CN113699094A - 一种无血清培养细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及一种无血清培养细胞的方法。本发明中，通过生物材料水溶液包裹细胞形成细胞高密度聚集的水凝胶结构，细胞个数与生物材料水溶液体积的比例在105–109个/mL范围内可以达到无血清培养细胞的效果，通过细胞自身分泌的活性成分可以实现水凝胶结构中细胞的正常生长增殖，细胞活率可达90%以上。

Description

一种无血清培养细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种无血清培养细胞的方法，该方法可以方便快捷进行无血清细胞培养，细胞生长正常。
背景技术
细胞培养领域中，在经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基和无血清培养已成为热点发展方向之一。无血清培养细胞是一种不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的细胞培养方式。采用无血清培养可降低生产成本，简化分离纯化步骤，避免病毒污染造成的危害。现有无血清培养细胞的方法主要集中在开发无血清细胞培养基上，即不加动物血清，在基础培养基中加入细胞生长有效因子，激素等，其中，加入成份完全明确的或部分明确的血清替代成份，达到既能满足动物细胞培养的要求，又能有效克服使用血清所带来问题的目的。例如，CN102827810B“一种无动物源的脐血干细胞无血清培养基”，其中，公开了一种无动物源的无血清培养基，其必要组成为IMDM、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、重组人胰岛素、人转铁蛋白、重组人白蛋白、2-巯基乙醇、植物血凝素PHA、脂质、氨基酸、维生素、微量元素、IL-3、SCF、Fit3-L、IL-6、G-CSF，该无血清培养基化学成分明确、无动物源、无血清，培养细胞安全、理想，避免了掺杂动物成分和批次的不稳定性，培养脐血干细胞结果显示其细胞总数、细胞表型和分泌细胞因子均正常。为了实现无血清培养细胞，虽然无血清培养基具有组成明确、可重复性强、避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染风险等优点，但也存在制备工艺繁杂、成本较高、普适性低等不足之处。
另一方面，不同于常规二维细胞培养方式，通过细胞结团聚集的方式也可以实现无血清培养细胞。例如，CN100543131C“一种用于动物细胞无血清结团灌流培养的方法”，其中，公开了一种用于动物细胞无血清结团灌流培养的方法，该方法包括以下步骤：(1)工程细胞在无血清培养基的搅拌培养中驯化；(2)工程细胞在转瓶、方瓶和搅拌瓶的无血清培养基培养中初步结团；(3)细胞在反应罐中用超声-沉降双结合灌流系统进一步结团和进行灌流培养；(4)不定期抽去部分细胞，使罐内细胞保持合适的高密度，并可直接用以扩大生产。该方法虽然可以提高细胞的结团效率和灌流时细胞的截留效率，促使细胞在无血清培养基中高效增殖，但过程复杂、成本较高，而且细胞结团聚集不利于细胞间活性成分传输，不利于细胞长期培养和分离。
针对以上无血清培养细胞存在的不足之处，本发明通过生物材料包裹达到细胞高密度聚集的效果，细胞可以在无血清细胞培养液中生长增殖，简便快捷实现无血清培养细胞。
发明内容
本发明提供一种无血清培养细胞的方法。
一种无血清培养细胞的方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)通过细胞计数板或细胞计数仪测定预培养细胞悬液中的细胞数，离心细胞悬液，细胞经离心聚集在离心管底部后，吸除上清液；
(2)将生物材料水溶液与细胞混合，吹打细胞直至与生物材料水溶液混合均匀，细胞均匀分散在生物材料水溶液中形成生物材料包裹细胞的三维结构；
(3)添加无血清细胞培养液浸没生物材料包裹细胞的三维结构，进行无血清培养细胞。
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(2)中生物材料包括天然生物材料或合成生物材料中的至少一种。
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(2)中天然生物材料包括壳聚糖及其衍生物、纤维素类材料、海藻酸盐及其衍生物、壳聚糖/甘油磷酸二钠混合物、淀粉类材料、血清白蛋白、明胶及其衍生物、鲱精蛋白、血纤蛋白原、胶原、肽类材料、木聚糖、透明质酸、鱼胶、角蛋白类、促凝血酶原激酶、还原角蛋白中的至少一种
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(2)中合成生物材料包括聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物、结冷胶、丙烯酸、聚氨基酸、丙烯酸衍生物、聚乙烯醇、嵌段式聚合物、合成肽类材料中的至少一种；优选地，所述聚氨基酸包括聚谷氨酸、聚赖氨酸中的至少一种；优选地，所述丙烯酸衍生物包括卡波姆、聚甲基丙烯酸、聚N-异丙基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸中的至少一种；优选地，所述嵌段式聚合物包括泊洛沙姆。
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(2)中将预定体积的生物材料水溶液滴加至步骤(1)含有细胞的离心管中，混合生物材料和细胞。
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(2)中离心管中的细胞个数与生物材料水溶液体积的比例范围为105–109个/mL。
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(2)中离心管中的细胞个数与生物材料水溶液体积的比例范围为106–108个/mL。
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(2)中吹打细胞的次数范围为20–200次。
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(2)中吹打细胞的频率范围为1–5次/秒。
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(2)中吹打生物材料/细胞混合物的操作可以用搅拌生物材料/细胞混合物的方式代替，搅拌速度范围为50–500rpm。
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(2)中生物材料水溶液的浓度范围为0.1–50wt.％，生物材料水溶液可以形成水凝胶结构包裹细胞，在步骤(3)无血清细胞培养液中水凝胶结构可以稳定存在，即，生物材料可以包裹细胞形成水凝胶结构稳定存在于无血清细胞培养液中，生物材料不会溶解在无血清细胞培养液中。
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(3)中无血清细胞培养液中不含动物源血清。
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(3)中无血清细胞培养液中不含胎牛血清、小牛血清、成牛血清、马血清、羊血清、鸡血清、兔血清中的任何一种。
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(3)中无血清细胞培养液中基础培养基包括199细胞培养基、RPMI-1640Medium、Minimum Essential Medium(MEM)、Iscove’s Modified Dubecco’s Medium(IMDM)、DMEM细胞培养基、DMEM-高糖(标准型)细胞培养基、DMEM-低糖(标准型)细胞培养基、DMEM/F12细胞培养基、McCoy’s 5A细胞培养基、M-199Medium、Leibovitz Medium(L-15)、Ham’s F-10培养基、Ham’s F-12培养基、William’sMedium E、MCDB 131培养液、Opti-MEM I Reduced Serum Media、植物血凝素(PHA)中的至少一种。
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(3)中无血清培养细胞的细胞活率可达90％以上。
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(3)中无血清细胞培养液为基础培养基，其中可以含有或不含生长因子、激素。
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(3)中无血清细胞培养液为基础培养基，其中可以含有或不含纤连蛋白、层粘连蛋白。
本发明一种无血清培养细胞的方法，其中，所述步骤(3)中无血清细胞培养液为基础培养基，其中可以含有或不含酶抑制剂。
本发明提供一种无血清培养细胞的方法，本发明不是对无血清培养基进行改良或提供含有特定成分的无血清培养基，方法中采用的无血清细胞培养液是不含动物源血清的基础培养基；本发明是通过生物材料包裹细胞达到细胞聚集的效果，而不是将细胞直接结团聚集；本发明将细胞分散在生物材料水溶液中，生物材料水溶液可以形成水凝胶结构包裹细胞，在无血清细胞培养液中，活性成分可以在水凝胶结构内部或细胞间自由传输；本发明可以达到细胞在生物材料水溶液形成的水凝胶结构中高密度聚集的效果，细胞在水凝胶结构中的密度在105–109个/mL特定范围内才可以实现无血清培养细胞的功效；细胞在水凝胶结构中的密度小于105个/mL时，细胞数量太少，细胞间间隔较大，细胞分泌的活性成分较少且无法供应细胞正常生长，细胞在无血清细胞培养液中无法正常生长增殖；细胞在水凝胶结构中的密度大于109个/mL时，细胞间间隔很小，细胞在水凝胶结构中容易结团聚集，不利于细胞分泌的活性成分在细胞间自由传输，细胞在无血清细胞培养液中无法正常生长增殖。
本发明提供一种无血清培养细胞的方法，本发明可以方便快捷且低成本的实现无血清培养细胞。
附图说明
图1实施例1的荧光染色结果(图1A是实施例1培养1天的样品，图1B是实施例1培养8天的样品，图1C是实施例1培养14天的样品)
图2实施例2的荧光染色结果(图2A是实施例2培养1天的样品，图2B是实施例2培养10天的样品)
图3对比例1的荧光染色结果(图3A是对比例1培养1天的样品，图3B是对比例1培养7天的样品)
图4对比例3的荧光染色结果(图4是对比例3培养7天的样品)
具体实施方式
实施例1
一种无血清培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞MOVAS的方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)通过细胞计数板测定预培养细胞(Solarbio，SCC-221511)悬液的细胞数约5×108个，离心细胞悬液，细胞经离心聚集在离心管底部后，吸除上清液；
(2)将1mL 10wt.％透明质酸(SIGMA，H5388)水溶液加入离心管底部与细胞混合，吹打细胞100次，吹打细胞的频率为2次/秒，直至细胞与生物材料混合均匀，形成透明质酸水凝胶包裹细胞的三维结构；
(3)添加不含任何动物源血清的DMEM/F12(Gibco，11320033)细胞培养基浸没透明质酸水凝胶包裹细胞的三维结构，进行无血清培养细胞。
实施例2
一种无血清培养人软骨细胞的方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)通过细胞计数仪测定预培养细胞(Procell，CP-H107)悬液的细胞数约3×106个，离心细胞悬液，细胞经离心聚集在离心管底部后，吸除上清液；
(2)将2mL 20wt.％聚丙烯酰胺(沪试，30503770)水溶液加入离心管底部与细胞混合，吹打细胞200次，吹打细胞的频率为5次/秒，直至细胞与生物材料混合均匀，形成聚丙烯酰胺水凝胶包裹细胞的三维结构；
(3)添加不含任何动物源血清的DMEM-高糖(标准型)(Gibco，11965126)细胞培养基浸没聚丙烯酰胺水凝胶包裹细胞的三维结构，进行无血清培养细胞。
实施例3
一种无血清培养小鼠成纤维细胞L929的方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)通过细胞计数仪测定预培养细胞(Procell，CL-0137)悬液的细胞数约4×105个，离心细胞悬液，细胞经离心聚集在离心管底部后，吸除上清液；
(2)将4mL 50wt.％泊洛沙姆(沃凯，XW90031162)水溶液加入离心管底部与细胞混合，吹打细胞20次，吹打细胞的频率为1次/秒，直至细胞与生物材料混合均匀，形成泊洛沙姆水凝胶包裹细胞的三维结构；
(3)添加不含任何动物源血清的RPMI-1640(Gibco，31870082)培养基浸没泊洛沙姆水凝胶包裹细胞的三维结构，进行无血清培养细胞。
实施例4
一种无血清培养宫颈癌细胞Hela的方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)通过细胞计数板测定预培养细胞(Byotime，C6330)悬液的细胞数约1×109个，离心细胞悬液，细胞经离心聚集在离心管底部后，吸除上清液；
(2)将0.5mL 2wt.％壳聚糖(沪试，69047434)水溶液和0.5mL 1wt.％胶原(沃凯，XW90073451)水溶液加入离心管底部与细胞混合，搅拌生物材料/细胞混合物，搅拌速度为500rpm，直至细胞与生物材料混合均匀，形成壳聚糖水凝胶包裹细胞的三维结构；
(3)添加不含任何动物源血清的Minimum Essential Medium(MEM)(Gibco，11095080)培养基浸没壳聚糖水凝胶包裹细胞的三维结构，进行无血清培养细胞。
实施例5
一种无血清培养大鼠骨髓间充质干细胞的方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)通过细胞计数仪测定预培养细胞(Procell，CP-R131)悬液的细胞数约3×107个，离心细胞悬液，细胞经离心聚集在离心管底部后，吸除上清液；
(2)将3mL 0.1wt.％结冷胶(沃凯，XW710105211)水溶液加入离心管底部与细胞混合，搅拌生物材料/细胞混合物，搅拌速度为50rpm，直至细胞与生物材料混合均匀，形成结冷胶水凝胶包裹细胞的三维结构；
(3)添加不含任何动物源血清的DMEM/F12(Gibco，11320033)培养基(含1ng/mL骨形成蛋白生长因子BMP2(北京中科物源生物，H5000-10))浸没结冷胶水凝胶包裹细胞的三维结构，进行无血清培养细胞。
实施例6
无血清培养细胞效果的比较试验
一、对比无血清培养细胞的方法
对比例1(与实施例1对比)：一种无血清培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞MOVAS的方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)通过细胞计数板测定预培养细胞(Solarbio，SCC-221511)悬液的细胞数约5×104个，离心细胞悬液，细胞经离心聚集在离心管底部后，吸除上清液；
(2)将1mL 10wt.％透明质酸(SIGMA，H5388)水溶液加入离心管底部与细胞混合，吹打细胞100次，吹打细胞的频率为2次/秒，直至细胞与生物材料混合均匀，形成透明质酸水凝胶包裹细胞的三维结构；
(3)添加不含任何动物源血清的DMEM/F12(Gibco，11320033)细胞培养基浸没透明质酸水凝胶包裹细胞的三维结构，进行无血清培养细胞。
对比例2(与实施例1对比)：一种无血清培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞MOVAS的方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)通过细胞计数板测定预培养细胞(Solarbio，SCC-221511)悬液的细胞数约1×1010个，离心细胞悬液，细胞经离心聚集在离心管底部后，吸除上清液；
(2)将1mL 10wt.％透明质酸(SIGMA，H5388)水溶液加入离心管底部与细胞混合，吹打细胞100次，吹打细胞的频率为2次/秒，直至细胞与生物材料混合均匀，形成透明质酸水凝胶包裹细胞的三维结构；
(3)添加不含任何动物源血清的DMEM/F12(Gibco，11320033)细胞培养基浸没透明质酸水凝胶包裹细胞的三维结构，进行无血清培养细胞。
对比例3(与实施例3对比)：一种无血清培养小鼠成纤维细胞L929的方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)通过细胞计数仪测定预培养细胞(Procell，CL-0137)悬液的细胞数约7×1010个，离心细胞悬液，细胞经离心聚集在离心管底部后，吸除上清液；
(2)将4mL 50wt.％泊洛沙姆(沃凯，XW90031162)水溶液加入离心管底部与细胞混合，吹打细胞20次，吹打细胞的频率为1次/秒，直至细胞与生物材料混合均匀，形成泊洛沙姆水凝胶包裹细胞的三维结构；
(3)添加不含任何动物源血清的RPMI-1640(Gibco，31870082)培养基浸没泊洛沙姆水凝胶包裹细胞的三维结构，进行无血清培养细胞。
对比例4(与实施例3对比)：一种无血清培养小鼠成纤维细胞L929的方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)通过细胞计数仪测定预培养细胞(Procell，CL-0137)悬液的细胞数约3×104个，离心细胞悬液，细胞经离心聚集在离心管底部后，吸除上清液；
(2)将4mL 50wt.％泊洛沙姆(沃凯，XW90031162)水溶液加入离心管底部与细胞混合，吹打细胞20次，吹打细胞的频率为1次/秒，直至细胞与生物材料混合均匀，形成泊洛沙姆水凝胶包裹细胞的三维结构；
(3)添加不含任何动物源血清的RPMI-1640(Gibco，31870082)培养基浸没泊洛沙姆水凝胶包裹细胞的三维结构，进行无血清培养细胞。
对比例5(与实施例5对比)：一种无血清培养大鼠骨髓间充质干细胞的方法，其中，依次包括如下步骤：
(1)通过细胞计数仪测定预培养细胞(Procell，CP-R131)悬液的细胞数约3×107个，离心细胞悬液，细胞经离心聚集在离心管底部后，吸除上清液；
(2)将3mL 0.1wt.％聚乙二醇PEG-400(沪试，30150828)水溶液加入离心管底部与细胞混合，搅拌生物材料/细胞混合物，搅拌速度为50rpm，直至细胞与生物材料混合均匀；
(3)添加不含任何动物源血清的DMEM/F12(Gibco，11320033)培养基(含1ng/mL骨形成蛋白生长因子BMP2(北京中科物源生物，H5000-10))浸没聚乙二醇PEG-400/细胞混合物，由于聚乙二醇PEG-400完全溶解于水中，无法形成聚乙二醇水凝胶包裹细胞的三维结构，无法进行无血清培养细胞。
二、效果试验对比
(一)无血清培养细胞状态观察：在37℃细胞培养箱中进行无血清培养细胞实验，分别在预设的培养时间取样，使用吖啶橙AO/碘化丙啶PI双染试剂标记样品中的活/死细胞，使用DAPI试剂标记细胞核，通过荧光显微镜观察记录细胞的生长状态和活率，通过活细胞数/总细胞数比例计算细胞活率。
荧光显微镜品牌为Mshot明美，型号为MI52-N，激发波长330-380nm、460-490nm和510-550nm分别激发蓝光荧光、绿光荧光和红光荧光。吖啶橙(AcridineOrange，简称AO)可以通过完整的细胞膜，嵌入所有细胞(活细胞和死细胞)的细胞核，呈现绿色荧光；碘化丙啶(Propidiumiodide，简称PI)只能通过不完整的细胞膜，即死细胞的细胞膜，嵌入所有死细胞的细胞核，呈现红色荧光；DAPI可以穿透细胞膜，和双链DNA结合呈现蓝色荧光。
实施例1的荧光染色结果见图1，细胞活率在95％以上。实施例2的荧光染色结果见图2，细胞活率在92％以上。
对比例1的荧光染色结果见图3，细胞活率在94％以上。对比例3的荧光染色结果见图4，细胞活率在46％以下。
由图1-4可知，实施例中采用本发明一种无血清培养细胞的方法，绿色荧光代表的活细胞数量随着培养时间明显增多，细胞在水凝胶结构中以成堆的模式三维生长，有些细胞表现出良好的伸展性，说明细胞状态很好，可以采用本发明方法在无血清条件下正常生长增殖；而与实施例1比较，对比例1和对比例4中细胞数量很少，而且随着培养时间细胞数量无明显变化，说明低细胞密度无法实现无血清培养细胞；与实施例3比较，对比例2和对比例3中细胞数量过多，代表死细胞的红色荧光较多，细胞活率很低，在50％以下，说明过高细胞密度无法实现无血清培养细胞。
(二)无血清培养细胞增殖情况：在37℃细胞培养箱中进行无血清培养细胞实验，分别在预设的培养时间(1天、7天、14天)取样，使用吖啶橙AO/碘化丙啶PI双染试剂标记样品中的活/死细胞，使用DAPI试剂标记细胞核，通过荧光显微镜观察细胞增殖情况。采用20×物镜对每个样品进行随机拍照，每个样品至少选取三个不同的视野。针对照片中活细胞呈现的绿色荧光进行计数，每个样品中细胞增殖倍数＝预设培养时间照片中活细胞数/培养1天照片中活细胞数。数据统计分析在SPSS 10.0统计软件上进行，细胞增殖倍数数据用t-test程序比较，p<0.05具有统计意义。细胞增殖情况见表1。
表1细胞增殖情况
Figure BDA0003230983420000091
由表1可知，本发明实施例中细胞正常增殖，随着培养时间细胞增殖倍数增大，虽然由于细胞特性、材料特性等差异造成增殖情况各不相同，但总体而言细胞在无血清培养条件下增殖趋势明显；而与实施例1比较，对比例1和对比例4中细胞由于密度很低，活细胞数量没有明显变化，在无血清培养条件下基本不增殖；与实施例3比较，对比例2和对比例3中细胞密度过高造成细胞容易结团生长，不利于活性成分在细胞间传输，细胞活率反而降低，无法实现在无血清培养条件下细胞增殖；与实施例5比较，对比例5由于生物材料无法包裹细胞形成水凝胶结构，细胞无法聚集生长，也不能实现无血清培养细胞的效果。
综上所述，在生物材料水溶液可以形成水凝胶结构包裹细胞，并且达到合适细胞密度的情况下，在无血清细胞培养液中，细胞分泌的活性成分可以在水凝胶结构内部或细胞间自由传输，按照本发明一种无血清培养细胞的方法才有可能实现无血清培养细胞，细胞可以正常生长，随着培养时间增长细胞在不断增殖，细胞活率都可达90％以上；而对比例1和对比例4中细胞密度在水凝胶结构中的密度小于105个/mL，细胞数量太少，细胞间间隔较大，细胞分泌的活性成分较少且无法供应细胞正常生长，细胞在无血清细胞培养液中随着时间无法正常生长增殖；对比例2和对比例3中细胞在水凝胶结构中的密度大于109个/mL，细胞间间隔很小，细胞在水凝胶结构中容易结团聚集，不利于细胞分泌的活性成分在细胞间自由传输，细胞在无血清细胞培养液中培养7天后死亡率较高，细胞活率在50％以下，无法正常生长繁殖；对比例5中生物材料水溶液无法形成水凝胶结构包裹细胞，无法达到细胞高密度聚集的效果，也无法实现无血清培养细胞。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种无血清培养细胞的方法，其特征在于，依次包括如下步骤：
(1)通过细胞计数板或细胞计数仪测定预培养细胞悬液中的细胞数，离心细胞悬液，细胞经离心聚集在离心管底部后，吸除上清液；
(2)将生物材料水溶液与细胞混合，吹打细胞直至与生物材料水溶液混合均匀，细胞均匀分散在生物材料水溶液中形成生物材料包裹细胞的三维结构；
(3)添加无血清细胞培养液浸没生物材料包裹细胞的三维结构，进行无血清培养细胞。
2.如权利要求1所述一种无血清培养细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中生物材料包括天然生物材料或合成生物材料中的至少一种。
3.如权利要求2所述一种无血清培养细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中天然生物材料包括壳聚糖及其衍生物、纤维素类材料、海藻酸盐及其衍生物、壳聚糖/甘油磷酸二钠混合物、淀粉类材料、血清白蛋白、明胶及其衍生物、鲱精蛋白、血纤蛋白原、胶原、肽类材料、木聚糖、透明质酸、鱼胶、角蛋白类、促凝血酶原激酶、还原角蛋白中的至少一种。
4.如权利要求2所述一种无血清培养细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中合成生物材料包括聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物、结冷胶、丙烯酸、聚氨基酸、丙烯酸衍生物、聚乙烯醇、嵌段式聚合物、合成肽类材料中的至少一种；优选地，所述聚氨基酸包括聚谷氨酸、聚赖氨酸中的至少一种；优选地，所述丙烯酸衍生物包括卡波姆、聚甲基丙烯酸、聚N-异丙基丙烯酰胺、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸中的至少一种；优选地，所述嵌段式聚合物包括泊洛沙姆。
5.如权利要求1所述一种无血清培养细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中将预定体积的生物材料水溶液滴加至步骤(1)含有细胞的离心管中，混合生物材料和细胞。
6.如权利要求5所述一种无血清培养细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中离心管中的细胞个数与生物材料水溶液体积的比例范围为105–109个/mL。
7.如权利要求6所述一种无血清培养细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中离心管中的细胞个数与生物材料水溶液体积的比例范围为106–108个/mL。
8.如权利要求1所述一种无血清培养细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中吹打细胞的次数范围为20–200次。
9.如权利要求1所述一种无血清培养细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中吹打细胞的频率范围为1–5次/秒。
10.如权利要求1所述一种无血清培养细胞的方法，其特征在于，所述步骤(2)中生物材料水溶液的浓度范围为0.1–50wt.％，生物材料水溶液可以形成水凝胶结构包裹细胞，在步骤(3)无血清细胞培养液中水凝胶结构可以稳定存在。
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