CN102477439A - 三元复合物和含有三元复合物的液体及制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种三元复合物，其特征在于，该三元复合物含有A组分，B组分和C组分，A组分为带有正电荷的载体，B组分为带有负电荷的核酸，C组分为带有负电荷的共聚物。本发明还提供了含有该三元复合物的液体及其制备方法。此外，还提供了上述三元复合物和含有三元复合物的液体的应用。本发明提供的三元复合物和含有三元复合物的液体能够兼具低毒和高转染效率。因此，能够广泛的用于细胞转染、疾病的预防、诊断和基因治疗中。

Description

三元复合物和含有三元复合物的液体及制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种三元复合物，一种含有三元复合物的液体，一种含有三元复合物的液体的制备方法以及三元复合物与含有三元复合物的液体的应用。
背景技术
基因治疗在癌症治疗、病毒感染和心血管疾病的治疗上具有很好的应用前景，但基因治疗需要安全、有效的载体。合成的阳离子聚合物作为基因的非病毒载体得到了广泛的关注，如聚乙烯亚胺(PEI)、壳聚糖(CS)、聚赖氨酸(PLL)、聚β-氨基酯(Poly(β-amino esters)，PBAEs)，聚酰胺-胺型树枝状聚合物(PAMAM)、聚二甲胺基丙烯酸乙酯(PDMAEMA)等阳离子聚合物或含有这些阳离子聚合物链的共聚物，通过静电相互作用与带负电荷的DNA或RNA复合形成纳米粒子。此外，还有表面带有正电荷的纳米金颗粒、纳米硅胶颗粒等也可作为DNA或RNA的载体。上述阳离子聚合物或纳米粒与DNA或RNA复合形成的纳米粒子可以促进基因的转染效果，但同时存在复合物表面正电性太强导致的毒性较大、体内运转时间短等问题。研究表明，在上述阳离子聚合物或纳米粒上引入聚乙二醇段可以大大提高生物相容性、降低纳米复合体系的毒性，延长纳米粒子在体内的循环时间等，但同时也导致纳米复合体系的细胞转染效率大大下降。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种兼具低毒和高转染效率的三元复合物及其液体和制备方法及应用。
本发明提供了一种三元复合物，其特征在于，该三元复合物含有A组分，B组分和C组分，A组分为带有正电荷的载体，B组分为带有负电荷的核酸，C组分为带有负电荷的共聚物。
本发明还提供了一种含有三元复合物的液体，其特征在于，该含有三元复合物的液体含有水和上述三元复合物。
此外，本发明还提供了一种含有三元复合物的液体的制备方法，其特征在于，该方法包括使Y物质的水溶液与D物质的水溶液混合，并将所得的混合物与M物质的水溶液混合；其中，Y物质为载体，所述载体能够在水溶液中形成带有正电荷的基团；D物质为核酸；M物质为能够在水溶液中形成带有负电荷基团的共聚物。以及提供了由上述方法制备得到的含有三元复合物的液体。
本发明还提供了上述三元复合物或含有三元复合物的液体在细胞转染、疾病的预防、诊断和基因治疗中的应用。以及上述三元复合物或含有三元复合物的液体在制备细胞转染试剂，制备疾病的预防、诊断或基因治疗的药物中的应用。
对本发明提供的三元复合物和含有三元复合物的液体进行细胞毒性实验，证实三元复合物的毒性远远低于二元复合物；对本发明提供的三元复合物和含有三元复合物的液体进行HeLa细胞转染实验，证实三元复合物相比二元复合物的细胞转染效率也有较大的提高。并且，对本发明优选实施方式制得的含有三元复合物的液体进行RNA干扰实验，证实由本发明的三元复合物和/或含有三元复合物的液体作为核酸的传递系统，能够高效地、高特异性的使核酸进入靶细胞，并能够保证传递的核酸的干扰活性。
由此可见，本发明提供的三元复合物和含有三元复合物的液体能够广泛的用于细胞转染、疾病的预防、诊断和基因治疗中，同时能够广泛的用于制备细胞转染试剂，制备疾病的预防、诊断或基因治疗的药物中。
附图说明
图1为本发明四种实施方式中的含有PCL-g-PDMAEMA1/D/M-1三元复合物的液体和六组对照组的凝胶电泳图。
图2为本发明一种实施方式中PCL-g-PDMAEMA1/D/M-1三元复合物的透射电镜照片。
图3为本发明两种实施方式中的含有PCL-g-PDMAEMA1/D/M-1三元复合物的液体和四组对照组的HeLa细胞转染效率的柱状图。
图4为本发明四种实施方式中的含有PCL-g-PDMAEMA1/D/M-1三元复合物的液体和六组对照组的HeLa细胞毒性的柱状图。
图5为本发明两种实施方式中的含有PCL-g-PDMAEMA1/siRNA1/M-2三元复合物的液体和对照组抑制HeLa-Luc细胞荧光素酶蛋白表达效率的柱状图。
具体实施方式
本发明提供了一种三元复合物，其特征在于，该三元复合物含有A组分，B组分和C组分，A组分为带有正电荷的载体，B组分为带有负电荷的核酸，C组分为带有负电荷的共聚物。
根据本发明，所述共聚物可以为本领域各种带有负电荷的共聚物，只要能够与A组分通过静电相互作用结合，形成所述的三元复合物即可，为了使形成的三元复合物具备更好的生物活性，优选地，C组分为聚谷氨酸与聚乙二醇形成的共聚物和/或聚谷氨酸与一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇形成的共聚物
根据本发明，所述带有正电荷的载体，即A组分优选为带有正电荷的纳米颗粒和/或带有正电荷的阳离子聚合物，进一步优选地，所述带有正电荷的纳米颗粒和带有正电荷的阳离子聚合物均含有基团Z，基团Z能够结合氢离子并形成带有正电荷的基团，并且基团Z中的至少一部分与氢离子结合，形成了所述带有正电荷的基团，A组分带有的正电荷由所述带有正电荷的基团提供；B组分带有的负电荷由核酸中的磷酸二酯键失去至少部分氢离子后得到的基团提供，其中，磷酸二酯键为本领域公知的概念，即：一种化学基团，指一分子磷酸与两分子醇(羟基)酯化形成的两个酯键，在水溶液中，至少部分磷酸上羟基的氢原子会解离，从而使核酸带有负电荷；优选情况下，C组分带有的负电荷由所述共聚物中的羧基失去至少部分氢离子后得到的基团提供，所述羧基为聚谷氨酸上没有用于聚合的羧基，在水溶液中，至少部分所述羧基能够电离，从而使C组分带有负电荷。需要明确的是，本发明中所述共聚物中羧基的摩尔数指呈电离状态的羧基的摩尔数与没有呈电离状态的羧基的摩尔数之和，即对应于共聚物中谷氨酸结构单元的摩尔数。
根据本发明，所述基团Z的摩尔数(记为N)、核酸中的核苷酸的摩尔数(记为P)与所述共聚物中羧基的摩尔数(记为C)的比例，简称为N/P/C值，可以在较大的范围内变化，为了获得更好的细胞转染效率并兼顾细胞相容性(即降低细胞毒性)，所述N/P/C值优选为1-50∶1∶1-50，进一步优选情况下，所述N/P/C值为1-30∶1∶1-30，并且，在优选条件下，所述A组分带有的正电荷、B组分带有的负电荷与C组分带有的负电荷使得三元复合物的Zeta电位为-20mV到30mV，进一步优选为-15mV到20mV。
根据本发明，所述基团Z为任何可以实现能够结合氢离子并带有正电荷的基团，如含有电负性较强的氮原子的氨基，具体地，本发明中所述基团Z优选为伯氨基、仲氨基和叔氨基中的一种或多种，进一步优选为叔氨基。
此外，本发明中所述阳离子聚合物还包括目前商品化的各种阳离子聚合物型转染试剂，如阳离子脂质体和Transfectam试剂等，这里需要特别说明的是，本发明中，利用商购的阳离子脂质体和Transfectam试剂制备三元复合物的过程，所述阳离子脂质体和Transfectam试剂均按照商购的试剂盒中的操作规程，根据所带有的N原子或正电荷的数目，得到满足一定N/P/C值的三元复合物。
根据本发明，所述带有正电荷的纳米颗粒作为核酸的载体，优选颗粒直径为10-400纳米；所述带有正电荷的纳米颗粒可以为本领域各种能够在溶液中形成带有正电荷基团的纳米颗粒，如通过各种方式形成的带有正电荷的金纳米颗粒和/或带有正电荷的硅胶纳米颗粒，当所述带有正电荷的纳米颗粒为金纳米颗粒和/或带有正电荷的硅胶纳米颗粒时，优选颗粒直径为10-200纳米，最优选为10-100纳米；本发明中所述带有正电荷的纳米颗粒通过在羧基化金纳米颗粒的表面复合阳离子聚合物，如聚乙烯亚胺而形成。
根据本发明，所述阳离子聚合物的数均分子量可以在较大范围内变化，优选地，所述阳离子聚合物的数均分子量为1KDa-150KDa，进一步优选地，所述阳离子聚合物的数均分子量为5KDa-120KDa，最优选地，所述阳离子聚合物的数均分子量为10KDa-100KDa。
本发明中，阳离子聚合物沿用本领域的常规定义，指链上有阳离子基团的聚合物，一般都指水溶性聚合物。常用的阳离子聚合物包括聚二烯丙基二甲基氯化铵、聚脒、聚乙烯胺、阳离子聚丙烯酰胺等。
根据本发明，所述阳离子聚合物作为核酸转染细胞的载体，所述阳离子聚合物可以为本领域各种能够作为细胞转染用载体的阳离子聚合物，优选地，所述阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、阳离子脂质体、聚β-氨基酯、壳聚糖、壳聚糖季铵盐、含有式(1)所示结构单元的聚合物、聚酰胺-胺型树枝状聚合物、两亲性梳形接枝共聚物和阳离子共聚物中的一种或多种，所述阳离子共聚物为聚乙烯亚胺、聚β-氨基酯、含有式(1)所示结构单元的聚合物、聚酰胺-胺型树枝状聚合物、两亲性梳形接枝共聚物中的至少两种形成的共聚物；
Figure BSA00000358804900061
式(1)，
其中，R1为H或C1-C4的烷基，优选地，R1为H或甲基；R2为C1-C4的亚烷基，优选地，R2为C1-C2的亚烷基；R3和R4各自独立地为C1-C4的烷基，优选地，R3和R4各自独立地为甲基或乙基，进一步优选地，R3和R4同时为甲基或乙基。
根据本发明，在满足能够在水溶液中形成带有正电荷的基团的前提下，所述两亲性梳形接枝共聚物可以为多种含有疏水性主链和亲水性侧链的两亲性梳形共聚物，本发明对所述两亲性梳形共聚物的制备方法没有特别的限定，优选地，所述两亲性梳形共聚物是在原子转移自由基聚合反应条件下，将含溴官能团的聚酯与至少一个末端为烯键的物质接触得到的，所述含溴官能团的聚酯与至少一个末端为烯键的物质的摩尔比可以为本领域常规的比例，优选地，所述含溴官能团的聚酯与至少一个末端为烯键的物质的摩尔比为1∶1-100，进一步优选为1∶30-70。
其中，所述至少一个末端为烯键的物质为具有式(2)所示结构的单体、含有式(1)所示结构单元的聚合物和聚乙烯亚胺中的一种或多种，即所述含溴官能团的聚酯可以与单体进行反应也可以与聚合物进行反应，
Figure BSA00000358804900062
式(2)，
其中，R1为H或C1-C4的烷基，优选地，R1为H或甲基，R2为C1-C4的亚烷基，优选地，R2为C1-C2的亚烷基；R3和R4各自独立地为C1-C4的烷基，优选地，R3和R4各自独立地为甲基或乙基，进一步优选地，R3和R4同时为甲基或乙基。
根据本发明，所述含溴官能团的聚酯可以为本领域各种能够作为原子转移自由基聚合反应的引发剂的大分子聚酯，优选地，所述含溴官能团的聚酯的数均分子量为500-30000，进一步优选为1000-15000，本发明中，所述含溴官能团的聚酯优选为γ-(2-溴-甲基丙酸酯)-己内酯的均聚物、γ-(2-溴-甲基丙酸酯)-己内酯与内酯的共聚物和γ-(2-溴-甲基丙酸酯)-己内酯与交酯的共聚物中的一种或多种，其中，所述内酯为β-羟基丁酯和/或β-羟基戊酯，所述交酯为乙交酯和/或丙交酯，进一步优选地，所述含有溴官能团的聚酯为γ-(2-溴-甲基丙酸酯)-己内酯的均聚物。
根据本发明，所述两亲性梳形接枝共聚物在制备三元复合物的过程中，要先经过一个将其制备成为纳米颗粒的过程，由于两亲性梳形接枝共聚物带有亲水性侧链和疏水性主链，因此，将其溶于有机溶剂后，再缓慢滴加到水相体系中，待有机溶剂挥发完全后，用稀盐酸调节聚合物溶液的pH值至中性，即可得到疏水性内核，亲水性外壳的纳米颗粒。为了使配制好的两亲性梳形接枝共聚物能够更稳定的保存，优选将配制好的聚合物溶液用0.22微米的Millipore无菌膜过滤除菌后放于4℃保存备用。需要特别明确的是，由于两亲性梳形接枝共聚物与其他阳离子聚合物都属于聚合物类，而且需要一定的处理步骤才会成为颗粒状，因此，在本申请中仍将其划分为阳离子聚合物的类别中。但是，由于其预先形成了纳米尺度内的颗粒，能够对其颗粒的直径进行测定，因此，本申请中所述带有正电荷的纳米颗粒的颗粒直径范围包括两亲性梳形接枝共聚物所形成的纳米颗粒的颗粒直径，本发明中所述两亲性梳形接枝共聚物形成的纳米颗粒的直径优选为30-360纳米。
根据本发明，所述原子转移自由基聚合反应的条件为本领域技术人员公知，如氮气保护下，聚合温度为30-70℃，聚合时间为10-18小时。
本发明中所述核酸可以为寡聚核苷酸和/或多聚核苷酸，所述核酸为本领域公知的概念，由核苷酸单体聚合而成，根据本发明的实质，所述核酸可以为任何长度的核酸，优选的所述核酸的分子量为1×103-1×108，进一步优选为5×103-1×107。
本发明中，所述核酸可以为核糖核酸，也可以为脱氧核糖核酸，可以为单链核酸也可以为双链核酸、三链核酸，或者由核糖核酸与脱氧核糖核酸组成的杂合链核酸，只要具备基本的核苷酸单位，都可以适用于本发明。在核酸药物应用领域，所述B组分优选为核糖核酸，进一步优选为双链核糖核酸，特别是带有1-10个核苷酸长度的单链区的双链核糖核酸，即双链核糖核酸中除了双链区域外，在其中一条链的5’端上游或3’端下游还有1-10个核苷酸长度的单链区域，所述单链区域可以为核糖核酸，也可以为脱氧核糖核酸，满足上述特征的最典型的结构即为小干扰核酸序列。
此外，所述B组分可以为部分经过化学修饰的核糖核酸，所述部分经过化学修饰的核糖核酸被修饰的方式可以为本领域各种对核酸进行修饰的方式，如核糖的修饰、碱基的修饰和磷酸二酯键的修饰中的至少一种。所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2’-OH的修饰，即，在核糖的羟基位置引入某些取代基，例如，2’-氟代修饰，如式(3)所示；2’-氧甲基修饰，如式(4)所示；2’-氧亚乙基甲氧基修饰，如式(5)所示；2，4’-二硝基苯酚修饰，如式(6)所示；锁核酸(LNA)，如式(7)所示；2’-氨基修饰，如式(8)所示；2’-脱氧修饰，如式(9)所示。
Figure BSA00000358804900081
式(3)                    式(4)                  式(5)                  式(6)
Figure BSA00000358804900091
式(7)                    式(8)                   式(9)
所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，例如，5′-溴尿嘧啶修饰，如式(10)所示；5′-碘尿嘧啶修饰，如式(11)所示；N-甲基脲嘧啶修饰，如式(12)所示；2，6-二氨基嘌呤修饰，如式(13)所示。
式(10)               式(11)                 式(12)                式(13)
所述化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰，如式(14)所示；和硼烷化磷酸盐修饰，如式(15)所示。两种修饰都能稳定小干扰核酸结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
Figure BSA00000358804900093
式(14)                                        式(15)
需要特别明确的是，对核酸中磷酸二酯键修饰的数目以不破坏核酸与组分A之间的静电相互作用为前提，即要保证核酸能够和组分A结合。
所述部分经过化学修饰的核糖核酸所含有的修饰基团可以为本领域各种用于核酸化学修饰的基团，例如，所述部分经过化学修饰的核糖核酸所含有的修饰基团可以为氟代基团、硫代基团、烷氧基团、烷基基团和酰基基团中的至少一种，根据本发明的原理，所述修饰基团不限于以上几种，这些基团可以修饰在相同或不同的核苷酸上。
根据本发明的实质，本领域技术人员可以预测，一些含有非天然碱基的核酸以及经过各种修饰的核酸，只要结构中含有至少部分解离形成负电荷的磷酸二酯键和/或其他能够在水溶液中电离形成负电荷的基团并能与Y组分通过静电相互作用结合都可以实现本发明。因此，本发明中的核酸并不局限于由天然碱基形成的核酸。
根据本发明，所述共聚物可以为嵌段共聚物和/或接枝共聚物，本发明中，所述嵌段共聚物优选为AB型、ABA型和BAB型嵌段共聚物中的至少一种，且共聚物的数均分子量优选为1000-400000，进一步优选为2000-200000；其中，所述AB型、ABA型和BAB型嵌段共聚物为本领域公知的概念，AB型嵌段共聚物为A和B组成的二嵌段共聚物，ABA型嵌段共聚物和BAB型嵌段共聚物为A和B组成的三嵌段共聚物，为清楚起见，定义A为聚谷氨酸嵌段，且A的数均分子量优选为1000-300000，进一步优选为5000-100000；定义B为聚乙二醇嵌段和/或一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇嵌段，且B的数均分子量优选为200-30000，进一步优选为1000-20000。
另外，所述共聚物还可以为接枝共聚物，所述接枝共聚物优选为含有聚谷氨酸主链和侧链的接枝共聚物，所述侧链可以为聚乙二醇和/或一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇，所述接枝共聚物的数均分子量优选为1000-400000，进一步优选为1000-200000；接枝率为10-80％，进一步优选为10-50％，最优选为15-40％；其中，所述接枝率沿用本领域常规的定义，接枝率即接枝效率，接枝率＝接枝共聚物中接枝组分的重量/反应所得聚合物的总质量，例如，本申请中的聚谷氨酸和聚乙二醇形成的接枝共聚物中，接枝率＝共聚物中聚乙二醇侧链的重量/共聚物的总重量。其中，所述聚谷氨酸主链的数均分子量优选为1000-300000，进一步优选为5000-150000；每个侧链的数均分子量优选为200-30000，进一步优选为1000-10000，最优选为1000-5000。
根据本发明，所述一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇为一个末端被靶向性物质修饰了的聚乙二醇，所述靶向性沿用本领域常规的定义，是指把治疗作用、药物效应等限定在特定的靶细胞、组织或器官内，而不影响其他正常的细胞、组织或器官的功能，所述靶向性物质可以通过例如共价键与具有治疗作用、药物效应或具备其他功能的组分连接，从而实现将所连接的组分限定在特定的靶细胞、组织或器官内，所述靶向性基团即靶向性物质连接到所述组分上所形成的基团。所述连接的方式可以为各种能够实现上述目的方式，只要满足所述靶向性物质形成的靶向性基团不影响被连接的组分的生物活性，被连接的组分也不影响靶向性基团的定位功能，同时，靶向性基团与被连接的组分在制备和使用过程中能够以稳定的形式结合在一起即可，因此，不同的靶向性物质可以根据各自的结构特征选择用不同的方式将其与所述具有治疗作用或药物效应的组分连接，目前，由于靶向性基团在科研和临床中的广泛应用，很多带有常规的靶向性基团的化合物已经实现了商品化，如本发明中使用的各种一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇，就是通过商购得到的。这些商品化的带有靶向性基团的化合物可以满足上述对带有靶向性基团的化合物的要求。
由靶向性的定义可以看出，所述靶向性物质的选择取决于作为靶点的细胞、组织或器官，目前，已经研究出多种针对不同的细胞、组织和器官具有靶向性作用的物质，包括小分子化合物，具有导向作用的短肽，如特异性靶向内皮细胞的RGD短肽(精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸)，适配子等，所述适配子沿用本领域公知的定义，即通过配体指数级富集系统进化(SELEX)技术得到的对于特定的细胞、蛋白、核酸或小分子等靶点具有高特异性结合能力的寡聚核苷酸。
根据本发明，所述靶向性物质可以为上述任何一种靶向性物质，优选地，所述靶向性物质为叶酸、甘露糖、半乳糖、具有导向作用的短肽和适配子中的一种或多种。尽管如此，根据本发明的发明实质，本领域技术人员可以确定，任何对特定的靶点(如器官、组织、细胞等)具备靶向能力的靶向性物质都可以应用于本发明，本发明并不局限于上述的靶向性物质。
本发明提供一种含有三元复合物的液体，其特征在于，该含有三元复合物的液体含有水和上述三元复合物。优选地，所述三元复合物中还含有其他离子，如磷酸缓冲液中各种形式的磷酸根离子，碱金属离子等，且所述含有三元复合物的液体的pH值为5.5-8，优选为6.0-7.4，进一步优选为7.2-7.4。
本发明对所述含有三元复合物的液体中三元复合物的浓度没有特别的限定，在以细胞转染为目的的应用中，优选地，以满足细胞转染需要的最低浓度为下限，以特定体积液体中所能容纳的三元复合物的总量为上限，进一步优选地，所述含有三元复合物的液体中三元复合物的浓度为0.001-4.0克/升，进一步优选为0.01-3克/升，最优选为0.02-1克/升；在用于细胞转染实验时，由于所需核酸的量较低，可以直接制备较低浓度的含有三元复合物的液体，也可以将制备好的含有三元复合物的液体进行稀释，以核酸的浓度为标准，所述含有三元复合物的液体的浓度优选为0.001-0.25毫克核酸/毫升，进一步优选为0.005-0.1毫克核酸/毫升。在上述各组分的优选条件下，所述含有三元复合物的液体中的三元复合物为颗粒状且平均颗粒直径为20-500纳米，进一步优选为50-380纳米，最优选为50-300纳米。
本发明提供了一种含有三元复合物的液体的制备方法，其特征在于，该方法包括使Y物质的水溶液与D物质的水溶液混合，并将所得的混合物与M物质的水溶液混合；其中，Y物质为载体，所述载体能够在水溶液中形成带有正电荷的基团；D物质为核酸；M物质为能够在水溶液中形成带有负电荷基团的共聚物。
根据本发明，所述能够在水溶液中形成带有负电荷基团的共聚物可以为本领域各种能够在水溶液中形成带有负电荷基团的共聚物，为使最后形成的含有三元复合物的液体具备更好的生物活性，优选地，所述能够在水溶液中形成带有负电荷基团的共聚物为聚谷氨酸与聚乙二醇形成的共聚物和/或聚谷氨酸与一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇形成的共聚物。
根据本发明，所述Y物质、D物质和M物质的水溶液中各种物质的浓度可以在很大范围内变化，制备过程中对各种物质浓度的选择取决于所需最终产物的浓度，在本发明中，所述Y物质的水溶液中Y物质的浓度为0.001-1克/升，进一步优选为0.005-0.5克/升，最优选为0.01-0.1克/升；所述D物质的水溶液中D物质的浓度为0.001-1克/升，进一步优选为0.005-0.1克/升，最优选为0.01-0.04克/升；M物质的水溶液中M物质的浓度为0.001-1克/升，进一步优选为0.01-0.5克/升，最优选为0.02-0.3克/升。
所述混合的条件为常规的混合条件，温度和时间都可以在很大范围内变化，两次混合的温度和时间可以相同或不同，优选为相同，所述温度例如可以为4℃-50℃，优选为15℃-40℃，时间可以为5分钟以上，考虑到节约时间与混合效果的平衡，优选混合的时间为10分钟-60分钟，进一步优选为15-30分钟。
当Y物质为两亲性梳形接枝共聚物时，优选所述Y物质的水溶液通过下述方法制备：用有机溶剂溶解所述两亲性梳形接枝共聚物，并缓慢滴加到去离子水中，待有机溶剂挥发完全后，用稀盐酸调节pH值为6.5-7.5，进一步优选为7.0-7.4。
当Y物质为其他物质时，优选情况下，所述Y物质的水溶液为Y物质的缓冲溶液，更优选地，所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，所述磷酸缓冲溶液的pH值优选为7-7.4，同样地，所述D物质的水溶液也优选为D物质的缓冲溶液，更优选地，所述缓冲溶液为磷酸缓冲溶液，所述磷酸缓冲溶液的pH值优选为7-7.4，进一步优选地，所述Y物质的水溶液和D物质的水溶液都为各自的磷酸缓冲液，且pH值均为7.2-7.4。
根据本发明，所述Y物质优选为纳米颗粒和/或阳离子聚合物，所述纳米颗粒和阳离子聚合物均含有基团Z，基团Z能够结合氢离子并形成所述带有正电荷的基团。
根据本发明，所述基团Z的摩尔数、核酸中核苷酸的摩尔数与所述共聚物中的羧基的摩尔数的比例范围与前述相同，在此不再赘述。其中，所述基团Z的摩尔数、核酸中的核苷酸的摩尔数与所述共聚物中的羧基的摩尔数使得制得的含有三元复合物的液体中三元复合物的Zeta电位为-20mV到30mV，进一步优选为-15mV到20mV。
根据本发明，基团Z的定义、纳米颗粒的选择、阳离子聚合物的各种描述、所述核酸的定义、类型与分子量以及共聚物的类型和具体描述均与前述相同，在此不再赘述。
本发明提供一种含有三元复合物的液体，所述含有三元复合物的液体通过上述含有三元复合物的液体的制备方法制得。
本发明提供的三元复合物和含有三元复合物的液体作为一种核酸传递方式，与其他的载体或传递方式同样的，能够在细胞转染、疾病的预防、诊断和基因治疗中应用。同时，也能够在制备细胞转染试剂，制备疾病的预防、诊断或基因治疗的药物中应用。如通过向机体细胞中转染本发明的三元复合物和/或含有三元复合物的液体，所述三元复合物中的D物质与要检测的从机体分化分离出的遗传信息存在特异性的结合，从而能够鉴定疾病病因和种类，特别是对那些只有一个基因异常引起的疾病，检测出基因缺陷或异常就可获得最终诊断，因此可以在制备疾病的诊断药物中得以应用。由于本发明中的三元复合物和/或含有三元复合物的液体能够有效的递送siRNA，因此，还可以用于制备基因治疗药物。并且，由于本发明中的三元复合物和/或含有三元复合物的溶液兼具低毒性和高转染效率，因此，相比现有技术的载体和方法，能够更好的应用于上述各种领域之中。
下面，通过实施例对本发明的内容进行更详细的描述。
检测和计算方法：
1、琼脂糖凝胶延滞实验，用于证明三元复合物中核酸的负载
将制备得到的5μL含有三元复合物的液体(浓度为1μg/50μL)和1μL的5×核酸上样缓冲液充分混合，然后用0.8重量％的琼脂糖(含0.5μg/mL溴化乙锭)凝胶电泳进行检测，电压120V，电泳时间为40分钟，在紫外下观察DNA电泳图谱并照相。
2、粒径及Zeta电位测定
三元复合物粒径、纳米颗粒的粒径和Zeta电位测量所用仪器为美国Brookhaven公司BI 90Plus/Zetaplus型激光粒度仪，测量温度为25℃，角度为90°，入射光波长为618nm。
3、透射电镜(TEM)实验，用于检测三元复合物的粒子形态
所用透射电镜为荷兰JEM-100CX II型透射电镜。首先将铜网浸入待测样品溶液中，然后用0.1重量％磷钨酸溶液进行染色，大约3分钟后，将多余液体用滤纸滤去，于室温下晾干。然后用透射电镜观察，并拍摄体系中粒子的形态。
4、核磁共振谱仪检测，用于确定接枝共聚物的接枝率
所用核磁共振谱仪为Bruker 400M核磁共振谱仪。具体计算方法参考文献，Boulmedais F.，Frisch B.，Etienne O.，Lavalle Ph.，Picart C.，Ogier J.，VoegelJ-C.，Schaaf P.，Egles C.Polyelectrolyte multilayer films with pegylatedpolypeptides as a new type of anti-microbial protection for biomaterials，Biomaterials，2004，25，2003-2011。
5、体外转染实验
(1)在24孔板中接种5×104个293T细胞(或HeLa细胞)/孔，DMEM培养基体积为0.5mL，培养过夜；
(2)在转染前，将培养基换成无血清无抗生素的DMEM，每孔0.5mL；
(3)将0.1毫升浓度为0.01毫克DNA/毫升的含有三元复合物的液体加入24孔板中；
(4)在37℃及5体积％CO2浓度下培养4小时，然后将孔中液体吸出，换为含2重量％的FBS(Gibico)的DMEM维持培养液(Gibico)，培养液体积为0.5mL/孔；
(5)在37℃的5体积％CO2培养箱(Thermo Scientific Heraeus，HERAcell150)中继续培养48小时后进行流式检测(BD FACSAria，美国BD公司)，并根据各孔的数值做出柱状图(Origin 6.0软件)。
其中，EGFP-N1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
6、细胞毒性检测
利用MTT法(四唑盐比色法)对聚合物的细胞毒性进行检测，具体方法如下：
(1)在96孔板中接种1×104个HeLa细胞/孔，每孔培养基体积为100μL，在5体积％CO2，37℃条件下孵育过夜。
(2)加入0.02毫升浓度为0.01毫克DNA/毫升的含有三元复合物的液体，同时设置调零孔(培养液、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、与含有三元复合物的液体体积相同的pH值为7.4的PBS、培养液、MTT、二甲基亚砜)，在5体积％CO2，37℃条件下孵育48小时。
(3)每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，继续在5体积％CO2，37℃条件下孵育4小时。
(4)小心弃去孔内上清培养液，每孔加入150μL二甲基亚砜，置低速振荡仪上振荡10分钟，使结晶物充分溶解。在连续光谱多功能酶标仪(TECAN Infinite 200)490nm处测量各孔的吸光值。
(5)计算各个样品孔细胞相对活力，将各孔吸光值减去调零孔吸光值，得到修正后吸光值OD490’。计算对照孔修正后吸光值的平均值avg(OD490C’)，并根据各孔的吸光值的平均值做出柱状图。
7、siRNA干扰实验步骤。
(1)在24孔板中接种5×104个HeLa-Luc细胞/孔，DMEM培养基体积为0.5mL，培养过夜；
(2)在转染前，将培养基换成无血清无抗生素的DMEM，每孔0.5mL；
(3)将0.1毫升浓度为0.01毫克siRNA/毫升的含有三元复合物的液体加入24孔板中；
(4)在37℃及5体积％CO2浓度下培养4小时后将孔中液体吸出，换为含2重量％的FBS的DMEM维持培养液，培养液体积为0.5mL/孔；
(5)在37℃的5体积％CO2培养箱中继续培养48小时后进行荧光素酶蛋白检测，用BCA(Pierce，USA)试剂盒测定总蛋白的浓度。通过与空白对照组对比，计算得出siRNA的抑制效率(即基因沉默效率)。
8、所述N/P/C值通过以下方法获得，根据加入Y物质的重量结合Y物质的结构式，计算Y物质中的基团Z的总摩尔数，对于商品化的转染试剂，根据试剂盒提供的信息进行计算，得到N值；根据加入的D物质的重量结合D物质中核苷酸的分子量，计算D物质中的核苷酸的总摩尔数，得到P值；根据加入的M物质的重量结合M物质中聚谷氨酸部分的含量，计算出D物质中羧基的摩尔数，得到C值，继而得到N/P/C值。
由此可知，本发明中可以通过改变Y物质、D物质和M物质的投料比例得到所需N/P/C值的三元复合物和/或含有三元复合物的液体。
9、本发明中，使用的不同的M物质的各项参数列于表1中，本发明中所述M物质均为自制，其中，接枝共聚物的制备方法参照文献(BoulmedaisF.，Frisch B.，Etienne O.，Lavalle Ph.，Picart C.，Ogier J.，Voegel J-C.，Schaaf P.，Egles C.Polyelectrolyte multilayer films with pegylated polypeptides as a newtype of anti-microbial protection for biomaterials，Biomaterials，2004，25，2003-2011)进行制备；嵌段共聚物的制备方法参照文献(聚乙二醇单甲醚-聚谷氨酸的合成与表征，生物医学工程杂质，2006年，第23卷第4期，786-789页)进行制备；本发明中得到的含有三元复合物的液体的各项参数列于表2中，本发明中制备的两亲性梳形接枝共聚物的各项参数列于表3中。
实施例1
将EGFP-N1质粒DNA(购自Invitrogen公司，质粒DNA的核苷酸数目为4.7kb)用PBS(组成为NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L，pH值为7.4)溶解(浓度为1μg/50μL)，将50μL的PEI(25kDa，购自Sigma-Aldrich公司，每克聚合物中含有0.0222molN原子)的PBS(与上述PBS组成和pH值相同)溶液(1.35μg/50μL)逐滴加入到50μL的EGFP-N1质粒的PBS溶液中，边加入边振荡，使之充分混匀，室温25℃放置20分钟；再加入50μL的M物质(M物质为M-1，具体见表1)的水溶液(1.31μg/50μL)，充分混合，在25℃下，孵育20分钟，即得N/P/C值为10/1/2的含有三元复合物的液体P1。
实施例2
将EGFP-N1质粒DNA用PBS(组成为NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO44.3mmol/L，KH2PO41.4mmol/L，pH值为7.2)溶解(浓度为1.8μg/50μL)，将50μL的PEI(与实施例1相同)的PBS溶液(2.5μg/50μL，与上述PBS组成相同)逐滴加入到50μL的EGFP-N1质粒DNA的PBS溶液中，边加入边振荡，使之充分混匀，15℃放置30分钟；再加入50μL的M-2的水溶液(7.6μg/50μL)，充分混合，在15℃下，孵育15分钟，即得N/P/C为10/1/8的含有三元复合物的液体P2。
实施例3
将EGFP-N1质粒DNA用PBS(与实施例1相同)溶解(浓度为1μg/100μL)，将50μL的PEI(与实施例1相同)的PBS(与实施例1相同)溶液(0.68μg/50μL)逐滴加入到50μL的EGFP-N1质粒DNA的PBS溶液中，边加入边振荡，使之充分混匀，37℃放置15分钟；再加入50μL的M-2的水溶液(3.7μg/50μL)，充分混合，在37℃下，孵育30分钟，即得N/P/C为10/1/10的含有三元复合物的液体P3。
实施例4-7
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P4-P7，不同的是，将PEI替换为壳聚糖(CS，50KDa，脱乙酰度为95％，购自山东奥康生物科技有限公司，氮原子含量为0.0061mol/克壳聚糖)或壳聚糖季铵盐(NCS，按照文献方法自制(M.Thanou，B.I.Florea，M.Geldof，et al.，Quaternizedchitosan oligomers as novel gene delivery vectors in epithelial cell lines，Biomaterials，2002，23(1)：153-159.)，GPC测定分子量为7×104g/mol，1H NMR测定季铵化程度为35％，氮原子含量为0.0045mol/克碘甲烷季铵化壳聚糖，GPC，型号为Waters 515；NMR型号为Bruker 500M)，Y物质和M物质的选择具体如表2所示，并按照表2中的各种N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。
实施例8-10
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P8-P10，不同的是，将PEI替换为阳离子脂质体(Lip，即N-[1-(2，3-Dioleoyloxy)propyl]-N，N，N-trimethylammonium methylsulfate(DOTAP)，购自Sigma-Aldrich公司，每克Lip含有0.0013mol的N原子)，M物质的选择具体如表2所示，并按照表2中的各种N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。
实施例11
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P11，不同的是，将PEI替换为Transfectam试剂(Tra，按试剂盒说明书操作，购自Promega公司，每克Tra中含有0.0051mol正电荷)，M物质的选择具体如表2所示，并按照表2中的各种N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。
实施例12-14
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P12-P14，不同的是，将PEI替换为聚酰胺-胺型树枝状聚合物(PAMAM，N原子含量为0.0177mol/克PAMAM，数均分子量为14270g/mol，购自Sigma-Aldrich公司)，M物质的选择具体如表2所示，并按照表2中的各种N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。
实施例15-17
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P15-P17，不同的是，将PEI替换为聚β-氨基酯(PBAEs，按照文献方法自制(D.M.Lynn，R.Langer，Degradable Poly(β-amino esters)：Synthesis，Characterization，and Self-Assembly with Plasmid DNA，Journal of the American Chemical Society，2000，122(44)：10761-10768.)，每克聚合物中含N的摩尔数＝(重复单元中N原子的个数)/(重复单元的分子量)，数均分子量为14000g/mol)，M物质的选择具体如表2所示，并按照表2中的各种N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。
实施例18-20
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P18-P20，不同的是，将PEI替换为甲基丙烯酸N，N-二甲氨基乙酯(PDMAEMA，N原子含量为0.0064mol/克PDMAEMA(每个DMAEMA重复单元上含有一个N原子)，按照文献(J.-Y.Cherng，P.van de Wetering，H.Talsma，et al.，Effect of Sizeand Serum Proteins on Transfection Efficiency of Poly((2-dimethylamino)ethylMethacrylate)-Plasmid Nanoparticles，Pharmaceutical Research，1996，13(7)：1038-1042.)的方法制备，数均分子量为40000g/mol)，M物质的选择具体如表2所示，并按照表2中的各种N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。
制备例1-4
本制备例用于制备聚己内酯接枝聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯(PCL-g-PDMAEMA)共聚酯的水溶液。
称取0.020克PCL-g-PDMAEMA接枝共聚物(按照文献(S.Guo，W.Wang，L.Deng，et al.，Poly(ε-caprolactone)-graft-poly(2-(dimethylamino)ethylmethacrylate)Amphiphilic Copolymers Prepared via a Combination of ROP andATRP：Synthesis，Characterization，and  Self-Assembly  Behavior，Macromolecular Chemistry and Physics，2010，211(14)：1572-1578.)的方法自制，N原子含量根据各接枝共聚物中PDMAEMA的相对含量进行计算)溶于1mL的四氢呋喃中。充分溶解后，在搅拌条件下将聚合物溶液缓慢滴加到10mL的去离子水中。室温下在通风橱中通过搅拌让四氢呋喃缓慢挥发。待溶剂挥发完全后，用稀盐酸调节聚合物溶液至pH值为7.2。配制好的聚合物溶液用0.22微米的Millipore无菌膜过滤除菌后放于4℃保存备用。按照上述方法制备PCL-g-PDMAEMA 1、PCL-g-PDMAEMA2、PCL-g-PDMAEMA3、PCL-g-PDMAEMA4的水溶液，PCL-g-PDMAEMA以纳米粒形式存在在水溶液中，四个共聚物的结构性质及水溶液纳米粒粒径列于表3中。
实施例21-25
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P21-P25，不同的是，将PEI替换为PCL-g-PDMAEMA1，M物质的选择具体如表2所示，并按照表2中的各种N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。
实施例26-32
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P26-P32，不同的是，将PEI替换为不同的PCL-g-PDMAEMA，Y物质和M物质的选择具体如表2所示，并按照表2中的各种N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。
实施例33-35
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P33-P35，不同的是，将PEI分别替换为PCL(15000)-g-PEI(800)/D/M-8(按照文献方法自制(L.Y.Qiu，Y.H.Bae，Self-assembled polyethylenimine-graft-poly([epsilon]-caprolactone)micelles as potential dual carriers of genes and anticancer drugs，Biomaterials，2007，28(28)：4132-4142.)，数均分子量为20000，接枝率为25.0％)、PCL(5000)-b-PEI(2000)/D/M-10(按照文献方法自制(P.Xu，E.A.VanKirk，Y.Zhan，et al.，Targeted Charge-Reversal Nanoparticles for Nuclear DrugDelivery，Angewandte Chemie International Edition，2007，46(26)：4999-5002.)，数均分子量为7000g/mol，接枝率为28.6％)和PCL(5000)-b-PDMAEMA(2000)/D/M-9(按照文献方法自制(L.Mespouille，M.Vachaudez，F.Suriano，etal.，One-Pot Synthesis of Well-Defined Amphiphilic and Adaptative BlockCopolymers via Versatile Combination of“Click”Chemistry and ATRP，Macromolecular Rapid Communications，2007，28(22)：2151-2158.)，数均分子量为7000g/mol，接枝率为28.6％)，根据表2的N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。
实施例36
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P36，不同的是，M物质为聚乙二醇一端带有通过叶酸修饰上的靶向基团与聚谷氨酸的接枝共聚物(M-19，购自北京键凯科技有限公司)，Y物质为PCL-g-PDMAEMA2，按照表2中的N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。
实施例37-40
按照实施例36所述的方法制备含有三元复合物的液体P37-P40，不同的是，M物质为一端带有通过甘露糖、半乳糖、RGD、Aptamer修饰上的靶向基团的聚乙二醇与聚谷氨酸形成的接枝共聚物，表1中PGA-g-PEG-G表示末端为半乳糖修饰的聚谷氨酸-g-聚二乙醇接枝共聚物，PGA-g-PEG-S表示末端为甘露糖修饰的聚谷氨酸-g-聚二乙醇接枝共聚物。
Y物质的选择见表2，按照表2中的N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，EGFP-N1质粒的加入量与实施例1相同。其中，一端带有通过甘露糖、半乳糖、RGD修饰上的靶向基团的聚乙二醇购自北京键凯科技有限公司。一端带有通过Aptamer修饰上的靶向性基团的聚乙二醇通过下述方法自制得到。
Aptamer的碱基序列如SEQ ID NO：2所示，为5′-ACC TGG GGG AGTATT GCG GAG GAA GGT GTC ACA(A)10-3′，为了能使Aptamer连接到聚乙二醇的末端，商购3′端带有氨基修饰的具有上述核苷酸序列的核酸，即结构为5′-ACC TGG GGG AGT ATT GCG GAG GAA GGT GTC ACA(A)10-NH2-3′(北京键凯科技有限公司)，使其与一个末端为羧基修饰的聚乙二醇(北京键凯科技有限公司)进行反应，参照文献方法制备Aptamer-PEG(S.Dhar，F.X.Gu，R.Langer，et al.，Targeted delivery of cisplatin to prostate cancer cells byaptamer functionalized Pt(IV)prodrug-PLGA-PEG nanoparticles，Proceedings ofthe National Academy of Sciences，2008，105(45)：17356-17361.)。
实施例41-43
按照实施例1所述的方法制备含有三元复合物的液体P41-P43，不同的是，将PEI替换为PCL-g-PDMAEMA1，D物质为siRNA1，M物质的选择具体如表2所示，并按照表2中的各种N/P/C值确定加入的三种物质的比例，其中，加入50μl浓度为1μg/50μL的siRNA1。
所述siRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
正义链：5′-UUGUUUUGGAGCGAAAdTdT-3′(SEQ ID NO：3)，
反义链：5′-UUUCCUUCCAAAACAAdTdT-3′(SEQ ID NO：4)。
实施例44-46
按照实施例41所述的方法制备含有三元复合物的液体P44-P46，不同的是，将PCL-g-PDMAEMA1替换为阳离子金纳米颗粒(C-Au)，M物质的选择见表2，按照表2中的N/P/C值确定加入的三种物质的比例。其中阳离子金纳米颗粒为羧基化金纳米颗粒与PEI(25KD)复合而成的(按照文献方法自制(S.Guo，Y.Huang，Q.Jiang，et al.，Enhanced Gene Delivery and siRNASilencing by Gold Nanoparticles Coated with Charge-Reversal Polyelectrolyte，ACS Nano，2010，4(9)：5505-5511.)，金纳米颗粒的颗粒直径为10-40nm，可通过三硝基苯磺酸滴定PEI的方法确定N原子的含量，N原子的含量为0.0089mol/克阳离子金纳米颗粒)。
测试例1-4
对P21-P24进行凝胶电泳检测，结果示于图1中。
测试例5
对P21进行透射电镜检测试验，结果示于图2中。
测试例6-51
测定P1-P46中三元复合物的颗粒直径，结果列于表2中。
测试例52-97
测定P1-P46中三元复合物的Zeta电位，结果列于表2中。
测试例98-137
检测P1-P40的转染效率，结果列于表2中，其中，P21和P22的测试结果示于图3中。
测试例138-183
检测P41-P46的基因沉默效率，结果列于表2中，P42的测试结果示于图5中。
测试例184-229
检测P1-P46的HeLa细胞毒性，结果列于表2中，其中，P21-P23和P25的测试结果示于图4中，其中，图4中的纵坐标为细胞活性，即所述各个加样孔中的相对细胞活力，与细胞毒性成反比。
对比例1
按照实施例21所述的方法制备复合物的液体，不同的是，不加入M物质，得到含有二元复合物的液体DP1，DP1的N/P值为10∶1。
对比例2-8
按照对比例1所述的方法制备含有二元复合物的溶液，调整N/P值，得到含有二元复合物的液体DP2-DP8，其中，DP2的N/P值为0.5∶1，DP3的N/P值为1∶1，DP4的N/P值为2∶1，DP5的N/P值为4∶1，DP6的N/P值为5∶1，DP7的N/P值为20∶1，DP8的N/P值为30∶1。
对比例9
按照实施例42所述的方法制备复合物的液体，不同的是，不加入M物质，得到含有二元复合物的液体DP9，DP9的N/P值为10∶1。
测试对比例1-5
将对比例1-5中得到的DP1-DP5进行凝胶电泳检测，并以2.5微升的EGFP-N1的溶液(浓度为1μg/50μL)作为对照。结果示于图1中。
测试对比例6-8
测试DP1、DP7和DP8的转染效率，并以现有技术，即，使用常规的载体PEI转染相同量的EGFP-N1作为对照组实验，结果示于图3中，其中，PEI的转染效率为11.6，DP1、DP7和DP8的转染效率分别为30.9、16.0和7.0。
测试对比例9-13
测试DP1和DP6-DP8的HeLa细胞毒性，并且以现有技术，即，使用常规的载体PEI和Lipofectamine(Lipofectamine 2000，Invitrogen)，转染相同量的EGFP-N1作为对照组实验，结果示于图4中，其中，将Lipofectamine对照组的细胞活性定为100，计算其他各组(包括实验组)中细胞的相对活性，PEI对照组细胞活性为90.4，DP1和DP6-DP8对照组中的细胞活性分别为60.2、83.1、18.3和12.4。
测试对比例14
检测DP9的基因沉默效率，并以使用现有技术，即，利用常规的转染试剂Lipofectamin 2000(Invitrogen)转染相同量的siRNA1作为对照组实验，结果示于图5中，其中，Lipofectamin 2000的基因沉默效率为50.2，DP9的基因沉默效率为60.6。
表1
Figure BSA00000358804900281
表1显示了实施例中使用的不同的M物质的组成和结构、M物质的数均分子量、接枝率、PGA链的数均分子量和PEG链的数均分子量。
表2
Figure BSA00000358804900291
其中，293T、HeLa和HeLa-Luc分别表示所用测试的细胞为293T细胞、HeLa细胞和HeLa-Luc细胞。所述转染效率为D物质是EGFP-N1质粒时EGFP-N1质粒的转染效率，所述基因沉默效率为D物质是siRNA1时siRNA1对靶基因的抑制效率。
从表2中可以看出不同N/P/C值、不同的Y物质、D物质和M物质的组成对得到的含有三元复合物的液体中三元复合物的粒径、Zeta电位和各种生物测试结果的影响。
从表2可以看出，本发明的含有三元复合物的液体的细胞转染效率或RNA干扰活性(即siRNA1的基因沉默效率)较高。
表3
Figure BSA00000358804900311
表3反映了不同梳形接枝共聚物的主链数均分子量、侧链数均分子量、每个大分子链上PDMAEMA支链数和两亲性梳形接枝共聚物形成的纳米颗粒的平均颗粒直径。
Figure ISA00000358805100011
Figure ISA00000358805100021
Figure ISA00000358805100031
Figure ISA00000358805100041
Figure ISA00000358805100051

Claims (53)

1.一种三元复合物，其特征在于，该三元复合物含有A组分，B组分和C组分，A组分为带有正电荷的载体，B组分为带有负电荷的核酸，C组分为带有负电荷的共聚物。
2.根据权利要求1所述的三元复合物，其中，所述共聚物为聚谷氨酸与聚乙二醇形成的共聚物和/或聚谷氨酸与一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇形成的共聚物。
3.根据权利要求2所述的三元复合物，其中，A组分为带有正电荷的纳米颗粒和/或带有正电荷的阳离子聚合物。
4.根据权利要求3所述的三元复合物，其中，所述带有正电荷的纳米颗粒和带有正电荷的阳离子聚合物均含有基团Z，基团Z能够结合氢离子并形成带有正电荷的基团，并且基团Z中的至少一部分与氢离子结合，形成了所述带有正电荷的基团，A组分带有的正电荷由所述带有正电荷的基团提供。
5.根据权利要求1所述的三元复合物，其中，B组分带有的负电荷由核酸中的磷酸二酯键失去至少部分氢离子后得到的基团提供。
6.根据权利要求2所述的三元复合物，其中，C组分带有的负电荷由所述共聚物中的羧基失去至少部分氢离子后得到的基团提供。
7.根据权利要求4所述的三元复合物，其中，基团Z的摩尔数、核酸中的核苷酸的摩尔数与所述共聚物中羧基的摩尔数的比例为1-50∶1∶1-50，所述A组分带有的正电荷、B组分带有的负电荷与C组分带有的负电荷使得三元复合物的Zeta电位为-20mV到30mV。
8.根据权利要求7所述的三元复合物，其中，基团Z的摩尔数、核酸中的核苷酸的摩尔数与所述共聚物中羧基的摩尔数的比例为1-30∶1∶1-30，所述A组分带有的正电荷、B组分带有的负电荷与C组分带有的负电荷使得三元复合物的Zeta电位为-15mV到20mV。
9.根据权利要求4、7-8中任意一项所述的三元复合物，其中，基团Z为伯氨基、仲氨基和叔氨基中的一种或多种。
10.根据权利要求3-4、7-8中任意一项所述的三元复合物，其中，所述带有正电荷的纳米颗粒的颗粒直径为10-400纳米，所述带有正电荷的纳米颗粒为带有正电荷的金纳米颗粒和/或带有正电荷的硅胶纳米颗粒。
11.根据权利要求3所述的三元复合物，其中，所述阳离子聚合物的数均分子量为1KDa-150KDa。
12.根据权利要求3-4、7-8和11中任意一项所述的三元复合物，其中，所述阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、阳离子脂质体、聚β-氨基酯、壳聚糖、壳聚糖季铵盐、含有式(1)所示结构单元的聚合物、聚酰胺-胺型树枝状聚合物、两亲性梳形接枝共聚物和阳离子共聚物中的一种或多种，所述阳离子共聚物为聚乙烯亚胺、聚β-氨基酯、含有式(1)所示结构单元的聚合物、聚酰胺-胺型树枝状聚合物、两亲性梳形接枝共聚物中的至少两种形成的共聚物；
式(1)，
其中，R1为H或C1-C4的烷基，R2为C1-C4的亚烷基，R3和R4各自独立地为C1-C4的烷基。
13.根据权利要求12所述的三元复合物，其中，所述两亲性梳形接枝共聚物是在原子转移自由基聚合反应条件下，由含溴官能团的聚酯与至少一个末端为烯键的物质接触得到的，所述至少一个末端为烯键的物质为具有式(2)所示结构的单体、含有式(1)所示结构单元的聚合物和聚乙烯亚胺中的一种或多种，
Figure FSA00000358804800032
式(2)，
其中，R1为H或C1-C4的烷基，R2为C1-C4的亚烷基，R3和R4各自独立地为C1-C4的烷基。
14.根据权利要求13所述的三元复合物，其中，所述含溴官能团的聚酯为γ-(2-溴-甲基丙酸酯)-己内酯的均聚物、γ-(2-溴-甲基丙酸酯)-己内酯与内酯的共聚物和γ-(2-溴-甲基丙酸酯)-己内酯与交酯的共聚物中的一种或多种，其中，所述内酯为β-羟基丁酯、β-羟基戊酯和己内酯中的一种或多种，所述交酯为乙交酯和/或丙交酯。
15.根据权利要求1所述的三元复合物，其中，所述B组分为核糖核酸。
16.根据权利要求15所述的三元复合物，其中，所述B组分为双链核糖核酸。
17.根据权利要求16所述的三元复合物，其中，所述B组分为带有1-10个核苷酸长度的单链区的双链核糖核酸。
18.根据权利要求15-17中任意一项所述的三元复合物，其中，所述B组分为部分经过化学修饰的核糖核酸。
19.根据权利要求18所述的三元复合物，其中，所述部分经过化学修饰的核糖核酸修饰的类型为核糖的修饰、碱基的修饰和磷酸二酯键的修饰中的至少一种。
20.根据权利要求19所述的三元复合物，其中，所述部分经过化学修饰的核糖核酸所含有的修饰基团为氟代基团、硫代基团、烷氧基团、烷基基团、酰基基团和氨基基团中的至少一种。
21.根据权利要求1、5、15-17、19-20中任意一项所述的三元复合物，其中，所述核酸为寡聚核苷酸和/或多聚核苷酸，所述核酸的分子量为1×103-1×108。
22.根据权利要求2所述的三元复合物，其中，所述共聚物为AB型、ABA型和BAB型嵌段共聚物中的至少一种，且共聚物的数均分子量为1000-400000，其中，A为聚谷氨酸嵌段，且A的数均分子量为500-300000，B为聚乙二醇嵌段和/或一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇嵌段，且B的数均分子量为200-30000。
23.根据权利要求2所述的三元复合物，其中，所述共聚物为含有聚谷氨酸主链和侧链的接枝共聚物，所述侧链为聚乙二醇和/或一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇，所述接枝共聚物的数均分子量为1000-400000，接枝率为10-80％，聚谷氨酸主链的数均分子量为500-300000，每个侧链的数均分子量为200-30000。
24.根据权利要求2、22或23所述的三元复合物，其中，所述一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇为一个末端被靶向性物质修饰了的聚乙二醇。
25.根据权利要求24所述的三元复合物，其中，所述靶向性物质为叶酸、甘露糖、半乳糖、具有导向作用的短肽和适配子中的一种或多种。
26.一种含有三元复合物的液体，其特征在于，该含有三元复合物的液体含有权利要求1-25中任意一项所述的三元复合物中的一种或多种和水。
27.根据权利要求26所述的含有三元复合物的液体，其中，所述含有三元复合物的液体中三元复合物的浓度为0.001-4.0克/升，所述含有三元复合物的液体中的三元复合物为颗粒状且平均颗粒直径为20-500纳米。
28.一种含有三元复合物的液体的制备方法，其特征在于，该方法包括使Y物质的水溶液与D物质的水溶液混合，并将所得的混合物与M物质的水溶液混合；其中，Y物质为载体，所述载体能够在水溶液中形成带有正电荷的基团；D物质为核酸；M物质为能够在水溶液中形成带有负电荷基团的共聚物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述能够在水溶液中形成带有负电荷基团的共聚物为聚谷氨酸与聚乙二醇形成的共聚物和/或聚谷氨酸与一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇形成的共聚物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，Y物质为纳米颗粒和/或阳离子聚合物，所述纳米颗粒和阳离子聚合物均含有基团Z，基团Z能够结合氢离子并形成所述带有正电荷的基团。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，基团Z的摩尔数、核酸中核苷酸的摩尔数与所述共聚物中的羧基的摩尔数的比例为1-50∶1∶1-50，所述基团Z的摩尔数、核酸中的核苷酸的摩尔数与所述共聚物中的羧基的摩尔数使得含有三元复合物的液体中的三元复合物的Zeta电位为-20mV到30mV。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，基团Z的摩尔数、核酸中核苷酸的摩尔数与所述共聚物中的羧基的摩尔数的比例为1-30∶1∶1-30，所述基团Z的摩尔数、核酸中的核苷酸的摩尔数与所述共聚物中的羧基的摩尔数使得含有三元复合物的液体中的三元复合物的Zeta电位为-15mV到20mV。
33.根据权利要求30-32中任意一项所述的方法，其中，基团Z为伯氨基、仲氨基和叔氨基中的一种或多种。
34.根据权利要求30-32中任意一项所述的方法，其中，所述纳米颗粒的颗粒直径为10-400纳米，所述纳米颗粒为金纳米颗粒和/或硅胶纳米颗粒。
35.根据权利要求30所述的方法，其中，所述阳离子聚合物的数均分子量为1KDa-150KDa。
36.根据权利要求30-32、35中任意一项所述的方法，其中，所述阳离子聚合物选自聚乙烯亚胺、阳离子脂质体、聚β-氨基酯、壳聚糖、壳聚糖季铵盐、含有式(1)所示结构单元的聚合物、聚酰胺-胺型树枝状聚合物、两亲性梳形接枝共聚物和阳离子共聚物中的一种或多种，所述阳离子共聚物为聚乙烯亚胺、聚β-氨基酯、含有式(1)所示结构单元的聚合物、聚酰胺-胺型树枝状聚合物、两亲性梳形接枝共聚物中的至少两种形成的共聚物；
Figure FSA00000358804800071
式(1)，
其中，R1为H或C1-C4的烷基，R2为C1-C4的亚烷基，R3和R4各自独立地为C1-C4的烷基。
37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述两亲性梳形接枝共聚物是在原子转移自由基聚合反应条件下，将含溴官能团的聚酯与至少一个末端为烯键的物质接触得到的，所述至少一个末端为烯键的物质为具有式(2)所示结构的单体、含有式(1)所示结构单元的聚合物和聚乙烯亚胺中的一种或多种，
Figure FSA00000358804800072
式(2)。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述含溴官能团的聚酯为γ-(2-溴-2-甲基丙酰氧基)-己内酯的均聚物、γ-(2-溴-2-甲基丙酰氧基)-己内酯与内酯的共聚物和γ-(2-溴-2-甲基丙酰氧基)-己内酯与交酯的共聚物中的一种或多种，其中，所述内酯为β-羟基丁酯、β-羟基戊酯和己内酯中的一种或多种，所述交酯为乙交酯和/或丙交酯。
39.根据权利要求28所述的方法，其中，所述B组分为核糖核酸。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述B组分为双链核糖核酸。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述B组分为带有1-10个核苷酸长度的单链区的双链核糖核酸。
42.根据权利要求39-41中任意一项所述的方法，其中，所述B组分为部分经过化学修饰的核糖核酸。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述至少部分化学修饰的核糖核酸修饰的类型为核糖的修饰、碱基的修饰和磷酸二酯键的修饰中的至少一种。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述部分经过化学修饰的核糖核酸所含有的修饰基团为氟代基团、硫代基团、烷氧基团、烷基基团、酰基基团和氨基基团中的至少一种。
45.根据权利要求28、39-41、43-44中任意一项所述的方法，其中，所述核酸为寡聚核苷酸和/或多聚核苷酸，所述核酸的分子量为1×103-1×108。
46.根据权利要求29所述的方法，其中，所述共聚物为AB型、ABA型和BAB型嵌段共聚物中的至少一种，且共聚物的数均分子量为1000-400000，其中，A为聚谷氨酸嵌段，且A的数均分子量为500-300000，B为聚乙二醇嵌段和/或一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇嵌段，且B的数均分子量为200-30000。
47.根据权利要求29所述的方法，其中，所述共聚物为含有聚谷氨酸主链和侧链的接枝共聚物，所述侧链为聚乙二醇和/或一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇，所述接枝共聚物的数均分子量为1000-400000，接枝率为10-80％，聚谷氨酸主链的数均分子量为500-300000，每个侧链的数均分子量为200-30000。
48.根据权利要求29、46或47所述的方法，其中，所述一个末端带有靶向性基团的聚乙二醇为一个末端被靶向性物质修饰了的聚乙二醇。
49.根据权利要求48所述的方法，其中，所述靶向性物质为叶酸、甘露糖、半乳糖、具有导向作用的短肽和适配子中的一种或多种。
50.根据权利要求28所述的方法，其中，所述Y物质的水溶液中Y物质的浓度为0.001-1克/升，D物质的水溶液中D物质的浓度为0.001-1克/升，M物质的水溶液中M物质的浓度为0.001-1克/升。
51.一种含有三元复合物的液体，所述含有三元复合物的液体通过权利要求28-50中任意一项所述的方法制得。
52.权利要求1-25中任意一项所述的三元复合物或权利要求26-27和51中任意一项所述的含有三元复合物的液体在细胞转染、疾病的预防、诊断和基因治疗中的应用。
53.权利要求1-25中任意一项所述的三元复合物或权利要求26-27和51中任意一项所述的含有三元复合物的液体在制备细胞转染试剂、制备疾病的预防、诊断或基因治疗的药物中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103255174A (zh) * 2013-05-02 2013-08-21 天津大学 以聚乙二醇接枝的透明质酸为外层的三元复合物及三元复合物的液体与应用
CN110129367A (zh) * 2019-05-28 2019-08-16 苏州博特龙免疫技术有限公司 一种阳离子型转染试剂及其制备方法和应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107142281A (zh) * 2017-06-07 2017-09-08 东华大学 聚酰胺‑胺树状大分子与纳米金颗粒的复合物作为非病毒载体进行基因转染的应用方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101684174A (zh) * 2008-07-09 2010-03-31 天津大学 两亲性可生物降解聚酯梳型接枝共聚物及其温敏原位凝胶体系
CN101864065A (zh) * 2010-06-13 2010-10-20 天津大学 含环醚侧基的可生物降解两亲性嵌段共聚物及其制备方法和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5744335A (en) * 1995-09-19 1998-04-28 Mirus Corporation Process of transfecting a cell with a polynucleotide mixed with an amphipathic compound and a DNA-binding protein
US20050265957A1 (en) * 2004-04-08 2005-12-01 Monahan Sean D Polymerized formamides for use in delivery of compounds to cells
US20080312174A1 (en) * 2007-06-05 2008-12-18 Nitto Denko Corporation Water soluble crosslinked polymers
CN101732723B (zh) * 2009-12-30 2012-07-25 上海市肿瘤研究所 聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸-聚赖氨酸纳米递送系统、制备方法及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101684174A (zh) * 2008-07-09 2010-03-31 天津大学 两亲性可生物降解聚酯梳型接枝共聚物及其温敏原位凝胶体系
CN101864065A (zh) * 2010-06-13 2010-10-20 天津大学 含环醚侧基的可生物降解两亲性嵌段共聚物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《Biomacromolecules》 20100728 董岸杰等 Amphiphilic Methoxy Poly(ethylene glycol)-b-poly(epsilon-caprolactone)-b-poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate) Cationic Copolymer Nanoparticles as a Vector for Gene and Drug Delivery 2306-2312 1-53 第11卷, 第9期 *
董岸杰等: "Amphiphilic Methoxy Poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone)-b-poly(2-dimethylaminoethyl methacrylate) Cationic Copolymer Nanoparticles as a Vector for Gene and Drug Delivery", 《BIOMACROMOLECULES》, vol. 11, no. 9, 28 July 2010 (2010-07-28), pages 2306 - 2312 *
董岸杰等: "The use of PEGylatedpoly [2-(N,N-dimethylamino) ethyl methacrylate] as a mucosal DNA delivery vector and the activation of innate immunity and improvement of HIV-1-specific immune responses", 《BIOMATERIALS》, vol. 31, no. 1, 24 September 2009 (2009-09-24), pages 115 - 123, XP026719467, DOI: doi:10.1016/j.biomaterials.2009.09.032 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103255174A (zh) * 2013-05-02 2013-08-21 天津大学 以聚乙二醇接枝的透明质酸为外层的三元复合物及三元复合物的液体与应用
CN103255174B (zh) * 2013-05-02 2015-10-28 天津大学 以聚乙二醇接枝的透明质酸为外层的三元复合物及三元复合物的液体与应用
CN110129367A (zh) * 2019-05-28 2019-08-16 苏州博特龙免疫技术有限公司 一种阳离子型转染试剂及其制备方法和应用

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