CN111939176B - 一种含有脂肪干细胞的皮肤损伤修复剂及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种含有脂肪干细胞的皮肤损伤修复剂及制备方法。本发明制备的转基因miR34a脂肪干细胞，其中所述miR的高表达能够促进脂肪干细胞向皮肤细胞的分化。将所述的转基因miR34a脂肪干细胞制备成为皮肤损伤修复剂之后，通过验证证明了其具有较显著的促进伤口愈合效果，因此可用于消炎，皮肤再生或伤口愈合。

Description

一种含有脂肪干细胞的皮肤损伤修复剂及制备方法

技术领域

本发明涉及生物领域，具体的涉及一种含有脂肪干细胞的皮肤损伤修复剂及制备方法。

背景技术

生物体的组织、器官中存在一定数量的干细胞。以维持其再生或者参与损伤后的组织修复干细胞是一类具有多向分化潜能和自我更新特点的增殖速度缓慢的原始细胞，可以广泛运用于医学发展的各个领域，皮肤损伤的治疗、组织再生及年轻化就是其中的一个部分。严重烧伤患者常应用同种异体皮肤移植。然而这种移植一般仅能起到暂时覆盖创面的作用近30年。许多患者得益于通过细胞培养而得到的细胞治疗产品通过自体表皮角质细胞的培养。大量严重烧伤患者得到了有效治疗。

已有的研究证实，多能干细胞可分化为表皮细胞和真皮细胞。多种组织工程皮肤产品已获得美国FDA批准，Green等通过体外培养患者的角质细胞并将这些细胞产品应用于大面积烧伤患者，可以预防感染和脱水。另外，利用同种异体细胞进行临时表皮细胞替代的治疗方法还可以运用于其他皮肤疾病的治疗。特别是某些皮肤溃疡性疾病和某些遗传性皮肤病伤口治愈可能并不需要移植组织的永久保存。事实上，无论是生物性的无细胞基层。或者甚至是包含有纤维、胶原蛋白和透明质酸等生物性物质的基层等。在对其进行自体移植的时候。都会和同种异体的角质细胞移植时出现相同的情况。及逐渐排斥除了对创面的临时覆盖作用。还可以刺激细胞的内生性增殖和创面周围正常组织中的干细胞向创面聚集。

目前。皮肤再生医学方面还包括基因治疗相关内容。如以Ⅶ型胶原基因转染治疗恶性营养障碍性表皮水疱症等创伤愈合过程中，生长因子调控着损伤后皮肤再生的全过程，包括细胞趋化、增殖、基质合成与降解、炎症反应等多个方面。因此，在以往的临床实践中，常采用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和角朊细胞生长因子(KGF)等促有丝分裂的生长因子以加速创面愈合和改善创面修复。然而，上述生长因子的外用效果十分有限，可能与生长因子的半衰期短暂、活性作用和生物利用度较低或需要携带其他(蛋白)分子等因素有关。基因治疗的优点是可以克服生长因子外用的种种不足能够通过局部活细胞主动和长期的表达来实现。目前，角朊细胞进行基因转染的技术较为成熟，但随着角朊细胞的不断分化，移植物在活体最终以“痂皮”的形式脱落。因此，除干细胞外，将基因导入其他成体细胞尚无法取得良好的治疗效果。

随着组织工程技术研究的深入,应用组织工程皮肤修复皮肤缺损是目前皮肤缺损修复研究的热点之一,脂肪组织来源干细胞(adipose tissue2derived stem cells,ADSC),由于来源广泛,取材方便,具有多向分化潜能[,在皮肤的创面微环境下有向血管内皮细胞和表皮细胞分化的可能,是皮肤组织工程种子细胞的理想来源。2001年，Zuk等第一次在脂肪组织中找到间充质干细胞，称为脂肪源性干细胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)，是一种具有多项分化潜能的干细胞，近年来成为干细胞中的“明星”细胞，成为各种损伤修复研究的重点。

目前，虽然已经有研究将脂肪干细胞用于皮肤损伤的治疗，但是其使用时干细胞转化为皮肤细胞的效率还不高，活性还不好，还有待于进一步的提高。

发明内容

本发明克服了现有技术的缺陷，提供了一种能够将来源广泛的脂肪干细胞高效的转化为皮肤细胞的方法。

发明人在研究脂肪干细胞分化皮肤的过程中，发现了miR-126和miR34a在脂肪干细胞向皮肤细胞分化时是高表达的存在，初步推定该所述miR的高表达能够促进脂肪干细胞向皮肤细胞的分化，并且在对分化的细胞进行蛋白鉴定时发现二个miR均能够上调RUNX2蛋白的表达，而RUNX2蛋白本身也是促进脂肪干细胞向表皮分化的重要蛋白，因此，初步鉴定miR-126和miR34a通过一系列的细胞调控来正向影响RUNX2的表达进而促进了脂肪干细胞向皮肤细胞的分化。

本发明一方面，提供了一种转miR34a基因的脂肪干细胞。

具体的，所述转基因脂肪干细胞的构建方法是合成miR-34a前体的寡聚核苷酸序列：miR-34a前体的寡聚核苷酸正向引物5′-TGCTGCGTCACCTCTTAGGCTTGGA-3′，miR-34a前体的寡聚核苷酸反向引物5′-CCTGCATTGGTGTCGTTGTGCTCTC-3′，退火产生miR-34a前体双链寡聚核苷酸克隆到载体pcDNA3.1(-)，得到重组质粒pcDNA3.1(-)-miR-34a进而转染到脂肪干细胞中获得的。

本发明的转染是指通过注射基因DNA，质粒DNA，病毒DNA引起基因导入和感染。具体地，表达载体的转染可以通过使用本领域已知的所有可用的转染方法来进行，包括磷酸钙转染，电穿孔，显微注射，脂质体注射等。另外，DNA可使用病毒或细菌作为载体引入真核细胞。

本发明还提供一种转基因脂肪干细胞分化为皮肤细胞的方法，所述方法为将转基因脂肪干细胞常规培养至细胞融合度达50％时，换成表皮诱导培养基诱导培养7天，隔天半量换液一次。表皮诱导条件培养基配方：DMEM:DF12＝1:1、20ng/ml表皮细胞生长因子、15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1％胰岛素-转铁蛋白-硒复合物、0.1μM地塞米松、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。

本发明的另外一个方面，还提供了一种皮肤损伤修复剂，其制备方法为称取无水海藻酸钠，加入去离子水均匀搅拌至溶解，再加入甘油混匀，然后加入的无血清间充质干细胞培养基充分混匀得到修复基础液；向1ml修复基础液中加入转miR基因干细胞悬液，表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子，再加入透明质酸钠液，搅拌均匀后即得转基因皮肤损伤修复剂。

本发明制备的所述皮肤损伤修复剂是一种膏状物，可均匀涂抹于皮肤创面而形成一种覆盖物。使用本细胞修复剂，可诱导形成新生的表皮和真皮，并促进创面边缘的自身皮向创面内生长进而高效的促进愈合，最快只要7d，远远快于现有技术的愈合促进剂。

本发明另外一个方面，提供了转miR-34a基因的脂肪干细胞在制备治疗皮肤损伤的药物中的用途。

本发明的又一个目的是提供一种用于皮肤再生的药物组合物，包括转miR34a基因的脂肪干细胞的组分。

本发明的又一个目的是提供一种用于伤口愈合的药物组合物，其包括转miR34a基因的脂肪干细胞。

本发明的药物组合物可以包括药学上可接受的载体，并且可以按照已知的方法配制成透皮剂量，例如液体，悬浮液，乳剂，洗剂，软膏等。

药学上可接受的载体可以包括水性稀释剂或溶剂如磷酸盐缓冲盐水、纯净水、无菌水等和非水稀释剂或溶剂如丙二醇、橄榄油等，它可任选地包括润湿剂、调味剂、防腐剂。

本发明的药物组合物可被配制成适合于所需的给药途径。给药途径可以是经皮涂覆给药。所述药物中还可包括以下组分:无菌稀释剂，例如注射用水，盐水，固定油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶液；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如乙酸酯，柠檬酸酯或磷酸盐；和张力控制器，如氯化钠或葡萄糖。pH可以是酸或碱，例如，用盐酸或氢氧化钠控制。

全身给药也可以通过粘膜或透皮途径。对于透粘膜或透皮给药，在制剂中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。这样的渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括，例如，用于经粘膜给药的洗涤剂和胆盐。透粘膜给药可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。对于透皮给药，活性化合物被配制成软膏剂，膏剂，凝胶剂或霜剂，如本领域中通常已知的。

本发明的另外一个方面，还提供一种化妆品组合物，所述本发明的“化妆品组合物”可以根据使用本发明的转基因脂肪干细胞制备成各种类型。例如，化妆品组合物可以制成肠溶产品，香波，洗发剂，发乳，发乳，发胶等类型，并且可以通过用清洁溶液，收敛溶液和保湿溶液稀释它来使用。此外，该化妆品组合物可以包括通常用于化妆品组合物领域的常用助剂，例如稳定剂，溶解剂，维生素，色素和调味剂。

本发明的另外一个方面，制备转基因脂肪干细胞的美容产品。具体为制备转基因脂肪干细胞来源的皮肤再生修复美容面膜，如下成分组成：

1)10ml实施例4制备的含转基因脂肪干细胞的皮肤损伤修复剂；

2)1张水凝胶膜；

将面膜装入含10ml修复剂的锡箔纸袋中，热缩密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下保存。

有益效果

根据本发明制备的转基因miR34a脂肪干细胞，其中所述miR的高表达能够促进脂肪干细胞向皮肤细胞的分化，并且在对分化的细胞进行蛋白鉴定时发现二个miR均能够上调RUNX2蛋白的表达，而RUNX2蛋白本身也是促进脂肪干细胞向表皮分化的重要蛋白。将所述的转基因miR34a脂肪干细胞制备成为皮肤损伤修复剂之后，通过验证证明了其具有较显著的促进伤口愈合效果，因此可用于消炎，皮肤再生或伤口愈合。

附图说明

图1miR基因表达量结果图

图2RUNX2表达量结果图

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。

实施例1脂肪干细胞的分离筛选

无菌条件下提取脂肪组织约15g,PBS液洗去红细胞。眼科剪剔除脂肪组织中可见血管,剪碎至细小颗粒,0.25％I型胶原蛋白酶消化,1500r/分离心10分钟,去除脂肪细胞及上清液,D-hanks液重悬沉淀,200目细胞筛过滤,1500r/分离心10分钟,所得细胞提取物用含15％胎牛血清的高糖DMEM培养液重悬,以适当密度接种于无菌培养瓶中,在37℃、CO₂体积分数为5％、饱和湿度的培养箱中孵育,5天后首次换液,之后3天换液1次,待原代细胞达85％融合时,以0.25％胰蛋白酶将贴壁细胞消化分离3-5分钟,进行传代,接种于25ml培养瓶中,3天换液1次,当贴壁细胞接近融合时再次传代。流式细胞仪对第3代脂肪干细胞表面相对特异性抗原进行检测。0.25％胰蛋白酶消化待检细胞,1500r/分离心10分钟,在细胞沉淀中分别加入FITC-CD44荧光抗体,PE-CD29荧光抗体,APC-CD105荧光抗体各20μL,孵育30分钟,再用PBS缓冲液清洗2遍,最后用10％福尔马林固定细胞,上机测定抗原的阳性率，结果显示CD29、CD44、CD105、CD13的间充质干细胞的特征性表面标志在脂肪干细胞中均阳性表达说明脂肪干细胞具有间充质干细胞表型分离成功。以第三代脂肪间充质干细胞作为细胞基础进行后续研究。

实施例2miR-34a转染脂肪干细胞

合成miR-34a前体的寡聚核苷酸序列：miR-34a前体的寡聚核苷酸正向引物5′-TGCTGCGTCACCTCTTAGGCTTGGA-3′，miR-34a前体的寡聚核苷酸反向引物5′-CCTGCATTGGTGTCGTTGTGCTCTC-3′，退火产生miR-34a前体双链寡聚核苷酸克隆到载体pcDNA3.1(-)，得到重组质粒pcDNA3.1(-)-miR-34a。

将实施例1分离得到的第三代脂肪干细胞培养到对数期后，采用0.15％胰酶消化，PBS洗涤，以每孔2*10⁵个细胞铺于6孔板中12h按说明书运用脂质体Lipo-fectamine 2000转染试剂进行转染。分别设置空白对照组，空载体对照组和实验组。72h后收集转染的细胞，提取总RNA，然后按照试剂盒操作将总RNA逆转录成cDNA，采用RT-PCR的方法，检测miR-34a的表达，PCR反应条件：95℃预变性10min；95℃变性20s，62℃退火l min，40个循环。每个样本重复PCR反应3次。采用Δ循环阈值(Ct)法处理结果，计算相对表达量2^-ΔΔCt。结果如图1所示。实验组细胞转染72h后，miRNA-34a的相对表达量2.97±0.13，远高于对照组，比较差异均有统计学意义(P<0.05)。这说明miR-34a得到了高表达。

实施例3转染miR-34a的脂肪干细胞的表皮化诱导

将实施例2中的转染后的阳性细胞进行表皮化诱导实验。分为实验组1(转染miR-34a的脂肪干细胞)，实验组2(未转染miR-34a的脂肪干细胞)，对照组(正常的脂肪干细胞)。对照组采用含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基常规培养，实验组常规培养至细胞融合度达50％时，换成表皮诱导培养基诱导培养7天，隔天半量换液一次。表皮诱导条件培养基配方：DMEM:DF12＝1:1、20ng/ml表皮细胞生长因子、15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1％胰岛素-转铁蛋白-硒复合物、0.1μM地塞米松、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。倒置显微镜下观察细胞形态变化结果发现，实验组1和2的细胞中出现较为典型的上皮样细胞形态，而对照组没有表现上皮样细胞形态的细胞。

将脂肪干细胞向表皮细胞诱导分化7天的细胞用PBS缓冲液润洗一次后，加入4％的多聚甲醛室温固定15分钟，含0.3％Triton X100的PBS缓冲液对细胞进行穿膜处理，随后用含10％山羊血清的PBS缓冲液对细胞进行封闭，加入小鼠抗人细胞角蛋白CK19单克隆抗体一抗工作液(1:50)4℃孵育过夜，标记山羊抗鼠的FITC荧光二抗，4℃避光孵育30min，用PBS缓冲液充分洗涤细胞三次，在荧光显微镜下观察结果。脂肪干细胞向表皮细胞诱导，表达表皮干细胞所特有的表面标志CK19，显微镜(100×)下随机计数10个视野内的细胞总数和完全分化的细胞数，经统计学分析显示如表1所示。

表1细胞分化效率结果

组别	细胞分化效率(％)
		实验组1	90.1±3.6
实验组2	62.5±2.5
		对照组	0

从表1的结果可以看出，实验组1的细胞分化效率为90.1±3.6，实验组2的细胞分化效率为62.5±2.5，而对照组没有分化。这说明miR-34a可以显著的促进脂肪干细胞细胞分化效率。在体外诱导条件下，脂肪干细胞具备较强的表皮细胞分化能力。

实施例4蛋白检测

提取转染前、转染后以及转然后诱导的实验组和对照组的总蛋白，用二辛丁酸法进行蛋白定量，100℃变性10min，各取50μg行PAGE凝胶电泳，转移至硝酸纤维滤膜上，封闭。分别加入兔抗人RUNX2一抗、兔抗人β-actin一抗(稀释比均为1∶200)，4℃孵育过夜；TTBS液冲洗后加入羊抗兔IgG-HRP二抗(稀释比为1∶5000)，室温孵育2h；TTBS液冲洗后曝片，胶片用扫描仪扫描成像，Image Pro-plus6.0图像分析软件进行灰度分析，结果以目的蛋白与β-actin的灰度值比值表示。实验重复3次。结果如图2所示：

Western blot显示在诱导之前，转染了miR的脂肪干细胞其中的RUNX2蛋白比未转染的已经得到了高表达。而经过诱导之后，RUNX2蛋白的表达水平达到了90.4±2.1显著高于对照组(图2)。可见miR-34a能够有效的增加RUNX2过表达继而促进人ADSCs向表皮诱导分化。

实施例5皮肤损伤修复剂的制备

称取6g无水海藻酸钠，加入38ml去离子水均匀搅拌至溶解，再加入22ml甘油混匀，然后加入40ml的无血清间充质干细胞培养基充分混匀得到修复基础液；向1ml修复基础液中加入1.0×10⁵细胞/ml实施例2制备的转基因干细胞悬液1ml，20ng表皮细胞生长因子、15ng碱性成纤维细胞生长因子，再加入1ml质量浓度为1％的透明质酸钠液，搅拌均匀后即得转基因皮肤损伤修复剂。

称取6g无水海藻酸钠，加入38ml去离子水均匀搅拌至溶解，再加入22ml甘油混匀，然后加入40ml的无血清间充质干细胞培养基充分混匀得到修复基础液；向1ml修复基础液中加入1.0×10⁵细胞/ml实施例1制备的干细胞悬液1ml，20ng表皮细胞生长因子、15ng碱性成纤维细胞生长因子，再加入1ml质量浓度为1％的透明质酸钠液，搅拌均匀后即得脂肪干细胞皮肤损伤修复剂。

称取6g无水海藻酸钠，加入38ml去离子水均匀搅拌至溶解，再加入22ml甘油混匀，然后加入40ml的无血清间充质干细胞培养基充分混匀得到修复基础液；向1ml修复基础液中加入20ng表皮细胞生长因子、15ng碱性成纤维细胞生长因子，再加入1ml质量浓度为1％的透明质酸钠液，搅拌均匀后即得对照皮肤损伤修复剂。

实施例6小鼠实验

大鼠背部全层皮肤缺损模型的建立：10％水合氯醛对大鼠进行腹腔注射麻醉(0.3ml/lO0g)，依次制作直径为2cm全层皮肤缺损的圆形创面，脊柱两侧对称分布，创面间隔为2cm。选取12只大鼠，每只大鼠背部6个创面共72个创面。将每只大鼠背部创面分为3组，每组为脊柱两侧对称的两个圆形创面，从头至尾依次为转基因BMSCs组(A组)，未转基因BMSCs组(B组)，无菌PBS对照组(C组)，模型做好后A组创面中心和边缘涂抹实施例5制备的转基因皮肤损伤修复剂，B组创面中心和边缘涂抹实施例5制备的脂肪干细胞皮肤损伤修复剂，C组涂抹对照皮肤损伤修复剂，涂抹完成后纱布覆盖、打包法处理创面，大鼠单笼饲养，自由饮食。分别在创伤后3、7、14d观察创面面积，计算创面愈合指数(WCI)，WCI＝(1一处理后创面面积/原始创面面积)×100％。用SPSS13.0软件进行统计学分析。从表2结果可以看出：

各组大鼠愈合面积比随着治疗天数的增加而增加，A组与B组较C组增加明显。其中在第3天、7天、第14天时，A组较C组大鼠的愈合面积比有明显增加，B组较C组大鼠愈合面积比在14天时有明显增加。且A组较B组在第7天、第14天时愈合面积比有统计学差异(P<0.01)(表2)。特别是A组在14天后，愈合达到了99.97％基本全部愈合。从结果可以看出，本发明制备的转基因脂肪干细胞具有较好的皮肤损伤治疗的作用。

与B组比较*P<0.05；与C组比较#P<0.05。

在使用细胞修复剂后14天，伤口愈合，柔韧性较好；而对照组的创口则需要21天才能愈合，且有广泛的瘢痕收缩，这说明本发明的修复剂具有较好的应用前景。

实施例7制备转基因脂肪干细胞的美容产品

制备转基因脂肪干细胞来源的皮肤再生修复美容面膜，如下成分组成：

1)10ml实施例4制备的含转基因脂肪干细胞的皮肤损伤修复剂；

2)1张水凝胶膜；

将面膜装入含10ml修复剂的锡箔纸袋中，热缩密封包装，形成产品；该生物面膜产品保存在4℃条件下保存。

序列表

<110> 北京瀚梅生物科技有限公司

<120> 一种含有脂肪干细胞的皮肤损伤修复剂及制备方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgctgcgtca cctcttaggc ttgga 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cctgcattgg tgtcgttgtg ctctc 25

Claims (1)

1.miR-34a在促进脂肪干细胞向表皮细胞分化中的用途，其特征在于：在脂肪干细胞中过表达miR-34a，将过表达miR-34a的脂肪干细胞常规培养至细胞融合度达50％时，换成表皮诱导培养基诱导培养7天，隔天半量换液一次，表皮诱导条件培养基配方：DMEM:DF12＝1:1、20ng/ml表皮细胞生长因子、15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、1％胰岛素-转铁蛋白-硒复合物、0 .1μM地塞米松、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素，所述的用途是非治疗目的的。

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