KR20160000030A - 피부 또는 혈관조직 손상 치료 보조용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 LED 광원을 이용하여 적색 파장대의 빛을 조사함으로써 혈관손상, 피부궤양 또는 상처를 치료하는 방법에 있어서, 이의 치료효과를 향상시키기 위하여, 환부 이식용 스페로이드를 포함하는 치료 보조용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 적색 파장대의 빛을 이용한 혈관손상, 피부궤양 또는 상처의 치료 보조용 조성물을 이용하면 생체내에서 손상된 혈관 또는 피부의 재생을 유도할 수 있으므로, 보다 효과적인 혈관손상, 피부궤양 또는 상처 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

피부 또는 혈관조직 손상 치료 보조용 약학 조성물{Pharmaceutical adjuvant composition for treating damages of skin or blood vessel tissue}

본 발명은 피부 또는 혈관조직 손상 치료 보조용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 LED 광원을 이용하여 적색 파장대의 빛을 조사함으로써 피부 또는 혈관조직 손상을 치료하는 방법에 있어서, 이의 치료효과를 향상시키기 위하여 사용되는, 환부 이식용 스페로이드를 포함하는 치료 보조용 약학 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 분화란 초기 단계의 세포가 각 조직으로서의 특성을 갖게 되는 과정을 말하는데, 그 대표적인 예는 동물의 발생 과정에서 볼 수 있다. 즉, 정자와 난자가 결합하여 만들어진 수정란이라는 하나의 세포가 뼈, 심장, 피부 등의 다양한 조직 세포로 만들어지기 위해서는 '분화'가 일어나야 하는 것이다. 이러한 분화능력을 가지고 있는 줄기세포(stem cell)는 조직을 구성하는 각 세포로 분화되기 전단계의 세포로서, 미분화 상태에서 무한 증식이 가능하며 특정 분화 자극에 의해 다양한 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재적 가능성을 가진 세포를 의미한다.

최근에, 인간 지방조직(adipose tissue)에 자가 재생능력이 뛰어나고, 간, 골, 연골, 지방, 혈관, 심장, 신경계 등과 같은 다양한 세포로 분화될 수 있는 미분화 세포군이 포함되어 있음이 보고되었다(B. Cousin 등, BBRC 301: 1016, 2003; Miranville 등, Circulation 110: 349, 2004; S. Gronthos 등, J. Cell Physiol. 189: 54, 2001; M.J. Seo 등, BBRC 328: 258, 2005). 이러한 지방조직 유래 다분화능 줄기세포로서 지방줄기세포(adipose-derived stem cells; ASCs)는 중간엽계 줄기세포와 비교하여 지방조직을 대량으로 추출할 수 있다는 점에서 취득과정이 용이하고 안전하며, 조직수급상의 제한이 없는 장점과 체외배양이 용이하여 조직 접근성, 안정성, 유효성, 그리고 경제적 측면에서 이점을 가지고 있어 다분화능 줄기세포의 새로운 공급원으로서 주목받고 있다.

지금까지 알려진 지방줄기세포로는 상피세포로 분화 가능한 인간 지방줄기세포(Martin Brzoska 등, BBRC 330: 142, 2005), 골 형성 및 지방세포로 분화 가능한 인간 지방줄기세포(Ying Cao 등, BBRC 332: 370, 2005), 신경세포로 분화 가능한 인간 지방줄기세포(Kristine M. Safford 등, BBRC 294: 371, 2005), 지방세포로 분화 가능한 쥐 지방줄기세포(Rei Ogawa 등, BBRC 319: 511, 2004), 골 형성 및 연골 형성 세포로 분화 가능한 쥐 지방줄기세포(Rei Ogawa 등, BBRC 313: 871, 2004), 연골세포로 분화 가능한 인간 지방줄기세포(Hani A. Awad 등, Biomaterials 25: 3211, 2004), 신경세포로 분화 가능한 쥐 지방줄기세포(Juri Fujimura 등, BBRC 333: 116, 2005), 및 골세포, 연골세포, 신경세포 또는 근육세포로 분화가능한 지방줄기세포(미국특허 제6,777,231호) 등이 있다.

한편, 당뇨성 질환 등에 의한 피부궤양의 초기병변은 염증반응에 의한 혈관내피세포의 손상이 주된 원인으로 알려져 있다. 정상 혈관내피세포들은 염증세포와 상호작용이 일어나지 않는 반면, 혈관내피세포에 염증이 일어나면 염증세포와 상호작용이 일어나 염증세포가 혈관벽에 달라붙어 염증반응이 일어나게 된다. 이러한 피부궤양 및 피부상처를 치료하는 방안으로서, 줄기세포를 이용한 세포치료제가 주목받고 있다. 예를 들어, 지방줄기세포를 육종마우스로부터 분리된 특수한 세포외 기질 성분인 마트리겔(matrigel)이 코팅된 배양용기에서 다양한 성장인자가 첨가된 배지를 이용하여 배양하면 혈관내피세포로 분화될 수 있고(Cao Y, 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 332: 370-379, 2005), 무혈청 배지에서 지방줄기세포를 배양하여 스페로이드(spheroid)를 형성한 후 이를 조혈모세포 배양배지에서 일주일간 배양하여 Flk-1을 다량 발현하는 혈관내피세포를 획득할 수 있음이 보고되었다(Martinez-Estrada O.M., 등, Cardiovasc. Res. 65(2): 328-33, 2005). 그러나, 줄기세포를 이용한 치료법은 줄기세포를 목적하는 조직세포로 분화시키는 것이 용이하지 않고, 목적하는 조직세포로 분화된 경우에도 면역거부반응이 일어날 수 있다는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 줄기세포를 직접 생체내에 이식하는 방안이 연구되고 있으나, 아직까지는 생체내에서 목적하는 조직세포로 줄기세포의 분화를 유도하는 기술의 개발수준이 낮아 추가적인 시간과 비용이 필요한 실정이다.

한편, 줄기세포와는 달리 생체내의 재생효과를 극대화 시켜서, 손상된 혈관을 자가치료하는 방법이 모색되기도 하였다. 예를 들어, 미국 특허공개 제2011-0137385호에는 허혈성 질환이 발병된 환부에 600 내지 1,000nm 파장의 빛을 조사하는 단계를 포함하는 혈관질환 치료방법이 개시되어 있는데, 상기 빛을 혈관이 손상된 환부의 외부에서 조사하면, 상기 조사된 빛에 의하여 손상된 혈관내피세포의 증식이 촉진되어 손상된 혈관을 재생 및 복구됨으로써, 결과적으로는 혈관손상을 치료할 수 있다. 상기 방법은 외부에서 빛을 조사할 뿐, 환자의 생체내에 어떠한 것도 투여되지 않기 때문에, 안전성이 극히 높다는 장점이 있는 반면, 생체내의 자가 회복력을 증진시키는 것이기 때문에 치료에 많은 시간이 소요된다는 단점이 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 보다 효과적으로 피부궤양 및 상처를 치료하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 지방줄기세포로부터 유도되어 혈관신생 관련 단백질 및 피부재생과 관련된 성장인자가 발현하는 스페로이드를 피부궤양 및 상처에 이식하고, 상기 혈관손상부에 적색파장대의 빛을 조사하면, 상기 조사된 적색파장대의 빛에 의하여 촉진된 생체내 자가 회복력을 상기 스페로이드가 보조하여, 피부궤양 및 상처를 보다 효과적으로 치료할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 지방줄기세포에서 유도된 스페로이드를 포함하는 피부 또는 혈관 조직 손상 치료 보조용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 보다 효과적으로 피부궤양 및 상처를 치료할 수 있는 방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, LED 광원을 이용하여 빛을 조사하는 방법에 주목하게 되었다. 즉, LED 광원에서 생성된 적색파장대의 빛을 피부궤양 및 상처 환부에 조사하면 환자의 자가 회복력을 증진시켜서 피부궤양 및 상처를 치료할 수 있다. 다만, 생체내의 자가 회복력을 증진시키는 것이기 때문에 치료에 많은 시간이 소요된다는 단점이 있는데, 이러한 단점을 극복하기 위하여, 줄기세포를 이용하는 방안을 연구한 결과, 줄기세포가 아닌 줄기세포로부터 형성된 스페로이드를 이용할 경우, 상기 적색파장대의 빛을 이용한 치료법의 단점인 시간의 과다한 소요라는 점을 해소하여, 보다 신속하게 피부궤양 및 상처를 치료할 수 있음을 확인하였다. 구체적으로, 줄기세포에서 생성된 스페로이드를 생체에 이식하고, 이식된 부위에 지속적으로 적색 파장대의 빛을 조사하면, 상기 스페로이드로부터 피부궤양 및 상처를 치료를 촉진할 수 있는 다양한 혈관생성 및 피부재생인자(FGF, VEGF, HGF 등)의 발현 및 분비가 촉진되어, 상기 스페로이드가 혈관재생 및 피부재생이 촉진될 수 있다.

따라서, 지방줄기세포로부터 형성된 스페로이드는 피부궤양 및 상처를 치료하기 위한 적색 파장대의 빛을 이용한 피부궤양 및 상처 치료법을 보조할 수 있는 약학 조성물의 유효성분으로서 사용될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 지방줄기세포로부터 유래된 스페로이드를 유효성분으로 포함하는, 적색 파장대의 빛을 이용한 피부 또는 혈관 조직 손상 치료 보조용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "지방줄기세포(adipose-derived stem cells; ASCs)"란, 지방조직(adipose tissue)에 존재하는 자가 재생능력이 뛰어나고, 간, 골, 연골, 지방, 혈관, 심장, 신경계 등과 같은 다양한 세포로 분화될 수 있는 미분화된 성체줄기세포를 의미한다. 상기 지방줄기세포는 중간엽 줄기세포와 비교하여 지방조직을 대량으로 추출할 수 있다는 점에서 취득과정이 용이하고 안전하며, 조직수급상의 제한이 없는 장점과 체외배양이 용이하여 조직 접근성, 안정성, 유효성, 그리고 경제적 측면에서 장점이 있다.

본 발명에서 제공하는 지방줄기세포는 스페로이드(spheroid) 또는 3차원 세포집합체(3D cell mass, 3DCM)라고 알려진 세포괴를 형성할 수 있는데, 상기 스페로이드는 특별히 제한되지 않는다. 상기 지방줄기세포의 배양시 정지배양, 진탕배양 등의 방법을 제한없이 사용할 수 있으며, 저산소 환경에서 배양시 더 효과적이다. 통상적으로 상기 스페로이드는 배양시간의 경과에 따라 그의 직경이 지속적으로 증가하는데, 직경이 1mm 이상으로 커지면, 내부적으로 세포괴사가 발생하여 이를 활용할 수 없는 문제점이 있다. 또한, 상기 스페로이드의 직경이 적어도 500 ㎛ 이상일 때 스페로이드 내부가 저산소 환경이 만들어지고 저산소 환경일 때 발현하는 HIF-1a 단백질이 발현한다. HIF-1a 시그널에 의해 혈관생성 및 피부재생인자(FGF, VEGF, HGF 등)의 발현 및 분비가 촉진되어 지는데 저산소 환경에서 배양시 더 효과적이다. 또한 외부에서 혈관생성 및 피부재생인자(FGF, VEGF, HGF 등)의 발현 및 분비가 촉진할 수 있는 외부적인 자극(광조사)을 가하면 더욱 효과적일 수 있다. 따라서, 적절한 스페로이드의 직경은 0.5 내지 1mm가 될 수 있다. 그러나, 적색 파장대의 빛을 이용한 피부 또는 혈관 조직 손상 치료를 보조하는 역할을 수행할 수 있다면, 상기 직경범위로 인하여 스페로이드의 사용이 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 스페로이드는 상기 지방줄기세포에 적색파장(600 내지 700nm) 대의 빛을 조사하여 형성될 수 있는데, 상기 스페로이드를 피부 또는 혈관 조직 손상 부위에 이식한 후, 적색파장(600 내지 700nm) 대의 빛을 조사하면 생체내에서 혈관내피세포 또는 피부세포 등으로 분화되어, 상기 적색파장 대의 빛에 의하여 촉진되는 생체내 자가 회복력을 보조할 수 있다.

따라서, 상기 스페로이드를 적색 파장대의 빛을 이용한 피부 또는 혈관 조직 손상 치료의 보조용 약학조성물의 유효성분으로 사용할 수 있으며, 상기 유효성분으로는 상기 스페로이드 뿐만 아니라, 스페로이드 배양액, 스페로이드 세포 파쇄물 등을 사용할 수도 있다. 이처럼 상기 스페로이드를 적색 파장대의 빛을 이용한 피부 또는 혈관 조직 손상 치료의 보조용 약학조성물의 유효성분으로 사용하는 기술은 지금까지 전혀 알려지지 않았으며, 본 발명자들에 의하여 최초로 개발되었다.

한편, 상기 스페로이드의 형성을 촉진하기 위하여, 소수성을 부여하는 고분자로 표면 처리된 배양용기 또는 상기 고분자로 제조된 배양용기에 접종하여 배양할 수 있다. 상기 소수성을 부여하는 고분자는 특별히 제한되지 않는다.

이때, 사용되는 배양용액은 지방줄기세포의 배양 및/또는 분화에 통상적으로 사용되는 배지라면 제한되지 않고 사용할 수 있고, 바람직하게는 DMEM(Dulbeco's modified eagle medium), Ham's F12 등에 혈청이 포함된 배지를 사용할 수 있으나 혈청이 첨가되지 않은 배지에서 사용하여도 무방하다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서는 DMEM과 Ham's F12가 1:1 비율로 혼합된 DMEM/F12 배지에 우 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 첨가된 배지를 사용하였다.

본 발명에서 제공하는 스페로이드는 생체내에 이식된 후, 적색 파장대의 빛이 조사되면, 혈관생성 및 피부재생인자(FGF, VEGF, HGF 등)의 발현 및 분비가 촉진되어, 결과적으로는 혈관재생 및 피부세포 분화를 촉진하여 최종적으로 피부괴사를 막고 피부재생을 촉진시킬 수 있다.

이때, 상기 적색파장대의 빛은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 LED(light emitting diode)로부터 발생된 빛을 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 LED로부터 발생되어 600 내지 700nm의 파장 및 1 내지 30W의 전력를 나타내는 빛을 사용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 LED로부터 발생되어 660nm의 파장 및 5W의 전력을 나타내는 빛을 사용할 수 있다.

아울러, 상기 빛의 조사조건 역시 지방줄기세포를 혈관내피세포로 분화시키는 것을 촉진시키는 효과를 나타내는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 이식된 부위로부터 1 내지 5cm의 간격을 두고 위치한 LED 광원을 이용하여 1일 10 내지 15분 동안 조사하는 방법을 사용할 수 있다.

아울러, 상기 지방줄기세포로부터 스페로이드를 용이하게 형성하기 위하여는, 상기 지방줄기세포를 1 × 10⁵ 내지 2 × 10⁶ 세포/㎠의 밀도로 접종함이 바람직하다. 1 × 10⁵ 세포/㎠ 미만의 밀도로 접종할 경우에는 스페로이드의 크기가 작고, 편차가 심하다는 문제점이 있고, 2 × 10⁶ 세포/㎠ 이상의 밀도로 접종할 경우에는 과다한 세포증식에 의한 세포사가 유발될 수 있다. 그러나, 1 × 10⁵ 내지 2 × 10⁶ 세포/㎠ 이상의 밀도로 접종할 경우에는, 육안으로 검출가능한 0.5 내지 1 ㎜의 직경을 갖는 스페로이드를 형성할 수 있다.

한편, 본 발명의 적색 파장대의 빛을 이용한 혈관생성 및 피부재생 치료의 보조용 약학 조성물은 살아있는 스페로이드를 유효성분으로 포함하므로, 세포치료제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 멸균수, 생리식염수, 관용의 완충제(인산, 구연산, 그 밖의 유기산 등), 안정제, 염, 산화방지제(아스코르브산 등), 계면활성제, 현탁제, 등장화제, 또는 보존제 등을 포함할 수 있다. 국소 투여를 위하여는, 바이오 폴리머 등의 유기물, 히드록시아파타이트 등의 무기물, 구체적으로는 콜라겐 매트릭스, 폴리락트산 폴리머 또는 코폴리머, 폴리에틸렌글리콜 폴리머 또는 코폴리머 및 그의 화학적 유도체, 펩타이드 단백질, 생체외 기질 단백질 (ECM), 겔 (gel) 등과 조합시켜서 제형화 할 수도 있다. 상기 스페로이드를 유지하기 위한 기제로는 생리식염수, PBS(phosphate buffered saline) 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 주사에 적당한 제형으로 조제됨이 바람직하고, 이를 위해서는, 상기 스페로이드를 약학적으로 허용되는 수용액 중에 용해되어 있거나 또는 용액상태에서 동결된 형태로 유지함이 바람직하다. 상기 조성물에는 스페로이드를 현탁 또는 희석하기 위해 사용할 수 있는, 약학적으로 허용할 수 있는 목적으로 하는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 담체로서는, 예를 들면 증류수, 생리식염수, PBS 등을 들 수 있다.

의약제제로서의 형태를 취하기 위해서 필요한 제제담체나 부형제를, 나아가서는 안정화제나 흡착방지제를 함유할 수 있고, 제형도 주사제 (피하, 피내, 근육 내, 정맥 내, 복강 내 등)등을 사용할 수 있으며, 주사 시 통증을 감소시킬 수 있는 무통화제를 사용할 수 있고, 필요에 따라 적당한 디바이스를 사용할 수 있다.

구체적인 제형으로서, 주사기나 디바이스에 담겨진 최종 주입 형태, 냉동이 가능한 크라이오바이알(cryovial)의 형태, 또는 액상의약품을 담을 수 있는 파이로젠이 없는 유리병과 고무전, 알루미늄 캡형태로 충진될 수 있다.

디바이스의 형태로는 주사기, 멀티실린지 등이 사용될 수 있으며 사지허혈성 질환의 경우에는 세포가 투여되는 동안 세포가 shear 되어 손상을 입히지 않으면서 고통을 최소화 할 수 있는 주사바늘(needle)을 이용하며 바람직하게는 20guage에서 31guage 범위에서 투여할 부위나 근육의 깊이를 고려하여 사용하며, 실린지나 디바이스가 세포 생존력에 영향을 미치지 않는 소재를 사용함이 바람직하다.

본 발명의 약학 조성물에 포함된 상기 스페로이드의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 10 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 20 내지 40 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.

상기 본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 약학조성물의 투여량은 예를 들어, 혈관손상부위 주변의 생존근(골격근 또는 심근 등)에 1개소 또는 복수 개소(예를 들면 2~50개소)에 투여할 수 있으며, 투여량은 바람직하게는 1.0 × 10⁵ 내지 1.0 × 10⁸ 세포수/kg(체중), 보다 바람직하게는 1.0 × 10⁶ 내지 1.0 × 10⁷ 세포수/kg(체중)이 될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 혈관질환이 유발된 개체에 투여하고 적색파장대의 빛을 조사하는 단계를 포함하는 피부 또는 혈관 조직 손상을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물은 그 자체로서도 혈관손상, 피부궤양 또는 상처를 치료할 수 있으나, 적색파장대의 빛이 조사될 경우에는 혈관내피세포 및 피부세포로의 분화가 촉진되어 피부 또는 혈관 조직 손상을 효과적으로 치료할 수 있다.

본 발명에서 용어 "개체"란 혈관손상, 피부 또는 혈관 조직 손상이 발생된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함한다. 이때, 상기 피부 또는 혈관 조직 손상이 유발되는 질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 허혈성 피부 궤양, 피부상처 등이 될 수 있고, 예를 들어 동맥경화증, 안정형 및 불안정형 협심증, 말초 심혈관 질환, 고혈압, 심부전증, 말초 순환장애, 심근경색증, 뇌졸중, 일과성 및 허혈성 발작, 지주막하 출혈 등의 질환이 될 수 있다.

본 발명의 피부 또는 혈관 조직 손상을 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 피내 투여될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 적색 파장대의 빛을 이용한 혈관손상, 피부궤양 또는 상처의 치료 보조용 조성물을 이용하면 생체내에서 손상된 혈관 또는 피부의 재생을 유도할 수 있으므로, 보다 효과적인 혈관손상, 피부궤양 또는 상처 치료에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 인간의 지방조직으로부터 분리한 줄기세포를 검증한 결과를 나타내는 현미경 사진 및 그래프이다.
도 2는 지방줄기세포로부터 형성된 스페로이드를 나타내는 사진이다.
도 3은 LED 조사에 의한 지방유래 줄기세포의 혈관신생 및 피부재생인자 발현량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 LED 조사하에서 배양된, 지방조직유래 중간엽 줄기세포(monolayer ASC)와 LED를 조사하면서 스페로이드를 형성한 지방조직유래 중간엽 줄기세포(spheroid ASC)에서 발현되는 혈관신생 관련 단백질의 발현수준 변화를 측정한 결과를 나타내는 도표 및 그래프이다.
도 5는 피부 창상 마우스 모델을 이용한 각각의 처리조건(control, ASCs, LLLT, spheroid 및 spheroid+LLLT)의 상처치료효과를 비교한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, A는 제작된 피부 창상 마우스 모델을 나타내는 사진이고, B는 각 실험군의 상처부위를 시간의 경과에 따라 촬영한 사진이며, C는 시간의 경과에 따른 상처부위의 면적 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6의 A는 피부 창상 마우스 모델의 상처부위에 존재하는 혈관내피세포 및 혈관외피세포의 수준을 각각의 처리조건(control, ASCs, LLLT, spheroid 및 spheroid+LLLT) 별로 비교한 결과를 나타내는 면역형광염색 사진으로서, 녹색은 혈관외피세포의 마커인 SMAa 액틴을 나타내고, 적색은 혈관내피세포 마커인 CD31을 나타낸다.
도 6의 B는 피부 창상 마우스 모델의 상처부위에 존재하는 단위면적당 미세혈관의 수를, 각각의 처리조건(control, ASCs, LLLT, spheroid 및 spheroid+LLLT) 별로 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6의 C는 피부 창상 마우스 모델의 상처부위에 존재하는 단위면적당 소동맥의 수를, 각각의 처리조건(control, ASCs, LLLT, spheroid 및 spheroid+LLLT) 별로 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 피부 창상 마우스 모델의 상처부위에 존재하는 피부세포의 수준을 각각의 처리조건(control, ASCs, LLLT, spheroid 및 spheroid+LLLT) 별로 비교한 결과를 나타내는 면역형광염색 사진으로서, 적색은 피부세포 마커인 사이토케라틴을 나타낸다.
도 8의 A는 피부 창상 마우스 모델의 상처부위에 존재하는 혈관신생 및 피부재생인자의 수준을 각각의 처리조건(control, ASCs, LLLT, spheroid 및 spheroid+LLLT) 별로 비교한 결과를 나타내는 면역형광염색 사진으로서, 적색은 각각의 혈관신생 및 피부재생인자인 FGF, VEGF 및 HGF를 나타낸다.
도 8의 B는 피부 창상 마우스 모델의 상처부위에 존재하는 혈관신생 및 피부재생인자의 수준을 각각의 처리조건(control, ASCs, LLLT, spheroid 및 spheroid+LLLT) 별로 웨스턴 블럿 분석에 의해 측정한 결과를 나타내는 사진이다.
도 8의 C는 상기 웨스턴 블럿 분석에 의해 검출된 각 혈관신생 및 피부재생인자의 수준을 각각의 처리조건별로 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 skin flap 마우스 모델을 이용한 상처치료효과를 비교한 결과를 나타내는 사진이다.
도 10은 skin flap 마우스 모델에서 촬영된 피부혈류의 흐름을 처리조건(control, ASCs, LLLT, spheroid 및 spheroid+LLLT) 별로, 1, 7 및 14일이 경과된 시점에서 비교한 결과를 나타내는 사진이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 인간의 지방유래 중간엽 줄기세포의 분리

인간 피하 지방조직으로부터 다분화능 줄기세포를 분리하고, 이를 그대로 위상차 현미경(Nikon)으로 관찰하거나, DAPI 염색을 수행하여 관찰하거나 또는 유세포분석을 수행하였다. 유세포분석 시에는 중간엽 줄기세포의 확인을 위한 표면항원으로 CD29, CD90 및 CD105를 사용하였고, 줄기세포의 분리, 배양 중 다른 세포의 혼입 여부를 관찰하기 위한 표면항원으로 CD34, CD31, KDR (Flk1) 및 α-SMA을 사용하여, 이들의 발현양상을 유세포 분석기(flow cytometry)를 사용하여 분석하였다(도 1).

도 1은 인간의 지방조직으로부터 분리한 줄기세포를 검증한 결과를 나타내는 현미경 사진 및 그래프이다. 도 1에서 보듯이, 인간 피하지방 조직에서 분리한 세포가 중간엽 줄기세포의 표현형을 가지는 지방줄기세포임을 확인하였다.

실시예 2: 중간엽 줄기세포의 스페로이드 ( spheroid : 3 DCM , 3D cell mass ) 형성

비-조직세포 배양용 24웰 플레이트의 각 웰에 웰당 5 × 10⁴ 세포수의 지방줄기세포를 접종한 후 5% FBS 함유 DMEM/F12 배지에서 3일간 배양하였다. 3일간 배양 후 각 세포접착 표면에서 지방줄기세포의 스페로이드 형성 여부를 관찰하였다(도 2).

도 2는 지방줄기세포로부터 형성된 스페로이드를 나타내는 사진이다. 도 2에서 보듯이, 배양이 종료될 때에는 약 1mm의 직경을 갖는 스페로이드가 형성됨을 확인하였다. 조직세포 배양용 24웰 플레이트에서 monolayer로 3일간 배양된 지방줄기세포는 스페로이드를 형성하지 못하였다.

실시예 3: LED 조사에 의한 지방유래 줄기세포의 혈관신생 및 피부재생인자 발현량 변화 측정

혈관신생 및 피부재생인자로서 알려진 FGF, VEGF 및 HGF의 발현량을 측정하기 위하여, LED를 조사하면서 2차원 배양된 지방세포유래 중간엽 줄기세포(monolayer ASC)와 LED를 조사하면서 스페로이드를 형성한 지방세포유래 중간엽 줄기세포(spheroid ASC)를 대상으로 하여 ELISA kit(R&D Systems)를 사용한 분석을 수행하였다(도 3). 이때, 단위 세포수(1 × 10⁴ 세포수)에서 발현되는 각 인자의 발현량을 pg 단위로 측정하였다.

도 3은 LED 조사에 의한 지방유래 줄기세포의 혈관신생 및 피부재생인자 발현량 변화를 나타내는 그래프이다. 도 3에서 보듯이, 3종의 혈관신생 및 피부재생인자는 LED를 조사하면서 스페로이드를 형성한 지방세포유래 중간엽 줄기세포(spheroid ASC)에서 발현량이 증가됨을 확인하였다.

실시예 4: LED 조사에 의한 지방유래 줄기세포의 혈관신생 관련 단백질 발현량 변화 측정

혈관신생 관련 단백질의 발현량을 측정하기 위하여, LED를 조사하면서 2차원 배양된 지방조직유래 중간엽 줄기세포(monolayer ASC)와 LED를 조사하면서 스페로이드를 형성한 지방세포유래 중간엽 줄기세포(spheroid ASC)를 대상으로 하여 Human Angiogenesis Array Kit (R&D Systems, Ltd., Abingdon, UK)를 사용한 분석을 수행하였다(도 4). 이때, 상기 각 줄기세포로부터 얻어진 단백질 50mg을 15㎕의 바이오틴이 결합된 검출용 항체와 혼합하여 반응시켰고, 검출신호는 image reader LAS-3000(Kodak, Rochester, NY)을 사용하여 측정한 다음, MultiGauge 4.0 software(Kodak)를 사용하여 분석하였다.

도 4는 LED 조사하에서 배양된, 지방조직유래 중간엽 줄기세포(monolayer ASC)와 LED를 조사하면서 스페로이드를 형성한 지방조직유래 중간엽 줄기세포(spheroid ASC)에서 발현되는 혈관신생 관련 단백질의 발현수준 변화를 측정한 결과를 나타내는 도표 및 그래프이다. 도 4에서 보듯이, 전체적으로 2차원 배양된 줄기세포 보다는 스페로이드가 형성된 줄기세포에서 혈관신생 관련 단백질의 발현수준이 증가함을 확인하였다.

실시예 5: 피부 창상 마우스 모델을 이용한 스페로이드 이식 및 LED 처리의 조합 효과 검증

먼저, 누드마우스를 마취시킨 후,8mm 펀치를 이용하여 등 부위의 피부조직에 상처를 형성시키고, 상처부위에 실리콘 재질의 부목(splint)을 설치하여 피부 창상 마우스 모델을 제작하였다.

다음으로, 상기 제작된 피부 창상 마우스 모델에 600㎕의 PBS를 주사한 대조군(control), 1.5 × 10⁶ 세포수의 지방조직유래 중간엽 줄기세포를 이식한 실험군(ASCs), LED 광원을 이용하여 매일 50 mW/㎠ 및 660nm 파장의 빛을 10분씩 조사한 실험군(low level light thearapy; LLLT), 15개의 스페로이드를 이식한 실험군(spheroid) 및 상기 15개의 스페로이드를 이식하고, LED를 조사한 실험군(spheroid+LLLT)을 각각 설정하고, 14일동안 사육한 다음 손상된 피부조직의 상처 치료효과를 확인하였다(도 5).

도 5는 피부 창상 마우스 모델을 이용한 각각의 처리조건(control, ASCs, LLLT, spheroid 및 spheroid+LLLT)의 상처치료효과를 비교한 결과를 나타내는 사진 및 그래프로서, A는 제작된 피부 창상 마우스 모델을 나타내는 사진이고, B는 각 실험군의 상처부위를 시간의 경과에 따라 촬영한 사진이며, C는 시간의 경과에 따른 상처부위의 면적 변화를 나타내는 그래프이다. 도 5에서 보듯이, 지방조직유래 중간엽 줄기세포를 이식(ASCs)하거나 LED를 조사(LLLT)한 실험군 보다는 스페로이드를 이식한 실험군의 상처치료 효과가 우수하였고, 스페로이드를 이식한 실험군 중에서도 LED 조사를 병행한 실험군(spheroid + LLLT)이 보다 우수한 상처치료 효과를 나타냄을 확인하였다.

실시예 6: 혈관재생에 미치는 스페로이드 이식 및 LED 처리의 조합 효과 검증

지방조직유래 중간엽 줄기세포로부터 형성된 스페로이드가 생체내에서 혈관내피세포로 분화되어 혈관재생효과를 나타낼 수 있는지를 확인하기 위하여, 상기 실시예 5에서 설정한 각 실험군의 마우스를 대상으로, 혈관내피세포 마커인 CD31과 혈관외피세포의 마커인 SMAa 액틴을 면역형광염색하였다.

구체적으로, 상기 각 실험군의 마우스를 희생시켜서, 상처부위의 조직을 적출하여 수득하고, 상기 수득한 조직을 4% 파라포름알데하이드 용액에 침지하여 30분간 실온에서 고정시킨 다음, OCT 화합물을 이용하여 -70℃에서 고정시키고, 마이크로톰을 이용해 4 ㎛ 두께로 세절하여 조직박편을 수득하였으며, 상기 조직박편을 슬라이드 글라스에 고정시켰다. 상기 슬라이드 글라스를 혈관내피세포 마커인 CD31과 혈관외피세포의 마커인 SMAa 액틴에 대한 일차항체를 함유한 PBS에 침지하여, 하룻밤 동안 반응시키고, PBS로 3회 세척한 다음, 다시 상기 일차항체에 결합할 수 있는 이차항체를 처리하고, 암실에서 1시간 동안 반응시켜서 면역형광염색을 수행하였다. 반응이 종료된 후, 상기 슬라이드 글라스를 PBS로 3회 세척하고 봉입(mounting)한 다음, 면역형광염색된 조직을 형광현미경으로 분석하였다(도 6의 A).

도 6의 A는 피부 창상 마우스 모델의 상처부위에 존재하는 혈관내피세포 및 혈관외피세포의 수준을 각각의 처리조건(control, ASCs, LLLT, spheroid 및 spheroid+LLLT) 별로 비교한 결과를 나타내는 면역형광염색 사진으로서, 녹색은 혈관외피세포의 마커인 SMAa 액틴을 나타내고, 적색은 혈관내피세포 마커인 CD31을 나타낸다. 도 6의 A에서 보듯이, 스페로이드를 이식하고, LED를 조사한 실험군(spheroid + LLLT)의 조직에서 상기 SMAa 액틴과 CD31의 발현수준이 다른 실험군의 조직에 비하여 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.

또한, 상기 면역형광염색된 조직의 형광현미경 사진으로부터 미세혈관과 소동맥의 수를 계수하고, 계수된 미세혈관 및 소동맥의 수를 단위면적(㎟)당 수로 환산하여 비교하였다(도 6의 B 및 C).

도 6의 B는 피부 창상 마우스 모델의 상처부위에 존재하는 단위면적당 미세혈관의 수를, 각각의 처리조건(control, ASCs, LLLT, spheroid 및 spheroid+LLLT) 별로 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 6의 C는 피부 창상 마우스 모델의 상처부위에 존재하는 단위면적당 소동맥의 수를, 각각의 처리조건(control, ASCs, LLLT, spheroid 및 spheroid+LLLT) 별로 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6의 B 및 C에서 보듯이, 스페로이드를 이식하고, LED를 조사한 실험군(spheroid + LLLT)의 조직에서 미세혈관과 동맥의 수가 가장 많이 생성됨을 확인하였다.

상기 도 6의 결과를 종합하면, 스페로이드를 이식하고, LED를 조사한 경우에 혈관부위의 상처가 효과적으로 치료되어 혈관재생이 촉진되는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 7: 피부재생에 미치는 스페로이드 이식 및 LED 처리의 조합 효과 검증

지방조직유래 중간엽 줄기세포로부터 형성된 스페로이드가 피부재생에도 효과를 나타내는지를 검증하고자, 피부세포 마커인 사이토케라틴(cytokeratin)을 대상으로 면역형광염색을 수행하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 6과 동일한 방법을 수행하고, 면역형광염색된 조직을 형광현미경으로 분석하였다(도 7).

도 7은 피부 창상 마우스 모델의 상처부위에 존재하는 피부세포의 수준을 각각의 처리조건(control, ASCs, LLLT, spheroid 및 spheroid+LLLT) 별로 비교한 결과를 나타내는 면역형광염색 사진으로서, 적색은 피부세포 마커인 사이토케라틴을 나타낸다. 도 7에서 보듯이, 스페로이드를 이식하고, LED를 조사한 실험군(spheroid + LLLT)의 조직에서 상기 사이토케라틴의 발현수준이 다른 실험군의 조직에 비하여 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.

따라서, 스페로이드를 이식하고, LED를 조사한 경우에는 혈관재생도 함께 촉진되는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 8: 혈관 및 피부 재생인자의 발현수준 확인

지방조직유래 중간엽 줄기세포로부터 형성된 스페로이드가 혈관신생 및 피부재생인자로서 알려진 FGF, VEGF 및 HGF의 발현량에도 효과를 나타내는지를 검증하고자 면역형광염색 분석 및 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다.

실시예 8-1: 면역형광염색 분석

면역형광염색 분석을 수행하기 위하여, 상기 실시예 5에서 설정한 각 실험군의 마우스로부터 얻어진 상처부위 조직을 대상으로 하고, 혈관신생 및 피부재생인자로서 알려진 FGF, VEGF 및 HGF를 대상으로 면역형광염색을 수행하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 6과 동일한 방법을 수행하고, 면역형광염색된 조직을 형광현미경으로 분석하였다(도 8의 A). 이때, 내부대조군으로는 HNA를 사용하였다.

도 8의 A는 피부 창상 마우스 모델의 상처부위에 존재하는 혈관신생 및 피부재생인자의 수준을 각각의 처리조건(control, ASCs, LLLT, spheroid 및 spheroid+LLLT) 별로 비교한 결과를 나타내는 면역형광염색 사진으로서, 적색은 각각의 혈관신생 및 피부재생인자인 FGF, VEGF 및 HGF를 나타낸다. 도 8의 A에서 보듯이, 스페로이드를 이식하고, LED를 조사한 실험군(spheroid + LLLT)의 조직에서 상기 혈관신생 및 피부재생인자의 발현수준이 다른 실험군의 조직에 비하여 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.

실시예 8-2: 웨스턴 블럿 분석

웨스턴 블럿 분석을 수행하기 위하여, 상기 상기 실시예 5에서 설정한 각 실험군의 마우스로부터 얻어진 상처부위 조직에서 발현된 혈관신생 및 피부재생인자로서 알려진 FGF, VEGF 및 HGF를 대상으로 웨스턴 블럿 분석을 수행하였다(도 8의 B 및 C).

도 8의 B는 피부 창상 마우스 모델의 상처부위에 존재하는 혈관신생 및 피부재생인자의 수준을 각각의 처리조건(control, ASCs, LLLT, spheroid 및 spheroid+LLLT) 별로 웨스턴 블럿 분석에 의해 측정한 결과를 나타내는 사진이고, 도 8의 C는 상기 웨스턴 블럿 분석에 의해 검출된 각 혈관신생 및 피부재생인자의 수준을 각각의 처리조건별로 비교한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 8의 B 및 C에서 보듯이, 스페로이드를 이식하고, LED를 조사한 실험군(spheroid + LLLT)의 조직에서 상기 혈관신생 및 피부재생인자의 발현수준이 다른 실험군의 조직에 비하여 높은 수준을 나타냄을 다시한번 확인하였다.

따라서, 스페로이드를 이식하고, LED를 조사한 경우에는 혈관 및 피부 재생인자의 발현수준이 가장 높은 수준을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 9: skin flap 마우스 모델을 이용한 스페로이드 이식 및 LED 처리의 조합 효과 검증

먼저, 누드마우스를 마취시키고, 이의 등 부위의 피부조직을 가로 2cm, 세포 4cm를 절개한 후 절개한 피부를 다시 봉합하여 skin flap 마우스 모델을 제작하였다.

다음으로, 상기 제작된 skin flap 마우스 모델에 600㎕의 PBS를 주사한 대조군(control), 1.5 × 10^6 세포수의 지방조직유래 중간엽 줄기세포를 이식한 실험군(ASCs), LED 광원을 이용하여 매일 50 mW/㎠ 및 660nm 파장의 빛을 10분씩 조사한 실험군(low level light thearapy; LLLT), 15개의 스페로이드를 이식한 실험군(spheroid) 및 상기 15개의 스페로이드를 이식하고, LED를 조사한 실험군(spheroid + LLLT)을 각각 설정하고, 14일동안 사육한 다음 손상된 피부조직의 상처 치료효과를 확인하였다(도 9).

도 9는 skin flap 마우스 모델을 이용한 상처치료효과를 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 9에서 보듯이, 지방조직유래 중간엽 줄기세포를 이식(ASCs)하거나, LED를 조사(LLLT)하거나 또는 스페로이드를 이식한 실험군(spheroid)은 상호 유사한 수준의 상처치료 효과가 나타났으나, 스페로이드를 이식하고, LED를 조사한 실험군(spheroid+LLLT)은 현저히 우수한 상처치료 효과를 나타냄을 확인하였다.

실시예 10: Skin flap 마우스 모델에서 혈류 측정

상기 Skin flap 마우스 모델에서 피부혈류(cutaneous blood flow)의 흐름을 촬영하였다. 구체적으로, 상기 실시예 9에서 설정한 각 실험군의 마우스를 37℃ 열판에 위치시키고, Laser Doppler blood flowmeter(Laser Doppler Perfusion Imager System PeriScan PIM 3 System; Perimed AB, Stockholm, Sweden)를 사용하여 스탠함으로써, 레이저 도트 칼라 이미지를 촬영하였다(도 10).

도 10은 skin flap 마우스 모델에서 촬영된 피부혈류의 흐름을 처리조건(control, ASCs, LLLT, spheroid 및 spheroid+LLLT) 별로, 1, 7 및 14일이 경과된 시점에서 비교한 결과를 나타내는 사진이다. 도 10에서 보듯이, 지방조직유래 중간엽 줄기세포를 이식(ASCs)하거나, LED를 조사(LLLT)하거나 또는 스페로이드를 이식한 실험군(spheroid)은 상호 유사한 수준의 혈류량이 측정되었으나, 스페로이드를 이식하고 LED를 조사한 실험군(spheroid+LLLT)은 현저히 증가된 혈류량이 측정됨을 확인하였다. 상기 혈류량은 손상된 혈관이 존재할 경우 감소되고, 손상된 혈관이 치료되면 혈류량이 증가되므로, 상기 결과로부터 스페로이드를 이식하고 LED를 조사한 실험군(spheroid+LLLT)은 손상된 혈관을 높은 수준으로 치료하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

Claims (9)

1. 지방줄기세포로부터 유래된 스페로이드를 유효성분으로 포함하는, 적색 파장대의 빛을 이용한 피부 또는 혈관 조직 손상 치료 보조용 약학 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 스페로이드는 지방줄기세포를 배양하여 형성되는 것인 조성물.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 스페로이드의 직경은 0.5 내지 1mm 인 것인 조성물.
   
4. 제2항에 있어서,
   상기 배양은 표면이 소수성을 띠는 배양용기를 사용하여 수행되는 것인 조성물.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 배양용기는 소수성을 부여하는 고분자 물질로 표면 처리된 배양용기 또는 상기 고분자 물질로 제조된 배양용기인 것인 조성물.
   
6. 제2항에 있어서,
   상기 배양시 지방줄기세포의 접종밀도는 1 × 10⁵ 내지 2 × 10⁶ 세포/㎠인 것인 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 적색 파장대의 빛은 600 내지 700nm의 파장을 갖는 것인 조성물.
   
8. 제1항에 있어서,
   상기 스페로이드는 상기 적색 파장대의 빛에 의하여 생체내에서 혈관내피세포로 분화되어, 상기 적색 파장대의 빛에 의하여 촉진되는 생체내 자가 회복력을 보조하는 것인 조성물.
   
9. 제1항에 있어서,
   상기 스페로이드는 상기 적색 파장대의 빛에 의하여 생체내에서 피부세포로 분화되어, 상기 적색 파장대의 빛에 의하여 촉진되는 생체내 자가 회복력을 보조하는 것인 조성물.
   
   
   

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