CN104629059A - 一种用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物的制备方法。在壳寡糖上氨基被保护的情况下，与4-戊炔酸反应，得到炔基化壳寡糖；利用疏水性环酯类单体开环聚合制备出大分子引发剂，结合原子转移自由基聚合，在大分子链上引入具有温度响应性的亲水链段MEO2MA和OEGMA，制备出两亲性嵌段共聚物，并使其端基叠氮化；通过点击化学反应，在两亲性嵌段共聚物上引入亲水性的壳寡糖分子链，制备出用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物。本发明制备的聚合物材料具有温度响应性和生物相容性，且具有较为丰富的氨基基团，能够起到搭载外源基因的作用，此外该两亲性嵌段共聚物可以在水中自组装成胶束，在癌症化疗、基因治疗等领域都具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于高分子材料和生物医学工程领域，具体涉及一种用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物的制备方法。
背景技术
癌症是一种严重威胁人类健康和生命的疾病，目前癌症的治疗方法可分为手术治疗和非手术治疗两大类，其中化疗是一种应用较广泛的非手术治疗方法。化疗是利用化学药物杀灭癌细胞的一种治疗方法，但由于化疗药物的选择性不强，在杀灭癌细胞的同时也会损伤人体正常细胞，因此需要研发高性能的载体材料用于控制药物释放，减轻对正常细胞的影响。
温度响应型聚合物能够根据外界温度变化发生相转变而改变自身结构，利用该特性可以达到药物控释的目的，是一种良好的药物载体材料。2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)是两种新型的温度响应型材料，具有良好的生物相容性，近年来已成为一个新的研究热点。Lutz等（Journal of the American Chemical Society 2006, 128, 13046-47）研究分析了MEO2MA和OEGMA的最低临界共溶温度（LCST），指出可以通过改变两者的比例制备出具有不同LCST的温度响应型无规共聚物，在生物医药领域具有一定的潜在应用性。
基因治疗是一种新兴的癌症治疗技术，是指将人类正常基因或有治疗作用的基因导入癌细胞或组织，阻止癌细胞的生长、转移、复发，以达到治疗癌症的目的。基因载体是将目的基因导入靶细胞的工具，一直以来都是基因治疗的研究重点之一，现如今常见的非病毒载体有脂质体、聚乙烯亚胺、壳聚糖等高分子材料。壳聚糖具有良好的生物相容性，且分子内含有许多氨基，在生理pH下会发生质子化而带正电荷，能够与基因上带负电荷的磷酸基团产生静电作用形成复合物，从而起到搭载外源基因的作用，但是壳聚糖存在分子量高、溶解性差、转染率低等缺点，限制了其在基因载体领域中的应用。低分子量壳聚糖，又称壳寡糖（Chitosan oligosaccharide, COS）是壳聚糖经过降解而得到的低聚合度寡糖产品，是自然界中唯一带正电荷的阳离子碱性氨基低聚糖。壳寡糖不仅保留了壳聚糖的基本性能，而且还具有水溶性好、抗肿瘤、抗菌等优良特性，是一种理想的基因载体材料。
利用疏水性单体开环聚合制备出大分子引发剂，结合原子转移自由基聚合，在大分子链上引入具有温度响应性的亲水链段MEO2MA和OEGMA，制备出两亲性嵌段共聚物，并结合点击化学反应，在两亲性嵌段共聚物上引入亲水性的壳寡糖分子链，制备出用于药物控释和基因载体的新型嵌段共聚物。这种两亲性嵌段共聚物在水溶液中能够自组装成具有温度响应性的胶束，该胶束可以作为化学药物和外源基因的载体材料，在生物医学、药物载体、基因治疗等领域将具有良好的发展前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物的制备方法。
本发明的目的是依次将具有亲水性的温度响应型聚合物和带有氨基基团的亲水性壳寡糖引入到疏水性的生物可降解聚酯类大分子链段上，使获得的两亲性嵌段共聚物具有良好的生物相容性、生物降解性、温度响应性和阳离子特性，并能够在水溶液中组装成稳定的纳米胶束。本发明以2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)、寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(OEGMA)、壳寡糖和环酯类单体为原料，采用开环聚合反应、原子转移自由基聚合反应和点击化学反应，制备一系列具有不同最低临界共溶温度(LCST)的温度响应型嵌段共聚物。
本发明提出的用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物的制备方法，具体步骤如下：
(1)将低分子量壳聚糖(壳寡糖COS)和邻苯二甲酸酐(PA)按照摩尔比为1：2～6(以壳寡糖中的吡喃糖环计算摩尔比)计量加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在氮气或氩气保护下反应，反应温度为100～150℃，反应时间为4～12小时，待反应产物冷却到室温，将其加入到甲醇中沉淀，抽滤，并用甲醇重复洗涤抽滤3次，将过滤产物在40℃下真空烘干24h，得到产物I邻苯二甲酰化壳寡糖；
(2)将步骤(1)得到的邻苯二甲酰化壳寡糖、4-戊炔酸、催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和催化剂羟基苯并三唑(HOBt)按照摩尔比为1：4～8：4～8：2～4(以壳寡糖中的吡喃糖环计算摩尔比)计量加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在氮气或氩气保护下室温反应24～72小时。反应结束后，将产物加入到甲醇中沉淀，抽滤，再用N,N-二甲基甲酰胺溶解后经甲醇沉淀，重复3次，将过滤产物在40℃下真空烘干24h，得到产物II炔基化邻苯二甲酰化壳寡糖；
(3)将步骤(2)得到的炔基化邻苯二甲酰化壳寡糖和水合肼(N2H4·H2O)按照摩尔比为1：5～10(以壳寡糖中的吡喃糖环计算摩尔比)计量加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在氮气或氩气保护下反应，反应温度为80～140℃，反应时间为4～8小时，待反应产物冷却到室温，将其加入到甲醇中沉淀，抽滤，并用甲醇重复洗涤抽滤至滤液无色为止，将过滤产物在40℃下真空烘干24h，得到产物III炔基化壳寡糖，备用；
(4)将含有羟基官能团的引发剂A和环酯类单体B按照摩尔比为1：20～1000计量加入到反应釜中，按照单体总摩尔量的0.01～1%加入催化剂C，在氮气或氩气保护下反应，反应温度为100～140℃，反应时间为12～36小时，待反应产物冷却到室温，加入二氯甲烷使其溶解，将溶液加入到甲醇中沉淀，抽滤，再用二氯甲烷溶解后经甲醇沉淀，重复3次，将过滤产物在40℃下真空烘干24h，得到产物IV聚酯类高分子材料；
(5)将步骤(4)得到的聚酯类高分子材料和三乙胺(Et3N)按照摩尔比为1：4～50计量加入到二氯甲烷中，随后将反应体系冷却到0℃，并向其中逐滴滴加2-溴异丁酰溴溶液(用量为产物IV摩尔数的3～35倍，用二氯甲烷稀释5～10倍)，0℃搅拌2小时后移至室温下继续反应36-72小时。反应结束后旋蒸浓缩，并依次用饱和NaHCO3溶液和去离子水反复洗涤多次，用无水硫酸镁除水后过滤、旋蒸浓缩，将溶液加入到甲醇中沉淀，抽滤，再用二氯甲烷溶解后经甲醇沉淀，重复3次，将过滤产物在40℃下真空烘干24h，得到产物V原子转移自由基聚合(ATRP)的大分子引发剂；
(6)将步骤(5)得到的ATRP大分子引发剂、催化剂溴化亚铜、配体PMDETA、MEO2MA单体和OEGMA单体按照摩尔比为1：2～20：2～20：10～1000：10～1000计量加入到四氢呋喃中，在氮气或氩气保护下反应，反应温度为40～80℃，反应时间为5～10小时，待反应产物冷却到室温，用四氢呋喃稀释后过中性氧化铝柱子以除去铜盐，旋蒸浓缩后透析除去未反应的单体，最后冷冻干燥得到产物VI温度响应型嵌段共聚物；
(7)将步骤(6)得到的温度响应型嵌段共聚物和叠氮化钠(NaN3)按照摩尔比为1：10～30计量加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在40～60℃温度下反应24～72小时。反应结束后旋蒸浓缩除去N,N-二甲基甲酰胺，用四氢呋喃重新溶解产物后过中性氧化铝柱子以除去残留的钠盐，将溶液旋蒸浓缩后加入到正己烷中沉淀，抽滤，再用四氢呋喃溶解后经正己烷沉淀，重复3次，将过滤产物在40℃下真空烘干24h，得到产物VII叠氮化的温度响应型嵌段共聚物；
(8)将步骤(7)得到的叠氮化温度响应型嵌段共聚物、步骤(3)得到的炔基化壳寡糖、催化剂溴化亚铜、配体PMDETA按照摩尔比为1：10～100：4～30：4～30计量加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在氮气或氩气保护下反应，反应温度为50～80℃，反应时间为24～72小时。反应结束后透析处理以除去未反应的原料，然后进行冷冻干燥处理，得到最终的用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物。
本发明中，所述的低分子量壳聚糖(壳寡糖COS)的数均分子量Mn在1000～3000之间，聚合度DP在2～10之间，脱乙酰度超过95%。
本发明中，所述含有羟基官能团的引发剂A为聚乙二醇、乙二醇、新戊二醇、季戊四醇、双季戊四醇或β-环糊精中的一种或几种。
本发明中，所述环酯类单体B为ε-己内酯、L-丙交酯、D-丙交酯、D,L-丙交酯，乙交酯或丁内酯中的一种或几种。
本发明中，所述催化剂C为辛酸亚锡、环烷氧锡、钛酸四丁酯、乙酰丙酮铁或异丙醇铝中的一种或几种。
本发明的有益效果在于：
1) 原料来源广泛，所用的低分子量壳聚糖(壳寡糖)、环酯类单体、温度响应型单体、溶剂、沉淀剂、催化剂等均可以工业化生产，合成方法简单可行。
2) 合成的用于药物控释和基因载体的聚合物同时具有温度响应性和生物相容性。
3) 合成的用于药物控释和基因载体的聚合物具有较为丰富的氨基基团，能够起到搭载外源基因的作用，有助于提高基因的转染效率。
4) 共聚物的最低临界共溶温度(LCST)可以通过改变MEO2MA和OEGMA的单体比例来调节。
5) 由于环酯类单体具有疏水性，温度响应型单体和壳寡糖具有亲水性，所以该聚合物材料能够在水中自组装成胶束，胶束粒径可以通过改变聚合物的亲疏水链段长度来调节。
6) 本发明所得的用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物在癌症化疗、基因治疗等领域都具有良好的应用前景。
附图说明
图1:为实施例1制备的用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物的结构示意图。
图2为实施例1制备的用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物胶束水溶液的透射电镜图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
该用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物的分子结构用核磁共振分析仪(NMR)、傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR)测定。聚合物的分子量用凝胶渗透色谱(GPC)测定，以四氢呋喃为淋洗剂。聚合物的最低临界共溶温度(LCST)用带热台的紫外-可见分光光度计测定，LCST定义为透光率降至初始值的50%时所对应的温度。自组装成的纳米胶束形态用透射电镜(TEM)测定，胶束粒径用动态激光光散射仪(DLS)测定。
实施例1
将20.0g壳寡糖和51.9g邻苯二甲酸酐溶解于150ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下120℃反应8h，冷却后经甲醇沉淀、洗涤，过滤后真空烘干得到产物I邻苯二甲酰化壳寡糖；将15.0g产物I、27.7g 4-戊炔酸、54.1g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和19.1g羟基苯并三唑溶解于150ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下室温反应24h，经甲醇沉淀并重复溶解沉淀，过滤后真空烘干得到产物II炔基化—邻苯二甲酰化壳寡糖；将10.0g产物II和6.0g水合肼溶解于50ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下100℃反应4h，冷却后经甲醇沉淀、洗涤，过滤后真空烘干得到产物III炔基化壳寡糖。
将0.7g新戊二醇和39.3g ε-己内酯加入到反应釜中，并向其中注入400μmol辛酸亚锡，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下120℃反应24h，冷却后用二氯甲烷溶解经甲醇沉淀，抽滤后真空烘干得到产物IV聚己内酯(PCL)；将11.6g产物IV和1.6g三乙胺溶解于50ml二氯甲烷中，待体系冷却至0℃，向其中逐滴滴加2-溴异丁酰溴溶液(2.8g / 15ml CH2Cl2)，搅拌2h后移至室温反应48h。反应结束后旋蒸浓缩，依次用饱和NaHCO3溶液和去离子水洗涤多次，用无水硫酸镁除水后过滤，经甲醇沉淀，抽滤后真空烘干得到产物V大分子引发剂(PCL-Br)；将3.6g产物V、11.5g MEO2MA、5.1g OEGMA、0.2g CuBr和0.3g PMDETA加入到30ml四氢呋喃中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下60℃反应8h，冷却后过中性氧化铝柱，透析，冻干得产物VI温度响应型PCL-b-P(MEO2MA-co-OEGMA)；将4.3g产物VI和0.9g叠氮化钠溶于20ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下45℃反应48h。反应结束后，旋蒸除溶剂用四氢呋喃溶解后过中性氧化铝柱，经正己烷沉淀，抽滤后真空烘干得到产物VII叠氮化的PCL-b-P(MEO2MA-co-OEGMA)-N3；
将3.5g产物VII、2.8g产物III、0.1g CuBr和0.2g PMDETA加入到50ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下65℃反应48h，反应结束后透析，冻干，得到最终产物PCL-b-P(MEO2MA-co-OEGMA)-b-COS共聚物。
实施例2
将10.0g壳寡糖和34.6g邻苯二甲酸酐溶解于80ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氮气保护下100℃反应12h，冷却后经甲醇沉淀、洗涤，过滤后真空烘干得到产物I邻苯二甲酰化壳寡糖；将7.5g产物I、11.5g 4-戊炔酸、22.5g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和8.0g羟基苯并三唑溶解于80ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氮气保护下室温反应24h，经甲醇沉淀并重复溶解沉淀，过滤后真空烘干得到产物II炔基化—邻苯二甲酰化壳寡糖；将5.0g产物II和4.8g水合肼溶解于50ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氮气保护下120℃反应6h，冷却后经甲醇沉淀、洗涤，过滤后真空烘干得到产物III炔基化壳寡糖。
将0.5g新戊二醇和41.5g L-丙交酯加入到反应釜中，并向其中注入288μmol辛酸亚锡，体系冷冻抽真空三次，在氮气保护下110℃反应36h，冷却后用二氯甲烷溶解经甲醇沉淀，抽滤后真空烘干得到产物IV聚乳酸(PLA)；将10.0g产物IV和0.9g三乙胺溶解于30ml二氯甲烷中，待体系冷却至0℃，向其中逐滴滴加2-溴异丁酰溴溶液(1.6g / 10ml CH2Cl2)，搅拌2h后移至室温反应72h。反应结束后旋蒸浓缩，依次用饱和NaHCO3溶液和去离子水洗涤多次，用无水硫酸镁除水后过滤，经甲醇沉淀，抽滤后真空烘干得到产物V大分子引发剂(PLA-Br)；将2.3g产物V、15.3g MEO2MA、6.8g OEGMA、0.3g CuBr和0.4g PMDETA加入到30ml 四氢呋喃中，体系冷冻抽真空三次，在氮气保护下80℃反应6h，冷却后过中性氧化铝柱，透析，冻干得产物VI温度响应型PLA-b-P(MEO2MA-co-OEGMA)；将3.6g产物VI和0.6g叠氮化钠溶于20ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氮气保护下50℃反应72h。反应结束后，旋蒸除溶剂用四氢呋喃溶解后过中性氧化铝柱，经正己烷沉淀，抽滤后真空烘干得到产物VII叠氮化的PLA-b-P(MEO2MA-co-OEGMA)-N3；
将5.3g产物VII、2.8g产物III、0.1g CuBr和0.2g PMDETA加入到50ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氮气保护下80℃反应36h，反应结束后透析，冻干，得到最终产物PLA-b-P(MEO2MA-co-OEGMA)-b-COS共聚物。
实施例3
将15.0g壳寡糖和86.5g邻苯二甲酸酐溶解于100ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氮气保护下150℃反应8h，冷却后经甲醇沉淀、洗涤，过滤后真空烘干得到产物I邻苯二甲酰化壳寡糖；将10.0g产物I、15.3g 4-戊炔酸、30.0g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10.7g羟基苯并三唑溶解于120ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氮气保护下室温反应36h，经甲醇沉淀并重复溶解沉淀，过滤后真空烘干得到产物II炔基化—邻苯二甲酰化壳寡糖；将6.0g产物II和5.7g水合肼溶解于80ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氮气保护下100℃反应8h，冷却后经甲醇沉淀、洗涤，过滤后真空烘干得到产物III炔基化壳寡糖。
将0.5g季戊四醇和52.9g L-丙交酯加入到反应釜中，并向其中注入380μmol辛酸亚锡，体系冷冻抽真空三次，在氮气保护下120℃反应36h，冷却后用二氯甲烷溶解经甲醇沉淀，抽滤后真空烘干得到产物IV聚乳酸(4sPLA)；将9.6g产物IV和0.8g三乙胺溶解于30ml二氯甲烷中，待体系冷却至0℃，向其中逐滴滴加2-溴异丁酰溴溶液(1.4g / 10ml CH2Cl2)，搅拌2h后移至室温反应48h。反应结束后旋蒸浓缩，依次用饱和NaHCO3溶液和去离子水洗涤多次，用无水硫酸镁除水后过滤，经甲醇沉淀，抽滤后真空烘干得到产物V大分子引发剂(4sPLA-Br)；将4.6g产物V、30.6g MEO2MA、13.6g OEGMA、0.5g CuBr和0.4g PMDETA加入到60ml 四氢呋喃中，体系冷冻抽真空三次，在氮气保护下65℃反应8h，冷却后过中性氧化铝柱，透析，冻干得产物VI温度响应型4sPLA-b-P(MEO2MA-co-OEGMA)；将7.2g产物VI和0.8g叠氮化钠溶于50ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氮气保护下60℃反应36h。反应结束后，旋蒸除溶剂用四氢呋喃溶解后过中性氧化铝柱，经正己烷沉淀，抽滤后真空烘干得到产物VII叠氮化的4sPLA-b-P(MEO2MA-co-OEGMA)-N3；
将8.6g产物VII、4.5g产物III、0.2g CuBr和0.3g PMDETA加入到50ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氮气保护下60℃反应48h，反应结束后透析，冻干，得到最终产物4sPLA-b-P(MEO2MA-co-OEGMA)-b-COS共聚物。
实施例4
将12.0g壳寡糖和69.2g邻苯二甲酸酐溶解于100ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下120℃反应6h，冷却后经甲醇沉淀、洗涤，过滤后真空烘干得到产物I邻苯二甲酰化壳寡糖；将8.0g产物I、13.2g 4-戊炔酸、24.0g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和9.1g羟基苯并三唑溶解于120ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下室温反应48h，经甲醇沉淀并重复溶解沉淀，过滤后真空烘干得到产物II炔基化—邻苯二甲酰化壳寡糖；将4.8g产物II和4.5g水合肼溶解于80ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下140℃反应4h，冷却后经甲醇沉淀、洗涤，过滤后真空烘干得到产物III炔基化壳寡糖。
将0.5g季戊四醇和50.3g ε-己内酯加入到反应釜中，并向其中注入450μmol钛酸四丁酯，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下140℃反应12h，冷却后用二氯甲烷溶解经甲醇沉淀，抽滤后真空烘干得到产物IV聚己内酯(4sPCL)；将7.2g产物IV和0.6g三乙胺溶解于30ml二氯甲烷中，待体系冷却至0℃，向其中逐滴滴加2-溴异丁酰溴溶液(1.1g / 10ml CH2Cl2)，搅拌2h后移至室温反应36h。反应结束后旋蒸浓缩，依次用饱和NaHCO3溶液和去离子水洗涤多次，用无水硫酸镁除水后过滤，经甲醇沉淀，抽滤后真空烘干得到产物V大分子引发剂(4sPCL-Br)；将5.2g产物V、34.6g MEO2MA、15.4g OEGMA、0.5g CuBr和0.4g PMDETA加入到60ml 四氢呋喃中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下70℃反应6h，冷却后过中性氧化铝柱，透析，冻干得产物VI温度响应型4sPCL-b-P(MEO2MA-co-OEGMA)；将6.4g产物VI和0.6g叠氩化钠溶于50ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下60℃反应36h。反应结束后，旋蒸除溶剂用四氢呋喃溶解后过中性氧化铝柱，经正己烷沉淀，抽滤后真空烘干得到产物VII叠氩化的4sPCL-b-P(MEO2MA-co-OEGMA)-N3；
将5.2g产物VII、4.5g产物III、0.1g CuBr和0.2g PMDETA加入到50ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下50℃反应72h，反应结束后透析，冻干，得到最终产物4sPCL-b-P(MEO2MA-co-OEGMA)-b-COS共聚物。
实施例5
将16.0g壳寡糖和92.3g邻苯二甲酸酐溶解于120ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下150℃反应4h，冷却后经甲醇沉淀、洗涤，过滤后真空烘干得到产物I邻苯二甲酰化壳寡糖；将11.6g产物I、19.2g 4-戊炔酸、34.8g 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和13.2g羟基苯并三唑溶解于120ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下室温反应72h，经甲醇沉淀并重复溶解沉淀，过滤后真空烘干得到产物II炔基化—邻苯二甲酰化壳寡糖；将9.6g产物II和10.2g水合肼溶解于120ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下120℃反应8h，冷却后经甲醇沉淀、洗涤，过滤后真空烘干得到产物III炔基化壳寡糖。
将0.4g双季戊四醇和48.6g ε-己内酯加入到反应釜中，并向其中注入430μmol辛酸亚锡，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下120℃反应24h，冷却后用二氯甲烷溶解经甲醇沉淀，抽滤后真空烘干得到产物IV聚己内酯(6sPCL)；将9.4g产物IV和0.8g三乙胺溶解于30ml二氯甲烷中，待体系冷却至0℃，向其中逐滴滴加2-溴异丁酰溴溶液(1.4g / 10ml CH2Cl2)，搅拌2h后移至室温反应48h。反应结束后旋蒸浓缩，依次用饱和NaHCO3溶液和去离子水洗涤多次，用无水硫酸镁除水后过滤，经甲醇沉淀，抽滤后真空烘干得到产物V大分子引发剂(6sPCL-Br)；将4.8g产物V、32.0g MEO2MA、14.2g OEGMA、0.5g CuBr和0.4g PMDETA加入到60ml 四氢呋喃中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下65℃反应5h，冷却后过中性氧化铝柱，透析，冻干得产物VI温度响应型6sPCL-b-P(MEO2MA-co-OEGMA)；将6.4g产物VI和0.8g叠氩化钠溶于50ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下60℃反应48h。反应结束后，旋蒸除溶剂用四氢呋喃溶解后过中性氧化铝柱，经正己烷沉淀，抽滤后真空烘干得到产物VII叠氩化的6sPCL-b-P(MEO2MA-co-OEGMA)-N3；
将6.4g产物VII、5.5g产物III、0.1g CuBr和0.2g PMDETA加入到50ml N,N-二甲基甲酰胺中，体系冷冻抽真空三次，在氩气保护下75℃反应36h，反应结束后透析，冻干，得到最终产物6sPCL-b-P(MEO2MA-co-OEGMA)-b-COS共聚物。
Claims (5)
1.一种用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)将低分子量壳聚糖和邻苯二甲酸酐按照摩尔比为1：2～6(以壳寡糖中的吡喃糖环计算摩尔比)计量加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在氮气或氩气保护下反应，反应温度为100～150℃，反应时间为4～12小时，待反应产物冷却到室温，将其加入到甲醇中沉淀，抽滤，并用甲醇重复洗涤抽滤3次，将过滤产物在40℃下真空烘干24h，得到产物I邻苯二甲酰化壳寡糖；所述低分子量壳聚糖为壳寡糖COS；
(2)将步骤(1)得到的邻苯二甲酰化壳寡糖、4-戊炔酸、催化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和催化剂羟基苯并三唑按照摩尔比为1：4～8：4～8：2～4(以壳寡糖中的吡喃糖环计算摩尔比)计量加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在氮气或氩气保护下室温反应24～72小时；反应结束后，将产物加入到甲醇中沉淀，抽滤，再用N,N-二甲基甲酰胺溶解后经甲醇沉淀，重复3次，将过滤产物在40℃下真空烘干24h，得到产物II炔基化邻苯二甲酰化壳寡糖；
(3)将步骤(2)得到的炔基化邻苯二甲酰化壳寡糖和水合肼按照摩尔比为1：5～10(以壳寡糖中的吡喃糖环计算摩尔比)计量加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在氮气或氩气保护下反应，反应温度为80～140℃，反应时间为4～8小时，待反应产物冷却到室温，将其加入到甲醇中沉淀，抽滤，并用甲醇重复洗涤抽滤至滤液无色为止，将过滤产物在40℃下真空烘干24h，得到产物III炔基化壳寡糖，备用；
(4)将含有羟基官能团的引发剂A和环酯类单体B按照摩尔比为1：20～1000计量加入到反应釜中，按照单体总摩尔量的0.01～1%加入催化剂C，在氮气或氩气保护下反应，反应温度为100～140℃，反应时间为12～36小时，待反应产物冷却到室温，加入二氯甲烷使其溶解，将溶液加入到甲醇中沉淀，抽滤，再用二氯甲烷溶解后经甲醇沉淀，重复3次，将过滤产物在40℃下真空烘干24h，得到产物IV聚酯类高分子材料；
(5)将步骤(4)得到的聚酯类高分子材料和三乙胺按照摩尔比为1：4～50计量加入到二氯甲烷中，随后将反应体系冷却到0℃，并向其中逐滴滴加2-溴异丁酰溴溶液，所述2-溴异丁酰溴溶液用量为产物IV聚酯类高分子材料摩尔数的3～35倍，用二氯甲烷稀释5～10倍，0℃搅拌2小时后移至室温下继续反应36-72小时；反应结束后旋蒸浓缩，并依次用饱和NaHCO3溶液和去离子水反复洗涤多次，用无水硫酸镁除水后过滤、旋蒸浓缩，将溶液加入到甲醇中沉淀，抽滤，再用二氯甲烷溶解后经甲醇沉淀，重复3次，将过滤产物在40℃下真空烘干24h，得到产物V原子转移自由基聚合的大分子引发剂；
(6)将步骤(5)得到的ATRP大分子引发剂、催化剂溴化亚铜、配体PMDETA、MEO2MA单体和OEGMA单体按照摩尔比为1：(2～20)：(2～20)：(10～1000)：(10～1000)计量加入到四氢呋喃中，在氮气或氩气保护下反应，反应温度为40～80℃，反应时间为5～10小时，待反应产物冷却到室温，用四氢呋喃稀释后过中性氧化铝柱子以除去铜盐，旋蒸浓缩后透析除去未反应的单体，最后冷冻干燥得到产物VI温度响应型嵌段共聚物；
(7)将步骤(6)得到的温度响应型嵌段共聚物和叠氮化钠按照摩尔比为1：10～30计量加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在40～60℃温度下反应24～72小时；反应结束后旋蒸浓缩除去N,N-二甲基甲酰胺，用四氢呋喃重新溶解产物后过中性氧化铝柱子以除去残留的钠盐，将溶液旋蒸浓缩后加入到正己烷中沉淀，抽滤，再用四氢呋喃溶解后经正己烷沉淀，重复3次，将过滤产物在40℃下真空烘干24h，得到产物VII叠氮化的温度响应型嵌段共聚物；
(8)将步骤(7)得到的叠氮化温度响应型嵌段共聚物、步骤(3)得到的炔基化壳寡糖、催化剂溴化亚铜、配体PMDETA按照摩尔比为1：10～100：4～30：4～30计量加入到N,N-二甲基甲酰胺中，在氮气或氩气保护下反应，反应温度为50～80℃，反应时间为24～72小时；反应结束后透析处理以除去未反应的原料，然后进行冷冻干燥处理，得到最终的用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物。
2.根据权利要求1所述的用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物的制备方法，其特征在于：所述壳寡糖COS的数均分子量Mn为1000～3000，聚合度DP为2～10，脱乙酰度超过95%。
3.根据权利要求1所述的用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物的制备方法，其特征在于：所述含有羟基官能团的引发剂A为聚乙二醇、乙二醇、新戊二醇、季戊四醇、双季戊四醇或β-环糊精中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物的制备方法，其特征在于：所述环酯类单体B为ε-己内酯、L-丙交酯、D-丙交酯、D,L-丙交酯、乙交酯或丁内酯中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的用于药物控释和基因载体的温度响应型聚合物的制备方法，其特征在于：所述催化剂C为辛酸亚锡、环烷氧锡、钛酸四丁酯、乙酰丙酮铁或异丙醇铝中的一种或几种。
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