KR20160091938A - 믹토-암 가지형 폴리머 - Google Patents

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methacrylate
acrylate
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파티라쟈 어락칠러지 구나틸레이크
트레이시 미셸 힌튼
산 호아 탕
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커먼웰쓰 사이언티픽 앤드 인더스트리얼 리서치 오가니제이션
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Abstract

본 발명은 지지 모이어티 및 지지 모이어티에 각각 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하는 가지형 폴리머에 관한 것이며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함한다.

Description

믹토-암 가지형 폴리머{Mikto-arm Branched Polymers}
본 발명은 일반적으로 믹토-암 가지형 폴리머에 관한 것이다. 다시 말하면, 본 발명은 일반적으로 적어도 3개의 폴리머 암(arm)을 가진 가지형 폴리머에 관한 것이다. 믹토-암 가지형 폴리머는 핵산 분자와 복합체를 형성하는데 사용하기에 특히 적합하며, 따라서 이런 응용분야에 대한 강조와 함께 본 발명을 기술하는 것이 편리할 것이다. 그러나, 믹토-암 가지형 폴리머는 다양한 응용분야에서 사용될 수 있다고 생각된다. 따라서 본 발명은 핵산 분자와 믹토-암 가지형 폴리머의 복합체, 핵산 분자를 세포에 전달하는 방법에서 이런 복합체의 용도 및 유전자 발현을 침묵시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 핵산 분자를 효소 분해로부터 보호하는 방법에서 믹토-암 가지형 폴리머의 용도에 관한 것이다.
가지형 폴리머는 적어도 3개의 폴리머 사슬이 부착된 원자 또는 분자와 같은 지지 모이어티를 포함하는 당업계에 공지된 형태의 폴리머이다. 적어도 3개의 폴리머 사슬은 가지형 폴리머의 "암"으로 불릴 수 있다. 가지형 폴리머의 구체적인 형태는 스타(star) 폴리머, 콤(comb) 폴리머, 브러쉬 폴리머 및 덴드리머를 포함한다.
가지형 폴리머는 다양한 독특한 특성을 나타내는 것으로 발견되었고 엘라스토머, 계면활성제 및 윤활제로 작용하는 다양한 형태의 응용분야에서 사용되고 있다.
생활성제의 전달은 생활성제 안정성, 방출 속도, 방출 유발 및 생분해성과 같은 결과를 나타내는 여러 변수가 존재하기 때문에 난제로 남아있다.
따라서, 이런 종류의 폴리머의 용도를 추가로 확장하는데 적합한 특성을 나타내는 새로운 가지형 폴리머 구조를 개발하기 위한 기회가 존재한다.
본 발명은 지지 모이어티 및 지지 모이어티에 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하는 가지형 폴리머를 제공하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함한다.
본 발명에 따른 가지형 폴리머는 놀랍게도 핵산 분자와 복합체를 효과적으로 형성할 뿐만 아니라 얻은 복합체의 혈청 안정성과 세포 흡수를 강화하게 할 수 있는 적어도 양이온성, 친수성 및 생분해성 특성의 독특한 조합을 제공한다는 것이 발견되었다.
지지 모이어티에 부착된 적어도 3개의 호모폴리머 암의 각각은 다르며 따라서 가지형 폴리머는 또한 믹토-암 가지형 폴리머로 불릴 수 있다.
WO 2013/113071은 지지 모이어티 및 모이어티에 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 블럭 코폴리머 사슬을 포함하는 가지형 폴리머를 개시한다. 블럭 코폴리머 사슬은 각각 친수성 폴리머 블럭 및 양이온성 폴리머 블럭, 및 선택적으로 소수성 폴리머 블럭을 포함한다. 놀랍게도, WO 2013/113071에 개시된 가지형 폴리머와 유사한 폴리머 구성요소를 가짐에도 불구하고, 본 발명에 따른 가지형 폴리머의 믹토-암 호모폴리머 구조는 WO 2013/113071에 개시된 가지형 코폴리머 구조에 비해 개선된 특성을 나타낸다.
예를 들어, 본 발명에 따른 가지형 폴리머의 믹토-암 호모폴리머 구조는 개선된 유전자 침묵 특성을 나타낸다. 이런 개선된 특성은 낮은 복용량에 의한 유전자 침묵을 포함한다. 예를 들어, 효과적인 유전자 침묵은 WO 2013/113071에 개시된 가지형 블럭 코폴리머 구조를 사용하여 적어도 250nM의 siRNA 농도와 비교하여 50nM 정도로 낮은 siRNA 농도에서 얻었다. 여러 세포주에서 용도는 다양성을 나타내는 것으로 입증되었다. 본 발명에 따른 가지형 폴리머의 믹토-암 호모폴리머 구조는 WO 2013/113071에 개시된 가지형 블럭 코폴리머 구조에 의한 동일한 목표를 성취하는데 필요한 여러-단계 방식과 비교된 암의 말단에서 더욱 쉽게 기능화될 수 있다.
한 실시태양에서, 가지형 폴리머는 믹토-암 스타 폴리머이다.
다른 실시태양에서, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬의 하나 이상은 분해성 작용기를 통해 지지 모이어티에 공유결합된다.
분해성 작용기의 분해는 공유 결합이 분해되고 호모폴리머 사슬이 지지 모이어티로부터 절단되게 한다.
적어도 3개의 호모폴리머 사슬의 각각은 분해성 작용기를 통해 지지 모이어티에 공유결합될 수 있다.
다른 실시태양에서, 지지 모이어티는 분해가 진행되자마자 그 분자 구조에서 하나 이상의 공유 결합의 분해 및 지지 모이어티로부터의 적어도 3개의 호모폴리머 사슬의 적어도 하나의 방출을 초래하는 하나 이상의 분해성 작용기를 포함하는 분자 구조를 가진다.
호모폴리머 사슬의 하나 이상의 가지형 폴리머에 의한 손실은 친수성, 소수성 및/또는 양이온 특성과 같은 폴리머 특성에 변화를 촉진한다. 가지형 폴리머의 분자량도 물론 감소할 것이다.
분해성 작용기의 적절한 선택 및 위치를 통해, 가지형 폴리머는 특정 분해 환경에서 특정한 구조적 변형이 일어나게 설계될 수 있다.
한 실시태양에서, 분해성 작용기는 생분해성 작용기이다.
예를 들어, 가지형 폴리머는 핵산 분자와 복합체를 형성하도록 설계될 수 있고, 복합체의 투여 및 후속 형질감염시에, 적절하게 위치된 생분해성 작용기는 생분해되어 가지형 폴리머 구조로부터 호모폴리머 사슬의 하나 이상의 분리를 초래한다. 세포 내에서 가지형 폴리머의 이런 구조 변형은 핵산 분자의 향상된 이용가능성을 제공할 수 있고 또한 가지형 폴리머(및/또는 이의 잔기들)의 신진대사 및 청소를 용이하게 할 수 있다.
따라서 본 발명은 가지형 폴리머 및 핵산 분자를 포함하는 복합체를 제공하며, 가지형 폴리머는 지지 모이어티 및 모이어티에 각각 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함한다.
이와 관련하여, 본질적으로 복합체는 가지형 폴리머와 핵산 분자 중간이라는 것을 알게 될 것이다.
가지형 폴리머는 다양한 핵산 분자와 안정한 복합체를 형성할 수 있으며, 얻은 복합체는 핵산 분자를 위한 개선된 형질감염을 다양한 세포 형태에 제공한다. 복합체 형태일 때, 가지형 폴리머는 또한 효소 분해로부터 핵산 분자에 우수한 보호를 제공하는 것으로 발견되었다.
가지형 폴리머의 적어도 3개의 호모폴리머 암의 각각은 유리하게는 소정의 핵산 분자와 효과적인 복합체화 및/또는 소정의 세포 형태에 의한 핵산 분자의 효과적인 형질감염을 제공하도록 맞춤 설계될 수 있다. 가지형 폴리머 및/또는 핵산 분자는 또한 유리하게는 복합체를 선택된 표적화된 세포 형태로 향하게 하는 표적 리간드를 포함하도록 맞춤-설계될 수 있다.
한 실시태양에서, 가지형 폴리머 및/또는 핵산 분자는 표적 리간드와 컨쥬게이트된다.
다른 실시태양에서, 가지형 폴리머는 지지 모이어티에 공유결합된 하나 초과의 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 또는 소수성 호모폴리머 사슬을 가진다.
본 발명은 또한 세포에 핵산 분자를 전달하는 방법을 제공하며, 이 방법은
(a) 가지형 폴리머 및 핵산 분자를 포함하는 복합체를 제공하는 단계, 가지형 폴리머는 지지 모이어티 및 모이어티에 각각 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함한다; 및
(b) 복합체를 세포에 전달하는 단계를 포함한다.
한 실시태양에서, 핵산 분자는 유전자 발현을 침묵시키기 위해 세포에 전달된다.
본 발명은 따라서 유전자 발현을 침묵시키는 방법을 제공하며, 가지형 폴리머 및 핵산 분자를 포함하는 복합체로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하며, 가지형 폴리머는 지지 모이어티 및 모이어티에 각각 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함한다.
본 발명의 이런 양태 및 다른 양태의 한 실시태양에서, 핵산 분자는 DNA 및 RNA로부터 선택된다.
다른 실시태양에서, DNA 및 RNA는 gDNA, cDNA, 이중 또는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드, 센스 RNAs, 안티센스 RNAs, mRNAs, tRNAs, rRNAs, 소형/짧은 간섭 RNAs(siRNAs), 이중-가닥 RNAs(dsRNA), 짧은 헤어핀 RNAs(shRNAs), piwi-상호작용 RNAs(PiRNA), 마이크로 RNA/소형 템포랄 RNA(miRNA/stRNA), 소형 핵 RNAs(SnoRNAs), 소형 핵(SnRNAs) 리보자임, 압타머, DNAzymes, 리보뉴클레아제-형태 복합체, 헤어핀 이중 가닥 RNA(hairpin dsRNA), 공간 성장을 매개하는 miRNAs(sdRNAs), 스트레스 반응 RNA(srRNA), 세포 주기 RNA(ccRNAs) 및 이중 또는 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드로부터 선택된다.
본 발명에 따른 가지형 폴리머는 또한 효소 분해에 대항하여 핵산 분자를 보호하는 것으로 발견되었다.
본 발명은 따라서 효소 분해로부터 핵산 분자를 보호하는 방법을 제공하며, 지지 모이어티 및 모이어티에 각각 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하는 가지형 폴리머로 핵산 분자를 복합체화하는 단계를 포함하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함한다.
핵산 분자를 세포에 전달하기 위한 복합체의 용도가 제공되며, 복합체는 가지형 폴리머 및 핵산 분자를 포함하며, 가지형 폴리머는 지지 모이어티 및 모이어티에 각각 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함한다.
본 발명은 유전자 발현을 침묵시키기 위한 복합체의 용도를 추가로 제공하며, 복합체는 가지형 폴리머 및 핵산 분자를 포함하며, 가지형 폴리머는 지지 모이어티 및 모이어티에 각각 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함한다.
본 발명은 효소 분해로부터 핵산 분자를 보호하는데 가지형 폴리머의 용도를 추가로 제공하며, 가지형 폴리머는 지지 모이어티 및 모이어티에 각각 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함한다.
본 발명의 다른 양태 및 실시태양은 아래 본 발명의 상세한 설명에 나타난다.
본 발명의 내용 중에 포함되어 있다.
본 발명은 다음 비 제한적인 도면을 참조하여 기술될 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 가지형 폴리머의 개략적 묘사를 예시한다.
도 2는 본 발명에 따른 가지형 폴리머를 제조하는 방법의 개략적 묘사를 예시한다.
도 3은 90℃ DMF에서 [RAFT]:[ACCN] 1.0:0.3의 상대적 몰비에서 사슬 전달제로서 4-사이아노-4-[(도데실설판일티오카본일)설판일]펜타노산을 사용하여 RAFT를 통해 폴리[(올리고(에틸렌글리콜 메타크릴레이트)], 폴리[2-(다이메틸아미노)에틸 메타크릴레이트], 폴리(n-부틸 메타크릴레이트)의 선형 중합을 위한 모노머 전환율에 의한 (a) 반-로그 그래프 및 (b) 수평균 분자량 및 분산성의 발전을 예시한다.
도 4(I)는 각각 P(OEGMA8 -9), P(DMAEMA) 및 P(n-BMA)(M-RAFT 1, 2, 3 도 4 I로 표시)에 의한 3개의 매크로-RAFT 물질에 대해 얻은 GPC 흔적을 예시한다; 도 4(II)는 다른 [가교제/매크로-RAFT] 비 = 8, 12, 16에 의해 합성된 믹토-암 스타 폴리머의 GPC 흔적을 예시한다; 도 4(III)는 다른 P(n-BMA) 몰비: P(OEGMA8 -9), P(DMAEMA) 및 P(n-BMA) = 3/3/x, x = 3, 2, 1, 0으로 합성된 믹토-암 폴리머의 GPC 흔적을 예시한다; 및 도 4(IV)는 미정제 스타 폴리머, 정제된 스타 폴리머, 혼합된 암 폴리머 및 분열된 스타 폴리머의 GPC 흔적을 예시한다;
도 5는 정제된 믹토-암 폴리머 S3-6의 1H NMR 스펙트럼을 도시한다(세부사항 표 2 참조).
도 6은 믹토-암 스타 폴리머 및 4원화 믹토-암 스타 폴리머 S3-6의 1H NMR 스펙트럼을 도시한다(세부사항 표 2 참조).
도 7은 실시예 1 실험 결과에서 제조된 일련의 폴리머에 대한 폴리머:siRNA 비(w/w)의 함수로서 siRNA와 믹토-암 폴리머의 결합: (I) 폴리머 단독, (II) N:P 비 2, (III) 5 및 (IV) 10을 예시한다.
도 8은 환원 조건하에서 siRNA의 방출을 예시한다(TCEP).
도 9는 다른 폴리머 농도에서 Huh7, A549 및 CHO-GFP 세포주에서 실시예 1에서 제조된 믹토-암 스타 폴리머의 세포 생존성을 예시한다.
도 10은 세포주 CHO-GFP, A549 및 Huh7에서 침묵 실험에 사용된 다른 농도의 믹토-암 폴리머의 세포 생존성을 예시한다.
도 11은 2 및 1의 N:P 비로 실시예에서 기술된 대로 제조된 믹토-암 폴리머의 % GFP 평균 형광에 의해 측정된 대로 CHO-GFP 세포에서 유전자 침묵을 예시한다.
도 12는 125 및 50nM의 농도에서 믹토-암 폴리머 S4-1 및 S4-5에 의한 A549 및 Huh7 세포에서 COPA 침묵을 예시한다.
도 13은 믹토-암 폴리머 S4-4를 사용하는 암 의약 SN38의 Huh7 세포에 대한 전달을 예시한다.
도 14는 내재화를 입증하는 공초점 현미경을 사용하는 CHO 세포의 세포질에서 siRNA(그린) 및 표지화(적색) 입자의 내재화를 예시한다.
도 15는 WO2013/113071에 기술된 방법에 따라 제조된 4-암 스타 블럭 코폴리머에 의한 CHO-GFP 세포에서 유전자 침묵을 예시한다: TL38-50(50% 4차화), TL38-100(100% 4차화), TL-84(100% PloyFluor 없이 4차화) 및 TL-85(Polyfluore를 가진 100% 4차화).
도 16은 qRT_PCR 분석 A) 비장 B 신장 C) 폐 D) 간에 의한 ssB mRNA 발현의 배수 변화를 예시한다. 데이터는 PBS 대조군과 비교된 Tukey 사후 분석에 의한 반복 측정 ANOVA로 분석되었다. **p<0.05, ***p<0.05, NS 유의하지 않음.
일부 도면은 컬러 묘사 또는 실체를 포함한다. 도면의 컬러 버전은 요청에 따라 이용가능하다.
본 명세서 및 다음 청구항 전체에서, 내용이 다른 것을 요구하지 않는 한, 단어 포함한다("comprise") 및 이의 변형("comprises" 및 "comprising")은 상기한 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하는 것을 의미하나 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 임의의 종래 공개공보(또는 이로부터 유래된 정보) 또는 공지된 임의의 내용에 대한 참조는 종래 공개공보(또는 이로부터 유래된 정보) 또는 공지된 내용이 본 명세서와 관련된 시도의 분야에서 공통의 일반적인 지식의 일부를 구성한다는 인정 또는 허가 또는 임의의 형태의 암시가 아니며 이로 해석돼서도 안 된다.
본 발명에 사용된 대로, 단수 형태("a" 및 "the")는 내용이 달리 명시하지 않는 한 복수 양태를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "한 세포"에 대한 언급은 단일 세포뿐만 아니라 둘 이상의 세포를 포함하며; "한 물질"에 대한 언급은 한 물질뿐만 아니라 둘 이상의 물질을 포함한다.
본 발명의 내용에 사용된 표현 "가지형 폴리머"는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬이 부착된 지지 모이어티를 포함하는 폴리머를 의미한다. 가지형 폴리머는 이런 지지 모이어티의 하나 이상을 포함할 수 있다.
지지 모이어티에 부착된 적어도 3개의 호모폴리머 암의 각각은 다르며, 따라서 가지형 폴리머는 믹토-암 가지형 폴리머로 불릴 수 있다.
가지형 폴리머의 구체적인 형태는 스타(star) 폴리머, 콤(comb) 폴리머, 브러쉬 폴리머 및 덴드리머를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 가지형 폴리머는 지지 모이어티에 각각 공유결합된 적어도 하나의 양이온성 호모폴리머 사슬, 적어도 하나의 친수성 호모폴리머 사슬 및 적어도 하나의 소수성 호모폴리머 사슬을 가진다. 편의를 위해, 지지 모이어티에 공유결합된 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 가지형 폴리머의 "암"으로 부를 수 있다.
한 실시태양에서, 가지형 폴리머는 믹토-암 스타 폴리머이다.
가지형 폴리머는 3개 초과의 암을 가질 수 있다. 예를 들어, 가지형 폴리머는 지지 모이어티에 부착된 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 호모폴리머 사슬을 가질 수 있다.
한 실시태양에서, 가지형 폴리머는 하나 초과의 지지 모이어티에 공유결합된 하나 초과의 (i) 양이온성 호모폴리머 사슬, (ii) 친수성 호모폴리머 사슬 및/또는 (iii) 소수성 호모폴리머 사슬을 가진다.
다른 실시태양에서, 양이온성 호모폴리머 사슬(들), 친수성 호모폴리머 사슬(들) 및 소수성 호모폴리머 사슬(들)의 비는 약 1:1:1이다.
적어도 3개의 호모폴리머 사슬이 각각 지지 모이어티에 공유결합되는 경우, 가지형 폴리머는 지지 모이어티에 공유결합된 하나 이상의 코폴리머 사슬을 가질 수 있다.
본 발명에 사용된 "호모폴리머" 사슬은 동일한 모노머의 중합 잔기로부터 유래된 분자 구조를 가진 폴리머 사슬을 의미한다.
본 발명에 사용된 "코폴리머" 사슬은 적어도 2개의 다른 모노머의 중합 잔기로부터 유래된 분자 구조를 가진 폴리머 사슬을 의미한다.
지지 모이어티에 부착된 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 각각 독립적으로 가지형 또는 직선형 호모폴리머 사슬일 수 있다.
본 발명에 따른 가지형 폴리머는 가지형 및 직선형 호모폴리머 사슬의 조합을 가질 수 있다.
지지 모이어티에 부착된 호모폴리머 사슬에 의해 "가지형이"되는 것은 호모폴리머 사슬이 가지 구조를 가진 주요 폴리머 주쇄로부터 가지 그룹을 제공하는 것을 의미한다. 예를 들어, 가지형 호모폴리머 사슬은 가지형 올리코 에틸렌 옥사이드 모이어티(예를 들어, 올리고(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트)를 포함하여 주요 폴리머 주쇄로부터의 가지형 올리고 에틸렌 옥사이드 가지 그룹을 제공하는 모노머로부터 유래될 수 있다.
한 실시태양에서, 지지 모이어티에 부착된 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 직선형 호모폴리머 사슬이다.
다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 가지형 폴리머는 스타 폴리머이다.
"스타 폴리머"는 적어도 3개의 공유결합된 폴리머 사슬 또는 암으로부터 나오는 단일 가지 모이어티를 포함하는 거대분자를 의미한다. 본 발명에 따라 (i) 가지 모이어티는 지지 모이어티를 나타내며, 지지 모이어티는 본 발명에 기술한 대로 적절한 원자, 분자 또는 분자 구조 형태일 수 있으며 (ii) 적어도 3개의 공유결합된 폴리머 사슬 또는 암은 적어도 3개의 호모폴리머 사슬이다.
본 발명에 따른 가지형 폴리머가 스타 폴리머인 경우, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 각각 독립적으로 직선형 또는 가지형일 수 있다.
본 발명에 따른 가지형 폴리머의 스타 폴리머 제제는 뛰어난 특성을 제공하는 것으로 발견되었다.
"지지 모이어티"는 가지형 폴리머의 암이 공유결합되는 원자, 분자 또는 코어 구조와 같은 모이어티를 의미한다. 따라서, 지지 모이어티는 공유결합된 암을 지지하는 기능을 한다.
가지형 폴리머를 기술하는 것을 돕기 위해, 특히 표현 "가지형 폴리머" 및 "지지 모이어티"가 의도하는 것을 설명하는 것을 돕기 위해서, 아래 일반식(A)를 참조할 수 있다:
Figure pct00001
SM은 지지 모이어티를 나타내며, HP1은 양이온성 호모폴리머 사슬을 나타내며, HP2는 친수성 호모폴리머 사슬을 나타내며, HP3는 소수성 호모폴리머 사슬을 나타내며, a, b 및 c는 각각 독립적으로 1 이상의 정수이며, 예를 들어, 각각은 독립적으로 1 내지 10의 정수이다. a, b 또는 c가 1보다 큰 경우 하나 초과의 관련 호모폴리머 사슬이 지지 모이어티에 공유결합된 상황을 나타내는 것을 알 것이다. 적어도 3개의 호모폴리머 암(HP1, HP2 및 HP3)의 하나 이상은 연결 모이어티를 통해 SM에 공유결합될 수 있다.
일반식(A)를 참조하여, 지지 모이어티(SM)는 이에 공유결합된 적어도 3개의 호모폴리머 암(HP1, HP2 및 HP3)의 각각을 가지며, SM은 구조 형태로서 간단하게 보일 수 있고 이로부터 가지화가 일어날 수 있다.
일반식(A)의 형태는 다양한 가지형 구조를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 가지형 폴리머는 더 많은 이런 구조 형태를 가질 수 있으며 이로부터 가지화가 일어날 수 있다. 예를 들어, 지지 모이어티는, 복수의 양이온성 호모폴리머 사슬, 복수의 친수성 호모폴리머 사슬 및 복수의 소수성 호모폴리머 사슬이 가지 형태로 공유결합되어 폴리머 브러쉬 구조를 형성하는 직선형 거대분자일 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 가지형 폴리머는 일반식(A)의 구조 형태를 포함하는 것으로 기술될 수 있다.
지지 모이어티가 원자인 경우, 일반적으로 C, Si 또는 N일 것이다. 원자가 C 또는 Si인 경우, 개별 원자에 공유결합된 네 번째 폴리머 사슬이 있을 수 있다.
지지 모이어티가 분자인 경우, 모이어티에 공유결합된 적어도 3개의 호모폴리머 암을 가질 수 있는 한 모이어티의 성질에 관한 특별한 제한은 없다. 다시 말하면, 분자는 적어도 3가이어야 한다(즉, 공유 결합이 일어나는 적어도 세 지점을 가진다). 예를 들어, 분자는 적어도 3가 형태의 선택적으로 치환된: 알킬, 알켄일, 알카인일, 아릴, 카보사이클일, 헤테로사이클일, 헤테로아릴, 알킬옥시, 알켄일옥시, 알카인일옥시, 아릴옥시, 카보사이클일옥시, 헤테로사이클일옥시, 헤테로아릴옥시, 알킬티오, 알켄일티오, 알카인일티오, 아릴티오, 카보사이클일티오, 헤테로사이클일티오, 헤테로아릴티오, 알킬알켄일, 알킬알카인일, 알킬아릴, 알킬아실, 알킬카보사이클일, 알킬헤테로사이클일, 알킬헤테로아릴, 알킬옥시알킬, 알켄일옥시알킬, 알카인일옥시알킬, 아릴옥시알킬, 알킬아실옥시, 알킬옥시아실알킬, 알킬카보사이클일옥시, 알킬헤테로사이클일옥시, 알킬헤테로아릴옥시, 알킬티오알킬, 알켄일티오알킬, 알카인일티오알킬, 아릴티오알킬, 알킬아실티오, 알킬카보사이클일티오, 알킬헤테로사이클일티오, 알킬헤테로아릴티오, 알킬알켄일알킬, 알킬알카인일알킬, 알킬아릴알킬, 알킬아실알킬, 아릴알킬아릴, 아릴알켄일아릴, 아릴알카인일아릴, 아릴아실아릴, 아릴아실, 아릴카보사이클일, 아릴헤테로사이클일, 아릴헤테로아릴, 알켄일옥시아릴, 알카인일옥시아릴, 아릴옥시아릴, 아릴아실옥시, 아릴카보사이클일옥시, 아릴헤테로사이클일옥시, 아릴헤테로아릴옥시, 알킬티오아릴, 알켄일티오아릴, 알카인일티오아릴, 아릴티오아릴, 아릴아실티오, 아릴카보사이클일티오, 아릴헤테로사이클일티오, 아릴헤테로아릴티오, 배위 복합체 및 폴리머 사슬로부터 선택되며, 존재하는 경우 임의의 알킬 사슬에서 하나의 또는 각각의 -CH2- 그룹은 -0-, -OP(0)2-, -OP(0)20-, -S-. -S(O)-, -S(0)20-, -OS(0)20-, -N=N-, -OSi(ORa)20-, -Si(ORa)20-, -OB(ORa)0-, -B(ORa)0-, -NRa-, -C(O)-, -C(0)0-, -OC(0)0-, -OC(0)NRa- 및 -C(0)NRa-로부터 독립적으로 선택된 2가 그룹으로 대체될 수 있으며, 하나의 또는 각각의 Ra는 수소, 알킬, 알켄일, 알카인일, 아릴, 카보사이클일, 헤테로아릴, 헤테로사이클일, 아릴알킬 및 아실로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 하나의 또는 각각의 Ra는 또한 수소, C1-18 알킬, C1 -18 알켄일, C1 -18 알카인일, C6 -18 아릴, C3 -18 카보사이클일, C3 -18 헤테로아릴, C3 -18 헤테로사이클일 및 C7 -18 아릴알킬로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
지지 모이어티가 코어 구조일 때, 모이어티에 공유결합된 적어도 3개의 호모폴리머 암을 가질 수 있는 한 모이어티의 성질에 관한 특별한 제한은 없다. 다시 말하면, 코어 구조는 공유 결합이 일어나는 적어도 3개의 지점을 가져야 한다. 예를 들어, 코어 구조는 나노-미립자 재료와 같은 고체 미립자 재료 또는 가교 폴리머 입자와 같은 폴리머 입자 형태일 수 있다. 이런 경우에, 코어 구조의 크기는 일반적으로 약 5 옹스트롬 내지 약 500nm, 예를 들어, 약 10 옹스트롬 내지 약 100nm 또는 약 20 옹스트롬 내지 약 10nm일 것이다.
가교 폴리머 지지 모이어티의 예는 다이설파이드 다이메타크릴레이트, 에틸렌 글리콜 다이(메타)아크릴레이트, 트라이에틸렌 글리콜 다이(메타)아크릴레이트, 테트라에틸렌 글리콜 다이(메타)아크릴레이트, 1,3-부틸렌 글리콜 다이(메타)아크릴레이트, 트라이메틸올프로페인 트라이(메타)아크릴레이트, 1,4-부테인다이올 다이(메타)아크릴레이트, 네오펜틸 글리콜 다이(메타)아크릴레이트, 1,6-헥세인다이올 다이(메타)아크릴레이트, 1,6-헥세인다이올 에톡실화 다이아크릴레이트(HEDA), 펜타에리트리톨 다이(메타)아크릴레이트, 펜타에리트리톨 트라이(메타)아크릴레이트, 펜타에리트리톨 테트라(메타)아크릴레이트, 글리세롤 다이(메타)아크릴레이트, 글리세롤 알릴옥시 다이(메타)아크릴레이트, 1,1,1-트리스(하이드록시메틸)에테인 다이(메타)아크릴레이트, 1,1,1-트리스(하이드록시메틸)에테인 트라이(메타)아크릴레이트, 1,1,1-트리스(하이드록시메틸)프로페인 다이(메타)아크릴레이트, 1,1,1-트리스(하이드록시메틸)프로페인 트라이(메타)아크릴레이트, 트라이알릴 시아누레이트, 트라이알릴 아이소시아누레이트, 트라이알릴 트라이멜리테이트, 다이알릴 프탈레이트, 다이알릴 테레프탈레이트, 다이바이닐 벤젠, 메틸올(메타)아크릴아마이드, 트라이알릴아민, 올레일 말레이트, 글리세릴 프로폭시 트라이아크릴레이트, 알릴 메타아크릴레이트, 메타크릴산 무수물, 메틸렌비스(메타)아크릴아마이드, 부트-2-엔-1,4-다이아크릴레이트(BDA), 비스페놀 A 에톡실화 다이아크릴레이트(BEDA), N,N'-비스(아크릴오일)시스탄이민(DSBAm), 다이바이닐 아디페이트(DVA), 4,4'-다이바이닐바이페닐(DVPB) 및 N.N'-메틸렌비스아크릴아마이드(MBA)로부터 선택된 하나 이상의 다가능 모노머의 중합 잔기를 함유하거나 중합을 통해 형성된 것들을 포함한다.
가지형 폴리머가 단지 하나의 지지 모이어티를 포함하고 적어도 3개의 호모폴리머 암이 직선형인 경우, 가지형 폴리머는 스타 폴리머 또는 믹토-암 스타 폴리머로 편하게 부를 수 있다.
지지 모이어티를 정의할 때 모이어티가 유래되는 화합물 또는 코어 구조로 부르는 것이 편리할 수 있다. 예를 들어, 지지 모이어티는 적어도 3개의 호모폴리머 암이 공유결합되는 반응 위치를 제공하는 셋 이상의 작용기를 가진 화합물 또는 코어 구조로부터 유래될 수 있다. 이 경우에, 지지 모이어티는, 예를 들어, 알코올, 할로겐, 티올, 카복실산, 아민, 에폭사이드, 아이소시아네이트 및 산 염화물로부터 선택된 셋 이상의 작용기를 가진 화합물 또는 코어 구조로부터 유래될 수 있다.
지지 모이어티가 유래될 수 있는 셋 이상의 알코올 작용기를 가진 화합물들의 예는 글리세롤, 펜타에리트리톨, 다이펜타에리트리톨, 트라이펜타에리트리톨, 1,2,3-트라이하이드록시헥세인, 트라이메틸올프로페인, 미오이니시톨, 글루코오스 및 이의 이성질체(예를 들어, d-갈락토오스, d-만노오스, d-프룩토오스), 말토오스, 수크로오스 및 만니톨을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
지지 모이어티가 유래될 수 있는 셋 이상의 3개 이상의 작용기(카복실, 머캡토, 할로겐 또는 아이소시아네이트)의 예는 바이페닐-3,4',5-트라이카복실산, cis,cis-1,3,5-트라이메틸사이클로헥세인-1,3,5-트라이카복실산, 1,2,4-벤젠트라이카복실산, 아가르산, 벤젠-1,3,5-트라이카복실산, 트라이에틸 1,1,2-에테인트라이카복실산, 사이클로헥세인-1,2,4,5-테트라카복실산, 사이클로펜테인-1,2,3,4-테트라카복실산, 바이사이클[2.2.2]옥트-7-엔-2,3,5,6-테트라카복실산, 펜타에리트리톨 테트라키스(3-머캡토프리오피오네이트), 1,2,3-트라이클로로프로페인, 1,3,3-트라이클로로부테인, 1,2,3-트라이클로로부테인, 리신 트라이아이소시아네이트, 및 트라이페닐메테인-4,4',4'-트라이아이소시아네이트를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
지지 모이어티가 유래될 수 있는 셋 이상의 3개 이상의 작용기의 예는 폴리(에틸렌 이민), 1,2,3-트라이아미노-2-(아미노메틸)프로페인, PAMAM 덴드리머, 부테인-1,2,3,4-테트라아민 및 펜테인-1,2,3,3-테트라아민을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 지지 모이어티에 각각(즉, 독립적으로) 공유결합된다. 각 호모폴리머 사슬은 지지 모이어티에 직접적으로 또는 간접적으로 공유결합될 수 있다.
"직접적으로" 공유결합되는 것은 호모폴리머 사슬과 지지 모이어티 사이에 하나 이상의 공유결합된 원자 또는 분자가 있다는 것을 의미한다.
"간접적으로" 공유결합되는 것은 호모폴리머 사슬과 지지 모이어티 사이에 하나 이상의 공유결합된 원자 또는 분자가 위치되는 것을 의미한다.
호모폴리머 사슬이 지지 모이어티에 간접적으로 공유결합되는 경우, 이를 연결 모이어티를 통해 지지 모이어티에 공유결합되는 호모폴리머 사슬로 편리하게 부를 수 있다.
한 실시태양에서, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬의 각각은 연결 모이어티를 통해 지지 모이어티에 공유결합된다.
다른 실시태양에서, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬의 각각은 연결 모이어티를 통해 지지 모이어티에 각각 공유결합된다.
적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 지지 모이어티에 결합하는 기능을 할 수 있는 한 이런 연결 모이어티의 성질에 관한 특별한 제한은 없다. 연결 모이어티는 물론 다른 폴리머 사슬이 아닐 것인데 이는 이것이 지지 모이어티에 연결되는 전체 코폴리머 사슬의 형성을 초래할 수 있기 때문이다.
적절한 연결 모이어티들의 예는 2가 형태의 선택적으로 치환된: 옥시(-O-), 다이설파이드(-S-S-), 알킬, 알켄일, 알카인일, 아릴, 아실(-C(O)- 포함), 카보사이클일, 헤테로사이클일, 헤테로아릴, 알킬옥시, 알켄일옥시, 알카인일옥시, 아릴옥시, 아실옥시, 카보사이클일옥시, 헤테로사이클일옥시, 헤테로아릴옥시, 알킬티오, 알켄일티오, 알카인일티오, 아릴티오, 아실티오, 카보사이클일티오, 헤테로사이클일티오, 헤테로아릴티오, 알킬알켄일, 알킬알카인일, 알킬아릴, 알킬아실, 알킬카보사이클일, 알킬헤테로사이클일, 알킬헤테로아릴, 알킬옥시알킬, 알켄일옥시알킬, 알카인일옥시알킬, 아릴옥시알킬, 알킬아실옥시, 알킬옥시아실알킬, 알킬카보사이클일옥시, 알킬헤테로사이클일옥시, 알킬헤테로아릴옥시, 알킬티오알킬, 알켄일티오알킬, 알카인일티오알킬, 아릴티오알킬, 알킬아실티오, 알킬카보사이클일티오, 알킬헤테로사이클일티오, 알킬헤테로아릴티오, 알킬알켄일알킬, 알킬알카인일알킬, 알킬아릴알킬, 알킬아실알킬, 아릴알킬아릴, 아릴알켄일아릴, 아릴알카인일아릴, 아릴아실아릴, 아릴아실, 아릴카보사이클일, 아릴헤테로사이클일, 아릴헤테로아릴, 알켄일옥시아릴, 알카인일옥시아릴, 아릴옥시아릴, 아릴아실옥시, 아릴카보사이클일옥시, 아릴헤테로사이클일옥시, 아릴헤테로아릴옥시, 알킬티오아릴, 알켄일티오아릴, 알카인일티오아릴, 아릴티오아릴, 아릴아실티오, 아릴카보사이클일티오, 아릴헤테로사이클일티오 및 아릴헤테로아릴티오를 포함하며, 존재하는 경우 임의의 알킬 사슬에서 하나의 또는 각각의 -CH2- 그룹은 -0-, -OP(0)2-, -OP(0)20-, -S-. -S(O)-, -S(0)20-, -OS(0)20-, -N=N-, -OSi(ORa)20-, -Si(ORa)20-, -OB(ORa)0-, -B(ORa)0-, -NRa-, -C(O)-, -C(0)0-, -OC(0)0-, -OC(0)NRa- 및 -C(0)NRa-로부터 독립적으로 선택된 2가 그룹으로 대체될 수 있으며, 하나의 또는 각각의 Ra는 수소, 알킬, 알켄일, 알카인일, 아릴, 카보사이클일, 헤테로아릴, 헤테로사이클일, 아릴알킬 및 아실로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 하나의 또는 각각의 Ra는 또한 수소, C1 -18 알킬, C1 -18 알켄일, C1 -18 알카인일, C6 -18 아릴, C3 -18 카보사이클일, C3 -18 헤테로아릴, C3 -18 헤테로사이클일 및 C7 -18 아릴알킬로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
본 발명에서 둘 이상의 서브그룹(예를 들어, [그룹 A][그룹 B]을 포함하는 그룹에 대한 언급은 서브그룹이 존재하는 순서에 제한되는 것을 의도하지 않는다. 따라서, [그룹 A][그룹 B]로 정의된 2개의 서브그룹(예를 들어, 알킬아릴)은 [그룹 B][그룹 A]로 정의된 2개의 서브그룹(예를 들어, 아릴알킬)에 대한 언급을 의도한다.
연결 모이어티는 분해성 작용기일 수 있거나 포함할 수 있다.
한 실시태양에서, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬의 하나 이상은 분해성 작용기를 통해 지지 모이어티에 공유결합되어 분해성 작용기의 분해 진행시에 공유결합은 분열되고 호모폴리머 사슬은 지지 모이어티로부터 절단된다.
적어도 3개의 호모폴리머 사슬의 각각은 분해성 연결 모이어티를 통해 지지 모이어티에 각각 공유결합될 수 있다.
다른 실시태양에서, 지지 모이어티는 하나 이상의 분해성 작용기를 포함하는 분자 구조를 가져서 분해성 작용기의 분해 진행시에 그 분자 구조에 있는 하나 이상의 공유 결합은 분열되고 적어도 3개의 호모폴리머 사슬의 적어도 하나는 지지 모이어티로부터 방출된다(즉, 유리된다).
작용기가 "분해성"이라는 것은 분해 환경에 노출된 후 화학 반응을 통해 분열(즉, 결합 분해 진행)되기 쉬운 분자 구조를 갖는 것을 의미한다.
한 실시태양에서, 분해성 작용기는 생분해성 작용기이다.
작용기가 "생분해성"이라는 것은 생물학적 환경(예를 들어, 대상 내에서 또는 혈액, 조직 등과 같은 생물학적 재료와 접촉하여)에 노출되자마자 화학적 반응을 통해 분열되기 쉬운(즉, 결합 분해 진행) 분자 구조를 가진다는 것을 의미한다. 생분해는 인비트로 또는 인비보에서 일어날 수 있다. 이런 화학적 분해 또는 생분해는 가수분해, 산화 또는 환원을 통할 수 있다. 따라서, 생분해성 작용기는 일반적으로 가수분해성, 산화성 또는 환원성 분해가 일어나기 쉬울 것이다. 생분해의 속도는 외인성 또는 내인성 인자(예를 들어, 빛, 열, 복사에너지, pH, 효소 또는 비효소 매개 등)의 수에 따라 변할 수 있다.
분해성 작용기는 분해가 진행될 때 적어도 3개의 호모폴리머 사슬의 하나 이상이 지지 모이어티로부터 방출(즉, 더 이상 모이어티에 공유결합되지 않음)되도록 위치된다.
지지 모이어티가 분해성 작용기를 포함하는 분자 구조를 갖는 경우, 이런 분해성 작용기의 분해는 지지 모이어티 구조를 분열시키며, 이것이 호모폴리머 사슬이 지지 모이어티로부터 방출(즉, 더 이상 모이어티에 공유결합되지 않음)되는 것을 초래한다.
당업자는 분해 및 생분해가 일어나기 쉬운 작용기의 형태를 알 것이다. 이런 작용기는, 예를 들어, 에스터, 무수물, 카보네이트, 퍼록사이드, 퍼옥시에스터, 포스페이트, 티오에스터, 우레아, 티오우레탄, 에터, 다이설파이드, 카바메이트(우레탄) 및 보로네이트 에스터를 포함할 수 있다.
한 실시태양에서 생분해성 작용기는 에스터, 무수물, 카보네이트, 퍼록사이드, 퍼옥시에스터, 포스페이트, 티오에스터, 우레아, 티오우레탄, 에터, 다이설파이드, 카바메이트(우레탄) 및 보로네이트 에스터로부터 선택된다.
다른 실시태양에서, 연결 모이어티는 에스터, 무수물, 카보네이트, 퍼록사이드, 퍼옥시에스터, 포스페이트, 티오에스터, 우레아, 티오우레탄, 에터, 다이설파이드, 카바메이트(우레탄) 및 보로네이트 에스터로부터 선택된 하나 이상의 작용기를 통해 생분해성이다.
생분해성 연결 모이어티의 분해는 결합 분해 과정에 촉매작용을 미치거나 적어도 도울 수 있는 산, 염기, 효소 및/또는 다른 내인성 생물학적 화합물의 존재하에서 촉진될 수 있다. 예를 들어, 에스터는 가수분해적으로 분해되어 카복실산기 및 알코올기를 생산할 수 있으며, 아마이드는 가수분해적으로 분해되어 카복실산기 및 아민기를 생산할 수 있고 다이설파이드는 환원적으로 분해되어 티올기를 생산할 수 있다.
분해는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 우유, 정액 유체, 질 유체, 활액 유체, 림프 유체, 양막 유체, 땀 및 눈물과 같은 생물학적 유체; 뿐만 아니라 예를 들어, 삼출물, 일액현상 유체, 목질부, 체관부, 수지 및 꿀을 포함하는 식물에 의해 생산된 수용액에서 일어날 수 있다.
분해는 또한 세포 또는 엔도솜 및 세포질과 같은 세포 구성요소에서 일어날 수 있다.
생분해성 작용기는 특정 생물학적 환경에 노출되자마자 분해가 일어날 수 있도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 산화환원 포텐셜 기울기가 정상 및 병태생리적 상태 사이에서 세포외 및 세포내 환경 사이에 존재한다. 생분해성 작용기에 존재하는 다이설파이드 결합은 환원성 세포내 환경에서 쉽게 환원될 수 있는 반면, 산화성 세포외 공간에서 손상되지 않고 유지될 수 있다. 다이설파이드 결합의 세포내 환원은 통상적으로 글루타티온(GSH) 및 티오레독신과 같은 작은 산화환원 분자에 의해 단독으로 또는 효소 기구의 도움으로 실행된다.
둘 이상의 분해성 작용기가 사용되는 경우, 이런 작용기 및 분해 환경의 성질에 따라, 작용기들 중 단지 하나가 원하는 결합 분해를 실제로 촉진할 수 있다. 예를 들어, 분해성 작용기는 에스터 및 다이설파이드 작용기를 포함할 수 있다. 환원 환경에서, 다이설파이드 작용기만 생분해가 일어날 것이다. 가수분해 환경에서 에스터 작용기만 분해가 일어날 것이다. 환원 및 가수분해 환경에서는 다이설파이드 및 에스터 작용기 모두가 분해가 일어날 것이다.
"양이온성" 호모폴리머 사슬은 총 양전하를 제공하거나 제공할 수 있는 호모폴리머 사슬을 의미한다. 한 실시태양에서, 양이온성 호모폴리머 사슬은 총 양전하를 제공한다.
"친수성" 호모폴리머 사슬은 총 친수성을 제공하는 호모폴리머 사슬을 의미한다. 친수성 호모폴리머 사슬은 일반적으로 총 음전하 또는 양전하를 제공하지 않거나 제공할 수 없을 것이다. 따라서 친수성 호모폴리머 사슬은 총 음전하 또는 총 양전하를 제공하지 않거나 제공할 수 없는 친수성 호모폴리머 사슬로 기술될 수 있다. 다시 말하면, 친수성 호모폴리머 사슬은 본 발명에 기술된 대로 양이온성 호모폴리머 사슬이 된다고 생각되지 않는다(즉, 친수성 호모폴리머 사슬은 총 양전하를 제공하지 않거나 제공할 수 없다). 따라서, 친수성 호모폴리머 사슬은 비-양이온성 친수성 호모폴리머 사슬로서 기술될 수 있다.
한 실시태양에서, 친수성 호모폴리머 사슬은 중성 친수성 호모폴리머 사슬이다(즉, 전하를 제공하지 않거나 제공할 수 없다). 이런 경우에, 친수성 호모폴리머 사슬은 비-이온화 친수성 호모폴리머 사슬로 기술될 수 있다.
"소수성" 호모폴리머 사슬은 총 소수성을 제공하는 호모폴리머 사슬을 의미한다. 소수성 호모폴리머 사슬은 일반적으로 총 음전하 또는 양전하를 제공하지 않거나 제공할 수 없을 것이다. 따라서 소수성 호모폴리머 사슬은 총 음전하 또는 총 양전하를 제공하지 않거나 제공할 수 없는 소수성 호모폴리머 사슬로 기술될 수 있다. 다시 말하면, 소수성 호모폴리머 사슬은 본 발명에 기술된 대로 양이온성 호모폴리머 사슬이 된다고 생각되지 않는다(즉, 친수성 호모폴리머 사슬은 총 양전하를 제공하지 않거나 제공할 수 없다). 따라서, 소수성 호모폴리머 사슬은 비-양이온성 소수성 호모폴리머 사슬로서 기술될 수 있다.
한 실시태양에서, 소수성 호모폴리머 사슬은 중성 소수성 호모폴리머 사슬이다(즉, 전하를 제공하지 않거나 제공할 수 없다). 이런 경우에, 소수성 호모폴리머 사슬은 비-이온화 소수성 호모폴리머 사슬로 기술될 수 있다.
표현 "양이온성", "친수성" 및 "소수성" 호모폴리머 사슬이 의미하는 것에 대한 추가 세부내용은 아래에 제공된다.
양이온성, 친수성 및 소수성 호모폴리머 사슬은 복수의 모노머 단위의 중합 잔기들을 각각 포함할 것이다. 이런 호모폴리머 사슬을 형성하는데 사용될 수 있는 모노머들에 관한 추가 세부내용은 아래에 제공된다.
양이온성 호모폴리머 사슬은 약 5 내지 약 250개, 또는 약 10 내지 약 200개, 또는 약 30 내지 약 150개 모노머 잔기 단위를 포함할 수 있다.
양이온성 호모폴리머 사슬은 수성 매질에 수용성이거나 혼합 가능하다는 점에서 친수성을 나타낼 수 있다.
한 실시태양에서, 가지형 폴리머는 음전하를 갖는 또는 가질 수 있는 중합 모노머 잔기 단위를 포함하지 않는다. 다시 말하면, 한 실시태양에서 가지형 폴리머는 양쪽성 가지형 폴리머가 아니다.
각각 양이온성 호모폴리머 사슬 또는 핵산 분자와 결합된 "양전하" 또는 "음전하"에 대한 언급은 양이온성 호모폴리머 사슬 또는 핵산 분자가 각각 양전하 또는 음전하를 제공하거나 제공할 의도가 있고 제공할 수 있는 하나 이상의 작용기 또는 모이어티를 가진다는 것을 의미한다.
따라서, 이런 작용기 또는 모이어티는 고유하게 그 전하를 가질 수 있거나, 예를 들어, 친전자체의 첨가 또는 제거를 통해, 하전된 상태로 변화될 수 있다. 다시 말하면, 양전하의 경우에, 작용기 또는 모이어티는 4차 암모늄 작용기 또는 모이어티와 같은 고유 전하를 가질 수 있거나 작용기 또는 모이어티 자체는 중성일 수 있으나, 4차 암모늄 양이온의 pH 의존성 형성 또는 4차 아민기의 4차화를 통해 양이온을 형성하도록 하전될 수 있다. 음전하의 경우, 작용기 또는 모이어티는, 예를 들어, 음전하를 제공하는 유기산 염을 포함하거나 작용기 또는 모이어티는 중성일 수 있으나, 예를 들어, 산성 프로톤의 pH 의존성 제거를 통해 음이온을 형성하도록 하전될 수 있는 유기산을 포함할 수 있다.
한 실시태양에서, 가지형 폴리머의 양이온성 호모폴리머 사슬은 중성 상태이며 뒤이어 양으로 하전된 상태로 전환될 수 있는 작용기 또는 모이어티를 포함하는 모노머를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 모노머는 중합되어 양이온성 폴리머를 형성하자마자 뒤이어 양으로 하전된 상태로 4차화되는 3차 아민 작용기를 포함할 수 있다.
다른 실시태양에서, 가지형 폴리머의 양이온성 호모폴리머 사슬은 양으로 하전된 상태이다. 다시 말하면, 양이온성 호모폴리머 사슬은 양으로 하전된 양이온성 호모폴리머 사슬이다.
당업자는 하전된 상태에서, 자체가 양이온성 호모폴리머 사슬과 결합된 양이온 또는 예를 들어, 자체가 핵산 분자와 결합된 음이온은 이와 결합된 적절한 반대 이온을 가질 것이라는 걸 이해할 것이다.
본 발명에 따른 가지형 폴리머가 핵산 분자와 복합체 형성에 사용될 때, 개별적으로 또는 함께(하나 초과하여 존재하는 경우), 양이온성 호모폴리머 사슬은 핵산 분자에 의한 복합체화를 촉진하는데 충분한 양이온 위치를 포함할 것이다.
한 실시태양에서, 본 발명에 따른 양이온성 호모폴리머 사슬은 각각 양전하를 포함하는 약 5 내지 약 250개, 또는 약 10 내지 약 200개, 또는 약 30 내지 약 150개 모노머 잔기 단위를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 친수성 호모폴리머 사슬은 약 5 내지 약 200개, 또는 약 10 내지 약 150개, 또는 약 20 내지 약 100개 모노머 잔기 단위를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 소수성 호모폴리머 사슬은 약 10 내지 약 200개, 또는 약 15 내지 약 150개, 또는 약 30 내지 약 100개 모노머 잔기 단위를 포함할 수 있다.
친수성 및 소수성과 같은 용어는 일반적으로 다른 것에 대한 한 구성요소 사이의 상호작용(예를 들어, 인력 또는 반발 상호작용 또는 용해도 특성)을 전달하는데 사용되며 다른 것에 대한 한 특정 구성요소의 특성을 정량적으로 정의하는데 사용되지 않는다.
예를 들어, 친수성 구성요소는 물과 같은 수성 매질에 의해 더욱 쉽게 습윤 또는 용매화될 수 있는 반면, 소수성 구성요소는 물과 같은 수성 매질에 의해 덜 쉽게 습윤 또는 용매화될 수 있다.
본 발명의 내용에서, 친수성 호모폴리머 사슬은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 우유, 정액 유체, 질 유체, 활액 유체, 림프 유체, 양막 유체, 땀 및 눈물과 같은 생물학적 유체; 뿐만 아니라 예를 들어, 삼출물, 일액현상 유체, 목질부, 체관부, 수지 및 꿀을 포함하는 식물에 의해 생산된 수용액을 포함하는 수성 매질에서 용해성 또는 혼합성을 나타내는 호모폴리머 사슬을 의미한다.
반대로, 소수성 호모폴리머 사슬은 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 타액, 우유, 정액 유체, 질 유체, 활액 유체, 림프 유체, 양막 유체, 땀 및 눈물과 같은 생물학적 유체; 뿐만 아니라 예를 들어, 삼출물, 일액현상 유체, 목질부, 체관부, 수지 및 꿀을 포함하는 식물에 의해 생산된 수용액을 포함하는 수성 매질에서 적은 용해성 또는 혼합성을 나타내거나 나타내지 않는 호모폴리머 사슬을 의미한다.
소정의 호모폴리머 사슬의 양이온성, 친수성 또는 소수성은 (a) 호모폴리머 사슬의 분자 조성물 및/또는 (b) 수성 매질에서 호모폴리머 사슬의 용해성 또는 혼합성(또는 이의 결여)의 간단한 평가를 통해 당업자에 의해 쉽게 측정될 수 있다.
친수성 호모폴리머 사슬은 일반적으로 가지형 폴리머가 일반적으로 수성 매질에서 수용성 또는 혼합성이 되도록 선택될 것이다.
한 실시태양에서, 친수성 호모폴리머 사슬은 약 5 내지 약 200개, 또는 약 10 내지 약 150개, 또는 약 20 내지 약 100개 친수성 모노머 잔기 단위를 포함할 수 있다.
한 실시태양에서, 소수성 호모폴리머 사슬은 약 10 내지 약 200개, 또는 약 15 내지 약 150개, 또는 약 30 내지 약 100개 소수성 모노머 잔기 단위를 포함할 수 있다.
호모폴리머 사슬의 각각은 가지형 구조를 가진 그룹을 포함하는 모노머로부터 유래될 수 있다(또는 모노머의 중합 잔기를 포함할 수 있다).
양이온성 호모폴리머 사슬은 N,N-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트, N,N-다이에틸아미노에틸 메타크릴레이트, N,N-다이메틸아미노에틸 아크릴레이트, N,N-다이에틸아미노에틸 아크릴레이트, 2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드, N-[3-N,N-다이메틸아미노)프로필]메타크릴아미드, N-(3-아미노프로필)메타크릴아마이드 하이드로클로라이드, N-[3-(N,N-다이메틸아미노)프로필]아크릴아마이드, N-[2-(N,N-다이메틸아미노)에틸]메타크릴아마이드, 2-N-모르폴리노에틸 아크릴레이트, 2-N-모르폴리노에틸 메타크릴레이트, 2-(N,N-다이메틸아미노)에틸 아크릴레이트, 2-(N,N-다이메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 2-(N,N-다이에틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 2-아크릴옥시에틸트라이메틸암모늄 클로라이드, 메타크릴아미도프로필트라이메틸암모늄 클로라이드, 2-(tert-부틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 알릴다이메틸암모늄 클로라이드, 2-(에틸아미노)에틸스티렌, 2-바이닐피리딘 및 4-바이닐피리딘으로부터 선택된 하나 이상의 모노머로부터 유래될 수 있다(또는 모노머의 중합 잔기를 포함할 수 있다).
친수성 호모폴리머 사슬은 아크릴산, 메타크릴산, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 하이드록시프로필 메타크릴레이트, 올리고(알킬렌 글리콜)메틸 에터(메타)아크릴레이트(OAG(M)A), 올리고(에틸렌 글리콜)(메타)아크릴레이트(OEG(M)A), 아크릴아마이드 및 메타크릴아마이드, 하이드록시에틸 아크릴레이트, N-메틸아크릴아마이드, N,N-다이메틸아크릴아마이드, N,N-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트, N,N-다이메틸아미노프로필 메타크릴아마이드, N-하이드록시프로필 메타크릴아마이드, 4-아크릴로일모르폴린, 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로페인설폰산, 포스포릴콜린 메타크릴레이트 및 N-바이닐 피롤리돈으로부터 선택된 하나 이상의 모노머로부터 유래될 수 있다(또는 모노머의 중합 잔기를 포함할 수 있다).
소수성 호모폴리머 사슬은 스티렌, 알파-메틸 스티렌, 부틸 아크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 아밀 메타크릴레이트, 헥실 메타크릴레이트, 라우릴 메타크릴레이트, 스테아릴 메타크릴레이트, 에틸 헥실 메타크릴레이트, 크로틸 메타크릴레이트, 시남일 메타크릴레이트, 올레일 메타크릴레이트, 리시놀레일 메타크릴레이트, 콜레스테릴 메타크릴레이트, 콜레스테릴 아크릴레이트, 바이닐 부티레이트, 바이닐 tert-부티레이트, 바이닐 스테아레이트 및 바이닐 라우레이트로부터 선택된 하나 이상의 모노머로부터 유래될 수 있다(또는 모노머의 중합 잔기를 포함할 수 있다).
본 발명에 따른 가지형 폴리머의 예들은 아래 일반식(A)를 참조하여 예시될 수 있다:
Figure pct00002
SM은 지지 모이어티를 나타내며, HP1은 N,N-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트, N,N-다이에틸아미노에틸 메타크릴레이트, N,N-다이메틸아미노에틸 아크릴레이트, N,N-다이에틸아미노에틸 아크릴레이트, 2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드, N-[3-N,N-다이메틸아미노)프로필]메타크릴아미드, N-(3-아미노프로필)메타크릴아마이드 하이드로클로라이드, N-[3-(N,N-다이메틸아미노)프로필]아크릴아마이드, N-[2-(N,N-다이메틸아미노)에틸]메타크릴아마이드, 2-N-모르폴리노에틸 아크릴레이트, 2-N-모르폴리노에틸 메타크릴레이트, 2-(N,N-다이메틸아미노)에틸 아크릴레이트, 2-(N,N-다이메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 2-(N,N-다이에틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 2-아크릴옥시에틸트라이메틸암모늄 클로라이드, 메타크릴아미도프로필트라이메틸암모늄 클로라이드, 2-(tert-부틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 알릴다이메틸암모늄 클로라이드, 2-(에틸아미노)에틸스티렌, 2-바이닐피리딘 및 4-바이닐피리딘으로부터 유래된 양이온성 호모폴리머 사슬(즉, 이의 중합 형태이다)을 나타내며, HP2는 아크릴산, 메타크릴산, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 하이드록시프로필 메타크릴레이트, 올리고(알킬렌 글리콜)메틸 에터(메타)아크릴레이트(OAG(M)A), 올리고(에틸렌 글리콜)(메타)아크릴레이트(OEG(M)A), 아크릴아마이드 및 메타크릴아마이드, 하이드록시에틸 아크릴레이트, N-메틸아크릴아마이드, N,N-다이메틸아크릴아마이드, N,N-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트, N,N-다이메틸아미노프로필 메타크릴아마이드, N-하이드록시프로필 메타크릴아마이드, 4-아크릴로일모르폴린, 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로페인설폰산, 포스포릴콜린 메타크릴레이트 또는 N-바이닐 피롤리돈으로부터 유래된 친수성 호모폴리머 사슬(즉, 이의 중합 형태이다)을 나타내며, HP3는 스티렌, 알파-메틸 스티렌, 부틸 아크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 아밀 메타크릴레이트, 헥실 메타크릴레이트, 라우릴 메타크릴레이트, 스테아릴 메타크릴레이트, 에틸 헥실 메타크릴레이트, 크로틸 메타크릴레이트, 시남일 메타크릴레이트, 올레일 메타크릴레이트, 리시놀레일 메타크릴레이트, 콜레스테릴 메타크릴레이트, 콜레스테릴 아크릴레이트, 바이닐 부티레이트, 바이닐 tert-부티레이트, 바이닐 스테아레이트 또는 바이닐 라우레이트로부터 유래된 소수성 호모폴리머 사슬(즉, 이의 중합 형태이다)을 나타내며, a, b 및 c는 각각 독립적으로 1 내지 50, 또는 1 내지 30, 또는 1 내지 20, 또는 1 내지 15, 또는 1 내지 10, 또는 1 내지 5의 정수이다. a, b 또는 c가 1보다 큰 경우 하나 초과의 관련 호모폴리머 사슬이 지지 모이어티에 공유결합된 상황을 나타내는 것을 알 것이다. 적어도 3개의 호모폴리머 암(HP1, HP2 및 HP3)의 하나 이상은 연결 모이어티를 통해 SM에 공유결합될 수 있다.
한 실시태양에서, 가지형 폴리머는 표적 리간드, 생활성제 및/또는 조영제를 더 포함한다. 이 경우에, 표적 리간드, 생활성제 또는 조영제는 일반적으로 가지형 폴리머에 공유결합될 것이다. 표적 리간드, 생활성제 또는 조영제는 지지 모이어티, 가지형 폴리머의 적어도 3개의 호모폴리머 사슬의 하나 이상 또는 이의 조합에 공유결합될 수 있다. 표적 리간드, 생활성제 및/또는 조영제의 둘 이상의 조합이 또한 고려된다.
가지형 폴리머에 결합될 수 있는 적절한 표적화 리간드의 예들은 당 및 펩타이드, 단백질, 압타머 및 콜레스테롤로부터 유래된 올리고사카라이드를 포함한다. 적절한 당의 예들은 갈락토오스, 만노오스 및 글루코사민을 포함한다. 적절한 펩타이드의 예들은 보베신, 황체형성호르몬 방출 펩타이드, 세포 침투 펩타이드(CPP's), GALA 펩타이드, 인플루엔자-유래 푸소제닉 펩타이드, RGD 펩타이드, 폴리(아르기닌), 폴리(리신), 페네트라틴, 탓-펩타이드 및 트랜스포르탄을 포함한다. 암 세포들을 표적화할 수 있는 엽산과 같은 다른 리간드는 또한 가지형 폴리머에 결합될 수 있다. 가지형 폴리머에 결합될 수 있는 생활성제의 예들은 활성 유기 화합물, 단백질 또는 항체(또는 이의 단편) 및 펩타이드를 포함한다. 적절한 단백질의 예들은 전달성 프로타민 및 항-EGFR 항체와 항-K-라스 항체와 같은 항체를 포함한다. 적절한 유기 화합물의 예들은 독소루비신, 파클리탁셀, 캄포테신 및 팔라티네이트와 같은 화학치료제를 포함한다.
가지형 폴리머와 결합될 수 있는 적절한 조영제의 예들은 PolyfluorTM(메타크릴옥시에틸 티오카바모일 로다민 B), Alexa Fluor 568 및 BOPIDY 염료를 포함한다.
본 발명에 따른 가지형 폴리머의 성질을 추가로 설명하기 위해서, 도 1을 참조하며 여기서
Figure pct00003
는 지지 모이어티를 나타내며,
Figure pct00004
는 일반적인 공유결합을 나타내며,
Figure pct00005
는 양이온성 호모폴리머 사슬을 나타내며,
Figure pct00006
는 친수성 호모폴리머 사슬을 나타내며,
Figure pct00007
는 소수성 호모폴리머 사슬을 나타낸다. 호모폴리머 사슬의 하나 이상은 연결 모이어티(도시되지 않음)를 통해 지지 모이어티에 공유결합될 수 있다. 연결 모이어티는 생분해성 작용기일 수 있거나 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 가지형 폴리머는 임의의 적절한 수단에 의해 제조될 수 있다.
한 실시태양에서, 가지형 폴리머 제조 방법은 에틸렌 불포화된 모노머의 중합을 포함한다. 에틸렌 불포화된 모노머의 중합은 바람직하게는 리빙 중합 기술을 사용하여 실행된다.
리빙 중합은 당업계에서 가역적 연쇄 종료가 실질적으로 없는 연쇄 중합의 형태로 일반적으로 생각된다. 리빙 중합의 한 중요한 특징은 폴리머 사슬들이 중합을 지원하는 모노머와 반응 조건들이 제공되는 동안 연속적으로 성장할 것이라는 것이다. 리빙 중합에 의해 제조된 폴리머들은 유리하게도 잘 구획된 분자 구조, 소정의 분자량 및 좁은 분자량 분포 또는 낮은 다분산성(polydispersity)을 나타낼 수 있다.
리빙 중합의 예들은 이온 중합 및 제어된 라디칼 중합(CRP)을 포함한다. CRP의 예들은 이니퍼터(iniferter) 중합, 안정한 유리 라디칼 매개 중합(SFRP), 원자 전달 라디칼 중합(ATRP) 및 가역적 첨가-분절 연쇄이동(RAFT) 중합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
리빙 중합을 실행하기 위한 장비, 조건 및 시약은 당업자에게 주지되어 있다.
에틸렌 불포화된 모노머들이 리빙 중합 기술에 의해 중합되는 경우, 일반적으로 소위 리빙 중합제를 사용하는 것이 필수적일 것이다. "리빙 중합제"는 하나 이상의 에틸렌 불포화된 모노머의 리빙 중합에 참여하고 제어 또는 매개하여 리빙 폴리머 사슬(즉 리빙 중합 기술에 따라 형성된 폴리머 사슬)을 형성할 수 있는 화합물을 의미한다.
리빙 중합제는 이온 중합 및 CRP로부터 선택된 리빙 중합 기술을 촉진하는 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 한 실시태양에서, 가지형 폴리머는 이온 중합을 사용하여 제조된다.
본 발명의 한 실시태양에서, 가지형 폴리머는 CRP를 사용하여 제조된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 가지형 폴리머는 이니퍼터 중합을 사용하여 제조된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 가지형 폴리머는 SRFP를 사용하여 제조된다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 가지형 폴리머는 ATRP를 사용하여 제조된다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 가지형 폴리머는 RAFT 중합을 사용하여 제조된다.
RAFT 중합에 의해 형성된 폴리머는 RAFT 폴리머로 편리하게 부를 수 있다. 중합의 메커니즘에 의해, 이런 폴리머는 모노머의 중합을 촉진하는 RAFT 물질의 잔여물을 포함할 것이다.
RAFT 폴리머를 제조하기에 적합한 RAFT 물질들은 티오카본일티오 그룹(-C(S)S-으로 나타낸 2가 모이어티)를 포함한다. RAFFT 중합 및 RAFT 물질은 WO98/01478, Moad G.; Rizzardo, E; Thang S, H. Polymer 2008, 49, 1079-1131 및 Aust. J. Chem., 2005, 58, 379-410; Aust. J. Chem., 2006, 59, 669-692; 및 Aust. J. Chem., 2009, 62, 1402-1472(이의 전체 내용은 참조로 본 발명에 포함된다)에 기술된다. 가지형 폴리머를 제조하는데 사용하기 위한 적절한 RAFT 물질은 잔타에이트, 다이티오에스터, 다이티오카보네이트, 다이티오카바메이트 및 트라이티오카보네이트 화합물을 포함한다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 RAFT 물질은 일반식(I) 또는 (II)로 나타내어진다:
Figure pct00008
여기서 Z 및 R은 그룹이며, R* 및 Z*는 각각 독립적으로 선택되어 물질이 하나 이상의 에틸렌 불포화된 모노머들의 중합에서 RAFT 물질로 작용할 수 있는 x-가 및 y-가 그룹이며; x는 정수 ≥1이며; y는 정수 ≥2이다.
한 실시태양에서, x는 정수 ≥3이며; y는 정수 ≥3이다. 이 경우에, R* 및 Z*는 지지 모이어티(SM)를 나타낼 수 있다.
하나 이상의 에틸렌 불포화된 모노머들의 중합에서 RAFT 물질들로서 기능하기 위해서, 당업자는 R 및 R*는 통상적으로 사용된 중합 조건들 하에서 자유 라디칼 이탈기로 기능하는 선택적으로 치환된 유기 그룹일 것이며 또한 자유 라디칼 이탈기로서 중합을 재개하는 능력을 보유할 것을 알 것이다. 당업자는 또한 Z 및 Z*는 통상적으로 중합이 과도하게 지연되는 정도로 RAFT-부가물 라디칼의 단편화 속도를 늦추지 않고 자유 라디칼 첨가에 대해 RAFT 물질에서 C=S 모이어티의 적절하게 높은 반응성을 제공하도록 기능하는 선택적으로 치환된 유기 그룹일 것을 알 것이다.
일반식(I)에서, R*는 x-가 그룹이며, x는 정수 ≥1이 된다. 따라서, R*는 1가, 2가, 3가 또는 더 높은 원자가일 수 있다. 예를 들어, R*는 선택적으로 치환된 폴리머일 수 있고, 일반식(I)에 표시된 RAFT 물질의 나머지는 폴리머 사슬로부터 매달린 다중 그룹들로 나타냈다. 일반적으로, x는 1 내지 약 20, 예를 들어 약 2 내지 약 10 또는 약 1 내지 약 5의 정수일 것이다. 한 실시태양에서, x=2이다.
유사하게, 일반식(II)에서, Z*는 y-가 그룹이며, y는 정수 ≥2이 된다. 따라서, Z*는 2가, 3가 또는 더 높은 원자가일 수 있다. 일반적으로, y는 2 내지 약 20, 예를 들어 약 2 내지 약 10 또는 약 2 내지 약 5의 정수일 것이다.
본 발명에 따라 사용된 RAFT 물질들에서 R의 예들은 선택적으로 치환된 다음을 포함하며, 본 발명에 따라 사용된 RAFT 물질들에서 R*의 경우에 x-가 형태의 선택적으로 치환된: 알킬, 알켄일, 알카인일, 아릴, 아실, 카보사이클일, 헤테로사이클일, 헤테로아릴, 알킬티오, 알켄일티오, 알카인일티오, 아릴티오, 아실티오, 카보사이클일티오, 헤테로사이클일티오, 헤테로아릴티오, 알킬알켄일, 알킬알카인일, 알킬아릴, 알킬아실, 알킬카보사이클일, 알킬헤테로사이클일, 알킬헤테로아릴, 알킬옥시알킬, 알켄일옥시알킬, 알카인일옥시알킬, 아릴옥시알킬, 알킬아실옥시, 알킬카보사이클일옥시, 알킬헤테로사이클일옥시, 알킬헤테로아릴옥시, 알킬티오알킬, 알켄일티오알킬, 알카인일티오알킬, 아릴티오알킬, 알킬아실티오, 알킬카보사이클일티오, 알킬헤테로사이클일티오, 알킬헤테로아릴티오, 알킬알켄일알킬, 알킬알카인일알킬, 알킬아릴알킬, 알킬아실알킬, 아릴알킬아릴, 아릴알켄일아릴, 아릴알카인일아릴, 아릴아실아릴, 아릴아실, 아릴카보사이클일, 아릴헤테로사이클일, 아릴헤테로아릴, 알켄일옥시아릴, 알카인일옥시아릴, 아릴옥시아릴, 알킬티오아릴, 알켄일티오아릴, 알카인일티오아릴, 아릴티오아릴, 아릴아실티오, 아릴카보사이클일티오, 아릴헤테로사이클일티오, 아릴헤테로아릴티오, 및 폴리머 사슬을 포함한다.
"선택적으로 치환된"에 대한 어떠한 의심스러운 언급을 피하기 위해, 알킬, 알켄일 등은 알킬과 알켄일과 같은 각 그룹이 선택적으로 치환되는 것을 의미한다.
본 발명에 따라 사용된 RAFT 물질에서 R의 예들은 x-가 형태의 선택적으로 치환된 알킬; 포화, 불포화 또는 방향족 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리; 알킬티오; 다이아킬아미노; 유기금속 종들; 및 폴리머 사슬을 포함하며 본 발명에 따라 사용된 RAFT 물질에서 RAFT 물질에서 R*의 경우에 또한 x-가 형태의 선택적으로 치환된 알킬; 포화, 불포화 또는 방향족 카보사이클릭 또는 헤테로사이클릭 고리; 알킬티오; 다이아킬아미노; 유기금속 종들; 및 폴리머 사슬을 포함한다.
폴리머 사슬을 포함하는 리빙 중합제는 당업계에서 일반적으로 "매크로(macro)" 리빙 중합제로 불린다. 이런 "매크로" 리빙 중합제는 소정의 리빙 중합제의 제어하에서 하나 이상의 에틸렌 불포화된 모노머를 중합함으로써 편리하게 제조될 수 있다.
한 실시태양에서, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 리빙 중합제, 예를 들어 RAFT 물질의 제어하에서 에틸렌 불포화된 모노머를 중합함으로써 형성된다.
본 발명에 따라 사용된 RAFT 물질들에서 Z의 예들은 선택적으로 치환된 다음을 포함하며, 본 발명에 따라 사용된 RAFT 물질들에서 Z*의 경우에 y-가 형태의 선택적으로 치환된: F, Cl, Br, I, 알킬, 아릴, 아실, 아미노, 카보사이클일, 헤테로사이클일, 헤테로아릴, 알킬옥시, 아릴옥시, 아실옥시, 아실아미노, 카보사이클일옥시, 헤테로사이클일옥시, 헤테로아릴옥시, 알킬티오, 아릴티오, 아실티오, 카보사이클일티오, 헤테로사이클일티오, 헤테로아릴티오, 알킬아릴, 알킬아실, 알킬카보사이클일, 알킬헤테로사이클일, 알킬헤테로아릴, 알킬옥시알킬, 아릴옥시알킬, 알킬아실옥시, 알킬카보사이클일옥시, 알킬헤테로사이클일옥시, 알킬헤테로아릴옥시, 알킬티오알킬, 아릴티오알킬, 알킬아실티오, 알킬카보사이클일티오, 알킬헤테로사이클일티오, 알킬헤테로아릴티오, 알킬아릴알킬, 알킬아실알킬, 아릴알킬아릴, 아릴아실아릴, 아릴아실, 아릴카보사이클일, 아릴헤테로사이클일, 아릴헤테로아릴, 아릴옥시아릴, 아릴아실옥시, 아릴카보사이클일옥시, 아릴헤테로사이클일옥시, 아릴헤테로아릴옥시, 알킬티오아릴, 아릴티오아릴, 아릴아실티오, 아릴카보사이클일티오, 아릴헤테로사이클일티오, 아릴헤테로아릴티오, 다이알킬옥시-, 다이헤테로사이클일옥시- 또는 다이아릴옥시-포스핀일, 다이알킬-, 다이헤테로사이클일- 또는 다이아릴-포스핀일, 사이아노(즉, -CN), 및 R은 일반식(II)에서 정의한 것과 같은 -S-R을 포함한다.
한 실시태양에서, 본 발명에 따라 사용된 RAFT 물질은 트라이티오카보네이트 RAFT 물질이며 Z 또는 Z*는 선택적으로 치환된 알킬티오 그룹이다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 매크로RAFT 물질은 구입할 수 있는데, 예를 들어, 시그마알드리치 카달로그에 기술된 것 참조(www.sigmaaldrich.com).
본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 RAFT 물질은 WO2010/083569 및 베나글리아 등, Maromolecules.(42), 9384-9386, 2009에 기술된 것들을 포함한다(이의 전문이 참조로 본 발명에 포함된다).
Z, Z*, R 및 R*가 선택될 수 있는 그룹들을 정의하는 목록들에서, 각각의 알킬, 알켄일, 알카인일, 아릴, 카보사이클일, 헤테로아릴, 헤테로사이클일 및 폴리머 사슬 모이어티는 선택적으로 치환될 수 있다.
Z, Z*, R 및 R*가 선택될 수 있는 그룹들을 정의하는 목록들에서, 소정의 Z, Z*, R 또는 R*는 둘 이상의 서브그룹(예를 들어, [그룹 A][그룹 B])을 포함하며, 서브그룹의 순서는 이들이 제공되는 순서에 제한되지 않는다(예를 들어, 알킬아릴은 또한 아릴알킬에 대한 언급으로 생각될 수 있다).
Z, Z*, R 또는 R*는 측쇄화 및/또는 선택적으로 치환될 수 있다. Z, Z*, R 또는 R*가 선택적으로 치환된 알킬 모이어티를 포함하는 경우, 선택적 치환기는 알칼기 사슬에서 -CH2-그룹이 -O-, -S-, -NRa-, -C(O)- (즉, 카본일), -C(O)O- (즉, 에스터), 및 -C(O)NRa- (즉, 아마이드)로부터 선택된 그룹으로 대체되는 것을 포함하며, Ra는 수소, 알킬, 알켄일, 알카인일, 아릴, 카보사이클일, 헤테로아릴, 헤테로사이클일, 아릴알킬 및 아실로부터 선택될 수 있다.
x-가, y-가, 다중-가 또는 2-가 "형태의...."에 대한 언급은 특정 그룹이 각각 x-가, y-가, 다중-가 또는 2-가 라디칼인 것을 의미한다. 예를 들어, x 또는 y가 2인 경우, 특정 그룹은 2가 라디칼인 것을 의미한다. 당업자는 더 높은 원자가 형태를 제공하는데 어떻게 이런 논리적 근거를 적용할지를 알 것이다.
가지형 폴리머의 제조는 일반적으로 에틸렌 불포화된 모노머의 중합을 필요로 할 것이다.
가지형 폴리머를 제조하는데 사용될 수 있는 적절한 에틸렌 불포화된 모노머들은 일반식(III)의 것들을 포함한다:
Figure pct00009
여기서 U 및 W는 -CO2H, -CO2R1, -COR1, -CSR1, -CSOR1, -COSR1, -CONH2, -CONHR1, -CONR1 2, 수소, 할로겐 및 선택적으로 치환된 C1-C4 알킬로부터 독립적으로 선택되며 또는 U 및 W는 함께 락톤, 무수물 또는 자체가 선택적으로 치환될 수 있는 이미드 고리를 형성하며, 여기서 선택적인 치환기들은 하이드록시, -CO2H, -CO2R1, -COR1, -CSR1, -CSOR1, -COSR1, -CN, -CONH2, -CONHR1, -CONR1 2, -OR1, -SR1, -O2CR1, -SCOR1, 및 -OCSR1로부터 독립적으로 선택된다;
V는 수소, R1, -CO2H, -CO2R1, -COR1, -CSR1, -CSOR1, -COSR1, -CONH2, -CONHR1, -CONR1 2, -OR1, -SR1, -O2CR1, -SCOR1, 및 -OCSR1로부터 선택된다;
여기서 하나의 또는 각각의 R1은 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 알켄일, 선택적으로 치환된 알카인일, 선택적으로 치환된 아릴, 선택적으로 치환된 헤테로아릴, 선택적으로 치환된 카보사이클일, 선택적으로 치환된 헤테로사이클일, 선택적으로 치환된 아릴알킬, 선택적으로 치환된 헤테로아릴알킬, 선택적으로 치환된 알킬아릴, 선택적으로 치환된 알킬헤테로아릴 및 선택적으로 치환된 폴리머 사슬로부터 독립적으로 선택된다.
일반식(III)의 모노머의 구체적인 예들은 WO 2010/083569, WO 98/01478, Moad G.; Rizzardo, E; Thang S, H. Polymer 2008, 49, 1079-1 131 and Aust. J. Chem., 2005, 58, 379-410; Aust. J. Chem./ 2006, 59, 669-692; Aust. J. Chem., 2009, 62, 1402- 1472, Greenlee, R. Z.. in Polymer Handbook 3rd edition (Brandup, J, and Immergut. E. H. Eds) Wiley: New York, 1989, p II/53 and Benaglia et al, Macromolecules. (42), 9384-9386, 2009(이의 전문이 참조로 본 발명에 포함된다)의 하나 이상에 약술된 것들을 포함한다.
가지형 폴리머를 제조하는데 사용될 수 있는 모노머의 형태를 논의할 때, 모노머가 특성이 친수성, 소수성 또는 양이온성이 되는 것으로 부르는 것이 편리할 수 있다. 이와 관련하여 "특성"이 친수성, 소수성 또는 양이온성이 되는 것은 중합하자마자 이런 모노머들이 친수성, 소수성 및 양이온성 호모폴리머 사슬을 생산하는 것을 의미한다. 예를 들어, 친수성 호모폴리머 사슬은 일반적으로 친수성 모노머를 중합함으로써 제조될 것이다.
단지 지표로서, 친수성 에틸렌 불포화된 모노머의 예들은 아크릴산, 메타크릴산, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 하이드록시프로필 메타크릴레이트, 올리고(알킬렌 글리콜)메틸 에터(메타)아크릴레이트(OAG(M)A), 올리고(에틸렌 글리콜)메틸 에터(메타)아크릴레이트(OEG(M)A), 아크릴아마이드 및 메타크릴아마이드, 하이드록시에틸 아크릴레이트, N-메틸아크릴아마이드, N,N-다이메틸아크릴아마이드 및 N,N-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트, N,N-다이메틸아미노프로필 메타크릴아마이드, N-하이드록시프로필 메타크릴아마이드, 4-아크릴로일모르폴린, 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로페인설폰산, 포스포릴콜린 메타크릴레이트 및 N-바이닐 피롤리돈을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
사용된 모노머가 양이온 호모폴리머 사슬을 생산하는 경우, 미리 약술한 대로, 이렇게 형성된 호모폴리머 사슬은 본질적으로 하전된 양이온 상태가 아닐 수 있다. 다시 말하면, 호모폴리머 사슬은 하전된 양이온 상태로 전환될 하나 이상의 다른 화합물과 반응할 필요가 있다. 예를 들어, 양이온성 호모폴리머 사슬을 형성하도록 선택된 모노머는 3차 아민 작용기를 포함할 수 있다. 모노머를 중합하여 양이온성 호모폴리머 사슬을 형성하자마자, 3차 아민 작용기는 뒤이어 양으로 하전된 상태로 4차화될 수 있다.
단지 지표로서, 양이온성 에틸렌 불포화된 모노머의 예들은 N,N-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트, N,N-다이에틸아미노에틸 메타크릴레이트, N,N-다이메틸아미노에틸 아크릴레이트, N,N-다이에틸아미노에틸 아크릴레이트, 2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드, N-[3-N,N-다이메틸아미노)프로필]메타크릴아미드, N-(3-아미노프로필)메타크릴아마이드 하이드로클로라이드, N-[3-(N,N-다이메틸아미노)프로필]아크릴아마이드, N-[2-(N,N-다이메틸아미노)에틸]메타크릴아마이드, 2-N-모르폴리노에틸 아크릴레이트, 2-N-모르폴리노에틸 메타크릴레이트, 2-(N,N-다이메틸아미노)에틸 아크릴레이트, 2-(N,N-다이메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 2-(N,N-다이에틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 2-아크릴옥시에틸트라이메틸암모늄 클로라이드, 메타크릴아미도프로필트라이메틸암모늄 클로라이드, 2-(tert-부틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 알릴다이메틸암모늄 클로라이드, 2-(에틸아미노)에틸스티렌, 2-바이닐피리딘 및 4-바이닐피리딘을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
단지 지표로서, 소수성 에틸렌성 불포화 모노머의 예들은 스티렌, 알파-메틸 스티렌, 부틸 아크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 아밀 메타크릴레이트, 헥실 메타크릴레이트, 라우릴 메타크릴레이트, 스테아릴 메타크릴레이트, 에틸 헥실 메타크릴레이트, 크로틸 메타크릴레이트, 시남일 메타크릴레이트, 올레일 메타크릴레이트, 리시놀레일 메타크릴레이트, 콜레스테릴 메타크릴레이트, 콜레스테릴 아크릴레이트, 바이닐 부티레이트, 바이닐 tert-부티레이트, 바이닐 스테아레이트 및 바이닐 라우레이트를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
친수성 에틸렌 불포화된 모노머 OAG(M)A의 경우에, 알킬렌 모이어티는 일반적으로 C2-C6, 예를 들어, C2 또는 C3 알킬렌 모이어티일 것이다. 당업자는 "(알킬렌 글리콜)"과 관련한 "올리고" 명명법은 복수의 알킬렌 글리콜 단위의 존재를 의미한다는 것을 알 것이다. 일반적으로, OAG(M)A의 올리고 구성요소는 약 2 내지 약 200개, 예를 들어, 약 2 내지 약 100개 또는 약 2 내지 약 50개 또는 약 2 내지 약 20개 알킬렌 글리콜 반복 단위를 포함할 것이다.
따라서 친수성 호모폴리머 사슬은 친수성 에틸렌 불포화된 모노머의 중합 잔기를 포함하는 것으로 기술될 수 있다.
양이온성 호모폴리머 사슬은 양이온성 에틸렌 불포화된 모노머의 중합 잔기를 포함하는 것으로 기술될 수 있다.
소수성 호모폴리머 사슬은 소수성 에틸렌 불포화된 모노머의 중합 잔기를 포함하는 것으로 기술될 수 있다.
자유 라디칼 중합 기술이 하나 이상의 에틸렌 불포화된 모노머를 중합하는데 사용되어 블럭 코폴리머 암의 적어도 일부를 형성하는 경우, 중합은 주로 자유 라디칼의 원료에 의한 개시를 필요로 할 것이다.
개시 라디칼의 원료는 적절한 화합물(들)(퍼옥사이드, 퍼옥시에스터 또는 아조 화합물과 같은 열적 개시제)의 열적으로 유도된 동질 분할과 같은 유리 라디칼을 생성하는 임의의 적절한 수단, 모노머(예를 들어, 스티렌)로부터 자발적 생성, 산화환원 개시 시스템, 광화학 개시 시스템 또는 전자빔, X- 또는 감마-조사와 같은 고 에너지 조사에 의해 제공될 수 있다. 이런 개시제의 예들은, 예를 들어, WO 2010/083569 및 Moad and Solomon "The Chemistry of Free Radical Polymerisation", Pergamon, London, 1995, pp 53-95(이의 전문이 참조로 본 발명에 포함된다)에서 발견될 수 있다.
가지형 폴리머는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리머의 블럭 코폴리머 암은 적절한 중합 반응을 사용하여 먼저 형성될 수 있고 그런 후에 뒤이어 적절한 지지 모이어티에 결합된다. 이런 기술은 "커플링 온투(coupling onto)" 방법으로 알려져 있다. 이런 커플링 온투 방법은 미리 형성된 지지 모이어티에 미리 형성된 호모폴리머 사슬을 결합하는 단계를 필요로 할 수 있다.
선택적으로, 미리 형성된 호모폴리머 사슬은 지지 모이어티의 동시 형성 동안 결합될 수 있다. 예를 들어, 공유결합된 리빙 중합제(또는 모이어티)를 가진 미리 형성된 호모폴리머 사슬은 다중-에틸렌 불포화 모노머의 중합을 제어하도록 사용되어 호모폴리머 사슬이 공유결합되는 가교 폴리머 지지 모이어티를 형성할 수 있다.
어떻게 본 발명에 따른 가지형 폴리머가 제조되는지를 추가로 예시하기 위해서, 도 2를 참조하며 도 2에서
Figure pct00010
는 가교 폴리머 구조 형태의 지지 모이어티를 나타내며,
Figure pct00011
는 일반적인 공유결합을 나타내며,
Figure pct00012
는 공유결합된 RAFT 물질을 가진 양이온성 호모폴리머 사슬을 나타내며,
Figure pct00013
는 공유결합된 RAFT 물질을 가진 친수성 호모폴리머 사슬을 나타내며,
Figure pct00014
는 공유결합된 RAFT 물질을 가진 소수성 호모폴리머 사슬을 나타내며, R과 Z는 적절한 RAFT 물질의 내용에서 정의된 것과 같다.
도 2를 참조하면, 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬, 및 소수성 호모폴리머 사슬 형태의 미리 형성된 매크로-RAFT 물질은 다중-에틸렌 불포화 모노머(DSDMA)의 중합을 제어하도록 사용되어 호모폴리머 사슬이 공유결합되는 가교 폴리머 지지 모이어티
Figure pct00015
를 형성한다.
본 발명은 따라서 지지 모이어티 및 모이어티에 각각 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하는 가지형 폴리머를 제조하는 방법을 제공하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함하며, 상기 방법은
(i) 각각 결합된 리빙 중합 모이어티를 가지는 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 제공하는 단계; 및
(ii) 리빙 중합 모이어티의 제어하에서 하나 이상의 다중-에틸렌 불포화 모노머를 중합하여 양이온성, 친수성 및 소수성 호모폴리머 사슬의 각각이 공유결합된 가교 폴리머 지지 모이어티를 형성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 한 실시태양에서, 단계 (i)에 제공된 각각의 호모폴리머 사슬은 공유결합된 RAFT 모이어티를 가진다.
본 발명에 사용된, "리빙 중합 모이어티(들)"는 하나 이상의 에틸렌 불포화 모노머의 리빙 중합에 참여하고 제어하여 리빙 폴리머 사슬을 형성할 수 있는 모이어티를 의미한다.
본 발명에 따른 용도에 적합한 리빙 중합 모이어티는 이온 중합 및 제어된 라디칼 중합(CRP)으로부터 선택된 리빙 중합 기술을 촉진하는 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. CRP의 예들은 이니퍼터(iniferter) 중합, 안정한 유리 라디칼 매개 중합(SFRP), 원자 전달 라디칼 중합(ATRP) 및 가역적 첨가-분절 연쇄이동(RAFT) 중합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 다중-에틸렌 불포화 모노머(또는 다기능 모노머)의 예들은 다이설파이드 다이메타크릴레이트, 에틸렌 글리콜 다이(메타)아크릴레이트, 에틸렌 글리콜 다이아크릴레이트, 트라이에틸렌 글리콜 다이(메타)아크릴레이트, 테트라에틸렌 글리콜 다이(메타)아크릴레이트, 폴리(에틸렌 글리콜) 다이메타크릴레이트, 1,3-부틸렌 글리콜 다이(메타)아크릴레이트, 트라이메틸올프로페인 트라이(메타)아크릴레이트, 1,4-부테인다이올 다이(메타)아크릴레이트, 1,4-부테인다이올 다이아크릴레이트, 네오펜틸 글리콜 다이(메타)아크릴레이트, 1,6-헥세인다이올 다이(메타)아크릴레이트, 펜타에리트리톨 다이(메타)아크릴레이트, 펜타에리트리톨 트라이(메타)아크릴레이트, 펜타에리트리톨 테트라(메타)아크릴레이트, 글리세롤 다이(메타)아크릴레이트, 글리세롤 알릴옥시 다이(메타)아크릴레이트, 1,1,1-트리스(하이드록시메틸)에테인 다이(메타)아크릴레이트, 1,1,1-트리스(하이드록시메틸)에테인 트라이(메타)아크릴레이트, 1,1,1-트리스(하이드록시메틸)프로페인 다이(메타)아크릴레이트, 1,1,1-트리스(하이드록시메틸)프로페인 트라이(메타)아크릴레이트, 트라이알릴 시아누레이트, 트라이알릴 아이소시아누레이트, 트라이알릴 트라이멜리테이트, 다이알릴 프탈레이트, 다이알릴 테레프탈레이트, 다이바이닐 벤젠, 다이바이닐 아디페이트, 4,4'-다이바이닐바이페닐, 메틸올(메타)아크릴아마이드, 트라이알릴아민, 올레일 말레이트, 글리세롤 프로폭시 트라이아크릴레이트, 알릴 메타크릴레이트, 메타크릴산 무수물 및 메틸렌비스(메타)아크릴아마이드, 비스(2-메타크릴올)옥시에틸 다이설파이드, N,N'-비스(아크릴로일)시스타민 및 N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드를 포함한다.
가지형 폴리머는 또한 적절한 지지 모이어티로부터 직접 모노머를 중합함으로써 형성될 수 있다. 이런 기술은 "코어 퍼스트(core first)" 방법으로 알려져 있다.
커플링 온투 및 코어 퍼스트 방법의 조합을 사용하는 것이 가능할 수 있다. 예를 들어, 모노머는 적절한 지지 모이어티로부터 직접 중합되어 양이온성 호모폴리머 사슬을 형성할 수 있다(코어 퍼스트). 그런 후에 미리 형성된 친수성 및 소수성 호모폴리머 사슬은 지지 모이어티에 결합될 수 있다(커플링 온투).
본 발명은 또한 가지형 폴리머 및 핵산 분자를 포함하는 복합체를 제공한다. 본 발명에서 사용된 대로 용어 "복합체"는 가지형 폴리머 및 핵산 분자의 이온 결합에 의한 회합을 의미한다. 이온 결합은 가지형 폴리머의 양이온성 호모폴리머 사슬(들) 및 핵산과 결합된 반대로 하전된 이온들 사이의 정전기 인력을 통해 유래된다. 양이온성 호모폴리머 사슬은 양전하를 제공할 것이고, 따라서 핵산 분자는 음전하를 제공할 것이어서 필요한 정전기 인력 및 복합체의 형성을 촉진할 것을 알 것이다.
핵산 분자에 대한 총 음전하는 일반적으로 자체로 음으로 하전된 핵산으로부터(예를 들어, 인산염 그룹으로부터) 유래될 것이다. 핵산 분자에 대해 가해진 임의의 변형(들)은 가지형 폴리머와의 이온 결합을 통해 복합체의 형성을 허용하는 정도로 총 음전하를 보유해야 한다.
이론에 한정되지 않기를 바라며, 가지형 폴리머 및 핵산 분자는 핵산 분자의 음으로 하전된 주쇄 및 가지형 폴리머의 양이온성 블럭 사이의 이온 상호작용을 통해 나노입자들을 형성하는 것으로 생각된다. 소정의 가지형 폴리머에서 양이온 전하의 숫자에 따라, 하나 이상의 핵산 분자가 폴리머와 결합하여 복합체를 형성할 수 있고, 복합체화된 핵산 분자들의 숫자는 폴리머에서 암/가지의 숫자가 증가함에 따라 증가할 수 있다. 따라서, 가지형 폴리머는 직선형 폴리머보다 가지형 폴리머 분자당 더 많은 핵산 분자들이 복합체화될 수 있다는 이점을 가질 수 있다.
가지형 폴리머 및 핵산 분자를 포함하는 복합체는 양이온성 폴리머/핵산 분자 복합체를 제조하는 공지된 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 물에 현탁된 필요한 양의 폴리머가 Opti-MEM®과 같은 환원성 혈청 매질을 포함하는 용기에 제공될 수 있다. 그런 후에 필요한 양의 핵산 분자가 이 용액에 제공될 수 있고 얻은 혼합물을 적절한 양의 시간 동안 환류하여 복합체를 형성할 수 있다.
핵산 분자는 구입하거나 당업계에 주지된 기술들을 사용하여 제조 또는 분리될 수 있다.
복합체를 형성하는데 사용될 수 있는 핵산 분자 대 가지형 폴리머의 비에 관한 특별한 제한은 없다. 당업자는 가지형 폴리머 및 핵산 분자의 비와 함께 가지형 폴리머 및 핵산 분자의 (제타 전위로 표시된) 전하 밀도가 얻은 복합체의 전체 전하/중성 상태에 영향을 미칠 것이다.
한 실시태양에서, 복합체는 양성 제타 전위를 가진다. 다른 실시태양에서, 복합체는 0mV 초과 내지 약 100mV 또는 0mV 초과 내지 약 50mV, 예를 들어 약 10mV 내지 약 40mV 또는 약 15mV 내지 약 30mV 또는 약 20mV 내지 약 25mV 범위의 양성 제타 전위를 가진다.
본 발명에 따른 복합체의 제타 전위는 말번 제타사이저에 의해 측정된 것이다. 제타 전위는 전기장에서 입자들의 이동도(전기영동 이동도) 및 샘플에서 입자 크기 분포의 측정으로부터 계산된다.
본 발명에 사용된 용어 "핵산 분자"는 본 발명에 기술된 대로 DNA(gDNA, cDNA), 올리고뉴클레오티드(이중 또는 단일 가닥), RNA(센스 RNAs, 안티센스 RNAs, mRNAs, tRNAs, rRNAs, 소형 간섭 RNAs(siRNAs), 이중-가닥 RNAs(dsRNA), 짧은 헤어핀 RNAs(shRNAs), piwi-상호작용 RNAs(PiRNA), 마이크로 RNAs(miRNAs), 소형 핵 RNAs(SnoRNAs), 소형 핵(SnRNAs)), 리보자임, 압타머, DNAzymes, 리보뉴클레아제-형태 복합체 및 다른 이런 분자를 포함하는 핵산 분자를 의미한다. 의심을 피하기 위해서, 용어 "핵산 분자"는 비-자연적으로 발생하는 변형 형태뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 형태를 포함한다.
일부 실시태양에서, 핵산 분자는 약 8 내지 약 80개 핵염기(즉, 약 8 내지 약 80개의 연속적으로 연결된 핵산)를 포함한다. 당업자는 본 발명은 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26. 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48. 49, 50, 51. 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74. 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80개 핵염기 길이의 핵산 분자를 포함한다는 것을 알 것이다.
용어 "핵산 분자"는 또한 올리고뉴클레오티드 유사체, 키메릭, 하이브리드 및 모방체 형태와 같은 다른 부류의 화합물을 포함한다.
키메릭 올리고머 화합물은 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 유사체, 올리고뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드 모방체를 포함하나 이에 제한되지 않는 둘 이상의 핵산 분자의 복합 구조로 형성될 수 있다. 일반적으로 사용된 키메릭 화합물은 하이브리드, 헤미머(hemimer), 갭머, 연장된 갭머, 역전된 갭머 및 블럭머(blockmer)를 포함하나 이에 제한되지 않으며, 다양한 점 변형 및 또는 지역은, 예를 들어, 잠김 핵산(LNA), 펩타이드 핵산(PNA), 모르폴리노스 및 기타와 같은 고유 또는 변형 DNA 및 RNA 형태 단위 및/또는 모방체 형태 단위로부터 선택된다. 이런 하이브리드 구조의 제조는, 예를 들어, 각각이 전문으로 본 발명에 참조로 포함되는, US Pat. Nos. 5,013,830; 5,149,797; 5,220.007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356; 및 5,700,922에 기술된다.
RNA 및 DNA 압타머가 또한 고려된다. 압타머는 전통적인 왓슨-크릭 염기쌍 이외의 상호작용을 통해 비-핵산 또는 핵산 분자에 대한 특이적 결합 친화력을 가진 핵산 분자이다. 압타머는, 예를 들어, 미국특허 Nos. 5,475,096; 5,270,163; 5,589,332; 5,589,332; 및 5,741,679에 기술된다. 비-핵산 표적을 인식하는 DNA 및 RNA 압타머의 증가하는 숫자는 자세히 설명되었고 특징이 묘사되었다(예를 들어, Gold et al., Annu. Rev. Biochem., 64: 763-797.1995; Bacher et al., Drug Discovery Today, 3(6): 265-273, 1998 참조).
핵산 분자들에 추가 변형이 가해질 수 있고 말단, 선택된 핵염기 위치, 당 위치의 하나 또는 뉴클레오시드내(internucleoside) 결합 중 하나에 부착된 컨쥬게이트 그룹을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 핵산 분자를 세포에 전달하는 방법을 제공하며, 이 방법은
(a) 가지형 폴리머 및 핵산 분자를 포함하는 복합체를 제공하는 단계, 가지형 폴리머는 지지 모이어티 및 모이어티에 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함한다; 및
(b) 복합체를 세포에 전달하는 단계를 포함한다.
이 방법은 인 비보, 엑스 비보 또는 인 비트로로 실행될 수 있다.
본 발명은 본 발명에 기술된 대로, 본 발명에 따른 핵산 분자 복합체의 치료적 유효량을 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 유전자 치료 방법을 추가로 제공한다.
유전자 치료로서 DNA 회복 및 매개 조합의 관련성은, 예를 들어, 낭포성 섬유증, 혈우병과 같은 유전병 및 겸상 적혈구 빈혈증(sickle cell anaemia)과 베타-지중해빈혈과 같은 혈색소증과 관련하여 연구할 때 명백하다. 예를 들어, 표적 유전자가 유전 질환의 원인인 돌연변이를 포함하는 경우, 핵산 분자를 대상의 세포(들) 속에 전달하는 것은 비정상 표적 유전자의 DNA 서열을 정상으로 회복하기 위해 돌연변이 회복을 촉진하는데 유용할 수 있다. 선택적으로, 대상의 세포(들)에 제공된 핵산 분자는 다른 상황에서는 질병 상태에서 억제되거나 침묵되는 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이런 핵산 분자들은 자체로 침묵 또는 억제 유전자를 암호화할 수 있거나 다른 상황에서 억제되거나 침묵된 표적 유전자의 전사 및/또는 번역을 활성화할 수 있다.
당업자는 본 발명의 방법을 사용하여 치료될 질환 또는 질병은 유전자 치료에 의해 치료될 수 있는 임의의 질환 또는 질병일 수 있으며 사용될 유전자 재료(즉, 핵산 분자)의 선택은 특정 질환 또는 질병에 분명하게 의존할 것이라는 걸 이해할 것이다. 치료될 수 있는 질환 또는 질병은 암(예를 들어, 골수 이상), 지중해빈혈, 낭포성 섬유증, 청각장애, 시력 이상(예를 들어, 레베르 선천성 흑암시(Leber Congenital Amaurosis)), 당뇨병, 헌팅턴병, X-연관 중증 복합 면역결핍증 질환(severe combined immune deficiency disease) 및 심장 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 선택적으로, 유전자 치료는 비-내인성 유전자, 예를 들어, 생발광을 위한 유전자를 제공하거나 내인성 유전자를 낙아웃할 유전자(예를 들어, RNA 간섭)를 제공하는데 사용될 수 있다.
당업자는 핵산 분자의 성질은 치료되거나 예방될 질환 또는 질병에 따라 변할 것이라는 걸 이해할 것이다. 예를 들어, 섬유성 세포외 기질 물질(예를 들어, 타입 II 콜라겐)의 축적에 적어도 부분적으로 기여하는 질병 또는 질환은 (표적화된 방식 또는 비-표적화된 방식으로) 본 발명의 핵산 분자 복합체를 대상에게 전달함으로써 치료 또는 예방될 수 있으며, 핵산 분자(예를 들어, siRNA)는 세포외 기질 물질을 암호화하는 유전자를 침묵시킬 수 있다. 일부 실시태양에서, 질환 또는 질병은 감염성 질환, 염증성 질환 또는 암이다.
본 발명에 따른 핵산 분자 복합체의 세포로의 전달이 인 비보로 실행되는 경우, 핵산 분자 복합체는 상황하에서 적절한 임의의 투여 경로에 의해 세포에 제공될 수 있다. 예를 들어, 전신 전달을 의도하는 경우, 복합체는 정맥, 피하, 근내, 경구 등으로 투여될 수 있다. 선택적으로, 복합체는 당업자에게 공지된 수단에 의해 특정 세포 또는 세포 형태에 표적화될 수 있다. 표적화는, 예를 들어, 핵산 분자가 비-악성 세포에 대해 허용할 수 없게 독성인 경우 또는 핵산 분자가 다른 상황에서 너무 많은 투여량을 필요로 하는 경우 암 세포들을 표적화하기 위한 것과 같은, 다양한 이유 때문에 바람직할 수 있다.
표적화된 전달은 인비보, 엑스비보 또는 인비트로로 실행될 수 있고 당업자에게 공지된 수단에 의해 성취될 수 있다. 예를 들어, 이것은 수용체-매개 표적화에 의해 또는 표적 세포(들)을 포함하는 조직에 핵산 복합체를 직접 투여함으로써 성취될 수 있다.
수용체-매개 표적화는 가지형 폴리머 및/또는 핵산 분자를 본 발명에 기술한 대로 적절한 표적화 리간드와 결합 또는 컨쥬게이트함으로써 성취될 수 있다.
예를 들어, 수용체-매개 표적화는 핵산 분자를 단백질 리간드에, 예를 들어, 폴리리신을 통해 컨쥬케이트함으로써 성취될 수 있다.
표적화 리간드들은 통상적으로 표적 세포/조직 형태의 표면상에 상응하는 리간드 수용체들의 존재를 기초로 선택된다.
리간드-핵산 분자 컨쥬게이트는 본 발명에 따른 가지형 폴리머와 복합체화될 수 있고 원하는 경우 전신(예를 들어, 정맥)으로 투여될 수 있고, 이들은 수용체 결합이 일어나는 표적 세포/조직으로 향하게 될 것이다.
한 실시태양에서, 가지형 폴리머 및/또는 핵산 분자는 세포의 수용체 매개 표적화를 촉진하도록 표적화 리간드와 컨쥬게이트된다.
다른 실시태양에서, 핵산 분자는 세포의 수용체 매개 표적화를 촉진하도록 단백질 리간드와 컨쥬게이트된다.
용어 "결합된", "결합하는" 및 "컨쥬게이트된", "컨쥬케이트되는"은 본 발명에서 교환적으로 사용되며 적어도 두 존재가, 예를 들어, 공유결합에 의해 결합되어 단일 존재를 형성하는 것을 의미한다.
다른 실시태양에서, 본 발명에 따른 핵산 분자의 세포로의 전달 방법은 엑스 비보로 실행된다. 예를 들어, 세포들은 대상으로부터 분리되고 본 발명의 핵산 분자 복합체와 함께 엑스 비보로 제공되어 외인성 핵산 분자를 포함하는 세포들을 생산한다. 세포들은 치료될 대상 또는 공동유전자 숙주로부터 분리될 수 있다. 그런 후에 세포들은 치료 또는 예방을 위해 대상(또는 공동유전자 수취인)에게 다시 제공된다. 일부 실시태양에서, 세포들은 조혈 전구체 또는 줄기 세포일 수 있다.
한 실시태양에서, 핵산 분자는 유전자 발현을 침묵시키기(또는 억제하기) 위해 세포에 전달된다. 일부 실시태양에서, 유전자 발현은 번역 효율을 감소시키거나 메세지 안정성(message stability)을 감소시키거나 이런 효과의 조합에 의해 침묵된다. 일부 실시태양에서, 처리되지 않은 RNA의 스플라이싱은 비-기능성 또는 덜 활성인 단백질의 생산을 유도하는 표적 목표이다.
일부 실시태양에서, 유전자 발현은 세포에 gDNA, cDNA 및 DNA 올리고뉴클레오티드(이중 또는 단일 가닥)를 포함하나 이에 제한되지 않는 DNA 분자를 전달함으로써 침묵된다.
일부 실시태양에서, 유전자 발현은 RNA 간섭(RNAi)에 의해 침묵된다. 본 발명을 특정한 이론 또는 작용 형태에 제한하지 않고, "RNA 간섭"은, 예를 들어, 통상적으로 서열 특이적 방식으로 mRNA을 분해하거나 다른 상황에서 mRNA의 번역을 예방하는 것을 기초로 유전자 발현을 침묵하는 메커니즘을 기술한다. 당업자는 외인성 간섭 RNA 분자들이 mRNA 분해 또는 mRNA 번역 억제를 유도할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 실시태양에서, RNA 간섭은 논센스-매개 붕괴(nonsense mediated decay)를 유도하는 하나 이상의 미성숙 정지 코돈을 제공하기 위해 리딩 프레임을 변경함으로써 얻어진다.
RNAi는 표적 mRNA 분해를 통해 유전자 발현에서 서열 특이적 환원을 유도하는 이중 가닥(센스 및 안티센스) RNA를 필요로 하는 유전자 침묵의 과정을 포함한다. RNAi는 통상적으로 짧은 이중 가닥 siRNAs 또는 단일 가닥 microRNAs(miRNA)에 의해 매개된다.
RNA-유사 특성을 가진 다른 올리고뉴클레오티드가 또한 기술되었고 RNAi의 여러 많은 다른 형태가 개발될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 엑손 사용을 변경하고 pre-RNA 스플라이싱을 조절하는데 사용되었다(예를 들어, Madocsai et al., Molecular Therapy, 12: 1013- 1022, 2005 and Aartsma-Rus et al., BMC Med Genet., 8: 43, 2007 참조). 안티센스 및 iRNA 화합물은 관심 표적 유전자의 DNA 또는 RNA에 특이적으로 혼성화하는 RNA 또는 RNA-유사 또는 DNA 또는 DNA-유사 분자인 이중가닥 또는 단일가닥 올리고뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 내용에서 사용하기에 적합한 RNA 분자의 예들은 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 긴 이중가닥 RNA( dsRNA ); 헤어핀 이중가닥 RNA(헤어핀 dsRNA); 짧은 간섭 RNA( siRNA ); 짧은 헤어핀 RNA( shRNA )(shRNA 마이크로 RNA/소형 템포랄 RNA( miRNA / stRNA ); 공간 성장(sdRNAs), 스트레스 반응(srRNAs) 또는 세포 주기(ccRNAs)를 매개하는 miRNA; 및 내인성으로 발현된 miRNA 또는 stRNA 또는 외인성으로 제공된 siRNA의 기능을 혼성화하고 예방하도록 디자인된 RNA 올리고뉴클레오티드.
다른 실시태양에서, 핵산 분자는 번역 개시, 스플라이스 도너 위치 또는 스플라이스 억셉터 위치에서 스플라이싱을 억제한다. 다른 실시태양에서, 스플라이싱의 변형은 리딩 프레임을 변형시키고 전사체의 논센스 매개 분해를 개시한다.
본 발명에 따라 사용하기에 적합한 핵산 분자의 디자인에 관한 다른 예에서, 분자의 특정 구조 및 길이를 결정하는 것, 예를 들어, 분자가 dsRNA, 헤어핀 dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, pre-mRNA, pri-miRNA 또는 본 발명에 기술한 임의의 다른 적절한 형태를 갖는지를 결정하는 것은 당업자의 기술 내에 있다.
용어 "유전자"는 가장 넓은 의미로 사용되며 유전자의 엑손에 상응하는 cDNA를 포함한다. 본 발명에서 "유전자"에 대한 언급은 또한 전사 및/또는 번역 조절 서열 및/또는 암호화 영역 및/또는 비-번역 서열(즉, 인트론, 5'- 및 3'-미번역 서열)로 이루어진 전통적인 게놈 유전자; 또는 유전자의 암호화 영역(즉, 엑손), pre-mRNA 및 5'- 및 3'-미번역 서열에 상응하는 mRNA 또는 cDNA 분자를 포함한다.
"발현"에 대한 언급은 유전자 발현에 대한 넓은 언급이며 유전자 또는 핵산 분자로부터, 선-전사를 통해, 후-번역에 대한 전사 및 번역을 통해 단백질 또는 RNA를 생산하는 방법의 임의의 단계를 포함한다.
본 발명에서 사용된 "세포"는 진핵세포(예를 들어, 동물 세포, 식물 세포 및 곰팡이 또는 원생생물의 세포) 및 원핵세포(예를 들어, 박테리아)를 포함한다. 한 실시태양에서, 세포는 인간 세포이다.
본 발명에서 사용된 용어 "대상"은 동물 또는 인간 대상을 의미한다. "동물"은 영장류, 가축 동물(소, 말, 양, 돼지 및 염소를 포함), 반려 동물(개, 고양이, 토끼 및 기니피그 포함), 포획 야생 동물(동물원에서 일반적으로 발견된 것들 포함) 및 수중 동물(어류 및 갑각류와 같은 민물 및 바닷물 동물 포함)을 의미한다. 토끼, 생쥐, 쥐, 기니피그 및 햄스터와 같은 실험실 동물 또한 고려되는데 이는 이들이 편리한 테스트 시스템을 제공할 수 있기 때문이다. 일부 실시태양에서, 대상은 인간 대상이다.
복합체 또는 조성물의 대상에 대한 "투여"는 물질 또는 조성물이 제공되어 대상에게 전달될 수 있거나 전달되는 것을 의미한다. 투여 방식에 대한 특정한 제한은 없으나, 일반적으로 경구, 비경구(피하, 피내, 근내, 정맥내, 수막내 및 척수내 포함), 흡입(분무 포함), 직장 및 질 방식에 의할 것이다.
이론에 한정되거나 제한됨이 없이, 본 발명의 복합체는 RNAse 및/또는 DNAse와 같은 효소에 의한 분해로부터 핵산 분자를 보호하는 것으로 발견되었다.
본 발명은 따라서 효소 분해로부터 핵산 분자를 보호하는 방법을 제공하며, 지지 모이어티 및 모이어티에 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하는 가지형 폴리머로 핵산 분자를 복합체화하는 단계를 포함하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함한다.
핵산 분자를 세포에 전달하기 위한 복합체의 용도가 제공되며, 복합체는 가지형 폴리머 및 핵산 분자를 포함하며, 가지형 폴리머는 지지 모이어티 및 모이어티에 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함한다.
본 발명은 유전자 발현을 침묵시키기 위한 복합체의 용도를 추가로 제공하며, 복합체는 가지형 폴리머 및 핵산 분자를 포함하며, 가지형 폴리머는 지지 모이어티 및 모이어티에 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함한다.
한 실시태양에서, 핵산 분자는 DNA 및 RNA로부터 선택된다. 다른 실시태양에서, DNA 및 RNA는 gDNA, cDNA, 이중 또는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드, 센스 RNAs, 안티센스 RNAs, mRNAs, tRNAs, rRNAs, 소형/짧은 간섭 RNAs(siRNAs), 이중-가닥 RNAs(dsRNA), 짧은 헤어핀 RNAs(shRNAs), piwi-상호작용 RNAs(PiRNA), 마이크로 RNA/소형 템포랄 RNA(miRNA/stRNA), 소형 핵 RNAs(SnoRNAs), 소형 핵(SnRNAs) 리보자임, 압타머, DNAzymes, 리보뉴클레아제-형태 복합체, 헤어핀 이중 가닥 RNA(hairpin dsRNA), 공간 성장을 매개하는 miRNAs(sdRNAs), 스트레스 반응 RNA(srRNA), 세포 주기 RNA(ccRNAs) 및 이중 또는 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드로부터 선택된다.
본 발명은 효소 분해로부터 핵산 분자를 보호하는데 가지형 폴리머의 용도를 추가로 제공하며, 가지형 폴리머는 지지 모이어티 및 모이어티에 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 분자 복합체를 포함하는 약학적 조성물과 같은 조성물에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 조성물은 본 발명의 핵산 분자 복합체 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 것이다.
본 발명의 조성물에서, 핵산 분자 복합체는 통상적으로 유효량으로 투여하도록 제제화된다. 본 발명에 사용된 용어 "유효량" 및 "치료적 유효량"의 핵산 복합체는 통상적으로 치료 동안 적어도 통계적으로 유의한 숫자의 대상에서 원하는 치료 또는 예방 효과를 제공하기 위한 충분한 양의 복합체를 의미한다.
일부 실시태양에서, 인간 대상에 대한 유효량은 약 0.1ng/kg 체중/투여량 내지 1g/kg 체중/투여량의 범위에 있다. 일부 실시태양에서, 범위는 약 1㎍ 내지 1g, 약 1mg 내지 1g, 1mg 내지 500mg, 1mg 내지 250mg, 1mg 내지 50mg 또는 1㎍ 내지 1mg/kg 체중/투여량이다. 투여 요법은 상황의 급한 상황에 맞도록 조절되며 최적의 치료 또는 예방 투여량을 제공하도록 조절될 수 있다.
"약학적으로 허용가능한" 담체, 부형제, 또는 희석제는 생물학적으로 또는 다른 상황에서 바람직하지 않은 재료로 이루어진 약학적 매질을 의미하는데; 즉, 재료는 어떠한 또는 상당한 부반응을 일으키지 않고 본 발명의 복합체와 함께 대상에게 투여될 수 있다.
본 발명의 양태들은 감염 질환, 염증 질환 또는 암에 대해 대상을 치료하는 방법을 포함하며, 이 방법은 대상에게 본 발명에 따른 복합체 또는 본 발명에 따른 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 가지형 폴리머는 농업 분야, 화장품 분야에서 생활성제용 전달 부형제, 점도 변형제, 계면활성제, 분산제로서 또는 예를 들어, 페인트 및 화장품용 제제에서 첨가제로서 용도를 발견할 수 있다.
본 발명에서 사용된 대로, 단독으로 또는 화합물 단어에 사용된 용어 "알킬"은 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 알킬, 바람직하게는 C1 -20 알킬, 예를 들어, C1 -10 또는 C1-6을 나타낸다. 직쇄 및 측쇄 알킬은 메틸, 에틸, n-프로필, 아이소프로필, n-부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸, 1,2-다이메틸프로필, 1,1-다이메틸-프로필 및 헥실을 포함한다. 사이클릭 알킬의 예들은 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 사이클로옥틸, 사이클로논일, 사이클로데실 등과 같은 모노- 또는 폴리사이클릭 알킬 그룹을 포함한다. 알킬 그룹이 일반적으로 "프로필", "부틸" 등으로 불리는 경우, 이는 적절한 경우 직쇄, 측쇄 및 고리 이성질체 중 임의의 것을 의미할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 알킬 그룹은 본 발명에 정의된 하나 이상의 선택적 치환기들에 의해 선택적으로 치환될 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "알켄일"은 이전에 정의한 대로 에틸렌으로 모노-, 다이- 또는 폴리불포화 알킬 또는 사이클로알킬 그룹을 포함하는 적어도 하나의 탄소 대 탄소 이중 결합을 함유하는 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 탄화수소 잔기들로 형성된 그룹들, 바람직하게는 C2 -20 알켄일(예를 들어, C2-10 또는 C2-6)을 나타낸다. 알켄일의 예들은 바이닐, 알릴, 1-메틸바이닐 및 부텐일을 포함한다. 알켄일 그룹은 본 발명에서 정의된 대로 하나 이상의 선택적 치환기에 의해 선택적으로 치환될 수 있다.
본 발명에서 사용된 대로 용어 "알카인일"은 이전에 정의한 대로 에틸렌으로 모노-, 다이- 또는 폴리불포화 알킬 또는 사이클로알킬 그룹을 포함하는 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭 탄화수소 잔기들로 형성된 그룹들을 나타낸다. 탄소 원자들의 수가 명시되지 않는 경우, 용어는 바람직하게는 C2 -20 알카인일(예를 들어, C2-10 또는 C2-6)을 의미한다. 예들은 에타인일, 1-프로파인일, 2-프로파인일 및 부타인일 이성질체 및 펜타인일 이성질체를 포함한다. 알카인일 그룹은 본 발명에서 정의된 대로 하나 이상의 선택적 치환기에 의해 선택적으로 치환될 수 있다.
용어 "할로겐"("할로")은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드(플루오로, 클로로, 브로모 또는 아이도)를 나타낸다.
용어 "아릴"(또는 "카보아릴")은 방향족 탄화수소 고리 시스템의 단일, 다핵, 컨쥬게이트 및 접합 잔기들 중 임의의 것(예를 들어, C6 -24 또는 C6 -18)을 나타낸다. 아릴의 예들은 페닐, 바이페닐, 터페닐, 쿼터페닐 및 나프틸을 포함한다. 아릴 그룹은 본 발명에 정의된 대로 하나 이상의 선택적 치환기들에 의해 선택적으로 치환되거나 되지 않을 수 있다. 용어 "아릴렌"은 2가 형태의 아릴을 나타내는 것을 의미한다.
용어 "카보사이클일"은 비 방향족 모노사이클릭, 폴리사이클릭, 접합 또는 컨쥬케이트 탄화수소 잔기들, 바람직하게는 C3 -20(예를 들어, C3 -10 또는 C3 -8) 중 임의의 것을 포함한다. 고리들은, 예를 들어, 사이클로알킬과 같이 포화될 수 있거나 하나 이상의 이중 결합(사이클로알켄일) 및/또는 하나 이상의 삼중 결합(사이클로알카인일)을 소유할 수 있다. 카보사이클일기는 본 발명에 정의된 대로 하나 이상의 최적 치환체들에 의해 선택적으로 치환될 수 있다. 용어 "카보사이클릴렌"은 카보사이클릴의 2가 형태를 표시하는 것으로 생각된다.
가장 넓은 의미로 사용된 용어 "헤테로원자" 또는 "헤테로"는 사이클릭 유기 그룹의 일원일 수 있는 탄소 원자 이외의 임의의 원자를 의미한다. 헤테로원자들의 구체적인 예들은 질소, 산소, 황, 인, 붕소, 규소, 셀레늄 및 텔루륨, 더욱 구체적으로 질소, 산소 및 황을 포함한다.
단독으로 또는 화합물 단어에 사용될 때 용어 "헤테로사이클일"은 모노사이클릭, 폴리사이클릭, 접합 또는 컨쥬케이트 탄화수소 잔기들 중 임의의 것, 바람직하게는 C3 -20(예를 들어, C3 -10 또는 C3 -8)을 포함하며 여기서 하나 이상의 탄소는 비 방향족 잔기를 제공하도록 헤테로원자에 의해 대체된다. 적절한 헤테로원자들은 O, N, S, P 및 Se, 특히 O, N 및 S를 포함한다. 둘 이상의 탄소 원자들이 대체되는 경우, 이것은 둘 이상의 동일한 헤테로원자 또는 다른 헤테로원자로 대체될 수 있다. 헤테로사이클일 그룹은 포화 또는 부분적으로 불포화될 수 있는데, 즉, 하나 이상의 이중 결합을 소유한다. 헤테로사이클일 그룹은 본 발명에서 정의된 대로 하나 이상의 선택적 치환기에 의해 선택적으로 치환될 수 있다. 용어 "헤테로사이클릴렌"은 2가 형태의 헤테로사이클일을 나타내는 것을 의미한다.
용어 "헤테로아릴"은 모노사이클릭, 폴리사이클릭, 접합 또는 컨쥬케이트 탄화수소 잔기들 중 임의의 것을 포함하며, 하나 이상의 탄소 원자들은 방향족 잔기를 제공하기 위해 이형원자로 대체된다. 바람직한 헤테로아릴은 3-20 고리 원자들, 예를 들어, 3-10을 가진다. 특히 바람직한 헤테로아릴은 5-6 및 9-10원 바이사이클릭 고리 시스템이다. 적절한 헤테로원자들은 O, N, S, P 및 Se, 특히 O, N 및 S를 포함한다. 둘 이상의 탄소 원자가 대체되는 경우, 이것은 둘 이상의 동일한 헤테로원자 또는 다른 헤테로원자에 의할 것이다. 헤테로아릴 그룹은 본 발명에서 정의된 대로 하나 이상의 선택적 치환기에 의해 선택적으로 치환될 수 있다. 용어 "헤테로아릴렌"은 2가 형태의 헤테로아릴을 나타내는 것을 의미한다.
단독 또는 화합물 단어인 용어 "아실"은 모이어티 C=O(및 카복실산, 에스터 또는 아마이드가 아님)를 함유하는 그룹을 나타낸다. 바람직한 아실은 C(O)-Re를 포함하며, Re는 수소 또는 알킬, 알켄일, 알카인일, 아릴, 헤테로아릴, 카보사이클일, 또는 헤테로사이클일 잔기이다.
단독 또는 화합물 단어인 용어 "설폭사이드"는 그룹 -S(O)Rf를 의미하고, Rf는 수소, 알킬, 알켄일, 알카인일, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클일, 카보사이클일 및 아르알킬로부터 선택된다. 바람직한 Rf의 예들은 C1 -20 알킬, 페닐 및 벤질을 포함한다.
단독 또는 화합물 단어인 용어 "설폰일"은 그룹 -S(O)2Rf를 의미하고, Rf는 수소, 알킬, 알켄일, 알카인일, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클일, 카보사이클일 및 아르알킬로부터 선택된다.
단독 또는 화합물 단어인 용어 "설폰아마이드"는 그룹 S(O)NRfRf를 의미하고, 각 Rf는 독립적으로 수소, 알킬, 알켄일, 알카인일, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클일, 카보사이클일 및 아르알킬로부터 선택된다.
용어 "아미노"는 당업계에서 이해된 것과 같은 가장 넓음 의미로 사용되며 식 NRaRb의 그룹을 포함하며 Ra 및 Rb는 수소, 알킬, 알켄일, 알카인일, 아릴, 카보사이클일, 헤테로아릴, 헤테로사이클일, 아릴아킬 및 아실로부터 독립적으로 선택된 임의의 것일 수 있다. 이들이 부착되는 질소와 함께 Ra 및 Rb는 모노사이클릭 또는 폴리사이클릭 고리 시스템, 예를 들어, 3-10원 고리, 바람직하게는 5-6 및 9-10원 시스템을 형성할 수 있다.
용어 "아미도"는 당업계에서 이해된 것과 같은 가장 넓음 의미로 사용되며 식 C(O)NRaRb을 가진 그룹을 포함하며, Ra 및 Rb는 위에서 정의한 것과 같다.
용어 "카복시 에스터"는 당업계에서 이해된 것과 같은 가장 넓음 의미로 사용되며 식 CO2Rg를 가진 그룹을 포함하며, Rg는 알킬, 알켄일, 알카인일, 아릴, 카보사이클일, 헤테로아릴, 헤테로사이클일, 아릴아킬 및 아실을 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 사용된 대로, 용어 "아릴옥시"는 산소 다리를 통해 부착된 "아릴" 그룹을 의미한다. 아릴옥시 치환기들의 예들은 페녹시, 바이페녹시, 나프틸옥시 등을 포함한다.
본 발명에 사용된 대로, 용어 "아실옥시"는 "아실" 그룹을 의미하며, "아실" 그룹은 산소 원자를 통해 부착된다.
본 발명에 사용된 대로, 용어 "알킬옥시카본일"은 카본일 그룹을 통해 부착된 "알킬옥시" 그룹을 의미한다. "알킬옥시카본일" 그룹의 예들은 부틸포르메이트, sec-부틸포르메이트, 헥실포르메이트, 옥틸포르메이트, 데실포르메이트, 사이클로펜틸포르메이트 등을 포함한다.
본 발명에 사용된 대로, 용어 "아릴알킬"은 방향족 고리로 치환된 직쇄 또는 측쇄 알케인으로부터 형성된 그룹을 의미한다. 아릴알킬의 예들은 페닐메틸(벤질), 페닐에틸 및 페닐프로필을 포함한다.
본 발명에 사용된 대로, 용어 "알킬아릴"은 직쇄 또는 측쇄 알케인으로 치환된 아릴 그룹으로부터 형성된 그룹을 의미한다. 알킬아릴의 예들은 메틸페닐 및 아이소프로필페닐을 포함한다.
본 명세서에서, "선택적으로 치환된"은 한 그룹이 다음: 알킬, 알켄일, 알카인일, 카보사이클일, 아릴, 헤테로사이클일, 헤테로아릴, 아실, 아르알킬, 알카릴, 알크헤테로사이클일, 알크헤테로아릴, 알크카보사이클일, 할로, 할로알킬, 할로알켄일, 할로알카인일, 할로아릴, 할로카보사이클일, 할로헤테로사이클일, 할로헤테로아릴, 할로아실, 할로아리알킬, 하이드록시, 하이드록시알킬, 하이드록시알켄일, 하이드록시알카인일, 하이드록시카보사이클일, 하이드록시아릴, 하이드록시헤테로사이클일, 하이드록시헤테로아릴, 하이드록시아실, 하이드록시아르알킬, 알콕시알킬, 알콕시알켄일, 알콕시알카인일, 알콕시카보사이클일, 알콕시아릴, 알콕시헤테로사이클일, 알콕시헤테로아릴, 알콕시아실, 알콕시아르알킬, 알콕시, 알켄일옥시, 알카인일옥시, 아릴옥시, 카보사이클일옥시, 아르알킬옥시, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클일옥시, 아실옥시, 할로알콕시, 할로알켄일옥시, 할로알카인일옥시, 할로아릴옥시, 할로카보사이클일옥시, 할로아르알킬옥시, 할로헤테로아릴옥시, 할로헤테로사이클일옥시, 할로아실옥시, 나이트로, 나이트로알킬, 나이트로알켄일, 나이트로알카인일, 나이트로아릴, 나이트로헤테로사이클일, 나이트로헤테로아릴, 나이트로카보사이클일, 나이트로아실, 나이트로아르알킬, 아미노(NH2), 알킬아미노, 다이알킬아미노, 알켄일아미노, 알카인일아미노, 아릴아미노, 다이아릴아미노, 아르알킬아미노, 다이아르알킬아미노, 아실아미노, 다이아실아미노, 헤테로사이클아미노, 헤테로아릴아미노, 카복시, 카복시에스터, 아미도, 알킬설폰일옥시, 아릴설펜일옥시, 알킬설펜일, 아릴설펜일, 티오, 알킬티오, 알켄일티오, 알카인일티오, 아릴티오, 아르알킬티오, 카보사이클일티오, 헤테로사이클일티오, 헤테로아릴티오, 아실티오, 설폭사이드, 설폰일, 설폰아마이드, 아미노알킬, 아미노알켄일, 아미노알카인일, 아미노카보사이클일, 아미노아릴, 아미노헤테로사이클일, 아미노헤테로아릴, 아미노아실, 아미노아르알킬, 티오알킬, 티오알켄일, 티오알카인일, 티오카보사이클일, 티오아릴, 티오헤테로사이클일, 티오헤테로아릴, 티오아실, 티오아르알킬, 카복시알킬, 카복시알켄일, 카복시알카인일, 카복시카보사이클일, 카복시아릴, 카복시헤테로사이클일, 카복시헤테로아릴, 카복시아실, 카복시아르알킬, 카복시에스터알킬, 카복시에스터알켄일, 카복시에스터알카인일, 카복시에스터카보사이클일, 카복시에스터아릴, 카복시에스터헤테로사이클일, 카복시에스터헤테로아릴, 카복시에스터아실, 카복시에스터아르알킬, 아미도알킬, 아미도알켄일, 아미도알카인일, 아미도카보사이클일, 아미도아릴, 아미도헤테로사이클일, 아미도헤테로아릴, 아미도아실, 아미도아르알킬, 포밀알킬, 포밀알켄일, 포밀알카인일, 포밀카보사이클일, 포밀아릴, 포밀헤테로사이클일, 포밀헤테로아릴, 포밀아실, 포밀아르알킬, 아실알킬, 아실알켄일, 아실알카인일, 아실카보사이클일, 아실아릴, 아실헤테로사이클일, 아실헤테로아릴, 아실아실, 아실아르알킬, 설폭사이드알킬, 설폭사이드알켄일, 설폭사이드알카인일, 설폭사이드카보사이클일, 설폭사이드아릴, 설폭사이드헤테로사이클일, 설폭사이드헤테로아릴, 설폭사이드아실, 설폭사이드아르알킬, 설폰일알킬, 설폰일알켄일, 설폰일알카인일, 설폰일카보사이클일, 설폰일아릴, 설폰일헤테로사이클일, 설폰일헤테로아릴, 설폰일아실, 설폰일아르알킬, 설폰아미도알킬, 설폰아미도알켄일, 설폰아미도알카인일, 설폰아미도카보사이클일, 설폰아미도아릴, 설폰아미도헤테로사이클일, 설폰아미도헤테로아릴, 설폰아미도아실, 설폰아미도아르알킬, 나이트로알킬, 나이트로알켄일, 나이트로알카인일, 나이트로카보사이클일, 나이트로아릴, 나이트로헤테로사이클일, 나이트로헤테로아릴, 나이트로아실, 나이트로아르알킬, 사이아노, 설페이트, 포스페이트, 트라이아릴메틸, 트라이아릴아미노, 옥사디아졸 및 카바졸 그룹으로부터 선택된 것들을 포함하는 유기 및 무기 그룹의 하나, 둘, 셋 이상으로 치환되거나 (축합된 폴리사이클릭 그룹을 형성하도록) 접합될 수 있거나 치환되거나 접합될 수 없다는 것을 의미한다. 선택적 치환은 사슬 또는 고리에서 있는 -CH2- 그룹이 -O-, -S-, -NRa-, -C(O)- (즉, 카본일), -C(O)O- (즉, 에스터), 및 Ra은 본 발명에서 정의한 것과 같은 -C(O)NRa- (즉, 아마이드)로부터 선택된 그룹에 의해 대체된다.
본 발명은 이제 다음 비 제한적인 실시예들을 참조하여 기술될 것이다.
실시예
실시예 1
재료
올리고(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트(OEGMA8 -9, Mn ~ 475 g mol-1), N,N-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA), n-부틸 메타크릴레이트(n-BMA) 모노머 및 에틸렌 글리콜 다이메타크릴레이트(EGDMA) 가교제를 알드리치로부터 구입하고 사용하기 전 30분 동안 하이드로퀴논 또는 하이드로퀴논 모노메틸 에터(알드리치)를 위한 억제제-제거제의 존재하에서 교반하여 정제하였다. 4-사이아노-4-[(도데실설판일티오카본일)설판일]펜타노산(DTTCP) RAFT 물질(G. Moad, Y. K. Chong, A. Postma, E. Rizzardo, S. H Thang, Polymer 2005, 46, 8458)[ 1], 다이설파이드 다이메타크릴레이트(DSDMA) 가교제(J. Rosselgong, S. P, Amies, W. Barton, D. Price, Macromolecules 2009, 42, 5919)[ 2]를 공개된 문헌에 따라 제조하였다. 1,1'-아조비스(사이클로헥세인카보나이트릴)(ACCN 또는 VAZO-88, 듀폰)개시제, 트라이부틸포스핀(Bu3P, 알드리치) 환원제를 구입한 대로 사용하였다. N,N-다이메틸포름아마이드(DMF), 다이클로로메테인(DCM), n-헥세인, n-헵테인, 다이아이소프로필 에터, 메탄올 및 다른 화학 물질은 상업용 시약이었고 추가 정제 없이 사용하였다.
특징묘사:
프로톤 핵자기공명(1H NMR) 스펙트럼을 브루커 어드밴스 400 MHz 분광계(1H 400MHz)로 얻었다. 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 측정을 CMB-20A 컨트롤러 시스템, SIL-20A HT 오토샘플러, LC-20AT 탠덤 펌프 시스템, DGU-20A 탈기 장치, CTO-20AC 컬럼 오븐, RDI-10A 굴절률 탐지기 및 4 x 워터스 스티라겔(Waters Styragel) 컬럼(HT2, HT3, HT4, HT5 각각 100-4000000의 유효 몰 질량 범위를 제공하는 300mm x 7.8mm)가 장착된 시마쥬 시스템에서 실행하였고 80℃에서 1mL min-1의 유속으로 용출액으로서 N,N-다이메틸아세트아마이드(DMAc)(2.1 gL-1의 염화 리튬(LiCl))을 사용한다. 샘플의 몰 질량은 낮은 다분산성 지수 값의 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA) 표준(Polymer Laboratories)로 만든 교정 곡선으로부터 얻었다. 3차 다항식을 사용하여 몰 질량 범위에 걸쳐 직선인 log Mp 대 시간 교정 곡선을 일치하였다. 동적 광 산란(DLS) 실험을 633nm에서 작동하는 4mW HeNe 레이저를 구비한 맬번 장치 제타사이저 나노시리즈 장치, 고 양자 효율을 가진 애발런차(alvalanche) 포토다이오드 탐지기 및 ALV/LSE-5003 멀티 τ 디지털 상관기 전자 시스템을 사용하여 실행하였다. 수성 광 산란 연구를 10mM NaCl의 배경 전해질에 의해 수성 1mg.mL-1 스타 폴리머 용액에 대해 실행하였다.
단실 RAFT-물질(3)의 합성:
표제 단실-RAFT 물질을 제조하기 위한 전구체 단실 에틸렌다이아민(또는 2-단실아미노에틸아민)(1)을 Schrader et. al. Chem. Eur. J. 2007, 13, 7701-7707에 의한 공개된 문헌에 따라 다이클로로메테인: n-헥세인(1:1) 용매 혼합물에서 재결정 후 84.8% 수율로 제조하였다.
Figure pct00016
단실-RAFT 물질:
Figure pct00017
다이클로로메테인(5mL) 속 단실 에틸렌다이아민(293mg, 1.0mmol), 4-사이아노-4-[(도데실설판일티오카본일)설판일]펜타노산(2)(403mg, 1.0mmol) 및 촉매 N,N-다이메틸아미노피리딘(DMAP)의 용액에 다이아이소프로필 카보다이이미드(DIC)(140mg, 1.1mmol)를 첨가하였고, 반응 혼합물을 4h 동안 실온에서 교반하였다. DIC-우레아 부생성물을 여과하고 휘발물질을 진공하에서 제거하고 미정제 반응 혼합물(790mg)을 컬럼 크로마토그래피(용출액으로서 에틸 아세테이트: n-헥세인 3:2 v/v)로 정제하여 노란색 액체로서 표제 생성물 단실-RAFT 물질(2)(460mg, 67.8%)을 생산하였다. 1H NMR (CDCl3)δ(ppm) 0.88 (t, 3H, CH3), 1.21 - 1.40 (br, s, 18H, 9xCH2), 1.70 (m, 2H, CH2), 1.85 (s, 3H, CH3), 2.30-2.42 (m, 4H; CH2CH2), 2.89 (s, 6H N(CH3)2), 3.05 (m, 2H, C(=0)NH CH2), 3.30 (m, 2H, S(0)2NHCH2), 3.33 (dd, 2H, CH2S), 5.49 (t, 1H, NH), 5,99 (t. 1H, NH), 7.21 (d, 1H, Ar-H), 7.53 (dd, 1H, Ar-H), 7.60 (dd 1H, Ar-H), 8.24 (dd, 1H, Ar-H), 8.55 (d, 1H, Ar-H).
SN38 RAFT 물질의 합성:
Figure pct00018
SN38-RAFT 물질을 Williams et al., Chem Med Chem. 2012, 7, 281-291에 의한 공개된 문헌에 따라 2단계 합성으로 제조하였다. 먼저, 10-Boc-SN38(SN38의 Boc-보호 10-OH기)를 자오 등((Bioconjugate Chem. 2008, 19, 849-59)의 절차에 따라 SN38(SN38은 항암제이다)로부터 제조한 후 제 2 단계에서, 얻은 10-Boc-SN38을 다이클로로메테인 용매에서 DIC 결합제의 존재하에서 4-사이아노-4-[(도데실설판일티오카본일)설판일]펜타노산과 반응시켰다.
DCM(15mL) 속 10-Boc-SN38(510mg, 1.035mmol), 4-사이아노-4-[(도데실설판일티오카본일)설판일]펜타노산(426mg, 1.05mmol) 및 촉매 N,N-다이메틸아미노피리딘(DMAP)의 용액에 DCM 속 다이아이소프로필 카보다이이미드(DIC)(195mg, 1.56mmol, 1.5eq)의 용액을 첨가하였고, 반응 혼합물을 16h 동안 실온에서 교반하였다. DIC-우레아 부생성물을 여과하고 휘발물질을 진공하에서 제거하고 미정제 반응 혼합물을 컬럼 크로마토그래피(용출액으로서 에틸 아세테이트: n-헥세인 1:1 v/v)로 정제하여 노란색 고체로서 SN38-RAFT 물질(498mg, 55%)을 생산하였다. 1H NMR (CDCl3)δ(ppm) 0.84 (t, 3H, CH3), 0.96 (t, 3H, CH3), 1.21 - 1.36 (br, m, 18H, 9xCH2), 1.35 (t, 3H, CH3), 1.58 (s, 9H, 3xCH3), 1.63 (m, 2H, CH2), 1.81 (s, 3H, CH3), 2.14(m, 1H), 2.25(m, 1H), 2.35(m, 1H), 2.50(m, 1H), 2.79(m, 2H), 3.10(dd, 2H, CH2S), 3.21(dt, 1H), 3.27(t, 1H), 5.18(s, 2H), 5.37(d, 1H), 5.64(d, 1H), 7.14(d, 1H, Ar-H), 7.64(dd, 1H, Ar-H), 7.84(d 1H, Ar-H), 8.21 (dd, 1H, Ar-H).
암 제 1 방법에 의한 믹토 -암 스타 폴리머의 합성
중합 키네틱 프로토콜: OEGMA8 -9, DMAEMA 및 BMA의 중합 속도를 개별 중합 실험을 실행하여 확인하였고 사용된 일반적인 절차는 아래에 요약된다:
DMF(2.5g) 속 VAZO-88(25mg)의 원료 용액 I를 플라스크에 제조하였다. DTTCP(106mg), OEGMA8 -9(5.0g), 원료 용액 I(643mg) 및 DMF(4.5g)의 혼합물을 제 2 플라스크에 제조하였다. 이 원료 용액의 분취량(1.0g)을 3회 반복 동결-제거-해동 사이클로 탈기하고 진공하에서 밀봉한 5개 앰풀에 옮겼다. 앰풀을 특정 시간 동안 90℃에서 가열한 후 GPC 및 1H NMR 분석을 하였다. 도 3은 시간과 모노머 전환율에 대한 3개 모노머에 대한 폴리머 분자량의 성장뿐만 아니라 폴리머 분산성을 예시한다. 제조된 3개 폴리머의 GPC 흔적은 도 3(I)에 도시된다. 폴리머 D의 GPC 및 다분산성으로부터의 분자량 결과는 표 1에 도시된다.
OEGMA8 -9, DMAEMA 및 n-BMA의 호모폴리머의 제조 및 이들의 GPC 분자량 결과
표제 폴리머
조성물		 시간
[h]		 전환율a )
[%]		 M n b )
(Theo)		 M n c )
(GPC)		 D c)
(GPC)
M-RAFT 1 P(OEGMA8 -9) 4 80.7 15,700 11,800 1.24
M-RAFT 2 P(DMAEMA) 6 79.9 15,500 13,100 1.19
M-RAFT 3 P(n-BMA) 8 73.8 14,000 11,500 1.11
a) 모노머 전환율은 1H NMR로부터 계산하였다; b) M n(Theo)는 모노머 전환율로부터 계산하였다; c) M n(GPC) 및 D(GPC)는 PMMA 표준을 사용하여 DMAc GPC로부터 얻었다.
믹토-암 폴리머의 합성: 앰풀을 사용하는 합성 믹토-암 폴리머에 대한 전형적인 절차는 다음과 같다:
DMF 속 ACCN (1.0 wt.%), P(OEGMA8 -9) (30.0 wt.%), P(DMAEMA) (30.1 wt.%), P(n-BMA) (27.3 wt.%), DSDMA (20.0 wt.%)의 원료 용액을 플라스크에 제조하였다. 각 모노머([모노머]:[폴리머]= 6:1)의 특정량을 각각 폴리머 용액에 첨가하였다. ACCN 용액(73mg), P(OEGMA8 -9) 용액(129mg), P(DMAEMA) 용액(127mg), P(n-BMA) 용액(120mg), DSDMA 용액(146mg) 및 DMF(127mg)의 혼합물을 플라스크에서 제조하였다. 원료 용액을 3회 반복 동결-제거-해동 사이클로 탈기하고 진공하에서 밀봉한 앰풀에 옮겼다. 앰풀을 20h 동안 90℃에서 가열하였다.
7개 스타 폴리머를 이런 절차에 따라 제조하였고 표 2는 사용된 각 호모폴리머 매크로 RAFT 물질과 다른 시약뿐만 아니라 GPC 분석을 기초로 한 믹토-암 폴리머 분자량의 상대량을 요약한다. 선택된 믹토-암 폴리머의 GPC 흔적은 도 4(III)에 도시된다. 도 4(IV)는 중합 이전 혼합 암, 중합 이후(미정제 폴리머), 정제 폴리머 및 분해 폴리머의 GPC 흔적을 도시한다. 도 5는 정제된 믹토-암 폴리머의 1H-NMR 스펙트럼을 예시한다.
믹토 -암 스타 폴리머의 4차화 :
믹토-암 스타 폴리머의 P(DMAEMA) 암의 3차 아미노기를 4차화하기 위해서, 상기 스타의 원료 용액을 DMF로 희석하고, 과량의 MeI를 용액에 첨가하고 실온에서 16h 동안 교반하였다. 마지막으로, 과량의 MeI를 회전 증발기에서 제거하고; DMF를 4일 동안 물에 대한 스타 폴리머의 투석으로 제거하였다(분자량 막 컷오프 25,000Da). 4차화 P(DMAEMA)를 함유하는 스타 폴리머를 동결 건조 후 얻었다. 도 6은 4차화 폴리머의 1H-NMR 스펙트럼을 도시한다.
실시예 1에 기술된 절차에 따라 제조된 믹토-암 스타 폴리머에 대한 조성물, 중합 시간, 모노머 및 암 전환율 및 분자량 데이터(PMMA 표준을 사용하는 DMAc)의 요약
믹토 -암 폴리머 코드 조성물 암 Mn [ DSDMA ]
/[M- CTA ] 		M- CTA 비 암
전환율 a 		Mn
(스타) b 		PDI Mn
(분해된 스타)
S3-16 POEGMA-PQDMAEMA-PBMA 스타 15k/15k/15k 12 3/3/3 81.5 136,200 1.33 17,800
S4-1 단실-POEGMA-단실
PQDMAEMA-
단실-PBMA 스타		 15k/15k/15k 12 3/3/3 89.1 87,400 1.19 20,800
S4-3 단실-POEGMA-단실-
PQDMAEMA-
단실-PBMA 스타		 5k/5k/5k 8 3/3/3 90.4 47,100 1.17 10,700
S4-4 SN38-POEGMA-SN38-PQDMAEMA-SN38-PBMA 스타 5k/5k/5k 8 3/3/3 83.9 49,600 1.17 9,500
S4-5 단실-POEGMA-단실-
PQDMAEMA-
단실-PBMA		 15k/15k/15k 8 3/3/3 77.1 61,000 1.32 19,000
S4-6 SN38-POEGMA-SN38-PQDMAEMA-SN38-PBMA 스타 15k/15k/15k 8 3/3/3 - - -
S4-7 단실-POEGMA-단실-
PQDMAEMA-
SN38-PBMA 스타		 15k/15k/15k 8 3/3/3 77.4 67,200 1.60 21,500
S4-8 단실-POEGMA-단실-
PQDMAEMA스타		 15k/15k 12 3/3 77.3 66,800 1.36 25,600
a) 암 전환율은 암 전환율 = 면적스타 / (면적스타 + 면적매크로 -RAFT)로서 GPC 흔적으로부터 계산하였다; b) Mn(GPC) 및 D(GPC)를 PMMA 표준을 사용하여 DMAc GPC로부터 얻었다.
실시예 2
트라이부틸포스핀을 사용하는 믹토 -암 스타 폴리머의 환원성 분해
코어에 이황화 결합을 함유하는 믹토-암 폴리머(5mg)를 20mg 트라이부틸포스핀을 함유하는 1mL의 DMAc에 용해하였다. 용액을 GPC 분석 전에 30분 동안 질소 분위기하에서 실온에서 교반하였다. 도 3(IV)는 암의 분자량에 필적할만한 분자량을 가진 저 분자량 폴리머를 생산하는 가교 코어의 분해를 입증하는 스타 폴리머 및 분해된 폴리머의 GPC 흔적을 도시한다.
실시예 3
형광 염료 로다민 메타크릴레이트를 포함하는 S4-1와 유사한 믹토-암 스타 폴리머의 합성(표 2 참조).
폴리플로우어(PolyFlour)를 가진 믹토-암 스타 폴리머를 암-제 1 방법을 사용하여 합성하였다.
제 1 단계의 경우, 폴리플로우어를 가진 직선형 폴리머의 합성에 대한 전형적인 절차는 다음과 같다. DMF(2.5g) 속 VAZO-88(25mg)의 원료 용액 I를 플라스크에 제조하였다. DTTCP(32mg), 폴리플로우어(로다민 메타크릴레이트 MA)(11mg), OEGMA8-9(1.5g), 원료 용액 I(190mg) 및 DMF(1.3g)의 혼합물을 제 2 플라스크에 제조하였다. 이 원료 용액을 3회 반복 동결-제거-해동 사이클로 탈기하고 진공하에서 밀봉한 앰풀에 옮겼다. 앰풀을 특정 시간 동안 90℃에서 가열한 후 GPC 및 1H NMR 분석을 하였다.
모노머 OEGMA8 -9, DMAEMA 및 n-BMA로부터 폴리플루오르를 가진 호모폴리머 매크로 RAFT 물질의 합성에 대한 반응 시간, 모노머 전환율 및 분자량 데이터.
샘플 코드 폴리머
조성물 		시간 전환율
(%) 		M n
( GPC ) 		D
( GPC )
M-RAFT 4 P(OEGMA8 -9-RhMA) 4 75.2 11,100 1,18
M-RAFT 5 P(DMAEMA-RhMA) 6.5 82.5 14,500 1,11
M-RAFT 6 P(n-BMA-RhMA) 8 80.2 11,600 1,09
그런 후에 제 2 단계로서, DMF 속 ACCN(1.0 wt.%), P(OEGMA8 -9-RhMA)(30.0 wt.%), P(DMAEMA-RhMA)(30.0 wt.%), P(n-BMA-RhMA)(30.0 wt.%) 및 DSDMA(20.6 wt.%)의 원료 용액을 플라스크에서 제조하였다. 각 모노머([모노머]:[폴리머]=6:1)의 특정량을 각 폴리머 용액 속에 첨가하였다. ACCN 용액(86mg), P(OEGMA8-9-RhMA) 용액(111mg), P(DMAEMA-RhMA) 용액(107mg), 및 DMF(284mg)의 혼합물을 플라스크에서 제조하였다. 이 원료 용액을 3회 동결-제거-해동 사이클로 탈기하고 진공하에서 밀봉한 앰풀에 옮겼다. 앰풀을 20h 동안 90℃에서 가열하였다.
12 및 8의 가교제 대 호모폴리머 RAFT 물질 비에 대한 표 3에 나열된 호모폴리머로부터 제조된 믹토-암 폴리머의 모노머 전환율, 폴리머 분자량 및 분산성
샘플 코드 DSDMA : M-RAFT 암 전환율
() 		M n D
S4-10 12 87.5 117,100 1.27
분해 S4-10 15,000 1.32
S4-11 8 86.9 78,300 1.20
분해 S4-11 14,300 1.26
실시예 4
재료 및 방법
세포: 녹색 형광 단백질을 구조적으로 나타내는 중국 햄스터 난소 세포(CHO-GFP)(CSIRO, Australia)를 10% 소 태아 혈청, 10mM Hepes, 0.01% 페니실린 및 0.01% 스트렙토마이신으로 보충한 MEMα 변형에서 5% CO2로 37℃에서 성장시켰고 주마다 2회 2차 배양하였다.
선암 인간 폐포 기저 상피 세포(A549 ATCC No. CCL185), 인간 간암 세포(VIDRL, Australia로부터 호의로 제공받은 HuH7)를 10% 소 태아 혈청, 10mM Hepes, 2mM 글루타민, 0.01% 페니실린 및 0.01% 스트렙토마이신으로 보충한 DMEM에서 5% CO2로 37℃에서 성장시켰고 주마다 2회 2차 배양하였다.
siRNA
안티-GFP 및 음성 대조군 siRNA를 QIAGEN(USA)로부터 얻었다. 항-GFP siRNA 서열은 센스 5' gcaagcugacccugaaguucau 3' 및 안티센스 5'gaacuucagggucagcuugccg 3'이다. DNA 올리고뉴클레오티드로서 동일한 서열이 비-침묵 대조군으로 사용된다.
siFAm은 5' FAM 표지가 센스 가닥 상에 있는 안티-GFP siRNA에 있는 동일한 서열이다.
안티 코타머 단백질 복합체, 아단위 알파(COPA) siRNA 풀을 시그마 알드리치(USA)로부터 구입하였다. 4개의 siRNA 서열은 1; 5'-ACUCAGAUCUGGUGUAAUA[dT][dT]-3' 2; 5'-GCAAUAUGCUACACUAUGU[dT][dT]-3' 3; 5'-GAUCAGACCAUCCGAGUGU[dT][dT]-3' 4; 5'- GAGUUGAUCCUCAGCAUU[dT][dT]-3'이다.
결합
폴리머 / siRNA 복합체의 형성:
폴리머 대 50pmole siRNA 또는 siDNA의 질소:인산염(N:P) 비를 계산하였다. 에핀도르프 튜브에 OPTIMEM 배지(Invitrogen, USA)를 첨가하여 복합체를 형성하였다. 물에 재현탁된 필요한 양의 폴리머를 튜브에 첨가하고 혼합물을 환류하였다. si22 또는 di22의 50pmole을 튜브에 첨가하고 샘플을 환류하였다. 실온에서 1h 동안 복합체화가 지속되게 하였다.
아가로스 겔
50pmole의 siRNA를 함유하는 샘플을 40분 동안 100V에서 TBE에 2% 아가로스 겔 상에서 전기영동하였다. siRNA를 카메라를 구비한 UV 트랜스일루미네이터(transilluminator) 상에서 겔 레드(조마 바이오센스)에 의해 시각화하였고, 이미지를 진스냅 프로그램(Syngene, USA)에 의해 기록하였다.
실시예 1의 절차에 따라 제조한 믹토-암 폴리머를 siRNA 결합, 독성 및 침묵의 평가에 사용하였다. 실시예 1에서 제조된 믹토-암 폴리머와 siRNA 결합의 결과는 도 7에 예시된다. 도 7(I)는 폴리머만을 예시하는 반면 도 7(II), (III) 및 (VI)는 각각 2, 5 및 10의 폴리머:siRNA(N:P)비에 대한 결합을 예시한다. 도 7의 결과는 낮은 N:P비에서도, 우수한 siRNA 결합이 관찰되며, 이는 우수한 침묵을 성취하기 위해 소량의 폴리머가 폴리머/siRNA 복합체의 제조에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.
이황화 결합 분해에 의한 siRNA 방출
TCEP 용액(50mM)을 탈산소수를 사용하여 제조하고 -20℃에 저장하였다. 폴리머/si22 복합체(50pmol)를 상기한 대로 결합하였다. 이런 복합체를 pH5 아세트산 나트륨 버퍼에서 0.3M NaCl의 존재하에서 50mM TCEP 환원시켰다. 반응을 2h 동안 37℃에서 배양하고 상기한 대로 2% 아가로스 겔 상의 전기영동에 의해 si22 방출에 대해 분석하였다. 도 8은 믹토-암 스타 폴리머 S4-1 및 S4-5에서 이황화 결합의 분해를 예시한다.
실시예 5
독성 폴리머 단독
독성 분석법
CHO-GFP 및 A549 세포를 1x104에 씨드하고 Huh7 세포를 삼중으로 96-웰 조직 배양판에서 2x104 세포로 씨드하고 5% CO2로 37℃에서 밤새 성장시켰다.
연속적으로 희석된 폴리머 재료를 각 샘플에 대해 96웰 배양판에서 3웰에 첨가하고 200㎕ 표준 배지에서 37℃에서 72h 동안 배양하였다. 제조사 지시에 따라 독성을 알마 블루 시약(Invitrogen, USA)을 사용하여 측정하였다. 간단하게 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하고 10% 알마 블루 시약을 포함하는 100㎕의 표준 배지로 교체하였고, 그런 후에 세포들을 5% CO2로 37℃에서 4h 동안 배양하였다. 분석을 540nm와 620nm에서 EL808 흡수도 미세판 리더(BIOTEK, USA)에서 읽었다. 세포 생존가능성을 540nm 측정값으로부터 620nm 측정값을 뺌으로써 측정하였다. 얻은 데이터는 마이크로소프트 엑셀로 분석하였다. 결과는 미처리된 세포들의 백분율로 제공되며 제공된 데이터는 삼중의 3개의 개별 실험을 나타낸다.
CHO-GFP 및 A549 세포를 1x104에 씨드하고 Huh7 세포를 삼중으로 96-웰 조직 배양판에서 2x104 세포로 씨드하고 5% CO2로 37℃에서 밤새 성장시켰다. 양성 및 음성 대조군의 경우, siRNA를 제조사의 지시에 따라 리포펙타민 2000(Invitrogen, USA)을 사용하여 세포 속에 감염시켰다. 간략하게, 10picomole의 관련 siRNA를 50㎕ OPTI-MEM(Invitrogen, USA)에 희석하고 20분 동안 실온에서 배양한 0.1㎕의 리포펙타민 2000과 혼합하였다. siRNA: 리포펙타민 혼합물을 세포에 첨가하고 4h 동안 배양하였다. 세포 배지를 교체하고 72h 동안 배양하였다.
폴리머/siRNA 복합체의 경우 세포 배지를 제거하고 200㎕ OPTI-MEM로 교체하였다. 폴리머/siRNA 복합체를 상기한 대로 제조하고 세포 속에 첨가하고 4h 동안 배양하고, 배지를 표준 성장 배지로 교체하고 추가 72h 동안 배양하였다. 독성을 상기한 대로 알마 블루 분석법을 사용하여 측정하였다. 얻은 데이터는 마이크로소프트 엑셀로 분석하였다. 결과는 미처리된 세포들의 백분율로 제공되며 제공된 데이터는 삼중의 3개의 개별 실험을 나타낸다.
폴리머 농도(폴리머 단독)의 함수로서 세포 생존가능성은 도 9에서 세포주 Huh7, A549 및 CHO-GFP에 대해 예시되는 반면, 도 10은 동일한 3개 세포주에서 폴리머/siRNA 복합체의 세포 생존가능성을 도시한다.
실시예 6
siRNA 침묵 CHO - GFP
CHO-GFP 세포를 삼중으로 96-웰 조직 배양판에서 1x104 세포로 씨드하고 5% CO2로 37℃에서 밤새 성장시켰다. 양성 및 음성 대조군의 경우, siRNA를 제조사의 지시에 따라 리포펙타민 2000(L2)(Invitrogen, USA)을 사용하여 세포 속에 형질감염시켰다. 간략하게, 10picomole의 관련 siRNA를 50㎕ OPTI-MEM(Invitrogen, USA)에 희석하고 20분 동안 실온에서 배양한 0.1㎕의 리포펙타민 2000과 혼합하였다. siRNA: 리포펙타민 혼합물을 세포에 첨가하고 4h 동안 배양하였다. 세포 배지를 교체하고 72h 동안 배양하였다.
폴리머/siRNA 복합체의 경우 세포 배지를 제거하고 200㎕ OPTI-MEM로 교체하였다. 폴리머/siRNA 복합체를 상기한 대로 제조하고 세포 속에 첨가하고 4h 동안 배양하고, 배지를 표준 성장 배지로 교체하고 추가 72h 동안 배양하였다.
배양 72시간 후 CHO-GFP 세포를 함유하는 96웰 플레이트를 PBSA로 세척하고 GFP 형광을 516nm에서 시너지(Synergy), HT(USA)에서 분석하였다. 얻은 데이터는 마이크로소프트 엑셀로 분석하였다. 결과는 폴리머/비-특이적 침묵 DNA 복합체의 백분율로 제공되며 제공된 데이터는 삼중의 3개의 개별 실험을 나타낸다.
도 11은 실시예 1에서 제조된 믹토-암 폴리머에 의한 녹색 형광 단백질(GFP)을 생산하는데 원인이 되는 유전자의 침묵을 예시한다(표 2).
다른 세포주 침묵
A549 세포를 1x104에 씨드하고 Huh7 세포를 삼중으로 96-웰 조직 배양판에서 2x104 세포/웰에 씨드하고 5% CO2로 37℃에서 밤새 성장시켰다. 양성 및 음성 대조군의 경우, siRNA를 제조사의 지시에 따라 리포펙타민 2000(L2)(Invitrogen, USA)을 사용하여 세포 속에 감염시켰다. 간략하게, 10picomole의 관련 siRNA를 50㎕ OPTI-MEM(Invitrogen, USA)에 희석하고 20분 동안 실온에서 배양한 0.1㎕의 리포펙타민 2000과 혼합하였다. siRNA: 리포펙타민 혼합물을 세포에 첨가하고 4h 동안 배양하였다. 세포 배지를 교체하고 72h 동안 배양하였다.
폴리머/siRNA 복합체의 경우 세포 배지를 제거하고 200㎕ OPTI-MEM로 교체하였다. 폴리머/siRNA 복합체를 상기한 대로 제조하고 세포 속에 첨가하고 4h 동안 배양하고, 배지를 표준 성장 배지로 교체하고 추가 72h 동안 배양하였다. COPA는 필수 유전자이기 때문에, 침묵은 상기한 대로 알마 블루 분석법을 사용하여 측정하였다. 얻은 데이터는 마이크로소프트 엑셀로 분석하였다. 결과는 미처리된 세포들의 백분율로 제공되며 제공된 데이터는 삼중의 3개의 개별 실험을 나타낸다.
도 12는 Huh7 및 A549 세포에서 COPA 침묵을 예시한다.
실시예 7
암 약물 SN38의 전달
RAFT 물질에 공유결합된 SN38을 가진 폴리머를 SN38을 전달하는 능력에 대해 테스트하였다. A549 세포를 1x104에 씨드하고 Huh7 세포를 삼중으로 96-웰 조직 배양판에서 2x104 세포/웰에 씨드하고 5% CO2로 37℃에서 밤새 성장시켰다. 폴리머 농도는 10, 1, 0.1 또는 0.01μM SN38을 전달하도록 계산되었다. 이들을 각 샘플에 대한 96웰 배양판에서 3웰에 첨가하고 200㎕ 표준 배지에서 37℃에서 72h 동안 배양하였다. 제조사 지시에 따라 독성을 알마 블루 시약(Invitrogen, USA)을 사용하여 측정하였다. 간단하게 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하고 10% 알마 블루 시약을 포함하는 100㎕의 표준 배지로 교체하였고, 그런 후에 세포들을 5% CO2로 37℃에서 4h 동안 배양하였다. 분석을 540nm와 620nm에서 EL808 흡수도 미세판 리더(BIOTEK, USA)에서 읽었다. 세포 생존가능성을 540nm 측정값으로부터 620nm 측정값을 뺌으로써 측정하였다. 얻은 데이터는 마이크로소프트 엑셀로 분석하였다. 결과는 미처리된 세포들의 백분율로 제공되며 제공된 데이터는 삼중의 3개의 개별 실험을 나타낸다. 결과는 도 13에 요약된다.
실시예 8
폴리머/si22-FAM 복합체(50pmol)를 [6FAM]표지화 si22를 사용하여 상기한 대로 결합하고 공초점 현미경 하에서 검사에 사용하였다.
공초점 현미경: Huh7 세포를 24웰 플레이트(Nunc, USA)에서 13mm 둥근 유리 커버슬립(Menzel, Germany) 상의 1x105 세포로 씨드하고 5% CO2로 37℃에서 밤새 성장시켰다. 양의 대조군의 경우 [6FAM]표지화 si22를 하기한 대로 제조사의 지시에 따라 리포텍타민 2000(Invitrogen, USA)을 사용하여 세포 속에 형질감염시켰다. 폴리머 및 표지화 siRNA 복합체를 상기한 대로 생산하고 5h 동안 세포에 첨가하였다. 공초점 현미경을 위한 세포를 처리하기 위해서, 세포를 PBS에 세척하고 1시간 동안 PBS에서 4% 파라포름알데하이드(Sigma, USA)에 고정하였다. 세포를 가진 커버슬립을 벡타쉴드에서 슬라이드 상에 장착하였다(Vector Laboratories, USA). Leica SP5 공초점 현미경 상에서 이미지를 얻었다(Leica Microsystems, Germany). 도 14는 공초점 현미경에 의해 조사한 대로 표지화 폴리머 및 FAM-표지화 siRNA의 흡수를 나타낸다.
실시예 9
블럭 코폴리머 암을 가진 4-암 스타의 제조(WO 2013/113071에 따른 비교예):
방법.
블럭 코폴리머로 제조된 4암 스타의 범위를 얻기 위한 N,N-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트(DMAEMA) 및 올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에터 메타크릴레이트(OEGMA475, 모노머는 WO 2013/113071에 약술된 방법에 따라 RAFT 중합을 통해 중합하였다).
RAFT 중합을 사용하여 제조된 스타 블럭 코폴리머의 분자량, 분산성 및 조성물
폴리머 코드 Mn(kDa) 분산성 Mn(NMR)
(kDa)		 조성물
A:B 또는 C*
/암		 블럭
TL38 PF 30.4 1.22 45.2 24:16 ABA
TL85 PF 26.6 1.35 39.2 24:16 ACA
*A: DMAEMA; B: OEGMA475; C:OEGMA475-BMA-DMAEMA(73.2:20:6.8)
CHO 세포에서 GFP의 침묵은 실시예 4와 동일한 방법에 의해 실행하였다.
침묵 데이터는 도 15에 제공되며, 샘플 TL38-50(50% 4차화), TL38-100(100% 4차화), TL84(100% 4차화, 폴리플루오레를 갖지 않음) 및 TL85(100% 4차화, 폴리플루오레를 가짐). TL-38 폴리머는 WO2013/113071에 기술된 것과 유사한 방법을 사용하여 제조된 4-암 스타를 나타낸다. TL-84는, 4-암 스타에서 암이 양이온성, 친수성 및 소수성 단편을 함유하였다는 것을 제외하고, 유사하게 제조하였다. 도 15의 결과는 스타의 암이 구조가 동일할 때, 본 발명에 따른 3개의 호모폴리머 암을 나타내는 단편을 가짐에도 불구하고, 침묵 결과는 믹토-암 폴리머에 대해 관찰된 것보다 떨어진다(비교를 위해 도 11에서 S4-1 참조).
실시예 10
이 동물 실험에 사용된 믹토-암 폴리머 S4-1 및 S4-10은 각각 실시예 1과 실시예 3에 개시된 것이다.
2, 4 및 6의 N/P 비에서 siRNA를 가진 S4-1의 제타 전위는 632.8nm에서 작동하는 22mW He-Ne 레이저를 구비한 맬번 장치 제타사이저 나노시리즈 DLS 탐지기, 고 양자 효율을 가진 애발런차(alvalanche) 포토다이오드 탐지기 및 ALV/LSE-5003 멀티 디지털 상관기 전자 시스템에서 37℃에서 측정하였다. 24.2uL의 믹토-암 폴리머 S4-1(4ug/uL)를 42uL의 물과 5uL GFP siRNA(10ug/uL)에 첨가하였다. 이 혼합물을 환류하여 나노입자의 자발적 형성을 초래하였다. 용액을 실온에서 2시간 동안 평형에 도달하게 하고 측정 직전에 10mM NaCl로 1mL로 희석하였다. 각각 2, 4 및 6의 N/P 비를 가진 나노입자의 제타 전위는 11.6, 29.7 및 30.8이었다.
C57/BLK6 생쥐를 동물 윤리 위원회(AEC) 승인에 따라 호주 동물 건강 연구(AAHL)의 소형 동물 시설로부터 얻었다.
100㎕ PBS 또는 PBS 속 100㎕ 치료제의 꼬리 정맥에 의한 정맥 주사 이틀 전에 생쥐를 계량하였다.
치료 그룹은 다음으로 이루어졌다:
그룹 1 대조군: 6 마리 PBS 대조군 동물.
그룹 2 폴리머 1 - 3: 3㎍/g 생쥐 체중 형광 믹토 스타(S4-10)/PBS 속 ssB mRNA 표적화 siRNA로 처리된 6 마리 동물
그룹 3 폴리머 2 - 3: 3㎍/g 생쥐 체중 믹토 스타(S4-1)/PBS 속 ssB mRNA 표적화 siRNA로 처리된 6 마리 동물
그룹 4 폴리머 3 - 9: 9㎍/g 생쥐 체중 형광 믹토 스타(S4-10)/PBS 속 ssB mRNA 표적화 siRNA로 처리된 6 마리 동물
그룹 5 폴리머 1 - 9: 9㎍/g 생쥐 체중 믹토 스타(S4-1)/PBS 속 ssB mRNA 표적화 siRNA로 처리된 6 마리 동물
48h 후 생쥐를 안락사하고, 폐, 비장, 간 및 신장 조직을 RNA 추출을 위해 수집하였다. 제조사 지시에 따라 프로메가 심플리 RNA 조직 키트를 사용하여 10mg의 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 정량적 실시간 PCR을 제조사 지시에 따라 어플라이드 바이오시스템 태그만 분석법을 사용하여 표적 유전자 쇼그렌 증후군 형태 B 항원(ssB)(TaqMan® Gene Expression Assay, SM Catalog #: 4331182 Assay ID: Mm00447374_m1 Gene. Symbol: Ssb, mCG12976) 및 하우스 키핑 유전자 GAPDH(TaqMan® Gene Expression Assay, SM Catalog #: 4331182 Assay ID: Mm99999915_g1 Gene Symbol; Gapdh)에 대해 실행하였다. 데이터를 PBS 대조군 동물에 대한 ssB 발현에서 배수 변화로서 분석하였다. 결과는 도 16에 도시된다.
실시예 11
모노머의 공급사, 모노머 및 폴리머를 기술하는 약어 및 본 실시예에서 기술된 막토-암 폴리머의 합성에 사용된 다른 재료는 실시예 1에 기술된다.
p(BMA) 함유량(TL8-1,2,3,4), 분자량(TL8-5,6)의 효과 및 믹토-암(TL8-7,8,9)의 코어를 제조하는데 사용된 모노머의 형태를 조사하기 위한 믹토-암 폴리머의 합성
암 제 1 방법에 의한 믹토 -암 폴리머의 합성
1) OEGMA8 -9, DMAEMA 및 n-BMA 텔레킬릭(telechelic) 매크로 RAFT 물질의 호모폴리머의 합성 및 특징묘사
전형적인 중합 실험에서, 6g의 OEGMA8 -9 모노머(1.264 x 10- 2 mol), 7.716 x 10-3g의 VAZO-88 개시제(3.159 x 10-5mol), 0.12748g의 DTTCP 물질(5)(3.154 x 10-4mol) 및 5.1063g의 DMF를 쉬링크 플라스크 속에 계량하였다. 용액 혼합물을 4회 동결-제거-해동 사이클로 탈기하고 4시간 동안 90℃에서 중합하였다.
모노머 대 폴리머 전환율은 (CDCl3에서) 1H-NMR에 의해 측정한 대로 84%이었다. 전환율은 형성된 폴리머의 COOCH2(4.1ppm)의 적분을 미-반응 모노머의 COOCH2(4.3ppm)의 적분과 비교함으로써 계산하였다. 1H-NMR을 기초로 계산한 폴리머의 분자량은 33.6의 중합도에 해당하는 16.4kDa이었다. 직선형 폴리스티렌 표준에 대한 겔 투과 크로마토그래피(GPC)로 측정한 대로 폴리머의 수평균 분자량(Mn)은 15.8kDa(1.27의 분산성)이었다. 결과는 표 6에 요약된다.
얻은 폴리머는 농축하고, 요오드화메틸로 4차화하고 투석하였다. 회수된 폴리머를 동결건조하였다.
OEGMA8 -9, DMAEMA 및 n-BMA 텔레킬릭(telechelic) 매크로 RAFT 물질의 믹토-암 호모폴리머의 분자량
표제 폴리머
조성물		 시간
[h]		 전환율a)
[%]		 M n b)
(Theo)		 M n c)
(GPC)		 D c)
(GPC)
M-RAFT 1 P(OEGMA8-9) 4 84 16,363 15,817 1.27
M-RAFT 2 P(DMAEMA) 6 81.3 15,811 15,484 1.25
M-RAFT 3 PIn-BMA) 8 79 15,008 13,959 1.15
a) 모노머 전환율은 1H NMR로부터 계산하였다; b) M n(Theo)는 모노머 전환율로부터 계산하였다; c) M n(GPC) 및 D(GPC)는 폴리스티렌 표준을 사용하여 DMAc GPC로부터 얻었다.
2) 믹토-암 폴리머의 합성 및 특징묘사
믹토-암 폴리머의 합성에 대한 전형적인 절차는 다음과 같다:
DMF 속 Vazo88(1.0 wt.%), P(OEGMA8 -9) (30.0 wt.%), P(DMAEMA) (30.0 wt.%), P(n-BMA) (30.0 wt.%), DSDMA (20.0 wt.%)의 원료 용액을 플라스크에 제조하였다. 각 모노머([모노머]:[폴리머]= 6:1)의 특정량을 각각 폴리머 용액에 첨가하였다. Vazo88 용액(247.3mg), P(OEGMA8 -9) 용액(539mg), P(DMAEMA) 용액(517mg), P(n-BMA) 용액(492mg), DSDMA 용액(528.9mg) 및 DMF(18mg)의 혼합물을 플라스크에서 제조하였다. 원료 용액을 3회 반복 동결-제거-해동 사이클로 탈기하고 진공하에서 밀봉한 앰풀에 옮겼다. 앰풀을 20h 동안 90℃에서 가열하였다.
6개 스타 폴리머를 이런 절차에 따라 제조하였고 표 7은 사용된 각 호모폴리머 매크로 RAFT 물질과 다른 시약뿐만 아니라 GPC 분석을 기초로 한 믹토-암 폴리머 분자량의 상대량 및 믹토-암 폴리머 및 분해된 믹토-암 폴리머의 분자량을 요약한다.
실시예 1에 기술된 절차에 따라 제조된 믹토-암 스타 폴리머에 대한 조성물, 중합 시간, 모노머 및 암 전환율 및 분자량 데이터(PMMA 표준을 사용하는 DMAc)의 요약
코드 조성물 암 Mn [DSDMA]
/[M-CTA] 		M- CTA 비 암
전환율 a 		Mn
(스타) b 		PDI Mn
(분해된 스타) PD
TL8-1 POEGMA-PQDMAEMA-PBMA 스타 15k/15k/15k 12 3/3/3 78.2 154k 1.36 22.6k
1.39
TL8-2 POEGMA-PQDMAEMA-
PBMA 스타		 15k/15k/15k 12 3/3/1 72.7 157k 1.44 22.4k
1.47
TL8-3 POEGMA-PQDMAEMA-
PBMA 스타		 15k/15k/15k 12 3/3/5 77.4 151k 1.42 22.6k
1.47
TL8-4 POEGMA-PQDMAEMA-
PBMA 스타		 15k/15k 12 3/3 70.9 168k 1.52 22.9k
1.5
TL8-5 POEGMA-PQDMAEMA-
PBMA 스타		 15k/15k/15k 12 3/3/9 81.8 218k 1.13 19.2k
1.53
TL8-6 POEGMA-PQDMAEMA-
PBMA 스타		 15k/15k/30k 12 3/3/1.5 54.4 260k 1.24 21.6k
1.66
TL8-7 POEGMA-PQDMAEMA-
PBMA 스타		 15k/15k/15k 12 3/3/3
c 		68 68k 1.47 24.9k
1.63
TL8-8 POEGMA-PQDMAEMA-
PBMA 스타		 15k/15k/15k 12 3/3/3
d 		75 206k 1.52 21.6k
1.48
TL8-9 POEGMA-PQDMAEMA-
PBMA 스타		 15k/15k/15k 12 3/3/3
e 		77.3 226k 1.65 23.2k
1.49
a) 암 전환율은 암 전환율 = 면적스타 / (면적스타 + 면적매크로 -RAFT)로서 GPC 흔적으로부터 계산하였다; b) Mn(GPC) 및 D(GPC)를 PMMA 표준을 사용하여 DMAc GPc로부터 얻었다; c) 코어 모노머는 단지 OEGMA이었다; d) 코어 모노머는 단지 DMAEMA이었다; e) 코어 모노머는 단지 n-BMA이었다.
믹토-암 스타 폴리머의 4차화:
믹토-암 스타 폴리머의 P(DMAEMA) 암의 3차 아미노기를 4차화하기 위해서, 상기 스타의 원료 용액을 DMF로 희석하고, 과량의 MeI를 용액에 첨가하고 실온에서 16h 동안 교반하였다. 마지막으로, 과량의 MeI를 회전 증발기에서 제거하고; DMF를 4일 동안 물에 대한 스타 폴리머의 투석으로 제거하였다(분자량 막 컷오프 25,000Da). 4차화 P(DMAEMA)를 함유하는 스타 폴리머를 동결 건조 후 얻었다. 도 6은 4차화 폴리머의 1H-NMR 스펙트럼을 도시한다.
트라이부틸포스핀을 사용하는 믹토 -암 스타 폴리머의 환원성 분해
코어에 이황화 결합을 함유하는 믹토-암 폴리머(5mg)를 20mg 트라이부틸포스핀을 함유하는 1mL의 DMAc에 용해하였다. 용액을 GPC 분석 전에 30분 동안 질소 분위기하에서 실온에서 교반하였다. 도 3(IV)은 스타 폴리머 및 분해 폴리머를 도시하여 GPC 흔적 및 암의 분자량과 필적할만한 분자량을 가진 저분자량 폴리머를 생산하기 위한 가교 코어의 분해를 입증한다.
본 명세서 및 다음 청구항 전체에서, 내용이 다른 것을 요구하지 않는 한, 단어 포함한다("comprise") 및 이의 변형("comprises" 및 "comprising")은 상기한 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹을 포함하는 것을 의미하나 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수들 또는 단계들의 그룹을 배제하지 않는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 임의의 종래 공개공보(또는 이로부터 유래된 정보) 또는 공지된 임의의 내용에 대한 참조는 종래 공개공보(또는 이로부터 유래된 정보) 또는 공지된 내용이 본 명세서와 관련된 시도의 분야에서 공통의 일반적인 지식의 일부를 구성한다는 인정 또는 허가 또는 임의의 형태의 암시가 아니며 이로 해석돼서도 안 된다.

Claims (20)

  1. 지지 모이어티 및 지지 모이어티에 각각 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하는 믹토-암 가지형 폴리머로서, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함하는 믹토-암 가지형 폴리머.
  2. 제 1 항에 있어서,
    적어도 3개의 호모폴리머 사슬의 하나 이상은 분해성 작용기를 통해 지지 모이어티에 공유결합된 가지형 폴리머.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    지지 모이어티에 공유결합된 하나 초과의 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 또는 소수성 호모폴리머 사슬을 가지는 가지형 폴리머.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    스타 폴리머 형태인 가지형 폴리머.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    지지 모이어티는 가교 폴리머 지지 모이어티 형태인 가지형 폴리머.
  6. 제 5 항에 있어서,
    가교 폴리머 지지 모이어티는 다이설파이드 다이메타크릴레이트, 에틸렌 글리콜 다이(메타)아크릴레이트, 트라이에틸렌 글리콜 다이(메타)아크릴레이트, 테트라에틸렌 글리콜 다이(메타)아크릴레이트, 1,3-부틸렌 글리콜 다이(메타)아크릴레이트, 트라이메틸올프로페인 트라이(메타)아크릴레이트, 1,4-부테인다이올 다이(메타)아크릴레이트, 네오펜틸 글리콜 다이(메타)아크릴레이트, 1,6-헥세인다이올 다이(메타)아크릴레이트, 1,6-헥세인다이올 에톡실화 다이아크릴레이트(HEDA), 펜타에리트리톨 다이(메타)아크릴레이트, 펜타에리트리톨 트라이(메타)아크릴레이트, 펜타에리트리톨 테트라(메타)아크릴레이트, 글리세롤 다이(메타)아크릴레이트, 글리세롤 알릴옥시 다이(메타)아크릴레이트, 1,1,1-트리스(하이드록시메틸)에테인 다이(메타)아크릴레이트, 1,1,1-트리스(하이드록시메틸)에테인 트라이(메타)아크릴레이트, 1,1,1-트리스(하이드록시메틸)프로페인 다이(메타)아크릴레이트, 1,1,1-트리스(하이드록시메틸)프로페인 트라이(메타)아크릴레이트, 트라이알릴 시아누레이트, 트라이알릴 아이소시아누레이트, 트라이알릴 트라이멜리테이트, 다이알릴 프탈레이트, 다이알릴 테레프탈레이트, 다이바이닐 벤젠, 메틸올(메타)아크릴아마이드, 트라이알릴아민, 올레일 말레이트, 글리세릴 프로폭시 트라이아크릴레이트, 알릴 메타아크릴레이트, 메타크릴산 무수물, 메틸렌비스(메타)아크릴아마이드, 부트-2-엔-1,4-다이아크릴레이트, 비스페놀 A 에톡실화 다이아크릴레이트, N,N'-비스(아크릴오일)시스탄이민, 다이바이닐 아디페이트, 4,4'-다이바이닐바이페닐 및 N.N'-메틸렌비스아크릴아마이드로부터 선택된 하나 이상의 다가능 모노머의 중합 잔기를 포함하는 가지형 폴리머.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    양이온성 호모폴리머 사슬은 N,N-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트, N,N-다이에틸아미노에틸 메타크릴레이트, N,N-다이메틸아미노에틸 아크릴레이트, N,N-다이에틸아미노에틸 아크릴레이트, 2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드, N-[3-N,N-다이메틸아미노)프로필]메타크릴아미드, N-(3-아미노프로필)메타크릴아마이드 하이드로클로라이드, N-[3-(N,N-다이메틸아미노)프로필]아크릴아마이드, N-[2-(N,N-다이메틸아미노)에틸]메타크릴아마이드, 2-N-모르폴리노에틸 아크릴레이트, 2-N-모르폴리노에틸 메타크릴레이트, 2-(N,N-다이메틸아미노)에틸 아크릴레이트, 2-(N,N-다이메틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 2-(N,N-다이에틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 2-아크릴옥시에틸트라이메틸암모늄 클로라이드, 메타크릴아미도프로필트라이메틸암모늄 클로라이드, 2-(tert-부틸아미노)에틸 메타크릴레이트, 알릴다이메틸암모늄 클로라이드, 2-(에틸아미노)에틸스티렌, 2-바이닐피리딘 및 4-바이닐피리딘으로부터 선택된 하나 이상의 모노머의 중합 잔기를 포함하며; 친수성 호모폴리머 사슬은 아크릴산, 메타크릴산, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, 하이드록시프로필 메타크릴레이트, 올리고(알킬렌 글리콜)메틸 에터(메타)아크릴레이트(OAG(M)A), 아크릴아마이드 및 메타크릴아마이드, 하이드록시에틸 아크릴레이트, N-메틸아크릴아마이드, N,N-다이메틸아크릴아마이드, N,N-다이메틸아미노에틸 메타크릴레이트, N,N-다이메틸아미노프로필 메타크릴아마이드, N-하이드록시프로필 메타크릴아마이드, 4-아크릴로일모르폴린, 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로페인설폰산, 포스포릴콜린 메타크릴레이트 및 N-바이닐 피롤리돈으로부터 선택된 하나 이상의 모노머의 중합 잔기를 포함하며; 소수성 호모폴리머 사슬은 스티렌, 알파-메틸 스티렌, 부틸 아크릴레이트, 부틸 메타크릴레이트, 아밀 메타크릴레이트, 헥실 메타크릴레이트, 라우릴 메타크릴레이트, 스테아릴 메타크릴레이트, 에틸 헥실 메타크릴레이트, 크로틸 메타크릴레이트, 시남일 메타크릴레이트, 올레일 메타크릴레이트, 리시놀레일 메타크릴레이트, 콜레스테릴 메타크릴레이트, 콜레스테릴 아크릴레이트, 바이닐 부티레이트, 바이닐 tert-부티레이트, 바이닐 스테아레이트 및 바이닐 라우레이트로부터 선택된 하나 이상의 모노머의 중합 잔기를 포함하는 가지형 폴리머.
  8. 지지 모이어티 및 모이어티에 각각 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하는 믹토-암 가지형 폴리머를 제조하는 방법으로서, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함하며, 상기 방법은
    (i) 각각 결합된 리빙 중합 모이어티를 가지는 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 제공하는 단계; 및
    (ii) 리빙 중합 모이어티의 제어하에서 하나 이상의 다중-에틸렌 불포화 모노머를 중합하여 양이온성, 친수성 및 소수성 호모폴리머 사슬의 각각이 공유결합된 가교 폴리머 지지 모이어티를 형성하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 믹토-암 가지형 폴리머 및 핵산 분자를 포함하는 복합체로서, 가지형 폴리머는 지지 모이어티 및 모이어티에 각각 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함하는 복합체.
  10. 제 9 항에 있어서,
    적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 약 10 내지 약 200개 모노머 잔기 단위를 포함하는 양이온성 호모폴리머 사슬을 포함하는 복합체.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서,
    적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 약 10 내지 약 150개 모노머 잔기 단위를 포함하는 친수성 호모폴리머 사슬을 포함하는 복합체.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 약 15 내지 약 150개 모노머 잔기 단위를 포함하는 소수성 호모폴리머 사슬을 포함하는 복합체.
  13. 제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    약 10mV 내지 약 40mV 범위의 제타 포텐셜을 가진 복합체.
  14. 제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 분자는 gDNA, cDNA, 이중 또는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드, 센스 RNAs, 안티센스 RNAs, mRNAs, tRNAs, rRNAs, 소형/짧은 간섭 RNAs(siRNAs), 이중-가닥 RNAs(dsRNA), 짧은 헤어핀 RNAs(shRNAs), piwi-상호작용 RNAs(PiRNA), 마이크로 RNA/소형 템포랄 RNA(miRNA/stRNA), 소형 핵 RNAs(SnoRNAs), 소형 핵(SnRNAs) 리보자임, 압타머, DNAzymes, 리보뉴클레아제-형태 복합체, 헤어핀 이중 가닥 RNA(hairpin dsRNA), 공간 성장을 매개하는 miRNAs(sdRNAs), 스트레스 반응 RNA(srRNA), 세포 주기 RNA(ccRNAs) 및 이중 또는 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드로부터 선택되는 복합체.
  15. 세포에 핵산 분자를 전달하는 방법으로서,
    (a) 믹토-암 가지형 폴리머 및 핵산 분자를 포함하는 복합체를 제공하는 단계, 가지형 폴리머는 지지 모이어티 및 모이어티에 각각 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함한다; 및
    (b) 복합체를 세포에 전달하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 유전자 발현을 침묵시키는 방법으로서, 믹토-암 가지형 폴리머 및 핵산 분자를 포함하는 복합체로 세포를 형질감염시키는 단계를 포함하며, 가지형 폴리머는 지지 모이어티 및 모이어티에 각각 공유결합되고 이로부터 연장되는 적어도 3개의 호모폴리머 사슬을 포함하며, 적어도 3개의 호모폴리머 사슬은 양이온성 호모폴리머 사슬, 친수성 호모폴리머 사슬 및 소수성 호모폴리머 사슬을 포함하는 방법.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서,
    인 비보로 실행되는 방법.
  18. 제 15 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    가지형 폴리머는 스타 폴리머 형태인 방법.
  19. 제 15 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 3개의 호모폴리머 사슬의 적어도 하나는 표적 리간드, 조영제, 생활성제 또는 이의 조합과 컨쥬케이트되는 방법.
  20. 제 15 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    복합체는 대상에게 투여되는 방법.
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