CN108721648B - 一种多功能微泡及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种多功能微泡，集超声/荧光双模态成像及基因治疗/光动力治疗于一体。由实施例结果可知，所述多功能微泡具有优异的基因转染能力、产生单线态氧的能力，具有超声显影增强性以及荧光成像能力，能够有效抑制肿瘤细胞的生长。本发明还提供了所述多功能微泡的制备方法，该方法操作简便，易于实施。本发明还提供了所述多功能微泡的应用，能够用于制备癌症的诊断或治疗试剂。

Description

一种多功能微泡及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其涉及一种多功能微泡及其制备方法和应用。
背景技术
荧光成像是分子生物学和医学研究极为重要的技术手段，其中近红外区域(波长600～900nm)生物分子的光吸收最低，而自发荧光最弱，大量的近红外光可以穿过组织和皮肤而被检测到。因此，近红外光的波长范围被认为是光学成像的“诊断窗”，其独特优势为：①敏感性高；②可通过不同荧光探针的设计实现各种肿瘤的靶向性成像；③可提供实时动态的肿瘤活体成像。但是，近红外染料受限于成像深度(不超过1cm)，从而影响了在显示深部肿瘤中的应用。
超声诊断是一种无创、无痛、方便、直观的有效检查手段，而且通常比其他成像技术便宜，被广泛应用于癌症的早期诊断，它可以提供实时的软组织结构和血流信号。然而，超声图像没有很强的对比度，有时成像的区域被组织掩埋和遮蔽。引用与机体组织声学特征不同的物质—超声造影剂(可以为气体、固体或者液体)，使血液内出现明显不同的界面来清楚地鉴别待查目标与周围组织，显著的提高了诊断的准确率。由于超声波可以穿透较深的组织，因此荧光/超声双模态成像，提供一种深浅兼顾的诊断方法，提高了肿瘤的诊出率。
基因治疗(Gene therapy)通过一定的方式将目的基因递送到靶器官、组织或细胞内，将特定基因封闭抑制或者激活来达到治疗目的，可以从根源上修正引起疾病的异常基因，使治疗手段从传统的手术、放疗以及化疗扩大到分子水平。裸露的基因生物半衰期短、细胞靶向性差且具有一定的免疫源性，因此基因治疗成功的关键是在载体参与下将外源的目的基因递送到靶细胞进行有效的转染与表达，寻找可载基因的高效、低免疫原性的载体，成为研究的前提和基础，是一个亟待突破的研究领域。
光动力治疗(Photodynamic therapy，PDT)由于其可以反复使用，可以实现被动靶向，不会产生累积的副作用，因此被认为是一种无创、耐受性好的替代疗法。PDT的关键是足量的光敏剂富集在肿瘤区域并暴露在特定波长的光下，产生具有大量细胞毒性的单线态氧(1O2)或活性氧(ROS)，杀伤肿瘤细胞，因此提高肿瘤区域光敏剂的富集以及增加单线态氧(1O2)或活性氧(ROS)的产率可以大大的提高PDT治疗效果。
可见，荧光成像技术、超声诊断技术、基因治疗技术和光动力治疗技术均有其独特的优势，但是，同时也具有其自身的局限性。因此，如何将上述各技术手段结合使用，这是本领域技术人员一直以来所追求的目标。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多功能微泡及其制备方法和应用，本发明提供的多功能微泡集超声/荧光双模态成像及基因治疗/光动力治疗于一体。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种多功能微泡，包含膜组分、包裹于膜组分内部的造影剂以及吸附于膜组分外表面的核酸；
所述膜组分为共价结合的磷脂和含有光敏剂功能基团的阳离子脂质，所述含有光敏剂功能基团的阳离子脂质中的光敏剂功能基团位于膜组分内部；
所述多功能微泡的粒径为1～7μm。
优选的，所述含有光敏剂功能基团的阳离子脂质的结构式如式Ⅰ所示：
Figure BDA0001688030340000021
式Ⅰ中，
G为光敏剂功能基团；
R1和R2独立的为C6～18烷基；
a和b独立的为2或3；
X为N或O。
优选的，所述造影剂为液态造影剂和/或气态造影剂；
所述液态造影剂为液态氟碳烃；
所述气态造影剂为空气、氮气、二氧化碳和气态氟碳烃中的一种或几种。
本发明提供了一种所述多功能微泡的制备方法，包含如下步骤：
(1)将磷脂与含有光敏剂功能基团的阳离子脂质溶于乙醇中，得到乙醇混合液；
(2)将所述乙醇混合液和生理盐水混合，得到生理盐水体系；
(3)对所述生理盐水体系进行透析，得到透析液；
(4)将所述透析液和稳定剂混合，得到稳定体系；
(5)向稳定体系中添加造影剂，震荡后得到初级微泡；
(6)将所述初级微泡和核酸混合，得到多功能微泡；
优选的，所述步骤(1)中磷脂与含有光敏剂功能基团的阳离子脂质的摩尔比为1:(0.5～2)；
所述磷脂在乙醇混合液中的浓度为0.5～2mg/mL。
优选的，所述步骤(2)中乙醇混合液和生理盐水的体积比为1:(3～5)。
优选的，所述步骤(4)中稳定剂为丙二醇和甘油的混合物；
所述丙二醇、甘油和透析液的体积比为(0.5～2):(0.5～2):10。
优选的，所述步骤(5)中震荡的频率为50～60Hz，震荡的时间为40～50s。
优选的，所述步骤(6)初级微泡膜组分阳离子基团中N和核酸中的P的摩尔比为(5～30):1。
本发明还提供了一种所述多功能微泡在制备癌症的诊断或治疗试剂中的应用。
本发明提供了一种多功能微泡，包含膜组分、包裹于膜组分内部的造影剂以及吸附于膜组分外表面的核酸；所述膜组分为共价结合的磷脂和含有光敏剂功能基团的阳离子脂质，所述含有光敏剂功能基团的阳离子脂质中的光敏剂功能基团位于膜组分内部；所述多功能微泡的粒径为1～7μm。本发明将用于光动力治疗的具有光敏剂功能基团的阳离子脂质组装到超声造影剂的膜组分中，将用于基因治疗的核酸物理结合于膜表面，在超声引导下可在肿瘤部位定点击破微泡，使其转变为纳米粒子并释放核酸，在超声空化作用下，纳米粒子及基因更多的被肿瘤细胞摄取，随后在荧光成像引导下，在肿瘤部位实施光动力联合治疗。所述多功能微泡集超声/荧光双模态成像及基因治疗/光动力治疗于一体。由实施例结果可知，所述多功能微泡具有优异的基因转染能力、产生单线态氧的能力，具有超声显影增强性以及荧光成像能力，能够有效抑制肿瘤细胞的生长。
本发明还提供了所述多功能微泡的制备方法，该方法操作简便，易于实施。
本发明还提供了所述多功能微泡的应用，能够用于制备癌症的诊断或治疗试剂。
附图说明
图1为本发明多功能微泡的结构示意图；
图2为是实施例1多功能微泡的粒径分布图；
图3为实施例4中多功能微泡造影剂体外mRNAHIF1α沉默效果；
图4为实施例5中多功能微泡造影剂体外在激光照射下产生单线态氧能力的测定结果；
图5是实施例6中微泡造影剂在动物肿瘤组织处的超声造影图像；
图6是实施例7中微泡造影剂在动物肿瘤组织处被超声击破后，经激光照射后肿瘤组织的近红外成像图；
图7是实施例8中微泡造影剂用于光热和光动力联合治疗下的动物肿瘤生长曲线；
图中，1-造影剂，2-核酸。
具体实施方式
本发明提供了一种多功能微泡，包含膜组分、包裹于膜组分内部的造影剂以及吸附于膜组分外表面的核酸；
所述膜组分为共价结合的磷脂和含有光敏剂功能基团的阳离子脂质，所述含有光敏剂功能基团的阳离子脂质中的光敏剂功能基团位于膜组分内部；
所述多功能微泡的粒径为1～7μm。
本发明所述多功能微泡包含膜组分，所述膜组分为共价结合的磷脂和含有光敏剂功能基团的阳离子脂质。在本发明中，所述磷脂优选为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)、胆固醇、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DPPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸(DPPA)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000(DSPE-PEG5000)中的一种或几种。
在本发明中，所述含有光敏剂功能基团的阳离子脂质为光敏剂功能基团共价连接在阳离子脂质上得到的物质，其结构式优选如式Ⅰ所示：
Figure BDA0001688030340000051
本发明所述式Ⅰ中，G为光敏剂功能基团，优选为血卟啉基团、原卟啉基团、四苯基卟啉基团、焦脱镁叶绿酸(pyropheophorbide)基团、细菌叶绿素基团、叶绿素a基团、苯并卟啉衍生物基团、四氢苯基二氢卟吩基团、苯并二氢卟吩基团、萘并二氢卟吩基团、酞菁基团和萘酞菁基团中的一种或几种；R1和R2独立的优选为C6～18烷基，更优选为C8～16烷基，最优选为C10～14烷基；a和b独立的优选为2或3；X优选为N或O。在本发明具体实施例中，所述含有光敏剂功能基团的阳离子脂质优选为阳离子四苯基卟啉脂质。
在本发明中，所述膜组分为共价结合的磷脂和含有光敏剂功能基团的阳离子脂质，所述含有光敏剂功能基团的阳离子脂质中的光敏剂功能基团位于膜组分内部。本发明所述含有光敏剂功能基团的阳离子脂质的生物相容性好、单线态氧量子产率高。
本发明所述多功能微泡，包含吸附于膜组分外表面的核酸。在本发明中，所述核酸可以为DNA或RNA；由于核酸显负电性，能够与含有光敏剂功能基团的阳离子脂质中的阳离子发生静电吸附作用，进而通过吸附力结合于膜组分的外表面。在本发明具体实施例中，所述核酸优选为SiRNA，更优选为siRNAHIF1α(购自上海吉玛制药技术有限公司)。
本发明所述多功能微泡，包含包裹于膜组分内部的造影剂。在本发明中，所述造影剂优选为液态造影剂和/或气态造影剂；所述液态造影剂优选为液态氟碳烃，更优选为C5～12的氟碳烃，最优选为C7～10的氟碳烃；所述气态造影剂优选为空气、氮气、二氧化碳和气态氟碳烃中的一种或几种。
本发明所述多功能微泡的粒径为1～7μm，优选为2～6μm，更优选为3～4μm。
本发明还提供了一种所述多功能微泡的制备方法，包含如下步骤：
(1)将磷脂与含有光敏剂功能基团的阳离子脂质溶于乙醇中，得到乙醇混合液；
(2)将所述乙醇混合液和生理盐水混合，得到生理盐水体系；
(3)对所述生理盐水体系进行透析，得到透析液；
(4)将所述透析液和稳定剂混合，得到稳定体系；
(5)向稳定体系中添加造影剂，震荡后得到初级微泡；
(6)将所述初级微泡和核酸混合，得到多功能微泡。
本发明将磷脂与含有光敏剂功能基团的阳离子脂质溶于乙醇中，得到乙醇混合液。在本发明中，所述步骤(1)中磷脂与含有光敏剂功能基团的阳离子脂质的摩尔比优选为1:(0.5～2)，更优选为1:(0.8～1.5)，最优选为(1～1.2)；所述磷脂在乙醇混合液中的浓度优选为0.5～2mg/mL，更优选为1～1.2mg/mL。
本发明对所述制备方法中所涉及到的所有原料的来源均没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的市售产品即可。
得到乙醇混合液后，本发明将所述乙醇混合液和生理盐水混合，得到生理盐水体系。本发明优选采用乙醇注入法，将所述乙醇混合液滴加至生理盐水中。所述混合之后，本发明优选对得到的混合物进行超声处理，得到生理盐水体系。在本发明中，所述超声处理的温度优选为40～60℃，更优选为45～55℃，最优选为50～52℃；所述超声处理的时间优选为15～30min，更优选为20～25min；所述超声处理的频率优选为80～120MHz，更优选为90～110MHz，最优选为100～105MHz。在本发明中，磷脂和脂质在所述超声条件下发生自组装；同时，所述超声处理能够帮助含有光敏剂功能基团的阳离子脂质在水中分散均匀，形成粒径小且均匀的纳米粒子。
在本发明中，所述步骤(2)中乙醇混合液和生理盐水的体积比优选为1:(3～5)，更优选为1:4。
得到生理盐水体系后，本发明对所述生理盐水体系进行透析，得到透析液。本发明优选使用8000～14000KD的透析袋进行所述透析，更优选为9000～13000KD，最优选为10000～12000KD。在本发明中，所述透析优选在室温下进行，所述透析的时间优选为2～4h，更优选为3h。本发明所述透析能够将生理盐水体系中的乙醇除去。
得到透析液后，本发明将所述透析液和稳定剂混合，得到稳定体系。在本发明中，所述步骤(4)中稳定剂优选为丙二醇和甘油的混合物；所述丙二醇、甘油和透析液的体积比优选为(0.5～2):(0.5～2):10，更优选为(1～1.2):(1～1.2):10。在本发明中，所述稳定剂能够保证形成初级微泡的稳定性。
得到稳定体系后，本发明向稳定体系中添加造影剂，震荡后得到初级微泡。本发明对添加造影剂的具体实施方式没有特殊要求，采用本领域技术人员所常用的方法进行即可。在本发明具体实施例中，所述造影剂的添加优选在西林瓶中进行，待添加完毕所述造影剂之后将西林瓶封口，进行震荡。在本发明中，所述震荡优选在银汞调和器中进行，所述震荡的速率优选≥4000r/min，更优选≥5000r/min，最优选≥6000r/min；所述震荡的频率优选为50～60Hz，更优选为55～58Hz；所述震荡的时间优选为40～50s，更优选为45～47s。本发明所述震荡过程中，含有光敏剂功能基团的阳离子脂质中的亲水侧自动转移至外侧，亲油侧自动转移至内侧，形成封闭的膜，将具有疏水性质的造影剂包裹在膜内。
得到初级微泡后，本发明将所述初级微泡和核酸混合，得到多功能微泡。本发明优选在所述混合结束后，将得到的混合物静置10～20min，更优选为15～18min。在本发明中，所述静置能够使核酸和含有光敏剂功能基团的阳离子脂质中的阳离子脂质结合的更充分。在本发明中，所述核酸的添加量优选根据氮磷比计算，所述步骤步骤(6)初级微泡膜组分阳离子基团中N和核酸中的P的摩尔比优选为(5～30):1，更优选为(10～25):1，最优选为(15～30):1。
本发明优选对所述混合静置后得到的多功能微泡体系进行分离提纯，以得到纯净的多功能微泡；所述分离提纯优选采用本领域技术人员所常用的低速离心。在本发明中，所述分离提纯过程的转速优选为700～900r/min，更优选为800～850r/min；所述分离提纯的时间优选为3～8min，更优选为5min。
本发明还提供了一种所述多功能微泡在制备癌症的诊断或治疗试剂中的应用。本发明所述多功能微泡在超声条件下可释放核酸，转变为纳米粒子；所述纳米粒子的粒径优选为50～200nm，更优选为80～150nm，最优选为100～120nm。
下面结合实施例对本发明提供的多功能微泡及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明得到的多功能微泡的结构示意图如图1所示，其中，1为膜内包裹的造影剂，2为核酸，其余部分为膜组分。
实施例1
将二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇(cholesterol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和阳离子四苯基卟啉脂质(CPGL)按照一定摩尔比(35％:10％:5％:50％)混合后溶于乙醇中，其中，所述阳离子卟啉脂质在乙醇中的浓度为1mg/mL；然后采用乙醇注入法，在50℃水浴、100MHz超声频率下，将0.15mL上述混合物注入到0.8ml生理盐水中，超声处理20分钟；将上述所得到的溶液置于截留分子量为8000Da的透析袋中，透析3h，取出后分别加入甘油和丙二醇各100μL混合均匀，将混合液装入3.5mL西林瓶中，充全氟丙烷(C3F8)气体赶尽空气，且至常压，振荡器震荡45s，根据N/P＝15:1加入适量的siRNAHIF1α，室温下静置15min，分离提纯后得到集超声/荧光双模态成像及基因治疗/光动力治疗于一体的多功能微泡(siHIF@CpMBs)。
本实施例得到的多功能微泡的粒径分布如附图2所示。由图2可知，所得多功能微泡的粒径主要分布在1～7μm范围内，且主要为小粒径，符合临床上用于超声成像的造影剂的粒径应小于8μm的要求，有利于多功能微泡通过肺毛细血管，避免引起肺栓塞。
实施例2
将二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)、阳离子四苯基卟啉脂质(CPGL)按照一定摩尔比(45％:5％:50％)混合后溶于乙醇中，其中，所述阳离子卟啉脂质在乙醇中的浓度为1mg/mL；然后采用乙醇注入法，在50℃水浴、100MHz超声频率下，将0.2mL上述混合物注入到0.8ml水中，超声处理20分钟；将上述所得到的溶液置于截留分子量为14000Da的透析袋中，透析2h，然后分别加入甘油和丙二醇各100μL混合均匀。将混合液装入3.5mL西林瓶中，充全氟丁烷气体赶尽空气，且至常压，振荡器震荡45s，根据N/P＝30:1加入适量的siRNAHIF1α，室温下静置15min，分离提纯后得到集超声/荧光双模态成像及基因治疗/光动力治疗于一体的多功能微泡(siHIF@CpMBs)。
对本实施例得到的多功能微泡的粒径分布进行检测，所得多功能微泡的粒径主要分布在1～7μm范围内，且主要为小粒径。
实施例3
将二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、1，2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷脂酸(DPPA)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)和阳离子四苯基卟啉脂质(CPGL)按照一定摩尔比(35％:10％:5％:50％)混合后溶于乙醇中，其中，所述阳离子卟啉脂质在乙醇中的浓度为1mg/mL；然后采用乙醇注入法，在50℃水浴、100MHz超声频率下，将0.18mL上述混合物注入到0.8ml水中，超声处理20分钟；将上述所得到的溶液置于截留分子量为12000Da的透析袋中，透析4h，然后分别加入甘油和丙二醇各100μL混合均匀。将混合液装入3.5mL西林瓶中，充全氟溴辛烷气体赶尽空气，振荡器震荡45s，根据N/P＝20:1加入适量的siRNAHIF1α，室温下静置15min，分离提纯后得到集超声/荧光双模态成像及基因治疗/光动力治疗于一体的多功能微泡(siHIF@CpMBs)。
对本实施例得到的多功能微泡的粒径分布进行检测，所得多功能微泡的粒径主要分布在1～7μm范围内，且主要为小粒径。
实施例4
为了评价实施例1所获得的多功能微泡的核酸转染能力，经过不同治疗条件处理后(有或没有超声1W/cm2，3min；有或没有激光650±5nm，10min；)，以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)为阴性对照，用qRT-PCR技术评价缺氧诱导因子1α(HIF1αmRNA)的表达，缺氧诱导因子1α是一种普遍存在的氧敏感性转录调节因子。与对照组相比(PBS)，siHIF@CpMBs+超声(US)或siHIF@CpMBs+超声+激光(Laser)大约80％HIF-1αmRNA表达下调。相反，siHIF@CpMBs+激光(无超声处理)表现出的影响可以忽略。以上结果表示，超声的声孔效应提高了siHIF@CpMBs的HIF 1α敲除效率，这是由于声孔效应增加了肿瘤细胞对siHIF的摄取。
图3为实施例4中多功能微泡造影剂体外HIF1αmRNA沉默效果，由图3可知siHIF@CpMBs对MDA-mb-231细胞HIF1αmRNA表达的影响(*P<0.05)，siHIF@CpMBs+US组和siHIF@CpMBs+US+Laser组HIF 1αmRNA明显被下调，也就是说在空化效应增加细胞膜的通透性，增加了核酸的摄取。
实施例5
为了评价实施例1中获得的多功能微泡产生单线态氧的能力，肿瘤细胞(MD-MBA-231)经过不同的处理后(超声＝1W/cm2，3min；有或没有激光＝650±5nm，10min)，使用单线态氧探针SOSG检测此过程中单线态氧的产生量。肿瘤细胞与siHIF@CpMBs孵育4h，然后经650±5nm激光照射后，siHIF@CpMBs+超声+激光处理细胞出现较强的绿色荧光，提示产生1O2，相比之下，仅用激光或siHIF@CpMBs+超声治疗的对照组几乎没有观察到绿色荧光，结果见附图4。
图4为实施例5中多功能微泡造影剂体外在激光照射下产生单线态氧能力的测定，比例尺＝10μm。具体的，SOSG是单态氧指示剂，当有单线态氧产生时，SOSG被氧化为SOSG-EP发绿色荧光，siHIF@CpMBs+US+Laser组产生了非常明显的绿色荧光，而siHIF@CpMBs+US–Laser没有产生明显的绿色荧光，由此可见，该多功能微泡只有在有激光存在的条件下，才会产生有生物毒性的活性氧。
实施例6
为了评估实施例1中获得的多功能微泡体内超声显影增强性能，对接种了皮下MD-MBA-231肿瘤的裸鼠进行肿瘤超声成像。按照1mL/kg的微泡浓度尾静脉注射到裸鼠体内，紧接着注射100μL生理盐水。使用超声诊断仪contrast模式，MI:0.104(机械指数)，探头频率：3～12MHz。注射前肿瘤组织中几乎没有超声造影剂，静脉注射siHIF@CpMBs后，肿瘤微血管清晰显示，信噪比明显提高，比传统二维超声显像具有更好的定位诊断效果，图像见附图5。
图5是具体实施例6中微泡造影剂在动物肿瘤组织处的超声造影图像，由图5可知，该多功能微泡是良好的造影剂，可以用于影像指导。
实施例7
为了评估实施例1中获得的多功能微泡在体内对肿瘤进行荧光成像的能力，对接种了皮下MD-MBA-231肿瘤的裸鼠进行荧光成像。按照1mL/kg的微泡浓度尾静脉注射到裸鼠体内，紧接着注射100μL生理盐水。在超声成像引导下进行高能量超声辐照肿瘤部位击碎微泡(1.03MHz，50％duty，1W/cm2，3min)，然后0.5h、3h、6h、9h、24h分别对小鼠进行近红外荧光成像。
体内活体荧光成像图像如附图6所示，图6是具体实施例7中微泡造影剂在动物肿瘤组织处被超声击破后，经激光照射后肿瘤组织的近红外成像图，超声爆破后，增加了肿瘤组织中血管以及肿瘤细胞膜的通透性，从而增加了肿瘤组织的富集；肿瘤部位超声击破微泡后，3小时后即可见肿瘤部位的荧光强度远远强于其他组织或器官。
实施例8
体内基因治疗和光动力联合治疗实验考察了实施例1中获得的多功能微泡是否能对肿瘤生长进行有效抑制。将携带MD-MBA-231皮下肿瘤的裸鼠随机分为5组，分别用PBS、siHIF@CpMBs+超声+激光、siHIF@CpMBs+超声、siHIF@CpMBs+激光、siN.C+超声+激光处理，其中，超声＝1W/cm2，3min；有激光＝650±5nm，30min；给药方式均为尾静脉注射200ul。每组小鼠治疗后，每天记录其肿瘤体积及体重变化(肿瘤体积＝长*宽^2/2)。siHIF@CpMBs+超声+激光治疗完全抑制肿瘤的生长和复发，而siN.C(阴性对照组，无效果siRNA)+超声+激光治疗组肿瘤再生生长至1000mm3左右，提示下调HIF1α的表达可增强光动力疗法PDT的疗效，显示PDT与基因治疗的协同作用。PDT与基因治疗的结合是由我们的siHIF@CpMBs系统在超声辅助下实现的，在三阴性乳腺癌治疗中显示出巨大的潜力。由此可见，微泡联合超声肿瘤部位靶向击破技术可以使得更多的治疗试剂被肿瘤细胞摄取，发挥更有效的治疗作用。
结果如附图7所示，图7是具体实施例8中微泡造影剂用于光热和光动力联合治疗下的动物肿瘤生长曲线(*P<0.05，**P<0.001)，siN.C@CpMBs+US+Laser和siHIF@CpMBs+US+Laser组，明显的抑制肿瘤组织的生长，也就是说在超声波增加了肿瘤组织的富集，且siHIF@CpMBs+US+Laser组抑制更加的明显，充分证明了基因治疗联合光动力治疗可明显的抑制肿瘤的生长。
由以上实施例可知，本发明提供了一种多功能微泡，包含膜组分、包裹于膜组分内部的造影剂以及吸附于膜组分外表面的核酸；所述膜组分为共价结合的磷脂和含有光敏剂功能基团的阳离子脂质，所述含有光敏剂功能基团的阳离子脂质中的光敏剂功能基团位于膜组分内部；所述多功能微泡的粒径为1～7μm。本发明将用于光动力治疗的具有光敏剂功能基团的阳离子脂质组装到超声造影剂的膜成分中，将用于基因治疗的核酸物理结合于膜表面，在超声引导下可在肿瘤部位定点击破微泡，使其转变为纳米粒子并释放核酸，在超声空化作用下，纳米粒子及基因更多的被肿瘤细胞摄取，随后在荧光成像引导下，在肿瘤部位实施光动力联合治疗。所述多功能微泡集超声/荧光双模态成像及基因治疗/光动力治疗于一体。由实施例结果可知，所述多功能微泡具有优异的基因转染能力、产生单线态氧的能力，具有超声显影增强性以及荧光成像能力，能够有效抑制肿瘤细胞的生长。
本发明还提供了所述多功能微泡的制备方法，该方法操作简便，易于实施。
本发明还提供了所述多功能微泡的应用，能够用于制备癌症的诊断或治疗试剂。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种多功能微泡，包含膜组分、包裹于膜组分内部的造影剂以及吸附于膜组分外表面的核酸；
所述膜组分为共价结合的磷脂和含有光敏剂功能基团的阳离子脂质，所述含有光敏剂功能基团的阳离子脂质中的光敏剂功能基团位于膜组分内部；
所述多功能微泡的粒径为1～7μm；
所述含有光敏剂功能基团的阳离子脂质的结构式如式Ⅰ所示：
Figure FDA0002703583540000011
式Ⅰ中，
G为光敏剂功能基团；
R1和R2独立的为C6～18烷基；
a和b独立的为2或3；
X为N或O。
2.根据权利要求1所述的多功能微泡，其特征在于，所述造影剂为液态造影剂和/或气态造影剂；
所述液态造影剂为液态氟碳烃；
所述气态造影剂为空气、氮气、二氧化碳和气态氟碳烃中的一种或几种。
3.权利要求1或2所述多功能微泡的制备方法，包含如下步骤：
(1)将磷脂与含有光敏剂功能基团的阳离子脂质溶于乙醇中，得到乙醇混合液；
(2)将所述乙醇混合液和生理盐水混合，得到生理盐水体系；
(3)对所述生理盐水体系进行透析，得到透析液；
(4)将所述透析液和稳定剂混合，得到稳定体系；
(5)向稳定体系中添加造影剂，震荡后得到初级微泡；
(6)将所述初级微泡和核酸混合，得到多功能微泡。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中磷脂与含有光敏剂功能基团的阳离子脂质的摩尔比为1:(0.5～2)；
所述磷脂在乙醇混合液中的浓度为0.5～2mg/mL。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中乙醇混合液和生理盐水的体积比为1:(3～5)。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中稳定剂为丙二醇和甘油的混合物；
所述丙二醇、甘油和透析液的体积比为(0.5～2):(0.5～2):10。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(5)中震荡的频率为50～60Hz，震荡的时间为40～50s。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)初级微泡膜组分阳离子基团中N和核酸中的P的摩尔比为(5～30):1。
9.权利要求1或2所述多功能微泡或者权利要求3～8任意一项所述制备方法得到的多功能微泡在制备癌症的诊断或治疗试剂中的应用。
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