠震荡的方法去除造成血液凝固的纤维蛋白原，以获得含有脐血的PBS混合液，最后用密度梯度离心的方法获得了单核细胞。本优选实施方式未使用化学试剂，而是通过物理分离的办法从脐血中获得了单核细胞。
本发明优选的实施方式中，步骤C1所述脐血的加入量与含有玻璃微珠的PBS溶液的使用量为1:1-1:3（体积比）；本领域的技术人员熟知，在用于吸附脐血溶液中的纤维蛋白原时，玻璃微珠的用量越多对脐血溶液中纤维蛋白原的吸附效果越好，但玻璃微珠的使用量过高会导致浪费，申请人经过大量试验总结获知，当所述脐血的加入量与含有玻璃微珠的PBS溶液的使用量为1:1-1:3（体积比）时，既能保证玻璃微珠能够完全吸附脐血溶液中的纤维蛋白原，又不至于玻璃微珠产生浪费。
本发明优选的实施方式中，步骤C1所述震荡的持续时间为0.5-5分钟。本领域的技术人员熟知，将脐血加入到含有玻璃微珠的PBS溶液中震荡有利于玻璃微珠对脐血溶液中的纤维蛋白原进行吸附，申请人经过大量试验总结获知，当震荡的持续时间为0.5-5分钟时，能使脐血溶液中的纤维蛋白原被玻璃微珠充分吸附。
本发明非限制性的实施方式中，步骤C3所述Ficoll细胞分离液的浓度为l.073-l.077g/mL；步骤C3所述含有脐血的PBS混合液的加入量与Ficoll细胞分离液的使用量为体积比2:1-3:1；步骤C3所述离心的持续时间为25-40分钟。本实施方式申请人使用市售Ficoll细胞分离液产品，或者利用现有技术配置Ficoll细胞分离液，申请人经过大量试验总结获知，Ficoll细胞分离液浓度在l.073-l.077g/mL范围内时且步骤C3所述含有脐血的PBS混合液的加入量与Ficoll细胞分离液的使用量为体积比2:1-3:1，在步骤C3所述离心的速度为250-600g，持续时间为25-40分钟后，更有利于获得单核细胞层。离心后，从上向下依次为血浆层、白膜层和分离液层，获取白膜层即得单核细胞。
本发明非限制性的实施方式中，所述多次更换第一培养基是指：第一次更换：接种后12~24小时，更换第一培养基以去除悬浮细胞；第二次更换：第一次更换第一培养基后72~96小时，再更换第一培养基以去除悬浮细胞；第N次更换（N为≥3的自然数）：自第二次更换第一培养基起，每隔72小时更换一次第一培养基，直至细胞集落形成。本实施方式为使细胞集落形成，在单核细胞接种到第一培养基后经过一段时间的培养，更换第一培养基，并且在第一次更换第一培养基后再经过更长一段时间的培养，更换第一培养基，再自第二次更换第一培养基起，每隔72小时更换一次第一培养基，直至细胞集落逐渐形成。本实施方式更换第一培养基的过程即为去除悬浮细胞的过程，申请人发现，目标细胞均贴壁生长，而悬浮细胞几乎全部为非目标细胞，这样，在更换第一培养基时，去除培养细胞后的第一培养基，即实现了去除悬浮细胞的目的，再加入新的第一培养基以继续培养单核细胞，利于目标细胞扩增。申请人经过大量试验总结获知，接种后12小时至24小时（含端点）更换第一培养基、第一次更换第一培养基后72~96小时（含端点）、以及第二次更换第一培养基起，每隔72小时更换一次第一培养基，这一过程中，多次更换第一培养基的步骤即可有效的去除悬浮细胞。同时申请人经过大量试验总结得到，通常N=4时即可获得有细胞集落形成能力的细胞。
需要说明的是，本发明各非限制性的实施方式及各优选的实施方式均未提及试验器皿，本领域的技术人员熟知，本发明的各个实施步骤均为本领域常用的试验操作步骤，本领域的技术人员可以根据当前实验步骤的需要而选择本领域常用的适宜的试验器皿。例如：更换第一培养基的步骤中，由于目标细胞具有贴壁生长的特点，因此，本领域的技术人员可以选择经过适宜处理的不同型号的培养皿进行单核细胞复苏，以有利于细胞集落形成。
本发明非限制性的实施方式中，所述多次更换第二培养基是指：所述克隆细胞形成后，将第一培养基更换为第二培养基，自更换第二培养基起，每隔72小时更换一次第二培养基，直至光学显微镜下观察达到70-80%细胞融合度，即可收获制得CD146+/NG2+/CD31-的多能血管祖细胞。本实施方式在获得细胞集落后，将第一培养基更换为第二培养基，继续换液，自更换第二培养基起，每隔72小时更换一次第二培养基，申请人经过大量试验总结获知，更换第二培养基直至光学显微镜下观察达到70-80%细胞融合度时，即制得表达CD146及NG2但不表达CD31的多能血管祖细胞。
本发明优选的实施方式中，利用相同来源的自体脐血中的血清制备两种不同的培养基，通过第一培养基对脐血中单核细胞进行复苏，通过第二培养基对复苏得到的具有集落形成能力的细胞进行扩增，得到的血管祖细胞超过95%表达CD146及NG2表面抗原且不表达CD31表面抗原。本发明制得的多能血管祖细胞经流式细胞术分析证明其同时具有骨髓间充质干细胞与血管周细胞相似的表型，并通过成脂、成骨和成软骨的分化试验证明其与骨髓间充质干细胞具有基本相同的中胚层细胞分化功能；通过平滑肌分化，体外促血管形成功能测试与血管组织工程试验证明其具有分化成成熟血管细胞和促进心血管系统修复再生的功能，以及良好的体外扩增能力。
附图说明
附图1 本发明提供的利用自体血清从脐血中获取表达CD146和NG2但不表达CD31的多能血管祖细胞的方法流程图；
附图2 本发明实施例7制备的多能血管祖细胞进行流式细胞术分析结果的染色照片；
附图3本发明实施例6制备的多能血管祖细胞进行脂肪分化试验的染色照片；
附图4本发明实施例5制备的多能血管祖细胞进行成骨分化试验的染色照片；
附图5 本发明实施例4制备的多能血管祖细胞进行软骨分化试验的染色照片；
附图6 本发明实施例5制备的多能血管祖细胞进行成熟心血管细胞分化试验的染色照片；
附图7 本发明实施例6制备的多能血管祖细胞进行体外血管组织工程试验的染色照片；
附图8 本发明实施例7制备的多能血管祖细胞进行体外促血管形成试验的染色照片。
具体实施方式
为了准确的表述和说明本发明提供的技术方案，在发明内容之前先对本发明使用的技术术语进行解释如下。
本发明所述“脐血”是指怀孕28周及以上的足月产儿脐带与胎盘内含有的血液。
本发明所述“自体血清”是指来源于脐血的血清。
本发明所述“表达CD146和NG2但不表达CD31”缩写为“CD146+/NG2+/CD31-”，其中CD146、NG2和CD31分别是指特异性免疫抗原CD146、NG2和CD31。
本发明所述“培养基”是指利用自体血清制备的培养基，为液体状态。
本发明所述“细胞集落”是指单个细胞经体外增殖后，在光学显微镜下观察到后代细胞所组成的细胞群体。
本发明所述“多能血管祖细胞（MVPC）”是一类兼具两种细胞特性的细胞亚群，其既同时具有骨髓间充质干细胞与血管周细胞相似的表型，又与骨髓间充质干细胞具有基本相同的中胚层细胞分化功能，还具有分化成成熟血管细胞和促进心血管系统修复再生的功能，并且具有良好的扩增能力。
下面结合附图对本发明非限制性的实施方式进一步说明。需要声明的是，下述具体实施方式仅为举例说明，不应理解为对本发明技术方案的限定。
实施例1
本实施例示例了一种利用自体血清从脐血中获取表达CD146和NG2但不表达CD31（CD146+/NG2+/CD31-）的多能血管祖细胞的方法，包括：步骤A.从脐血中获取血清；步骤B.用步骤A获取的血清制备第一培养基和第二培养基；步骤C.从脐血中获取单核细胞；步骤D.将步骤C获取的单核细胞重悬于步骤B制备的第一培养基后接种于培养皿，多次更换第一培养基，直至细胞集落形成；步骤E.步骤D所述细胞集落形成后，将第一培养基更换为步骤B制备的第二培养基，多次更换第二培养基，制得CD146+/NG2+/CD31-多能血管祖细胞。
本实施例未记载的其他试验试剂、材料、条件及参数，本领域的技术人员可以在付出创造性劳动的情况下选择适当的试剂、材料、参数和特定步骤的实施顺序进行实施，其中，从脐血中获取血清的办法可以通过本领域技术人员在付出创造性劳动的情况下获得，进而利用本发明提供的方法获取单核细胞，再经第一培养基培养形成细胞集落，最后经第二培养基培养而制得CD146+/NG2+/CD31-多能血管祖细胞。本实施例利用相同来源的自体脐血中的血清制备两种不同的培养基，通过第一培养基对脐血中单核细胞进行复苏，通过第二培养基对复苏得到的具有集落形成能力的细胞进行扩增，最终得到的血管祖细胞超过95%能够表达CD146和NG2表面抗原且不表达CD31表面抗原，同时具有骨髓间充质干细胞与血管周细胞相似的表型，又与骨髓间充质干细胞具有基本相同的中胚层细胞分化功能，还具有分化成成熟血管细胞和促进心血管系统修复再生的功能，并且具有良好扩增能力的多能血管祖细胞。
实施例2
本实施例示例了一种利用自体血清从脐血中获取CD146+/NG2+/CD31-的多能血管祖细胞的方法，在实施1的基础上，步骤A.从脐血中获取血清包括：使脐血自然凝固50min后，在离心力为3000g持续离心5分钟，离心结束后获取上层，即得到血清。步骤B制备的第一培养基为含有20%（v / v）血清的培养基，所述第二培养基为含有15%（v / v）血清的培养基。另取相同来源的脐血加入到含有玻璃微珠的PBS溶液中稀释后震荡，以保持脐血细胞在混合液中处于悬浮状态，同时利用玻璃微珠吸附脐血溶液中的纤维蛋白原，再用过滤网过滤去除玻璃微珠后获得未凝固的含有脐血的PBS混合液；再将含有脐血的PBS混合液缓慢加入到浓度为l.073g/mLFicoll的细胞分离液中（加入量为：含有脐血的PBS混合液的加入量与Ficoll细胞分离液的使用量为体积比3:1）离心，离心力为600g，离心持续时间为25分钟。离心后，从上向下依次为血浆层、白膜层和分离液层，获取白膜层即得到单核细胞。再将单核细胞重悬于步骤B制备的第一培养基，重悬后接种于经过胶原蛋白与纤维蛋白混合预处理的培养皿中，接种后18小时更换第一培养基，培养72小时后第二次更换第一培养基，再培养72小时后第三次更换第一培养基。由于多能血管祖细胞均贴壁生长，而悬浮细胞为非目标细胞，所以在更换第一培养基时，同时去除悬浮细胞，这样更换3次后即可实现去除非目标细胞的目的。当观察到细胞集落形成后，将第一培养基更换为第二培养基，自更换第二培养基起，每隔72小时更换一次第二培养基，更换2次后培养72小时即达到70%细胞融合度，亦即制得CD146+/NG2+/CD31-多能血管祖细胞。
本实施例未记载的其他试验试剂、材料、条件及参数，本领域的技术人员可在不付出创造性劳动的情况下选择试剂、材料、参数和特定步骤的实施顺序进行实施，进而得到CD146+/NG2+/CD31-多能血管祖细胞。
实施例3
本实施例示例了一种利用自体血清从脐血中获取CD146+/NG2+/CD31-的多能血管祖细胞的方法，在实施1的基础上，步骤A.从脐血中获取血清包括：使脐血自然凝固55min后，在离心力为2000g持续离心15分钟，离心结束后获取上层，即得到血清。步骤B制备的第一培养基为含有15%浓度血清的培养基，所述第二培养基为含有12%浓度血清的培养基。另取相同来源的脐血加入到含有玻璃微珠的PBS溶液中稀释后震荡，以保持脐血细胞在混合液中处于悬浮状态，同时利用玻璃微珠吸附脐血溶液中的纤维蛋白原，再用过滤网过滤去除玻璃微珠后获得未凝固的含有脐血的PBS混合液；再将含有脐血的PBS混合液缓慢加入到浓度为l.073g/mLFicoll的细胞分离液中（加入量为：含有脐血的PBS混合液的加入量与Ficoll细胞分离液的使用量为体积比3:1）离心，离心力为500g，离心持续时间为30分钟。离心后，从上向下依次为血浆层、白膜层和分离液层，获取白膜层即得到单核细胞。再将单核细胞重悬于步骤B制备的第一培养基，重悬后接种于经过胶原蛋白与纤维蛋白混合预处理的培养皿中，接种后12小时更换第一培养基，培养96小时后第二次更换第一培养基，再培养96小时后第三次更换第一培养基。由于多能血管祖细胞均贴壁生长，而悬浮细胞为非目标细胞，所以在更换第一培养基时，同时去除悬浮细胞，这样更换3次后即可实现去除非目标细胞的目的。当观察到细胞集落形成后，将第一培养基更换为第二培养基，自更换第二培养基起，每隔72小时更换一次第二培养基.当细胞达到70-80%融合度后使用酶消化方法传代，细胞在第二培养基的环境下经过2次传代培养，达到纯化目标细胞的目的，即制得CD146+/NG2+/CD31-多能血管祖细胞。本实施例未记载的其他试验试剂、材料、条件及参数，本领域的技术人员可在不付出创造性劳动的情况下选择试剂、材料、参数和特定步骤的实施顺序进行实施，进而得到CD146+/NG2+/CD31-多能血管祖细胞。
实施例4
本实施例示例了一种利用自体血清从脐血中获取CD146+/NG2+/CD31-的多能血管祖细胞的方法，在实施1的基础上，步骤A.从脐血中获取血清包括：使脐血自然凝固50min后，在离心力为1000g持续离心20分钟，离心结束后获取上层，即得到血清。步骤B制备的第一培养基为含有10%血清的培养基，所述第二培养基为含有8%浓度血清的培养基。另取相同来源的脐血加入到含有玻璃微珠的PBS溶液中稀释后震荡，以保持脐血细胞在混合液中处于悬浮状态，同时利用玻璃微珠吸附脐血溶液中的纤维蛋白原，再用过滤网过滤去除玻璃微珠后获得未凝固的含有脐血的PBS混合液；再将含有脐血的PBS混合液缓慢加入到浓度为l.077g/mLFicoll的细胞分离液中（加入量为：含有脐血的PBS混合液的加入量与Ficoll细胞分离液的使用量为体积比2.5:1）离心，离心力为400g，离心持续时间为35分钟。离心后，从上向下依次为血浆层、白膜层和分离液层，获取白膜层即得到单核细胞。再将单核细胞重悬于步骤B制备的第一培养基，重悬后接种于经过胶原蛋白与纤维蛋白混合预处理的培养皿中，接种后13小时更换第一培养基，培养88小时后第二次更换第一培养基，再培养88小时后第三次更换第一培养基。由于多能血管祖细胞均贴壁生长，而悬浮细胞为非目标细胞，所以在更换第一培养基时，同时去除悬浮细胞，这样更换3次后即可实现去除非目标细胞的目的。当观察到细胞集落形成后，将第一培养基更换为第二培养基，自更换第二培养基起，每隔72小时更换一次第二培养基. 当细胞达到70-80%融合度后使用酶消化方法传代，细胞在第二培养基的环境下经过2次传代培养，达到纯化目标细胞的目的，即制得CD146+/NG2+/CD31-多能血管祖细胞。
本实施例未记载的其他试验试剂、材料、条件及参数，本领域的技术人员可在不付出创造性劳动的情况下选择试剂、材料、参数和特定步骤的实施顺序进行实施，进而得到CD146+/NG2+/CD31-多能血管祖细胞。
实施例5
本实施例示例了一种利用自体血清从脐血中获取CD146+/NG2+/CD31-的多能血管祖细胞的方法，在实施1的基础上，步骤A.从脐血中获取血清包括：使脐血自然凝固55min后，在离心力为2500g持续离心8分钟，离心结束后获取上层，即得到血清。步骤B制备的第一培养基为含有5%浓度血清的培养基，所述第二培养基为含有4%浓度血清的培养基。另取相同来源的脐血加入到含有玻璃微珠的PBS溶液中稀释后震荡，以保持脐血细胞在混合液中处于悬浮状态，同时利用玻璃微珠吸附脐血溶液中的纤维蛋白原，再用过滤网过滤去除玻璃微珠后获得未凝固的含有脐血的PBS混合液；再将含有脐血的PBS混合液缓慢加入到浓度为l.073g/mLFicoll的细胞分离液中（加入量为：含有脐血的PBS混合液的加入量与Ficoll细胞分离液的使用量为体积比3:1）离心，离心力为300g，离心持续时间为40分钟。离心后，从上向下依次为血浆层、白膜层和分离液层，获取白膜层即得到单核细胞。再将单核细胞重悬于步骤B制备的第一培养基，重悬后接种于经过胶原蛋白与纤维蛋白混合预处理的培养皿中，接种后20小时更换第一培养基，培养79小时后第二次更换第一培养基，再培养79小时后第三次更换第一培养基。由于多能血管祖细胞均贴壁生长，而悬浮细胞为非目标细胞，所以在更换第一培养基时，同时去除悬浮细胞，这样更换3次后即可实现去除非目标细胞的目的。当观察到细胞集落形成后，将第一培养基更换为第二培养基，自更换第二培养基起，每隔72小时更换一次第二培养基.当细胞达到70-80%融合度后使用酶消化方法传代，细胞在第二培养基的环境下经过2次传代培养，达到纯化目标细胞的目的，即制得CD146+/NG2+/CD31-多能血管祖细胞。本实施例未记载的其他试验试剂、材料、条件及参数，本领域的技术人员可在不付出创造性劳动的情况下选择试剂、材料、参数和特定步骤的实施顺序进行实施，进而得到CD146+/NG2+/CD31-多能血管祖细胞。
实施例6
本实施例示例了一种利用自体血清从脐血中获取CD146+/NG2+/CD31-的多能血管祖细胞的方法，在实施1的基础上，步骤A.从脐血中获取血清包括：使脐血自然凝固50min后，在离心力为1500g持续离心18分钟，离心结束后获取上层，即得到血清。步骤B制备的第一培养基为含有14%浓度血清的培养基，所述第二培养基为含有12%浓度血清的培养基。另取相同来源的脐血加入到含有玻璃微珠的PBS溶液中稀释后震荡，以保持脐血细胞在混合液中处于悬浮状态，同时利用玻璃微珠吸附脐血溶液中的纤维蛋白原，再用过滤网过滤去除玻璃微珠后获得未凝固的含有脐血的PBS混合液；再将含有脐血的PBS混合液缓慢加入到浓度为l.077g/mLFicoll的细胞分离液中（加入量为：含有脐血的PBS混合液的加入量与Ficoll细胞分离液的使用量为体积比2:1）离心，离心力为450g，离心持续时间为33分钟。离心后，从上向下依次为血浆层、白膜层和分离液层，获取白膜层即得到单核细胞。再将单核细胞重悬于步骤B制备的第一培养基，重悬后接种于经过胶原蛋白与纤维蛋白混合预处理的培养皿中，接种后14小时更换第一培养基，培养77小时后第二次更换第一培养基，再培养78小时后第三次更换第一培养基。由于多能血管祖细胞均贴壁生长，而悬浮细胞为非目标细胞，所以在更换第一培养基时，同时去除悬浮细胞，这样更换3次后即可实现去除非目标细胞的目的。当观察到细胞集落形成后，将第一培养基更换为第二培养基，自更换第二培养基起，每隔72小时更换一次第二培养基。当细胞达到70-80%融合度后使用酶消化方法传代，细胞在第二培养基的环境下经过2次传代培养，达到纯化目标细胞的目的，即制得CD146+/NG2+/CD31-多能血管祖细胞。
本实施例未记载的其他试验试剂、材料、条件及参数，本领域的技术人员可在不付出创造性劳动的情况下选择试剂、材料、参数和特定步骤的实施顺序进行实施，进而得到CD146+/NG2+/CD31-多能血管祖细胞。
实施例7
本实施例示例了一种利用自体血清从脐血中获取CD146+/NG2+/CD31-的多能血管祖细胞的方法，在实施1的基础上，步骤A.从脐血中获取血清包括：使脐血自然凝固50min后，在离心力为3000g持续离心10分钟，离心结束后获取上层，即得到血清。步骤B制备的第一培养基为含有20%浓度血清的培养基，所述第二培养基为含有15%浓度血清的培养基。另取相同来源的脐血加入到含有玻璃微珠的PBS溶液中稀释后震荡，以保持脐血细胞在混合液中处于悬浮状态，同时利用玻璃微珠吸附脐血溶液中的纤维蛋白原，再用过滤网过滤去除玻璃微珠后获得未凝固的含有脐血的PBS混合液；再将含有脐血的PBS混合液缓慢加入到浓度为l.073g/mL Ficoll的细胞分离液中（加入量为：含有脐血的PBS混合液的加入量与Ficoll细胞分离液的使用量为体积比3:1）离心，离心力为300g，离心持续时间为30分钟。离心后，从上向下依次为血浆层、白膜层和分离液层，获取白膜层即得到单核细胞。再将单核细胞重悬于步骤B制备的第一培养基，重悬后接种于经过胶原蛋白与纤维蛋白混合预处理的培养皿中，接种后24小时更换第一培养基，培养96小时后第二次更换第一培养基，再培养72小时后第三次更换第一培养基。由于多能血管祖细胞均贴壁生长，而悬浮细胞为非目标细胞，所以在更换第一培养基时，同时去除悬浮细胞，这样更换3次后即可实现去除非目标细胞的目的。当观察到细胞集落形成后，将第一培养基更换为第二培养基，自更换第二培养基起，每隔72小时更换一次第二培养基。，当细胞达到70-80%融合度后使用酶消化方法传代，细胞在第二培养基的环境下经过2次传代培养，达到纯化目标细胞的目的，即制得CD146+/NG2+/CD31-多能血管祖细胞。
本实施例未记载的其他试验试剂、材料、条件及参数，本领域的技术人员可在不付出创造性劳动的情况下选择试剂、材料、参数和特定步骤的实施顺序进行实施，进而得到CD146+/NG2+/CD31-多能血管祖细胞。
实施例8
取实施例7制备的多能血管祖细胞进行流式细胞术分析，具体如下。
平行试验组A：样品（细胞）取自实施例7制备的多能血管祖细胞在1000rpm下离心5分钟，获取多能血管祖细胞，重悬于含有2%FBS 的PBS（抗体培养液）后制成200万细胞/ml细胞悬液。
平行试验组B：样品（细胞）取骨髓来源的骨髓间充质干细胞（MSC）制成含2%FBS的PBS（抗体培养液）的200万细胞/ml细胞悬液。
本研究中使用的所有FACS抗体及其同型对照都是小鼠抗人抗体。
实验过程：取平行试验组A细胞和平行试验组B细胞进行以下平行实验操作。
将收获的细胞重新悬浮于封闭溶液中，所述封闭溶液为含有2％ FBS（Hyclone）的PBS缓冲液，使细胞浓度为2×106个细胞/ mL。在冰上孵育30分钟，用PBS洗涤，在将细胞重悬于FACS缓冲液中，在PBS中包含0.5％的牛血清白蛋白（BSA，Sigam），并以1×105个细胞/25μL的密度分装到FACS管中，然后将荧光标记偶联的抗体添加到FACS管中，在避光条件下于4°C孵育30分钟。然后用2 mL PBS洗涤细胞2次，最后将其重悬于400ul FACS缓冲液中以进行流式细胞术分析。
为了排除数据采集中的死亡细胞，在将样品（细胞）通过BD FACS Canto-F60细胞分选仪（BD Biosciences，产自美国）分析之前，向每个FACS管中加入1μL碘化丙锭。根据FSC大小值清除碎片，然后通过排除吸收PI染色的死细胞来选择活细胞。阳性阈值由同种Isotype IgG界定，并据此产生相应抗体的比较检测结果。数据由FLOWJO（美国Tree Star公司）分析。详见由GraphPad Prism（GraphPad Software，Inc. USA）生成的附图2。
表1 流式抗体列表
实验结果：附图2显示：流式细胞检测结果显示多能血管祖细胞高表达骨髓间充质干细胞表面抗原CD73，CD90，CD105，以及血管祖细胞表面抗原CD146和NG2，表达率均超过95%，接近100%，但不表达CD31，CD34和CD45。t-test (n=3)，P=0.8365。结果显示：本发明提供的方法制得的多能血管祖细胞与骨髓间充质干细胞具有相似的表型，高表达率说明多能血管祖细胞的纯度超过95%，接近100%。
实施例9
取实施例6制备的多能血管祖细胞进行脂肪细胞分化试验，以骨髓来源的骨髓间充质干细胞（MSC）作为阳性对照，具体如下。
取实施例6制备的多能血管祖细胞在1000rpm下离心5分钟，获取多能血管祖细胞重悬于α-MEM基础培养基以37000个细胞/孔的密度接种在24孔板中；当细胞扩增至70％以上汇合时，将培养基更换为成脂诱导培养基，此成脂分化培养基为含有10uL / mL成脂补充剂（R＆D Systems）的α-MEM基础培养基。
阴性对照在无成脂补充剂（R＆D Systems）的α-MEM基础培养基下培养，含有最低必需培养基Eagle（Sigma）补充了10％（v / v）FBS（Hyclone），1％（v / v）青链霉素-链霉素和1％（v / v）glutamax（Sigma）。
每3天更换一次培养基，持续7-21天。为了检测由脂肪细胞产生的脂滴，将样品细胞用PBS洗涤，在室温下固定在4％多聚甲醛中10分钟，然后用PBS洗涤。样品用新鲜制备的油红O工作溶液染色30分钟，该溶液含有0.3％（w / v）油红O（Fluka，Sigma），60％异丙醇（Fisher science）和40％dH2O，然后在60％中洗涤一次异丙醇。图像由Primo Ver TM倒置显微镜（德国卡尔·蔡西斯）使用AxioVison显微镜软件拍摄。详见附图3。
附图3显示：本发明提供的方法制得的多能血管祖细胞（MVPC）与骨髓间充质干细胞（BMMSC）在成脂诱导培养基中培养14天后，经油红染色后均显示有大量的脂滴形成，同时基础培养基中的对照组无脂滴形成（放大倍数10倍）。结果表明：本发明实施例制得的多能血管祖细胞（MVPC）与BMMSC具有相似的成脂分化能力。
实施例10
取实施例5制备的多能血管祖细胞进行骨细胞分化实验，以骨髓来源的骨髓间充质干细胞（MSC）作为阳性对照，具体如下。
取实施例5制备的多能血管祖细胞，以7400个细胞/孔的密度接种在24孔板中。48小时后，换为成骨诱导培养基，该培养基含有以50μl/ ml的剂量添加了促成骨补充剂（R＆DSystems）的αMEM基础培养基。阴性对照在无添加剂的αMEM基础培养基下培养。每3天更换一次介质，持续14-21天。然后将细胞用PBS洗涤，在4℃的70％（v / v）乙醇（Fisher science）溶液中固定1小时，然后用含有40mM茜素红（Fluka，Sigma）dH2O染色细胞外钙结节沉淀物。用PBS清洗至少5次后，使用AxioVison显微镜软件通过Primo Vert™倒置显微镜（德国卡尔·蔡司）拍摄图像。详见附图4。
附图4显示：本发明提供的方法制得的多能血管祖细胞（MVPC）与骨髓间充质干细胞（BMMSC）在成骨诱导培养基中培养14天后，经茜红染色后均显示有大量的钙沉积结节形成，同时基础培养基中的对照组无钙结节形成（放大倍数10倍）。结果表明：本发明实施例制得的多能血管祖细胞（MVPC）与BMMSC具有相似的成骨分化能力。
实施例11
取实施例4制备的多能血管祖细胞进行成软骨细胞分化试验，以骨髓来源的骨髓间充质干细胞（MSC）作为阳性对照，具体如下。
取实施例4制备的多能血管祖细胞，300000个细胞在15ml离心管和0.5ml软骨诱导培养基中沉淀，其中包含高葡萄糖DMEM（HG-DMEM，Sigma）补充1％（v / v）青链霉素-链霉素，1mM丙酮酸钠（Sigma Aldrich），1％（v / v）谷氨酰胺，1％（v / v）胰岛素，转铁蛋白-硒-乙醇胺（ITS，Invitrogen），10ng / mlTGF-β3（R＆D系统），50μg/ ml抗坏血酸-2-磷酸（Sigma）将Aldrich和100nM地塞米松（Sigma Aldrich）缓慢加入每个试管中。每3天更换一次介质，持续21天。在第21天收获沉淀物，并首先在蒸馏水中洗涤，然后在Alcian blue溶液中染色，该溶液在室温下在dH2O中含有1％（w / v）Alcian blue，3％乙酸（Sigma），时间为30分钟。将沉淀在流动的自来水中洗涤2分钟。
然后将沉淀包埋并冷冻在OCT中，并在低温恒温器内将切片切成8um厚。图像由Primo Vert™倒置显微镜（德国卡尔·蔡西斯）使用AxioVison显微镜软件拍摄。详见附图5。
附图5显示：本发明提供的方法制得的多能血管祖细胞（MVPC）与骨髓间充质干细胞（BMMSC）在软骨诱导培养基中培养21天后，经阿尔新蓝染色后均显示有大量细胞外酸性多糖（糖胺聚糖）基质形成，基础培养基中的对照组无酸性多糖基质产生（放大倍数4倍）。结果表明：本发明实施例制得的多能血管祖细胞（MVPC）与BMMSC具有相似的软骨分化能力。本实施例通过脂肪形成、成骨形成和软骨形成的分化试验显示了本发明实施例制得的多能血管祖细胞与骨髓间充质干细胞具有基本相同的中胚层细胞分化功能。
实施例12
取实施例5制备的多能血管祖细胞（MVPC）分别进行成熟心血管细胞分化试验，在促血管平滑肌细胞分化诱导培养基中培养8-10天后，用4%多聚甲醛固定，使用鼠抗人抗体对心血管平滑肌细胞特异性抗原，alpha-SMA，Calponin，Myosin Heave Chain(MHC) 进行免疫组化染色，显示分化后的细胞表型。具体如下。
表2 免疫组化抗体表
附图6显示：本发明实施例制得的多能血管祖细胞（MVPC）在血管平滑肌细胞分化培养基中培养8-10天后，免疫组化染色显示分化后的细胞表达心血管平滑肌细胞特异性抗原，alpha-SMA，Calponin，Myosin Heaves Chain（MHC），放大倍数10倍。结果表明：本发明实施例制得的多能血管祖细胞（MVPC）在适当的诱导条件下能够生成成熟心血管细胞。
实施例13
取实施例6制备的多能血管祖细胞（MVPC）进行体外血管组织工程试验，将MVPCs种植在去细胞化猪小肠内膜（来源于中国陕西艾尔肤组织工程有限公司）之后，使用生物反应器经过14天的培养形成了类血管的管状结构。
附图7显示：经组织学染色分析，H&E染色显示多层细胞均匀分布于支架材料表面，形成类似血管组织结构。结果表明：本发明实施例制得的多能血管祖细胞（MVPC）在血管组织工程实验中经免疫组织化学分析显示工程化多能血管祖细胞（MVPC）结合支架材料能够生成类血管组织，具有良好的血管再生能力。
实施例14
取实施例7制备的多能血管祖细胞（MVPC）进行体外促血管生成试验。结果MVPCs与脐静脉血管内皮细胞混合种植于Matrigel（BD bioscience）后，经过6小时开始形成类毛细血管的网状结构，至24小时到达高峰。
附图8显示：本发明实施例制得的多能血管祖细胞（MVPC）通过与脐静脉血管内皮细胞混合种植于Matrigel后形成类似毛细血管网络。结果表明：本发明实施例制得的多能血管祖细胞（MVPC）具有良好的促血管生成能力，具可促进微血管网形成。
以上实施例8-14选用部分实施例制得的多能血管祖细胞进行了流式细胞术、成脂分化试验、成骨分化试验、软骨分化试验、成熟心血管细胞分化试验和体外血管组织工程与促血管生成试验等，试验表明本发明部分实施例制得的多能血管祖细胞具有中胚层干细胞多分化潜力和扩增能力，以及血管修复再生与改善局部血液循环的能力。需要说明的是，申请人利用本发明提供的包括实施例1-7的方法制得的多能血管祖细胞在进行上述实验后得到了几乎相同的实验结果。
以上所述仅为本发明具体实施方式中较佳实施例，并非对本发明保护的技术方案的限定，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术方案范围内，对本发明的技术方案的发明构思进行等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种利用自体血清从脐血中获取表达CD146和NG2但不表达CD31的多能血管祖细胞的方法，其特征在于，包括：
步骤A. 从脐血中获取血清；
步骤B. 用步骤A获取的血清制备第一培养基和第二培养基；
步骤C. 从脐血中获取单核细胞；
步骤D. 将步骤C获取的单核细胞重悬于步骤B制备的第一培养基后接种于培养皿，多次更换第一培养基，直至细胞集落形成；所述多次更换第一培养基是指：
第一次更换：接种后12~24小时，更换第一培养基以去除悬浮细胞；
第二次更换：第一次更换第一培养基后72~96小时，再更换第一培养基以去除悬浮细胞；
第N次更换：自第二次更换第一培养基起，每隔72小时更换一次第一培养基，直至细胞集落形成；
步骤E. 步骤D所述细胞集落形成后，将第一培养基更换为步骤B制备的第二培养基，多次更换第二培养基，制得表达CD146和NG2但不表达CD31的多能血管祖细胞；所述多次更换第二培养基是指：
所述细胞集落形成后，将第一培养基更换为第二培养基，自更换第二培养基起，每隔72小时更换一次第二培养基，直至达到70%-80%细胞融合度，制得表达CD146和NG2但不表达CD31的多能血管祖细胞；
步骤A所述的脐血与步骤C所述的脐血为同一来源；
所述步骤B制备的第一培养基为含有5-20%血清的培养基，所述步骤B制备的第二培养基为含有低于第一培养基血清浓度的培养基；
所述步骤C包括：
步骤C1. 将脐血加入到含有玻璃微珠的PBS溶液中震荡；
步骤C2. 去除玻璃微珠，获得含有脐血的PBS混合液；
步骤C3. 将含有脐血的PBS混合液加入到含有Ficoll细胞分离液中离心；
步骤C4. 获取血浆层和分离液层之间的白膜层，即得所述单核细胞；
其中，步骤C1所述脐血的加入量与含有玻璃微珠的PBS溶液的使用量为1:1-1:3；步骤C1所述震荡的持续时间为0.5-5分钟；
步骤C3所述Ficoll细胞分离液的浓度为l.073-l.077g/mL；步骤C3所述含有脐血的PBS混合液的加入量与Ficoll细胞分离液的使用量为体积比2:1-3:1；步骤C3所述离心的持续时间为25-40分钟。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养皿为经胶原蛋白与纤维蛋白混合预处理的培养皿。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A包括：使脐血自然凝固后进行离心，获取上层，即得血清。
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| 胎盘间充质干细胞研究进展;张迪等;《安徽医学》;20101231;第31卷(第12期);全文 * |
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