CN103690486A - 一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体及其制备方法和应用 - Google Patents
一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体，所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体包括吲哚菁绿、磷脂层和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层，所述吲哚菁绿被所述磷脂层环绕，所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的叶酸，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂穿插于所述磷脂层，所述叶酸暴露在所述磷脂层外，所述吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为（1～5）：（1～3）：（1～3），本发明还提供了一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体的制备方法和光热治疗应用，所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体在应用时，所述吲哚菁绿不易聚集、稳定性和靶向性良好。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料领域，特别涉及一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体及其制备方法和光热治疗应用。
背景技术
吲哚菁绿（ICG）是一种三碳化氢类染料，其最大吸收波长和最大发射波长在740nm和800nm的近红外区域，荧光穿透力强，是唯一一种被美国食品药品监督管理局（FDA)批准的用于人类医学成像和诊断的试剂，同时它作为一种光热制剂应用于临床热疗。但是，吲哚菁绿在极性溶剂中会迅速聚集，稳定性较差，其在血浆中会被快速清除，在体内循环时间短，同时吲哚菁绿还缺乏肿瘤细胞靶向特异性，这些缺陷大大限制了吲哚菁绿的应用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体及其制备方法和应用。所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体中在使用时，吲哚菁绿不易聚集，制得的吲哚菁绿纳米靶向脂质体稳定性和靶向识别能力良好，同时制备方法工艺简单。
第一方面，本发明提供了一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体，所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体包括吲哚菁绿、磷脂层和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层，所述吲哚菁绿被所述磷脂层环绕，所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的叶酸，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂穿插于所述磷脂层，所述叶酸暴露在所述磷脂层外，所述吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为（1～5）：（1～3）：（1～3）。
优选地，所述吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为1:1.7:1.7。
优选地，所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体的粒径为10nm～100nm。
优选地，所述磷脂层中的磷脂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷、脂酰胆碱或氢化大豆磷脂。
优选地，所述聚乙二醇衍生化磷脂由聚乙二醇通过共价键和磷脂类物质相连得到，所述聚乙二醇的分子量为200～20000。
本发明第一方面提供的所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体包括吲哚菁绿、磷脂层和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层，磷脂在制备过程中，可自组装成磷脂层，所述吲哚菁绿被所述磷脂层环绕，所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的叶酸，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂通过物理作用和所述磷脂层中的磷脂分子结合从而穿插于所述磷脂层，所述叶酸暴露在所述磷脂层外，所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层为纳米脂质体提供了聚乙二醇亲水性外层和叶酸配体。
所述磷脂层包裹亲水性的吲哚菁绿，可以有效避免ICG发生聚集；聚乙二醇作为一种极性分子，阻碍了免疫系统对其识别，减少单核-吞噬细胞系统摄取，本发明所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂穿插于所述磷脂层得到亲水性外层，显著延长了脂质体在体内的循环时间，从而增强药物的生物利用度和血脑屏障转运效率。所述叶酸暴露在所述磷脂层外提供叶酸配体，所述叶酸配体可以和肿瘤细胞特异性结合，可以提高吲哚菁绿对肿瘤细胞靶向特异性，提高吲哚菁绿的肿瘤治疗效果。
因此，本发明提供的吲哚菁绿纳米靶向脂质体可以提高ICG的稳定性，可有效避免ICG的分解及体内清除，同时能够靶向识别肿瘤，能够很好地应用于肿瘤的热疗。
所述吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为1:1.7:1.7，在该质量比下，吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂可以很好地形成纳米靶向脂质体结构，避免了吲哚菁绿的聚集，提高吲哚菁绿的稳定性和靶向性。
第二方面，本发明提供了一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂按质量比为（1～5）：（1～3）:（1～3）溶解于溶剂中得到第一混合溶液，所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的叶酸；
（2）通过旋转蒸发法去除所述第一混合溶液中的溶剂，得到膜状材料；
（3）溶解所述膜状材料，超声1～10min，得到第二混合溶液；
（4）将所述第二混合溶液挤压通过孔径为200nm聚碳酸酯膜3～8次后，再挤压通过孔径为100nm聚碳酸酯膜3～8次，制得所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体，所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体包括吲哚菁绿、磷脂层和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层，所述吲哚菁绿被所述磷脂层环绕，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂穿插于所述磷脂层，所述叶酸暴露在所述磷脂层外。
优选地，步骤（1）中所述吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为1:1.7:1.7。
优选地，步骤（1）中溶剂为乙氰和水的混合溶液或氯仿和甲醇的混合溶液。
优选地，步骤（3）中采用超声波细胞破碎仪以20kHz的频率和130W的功率进行超声。
根据吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的化学性质，将吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂溶解于溶剂中，磷脂分子包括亲水性头部和两个疏水性尾部，当磷脂处于水性环境时，亲水性头部聚集成线性构型，而它们的疏水性尾部平行地排列。由于疏水性尾部试图避开水性环境，第二列磷脂分子与第一列磷脂分子尾部对尾部进行排列，为了最大程度地避免与水性环境接触，同时使表面积与体积之比最小从而达到最小能量构型，两列磷脂聚集成球（形成磷脂双分子层），磷脂双分子层中的亲水腔包裹第一混合溶液中亲水性强的吲哚菁绿；所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的叶酸，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂通过物理作用和所述磷脂层中的磷脂分子结合从而穿插于所述磷脂层，所述叶酸暴露在所述磷脂层外，所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层为纳米脂质体提供了聚乙二醇亲水性外层和叶酸配体。旋转蒸发后，得到膜状材料，将膜状材料溶解于超纯水后，再进行超声分散，使纳米靶向脂质体的粒径更小，最后通过挤压通过孔径为纳米级的聚碳酸酯，得到所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体。
所述吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂通过自组装过程形成所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体，不需要进行化学反应，制备过程环保无毒，制备方法简单易操作。
第二方面，本发明提供了一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体的应用，所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体用于肿瘤的热疗。
综上，本发明有益效果包括以下几个方面：
（1）本发明制得的吲哚菁绿纳米靶向脂质体可以防止吲哚菁绿的聚集，提高吲哚菁绿的稳定性，延长其在体内的循环时间，提高吲哚菁绿的靶向性；
（2）本发明方法制备过程环保无毒，制备方法简单易操作。
（3）本发明制得的所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体可以用于肿瘤的热疗。
附图说明
图1为实施例1制备的吲哚菁绿纳米靶向脂质体的结构示意图；
图2为实施例1制备的吲哚菁绿纳米靶向脂质体的透射电镜图；
图3为应用实施例吲哚菁绿纳米靶向脂质体用于肿瘤热疗的效果图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
第一方面，本发明提供了吲哚菁绿纳米靶向脂质体，所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体包括吲哚菁绿、磷脂层和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层，所述吲哚菁绿被所述磷脂层环绕，所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的叶酸，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂穿插于所述磷脂层，所述叶酸暴露在所述磷脂层外，所述吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为（1～5）：（1～3）：（1～3）。
所述吲哚菁绿、磷脂和叶修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为1:1.7:1.7。
所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体的粒径为10nm～100nm。
所述磷脂层中的磷脂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷、脂酰胆碱或氢化大豆磷脂。
所述中间层为磷脂双分子层。
所述聚乙二醇衍生化磷脂由聚乙二醇通过共价键和磷脂类物质相连得到，所述聚乙二醇分子的分子量为200～20000。
所述磷脂类物质可以为人工合成的或自然界存在的磷脂，所述磷脂类物质可以为但不限于二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰甘油或胆固醇。
所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂为叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（FA-PEG-DSPE）。
所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体中还包括胆固醇，所述胆固醇分子镶嵌于磷脂分子之间。
所述吲哚菁绿、磷脂、叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂和胆固醇的质量比为1:1.7:1.7:2。
本发明第一方面提供的所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体包括吲哚菁绿、磷脂层和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层，磷脂在制备过程中，可自组装成磷脂层，所述吲哚菁绿被所述磷脂层环绕，所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的叶酸，根据相似相溶的原理，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂通过物理作用和所述磷脂层中的磷脂分子结合从而穿插于所述磷脂层，所述叶酸暴露在所述磷脂层外，所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层为纳米脂质体提供了聚乙二醇亲水性外层和叶酸配体。
所述磷脂层包裹第一混合溶液中亲水性强的吲哚菁绿，可以有效避免吲哚菁绿发生聚集；聚乙二醇作为一种亲水性极性分子，阻碍了免疫系统对其识别，减少单核-吞噬细胞系统摄取，本发明所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂穿插于所述磷脂层得到亲水性外层，显著延长了脂质体在体内的循环时间，进而借助增强渗透滞留效应（EPR效应）富集到肿瘤组织中，最终实现肿瘤的被动靶向，从而增强药物的口服生物利用度和血脑屏障转运效率。同时，本发明具有聚乙二醇的亲水保护层，能够避免纳米靶向脂质体的聚集，可以提高纳米靶向脂质体在储存期内的稳定性；所述叶酸暴露在所述磷脂层外，可以提高吲哚菁绿对肿瘤细胞靶向特异性，提高吲哚菁绿的肿瘤治疗效果。
因此，本发明提供的吲哚菁绿纳米靶向脂质体可以提高ICG的稳定性，可有效避免ICG的分解及体内清除，同时能够靶向识别肿瘤，能够很好地应用肿瘤的热疗。
磷脂、叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂和细胞膜具有很强的亲和力，可以很好地携带吲哚菁绿进入细胞内，传输效果好，有利于吲哚菁绿后续的肿瘤治疗效果。
磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂具有良好的生物相容性，可通过生物降解并通过正常的生理途径吸收或排出体外，对生物体伤害小。
所述吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为1:1.7:1.7，在该质量比下，吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂可以很好地形成纳米靶向脂质体，避免了吲哚菁绿的聚集，提高吲哚菁绿的稳定性和靶向性。
所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体中还包括胆固醇，所述胆固醇分子镶嵌于磷脂分子之间，可以提高磷脂分子层的刚性，提高了磷脂分子层的稳定性。
第二方面，本发明提供了一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂按质量比为（1～5）:（1～3）:（1～3）溶解于溶剂中得到第一混合溶液，所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的叶酸；
（2）通过旋转蒸发法去除所述第一混合溶液中的溶剂，得到膜状材料；
（3）溶解所述膜状材料，超声1～10min，得到第二混合溶液；
（4）将所述第二混合溶液挤压通过孔径为200nm聚碳酸酯膜3～8次后，再挤压通过孔径为100nm聚碳酸酯膜3～8次，制得所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体，所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体包括吲哚菁绿、磷脂层和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层，所述吲哚菁绿被所述磷脂层环绕，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂穿插于所述磷脂层，所述叶酸暴露在所述磷脂层外。
步骤（1）中所述吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为1:1.7:1.7。
所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体的粒径为10nm～100nm。
步骤（1）中所述磷脂层中的磷脂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷、脂酰胆碱或氢化大豆磷脂。
步骤（1）中所述中间层为磷脂双分子层。
步骤（1）中所述的叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂为聚乙二醇衍生化磷脂和叶酸发生酰胺化反应得到。
步骤（1）中所述的叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂可以购买得到。
优选地，所述聚乙二醇衍生化磷脂由聚乙二醇通过共价键和磷脂类物质相连得到，所述聚乙二醇分子的分子量为200～20000。
所述磷脂类物质可以为人工合成的或自然界存在的磷脂，所述磷脂类物质可以为但不限于二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰甘油或胆固醇。
所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂为叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（FA-PEG-DSPE）。
所述叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（FA-PEG-DSPE）可以购买得到。
步骤（1）中所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体中还包括胆固醇，所述胆固醇分子镶嵌于磷脂分子之间。
步骤（1）中所述吲哚菁绿、磷脂、叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂和胆固醇的质量比为1:1.7:1.7:2。
步骤（1）中所述溶剂为乙氰和水的混合溶液或氯仿和甲醇的混合溶液。
步骤（3）中用超纯水、PBS缓冲溶液（磷酸盐缓冲液）或生理盐水溶解所述膜状材料。
步骤（3）采用超声波细胞破碎仪以20kHz的频率和130W的功率超声。
根据吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的化学性质，将吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂溶解于溶剂中，磷脂分子包括亲水性头部和两个疏水性尾部，当磷脂处于水性环境时，亲水性头部聚集成线性构型，而它们的疏水性尾部平行地排列。由于疏水性尾部试图避开水性环境，第二列磷脂分子与第一列磷脂分子尾部对尾部进行排列，为了最大程度地避免与水性环境接触，同时使表面积与体积之比最小从而达到最小能量构型，两列磷脂聚集成球（形成磷脂双分子层），磷脂双分子层中的亲水腔包裹第一混合溶液中亲水性强的吲哚菁绿；所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的叶酸，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂通过物理作用和所述磷脂层中的磷脂分子结合从而穿插于所述磷脂层，所述叶酸暴露在所述磷脂层外，所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层为纳米脂质体提供了聚乙二醇亲水性外层和叶酸配体。旋转蒸发后，得到膜状材料，将膜状材料溶解于超纯水后，再进行超声分散，使纳米靶向脂质体的粒径更小，最后通过挤压通过孔径为纳米级的聚碳酸酯，得到所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体。
所述磷脂双分子层包裹吲哚菁绿，可以有效避免吲哚菁绿发生聚集；聚乙二醇作为一种亲水性极性分子，阻碍了免疫系统对其识别，减少单核-吞噬细胞系统摄取，本发明所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂穿插于所述磷脂层，显著延长了脂质体在体内的循环时间，进而借助增强渗透滞留效应（EPR效应）富集到肿瘤组织中，最终实现肿瘤的被动靶向，从而增强药物的生物利用度和血脑屏障转运效率。同时，本发明具有聚乙二醇的亲水保护层，能够避免纳米靶向脂质体的聚集，可以提高纳米靶向脂质体在储存期内的稳定性；所述叶酸暴露在所述磷脂层外，可以提高吲哚菁绿对肿瘤细胞靶向特异性，提高吲哚菁绿的肿瘤治疗效果。
本发明根据吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的性质，将这三种物质溶解后，吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂通过自组装过程形成所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体，不需要进行化学反应，制备过程环保无毒，制备方法简单易操作，制备出的所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体的粒径较小。
第三方面，一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体的应用，所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体用于肿瘤细胞的热疗。
所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体的粒径为10nm～100nm。
本发明提供的吲哚菁绿纳米靶向脂质体可以提高ICG的稳定性，可有效避免ICG的分解及体内清除，同时能够靶向识别肿瘤，能够很好地应用肿瘤的热疗。
实施例一
一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将吲哚菁绿、大豆卵磷脂和FA-PEG-DSPE（PEG的分子量为3350），按质量比为1:1.7:1.7溶解于3mL氯仿和甲醇的混合溶液中得到第一混合溶液；FA-PEG-DSPE包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的叶酸；
（2）通过旋转蒸发法去除第一混合溶液中的氯仿和甲醇，得到膜状材料；
（3）加入2.5mL超纯水溶解膜状材料，采用超声波细胞破碎仪以20kHz的频率和130W的功率超声2min，得到第二混合溶液；
（4）将第二混合溶液挤压通过孔径为200nm聚碳酸酯膜5次后，再挤压通过孔径为100nm聚碳酸酯膜5次，制得吲哚菁绿纳米靶向脂质体（表示为FA-INPs），吲哚菁绿纳米靶向脂质体包括吲哚菁绿、磷脂层和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层，磷脂层为大豆卵磷脂形成的磷脂双分子层，ICG主要被包裹于磷脂双分子层的亲水腔内，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）-聚乙二醇（PEG）-叶酸（FA）中的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）穿插于磷脂双分子层，为纳米脂质体提供FA配体和PEG亲水性外层。
图1为实施例1制备的吲哚菁绿纳米靶向脂质体的结构示意图；图中1为吲哚菁绿，2为磷脂层，3为叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层，3包括聚乙二醇衍生化磷脂31和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的叶酸32；
图2为实施例1制得的吲哚菁绿纳米靶向脂质体的透射电镜图，从图中可以看出，本实施例制得的吲哚菁绿纳米靶向脂质体的粒径为20nm左右，粒径较小。
实施例二
一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将吲哚菁绿、脑磷脂、叶酸修饰FA-PEG-DSPE（PEG的分子量为5000）按质量比为1:1.7:1.7:2溶解于3mL乙腈和水的混合溶液中得到第一混合溶液；FA-PEG-DSPE包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的叶酸；
（2）通过旋转蒸发法去除乙腈和水，得到膜状材料；
（3）加入2.5mLPBS缓冲液溶解膜状材料，采用超声波细胞破碎仪以20kHz的频率和130W的功率超声2min，得到第二混合溶液；
（4）将第二混合溶液挤压通过孔径为200nm聚碳酸酯膜3次后，再挤压通过孔径为100nm聚碳酸酯膜3次，制得吲哚菁绿纳米靶向脂质体（表示为FA-INPs），吲哚菁绿纳米靶向脂质体包括吲哚菁绿、磷脂层和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层，磷脂层为脑磷脂形成的磷脂双分子层，ICG主要被包裹于磷脂双分子层的亲水腔内，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）-聚乙二醇（PEG）-叶酸（FA）中的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）穿插于磷脂双分子层，为纳米脂质体提供FA配体和PEG亲水性外层。
实施例三
一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将吲哚菁绿、蛋黄卵磷脂和FA-PEG-DSPE（PEG分子量为200），按质量比为1:3:3溶解于3mL氯仿和甲醇的混合溶液中得到第一混合溶液；FA-PEG-DSPE包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的叶酸；
（2）通过旋转蒸发法去除氯仿和甲醇，得到膜状材料；
（3）加入2.5mL生理盐水溶解膜状材料，采用超声波细胞破碎仪以20kHz的频率和130W的功率超声10min，得到第二混合溶液；
（4）将第二混合溶液挤压通过孔径为200nm聚碳酸酯膜8次后，再挤压通过孔径为100nm聚碳酸酯膜8次，制得吲哚菁绿纳米靶向脂质体（表示为FA-INPs），吲哚菁绿纳米靶向脂质体包括吲哚菁绿、磷脂层和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层，磷脂层为蛋黄卵磷脂形成的磷脂双分子层，ICG主要被包裹于磷脂双分子层的亲水腔内，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）-聚乙二醇（PEG）-叶酸（FA）中的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）穿插于磷脂双分子层，为纳米脂质体提供FA配体和PEG亲水性外层。
实施例四
一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体的制备方法，包括以下步骤：
（1）将吲哚菁绿、二棕榈酰磷和FA-PEG-DSPE（PEG的分子量为20000），按质量比为5:1:1溶解于3mL氯仿和甲醇的混合溶液中得到第一混合溶液；FA-PEG-DSPE包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的叶酸；
（2）通过旋转蒸发法去除氯仿和甲醇，得到膜状材料；
（3）加入2.5mL生理盐水溶解膜状材料，采用超声波细胞破碎仪以20kHz的频率和130W的功率超声1min，得到第二混合溶液；
（4）将第二混合溶液挤压通过孔径为200nm聚碳酸酯膜3次后，再挤压通过孔径为100nm聚碳酸酯膜3次，制得吲哚菁绿纳米靶向脂质体（表示为FA-INPs），吲哚菁绿纳米靶向脂质体包括吲哚菁绿、磷脂层和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层，磷脂层为二棕榈酰磷形成的磷脂双分子层，ICG主要被包裹于磷脂双分子层的亲水腔内，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）-聚乙二醇（PEG）-叶酸（FA）中的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE）穿插于磷脂双分子层，为纳米脂质体提供FA配体和PEG亲水性外层。
应用实施例
在两组雌性BALB/c裸鼠（4-6周，体重为15–20mg）皮下注射1×106个MCF-7乳腺癌细胞，待肿瘤体积达到100-200mm3左右时（肿瘤体积计算公式为：肿瘤长度×(肿瘤宽度)2/2），在其中一组裸鼠体内静脉注射200μL含有FA-INPs的PBS缓冲溶液（ICG浓度为176μg/mL）作为实验组，另外一组裸鼠不注射FA-INPs作为对照组，3天后，用1W/cm2的功率密度的808nm近红外激光照射实验组和对照组各5min，17天后，观察裸鼠内肿瘤情况。
3为应用实施例中吲哚菁绿纳米靶向脂质体用于肿瘤热疗的效果图。图中箭头指示肿瘤位置。如图3中B所示，对照组荷瘤裸鼠激光照射处理17天后肿瘤长大至约1350mm3。如图3中A所示，实验组激光照射处理17天后肿瘤消除，只留下一块黑痂。说明本发明提供的吲哚菁绿纳米靶向脂质体应用于肿瘤的热疗时治疗效果良好。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体，其特征在于，所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体包括吲哚菁绿、磷脂层和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层，所述吲哚菁绿被所述磷脂层环绕，所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的叶酸，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂穿插于所述磷脂层，所述叶酸暴露在所述磷脂层外，所述吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为（1～5）：（1～3）：（1～3）。
2.如权利要求1所述的吲哚菁绿纳米靶向脂质体，其特征在于，所述吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为1:1.7:1.7。
3.如权利要求1所述的吲哚菁绿纳米靶向脂质体，其特征在于，所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体的粒径为10nm～100nm。
4.如权利要求1所述的吲哚菁绿纳米靶向脂质体，其特征在于，所述磷脂层中的磷脂为大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、脑磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷、脂酰胆碱或氢化大豆磷脂。
5.如权利要求1所述的吲哚菁绿纳米靶向脂质体，其特征在于，所述聚乙二醇衍生化磷脂为聚乙二醇通过共价键和磷脂类物质相连得到，所述聚乙二醇的分子量为200～20000。
6.一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂按质量比为（1～5）:（1～3）:（1～3）溶解于溶剂中得到第一混合溶液；所述叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层包括聚乙二醇衍生化磷脂和通过酰胺键与聚乙二醇衍生化磷脂连接的叶酸；
（2）通过旋转蒸发法去除所述第一混合溶液中的溶剂，得到膜状材料；
（3）溶解所述膜状材料，超声1～10min，得到第二混合溶液；
（4）将所述第二混合溶液挤压通过孔径为200nm聚碳酸酯膜3～8次后，再挤压通过孔径为100nm聚碳酸酯膜3～8次，制得所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体，所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体包括吲哚菁绿、磷脂层和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂层，所述吲哚菁绿被所述磷脂层环绕，所述聚乙二醇衍生化磷脂中的磷脂穿插于所述磷脂层，所述叶酸暴露在所述磷脂层外。
7.如权利要求6所述的吲哚菁绿纳米靶向脂质体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述吲哚菁绿、磷脂和叶酸修饰的聚乙二醇衍生化磷脂的质量比为1:1.7:1.7。
8.如权利要求6所述的吲哚菁绿纳米靶向脂质体的制备方法，其特征在于，步骤（1）中的溶剂为乙氰和水的混合溶液或氯仿和甲醇的混合溶液。
9.如权利要求6所述的吲哚菁绿纳米靶向脂质体的制备方法，其特征在于，步骤（3）中采用超声波细胞破碎仪以20kHz的频率和130W的功率进行超声。
10.一种吲哚菁绿纳米靶向脂质体的应用，其特征在于，所述吲哚菁绿纳米靶向脂质体用于肿瘤的热疗。
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