CN113897337A - 一种调节巨噬细胞极化状态的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及生物医药技术领域,具体公开了一种调节巨噬细胞极化状态的方法,该方法包括采用过表达HIMF基因感染巨噬细胞或者特异性siRNA敲减或整体敲除巨噬细胞中HIMF基因的步骤。通过上述方式,本申请采用过表达HIMF基因感染巨噬细胞或特异性siRNA敲减或整体敲除巨噬细胞中HIMF基因,影响不同极化类型的巨噬细胞的功能,从而抑制炎症的发生发展,并延缓心肌梗死的发生。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药领域,特别是涉及一种调节巨噬细胞极化状态的方法。
背景技术
巨噬细胞是由骨髓系祖细胞极化为单核细胞后进入血液,迁移至组织中极化形成的。根据激活方式以及功能的差异,巨噬细胞分为经典型(M1型)和替代型(M2型)。在细菌毒素LPS或Th1类细胞因子(TNFα,IFNγ)等刺激下,巨噬细胞被激活极化为M1型,表达和释放相关标志基因和活性氧,具有杀灭病原体、清除坏死组织和促进炎症反应发生的作用;与之对应,在Th2类细胞因子(IL-4,IL-13)等诱导下,巨噬细胞被激活为M2型,表达抗炎因子(如TGFβ,IL-10),具有消退炎症、促进组织生长和修复的作用。
研究发现,两种不同的极化巨噬细胞在炎症疾病的发生过程中具有重要的调控作用,在不同的微环境响应不同刺激时,可以在功能上相互转变;而阻断M1型巨噬细胞的功能,维持M2型极化细胞的抗炎修复特性,对抑制炎症的发生发展具有重要作用。因此,寻找一种有效的方法调节巨噬细胞的极化状态,在预防和治疗炎症相关疾病方面意义重大。然而,目前有效的调节巨噬细胞极化的方法较少。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求,本申请提供了一种调节巨噬细胞极化状态的方法,采用过表达HIMF基因感染巨噬细胞或特异性siRNA敲减或整体敲除巨噬细胞中HIMF基因,影响不同极化类型的巨噬细胞的功能,从而抑制炎症的发生发展,并延缓心肌梗死的发生。
为达此目的,本申请采用以下技术方案:
第一方面,本申请提供了一种调节巨噬细胞极化状态的方法,所述方法包括采用过表达HIMF基因感染巨噬细胞或者特异性siRNA敲减或整体敲除巨噬细胞中HIMF基因的步骤。
其中,所述采用过表达HIMF基因感染巨噬细胞的步骤,包括:构建过表达HIMF基因的腺病毒载体;将所述巨噬细胞接种于多孔板中;待所述巨噬细胞的细胞密度达预设值时,用所述过表达HIMF基因的腺病毒载体感染所述巨噬细胞。
其中,将所述巨噬细胞接种于多孔板中的步骤之前,所述方法还包括:分离和培养骨髓来源巨噬细胞:将小鼠脱颈处死,依次浸泡于两个75%酒精烧杯中;用剪刀剪断大腿,分离股骨和胫骨,剔除皮肉后置于培养基中;剪断股骨和胫骨的关节面,暴露骨髓腔,用注射器冲洗骨髓腔,移液枪吹散细胞;细胞经细胞筛过滤后,收集细胞悬浮液至离心管中;离心,弃上清,用含有巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)的培养基重悬细胞,接种于多孔板中进行培养;3天后添加含有MCSF的培养基,再培养3天后获得的成熟的所述骨髓来源巨噬细胞。其中,所述巨噬细胞包括RAW264.7和/或骨髓来源巨噬细胞。
第二方面,本申请提供了一种调节巨噬细胞极化状态的药物组合物,所述药物组合物包括过表达HIMF基因的腺病毒载体。
其中,所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
其中,所述过表达HIMF基因的腺病毒载体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
SEQ.ID.NO.1:
AAATGTGGGCGGCCAAAGTGTATTGAAAGTGTTTACTCCATTGGGATGTGCTTGTATATATTCAGGGCCCCTAGGTCAGTAATCTCATAGTGTATTAAAAAGCATCTCATCTGGCAAGGTCCTGGAAACTTTTCTGAGATTCTGGTGAGTCAGTCAGCTCTGTAGGATCCTCTCTTCCTCCTAAACATCTGGAATAATTATAGTAGCATTTCTCCTGATGTTCTCACCCTCTCCTCTACCTCACATCCATCCTAGAGCTCATTGATCTCATCTTCTCTGCTCTTCCCCTCCAGCCCCAGGACACTGACTTTCAACAGGATGAAGACTGCAACCTGTTCCCTTCTCATCTGCGTCTTCCTTCTCCAGCTGATGGTCCCAGTGAATACTGATGGAACCTTAGACATTATTGGGAAGAAAAAGGTCAAGGAACTTCTAGCCCATCAAGGTATGAGATGAGTAGGAAAAATCATAGCTTAATCCTTGCTGATGATGACTGTACATAAGACCTAAAATCTCTTGTATCCTGGTCTAAGCTCTTAGTCCCCGTTATCCCTGCCTTCCTGACCAGGGCTTCCTTCAGCACCCTACACTTTTGAACTCTTGGATAACAGCTTAATGTTGTTGATGAAGATGAAGAAAAAGGATAGAACCTGTAATTTATAAACATATCACAAAACAAACATATTAAGCATTCAGTTAGTTCATTCAATTTTCACAGGCACTTTATGAGTTAAGTACAACTATTACTTTTTCTTTACAAATGAGGAAGCTAGATCTTAAAAGTTAGCAAGGGGACTACTTATGGAACCAGTGACACCCCCAAGATAGAGGAAGACTTATAAAAGAATTGTGAGAAAGATCATGGGCTATATCACCTTTCTCTCTTACTCAGATAACTATCCCTCTGCTGTAAGGAAGACCCTCTCATGCACTAATGTCAAGTCTATGAGCAAATGGGCCTCCTGCCCTGCTGGTGAGTAATTCCTTAAGGAGATTTTGTGAATACAGTGGGTTCCTCTGTGTCCTCCCTCATCAATCTCTTAATGCCATCTTTCTCCTAAGTCAGGTTTGTACTGCAATGGAACTGAGCTACAGTTCCAGATGTGCAGACACCACTTCCTGATTTTCAGCTCTCCAATGATGCTATTGAGGGACTTTTGGTTTCTGCCTTTCATGTCACTTCTTCCTTTATGCCAGCCCTTCCTGTCCCTCAAGTGTCTGGTAATGGATATATATGGCCTTCATTTCTTCCATAACCTTTTCCCTTGTATTGTGGGCAGCAGGAGTCAGAACAGGGGTGAATTTGCTATTAATTGAAAGACAGTGAAACTCCACCTTCCAAATCCTCCAGTTTAAGTAACTTTTGCACTTGGTTTGTTTGAAAAGAACTGTGGAATTTGAATAGCTTTTTGTTTTGCAAAATAGAGCAACTCATGTGCTTTCTAAGAAGGAAGAACAGTTAGGGACCTTCCCTCCCTTACAGTCCAAGGGCTCTGACATATCTGTCTCACATAACTATGCAGGGATGACTGCTACTGGTTGTTCTTGTGGCTTTGCCTGTGGATCTTGGGAAATCCAGAATGAAAATATTTGCAACTGCCTGTGCTTAATCGTTGACTGGGCCTATGCCCGCTGCTGCCAACTGTCCTAAGAATGGAGAGGCACAGAACTCAGCTTTGATATGATGAGTCTAACAAAACTGCAATCTCAACTTGGAAATCTGACTCATGCGCATTTGATGTATTCATATTGCCCATTAACCCCGCTTCTTGAAAAAATAAAGACAAATTTACATCTTTCTA
第三方面,本申请提供了前述药物组合物在制备炎症相关疾病治疗药物中的应用。
其中,所述疾病包括心血管疾病、脓血症、风湿性关节炎、炎症性胃肠道疾病、神经系统疾病或肿瘤中的任意一种或至少两种的组合。
其中,所述疾病包括导致心肌梗死的心血管疾病。
与现有技术相比,本申请具有如下有益效果:
(1)本申请采用过表达HIMF基因感染巨噬细胞,促进M1型巨噬细胞的极化,并抑制M2型巨噬细胞的极化,实现了特异性调节极化巨噬细胞功能及其引发的疾病的效果;
(2)本申请通过特异性siRNA敲减或整体敲除巨噬细胞中HIMF基因,抑制M1型促炎性巨噬细胞的功能,促进M2型巨噬细胞的功能,实现了特异性调节极化巨噬细胞功能及其引发的疾病的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。其中:
图1为本申请采用过表达HIMF基因感染巨噬细胞的步骤的流程示意图;
图2为本申请实施例中的技术方案路线图;
图3a为过表达HIMF基因促进M1型RAW264.7细胞相关标志基因(TNFα、IL-1β、IL-6)的表达结果;
图3b为过表达HIMF基因促进M1型BMDM细胞相关标志基因(TNFα、IL-1β、IL-6)的表达结果;
图4a为过表达HIMF基因抑制M2型RAW264.7细胞相关标志基因(Arg1、TGF以及IL-10)的表达结果;
图4b为过表达HIMF基因抑制M2型BMDM细胞相关标志基因(Arg1、TGF以及IL-10)的表达结果;
图5a为对照组(未敲除巨噬细胞中HIMF基因的小鼠)的流式荧光筛选结果;
图5b为实验组(特异性siRNA敲减或整体敲除巨噬细胞中HIMF基因后的小鼠)的流式荧光筛选结果;
图6a为敲除巨噬细胞中HIMF基因抑制M1型巨噬细胞相关标志基因(CD45+CD11B+Ly6G-Ly6C+)的表达结果;
图6b为过表达HIMF基因促进M2型巨噬细胞相关标志基因(CD45+CD11B+Ly6G-Ly6C-)的表达结果;
图7为小鼠心脏切片染色照片;
图8为手术组和对照组的梗死区域的统计数据;
图9为手术组和对照组的存活率的统计数据。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图,对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性的劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本申请保护的范围。
本申请从调节巨噬细胞极化功能,进而特异性干预巨噬细胞功能的角度出发,运用原代细胞培养、组织病理观察等技术手段,提出一种调节巨噬细胞极化状态的方法,该方法包括采用过表达HIMF基因感染巨噬细胞、或者在巨噬细胞特异性敲除HIMF基因、或者向巨噬细胞递送siRNA以抑制HIMF基因的表达的步骤。
上述实施例中,低氧诱导促有丝分裂因子(hypoxia-induced mitogenic factor,HIMF),又称抵抗素样分子α(resistin-like molecμLeα,RELMα)或发现于炎症区域1(foundin inflammatory zone 1,FIZZ1),属于序列高度保守的RELM家族基因之一,已知的RELM家族包括四种鼠类的亚型(HIMF/RELMα/FIZZ1、RELM/FIZZ2、Resistin/FIZZ3和RELM/FIZZ4)和两种人类的亚型(RELM/FIZZ2和Resistin/FIZZ3),每种亚型都具有独特的表达方式,发挥不同的生物学功能,并发挥不同的生物学功能。
HIMF最初发现于炎症区域的巨噬细胞中,对炎症的发生发展以及血管再生具有重要调节功能。研究表明,HIMF可以通过不同细胞内信号通路(如PI3K/Akt信号通路等),在调节细胞功能(如细胞增殖、胞内钙流动等),以及不同疾病(如肺高压、炎症爆发和纤维化)的病理过程的发生发展具有重要作用。
在一实施例中,如图1所示,上述采用过表达HIMF基因感染巨噬细胞的步骤,具体包括:
S10:构建过表达HIMF基因的腺病毒载体。
S20:将巨噬细胞接种于多孔板中。
S30:待巨噬细胞的细胞密度达预设值时,用过表达HIMF基因的腺病毒载体感染巨噬细胞。
在一实施例中,在步骤S20之前,方法还包括:分离和培养骨髓来源巨噬细胞:将小鼠脱颈处死,依次浸泡于两个75%酒精烧杯中;用剪刀剪断大腿,分离股骨和胫骨,剔除皮肉后置于培养基中;剪断股骨和胫骨的关节面,暴露骨髓腔,用注射器冲洗骨髓腔,移液枪吹散细胞;细胞经细胞筛过滤后,收集细胞悬浮液至离心管中;离心,弃上清,用含有巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)的培养基重悬细胞,接种于多孔板中进行培养;3天后添加含有MCSF的培养基,再培养3天后获得的成熟的骨髓来源巨噬细胞。其中,巨噬细胞包括RAW264.7和/或骨髓来源巨噬细胞。
本申请还提出了一种调节巨噬细胞极化状态的药物组合物,药物组合物包括过表达HIMF基因的腺病毒载体。
其中,药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
其中,过表达HIMF基因的腺病毒载体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
SEQ.ID.NO.1:
AAATGTGGGCGGCCAAAGTGTATTGAAAGTGTTTACTCCATTGGGATGTGCTTGTATATATTCAGGGCCCCTAGGTCAGTAATCTCATAGTGTATTAAAAAGCATCTCATCTGGCAAGGTCCTGGAAACTTTTCTGAGATTCTGGTGAGTCAGTCAGCTCTGTAGGATCCTCTCTTCCTCCTAAACATCTGGAATAATTATAGTAGCATTTCTCCTGATGTTCTCACCCTCTCCTCTACCTCACATCCATCCTAGAGCTCATTGATCTCATCTTCTCTGCTCTTCCCCTCCAGCCCCAGGACACTGACTTTCAACAGGATGAAGACTGCAACCTGTTCCCTTCTCATCTGCGTCTTCCTTCTCCAGCTGATGGTCCCAGTGAATACTGATGGAACCTTAGACATTATTGGGAAGAAAAAGGTCAAGGAACTTCTAGCCCATCAAGGTATGAGATGAGTAGGAAAAATCATAGCTTAATCCTTGCTGATGATGACTGTACATAAGACCTAAAATCTCTTGTATCCTGGTCTAAGCTCTTAGTCCCCGTTATCCCTGCCTTCCTGACCAGGGCTTCCTTCAGCACCCTACACTTTTGAACTCTTGGATAACAGCTTAATGTTGTTGATGAAGATGAAGAAAAAGGATAGAACCTGTAATTTATAAACATATCACAAAACAAACATATTAAGCATTCAGTTAGTTCATTCAATTTTCACAGGCACTTTATGAGTTAAGTACAACTATTACTTTTTCTTTACAAATGAGGAAGCTAGATCTTAAAAGTTAGCAAGGGGACTACTTATGGAACCAGTGACACCCCCAAGATAGAGGAAGACTTATAAAAGAATTGTGAGAAAGATCATGGGCTATATCACCTTTCTCTCTTACTCAGATAACTATCCCTCTGCTGTAAGGAAGACCCTCTCATGCACTAATGTCAAGTCTATGAGCAAATGGGCCTCCTGCCCTGCTGGTGAGTAATTCCTTAAGGAGATTTTGTGAATACAGTGGGTTCCTCTGTGTCCTCCCTCATCAATCTCTTAATGCCATCTTTCTCCTAAGTCAGGTTTGTACTGCAATGGAACTGAGCTACAGTTCCAGATGTGCAGACACCACTTCCTGATTTTCAGCTCTCCAATGATGCTATTGAGGGACTTTTGGTTTCTGCCTTTCATGTCACTTCTTCCTTTATGCCAGCCCTTCCTGTCCCTCAAGTGTCTGGTAATGGATATATATGGCCTTCATTTCTTCCATAACCTTTTCCCTTGTATTGTGGGCAGCAGGAGTCAGAACAGGGGTGAATTTGCTATTAATTGAAAGACAGTGAAACTCCACCTTCCAAATCCTCCAGTTTAAGTAACTTTTGCACTTGGTTTGTTTGAAAAGAACTGTGGAATTTGAATAGCTTTTTGTTTTGCAAAATAGAGCAACTCATGTGCTTTCTAAGAAGGAAGAACAGTTAGGGACCTTCCCTCCCTTACAGTCCAAGGGCTCTGACATATCTGTCTCACATAACTATGCAGGGATGACTGCTACTGGTTGTTCTTGTGGCTTTGCCTGTGGATCTTGGGAAATCCAGAATGAAAATATTTGCAACTGCCTGTGCTTAATCGTTGACTGGGCCTATGCCCGCTGCTGCCAACTGTCCTAAGAATGGAGAGGCACAGAACTCAGCTTTGATATGATGAGTCTAACAAAACTGCAATCTCAACTTGGAAATCTGACTCATGCGCATTTGATGTATTCATATTGCCCATTAACCCCGCTTCTTGAAAAAATAAAGACAAATTTACATCTTTCTA
本申请还提出了前述药物组合物在制备炎症相关疾病治疗药物中的应用。
其中,疾病包括心血管疾病、脓血症、风湿性关节炎、炎症性胃肠道疾病、神经系统疾病或肿瘤中的任意一种或至少两种的组合。
其中,疾病包括导致心肌梗死的心血管疾病。
为了可以更好地理解本申请,主要从以下方面列举实施例:(1)采用过表达HIMF基因感染巨噬细胞,在体外细胞和动物实验中验证促进M1型巨噬细胞极化而抑制M2型巨噬细胞极化;(2)利用心肌梗死小鼠模型验证在巨噬细胞特异性敲除HIMF基因对炎症的进程和心脏坏死的抑制作用,技术方案路线图如图2所示。这些实施例仅用于说明的目的,并且不应被解释为以任何方式限制本申请的范围。
实施例1骨髓源性巨噬细胞(bone marrow derived macrophage,BMDM)的分离和培养
将小鼠脱颈处死,依次浸泡于两个75%酒精烧杯中;用剪刀剪断大腿,分离股骨和胫骨,剔除皮肉后置于10mL RPMI1640培养基(含10%FBS)中;剪断股骨和胫骨的关节面,暴露骨髓腔,用10mL注射器(1mL针头)冲洗骨髓腔,1mL移液枪吹散细胞;
细胞经细胞筛过滤后,收集细胞悬浮液至50mL离心管中;1000g离心8分钟,弃上清,用含有10ng/mL巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)的1640培养基重悬细胞,接种于6孔板中进行培养;3天后添加含有10ng/mL MCSF的培养基,再培养3天后获得的成熟骨髓源性巨噬细胞。
实施例2过表达HIMF基因对M1型巨噬细胞的影响
将RAW264.7细胞接种于6孔板中,待细胞密度达70%左右时,分别加入病毒滴度MO1-30的过表达HIMF基因的腺病毒载体感染RAW264.7细胞。使用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激诱导M1型巨噬细胞,48小时后收集细胞,分析相关标志基因TNFα、IL-1β、IL-6的表达。
将BMDM细胞接种于6孔板中,待细胞密度达70%左右时,分别加入病毒滴度MO1-30的过表达HIMF基因的腺病毒载体感染BMDM细胞。使用IFN-γ刺激诱导M1型巨噬细胞,48小时后收集细胞,分析相关标志基因TNFα、IL-1β、IL-6的表达。
结果如图3a和图3b所示,结果显示:与对照组相比,在LPS诱导的RAW264.7细胞中,过表达HIMF基因能够明显促进M1型巨噬细胞的极化,促进相关标志基因如TNFα、IL-1β、IL-6的表达;与此类似,与对照组相比,在IFNγ诱导的BMDM细胞中,过表达HIMF基因能够明显促进M1型巨噬细胞的极化,促进相关标志基因如TNFα、IL-1β、IL-6的表达。
实施例3过表达HIMF基因对M2型巨噬细胞的影响
将RAW264.7细胞接种于6孔板中,待细胞密度达70%左右时,分别加入病毒滴度MO1-30的过表达HIMF基因的腺病毒载体感染RAW264.7细胞。使用IL-4刺激诱导M2型巨噬细胞,48小时后收集细胞,分析相关标志基因Arg1、TGF以及IL-10的表达。
将BMDM细胞接种于6孔板中,待细胞密度达70%左右时,分别加入病毒滴度MO1-30的过表达HIMF基因的腺病毒载体感染BMDM细胞。使用IL-4刺激诱导M2型巨噬细胞,48小时后收集细胞,分析相关标志基因Arg1、TGF以及IL-10的表达。
结果如图4a和图4b所示,结果显示:在IL-4诱导的RAW264.7细胞中,过表达HIMF基因能够明显抑制M2型巨噬细胞的极化,IL-4诱导产生的相关标志基因(Arg1、TGF以及IL-10)能够被过表达HIMF基因抑制,并呈现浓度依赖性。与此类似,在IL-4诱导的BMDM细胞中,过表达HIMF基因能够明显抑制M2型巨噬细胞的极化,IL-4诱导产生的相关标志基因(Arg1、TGF以及IL-10)能够被过表达HIMF基因抑制,并呈现浓度依赖性。
实施例4构建小鼠心肌梗死模型
心肌梗死是持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死,可并发心律失常、休克或心力衰竭,常可危及生命。心肌梗死导致心肌细胞缺血坏死并引发严重的炎症反应,此时大量的巨噬细胞被募集至心脏以清除死亡心肌组织,同时分泌多种细胞因子和趋化因子,协助吞噬坏死细胞碎片并促进组织修复。这个过程由多种因素调控,并主要与组织微环境相关。在一些情况下,巨噬细胞调控失衡会造成不可逆的损伤,并加速心力衰竭的过程。
将特异性siRNA敲减或整体敲除巨噬细胞中HIMF基因后的小鼠(6-8周龄,体重20-24g)随机分为手术组和假手术组两组。
将戊巴比妥钠按照每100mL生理盐水溶解3g戊巴比妥钠的比例,配置3%戊巴比妥钠溶液,用干净的1mL的注射器吸取适量麻药(按每10g体重注射0.05mL 3%戊巴比妥钠溶液计)后,抓住小鼠颈背部皮肤,将小鼠斜向下倒置,将腹部脏器尽可能的向胸腔移位。暴露腹部后,将注射器与腹部皮肤呈45°刺入皮肤,摇晃注射器针头感觉针头在腹腔内活动自如,证明针头刺入腹腔内,大拇指推动注射器推柄注射麻药。
用镊子用力夹住小鼠尾巴,小鼠无反应表示小鼠麻醉成功,随后将小鼠固定在操作台上,夹出舌头以免插管至食管中。将准备好的管子顺着下颌插入气管中,进行机械通气(100次/分钟,每搏输出量为250μL)。观察机械通气的频率与小鼠胸腔起伏的频率一致,即说明气管插管成功。
检查气管插管和机械通气均操作无误后,沿着小鼠胸骨左侧第三和第四肋间隙切开皮肤,小心分离皮下组织和肌肉,打开胸腔,暴露心尖后,手术组的小鼠在体视显微镜下找出左冠状动脉前降支(LAD),用7-0缝合线缝合LAD,即可见左心室壁变白,室壁搏动减少,提示结扎成功;而假手术组的小鼠则打开胸腔,不结扎LAD。最后用7-0缝合线将肌肉和皮肤依次缝合,皮下注射0.9%的生理盐水0.2mL补液。
待小鼠情况稳定,可自主呼吸后,将气管插管轻轻拔出。小鼠醒后便可放回屏蔽笼继续饲养,待日后使用。
实施例5小鼠心脏巨噬细胞的分离及流式分析
(1)配置消化液:无血清的DMEM培养基每1mL溶解透明质酸酶0.48mg、Ⅰ型胶原酶3.6mg和DNA酶0.3μL,每颗心脏大约需要1mL消化液;
(2)配置HBSS:HANKS缓冲液中加入0.2%BSA和2%FBS,用0.22μm的滤网过滤;
(3)麻醉:将实施例4模型构建7天后的小鼠称重后记下标号,同前述麻醉操作,腹腔麻醉;
(4)灌流:沿着胸骨将小鼠胸腔剪开,注意不要剪破心脏。暴露出心脏后,在心脏左上方位置找到覆盖在心脏表面的左心耳,剪掉左心耳,将20mL注射器吸满预冷的PBS,换上1mL注射器的小号针头,从心尖处左心室的位置插入,注射PBS,使PBS从左心室进入,绕循环系统一周后从左心房流出,观察到肝脏和肺脏变得苍白后,灌流成功;
(5)消化:将灌流后的心脏取出,用吸水纸擦干水分后称重,称重完毕后,将心脏置于小皿中,滴入1滴PBS保持湿润,在冰上将心脏剪碎成泥状,将其转移到2mL离心管中,加入1mL消化液,用封口膜封口后置于37℃摇床100rpm消化1小时;
(6)终止消化:将离心管vortex震荡20s,肉眼观察无固体后,用40μm滤网将细胞悬液过滤至50mL离心管中,加HBSS终止消化;
(7)重悬:将终止消化的细胞悬液置于4℃离心机,低温400g离心5分钟,弃上清后,加stain buffer1mL,轻轻吹散细胞,并将细胞悬液转移至1.5mL离心管中,4℃400g离心5分钟后,加入200μL的stain buffer再一次重悬;
(8)封闭:以1:100的比例向200μL细胞悬液中加2μLCD16/CD32,避光条件下室温静置15分钟;
(9)染色:测定细胞量后,按照需要对封闭后的细胞悬液进行染色,分别加入CD45、CD11b和Ly6G,通过流式细胞术分选巨噬细胞。
(10)流式细胞术:操作流式细胞仪,使用特定的抗体组合CD45、CD11b、Ly6G筛选得到巨噬细胞,筛选结果如图5a和图5b所示,其中,图5a为对照组(未敲除巨噬细胞中HIMF基因的小鼠)的流式荧光筛选结果;图5b为实验组(特异性siRNA敲减或整体敲除巨噬细胞中HIMF基因后的小鼠)的流式荧光筛选结果。
(11)通过抗体CD45+CD11B+Ly6G-Ly6C+标记M1型巨噬细胞,结果如图6a所示,结果显示:与对照组(未敲除巨噬细胞中HIMF基因的小鼠)相比,巨噬细胞特异性敲除HIMF基因抑制了M1型巨噬细胞的极化;与对照组(未敲除巨噬细胞中HIMF基因的小鼠)相比,通过抗体CD45+CD11B+Ly6G-Ly6C-标记M2型巨噬细胞,结果如图6b所示,结果显示:巨噬细胞特异性敲除HIMF基因促进了M2型巨噬细胞的极化。
实施例5小鼠心脏切片Masson染色
(1)切片:小鼠脱颈处死后,取出完整心脏,用4%多聚甲醛完全浸泡置于摇床上室温固定1-3天,脱水包埋后使用切片机切片。
(2)烤片:将切片置于56℃恒温烘箱烘烤120分钟。
(3)水合:室温下依次将烘烤后的切片置入二甲苯、二甲苯、无水乙醇、无水乙醇、95%酒精、85%酒精、75%酒精、50%酒精中浸泡5分钟,梯度水合后用dd H20清洗5分钟,重复两次。
(4)染色:①将切片常规梯度水合后,按照说明书加入Bouin液,于室温作用一晚进行媒染,流水冲洗至切片上的黄色消失;②天青石蓝染色液滴染2-3分钟后,用洗瓶稍作冲洗;③Mayer苏木素染色液滴染2-3分钟,洗瓶稍作冲洗;④酸性乙醇极化液浸泡组织数秒后,置于水龙头下用流水冲洗10分钟,注意流水尽量不要冲到组织上;⑤丽春红品红染色液滴染10分钟后,流水稍冲洗,将水尽量甩干;⑥磷钼酸溶液浸泡组织10分钟左右,肉眼可见胶原纤维被染成无色或淡红,而肌纤维被染成鲜红色;⑦甩去上液,不用冲洗,直接滴入苯胺蓝染色液5分钟,无色或淡红的胶原纤维即可呈现蓝色;⑧为了出去原浆内的蓝色,用弱酸处理2分钟;⑨室温下依次将切片置入50%酒精、75%酒精、85%酒精、95%酒精、无水乙醇、无水乙醇、二甲苯、二甲苯中浸泡5分钟,梯度脱水;⑩用中性树胶小心固封,注意组织上不要存有气泡。
手术组、假手术组以及对照组的小鼠心脏切片染色照片如图7所示。
统计后,手术组和对照组的梗死区域如图8所示。
统计后,手术组和对照组的存活率如图9所示。
与现有技术相比,本申请具有如下有益效果:
(1)本申请采用过表达HIMF基因感染巨噬细胞,促进M1型巨噬细胞的极化,并抑制M2型巨噬细胞的极化,实现了特异性调节极化巨噬细胞功能及其引发的疾病的效果;
(2)本申请通过特异性siRNA敲减或整体敲除巨噬细胞中HIMF基因,抑制M1型促炎性巨噬细胞的功能,促进M2型巨噬细胞的功能,实现了特异性调节极化巨噬细胞功能及其引发的疾病的效果。
以上所述仅为本申请的实施方式,并非因此限制本申请的专利范围,凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本申请的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种调节巨噬细胞极化状态的方法,其特征在于,所述方法包括采用过表达HIMF基因感染巨噬细胞、或者采用特异性siRNA敲减或整体敲除巨噬细胞中HIMF基因的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述采用过表达HIMF基因感染巨噬细胞的步骤,包括:
构建过表达HIMF基因的腺病毒载体;
将所述巨噬细胞接种于多孔板中;
待所述巨噬细胞的细胞密度达预设值时,用所述过表达HIMF基因的腺病毒载体感染所述巨噬细胞。
3.根据权利要求1-2任一项所述的方法,其特征在于,所述巨噬细胞包括RAW264.7和/或骨髓来源巨噬细胞。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,将所述巨噬细胞接种于多孔板中的步骤之前,所述方法还包括:
分离和培养骨髓来源巨噬细胞:将小鼠脱颈处死,依次浸泡于两个75%酒精烧杯中;用剪刀剪断大腿,分离股骨和胫骨,剔除皮肉后置于培养基中;剪断股骨和胫骨的关节面,暴露骨髓腔,用注射器冲洗骨髓腔,移液枪吹散细胞;细胞经细胞筛过滤后,收集细胞悬浮液至离心管中;离心,弃上清,用含有巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)的培养基重悬细胞,接种于多孔板中进行培养;3天后添加含有MCSF的培养基,再培养3天后获得的成熟的所述骨髓来源巨噬细胞。
5.一种调节巨噬细胞极化状态的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包括过表达HIMF基因的腺病毒载体。
6.根据权利要求5所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
7.根据权利要求5所述的药物组合物,其特征在于,所述过表达HIMF基因的腺病毒载体的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示;
SEQ.ID.NO.1:
AAATGTGGGCGGCCAAAGTGTATTGAAAGTGTTTACTCCATTGGGATGTGCTTGTATATATTCAGGGCCCCTAGGTCAGTAATCTCATAGTGTATTAAAAAGCATCTCATCTGGCAAGGTCCTGGAAACTTTTCTGAGATTCTGGTGAGTCAGTCAGCTCTGTAGGATCCTCTCTTCCTCCTAAACATCTGGAATAATTATAGTAGCATTTCTCCTGATGTTCTCACCCTCTCCTCTACCTCACATCCATCCTAGAGCTCATTGATCTCATCTTCTCTGCTCTTCCCCTCCAGCCCCAGGACACTGACTTTCAACAGGATGAAGACTGCAACCTGTTCCCTTCTCATCTGCGTCTTCCTTCTCCAGCTGATGGTCCCAGTGAATACTGATGGAACCTTAGACATTATTGGGAAGAAAAAGGTCAAGGAACTTCTAGCCCATCAAGGTATGAGATGAGTAGGAAAAATCATAGCTTAATCCTTGCTGATGATGACTGTACATAAGACCTAAAATCTCTTGTATCCTGGTCTAAGCTCTTAGTCCCCGTTATCCCTGCCTTCCTGACCAGGGCTTCCTTCAGCACCCTACACTTTTGAACTCTTGGATAACAGCTTAATGTTGTTGATGAAGATGAAGAAAAAGGATAGAACCTGTAATTTATAAACATATCACAAAACAAACATATTAAGCATTCAGTTAGTTCATTCAATTTTCACAGGCACTTTATGAGTTAAGTACAACTATTACTTTTTCTTTACAAATGAGGAAGCTAGATCTTAAAAGTTAGCAAGGGGACTACTTATGGAACCAGTGACACCCCCAAGATAGAGGAAGACTTATAAAAGAATTGTGAGAAAGATCATGGGCTATATCACCTTTCTCTCTTACTCAGATAACTATCCCTCTGCTGTAAGGAAGACCCTCTCATGCACTAATGTCAAGTCTATGAGCAAATGGGCCTCCTGCCCTGCTGGTGAGTAATTCCTTAAGGAGATTTTGTGAATACAGTGGGTTCCTCTGTGTCCTCCCTCATCAATCTCTTAATGCCATCTTTCTCCTAAGTCAGGTTTGTACTGCAATGGAACTGAGCTACAGTTCCAGATGTGCAGACACCACTTCCTGATTTTCAGCTCTCCAATGATGCTATTGAGGGACTTTTGGTTTCTGCCTTTCATGTCACTTCTTCCTTTATGCCAGCCCTTCCTGTCCCTCAAGTGTCTGGTAATGGATATATATGGCCTTCATTTCTTCCATAACCTTTTCCCTTGTATTGTGGGCAGCAGGAGTCAGAACAGGGGTGAATTTGCTATTAATTGAAAGACAGTGAAACTCCACCTTCCAAATCCTCCAGTTTAAGTAACTTTTGCACTTGGTTTGTTTGAAAAGAACTGTGGAATTTGAATAGCTTTTTGTTTTGCAAAATAGAGCAACTCATGTGCTTTCTAAGAAGGAAGAACAGTTAGGGACCTTCCCTCCCT TACAGTCCAAGGGCTCTGACATATCTGTCTCACATAACTATGCAGGGATGACTGCTACTGGTTGTTCTTGTGGCTTTGCCTGTGGATCTTGGGAAATCCAGAATGAAAATATTTGCAACTGCCTGTGCTTAATCGTTGACTGGGCCTATGCCCGCTGCTGCCAACTGTCCTAAGAATGGAGAGGCACAGAACTCAGCTTTGATATGATGAGTCTAACAAAACTGCAATCTCAACTTGGAAATCTGACTCATGCGCATTTGATGTATTCATATTGCCCATTAACCCCGCTTCTTGAAAAAATAAAGACAAATTTACATCTTTCTA。
8.权利要求5-7任一项所述的药物组合物在制备炎症相关疾病治疗药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述疾病包括心血管疾病、脓血症、风湿性关节炎、炎症性胃肠道疾病、神经系统疾病或肿瘤中的任意一种或至少两种的组合。
10.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述疾病包括导致心肌梗死的心血管疾病。
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