CN114209829A - 负载荧光染料的光热脂质体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了一种负载荧光染料的光热脂质体，包括：结构脂质体，至少包括阴离子脂质、含有羟基的脂质分子；吲哚菁绿类染料，负载于结构脂质体亲水的腔内和表面。本公开的新型光热脂质体，将吲哚菁绿类染料与脂质分子自组装，形成脂质体；胞外团聚的染料分子表现出增强的光热效应，内吞后释放的小分子染料能够表现出一定的光动力效应和化疗效应，结构中引入的活性羟基为免疫佐剂的键合作用提供了可能，因此该材料具备多疗法联用的潜力。本公开制备方法简单，具有临床转化的潜力。本公开还提供了一种根据前述负载荧光染料的光热脂质体的制备方法和用途。
Description
技术领域
本公开涉及仿生纳米材料技术领域，具体涉及一种负载荧光染料的光热脂质体及其制备方法和用途。
背景技术
传统光疗具备一些突出的优点，首先，光敏剂由激光触发，相当于安装了一个开关，具备微创、可控的优点，且对其他组织的毒性较小；其次，其可诱导强烈的炎症，一定的光热效应可促使肿瘤周围的血管扩张，吸引抗原呈递细胞(Antigen-presenting cells，APC)的富集，具备诱导全身免疫的潜力。但是，光疗也具备一定的缺陷，目前临床上批准通过的光敏剂多为卟啉系列小分子，激发波长在600nm左右，对人体的穿透性不强，难以作用于实体瘤，且多用于早期肿瘤，治疗后易复发，难以抑制肿瘤转移。
808nm波长的近红外激发光在人体中具有很好的穿透性，能应用于生物体内更深的病灶治疗。IR808作为吲哚菁绿系列染料，在808nm波长的近红外光激发下具有一定的光热效应，光动力效应和化疗效应，以及出色的成像功能。但是，IR808在体内循环时间短，很快被排泄，且光动力和光热效率都较弱，难以有效杀伤肿瘤。因此，开发一种近红外激发波长下能够同时具有光动力-光热-成像一体化的材料具有重要意义。
发明内容
(一)要解决的技术问题
针对上述问题，本公开提供了一种负载荧光染料的光热脂质体及其制备方法和用途，用于至少部分解决传统吲哚菁绿类染料光热效应差、光动力和光热效率都较弱等技术问题。
(二)技术方案
本公开一方面提供了一种负载荧光染料的光热脂质体，包括：结构脂质体，至少包括阴离子脂质、含有羟基的脂质分子；吲哚菁绿类染料，负载于结构脂质体亲水的腔内和表面。
进一步地，吲哚菁绿类染料包括IR808、IR820、IR825、IR783、IR780、IR-pyr、ICG、ICG-I、ICG-I2、dyel、dye2或其组合。
进一步地，结构脂质体还包括聚乙二醇衍生物类脂质分子，聚乙二醇衍生物类脂质分子包括二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、1，2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇或其组合。
进一步地，阴离子脂质的摩尔百分比含量为0.1～99.9％，含有羟基的脂质分子的摩尔百分比含量为0～99％，聚乙二醇衍生物类脂质分子的摩尔百分比含量为0～30％，吲哚菁绿类染料的摩尔百分比含量为0～80％。
进一步地，吲哚菁绿类染料负载于结构脂质体的负载率为0％～100％。
本公开还有一方面提供了一种负载荧光染料的光热脂质体的制备方法，包括：S1，称取脂质分子，溶解于第一有机溶剂中配置成第一溶液，脂质分子为结构脂质体，至少由阴离子脂质、含有羟基的脂质分子组成；S2，称取吲哚菁绿类染料，溶解于第二有机溶剂中配置成第二溶液；S3，将第一溶液、第二溶液混合，旋蒸除去有机溶剂，得到脂质膜；S4，加入缓冲溶液，超声溶解脂质膜，得到第三溶液；S5，将第三溶液进行脂质体挤出，得到纳米级负载荧光染料的光热脂质体。
进一步地，吲哚菁绿类染料包括IR808、IR820、IR825、IR783、IR780、IR-pyr、ICG、ICG-I、ICG-I2、dye1、dye2或其组合；结构脂质体还包括聚乙二醇衍生物类脂质分子。
进一步地，阴离子脂质的摩尔百分比含量为0.1～99.9％，含有羟基的脂质分子的摩尔百分比含量为0～99％，聚乙二醇衍生物类脂质分子的摩尔百分比含量为0～30％，吲哚菁绿类染料的摩尔百分比含量为0～80％。
进一步地，第一有机溶剂包括氯仿，第二有机溶剂包括甲醇。
本公开还有一方面提供了一种根据前述的负载荧光染料的光热脂质体在制备光热材料中的应用。
(三)有益效果
本公开的负载荧光染料的光热脂质体，将吲哚菁绿类染料与脂质分子自组装，形成脂质体；胞外团聚的吲哚菁绿类分子表现出增强的光热效应，内吞后释放的小分子染料能够表现出一定的光动力效应和化疗效应，结构中引入的活性羟基为免疫佐剂的键合作用提供了可能，因此该材料具备多疗法联用的潜力；且该脂质体具有极高的负载率和均一的尺寸，能有效提高染料在体内的循环时间以及在肿瘤部位的富集并且降低组织毒性；本公开的制备方法简单，具有临床转化的潜力。
附图说明
图1示意性示出了根据本公开实施例的负载荧光染料的光热脂质体的结构示意图；
图2示意性示出了根据本公开实施例负载荧光染料的光热脂质体的制备方法的流程图；
图3示意性示出了根据本公开实施例中脂质体纳米颗粒在100K透析管中超滤30min后上下层液体中染料小分子的含量情况；
图4示意性示出了根据本公开实施例中脂质体纳米颗粒在DLS仪器中测得的粒径表征图；
图5示意性示出了根据本公开实施例中脂质体纳米颗粒在DLS仪器中测得的zeta电势表征图；
图6示意性示出了根据本公开实施例中脂质体纳米颗粒中的IR808在PBS和酸性环境下的释放情况；
图7示意性示出了根据本公开实施例中脂质体纳米颗粒在DLS仪器中测得的粒径表征图；
图8示意性示出了根据本公开实施例中脂质体纳米颗粒在体外提高染料小分子光热效率的热成像图；
图9示意性示出了根据本公开实施例中脂质体纳米颗粒在体外提高染料小分子光热效率数据统计图；
图10示意性示出了根据本公开实施例中脂质体纳米颗粒在小鼠体内荷瘤部位的光热效果热成像图；
图11示意性示出了根据本公开实施例中脂质体纳米颗粒在小鼠体内不同器官的实时荧光成像图；
图12示意性示出了根据本公开实施例中脂质体纳米颗粒和应用例中添加了佐剂的脂质体纳米颗粒对植入4T1细胞的荷瘤小鼠的肿瘤生长整体抑制效果图；
图13示意性示出了根据本公开实施例中的脂质体纳米颗粒和应用例中不同染料制成的纳米颗粒与Free染料在活体小鼠体内的实时荧光成像图。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。
本公开的实施例提供了一种负载荧光染料的光热脂质体，请参见图1，包括：结构脂质体，至少包括阴离子脂质、含有羟基的脂质分子；吲哚菁绿类染料，负载于结构脂质体亲水的腔内和表面。
其中，阴离子脂质包括二油酰磷脂酰甘油、二十六烷基磷酸酯、磷脂酰肌醇、磷脂酰肌醇、磷脂酸、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸、1，2-Dioleoyl-sn-glycero-3-PA、1，2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸、1-油酰溶血磷脂酸、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰丝氨酸、1，2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-PS、1，2-Dioleoyl-sn-glycero-3-PS、1，2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-PS、1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-PG、1，2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-PG、1，2-Dioleoyl-sn-glycero-3-PG、1，2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-PG、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-PG、1-Myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-PG、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-PG、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-PG、1-Oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-PG或其组合。
含有羟基的脂质分子包括胆固醇、OH-C-Chol、MHAPC-Chol、1-十四酰-2-羟基卵磷脂、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-PC、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-PC、1-Myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-PE、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-PE或其组合。
例如，结构脂质体，至少由二油酰磷脂酰甘油、胆固醇组成；吲哚菁绿类染料，负载于结构脂质体亲水的腔内和表面。
二油酰磷脂酰甘油(Dioleoyl Phosphatidylglycerole，DOPG)、胆固醇(Cholesterol，Chol)是结构脂质。DOPG，其结构如式I：
DOPG的亲水端磷酸基团在水中电离，呈负电性。
吲哚菁绿(Indocyanine Green，ICG)系列的染料，也可用作光敏剂，具有亲水性，在水中会电离为Br-和具有共轭结构的正电荷离子。近红外吲哚菁绿类染料包括IR808，其结构如下：
IR808在类似ICG的共轭结构基础上引入的羧基基团有效提高了其亲水性，在水中电离出Br-和正电性的共轭基团。
DOPG与IR808电离出的正电性共轭结构盐通过静电力结合，将其包裹在脂质体亲水的腔或连接在表面的亲水端。
结构脂质还包括含有羟基的胆固醇，其羟基反应活性较高，可以通过键合作用递送某些含有羟基的佐剂，并且可以酸响应释放，达到免疫疗法与光疗的联用效果。
在上述实施例的基础上，吲哚菁绿类染料包括IR808、IR820、IR825、IR783、IR780、IR-pyr、ICG、ICG-I、ICG-I2、dye1、dye2或其组合。
吲哚菁绿系列的染料均可通过与本公开中的结构脂质自组装形成脂质体纳米颗粒。优越的性能使得IR808可通过自组装以及静电吸附作用负载到脂质体上，具有超高的负载率，并且利用染料的荧光猝灭效应，能有效提高其光热效率。胞外团聚的染料分子表现出增强的光热效应，内吞后释放的小分子染料能够表现出一定的光动力效应和化疗效应，结构中引入的活性羟基为免疫佐剂的键合作用提供了可能，该材料具备多疗法联用的潜力。
在上述实施例的基础上，结构脂质体还包括聚乙二醇衍生物类脂质分子，聚乙二醇衍生物类脂质分子包括二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、1，2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇或其组合。
聚乙二醇衍生物类脂质分子可延长脂质体在体内的循环时间。
在上述实施例的基础上，阴离子脂质的摩尔百分比含量为0.1～99.9％，含有羟基的脂质分子的摩尔百分比含量为0～99％，聚乙二醇衍生物类脂质分子的摩尔百分比含量为0～30％，吲哚菁绿类染料的摩尔百分比含量为0～80％。
在本公开中，可以通过调整阴离子脂质和吲哚菁绿类染料的投料比例来调整光热效率以及纳米颗粒的电性。根据上述实施例，例如通过调整DOPG和IR808的投料比例，IR808比例相对于DOPG太低会导致光热效率低，若相对比例太高会导致IR808负载率降低且制备时难以过膜，尺寸不均一，并且系统给药需要材料呈现负电性；另一方面，具备佐剂负载潜力的胆固醇具备一定的刚性结构，若比例太高会导致尺寸不均匀，若比例太低，佐剂负载太少难以发挥作用。因此，经过调整，最终确定的投料比例范围为摩尔比：DOPG∶Chol∶Dspe-Peg∶IR808＝8∶2∶0.5∶4～5∶5∶0.5∶4。
在上述实施例的基础上，吲哚菁绿类染料负载于结构脂质体的负载率为0％～100％。
根据上述实施例，通过调整投料摩尔比，使得IR808能够绝大部分被负载到脂质体上，负载率可达到100％。该光热脂质体由于其极高的负载率和均一的尺寸，能有效提高染料在体内的循环时间以及在肿瘤部位的富集并且降低组织毒性。
本公开还提供了一种负载荧光染料的光热脂质体的制备方法，请参见图2，包括：S1，称取脂质分子，溶解于第一有机溶剂中配置成第一溶液，脂质分子为结构脂质体，至少由阴离子脂质、含有羟基的脂质分子组成；S2，称取吲哚菁绿类染料，溶解于第二有机溶剂中配置成第二溶液；S3，将第一溶液、第二溶液混合，旋蒸除去有机溶剂，得到脂质膜；S4，加入缓冲溶液，超声溶解脂质膜，得到第三溶液；S5，将第三溶液进行脂质体挤出，得到纳米级负载荧光染料的光热脂质体。
称取脂质分子，溶解在有机溶剂中配置成溶液；将脂质分子溶液按照一定的投料比混合，旋蒸除去有机溶剂；在圆底烧瓶中加入PBS，将旋蒸好的脂质膜超声，得到溶液；用avanti脂质体挤出器，选择100nm的膜片，来回挤压合计29次，即可得到颗粒均匀，尺寸在100nm左右的脂质体。
在上述实施例的基础上，第一有机溶剂包括氯仿，第二有机溶剂包括甲醇。
根据上述实施例，将DOPG、Chol、Dspe-peg溶于氯仿，配置成浓度为10mg/mL的溶液；将IR808溶于甲醇浓度为10mg/mL，配置IR808溶液时全程避光；配置好的溶液缠好塑封膜置于-20℃冰箱备用。
在溶剂的选择上，需要沸点低但是不能太容易挥发，且对目标分子溶解度高的溶剂，因此，将结构脂质DOPG、DSPE-peg以及胆固醇溶解于氯仿，同时IR808选择甲醇作为溶剂，配制为10mg/mL的溶液备用。氯仿和甲醇的混合溶剂在旋蒸时并不会明显提高沸点，可以混合使用。同时，氯仿和甲醇也有一定的挥发性，为防止浓度变化，配制完溶液后立刻用塑封膜封好置于-20℃冰箱以便于后续使用。注意IR808溶液的配制需要避光。
本公开还提供了根据前述的负载荧光染料的光热脂质体在制备光热材料中的应用。
本公开的光热脂质体在体液环境中较为稳定，当被肿瘤细胞内吞后，由于溶酶体中PH约为5.5，氢离子会与IR808染料竞争吸附，导致IR808释放，由于染料的荧光猝灭效应，释放前团聚的IR808主要表现为光热效应，在细胞内部单一的IR808可以表现出光动力效应和化疗效应。为实现光热-光动力-化疗-成像联用的疗法提供了可能；
并且，在脂质体结构设计中，引入了胆固醇，其作为具有高度反应活性的羟基，能够通过一些键合作用连接同样具备羟基的佐剂，为光疗和免疫疗法的联用提供可能，具备解决光疗中肿瘤转移和复发问题的潜力。
综上所述，本公开提供的静电吸附的自组装近红外光热脂质体具备较强的光热效应且能够实现多种疗法的联用从而治疗肿瘤。
作为本公开的再一个方面，还提供一种如上述所说静电吸附的自组装近红外光热脂质体在肿瘤治疗的应用。
本公开的静电吸附的自组装近红外光热脂质体，通过染料荧光猝灭效应有效提高了其光热效率，同时在溶酶体中酸响应释放的染料小分子，能够实现多种光热-光动力-化学疗法的联用。其中，设计了通过静电相互作用负载荧光染料的光热脂质体(Lipo-IR808)，在水溶液中，DOPG电离的负电性磷酸基团与近红外染料IR808电离的正电性共轭基团通过静电相互作用，这种结合并不会破坏脂质分子的两亲性，调整合适的配比，通过脂质体挤出器挤压过膜后，脂质分子可以自组装从而能得到尺寸均匀的脂质体纳米颗粒，同时将IR808负载到脂质体亲水的腔内和表面。通过释放曲线可知在血液中长时间循环时，IR808能较为稳定地负载在脂质体表面，其光热效应并不会被破坏。当光热脂质体被肿瘤细胞内吞后，进入溶酶体中，在生理刺激(PH＝5.5)条件下，染料分子IR808缓慢释放，发挥其本身的化学杀伤作用，同时，染料由团聚状态转化为单一的分子，从光热效应转变为光动力效应，能够实现多种疗法的联用。
下面通过具体实施方式对本公开作进一步说明。实施例中使用的试剂均为市售产品，二油酰磷脂酰甘油和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇购自avt，胆固醇购自avanti，近红外染料IR808购自希恩斯。
一种静电吸附的自组装近红外光热脂质体，其结构如附图1所示。静电吸附的自组装近红外光热脂质体由二油酰磷脂酰甘油电离的负电性磷酸基团与红外染料IR808正电性的共轭基团通过静电作用力相互吸引，通过调整投料摩尔比，使得IR808能够100％被负载到脂质体上。当共轭结构被808nm波长的激光激发后，由基态转变为激发态，由于染料团聚，能量转移到其他基态分子上，以热量的方式传递出来；当染料释放后，浓度变小，单一的分子被激发后，将能量传递给周围的氧，生成反应活性很强的单线态氧，与附近的大分子发生氧化反应，杀伤肿瘤细胞；同时，IR808本身也具备一定的化疗效果。
一种静电吸附的自组装近红外光热脂质体的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：称取脂质分子，溶解在有机溶剂中配置成溶液，相当于S1～S2。
步骤2：将脂质分子溶液按照一定的投料比混合，旋蒸除去有机溶剂，相当于S3。
步骤3：在圆底烧瓶中加入PBS，将旋蒸好的脂质膜超声，得到溶液，相当于S4。
步骤4：用avanti脂质体挤出器，选择100nm的膜片，来回挤压合计29次，即可得到颗粒均匀，尺寸在100nm左右的脂质体，相当于S5。
在本实施例中，步骤1具体包括：
将DOPG、Chol、Dspe-peg溶于氯仿，配置成浓度为10mg/mL的溶液；
将IR808溶于甲醇，配制为浓度为10mg/mL的溶液，配置IR808溶液时全程避光；
配置好的溶液均缠好塑封膜置于-20℃冰箱备用。
在本实施例中，步骤2具体包括：
取出步骤1中的脂质分子溶液和染料溶液，待升温至室温后方可投料。
按照摩尔比DOPG∶Chol∶Dspe-Peg∶IR808＝8∶2∶0.5∶4～5∶5∶0.5∶4的比例范围进行投料，IR808的质量在0.5～2mg左右最为适宜，将混合溶液置于10mL圆底烧瓶中，旋蒸除去有机溶剂；
旋蒸时，先用水泵旋蒸，观察到有机溶剂被除去，脂质在烧瓶瓶壁上形成一层绿色薄膜后，换油泵再抽五分钟，确保没有残留的溶剂，注意此过程需要全程避光。
在本实施例中，步骤3具体包括：
在圆底烧瓶中加入0.8～1mLPBS，按照将超声功率调至50～100w，时长5～10分钟。观察到烧瓶壁上的脂质薄膜分散在PBS中，形成接近透明的绿色溶液。
将烧瓶中的液体取出后，可添加1～200微升PBS，震荡，取出溶液，减少壁上的损失。
注意该步骤也需要全程避光。
在本实施例中，步骤4具体包括：
将Avanti脂质体挤出器置于搅拌台，加热至40～60℃，该温度下磷脂的流动性较好，有助于形成更加均匀的纳米颗粒，挤出器模块之间安装好支撑膜和膜片，可根据递送尺寸需求调整膜片规格100～800nm之间不等，步骤3中制备好的溶液过膜挤压29次，得到颗粒均匀的脂质体。
实施例1
第一步，首先配制好脂质分子溶液。
将结构脂质DOPG、DSPE-peg以及胆固醇溶解于氯仿，同时IR808选择甲醇作为溶剂，配制为10mg/mL的溶液备用。氯仿和甲醇的混合溶剂在旋蒸时并不会明显提高沸点，可以混合使用。同时，氯仿和甲醇也有一定的挥发性，为防止浓度变化，配制完溶液后立刻用塑封膜封好置于-20℃冰箱以便于后续使用。注意IR808溶液的配制需要避光。
第二步，按照一定的投料比制备脂质膜。
取出第一步中的脂质分子溶液和染料溶液，待升温至室温后方可投料。
按照摩尔比DOPG∶Chol∶Dspe-Peg∶IR808＝6∶4∶0.5∶4的比例范围进行投料，投料比例对脂质体的形貌和负载，以及后续光热性能的提升都非常关键。IR808的质量在0.5～2mg左右最为适宜，将混合溶液置于10mL圆底烧瓶中，旋蒸除去有机溶剂；
旋蒸时，先用水泵旋蒸，观察到有机溶剂被除去，脂质在烧瓶瓶壁上形成一层绿色薄膜后，换油泵再抽五分钟，确保没有残留的溶剂，注意此过程需要全程避光。
第三步，超声得到近似澄清透明的溶液。
在圆底烧瓶中加入0.8mLPBS，按照将超声功率调至100w，时长10分钟。观察到烧瓶壁上的脂质薄膜分散在PBS中，形成接近透明的绿色溶液。
将烧瓶中的液体取出后，可添加200微升PBS，震荡，取出溶液，减少壁上的损失。
注意该步骤也需要全程避光。
第四步，挤压得到尺寸均匀的纳米颗粒。
将Avanti脂质体挤出器置于搅拌台，加热至40℃，挤出器模块之间安装好支撑膜和100nm膜片，步骤3中制备好的溶液过膜挤压29次，得到颗粒均匀的脂质体。
对本实例1得到的静电吸附的自组装近红外光热脂质体，进行表征，得到如下结果。
(1)图3为纳米颗粒负载IR808测试，由于IR808出色的亲水性，可以排除分子聚沉未穿过透析膜的可能。如图3所示，将步骤4中制备得到的纳米颗粒置于100k透析管中，调整转速为3000rpm，离心时间10min，理论上小分子会透过滤膜进入下层液体，从图中可观察，没有检测到IR808渗漏到下层，因此可以判断该纳米颗粒的负载率为100％。
(2)图4为纳米颗粒尺寸测试。如图4所示，通过DLS测试纳米颗粒的尺寸，尺寸非常均一，PDI<0.2，平均尺寸为101.3nm。符合EPR效应的尺寸要求，理论上能达到在肿瘤部位富集的效果。
(3)图5为纳米颗粒的zeta电势。如图5所示，通过DLS测试纳米颗粒的zeta电势，发现zeta电势约为-36mv，由于生物体内环境为负电性，该纳米颗粒进入血液后不会引起血红蛋白聚沉，因此符合体内系统递送电荷要求。
(4)图6为IR808的释放曲线。如图6所示，在24小时以内，PBS环境下的光热脂质体释放低于10％，在48小时左右缓释约为20％后达到平衡。而溶酶体环境下(PH＝5.5)，正电性的染料小分子与环境中的H+相互竞争，最终在释放50％左右达到一个相对平衡的状态。
对比例1
本对比例1采用如实施例1的制备方法，其不同之处在于：
第四步中调整脂质分子与IR808的摩尔比为DOPG∶Chol∶Dspe-Peg∶IR808＝4∶6∶0.5∶4：。试图使纳米颗粒负电性降低且增加胆固醇的比例后可能增加佐剂的负载量。但是在制备过程中发现此比例难以过膜，大量脂质分子和光敏剂在膜片上损失。
图7是对比例1中制备的脂质体样品的DLS纳米颗粒size测量结果，可以发现粒径非常不均一。
应用实例1光热脂质体在体外能有效提高染料分子的光热效率
配制1mL Free的IR808染料为20μg/mL(约0.026μM)的PBS溶液，1mL同等浓度IR808的实施例1中得到的脂质体纳米颗粒的PBS溶液，以及1mLPBS，使用808nm激光器在不同功率下对三种不同的体系温度进行实时的监控记录(图8)。实验结果表明，激光功率为2w/cm2时，在室温17℃左右的情况下，脂质体纳米颗粒体系的温度可以攀升至48℃左右，而Free的小分子染料只能升温至24℃左右，空白的PBS组作为对照，几乎不能升温(图9)。
应用实例2光热脂质体在小鼠体内的光热性能
首先对小鼠进行植瘤，所选细胞为中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库来源的4T1细胞。在15cm dish内复苏细胞传代两次后，观察细胞生长状态和密度，密度约为60％适宜植瘤。取15mlPBS洗涤细胞，重复三次，加入1.5mL胰酶消化细胞4分钟，收集细胞，用细胞计数板计数后，配制浓度每毫升500万4T1细胞的悬液。在灭菌好的1.5ml离心管中分装50微升基质胶，然后在基质胶上层加入50微升配置好的细胞悬液。此操作过程中保证基质胶和细胞悬液在冰上进行操作。将基质胶和细胞悬液的混合物植入小鼠皮下，观察约5-7天，小鼠肿瘤体积达到150mm3左右时给药。
配制0.5mg/mL IR808的实施例1中得到的脂质体纳米颗粒的PBS溶液，取200微升溶液尾静脉注射，由于纳米颗粒的富集程度会影响光热效果，不同时间富集程度不同，在注射6小时和24小时后，分别采用不同的光照剂量。通过体外探究，将光照功率调至2w/cm2，但是温度骤升，小鼠剧烈挣扎，于是将光照功率调至1w/cm2和1.5w/cm2，观察小鼠荷瘤部位的温度变化情况。
如图10所示，注射6h后，采用1w/cm2功率光照，荷瘤部位温度在2min左右升至48.8℃，后续一直维持在49℃左右，可用于低温光热；将功率1.5w/cm2，小鼠在2min左右，荷瘤部位温度升高至57℃，后续一直维持在58℃左右，能达到明显的光热效果，但是温度略高。对比注射24小时后再添加光照的小鼠。荷瘤部位在2min左右升至51.7℃，后续维持在53℃左右，是较为适宜的光热现象。将功率调至1.5w/cm2，小鼠荷瘤部位在2min左右升至61.5℃，后续也一直维持在60℃左右，光热效果明显，温度偏高。从上述结果可知，较为适宜的光照时间点和剂量为24h，1w/cm2。
应用实例3光热脂质体在小鼠中的成像功能
重复应用实例2中植瘤步骤。
配制0.3mg/mL IR808的实施例1中得到的脂质体纳米颗粒的PBS溶液，取200微升溶液尾静脉注射，选取注射后时间节点1h，4h，8h，12h和24h，将小鼠处死后，对小鼠各个器官进行荧光成像。IR808作为染料，在808nm激发波长下会发出荧光，可以观测到纳米颗粒进入体内后，不同时间在不同器官中的富集情况。
如图11所示，采用近红外二区小动物活体成像仪对小鼠器官进行成像，图11中从左至右依次是肿瘤，肝脏，心脏，肾脏，肺，脾脏，膀胱；从上至下时间节点依次是1h，4h，8h，12h，24h。可以观察到，纳米颗粒最开始主要富集到小鼠肝脏和肺部，随着时间的推移，在各个器官内的富集量减少，而在肿瘤中的富集量逐渐增加，在24h达到峰值，说明纳米颗粒随着血液循环，逐渐富集到肿瘤部位，与热成像实验结果相互印证。
应用实例4
重复应用实例2中植瘤步骤。
配制0.5mg/mL IR808的实施例1中得到的脂质体纳米颗粒的PBS溶液，取200微升溶液尾静脉注射，注射后24h采用1w/cm2功率808nm激光对小鼠肿瘤部位光照5min，对比注射空白对照组PBS并且注射后不光照，以及实验对照组PBS注射后24h采用1w/cm2光照5min，持续观察并记录肿瘤体积，每组8只患有三阴性乳腺癌的荷瘤小鼠。
图12示出了脂质体纳米颗粒对植入4T1细胞的荷瘤小鼠的肿瘤生长整体抑制效果图，空白对照组和实验对照组的小鼠肿瘤生长曲线没有差异，说明单独的光照对小鼠肿瘤没有治疗效果；注射光热脂质体的实验组肿瘤体积明显变小；图13示出了脂质体纳米颗粒对植入4T1细胞的荷瘤小鼠的肿瘤生长单只抑制效果图，注射光热脂质体是实验组有5只小鼠被治愈，而空白组的小鼠均未被治愈，说明光热脂质体药效十分明显，有效抑制了肿瘤生长。
应用实例5
用二氯二甲基硅烷、二氯二乙基硅烷、二氯二丙基硅烷、二氯二正丁基硅烷、二氯二异丁基硅烷、二氯二叔丁基硅烷作为linker，通过有机键合，将小分子佐剂包括雷西莫特、洛索立宾、尼日利亚菌素、ADU-S100、单磷酰脂质A、CRX-527、CL429、CL264、CL307、CL347、CL413、嘎德莫特、ADP-庚糖一种或其组合连接到胆固醇、OH-C-Chol、MHAPC-Chol、1-十四酰-2-羟基卵磷脂、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油-3-PC、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-PC、1-Myristoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-PE、1-硬脂酰-2-羟基-sn-甘油-3-PE一种或其组合上，制备与免疫佐剂联用的光热-佐剂脂质体。
在本应用中，通过有机键合，通过二氯二乙基硅烷将胆固醇与洛索立宾连接，得到分子Chol-Si-Loxo，按照实施例一中的制备方法，将胆固醇更换为Chol-Si-Loxo。得到新的光热-佐剂脂质体。
重复应用实例2中的植瘤步骤和应用实例4中的给药和光照步骤。图12示出了注射光热-佐剂脂质体的实验组的治疗效果比光热脂质体实验组的治疗效果得到了进一步提高，在统计学上呈现出一颗星的明显差异，P＝0.0293。
应用实例6
按照摩尔比DOPG∶Chol∶Dspe-Peg∶ICG＝8∶2∶0.5∶1的比例范围进行投料，重复实施例1中的脂质体制备方法，得到浓度为0.05mg/ml ICG脂质体纳米颗粒的PBS溶液，同时配制相同浓度的Free ICG溶液。
分别取200微升溶液尾静脉注射，选取注射后时间节点12h，24h，48h和72h，对小鼠进行活体荧光成像。如图13所示，采用近红外二区小动物活体成像仪对小鼠进行成像，图13中从左至右依次是注射药物后12h，24h，48h和72h的小鼠活体成像；从上至下依次是脂质体纳米颗粒组和Free药物组。可以观察到，与Free药物相比，纳米颗粒能够明显提高染料分子在小鼠体内的循环时间以及在肿瘤组织的富集程度。
以上所述的具体实施例，对本公开的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本公开的具体实施例而已，并不用于限制本公开，凡在本公开的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种负载荧光染料的光热脂质体，其特征在于，包括：
结构脂质体，至少包括阴离子脂质、含有羟基的脂质分子；
吲哚菁绿类染料，负载于所述结构脂质体亲水的腔内和表面。
2.根据权利要求1所述的负载荧光染料的光热脂质体，其特征在于，所述吲哚菁绿类染料包括IR808、IR820、IR825、IR783、IR780、IR-pyr、ICG、ICG-I、ICG-I2、dye1、dye2或其组合。
3.根据权利要求2所述的负载荧光染料的光热脂质体，其特征在于，所述结构脂质体还包括聚乙二醇衍生物类脂质分子，所述聚乙二醇衍生物类脂质分子包括二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、1，2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇或其组合。
4.根据权利要求3所述的负载荧光染料的光热脂质体，其特征在于，所述阴离子脂质的摩尔百分比含量为0.1～99.9％，含有羟基的脂质分子的摩尔百分比含量为0～99％，聚乙二醇衍生物类脂质分子的摩尔百分比含量为0～30％，吲哚菁绿类染料的摩尔百分比含量为0～80％。
5.根据权利要求4所述的负载荧光染料的光热脂质体，其特征在于，所述吲哚菁绿类染料负载于所述结构脂质体的负载率为0％～100％。
6.一种负载荧光染料的光热脂质体的制备方法，其特征在于，包括：
S1，称取脂质分子，溶解于第一有机溶剂中配置成第一溶液，所述脂质分子为结构脂质体，至少由阴离子脂质、含有羟基的脂质分子组成；
S2，称取吲哚菁绿类染料，溶解于第二有机溶剂中配置成第二溶液；
S3，将所述第一溶液、第二溶液混合，旋蒸除去有机溶剂，得到脂质膜；
S4，加入缓冲溶液，超声溶解所述脂质膜，得到第三溶液；
S5，将所述第三溶液进行脂质体挤出，得到纳米级负载荧光染料的光热脂质体。
7.根据权利要求6所述负载荧光染料的光热脂质体的制备方法，其特征在于，所述吲哚菁绿类染料包括IR808、IR820、IR825、IR783、IR780、IR-pyr、ICG、ICG-I、ICG-I2、dye1、dye2或其组合；所述结构脂质体还包括聚乙二醇衍生物类脂质分子。
8.根据权利要求7所述负载荧光染料的光热脂质体的制备方法，其特征在于，所述阴离子脂质的摩尔百分比含量为0.1～99.9％，含有羟基的脂质分子的摩尔百分比含量为0～99％，聚乙二醇衍生物类脂质分子的摩尔百分比含量为0～30％，吲哚菁绿类染料的摩尔百分比含量为0～80％。
9.根据权利要求6所述负载荧光染料的光热脂质体的制备方法，其特征在于，所述第一有机溶剂包括氯仿，所述第二有机溶剂包括甲醇。
10.根据权利要求1～5中任意一项所述的负载荧光染料的光热脂质体在制备光热材料中的应用。
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