JP2017500390A - ミクトアーム分岐ポリマー - Google Patents
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Abstract
Description
(a)分岐ポリマーと核酸分子とを含む複合体を提供することと、
(b)該複合体を細胞に送達することとを含み、
分岐ポリマーは支持部分と、それぞれその部分に共有結合しており、且つその部分から伸びる少なくとも3つのホモポリマー鎖とを含み、少なくとも3つのホモポリマー鎖には、カチオン性ホモポリマー鎖、親水性ホモポリマー鎖、及び疎水性ホモポリマー鎖が含まれる。
U及びWは独立して−CO2H、−CO2R1、−COR1、−CSR1、−CSOR1、−COSR1、−CONH2、−CONHR1、−CONR1 2、水素、ハロゲン及び置換されていてもよいC1−C4アルキルから選択され、又はU及びWは一緒に、それ自体置換されていてもよいラクトン、無水物若しくはイミドの環を形成し、ここで、任意の置換基はヒドロキシ、−CO2H、−CO2R1、−COR1、−CSR1、−CSOR1、−COSR1、−CN、−CONH2、−CONHR1、−CONR1 2、−OR1、−SR1、−O2CR1、−SCOR1、及び−OCSR1から独立して選択され;
Vは、水素、R1、−CO2H、−CO2R1、−COR1、−CSR1、−CSOR1、−COSR1、−CONH2、−CONHR1、−CONR1 2、−OR1、−SR1、−O2CR1、−SCOR1、及び−OCSR1から選択され;
R1又は各R1は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいアリール、置換されていてもよいヘテロアリール、置換されていてもよいカルボシクリル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリールアルキル、置換されていてもよいヘテロアリールアルキル、置換されていてもよいアルキルアリール、置換されていてもよいアルキルヘテロアリール、及び置換されていてもよいポリマー鎖から独立して選択される。
(i)各ホモポリマー鎖がそれに共有結合しているリビング重合部分を有するカチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性ホモポリマー鎖とを提供することと、
(ii)カチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性ホモポリマー鎖のそれぞれが共有結合される架橋ポリマーの支持部分を形成するようにリビング重合部分の制御下で1以上の多エチレン性不飽和モノマーを重合することとを含む。
(a)分岐ポリマーと核酸分子を含む複合体を提供することと、
(b)該複合体を細胞に送達することとを含み、
分岐ポリマーは支持部分と、その部分に共有結合しており、且つその部分から伸びる少なくとも3つのホモポリマー鎖とを含み、少なくとも3つのホモポリマー鎖はカチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性のホモポリマー鎖とを含む。
材料
オリゴ(エチレングリコール)メタクリレート(OEGMA8−9、Mn〜475g.mol−1)、N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート(DMAEMA)、n−ブチルメタクリレート(n−BMA)のモノマー及びエチレングリコールジメタクリレート(EGDMA)架橋剤はAldrichから購入し、使用前30分間、ヒドロキノン又はヒドロキノンモノメチルエーテル(Aldrich)のための阻害剤/除去剤の存在下で撹拌することによって精製した。4−シアノ−4−[(ドデシルスルファニルチオカルボニル)スルファニル]ペンタン酸(DTTCP)RAFT剤(G.Moad,Y.K.Chong,A.Postma,E.Rizzardo,S.H.Thang,Polymer2005,46,8458)[1]、ジスルフィドジメタクリレート(DSDMA)架橋剤(J.Rosselgong,S.P.Armes,W.Barton,D.Price,Macromolecules,2009,42,5919)[2]は公開された文献に従って調製した。1,1’−アゾビス(シクロヘキサンカルボニトリル)(ACCN又はVAZO−88,DuPont)開始剤、トリブチルホスフィン(Bu3P,Aldrich)還元剤は受け取ったとおりに使用した。N,N−ジメチルホルムアミド(DMF)、ジクロロメタン(DCM)、n−ヘキサン、n−ヘプタン、ジイソプロピルエーテル、メタノール及び他の化学物質は市販の試薬であり、さらに精製することなく使用した。
プロトン核磁気共鳴(1H−NMR)スペクトルはBruker Advance400MHz分光光度計(1H−400MHz)によって得た。ゲル透過クロマトグラフィ(GPC)測定は、CMB−20Aコントローラシステム、SIL−20A HT自動試料採取器、LC−20AT直列ポンプシステム、DGU−20A脱気ユニット、CTO−20ACカラムオーブン、RDI−10A屈折率検出器を備え、4×Waters Styragelカラム(100〜4000000の有効なモル質量範囲を提供する各300mm×7.8mmのHT2,HT3,HT4,HT5)を備えたShimadzuシステムにて行ったが、80℃にて1mL/分の流速で溶出液としてN,N−ジメチルアセトアミド(DMAc)(2.1g/Lの塩化リチウム(LiCl)と共に)を使用する。試料のモル質量は、低い多分散指数値のポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)標品(Polymer Laboratories)によって構築された較正曲線から得た。三次多項式を用いてlogMp対時間の較正曲線を当て嵌めたが、それはモル質量の範囲を横切る線形だった。動的光散乱(DLS)実験は、633nmで作動する4mWのHeNeレーザー、高量子効率のアバランシェ光ダイオード検出器及びALV/LSE−5003多重τデジタル相関器電子システムを備えたMalvern Instrumentsのゼータサイザーナノシリーズ機器を用いて実施した。水性光散乱試験は、10mMのNaClのバックグランド電解質と共に1mg/mLの星型ポリマー水溶液で実施した。
Schraderら,Chem.Eur.J.2007,13,7701−7707による公開された文献に従ってジクロロメタン:n−ヘキサン(1:1)溶媒混合物における再結晶化の後、84.8%の収率で、表題のダンシルRAFT剤を作製するための前駆体、ダンシルエチレンジアミン(又は2−ダンシルアミノエチルアミン)(1)を調製した。
[重合の動的プロトコール]別々の重合実験を行うことによってOEGMA8−9とDMAEMAとBMAとの重合比率を確定したが、使用した基本手順を以下に要約する:
VAZO−88(25mg)のDMF(2.5g)ストック溶液Iをフラスコで調製した。DTTCP(106mg)とOEGMA8−9(5.0g)とストック溶液I(643mg)とDMF(4.5g)の混合物を第2のフラスコで調製した。凍結/排気/融解の3回のサイクルによって脱気し、真空下で密封した5つのアンプルにこのストック溶液のアリコート(1.0g)を移した。アンプルを特定の時間90℃に加熱し、次いでGPC及び1H−NMRの解析に供した。図3は、時間及びモノマーの変換、並びにポリマーの分散に関する3つのモノマーについてのポリマー分子量の成長を説明する。調製された3つのポリマーのGPCトレースを図3(I)に示し、GPCからの分子量の結果及びポリマーの多分散度Dを表1に示す。
ACCN(1.0重量%)、P(OEGMA8−9)(30.0重量%)、P(DMAEMA)(30.1重量%)、P(n−BMA)(27.3重量%)、DSDMA(20.0 重量%)のDMFストック溶液をフラスコにて調製した。特定の量の各モノマー([モノマー]:[ポリマー]=6:1)をそれぞれポリマー溶液に加えた。ACCN溶液(73mg)、P(OEGMA8−9)溶液(129mg)、P(DMAEMA)溶液(127mg)、P(n−BMA)溶液(120mg)、DSDMA溶液(146mg)及びDMF(127mg)の混合物をフラスコにて調製した。3回の凍結/排気/融解のサイクルで脱気し、真空下で密封したアンプルにストック溶液を移した。アンプルを90℃で20時間加熱した。
ミクトアーム星型ポリマーのP(DMAEMA)アームの三級アミノ基を四級化するために、上述の星型のストック溶液をDMFで希釈し、次いで過剰なMeIを溶液に加え、室温で16時間撹拌した。最終的に過剰のMeIを回転エバポレータで取り除き;水に対する星型ポリマーの4日間の透析(分子量膜カットオフ25,000Da)によってDMFを取り除いた。凍結乾燥の後、四級化P(DMAEMA)を含有する星型ポリマーを得た。図6は四級化ポリマーの1H−NMRスペクトルを示す。
トリブチルホスフィンを用いたミクトアーム星型ポリマーの還元的切断
20mgのトリブチルホスフィンを含有する1mLのDMAcに、そのコアにジスルフィド結合を含有するミクトアームポリマー(5mg)を溶解した。GPC解析に先立って、窒素雰囲気下で30分間、室温にて溶液を撹拌した。図3(IV)は、星型ポリマーと、アームのそれに匹敵する分子量を持つ低分子量ポリマーを生じる架橋コアの切断を示す分解ポリマーのGPCトレースを示す。
蛍光色素であるローダミンメタクリレートを取り込んでいるS4−1(表2を参照)に類似するミクトアーム星型ポリマーの合成
アームファースト法を用いてPolyFlourを有するミクトアーム星型ポリマーを合成した。
材料及び方法
細胞
緑色蛍光タンパク質を構成的に発現しているチャイニーズハムスターの卵巣細胞(CHO−GFP)(CSIRO,オーストラリア)を、10%ウシ胎児血清、10mMのHEPES、0.01%のペニシリン及び0.01%のストレプトマイシンで補完された改変MEMαにて5%CO2と共に37℃で増殖させ、週に2回継代した。
抗GFP及び陰性対照のsiRNAはQIAGEN(USA)から得た。抗GFPのsiRNAの配列は、センス5’gcaagcugacccugaaguucau3’及びアンチセンス5’gaacuucagggucagcuugccg3’である。DNAオリゴヌクレオチドとして同等の配列を非サイレンシング対照として用いる。
ポリマー/siRNA複合体の形成
ポリマーの50ピコモルのsiRNA又はsiDNAに対する窒素:リン酸(N:P)比を算出した。エッペンドルフチューブへのOPTIMEM培地(Invitrogen、USA)の添加によって複合体を形成した。水に再懸濁した必要な量のポリマーをチューブに加え、混合物をボルテックスで撹拌した。次いで50ピコモルのsi22又はdi22をチューブに加え、試料をボルテックスで撹拌した。室温で1時間、複合体化を継続させた。
50ピコモルのsiRNAを含有する試料をTBEでの2%アガロースゲル上で100Vにて40分間、電気泳動した。カメラ付きUVトランスイルミネータでゲルレッド(Jomar Bioscience)によってsiRNAを視覚化し、GeneSnapプログラム(Syngene,USA)によって画像を記録した。
脱酸素水を用いてTCEP溶液(50mM)を調製し、−20℃で保存した。ポリマー/si22複合体(50ピコモル)を上述のように構築した。これらのポリプレックスをpH5の酢酸ナトリウム緩衝液中で0.3MのNaClの存在下にて50mMのTCEP還元に供した。反応物を37℃で2時間インキュベートし、上述のような2%アガロースゲル上の電気泳動によってsi22の放出について解析した。図8はミクトアーム星型ポリマーS4−1及びS4−5におけるジスルフィド結合の切断を説明する。
毒性ポリマー単独
毒性アッセイ
96穴組織培養プレートにて3つ組でCHO−GFP細胞及びA549細胞を1×104個で播いた一方でHuh7細胞を2×104個で播き、5%CO2と共に37℃で増殖させた。
CHO−GFPをサイレンシングするsiRNA
3つ組にて96穴組織培養プレートに1×104個でCHO−GFP細胞を播き、5%CO2と共に37℃で一晩増殖させた。陽性対照及び陰性対照については、製造元の指示書通りにLipofectoamine2000(L2)(Invitrogen、USA)を用いてsiRNAを細胞に形質移入した。手短には、双方とも50μLのOPTI−MEM(Invitrogen、USA)で希釈して、10ピコモルの関連するsiRNAを0.1μLのLipofectoamine2000と混合し、室温で20分間インキュベートした。siRNA:Lipofectoamine混合物を細胞に加え、4時間インキュベートした。細胞培地を交換し、72時間インキュベートした。
96穴組織培養プレートにて3つ組でA549細胞を1×104細胞/ウェルで播き、Huh7細胞を2×104細胞/ウェルで播いて、5%CO2と共に37℃で一晩増殖させた。陽性対照及び陰性対照については、製造元の指示書通りにLipofectoamine2000(L2)(Invitrogen、USA)を用いてsiRNAを細胞に形質移入した。手短には、双方とも50μLのOPTI−MEM(Invitrogen、USA)で希釈して、10ピコモルの関連するsiRNAを0.1μLのLipofectoamine2000と混合し、室温で20分間インキュベートした。siRNA:Lipofectoamine混合物を細胞に加え、4時間インキュベートした。細胞培地を交換し、72時間インキュベートした。
図12はHuh7細胞及びA549細胞におけるCOPAのサイレンシングを説明する。
抗癌剤SN38の送達
RAFT剤を介して共有結合したSN38を有するポリマーを、SN38を送達する能力について調べた。96穴組織培養プレートにて3つ組でA549細胞を1×104個で播き、Huh7細胞を2×104個で播いて、5%CO2と共に37℃で一晩増殖させた。10、1、0.1、又は0.01μMのSN38を送達するようにポリマーの濃度を算出した。各試料についてこれらを96穴組織培養プレートの3ウェルに加え、200μLの標準培地にて37℃で72時間インキュベートした。製造元の指示書に従ってAlamar Blue試薬(Invitrogen USA)を用いて毒性を測定した。手短には、培地を取り除き、細胞をPBSで洗浄し、10%Alamar Blue試薬を含有する100μLの標準培地で置き換え、次いで細胞を5%CO2と共に37℃で4時間インキュベートした。EL808吸光度マイクロプレートリーダー(BIOTEK、USA)にて540nm及び620nmでアッセイを読み取った。細胞の生存率は540nmでの測定から620nmでの測定を差し引くことによって決定した。得られたデータはマイクロソフトのエクセルで解析した。結果は、未処理の細胞の比率として提示され、提示されたデータは3つ組での3つの別々の実験の代表的なものである。結果を図13にて要約する。
[6FAM]標識したsi22を用いて上述のようにポリマー/si22−FAM複合体(50ピコモル)を構築し、共焦点顕微鏡下での実験に用いた。
ブロックコポリマーのアームを有する4アーム星型の調製(国際公開第2013/113071号に係る比較例)
方法
国際公開第2013/113071号で要点が述べられた方法に従って、RFAT重合を介してN,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート(DMAEMA)及びオリゴ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート(OEGMA475)モノマーを重合して、ブロックコポリマーで構成される様々な4アーム星型を達成した。
サイレンシングのデータは、試料TL38−50(50%四級化)、TL38−100(100%四級化)、TL−84(PolyFluorを有しない100%四級化)、及びTL−85(PolyFluorを有する100%四級化)についてのCHO−GFPのサイレンシングを説明する図15にて提示される。TL−38ポリマーは国際公開第2013/113071号にて記載されたものに類似する方法を用いて調製された4アーム星型を表す。TL−84は、4アーム星型におけるアームがカチオン性、親水性及び疎水性のセグメントを含有することを除いて類似して調製された。図15における結果は、本発明に係る3つのホモポリマーアームを表すセグメントを有するにもかかわらず、星型のアームが構造的に同等である場合、サイレンシングの成績はミクトアームポリマーで見られたものに劣ることを明らかにしている(比較には図11におけるS4−1を参照のこと)。
この動物試験で使用されるミクトアームポリマーS4−1及びS4−10はそれぞれ実施例1及び実施例3で開示されたものだった。
632.8nmで作動する22mWのHe−Neレーザー、高量子効率のアバランシェ光ダイオード検出器及びALV/LSE−5003多重デジタル相関器電子システムを備えるMalvern ZetasizerナノシリーズDLS検出器にて、2、4及び6のN/P比でsiRNAを用いたS4−1のゼータ電位を37℃で測定した。24.2μLのミクトアームポリマーS4−1(4μg/μL)を42μLの水と5μLのGFPsiRNA(10μg/μL)に加えた。この混合物をボルテックスで撹拌したところ、ナノ粒子が自然発生的に形成した。溶液を室温で2時間平衡化させ、測定の直前に10mMのNaClで1mLに希釈した。2、4及び6のN/P比を持つナノ粒子のゼータ電位はそれぞれ、−11.6、29.7及び30.8だった。
グループ1 対照:6匹のPBS対照動物;
グループ2 ポリマー1−3:PBS中での蛍光ミクト星型(S4−10)/ssBのmRNAを標的とするsiRNAのマウスの体重g当たり3μgで処理した6匹の動物;
グループ3 ポリマー2−3:PBS中でのミクト星型(S4−1)/ssBのmRNAを標的とするsiRNAのマウスの体重g当たり3μgで処理した6匹の動物;
グループ4 ポリマー3−9:PBS中での蛍光ミクト星型(S4−10)/ssBのmRNAを標的とするsiRNAのマウスの体重g当たり9μgで処理した6匹の動物;
グループ5 ポリマー1−9:PBS中でのミクト星型(S4−1)/ssBのmRNAを標的とするsiRNAのマウスの体重g当たり9μgで処理した6匹の動物;
から成った。
モノマーの供給業者、この実施例で記載されるミクトアームポリマーの合成で使用されるモノマー及びポリマー及び他の材料を記載する略記は実施例1にて記載されている。
アームファースト法によるミクトアームポリマーの合成
(1)(OEGMA8−9)、DMAEMA及びn−BMAの両端二官能性マクロRAFT剤のホモポリマーの合成及び性状分析
ミクトアームポリマーの合成のための典型的な手順は以下のとおりである;
Vazo88(1.0重量%)、P(OEGMA8−9)(30.0重量%)、P(DMAEMA)(30.0重量%)、P(n−BMA)(30.0重量%)、DSDMA(20.0重量%)のDMFストック溶液を調製した。特定の量の各モノマー([モノマー]:[ポリマー]=6:1)をそれぞれポリマー溶液に加えた。Vazo88溶液(247.3mg)、P(OEGMA8−9)溶液(539mg)、P(DMAEMA)溶液(517mg)、P(n−BMA)溶液(492mg)、DSDMA溶液(528.9mg)及びDMF(18mg)の混合物をフラスコで調製した。3回の凍結/排気/融解のサイクルで脱気し、真空下で密封したアンプルにストック溶液を移した。アンプルを90℃で20時間加熱した。
ミクトアーム星型ポリマーのP(DMAEMA)アームの三級アミノ基を四級化するために、上述の星型のストック溶液をDMFで希釈し、次いで過剰のMeIを溶液に加え、室温で16時間撹拌した。最終的に、過剰のMeIを回転エバポレータで取り除き;水に対する星型ポリマーの4日間の透析(分子量膜カットオフ25,000Da)によってDMFを取り除いた。凍結乾燥の後、四級化P(DMAEMA)を含有する星型ポリマーを得た。図6は四級化ポリマーの1H−NMRスペクトルを示す。
20mgのトリブチルホスフィンを含有する1mLのDMAcに、そのコアにジスルフィド結合を含有するミクトアームポリマー(5mg)を溶解した。GPC解析に先立って、窒素雰囲気下で30分間、室温にて溶液を撹拌した。図3(IV)は、星型ポリマーと分解ポリマーのGPCトレースを示す。これは、アームのそれに匹敵する分子量を持つ低分子量ポリマーを生じる架橋コアの切断を示している。
Claims (20)
- 支持部分と、それぞれ前記支持部分に共有結合しており、且つ前記支持部分から伸びる少なくとも3つのホモポリマー鎖とを含むミクトアーム分岐ポリマーであって、
前記少なくとも3つのホモポリマー鎖がカチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性ホモポリマー鎖とを含む、分岐ポリマー。 - 少なくとも3つのホモポリマー鎖の1以上が分解性官能基を介して支持部分に共有結合している、請求項1に記載の分岐ポリマー。
- 支持部分に共有結合している1より多くのカチオン性ホモポリマー鎖、親水性ホモポリマー鎖又は疎水性ホモポリマー鎖を有する、請求項1又は2に記載の分岐ポリマー。
- 星型ポリマーの形態である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の分岐ポリマー。
- 支持部分が架橋されたポリマーの支持部分の形態である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の分岐ポリマー。
- 架橋されたポリマーの支持部分が、ジスルフィドジメタクリレート、エチレングリコールジ(メタ)アクリレート、トリエチレングリコールジ(メタ)アクリレート、テトラエチレングリコールジ(メタ)アクリレート、1,3−ブチレングリコールジ(メタ)アクリレート、トリメチロールプロパントリ(メタ)アクリレート、1,4−ブタンジオールジ(メタ)アクリレート、ネオペンチルグリコールジ(メタ)アクリレート、1,6−ヘキサンジオールジ(メタ)アクリレート、1,6−ヘキサンジオールエトキシ化ジアクリレート(HEDA)、ペンタエリスリトールジ(メタ)アクリレート、ペンタエリスリトールトリ(メタ)アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ(メタ)アクリレート、グリセロールジ(メタ)アクリレート、グリセロールアリルオキシジ(メタ)アクリレート、1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタンジ(メタ)アクリレート、1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)エタントリ(メタ)アクリレート、1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)プロパンジ(メタ)アクリレート、1,1,1−トリス(ヒドロキシメチル)プロパントリ(メタ)アクリレート、トリアリルシアヌレート、トリアリルイソシアヌレート、トリアリルトリメリテート、ジアリルフタレート、ジアリルテレフタレート、ジビニルベンゼン、メチロール(メタ)アクリルアミド、トリアリルアミン、オレイルマレエート、グリセリルプロポキシトリアクリレート、アリルメタクリレート、無水メタクリル酸、メチレンビス(メタ)アクリルアミド、ブタ−2−エン−1,4−ジアクリレート、ビスフェノールAエトキシ化ジアクリレート、N,N’−ビス(アクリロイル)シスタニミン、アジピン酸ジビニル、4,4’−ジビニルビフェニル及びN,N’−メチレンビスアクリルアミドから選択される1以上の多官能性モノマーの重合残基を含む、請求項5に記載の分岐ポリマー。
- カチオン性ホモポリマー鎖が、N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート、N,N−ジエチルアミノエチルメタクリレート、N,N−ジメチルアミノエチルアクリレート、N,N−ジエチルアミノエチルアクリレート、2−アミノエチルメタクリレート塩酸塩、N−[3−(N,N−ジメチルアミノ)プロピル]メタクリルアミド、N−(3−アミノプロピル)メタクリルアミド塩酸塩、N−[3−(N,N−ジメチルアミノ)プロピル]アクリルアミド、N−[2−(N,N−ジメチルアミノ)エチル]メタクリルアミド、2−N−モルフォリノエチルアクリレート、2−N−モルフォリノエチルメタクリレート、2−(N,N−ジメチルアミノ)エチルアクリレート、2−(N,N−ジメチルアミノ)エチルメタクリレート、2−(N,N−ジエチルアミノ)エチルメタクリレート、塩化2−アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウム、塩化メタクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウム、2−(tert−ブチルアミノ)エチルメタクリレート、塩化アリルジメチルアンモニウム、2−(ジエチルアミノ)エチルスチレン、2−ビニルピリジン、及び4−ビニルピリジンから選択される1以上のモノマーの重合残基を含み;
親水性ホモポリマー鎖が、アクリル酸、メタクリル酸、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、オリゴ(アルキレングリコール)メチルエーテル(メタ)アクリレート(OAG(M)A)、アクリルアミド及びメタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレート、N−メチルアクリルアミド、N,N−ジメチルアクリルアミド、N,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート、N,N−ジメチルアミノプロピルメタクリルアミド、N−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、4−アクリロイルモルフォリン、2−アクリルアミド−2−メチル−1−プロパンスルホン酸、ホスホリルコリンメタクリレート及びN−ビニルピロリドンから選択される1以上のモノマーの重合残基を含み;並びに
疎水性ホモポリマー鎖が、スチレン、α−メチルスチレン、ブチルアクリレート、ブチルメタクリレート、アミルメタクリレート、ヘキシルメタクリレート、ラウリルメタクリレート、ステアリルメタクリレート、エチルヘキシルメタクリレート、クロチルメタクリレート、シンナミルメタクリレート、オレイルメタクリレート、リシノレイルメタクリレート、コレステリルメタクリレート、コレステリルアクリレート、ビニルブチレート、ビニルtert−ブチレート、ビニルステアレート及びビニルラウレートから選択される1以上のモノマーの重合残基を含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の分岐ポリマー。 - 支持部分と、それぞれ前記部分に共有結合しており、且つ前記部分から伸びる少なくとも3つのホモポリマー鎖とを含むミクトアーム分岐ポリマーを調製する方法であって、
前記少なくとも3つのホモポリマー鎖がカチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性ホモポリマー鎖とを含み、前記方法が、
(i)各ホモポリマー鎖がそれに共有結合されたリビング重合部分を有する、カチオン性ホモポリマー鎖、親水性ホモポリマー鎖及び疎水性ホモポリマー鎖を提供することと、
(ii)前記カチオン性ホモポリマー鎖、親水性ホモポリマー鎖及び疎水性ホモポリマー鎖のそれぞれが共有結合される架橋ポリマー支持部分を形成するように、リビング重合部分の制御下で1以上の多エチレン性不飽和モノマーを重合させることとを含む方法。 - ミクトアーム分岐ポリマーと核酸分子とを含む複合体であって、
前記分岐ポリマーが、支持部分と、それぞれ前記部分に共有結合しており、且つ前記部分から伸びる少なくとも3つのホモポリマー鎖とを含み、
前記少なくとも3つのホモポリマー鎖がカチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性ホモポリマー鎖とを含む、複合体。 - 少なくとも3つのホモポリマー鎖が、約10〜約200のモノマー残基単位を含むカチオン性ホモポリマー鎖を含む、請求項9に記載の複合体。
- 少なくとも3つのホモポリマー鎖が、約10〜約150のモノマー残基単位を含む親水性ホモポリマー鎖を含む、請求項9又は10に記載の複合体。
- 少なくとも3つのホモポリマー鎖が、約15〜約150のモノマー残基単位を含む疎水性ホモポリマー鎖を含む、請求項9〜11のいずれか1項に記載の複合体。
- 約10mV〜約40mVの範囲に及ぶゼータ電位を有する、請求項9〜12のいずれか1項に記載の複合体。
- 核酸分子が、gDNA、cDNA、二本鎖又は一本鎖DNAオリゴヌクレオチド、センスRNA、アンチセンスRNA、mRNA、tRNA、rRNA、小分子/短分子干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、短ヘアピンRNA(shRNA)、piwi−相互作用RNA(PiRNA)、マイクロRNA/小分子RNA(miRNA/stRNA)、核小体小分子RNA(SnoRNAs)、核内小分子(SnRNA)リボザイム、アプタマー、DNAザイム、リボヌクレアーゼ型複合体、ヘアピン二本鎖RNA(ヘアピンdsRNA)、空間的推移に介在するmiRNA(sdRNA)、ストレス応答性RNA(srRNA)、細胞周期RNA(ccRNA)及び二本鎖又は一本鎖RNAオリゴヌクレオチドから選択される、請求項9〜13のいずれか1項に記載の複合体。
- 細胞に核酸分子を送達する方法であって、前記方法が
(a)ミクトアーム分岐ポリマーと核酸分子とを含む複合体を提供することと、
(b)前記細胞に前記複合体を送達することとを含み、
前記分岐ポリマーが、支持部分と、それぞれ前記部分に共有結合しており、且つ前記部分から伸びる少なくとも3つのホモポリマー鎖とを含み、
前記少なくとも3つのホモポリマー鎖がカチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性ホモポリマー鎖とを含む、方法。 - 遺伝子発現をサイレンシングする方法であって、前記方法がミクトアーム分岐ポリマーと核酸分子とを含む複合体で細胞に形質移入することを含み、
前記分岐ポリマーが、支持部分と、それぞれ前記部分に共有結合しており、且つ前記部分から伸びる少なくとも3つのホモポリマー鎖とを含み、
前記少なくとも3つのホモポリマー鎖がカチオン性ホモポリマー鎖と親水性ホモポリマー鎖と疎水性ホモポリマー鎖とを含む、方法。 - インビボで実施される、請求項15又は16に記載の方法。
- 分岐ポリマーが星型ポリマーの形態である、請求項15〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 少なくとも3つのホモポリマー鎖の少なくとも1つが標的化リガンド、イメージング剤、生物活性剤、又はそれらの組み合わせを抱合している、請求項15〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 複合体が被験体に投与される、請求項15〜19のいずれか1項に記載の方法。
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