CN111298133B - 一种岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备方法及其应用 - Google Patents

一种岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

一种岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备方法，具体包括以下步骤：（1）介孔MnO2的合成；（2）介孔MnO2的修饰；（3）岩藻多糖接枝多肽（pep‑Fuco），得岩藻多糖‑多肽；（4）介孔MnO2修饰岩藻多糖‑多肽复合物（MnO2@pep‑Fuco）的制备；（5）介孔二氧化锰纳米药物递送系统负载尿激酶（MnO2/uPA@pep‑Fuco）的制备，制备方法简单，易生产制备，所制备的该体系降低尿激酶给药剂量的同时增加了尿激酶在血栓部位的有效浓度，减少了全身出血等严重不良反应，提高了溶栓的安全性，二氧化锰纳米粒可有效清除血栓部位的双氧水并产生氧气，缓解了血栓部位乏氧、抑制了血管炎症和血栓的进一步发展，是抗血栓药物上的创新，有显著的经济和社会效益。

Description

一种岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制 备方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备方法及其应用。
背景技术
体内血栓的形成可导致血管阻塞或闭塞，继而引发缺血性中风、急性心肌梗死和肺栓塞等事件。因此，快速清除血管内血栓以恢复正常组织或器官的血流供给是治疗这些疾病的关键。目前临床上通常采用静脉滴注纤溶药物进行溶栓，如链激酶，尿激酶，阿替普酶等。然而，全身应用溶栓药物容易引起出血等严重不良反应，对血栓患者的生命造成威胁。另一方面，纤溶药物存在给药剂量大、半衰期短、在体内易被清除等缺点。近年来，靶向递药系统的设计为治疗血栓提供了新思路。血栓部位存在大量的H2O2，活化的血小板，丰富的凝血酶和纤维蛋白等。通过设计一种靶向血栓并实现血栓微环境响应释药的纳米药物递送系统，可以将纤溶药物准确地递送至血栓部位，降低给药剂量的同时提高血栓部位的有效药物浓度，从而降低出血风险，提高溶栓的安全性。
介孔二氧化锰（MnO2）纳米粒具有合适的粒径、大的孔径、良好的分散性。此外，二氧化锰能够催化血栓部位的H2O2产生O2。一方面，受损血管和活化的血小板产生的H2O2是进一步引发其他血小板活化和聚集的关键介质。且H2O2介导炎症蛋白的内皮表达，激活血小板-内皮相互作用，促进了炎症和血管阻塞性疾病的发展。另一方面，在血栓部位，由于血管阻塞常表现出乏氧的微环境，而在乏氧条件下，纤溶系统的活性会受到抑制，若改善乏氧可能会有利于抗血栓治疗。因此，将介孔二氧化锰用作纳米药物递送的载体，运载药物到达血栓部位，清除血栓微环境中双氧水的同时还可产生氧气以缓解血栓部位乏氧，增强抗血栓治疗效果。
岩藻多糖（fucoidan）是一类以岩藻糖为主、含有多种单糖残基以及硫酸基的水溶性多糖，主要来源于褐藻。它具有多种生物学功能，如抗凝血、抗肿瘤、抗血栓、抗病毒、抗氧化和增强机体免疫机能等生理作用，且研究表明岩藻多糖可以食用，无毒，因此它被广泛地应用于现代食品和医药领域。而岩藻多糖对活化血小板表面高表达的P-选择素具有很强的亲和力。此外，在缺血组织中活化的内皮细胞也过度表达P-选择素。因此在血栓靶向递药系统的设计中可将岩藻多糖作为纳米载体的包封剂和靶向剂，防止药物泄露的同时使载药系统特定靶向血栓部位。
含LVPRGS序列肽为凝血酶响应肽，可被凝血酶特异性切割。在此，本发明设计了一个凝血酶可降解的多肽序列GGLVPRGSGG，通过其连接二氧化锰和岩藻多糖，将岩藻多糖成功包被在介孔二氧化锰纳米粒子表面。在该递药系统中以纤溶药物尿激酶（uPA）作为模型药物，得到最终的纳米药物递送系统MnO2/uPA@pep-Fuco。当该递药系统进入血液循环后，可通过岩藻多糖特定靶向血栓部位，而血栓微环境中大量存在的凝血酶可对凝血酶响应肽进行切割，使得岩藻多糖从二氧化锰纳米粒表面脱离，释放包载的溶栓药物尿激酶，同时暴露的二氧化锰纳米粒催化双氧水产生氧气，清除双氧水的同时缓解了血栓部位乏氧，从而促进抗血栓治疗，但至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备方法及其应用，可有效解决岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备，实现在抗血栓药物中的应用问题。
为实现上述目的，本发明的技术方案是，一种岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备方法，采用能催化双氧水产生氧气的介孔二氧化锰纳米粒作为基体材料，以纤溶药物尿激酶作为模型药物，并通过凝血酶可降解肽将岩藻多糖修饰在二氧化锰表面，构建具有血栓靶向、凝血酶响应释药的纳米药物递送系统，缓解血栓部位乏氧促进抗血栓治疗的药物，具体包括以下步骤：
（1） 介孔MnO2的合成：将十二烷基苯磺酸钠溶解于超纯水中，配制成浓度为0.4-2mol/L的十二烷基苯磺酸钠溶液20~40 mL，在30-100 ℃油浴锅中搅拌10 min，将浓度为0.1-0.4 mol/L 的高锰酸钾水溶液20~40mL，逐滴加入到十二烷基苯磺酸钠溶液中，继续搅拌30 min，再逐滴加入浓度为2~4 mol/L的硝酸20~100 mL，成反应体系，继续搅拌3-6 h，在10000~12000 rpm离心5~20 min，收集沉淀物；
（2） 介孔MnO2的修饰，包括氨基化修饰或羧基化修饰，其中所述的氨基化修饰是将MnO215mg分散于5~10 mL无水甲醇中，加入75μL的 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES），密封避光搅拌12~72 h，在10000~12000 rpm离心5~20min收集沉淀物，所述的羧基化修饰是将MnO245mg分散于10mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，加入96mg 丁二酸酐，60mg 的4-二甲氨基吡啶（DMAP），132μL 三乙胺，密封避光搅拌12h，12000rpm离心5min收集沉淀物；
（3） 岩藻多糖接枝多肽（pep-Fuco）：将2~5 mg的多肽溶于0.5-1mL无水甲酰胺中，并依次加入10μL 2,4,6-三氯苯甲酰氯，10 mg的 4-二甲氨基吡啶（DMAP），10μL三乙胺，磁力搅拌使充分溶解，活化羧基30 min，将10mg的岩藻多糖用1ml的无水甲酰胺超声溶解，逐滴加入到上述多肽体系中，避光密封，搅拌过夜8-12h，得岩藻多糖-多肽；
（4） 介孔MnO2修饰岩藻多糖-多肽复合物（MnO2@pep-Fuco）的制备：通过介孔MnO2表面的羧基或介孔MnO2表面的氨基和岩藻多糖-多肽的酰胺反应，将岩藻多糖修饰到MnO2表面，将5mg MnO2纳米粒，5mg岩藻多糖-多肽用1mL甲酰胺或800μL 0.1M的pH为6.5的MES缓冲液分散，加入34-38.34mg 碳二亚胺（EDC）和23.02-38.6mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺（sulfo-NHS），磁力搅拌17-48h，10000-12000rpm离心5-20min，得沉淀物；
（5）介孔二氧化锰纳米药物递送系统负载尿激酶（MnO2/uPA@pep-Fuco）的制备：称取5~20 mg步骤(4)制备的沉淀物加入到2~40 mL pH=7.4的PBS缓冲液中，超声分散1-2min得分散液，将尿激酶用pH为7.4的PBS缓冲液溶解后，逐滴加入到上述分散液中，4℃超声条件下反应1~5h，得岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统，所述的步骤(4)制备的沉淀物与尿激酶的质量比为1:1-4。
本发明制备方法简单，原料丰富，易生产制备，所制备的该体系降低尿激酶给药剂量的同时增加了尿激酶在血栓部位的有效浓度，减少了全身出血等严重不良反应，提高了溶栓的安全性。另一方面，二氧化锰纳米粒可有效清除血栓部位的双氧水并产生氧气，缓解了血栓部位乏氧、抑制了血管炎症和血栓的进一步发展，有利于抗血栓治疗，是抗血栓药物上的创新，有显著的经济和社会效益。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中，由以下实施例给出。
实施例1
一种岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
（1）介孔MnO2的合成：将十二烷基苯磺酸钠溶解于超纯水中，配制成浓度为0.4mol/L的十二烷基苯磺酸钠溶液20 mL，在30 ℃油浴锅中搅拌10 min，将浓度为0.1mol/L的高锰酸钾水溶液20mL，逐滴加入到十二烷基苯磺酸钠溶液中，继续搅拌30 min，再逐滴加入浓度为2mol/L的硝酸20mL，成反应体系，继续搅拌3 h，在10000 rpm离心20min，收集沉淀物；
（2）介孔MnO2的修饰，包括氨基化修饰或羧基化修饰，其中所述的氨基化修饰是将MnO215mg分散于5 mL无水甲醇中，加入75μL的 APTES，密封避光搅拌12h，在10000 rpm离心20min收集沉淀物，所述的羧基化修饰是将MnO245mg分散于10mLDMF中，加入96mg 丁二酸酐，60mg DMAP，132μL 三乙胺，密封避光搅拌12h，12000rpm离心5min收集沉淀物；
（3）岩藻多糖接枝多肽：将2 mg的多肽溶于0.5mL无水甲酰胺中，并依次加入10μL2,4,6-三氯苯甲酰氯，10 mg DMAP，10μL三乙胺，磁力搅拌使充分溶解，活化羧基30 min，将10mg的岩藻多糖用1ml的无水甲酰胺超声溶解，逐滴加入到上述多肽体系中，避光密封，搅拌过夜8h；
（4）介孔MnO2修饰岩藻多糖-多肽复合物的制备：通过介孔MnO2表面的羧基和岩藻多糖-多肽上的末端氨基之间的酰胺反应，将岩藻多糖修饰到MnO2表面，将5mg MnO2纳米粒，5mg岩藻多糖-多肽用1mL甲酰胺中分散，加入38.34mg 碳二亚胺和23.02mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，磁力搅拌48h， 10000rpm离心20min，得沉淀物；
（5）介孔二氧化锰纳米药物递送系统负载尿激酶的制备：称取10 mg步骤(4)制备的沉淀物加入到2 mL pH为7.4的PBS缓冲液中，超声分散1min得分散液，将尿激酶用pH为7.4的PBS缓冲液溶解后，逐滴加入到上述分散液中，4℃超声条件下反应2h，得岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统，所述的步骤(4)制备的沉淀物与尿激酶的质量比为1:1。
实施例2
一种岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
（1）介孔MnO2的合成：将十二烷基苯磺酸钠溶解于超纯水中，配制成浓度为1.5mol/L的十二烷基苯磺酸钠溶液30mL，在65 ℃油浴锅中搅拌10 min，将浓度为0.25mol/L 的高锰酸钾水溶液30mL，逐滴加入到十二烷基苯磺酸钠溶液中，继续搅拌30 min，再逐滴加入浓度为3mol/L的硝酸60 mL，成反应体系，继续搅拌4.5h，在11000 rpm离心12.5min，收集沉淀物；
（2）介孔MnO2的修饰，包括氨基化修饰或羧基化修饰，其中所述的氨基化修饰是将MnO215mg分散于7.5 mL无水甲醇中，加入75μL的 APTES，密封避光搅拌43.5h，在11000 rpm离心12.5min收集沉淀物，所述的羧基化修饰是将MnO245mg分散于10mLDMF中，加入96mg 丁二酸酐，60mg DMAP，132μL 三乙胺，密封避光搅拌12h，12000rpm离心5min收集沉淀物；
（3）岩藻多糖接枝多肽：将2.5mg的多肽溶于0.75mL无水甲酰胺中，并依次加入10μL 2,4,6-三氯苯甲酰氯，10 mg DMAP，10μL三乙胺，磁力搅拌使充分溶解，活化羧基30 min，将10mg的岩藻多糖用1ml的无水甲酰胺超声溶解，逐滴加入到上述多肽体系中，避光密封，搅拌过夜10h；
（4）介孔MnO2修饰岩藻多糖-多肽复合物的制备：通过介孔MnO2表面的羧基和岩藻多糖-多肽上的末端氨基之间的酰胺反应，将岩藻多糖修饰到MnO2表面，将5mg MnO2纳米粒，5mg岩藻多糖-多肽用1mL甲酰胺中分散，加入38.34mg 碳二亚胺和23.02mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，磁力搅拌48h， 11000rpm离心2.5min，得沉淀物；
（5）介孔二氧化锰纳米药物递送系统负载尿激酶的制备：称取12.5mg步骤(4)制备的沉淀物加入到21mL pH=7.4的PBS缓冲液中，超声分散1.5min得分散液，将尿激酶用pH为7.4的PBS缓冲液溶解后，逐滴加入到上述分散液中，4℃超声条件下反应3h，得岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统，所述的步骤(4)制备的沉淀物与尿激酶的质量比为1:2。
实施例3
一种岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备方法，包括以下步骤：
（1）介孔MnO2的合成：将十二烷基苯磺酸钠溶解于超纯水中，配制成浓度为1.5mol/L的十二烷基苯磺酸钠溶液30 mL，在80℃油浴锅中搅拌10 min，将浓度为0.3 mol/L 的高锰酸钾水溶液30mL，逐滴加入到十二烷基苯磺酸钠溶液中，继续搅拌30 min，再逐滴加入浓度为3mol/L的硝酸30 mL，成反应体系，继续搅拌4h，在12000 rpm离心5min，收集沉淀物；
（2）介孔MnO2的修饰，包括氨基化修饰或羧基化修饰，其中所述的氨基化修饰是将MnO215mg分散于7 mL无水甲醇中，加入75μL的 APTES，密封避光搅拌30h，在12000 rpm离心5min收集沉淀物，所述的羧基化修饰是将MnO245mg分散于10mLDMF中，加入96mg 丁二酸酐，60mg DMAP，132μL 三乙胺，密封避光搅拌12h，12000rpm离心5min收集沉淀物；
（3）岩藻多糖接枝多肽：将2mg的多肽溶于0.5mL无水甲酰胺中，并依次加入10μL2,4,6-三氯苯甲酰氯，10 mg DMAP，10μL三乙胺，磁力搅拌使充分溶解，活化羧基30 min，将10mg的岩藻多糖用1ml的无水甲酰胺超声溶解，逐滴加入到上述多肽体系中，避光密封，搅拌过夜9h；
（4）介孔MnO2修饰岩藻多糖-多肽复合物的制备：通过介孔MnO2表面的氨基和岩藻多糖-多肽上的末端羧基之间的酰胺反应，将岩藻多糖修饰到MnO2表面，将5mg MnO2纳米粒，5mg岩藻多糖-多肽用800μL 0.1M的pH为6.5的MES缓冲液分散，加入34mg 碳二亚胺和38.6mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，磁力搅拌17h， 12000rpm离心5min，得沉淀物；
（5）介孔二氧化锰纳米药物递送系统负载尿激酶的制备：称取5mg步骤(4)制备的沉淀物加入到40mL pH为7.4的PBS缓冲液中，超声分散1min得分散液，将尿激酶用pH为7.4的PBS缓冲液溶解后，逐滴加入到上述分散液中，4℃超声条件下反应2h，得岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统，所述的步骤(4)制备的沉淀物与尿激酶的质量比为1:4。
所述的岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的粒径为100~300nm。
所述方法制备的岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统在制备抗血栓药物中的应用。
所述的药物为注射剂、冻干粉针或片剂。
由上述可以看出，本发明涉及一种岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备及应用。方法为采用能够催化双氧水产生氧气的介孔二氧化锰纳米粒作为基体材料，以纤溶药物尿激酶作为模型药物，以岩藻多糖作为靶向剂和包封剂，并通过凝血酶可降解肽（GGLVPRGSGG）将岩藻多糖修饰连接在介孔二氧化锰表面，构建一种具有血栓靶向、凝血酶响应释药的纳米药物递送系统。该体系降低尿激酶给药剂量的同时增加了尿激酶在血栓部位的有效浓度，减少了全身出血等严重不良反应，提高了溶栓的安全性。另一方面，二氧化锰纳米粒可有效清除血栓部位的双氧水并产生氧气，缓解了血栓部位乏氧、抑制了血管炎症和血栓的进一步发展，有利于抗血栓治疗，并经实验，取得了非常好的有益技术效果，有关实验资料如下（以实施例1为例）：
实验1：MnO2@pep-Fuco纳米粒的凝血酶响应释药
用PBS buffer ( pH 7.4) 配制不同浓度的凝血酶溶液(0、5和10 U/mL)。将负载FITC-uPA的MnO2@pep-Fuco纳米粒置于透析袋内（截留分子量=100kDa），分别在上述不同浓度的凝血酶溶液中孵育（100rpm，37℃）。每隔一定时间取出部分释放介质，通过测定FITC标记的uPA荧光强度，得到药物释放动力学（5min，20min，1h，2h，3h，12h）。结果表明该纳米制剂具有明显的凝血酶敏感性，凝血酶浓度越高，释药越快，没有凝血酶存在时，在12h内药物的释放量很少。
实验2： MnO2@pep-Fuco纳米载体对内皮细胞的毒性
体外细胞毒性试验以内皮细胞为研究对象，用不同剂量MnO2@pep-Fuco纳米粒对细胞进行处理，继续培养24h，通过SRB法考察其对内皮细胞的毒性。结果表明，MnO2@pep-Fuco纳米载体对内皮细胞的活性影响很小。
实验3：MnO2@pep-Fuco纳米载体在体外血栓模型中的靶向研究
制备大鼠富血小板血浆，在10μL凝血酶（0.1U/μL）和10μL CaCl2（0.4M）存在下，于96孔板中加入富血小板血浆180μL/孔，37℃、100rpm条件下孵育诱导凝块形成。在凝块形成90分钟后，用PBS洗涤，每孔加入FITC标记的MnO2@pep-Fuco纳米颗粒（100μg）并孵育30分钟，设置空白对照组和无靶头组。再用PBS溶液洗涤凝块三次，然后使用荧光成像系统分析平板。结果表明，MnO2/uPA@pep-Fuco与空白组和无靶头组相比，对体外血栓具有良好的靶向作用。
实验4：MnO2/uPA@pep-Fuco纳米粒在体外血栓模型中的溶栓研究
制备大鼠富血小板血浆，在10μL凝血酶（0.1U/μL）和10μL CaCl2（0.4M）存在下，于96孔板中加入富血小板血浆180μL/孔，37℃、100rpm条件下孵育诱导凝块形成。在凝块形成90分钟后，用PBS洗涤，每孔加入MnO2/uPA@pep-Fuco纳米粒（100μg）并孵育30分钟，设置空白对照组和MnO2@pep-Fuco组。再用PBS溶液浸泡洗涤凝块，4%组织细胞固定液固定24h，包埋、H&E染色切片后置于显微镜下观察各组血栓块的形态并拍照。结果表明，MnO2/uPA@pep-Fuco对体外血栓块具有良好的溶解作用。
实验5：MnO2/uPA@pep-Fuco纳米粒在体内血栓模型中的靶向溶栓研究
将大鼠麻醉后，用10%FeCl3诱导大鼠一侧颈动脉形成血栓模型。时间效应：血栓形成后不同时间内通过尾静脉注射IR820标记的MnO2/uPA@pep-Fuco纳米粒分散液，考察血栓栓龄对溶栓效果的影响；剂量效应：用不同剂量IR820标记的MnO2/uPA@pep-Fuco处理细胞，考察其对血栓块的溶解作用。设置无靶头组，有靶头组，利用IR820光吸收特性，使用荧光成像系统对血栓进行荧光成像，设置拍照时间间隔为0，10，60，90min。拍照结束后，处死大鼠，取两侧颈动脉，进行H&E染色切片。置于显微镜下观察各组两侧颈动脉的形态并拍照。实验结果表明，MnO2/uPA@pep-Fuco在大鼠体内具有良好的靶向和溶栓作用。
本发明除在做上述三个重复实验的同时，还对实施例2和实施例3给出的产品做了同样的实验，均取得了相同和相近似的结果，这里不一一列举，实验表明，方法稳定可靠，产品质量好，与现有技术相比，具有以下有益技术效果：
（1）该体系能够通过岩藻多糖靶向血栓部位活化血小板，降低尿激酶给药量的同时提高了血栓部位有效药物浓度，降低了全身出血等严重不良反应，提高了溶栓的安全性；
（2）该体系能够清除血栓部位存在的大量双氧水，抑制了血管炎症和栓塞的进一步发展；
（3）该体系在血栓部位通过催化双氧水产生氧气，缓解血栓部位乏氧，有利于抗血栓治疗，开拓了抗血栓药物的新途径，有显著的经济和社会效益。

Claims (7)

1.一种岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备方法，其特征在于，采用能催化双氧水产生氧气的介孔二氧化锰纳米粒作为基体材料，以纤溶药物尿激酶作为模型药物，并通过凝血酶可降解肽将岩藻多糖修饰在二氧化锰表面，构建具有血栓靶向、凝血酶响应释药的纳米药物递送系统，缓解血栓部位乏氧促进抗血栓治疗的药物，具体包括以下步骤：
（1）介孔MnO2的合成：将十二烷基苯磺酸钠溶解于超纯水中，配制成浓度为0.4-2 mol/L的十二烷基苯磺酸钠溶液20~40 mL，在30-100 ℃油浴锅中搅拌10 min，将浓度为0.1-0.4mol/L 的高锰酸钾水溶液20~40mL，逐滴加入到十二烷基苯磺酸钠溶液中，继续搅拌30min，再逐滴加入浓度为2~4 mol/L的硝酸20~100 mL，成反应体系，继续搅拌3-6 h，在10000~12000 rpm离心5~20 min，收集沉淀物；
（2）介孔MnO2的修饰，包括氨基化修饰或羧基化修饰，其中所述的氨基化修饰是将MnO215mg分散于5~10 mL无水甲醇中，加入75μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，密封避光搅拌12~72 h，在10000~12000 rpm离心5~20min收集沉淀物，所述的羧基化修饰是将MnO245mg分散于10mLN,N-二甲基甲酰胺中，加入96mg 丁二酸酐，60mg 的4-二甲氨基吡啶，132μL 三乙胺，密封避光搅拌12h，12000rpm离心5min收集沉淀物；
（3）岩藻多糖接枝多肽：将2~5 mg的多肽溶于0.5-1mL无水甲酰胺中，并依次加入10μL2,4,6-三氯苯甲酰氯，10 mg 的4-二甲氨基吡啶，10μL三乙胺，磁力搅拌使充分溶解，活化羧基30 min，将10mg的岩藻多糖用1ml的无水甲酰胺超声溶解，逐滴加入到上述多肽体系中，避光密封，搅拌过夜8-12h，得岩藻多糖-多肽；
（4）介孔MnO2修饰岩藻多糖-多肽复合物的制备：通过介孔MnO2表面的羧基或介孔MnO2表面的氨基和岩藻多糖-多肽的酰胺反应，将岩藻多糖修饰到MnO2表面，将5mg MnO2纳米粒，5mg岩藻多糖-多肽用1mL甲酰胺或800μL 0.1M的pH为6.5的MES缓冲液分散，加入34-38.34mg 碳二亚胺和23.02-38.6mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，磁力搅拌17-48h，10000-12000rpm离心5-20min，得沉淀物；
（5）介孔二氧化锰纳米药物递送系统负载尿激酶的制备：称取5~20 mg步骤(4)制备的沉淀物加入到2~40 mL pH为7.4的PBS缓冲液中，超声分散1-2min得分散液，将尿激酶用pH为7.4的PBS缓冲液溶解后，逐滴加入到上述分散液中，4℃超声条件下反应1~5h，得岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统，所述的步骤(4)制备的沉淀物与尿激酶的质量比为1:1-4。
2.根据权利要求1所述的岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）介孔MnO2的合成：将十二烷基苯磺酸钠溶解于超纯水中，配制成浓度为0.4 mol/L的十二烷基苯磺酸钠溶液20 mL，在30 ℃油浴锅中搅拌10 min，将浓度为0.1mol/L 的高锰酸钾水溶液20mL，逐滴加入到十二烷基苯磺酸钠溶液中，继续搅拌30 min，再逐滴加入浓度为2mol/L的硝酸20mL，成反应体系，继续搅拌3 h，在10000 rpm离心20min，收集沉淀物；
（2）介孔MnO2的修饰，包括氨基化修饰或羧基化修饰，其中所述的氨基化修饰是将MnO215mg分散于5 mL无水甲醇中，加入75μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，密封避光搅拌12h，在10000 rpm离心20min收集沉淀物，所述的羧基化修饰是将MnO245mg分散于10mLN,N-二甲基甲酰胺中，加入96mg 丁二酸酐，60mg 的4-二甲氨基吡啶，132μL 三乙胺，密封避光搅拌12h，12000rpm离心5min收集沉淀物；
（3）岩藻多糖接枝多肽：将2 mg的多肽溶于0.5mL无水甲酰胺中，并依次加入10μL 2,4,6-三氯苯甲酰氯，10 mg 的4-二甲氨基吡啶，10μL三乙胺，磁力搅拌使充分溶解，活化羧基30 min，将10mg的岩藻多糖用1ml的无水甲酰胺超声溶解，逐滴加入到上述多肽体系中，避光密封，搅拌过夜8h；
（4）介孔MnO2修饰岩藻多糖-多肽复合物的制备：通过介孔MnO2表面的羧基和岩藻多糖-多肽上的末端氨基之间的酰胺反应，将岩藻多糖修饰到MnO2表面，将5mg MnO2纳米粒，5mg岩藻多糖-多肽用1mL甲酰胺中分散，加入38.34mg 碳二亚胺和23.02mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，磁力搅拌48h， 10000rpm离心20min，得沉淀物；
（5）介孔二氧化锰纳米药物递送系统负载尿激酶的制备：称取10 mg步骤(4)制备的沉淀物加入到2 mL pH为7.4的PBS缓冲液中，超声分散1min得分散液，将尿激酶用pH为7.4的PBS缓冲液溶解后，逐滴加入到上述分散液中，4℃超声条件下反应2h，得岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统，所述的步骤(4)制备的沉淀物与尿激酶的质量比为1:1。
3.根据权利要求1所述的岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）介孔MnO2的合成：将十二烷基苯磺酸钠溶解于超纯水中，配制成浓度为1.5mol/L的十二烷基苯磺酸钠溶液30mL，在65 ℃油浴锅中搅拌10 min，将浓度为0.25 mol/L 的高锰酸钾水溶液30mL，逐滴加入到十二烷基苯磺酸钠溶液中，继续搅拌30 min，再逐滴加入浓度为3mol/L的硝酸60 mL，成反应体系，继续搅拌4.5h，在11000 rpm离心12.5 min，收集沉淀物；
（2）介孔MnO2的修饰，包括氨基化修饰或羧基化修饰，其中所述的氨基化修饰是将MnO215mg分散于7.5 mL无水甲醇中，加入75μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，密封避光搅拌43.5h，在11000 rpm离心12.5min收集沉淀物，所述的羧基化修饰是将MnO245mg分散于10mLN,N-二甲基甲酰胺中，加入96mg 丁二酸酐，60mg 的4-二甲氨基吡啶，132μL 三乙胺，密封避光搅拌12h，12000rpm离心5min收集沉淀物；
（3）岩藻多糖接枝多肽：将2.5mg的多肽溶于0.75mL无水甲酰胺中，并依次加入10μL 2,4,6-三氯苯甲酰氯，10 mg 的4-二甲氨基吡啶，10μL三乙胺，磁力搅拌使充分溶解，活化羧基30 min，将10mg的岩藻多糖用1ml的无水甲酰胺超声溶解，逐滴加入到上述多肽体系中，避光密封，搅拌过夜10h；
（4）介孔MnO2修饰岩藻多糖-多肽复合物的制备：通过介孔MnO2表面的羧基和岩藻多糖-多肽上的末端氨基之间的酰胺反应，将岩藻多糖修饰到MnO2表面，将5mg MnO2纳米粒，5mg岩藻多糖-多肽用1mL甲酰胺中分散，加入38.34mg 碳二亚胺和23.02mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，磁力搅拌48h， 11000rpm离心2.5min，得沉淀物；
（5）介孔二氧化锰纳米药物递送系统负载尿激酶的制备：称取12.5mg步骤(4)制备的沉淀物加入到21mL pH=7.4的PBS缓冲液中，超声分散1.5min得分散液，将尿激酶用pH为7.4的PBS缓冲液溶解后，逐滴加入到上述分散液中，4℃超声条件下反应3h，得岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统，所述的步骤(4)制备的沉淀物与尿激酶的质量比为1:2。
4.根据权利要求1所述的岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）介孔MnO2的合成：将十二烷基苯磺酸钠溶解于超纯水中，配制成浓度为1.5mol/L的十二烷基苯磺酸钠溶液30 mL，在80℃油浴锅中搅拌10 min，将浓度为0.3 mol/L 的高锰酸钾水溶液30mL，逐滴加入到十二烷基苯磺酸钠溶液中，继续搅拌30 min，再逐滴加入浓度为3mol/L的硝酸30 mL，成反应体系，继续搅拌4h，在12000 rpm离心5min，收集沉淀物；
（2）介孔MnO2的修饰，包括氨基化修饰或羧基化修饰，其中所述的氨基化修饰是将MnO215mg分散于7 mL无水甲醇中，加入75μL的3-氨丙基三乙氧基硅烷，密封避光搅拌30h，在12000 rpm离心5min收集沉淀物，所述的羧基化修饰是将MnO245mg分散于10mLN,N-二甲基甲酰胺中，加入96mg 丁二酸酐，60mg 的4-二甲氨基吡啶，132μL 三乙胺，密封避光搅拌12h，12000rpm离心5min收集沉淀物；
（3）岩藻多糖接枝多肽：将2mg的多肽溶于0.5mL无水甲酰胺中，并依次加入10μL 2,4,6-三氯苯甲酰氯，10 mg 的4-二甲氨基吡啶，10μL三乙胺，磁力搅拌使充分溶解，活化羧基30 min，将10mg的岩藻多糖用1ml的无水甲酰胺超声溶解，逐滴加入到上述多肽体系中，避光密封，搅拌过夜9h；
（4）介孔MnO2修饰岩藻多糖-多肽复合物的制备：通过介孔MnO2表面的氨基和岩藻多糖-多肽上的末端羧基之间的酰胺反应，将岩藻多糖修饰到MnO2表面，将5mg MnO2纳米粒，5mg岩藻多糖-多肽用800μL 0.1M的pH为6.5的MES缓冲液分散，加入34mg 碳二亚胺和38.6mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，磁力搅拌17h， 12000rpm离心5min，得沉淀物；
（5）介孔二氧化锰纳米药物递送系统负载尿激酶的制备：称取5mg步骤(4)制备的沉淀物加入到40mL pH为7.4的PBS缓冲液中，超声分散1min得分散液，将尿激酶用pH为7.4的PBS缓冲液溶解后，逐滴加入到上述分散液中，4℃超声条件下反应2h，得岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统，所述的步骤(4)制备的沉淀物与尿激酶的质量比为1:4。
5.根据权利要求1-4任一所述的岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的制备方法，其特征在于，所述的岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统的粒径为100~300nm。
6.权利要求1-5任一所述方法制备的岩藻多糖包被的门控型介孔二氧化锰纳米载药系统在制备抗血栓药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的在制备抗血栓药物中的应用，其特征在于，所述的药物为注射剂、冻干粉针或片剂。
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