CN103710409A - 一种降解速率可控的微孔淀粉及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种降解速率可控的微孔淀粉及其制备方法。微孔淀粉具有较大的比表面积,一定条件下分散在水及其它溶剂中,仍能保持结构的完整性,但使用安全性较低。本发明配制玉米淀粉浆溶液后,用稀酸进行出孔预处理,中和洗涤,加入α-淀粉酶和糖化酶恒温反应,再中和离心,真空冷冻冻干得微孔淀粉,与胶原蛋白混合并加入交联剂,恒温反应,洗涤冻干得目的产品。本发明作为可生物降解组织工程用止血材料,具有适宜的微观结构和孔隙率,具有优良的止血性能和可控的降解速率;当出血时,适于血细胞附着在材料表面形成一种凝胶状混合物,从而达到止血的效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域,具体涉及一种降解速率可控的微孔淀粉及其制备方法。
背景技术
微孔淀粉又称为多孔淀粉,是原淀粉颗粒经人工方法处理,即用盐酸、淀粉酶适当水解后得到的多孔状淀粉,是一种全新的变性淀粉。它具有较大的比表面积,一定条件下分散在水及其它溶剂中,仍能保持结构的完整性,因此具有良好的吸水、吸油性能,可作为香精、香料、风味物质、色素、药剂及保健食品中功能成分的吸附载体,并且成本较低,可自然降解。它的优势在于:⑴对物体吸附是一种物理方式;⑵具有较大的比孔容、比表面积和良好的吸附性(吸水能力);⑶堆积密度和颗粒密度小,结构疏松;⑷具有分子筛的作用。
类人胶原蛋白是将人体已知序列胶原蛋白的一段mRNA逆转录生成cDNA后,经过特定序列重复和修饰,转化于大肠杆菌中,并经过高密度发酵、分离提取及纯化而得。该蛋白从根本上解决了动物提取胶原蛋白的水不溶性和病毒隐患(疯牛病、猪瘟疫、禽流感)等问题,具有良好的促新细胞形成和促上皮细胞、成纤维细胞生长功能,相比动物胶原蛋白更具有良好的生物相容性,免疫排异反应低。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用安全性大幅度提高的降解速率可控的微孔淀粉及其制备方法。
本发明所采用的技术方案是:
一种降解速率可控的微孔淀粉的制备方法,其特征在于:
由以下步骤实现:
步骤一:配制质量分数为38~40%的玉米淀粉溶液;
步骤二:用稀酸对玉米淀粉浆溶液进行出孔预处理,置于50℃恒温水浴锅中;反应4h后加入缓冲液中和,离心洗涤,离心条件为3000r/min, 4℃, 10min,反复操作3次,移去上清;
步骤三:以每克干基玉米淀粉加入60国际单位α-淀粉酶的比例称取α-淀粉酶,再按国际单位比α-淀粉酶:糖化酶=1:(1~5)的比例称取糖化酶,将α-淀粉酶和糖化酶混合,加入步骤二得到的玉米淀粉浆溶液中,加入缓冲液调节pH至4.5~5.0,在恒温搅拌器上反应,反应时间为18~22h,反应温度为45~55℃;
步骤四:加碱中和,离心3~5次,转速为3000r/min, 反应温度为4℃,每次离心10min,弃上清,真空冷冻干燥机冻干,得微孔淀粉;
步骤五:将胶原蛋白与微孔淀粉按照(10~20):1的质量比,在50mL离心管中混合并加入交联剂,于37℃恒温培养箱中反应24~72h后取出洗涤,冻干,得降解速率可控的微孔淀粉。
步骤一中,所用玉米淀粉的分子量为7000~10000Da;
步骤一中,配制玉米淀粉溶液使用蒸馏水。
步骤二中,稀酸选取摩尔浓度为1.5~3.0mol/L的稀盐酸;
步骤二中,缓冲液选取摩尔浓度为0.2mol/L的Na2HPO4溶液。
步骤三中,α-淀粉酶活度为5.0×104IU/g,糖化酶活度为1.0×105IU/g;
步骤三中,缓冲液由摩尔浓度为0.2mol/L的Na2HPO4溶液和摩尔浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液按体积比2:1的比例混合而成。
步骤四中,碱指摩尔浓度为1.5~2.0mol/L的NaOH溶液。
步骤五中,交联剂为质量分数为0.05~0.2%的戊二醛溶液;
步骤五中,交联反应体系的溶剂为体积分数为95%的乙醇;
步骤五中,胶原蛋白选取基因工程技术高密度发酵生产的人源型胶原蛋白。
所述的一种降解速率可控的微孔淀粉的制备方法制备的降解速率可控的微孔淀粉。
本发明具有以下优点:
本发明提供的一种降解速率可控的微孔淀粉,作为可生物降解组织工程用止血材料,具有适宜的微观结构和孔隙率,具有优良的止血性能和可控的降解速率。当出血时,适于血细胞附着在材料表面形成一种凝胶状混合物,从而达到止血的效果。与现有技术相比,该止血材料又具有其自身显著的优点:免疫排异反应更低,而且彻底杜绝了胶原蛋白止血材料不可避免的病毒隐患,使用安全性大幅度提高。
附图说明
图1为微孔淀粉扫描电镜(SEM)。左侧为微孔淀粉酶解后表面成孔情况,右侧为与少量类人胶原蛋白交联的微孔淀粉。
图2为在兔子肝脏做出创面的照片。
图3为微孔淀粉的止血效果对比照片。左侧为外购的阿里斯泰止血粉,右侧为类人胶原蛋白-微孔淀粉组。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。
本发明说涉及的一种降解速率可控的微孔淀粉的制备方法,由以下步骤实现:
步骤一:配制质量分数为38~40%的玉米淀粉溶液;所用玉米淀粉的分子量为7000~10000Da,配制玉米淀粉溶液使用蒸馏水。
步骤二:用摩尔浓度为1.5~3.0mol/L的稀盐酸对玉米淀粉浆溶液进行出孔预处理,置于50℃恒温水浴锅中;反应4h后加入摩尔浓度为0.2mol/L的Na2HPO4缓冲液中和,离心洗涤,离心条件为3000r/min, 4℃, 10min,反复操作3次,移去上清。
步骤三:以每克干基玉米淀粉加入60国际单位α-淀粉酶的比例称取α-淀粉酶,再按国际单位比α-淀粉酶:糖化酶=1:(1~5)的比例称取糖化酶,α-淀粉酶活度为5.0×104IU/g,糖化酶活度为1.0×105IU/g,将α-淀粉酶和糖化酶混合,加入步骤二得到的玉米淀粉浆溶液中,加入缓冲液调节pH至4.5~5.0,缓冲液由摩尔浓度为0.2mol/L的Na2HPO4溶液和摩尔浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液按体积比2:1的比例混合而成;在恒温搅拌器上反应,反应时间为18~22h,反应温度为45~55℃。
步骤四:加摩尔浓度为1.5~2.0mol/L的NaOH溶液中和,离心3~5次,转速为3000r/min, 反应温度为4℃,每次离心10min,弃上清,将沉淀转移至一次性培养皿中,于-80℃超低温保藏箱预冻6h,后移入冷阱预冷完成的真空冷冻干燥机进行干燥48h,得微孔淀粉;
步骤五:将胶原蛋白与微孔淀粉按照(10~20):1的质量比,在50mL离心管中混合并加入交联剂,交联剂为质量分数为0.05~0.2%的戊二醛溶液,交联反应体系的溶剂为体积分数为95%的乙醇,密封后放入生化培养箱或电热鼓风干燥箱中进行交联,温度为37℃,持续交联24h。交联结束后,使用无菌注射用水进行离心洗涤,共洗涤6次,移去上清液。洗涤结束后于真空冷冻干燥机中冻干48h。冻干结束后,加以内包装密封,然后以≥25KGY的照射剂量进行Co-60辐照灭菌,得降解速率可控的微孔淀粉。胶原蛋白选取基因工程技术高密度发酵生产的人源型胶原蛋白。
淀粉经酸解酶解反应处理后,颗粒表面成孔明显,孔隙分布密集均匀,淀粉颗粒大小均匀,与对照品阿里斯泰止血粉相比,吸水性能好,生物相容性更优。
实施例1:
步骤一:配制质量分数为38%的玉米淀粉溶液;所用玉米淀粉的分子量为7000Da,配制玉米淀粉溶液使用蒸馏水。
步骤二:用摩尔浓度为1.5mol/L的稀盐酸对玉米淀粉浆溶液进行出孔预处理,置于50℃恒温水浴锅中;反应4h后加入摩尔浓度为0.2mol/L的Na2HPO4缓冲液中和,离心洗涤,离心条件为3000r/min, 4℃, 10min,移去上清。
步骤三:以每克干基玉米淀粉加入60国际单位α-淀粉酶的比例称取α-淀粉酶,再按国际单位比α-淀粉酶:糖化酶=1:1的比例称取糖化酶,α-淀粉酶活度为5.0×104IU/g,糖化酶活度为1.0×105IU/g,将α-淀粉酶和糖化酶混合,加入步骤二得到的玉米淀粉浆溶液中,加入缓冲液调节pH至4.5~5.0,缓冲液由摩尔浓度为0.2mol/L的Na2HPO4溶液和摩尔浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液按体积比2:1的比例混合而成;在恒温搅拌器上反应,反应时间为18h,反应温度为45℃。
步骤四:加摩尔浓度为1.5mol/L的NaOH溶液中和,离心3次,转速为3000r/min, 反应温度为4℃,每次离心10min,弃上清,真空冷冻干燥机冻干,得微孔淀粉;
步骤五:将胶原蛋白与微孔淀粉按照10:1的质量比,在50mL离心管中混合并加入交联剂,交联剂为质量分数为0.05%的戊二醛溶液,交联反应体系的溶剂为体积分数为95%的乙醇,于37℃恒温培养箱中反应24h后取出洗涤,冻干,得降解速率可控的微孔淀粉。胶原蛋白选取基因工程技术高密度发酵生产的人源型胶原蛋白。
实施例2:
步骤一:配制质量分数为39%的玉米淀粉溶液;所用玉米淀粉的分子量为8000Da,配制玉米淀粉溶液使用蒸馏水。
步骤二:用摩尔浓度为2.0mol/L的稀盐酸对玉米淀粉浆溶液进行出孔预处理,置于50℃恒温水浴锅中;反应4h后加入摩尔浓度为0.2mol/L的Na2HPO4缓冲液中和,离心洗涤,离心条件为3000r/min, 4℃, 10min,移去上清。
步骤三:以每克干基玉米淀粉加入60国际单位α-淀粉酶的比例称取α-淀粉酶,再按国际单位比α-淀粉酶:糖化酶=1:3的比例称取糖化酶,α-淀粉酶活度为5.0×104IU/g,糖化酶活度为1.0×105IU/g,将α-淀粉酶和糖化酶混合,加入步骤二得到的玉米淀粉浆溶液中,加入缓冲液调节pH至4.5~5.0,缓冲液由摩尔浓度为0.2mol/L的Na2HPO4溶液和摩尔浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液按体积比2:1的比例混合而成;在恒温搅拌器上反应,反应时间为20h,反应温度为50℃。
步骤四:加摩尔浓度为1.7mol/L的NaOH溶液中和,离心4次,转速为3000r/min, 反应温度为4℃,每次离心10min,弃上清,真空冷冻干燥机冻干,得微孔淀粉;
步骤五:将胶原蛋白与微孔淀粉按照15:1的质量比,在50mL离心管中混合并加入交联剂,交联剂为质量分数为0.1%的戊二醛溶液,交联反应体系的溶剂为体积分数为95%的乙醇,于37℃恒温培养箱中反应48h后取出洗涤,冻干,得降解速率可控的微孔淀粉。胶原蛋白选取基因工程技术高密度发酵生产的人源型胶原蛋白。
实施例3:
步骤一:配制质量分数为40%的玉米淀粉溶液;所用玉米淀粉的分子量为10000Da,配制玉米淀粉溶液使用蒸馏水。
步骤二:用摩尔浓度为3.0mol/L的稀盐酸对玉米淀粉浆溶液进行出孔预处理,置于50℃恒温水浴锅中;反应4h后加入摩尔浓度为0.2mol/L的Na2HPO4缓冲液中和,离心洗涤,离心条件为3000r/min, 4℃, 10min,移去上清。
步骤三:以每克干基玉米淀粉加入60国际单位α-淀粉酶的比例称取α-淀粉酶,再按国际单位比α-淀粉酶:糖化酶=1:5的比例称取糖化酶,α-淀粉酶活度为5.0×104IU/g,糖化酶活度为1.0×105IU/g,将α-淀粉酶和糖化酶混合,加入步骤二得到的玉米淀粉浆溶液中,加入缓冲液调节pH至4.5~5.0,缓冲液由摩尔浓度为0.2mol/L的Na2HPO4溶液和摩尔浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液按体积比2:1的比例混合而成;在恒温搅拌器上反应,反应时间为22h,反应温度为55℃。
步骤四:加摩尔浓度为2.0mol/L的NaOH溶液中和,离心5次,转速为3000r/min, 反应温度为4℃,每次离心10min,弃上清,真空冷冻干燥机冻干,得微孔淀粉;
步骤五:将胶原蛋白与微孔淀粉按照20:1的质量比,在50mL离心管中混合并加入交联剂,交联剂为质量分数为0.2%的戊二醛溶液,交联反应体系的溶剂为体积分数为95%的乙醇,于37℃恒温培养箱中反应72h后取出洗涤,冻干,得降解速率可控的微孔淀粉。胶原蛋白选取基因工程技术高密度发酵生产的人源型胶原蛋白。
类人胶原蛋白-微孔淀粉止血材料性能测试:
1、孔隙率的测定
干燥的类人胶原蛋白—微孔淀粉止血材料成品若干块:矩形,正圆形和不规则形状各3个样,本实验室自制。选一个容积为50mL的烧杯,倒满乙醇称重M1,把重为MS的材料浸入乙醇中,超声脱气,务必使乙醇充盈于材料,然后称重为M2,把浸满了乙醇的样品取出后,称剩余的乙醇的重量为M3,计算孔隙率θ,每组测三个样,最后求平均值。
θ=(M 2 —M 3 —M S)/(M 1—M 3)
表1 类人胶原蛋白-微孔淀粉止血材料孔隙率的测定
2、对兔肝脏止血效果研究:
将10只实验兔随机分为2组,一组为类人胶原蛋白-微孔淀粉,一组为阿里斯泰止血粉,每组5只,雌雄不限,采用2.5%戊巴比妥钠溶液2ml耳缘静脉注射麻醉,逐层开腹,暴露肝脏,将肝叶上用手术刀片做1.0cm×1.0cm的创面,在创面形成过程中渗血用纱布吸取,然后迅速用准备好的类人胶原蛋白-微孔淀粉、阿里斯泰止血粉分别敷压创面,记录完全止血时间,观察两种材料在创面的粘附情况并对肝脏表面进行拍照。如图2所示。肝脏创面完全止血计时如表2:
表2 类人胶原蛋白-微孔淀粉对肝脏止血效果
上述结果显示,当微孔淀粉与类人胶原蛋白复合时,能更好地促进创面的愈合与修复血管内壁。原因可能是:微孔淀粉的颗粒表面积大,吸水速率高,加之类人胶原蛋白可以促使凝血因子发挥作用,二者协同大大缩短了止血时间,最终达到快速止血的目的。
本发明的内容不限于实施例所列举,本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换,均为本发明的权利要求所涵盖。
Claims (7)
1.一种降解速率可控的微孔淀粉的制备方法,其特征在于:
由以下步骤实现:
步骤一:配制质量分数为38~40%的玉米淀粉溶液;
步骤二:用稀酸对玉米淀粉浆溶液进行出孔预处理,置于50℃恒温水浴锅中;反应4h后加入缓冲液中和,离心洗涤,离心条件为3000r/min, 4℃, 10min,反复操作3次,移去上清;
步骤三:以每克干基玉米淀粉加入60国际单位α-淀粉酶的比例称取α-淀粉酶,再按国际单位比α-淀粉酶:糖化酶=1:(1~5)的比例称取糖化酶,将α-淀粉酶和糖化酶混合,加入步骤二得到的玉米淀粉浆溶液中,加入缓冲液调节pH至4.5~5.0,在恒温搅拌器上反应,反应时间为18~22h,反应温度为45~55℃;
步骤四:加碱中和,离心3~5次,转速为3000r/min, 反应温度为4℃,每次离心10min,弃上清,真空冷冻干燥机冻干,得微孔淀粉;
步骤五:将胶原蛋白与微孔淀粉按照(10~20):1的质量比,在50mL离心管中混合并加入交联剂,于37℃恒温培养箱中反应24~72h后取出洗涤,冻干,得降解速率可控的微孔淀粉。
2.根据权利要求1所述的一种降解速率可控的微孔淀粉的制备方法,其特征在于:
步骤一中,所用玉米淀粉的分子量为7000~10000Da;
步骤一中,配制玉米淀粉溶液使用蒸馏水。
3.根据权利要求2所述的一种降解速率可控的微孔淀粉的制备方法,其特征在于:
步骤二中,稀酸选取摩尔浓度为1.5~3.0mol/L的稀盐酸;
步骤二中,缓冲液选取摩尔浓度为0.2mol/L的Na2HPO4溶液。
4.根据权利要求3所述的一种降解速率可控的微孔淀粉的制备方法,其特征在于:
步骤三中,α-淀粉酶活度为5.0×104IU/g,糖化酶活度为1.0×105IU/g;
步骤三中,缓冲液由摩尔浓度为0.2mol/L的Na2HPO4溶液和摩尔浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液按体积比2:1的比例混合而成。
5.根据权利要求4所述的一种降解速率可控的微孔淀粉的制备方法,其特征在于:
步骤四中,碱指摩尔浓度为1.5~2.0mol/L的NaOH溶液。
6.根据权利要求5所述的一种降解速率可控的微孔淀粉的制备方法,其特征在于:
步骤五中,交联剂为质量分数为0.05~0.2%的戊二醛溶液;
步骤五中,交联反应体系的溶剂为体积分数为95%的乙醇;
步骤五中,胶原蛋白选取基因工程技术高密度发酵生产的人源型胶原蛋白。
7.一种根据权利要求6所述的一种降解速率可控的微孔淀粉的制备方法制备的降解速率可控的微孔淀粉。
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