CN103864921A - 双重靶向治疗癌症的叶酸-阿霉素免疫制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物制剂领域，特别涉及一种药物组合物及其应用、制备方法。本发明提供的药物组合物可通过免疫治疗和主动靶向药物治疗的双重作用协同治疗肿瘤（癌症），且疗效显著。如式I所示的阿霉素-牛血清白蛋白偶联物，由阿霉素和牛血清白蛋白偶联制得。。

Description

双重靶向治疗癌症的叶酸-阿霉素免疫制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及药物制剂领域，特别涉及一种药物组合物及其应用、制备方法。
背景技术
癌症，亦称恶性肿瘤（Malignant neoplasm），为由控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分，可破坏组织、器官的结构和功能，引起坏死出血合并感染，患者最终由于器官功能衰竭而死亡。常见的癌症有血癌（白血病）、骨癌、淋巴癌（包括淋巴细胞瘤）、肠癌、肝癌、胃癌、盆腔癌（包括子宫癌、宫颈癌）、肺癌（包括纵隔癌）、脑癌、神经癌、乳腺癌、食道癌、肾癌等。近三十年来，世界癌症发病率以年均3-5%的速度递增，癌症已成为人类第一位死因。如何有效预防和治疗癌症一直是医学研究的重点领域。
目前治疗癌症的方法，除手术治疗外，主要包括化学治疗、免疫治疗、放射治疗、自然疗法等。其中，化学治疗存在毒副作用严重，降低机体正常功能，治疗不彻底等问题，为了改善化学治疗存在的问题，在细胞水平和分子水平上利用配体-受体、抗原-抗体的特异性作用发展起来的主动靶向给药成为研究热点。尤其是目前大量研究的叶酸修饰药物，抗癌药物经叶酸修饰后形成叶酸-药物，可针对在子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肺癌和鼻咽癌等各类肿瘤细胞表面过度表达的叶酸受体产生特异性作用，叶酸-药物与癌细胞表面的叶酸受体结合后，经内吞途径进入癌细胞并形成内涵体，叶酸-药物可利用内涵体偏酸性特点，在癌细胞的胞浆内解体，释放药物发挥作用，从而起到主动靶向治疗的作用。这类药物可通过分子靶向作用实现对癌细胞的主动靶向给药，对癌细胞具有高度选择性，靶向定位精确，可有效、低毒治疗癌症。另外由于叶酸体积小，无免疫原性，廉价易得，性质稳定，易于修饰和产业化，因此，叶酸修饰药物在治疗癌症方面具有显著的优势。然而，叶酸修饰药物不可避免地、或多或少地会进一步加深患癌机体已经异常的免疫功能的紊乱程度，故叶酸修饰药物无法从根本上改善整个癌症机体的免疫状况。
免疫系统具有生理防御、自身稳定、免疫监视等功能。免疫监视正常时，机体受异体蛋白大分子、病原体、自身变异细胞和癌细胞等抗原的刺激，会产生抗体（antibody，内源性蛋白质），并形成抗原-抗体复合物将抗原标记，进而启动免疫系统后续功能，通过吞噬细胞、自然杀伤细胞、补体等将抗原杀灭和清除。当免疫监视异常时，受抗原刺激的机体因原有保护机制受阻，免疫系统丧失免疫识别能力，不能及时识别癌细胞，难以启动将其杀死并清除的功能，往往导致癌症发生。故如何诱导机体恢复对癌细胞的识别，并产生抗体进而启动免疫防御功能将其消除，成为解决问题的核心。基于此原理，近年来出现了一种新兴的、具有显著疗效的癌症治疗模式——免疫治疗。但此疗法不具备化学治疗直接杀死癌细胞的优势，发挥疗效的周期较长。
鉴于主动靶向化学药物治疗和免疫治疗在癌症治疗中各有所长，又都存在一定的不足，因此，提供一种疗效显著，既能够直接杀死癌细胞，又能恢复机体免疫功能的癌症治疗药物及其制备方法，具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种药物组合物及其应用、制备方法。该药物组合物可通过免疫治疗和主动靶向药物治疗的双重作用协同治疗肿瘤（癌症），且疗效显著。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种如式I所示的阿霉素-牛血清白蛋白偶联物，由阿霉素和牛血清白蛋白偶联制得；阿霉素-牛血清白蛋白偶联物作为一种药物组合物的一部分，为治疗癌症而应用于刺激癌症机体产生抗体。
本发明提供的一些实施例中，癌症为血癌、骨癌、淋巴癌、肠癌、肝癌、胃癌、盆腔癌、肺癌、脑癌、神经癌、宫颈癌、乳腺癌、食道癌或肾癌。
本发明提供的一种药物组合物，包括本发明提供的如式I所示的ADM-BSA和如式II所示的FA-ADM；
阿霉素-牛血清白蛋白偶联物的制备方法为：取阿霉素（ADM）和牛血清白蛋白（BSA），用戊二醛偶联法，在二甲基甲酰胺（DMF）中反应，即得；
由于小分子-异体蛋白偶联物可作为抗原（亦称免疫原）刺激免疫系统产生抗小分子抗体，但要求小分子半抗原与异体蛋白，采取适当方式制成将小分子抗原决定族暴露在异体蛋白大分子表面的抗原。ADM为半抗原，经BSA修饰得到抗原ADM-BSA。经BSA修饰后的ADM应不受BSA的空间位阻干扰，为获得抗ADM的特异性多克隆抗体奠定了基础。
本发明提供的药物组合物治疗癌症的作用机理为：先将本发明提供的ADM-BSA注射入癌症机体中，诱导机体产生抗ADM多克隆抗体；然后将本发明提供的FA-ADM注射入癌症机体中，利用配体和受体的作用，FA-ADM与癌细胞表面过度表达的叶酸受体（FR）结合；同时，利用抗原-抗体作用，FA-ADM可发挥连接桥作用，与抗ADM多克隆抗体作用，形成叶酸受体-FA-ADM-抗ADM抗体复合物（简称：FA—FA-ADM—抗体复合物，或：抗体复合物）。该抗体复合物可恢复机体的免疫识别功能，从而启动机体免疫保护系统的巨噬细胞、自然杀伤细胞及补体等，将癌细胞杀灭和清除，发挥靶向免疫治疗作用；此外，部分没有与抗体结合的FA-ADM，可与癌细胞表面的FR作用，通过内吞途径进入癌细胞并形成内涵体，FA-ADM可利用内涵体偏酸性特点，在癌细胞的胞浆内解体，释放ADM发挥治疗作用。
在本发明提供的一些实施例中，阿霉素-牛血清白蛋白偶联物在255nm和485nm位置有紫外吸收的特征峰。BSA的紫外特征峰在280nm左右处，ADM在233nm、253nm、290nm、485nm处有不同吸收强度的吸收峰，而合成的ADM-BSA在485nm左右出现了ADM的特征峰，并且在255nm左右出现一个峰肩，是ADM的吸收峰BSA吸收峰加和的结果，表明ADM与BSA交联成功，制得了ADM-BSA。
在本发明提供的一些实施例中，叶酸-阿霉素偶联物的制备方法为：叶酸经N,N’-二环己基碳二亚胺（DCC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）的活化作用，得到叶酸物，叶酸物与阿霉素偶联，即得。
本发明还提供了该药物组合物的制备方法，包括如下步骤：
将阿霉素和牛血清白蛋白，用戊二醛法偶联，在二甲基甲酰胺（DMF）中反应得到阿霉素-牛血清白蛋白偶联物；
叶酸经DCC和NHS的活化作用，得到叶酸活化物，叶酸活化物与阿霉素偶联，得到叶酸-阿霉素偶联物；
药物组合物包括阿霉素-牛血清白蛋白偶联物和叶酸-阿霉素偶联物。
本发明提供了一种如式I所示的阿霉素-牛血清白蛋白偶联物，由阿霉素和牛血清白蛋白偶联制得；
Figure BDA0000457858490000041
本发明还提供了该阿霉素-牛血清白蛋白偶联物用于制备治疗癌症的药物。
在本发明提供的一些实施例中，癌症为血癌、骨癌、淋巴癌、肠癌、肝癌、胃癌、盆腔癌、肺癌、脑癌、神经癌、宫颈癌、乳腺癌、食道癌或肾癌。
在本发明提供的一些实施例中，癌症为宫颈癌或乳腺癌。
本发明还提供了一种药物组合物，包括本发明提供的如式I所示的阿霉素-牛血清白蛋白偶联物（ADM-BSA）和如式II所示的叶酸-阿霉素偶联物（FA-ADM）；
阿霉素-牛血清白蛋白偶联物的制备方法为：取阿霉素（ADM）和牛血清白蛋白（BSA），经戊二醛偶联，即得。
小分子-异体蛋白偶联物亦可作为抗原（亦称免疫原）刺激免疫系统产生抗小分子抗体，但要求小分子半抗原与异体蛋白，采取适当方式制成将小分子抗原决定族暴露在异体蛋白大分子表面的抗原。ADM为半抗原，经BSA修饰得到ADM-BSA，ADM-BSA可作为抗原使用。经BSA修饰后的ADM不受BSA的空间位阻干扰，为获得特异性多克隆抗体奠定了基础。
本发明提供的药物组合物治疗癌症的作用机理为：先将本发明提供的ADM-BSA注射入癌症机体中，诱导机体产生抗ADM多克隆抗体；然后将本发明提供的FA-ADM注射入癌症机体中，一方面，利用配体和受体的作用，FA-ADM与癌细胞表面的叶酸受体（FR）结合，又利用抗原-抗体作用，FA-ADM可发挥连接桥作用，与抗ADM多克隆抗体连接，形成FR—FA-ADM—抗ADM抗体复合物，可恢复机体的免疫识别功能，从而启动机体免疫保护系统的巨噬细胞、自然杀伤细胞及补体等，将癌细胞杀灭和清除，发挥靶向免疫治疗作用；另一方面，部分没有与抗体结合的FA-ADM，可与癌细胞表面的FR作用，通过内吞途径进入癌细胞并形成内涵体，FA-ADM可利用内涵体偏酸性特点，在癌细胞的胞浆内解体，释放ADM发挥治疗作用。
在本发明提供的一些实施例中，阿霉素-牛血清白蛋白偶联物在255nm和485nm位置有紫外吸收的特征峰。BSA的紫外特征峰在280nm左右处，ADM在233nm、253nm、290nm、485nm处有不同吸收强度的吸收峰，而合成的ADM-BSA在485nm左右出现了ADM的特征峰，并且在255nm左右出现一个峰肩，是ADM的吸收峰BSA吸收峰加和的结果，表明ADM与BSA交联成功，得到了ADM-BSA。
在本发明提供的一些实施例中，叶酸-阿霉素偶联物的制备方法为：叶酸经N,N’-二环己基碳二亚胺（DCC）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）的活化作用，得到叶酸活化物，叶酸活化物与阿霉素偶联，即得。
本发明还提供了该药物组合物在制备治疗癌症药物中的应用。
在本发明提供的一些实施例中，癌症为血癌、骨癌、淋巴癌、肠癌、肝癌、胃癌、盆腔癌、肺癌、脑癌、神经癌、宫颈癌、乳腺癌、食道癌或肾癌。
在本发明提供的一些实施例中，癌症为宫颈癌或乳腺癌。
在本发明提供的一些实施例中，该药物组合物可用于制备治疗宫颈癌和乳腺癌的药物。
本发明还提供了该药物组合物的制备方法，包括如下步骤：
取阿霉素和牛血清白蛋白，经戊二醛偶联，得到阿霉素-牛血清白蛋白偶联物；
叶酸经DCC和NHS的活化作用，得到叶酸活化物，叶酸活化物与阿霉素偶联，得到叶酸-阿霉素偶联物；
药物组合物包括阿霉素-牛血清白蛋白偶联物和叶酸-阿霉素偶联物。
本发明提供了一种药物组合物及其应用、制备方法。如式I所示的阿霉素-牛血清白蛋白偶联物，由阿霉素和牛血清白蛋白偶联制得。通过对本发明提供的ADM-BSA的免疫原性进行考察，结果显示ADM-BSA对健康兔免疫5次（历时4个半月）产生的抗阿霉素多克隆抗体对ADM和FA-ADM的竞争抑制曲线IC50分别为3.09ng/mL、4.10ng/mL（无显著性差异），灵敏度高；对健康鼠（寿命比兔子短）仅免疫3次（历时2个半月），产生的抗阿霉素多克隆抗体对阿霉素竞争抑制曲线的IC50为167ng/mL，表明本发明提供的ADM-BSA的免疫原性强。本发明提供的ADM-BSA可诱导荷瘤鼠体内产生抗阿霉素多克隆抗体，因为抗血清可在游离ADM竞争下与包被抗原反应，进而与标记二抗作用，经显色、终止显色后，在490nm测得吸光度为0.84±0.13，而同样条件下抗血清+1μg/mL ADM吸光度为0.28±0.04，表明ADM可对抗阿霉素多克隆抗体产生显著的抑制，说明荷瘤鼠体内已产生抗阿霉素多克隆抗体；通过本发明提供的FA-ADM对人宫颈癌（Hela）细胞、鼠乳腺癌（4T1）细胞的细胞毒性试验，结果显示以FA修饰的ADM（FA-ADM）对癌细胞Hela、4T1的IC50分别由10.2降低为5.4，由2.3降低为1.1，说明FA-ADM抗癌的优势显著，结果还显示，FA-ADM的抗癌作用受游离叶酸干扰，对癌细胞Hela、4T1的IC50分别从5.4升高为8.2、从1.1升高至3.4，说明FA-ADM抗癌作用的发挥与叶酸-叶酸受体介导作用的特异性靶向作用有关，从而证实了FA-ADM具有主动靶向化疗作用；荧光显微镜观察细胞摄取试验发现FA-ADM的荧光强度较高，且随时间延长其优势更加显著，这也说明了FA修饰ADM后细胞毒性的提高，与其能增加进入细胞药量有关；通过Hela细胞与FA-ADM、抗ADM血清作用后，加标记二抗测定发现，测定值分别是FA-ADM与正常血清（或PBS）的3.4倍（或3.3倍），说明测定体系中FA-ADM可促进抗体与癌细胞结合，从而证明了FA-ADM的连接桥作用，即FA-ADM可使癌细胞表面形成“FR-FA-ADM-抗ADM抗体（叶酸受体-叶酸-阿霉素-抗阿霉素抗体）”复合物，为刺激机体自身免疫，发挥对癌细胞的免疫杀伤作用的奠定了基础；最后，通过本发明提供的药物组合物的双重靶向免疫治疗对荷瘤鼠的疗效考察，结果表明本发明提供的ADM-BSA和FA-ADM比各对照组的疗效提高了3.3倍—5.9倍。由此可见，本发明提供的药物组合优势明显，ADM-BSA的免疫原性强，能诱导荷瘤鼠体内产生抗阿霉素多克隆抗体；FA-ADM具有免疫治疗的连接桥作用，能使癌细胞表面形成FR-FA-ADM-抗ADM抗体复合物，发挥免疫治疗功能，兼具主动靶向抗癌作用，从而通过免疫治疗和主动靶向药物治疗的双重作用协同治疗肿瘤（癌症），且疗效显著。
附图说明
图1示实施例1中紫外-可见分光光谱图；其中，线1示阿霉素-牛血清白蛋白偶联物（ADM-BSA）的紫外吸收曲线；线2示牛血清白蛋白（BSA）的紫外吸收曲线；线3示阿霉素（ADM）的紫外吸收曲线；
图2示实施例2中经ADM-BSA诱导产生的兔抗ADM多抗ELISA测定的ADM、FA-ADM竞争性抑制曲线；
图3示实施例3中经ADM-BSA诱导产生的鼠抗ADM多抗ELISA测定ADM的抑制曲线；
图4示实施例5提供的叶酸-阿霉素（FA-ADM）的1H-NMR谱图；
图5示实施例5提供的FA-ADM的质谱图；
图6示实施例6中Hela细胞生长抑制曲线图；
图7示实施例6中4T1细胞生长抑制曲线图；
图8示实施例7中Hela细胞对FA-ADM摄取的荧光图；其中，图8（a）示Hela细胞经FA-ADM处理0.25h的DAPI染料荧光图片；图8（b）示Hela细胞经FA-ADM处理0.25h的阿霉素荧光图片；图8（c）示图8（a）和图8（b）图片的叠加图；图8（d）示Hela细胞经FA-ADM处理2h的DAPI染料荧光图片；图8（e）示Hela细胞经FA-ADM处理2h的阿霉素荧光图片；图8（f）示图8（d）和图8（e）图片的叠加图；图8（g）示Hela细胞经FA-ADM处理6h的DAPI染料荧光图片；图8（h）示Hela细胞经FA-ADM处理6h的阿霉素荧光图片；图8（i）示图8（g）和图8（h）图片的叠加图；
图9示实施例7中Hela细胞对ADM摄取的荧光图；其中，图9（a）示Hela细胞经ADM处理0.25h的DAPI染料荧光图片；图9（b）示Hela细胞经ADM处理0.25h的阿霉素荧光图片；图9（c）示图9（a）和图9（b）图片的叠加图；图9（d）示Hela细胞经ADM处理2h的DAPI染料荧光图片；图9（e）示Hela细胞经ADM处理2h的阿霉素荧光图片；图9（f）示图9（d）和图9（e）图片的叠加图；图9（g）示Hela细胞经ADM处理6h的DAPI染料荧光图片；图9（h）示Hela细胞经ADM处理6h的阿霉素荧光图片；图9（i）示图9（g）和图9（h）图片的叠加图；
图10示实施例8中FA-ADM在癌细胞表面连接抗体的ELISA测定图；
图11示实施例9中荷瘤鼠肿瘤生长抑制曲线。
具体实施方式
本发明公开了一种药物组合物及其应用、制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的药物组合物及其应用、制备方法中所用原料药或试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 如式I所示的阿霉素-牛血清白蛋白偶联物的制备
取牛血清白蛋白（BSA）100mg于100mL的圆底烧瓶中，加3mL 0.1M磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，得到BSA溶液；另称取阿霉素（ADM）78mg加1mL DMF溶解后，得到ADM溶液，将ADM溶液加入到上述BSA溶液中，一边搅拌一边缓慢滴入稀释20倍的25%戊二醛溶液75μL，室温下避光反应5h后，反应液在6000rpm，-4℃离心10min，将上清液转入透析袋（截留分子量8000-12000）中，在0.01M PBS的透析介质中透析7天，每天更新3次透析介质。然后，将透析袋内液体在6000rpm，-4℃离心10min，取上清液，冰冻干燥，得橙红色固体粉末，-40℃保存备用。
采用紫外-可见分光光度法对所得橙红色固体粉末进行鉴别，结果见图1。
由图1可知，线2所示的BSA的紫外特征峰在280nm左右处，线3所示的ADM在233nm、253nm、290nm、485nm处有不同吸收强度的吸收峰，而线1所示的橙红色固体粉末在485nm左右出现了ADM的特征峰，并且在255nm左右出现一个峰肩，是ADM的吸收峰与BSA吸收峰加和的结果，表明ADM与BSA交联成功，得到了阿霉素-牛血清白蛋白偶联物（ADM-BSA）。
实施例2 如式I所示的阿霉素-牛血清白蛋白偶联物的免疫原性考察
用健康新西兰兔（多抗制备常用动物）制备多克隆抗体，考察实施例1提供的ADM-BSA的免疫原性，共免疫5次（首次免疫和4次加强免疫）。首次免疫操作为：称取1～4mg实施例1提供的ADM-BSA溶于0.5～4mL的生理盐水中，加入0.5～3mL福氏完全佐剂制成混合液，在兔子背部皮下多点注射混合液0.5～2mL/只；加强免疫操作为：在首次免疫1～5周后进行二免，用福氏不完全佐剂，其余与首次免疫相同。二免后每隔2～5周进行下一次免疫，并且分别在三免、四免后5～7天抽取0.1～0.5mL耳血，监测抗体产生情况，五免后5～15天取全血，将血液在4℃冰箱中放置过夜，吸取上层清液（抗血清），分装，于-40℃低温冰箱中储存，备用。
用0.1mol/L PBS（pH7.4）加水至10倍所得溶液，将得到的抗血清以1:5000稀释后进行抗体的检测。抗体的检测采用酶联免疫吸附分析方法（ELISA），具体如下：
称取1mg包被抗原阿霉素-卵清蛋白偶联物（ADM-OVA）用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液溶解倍后加入酶标板中（200μL/孔），冰箱4℃过夜。在洗板机上，用PBST缓冲液350μL/孔洗板三次后，加入酪蛋白溶液300μL/孔包被，室温放置1h，用PBST缓冲液洗板三次，分别加入100μl/孔ADM或FA-ADM系列浓度标准溶液和100μL/孔1:5000稀释的抗血清（所得抗血清，即抗体可与板子上的包被抗原或溶液中ADM或FA-ADM竞争结合。若抗体对抗原的选择性强，a稀释倍数高；b在与溶液中高浓度ADM、FA-ADM结合时，也有机会与板子上的抗原结合而在后期测到信号），室温置于微量振荡器上振摇1小时，用PBST缓冲液洗板三次，加入1:10000的酶标二抗（羊抗兔或羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶）200μL/孔，室温放置1h，用PBST缓冲液洗板三次，加入20mL纯水、1mL pH5.8的磷酸盐缓冲溶液、200μL1%四甲基联苯胺（TMB，底物）溶液，20μL5%过氧化氢显色，振摇20min后，加入100μL5%H2SO4终止显色反应后，用酶标仪测定各组在490nm的吸光度B（标准溶液浓度为零的吸光度值为B0），分别以B/B0×100%为纵坐标，以阿霉素标准溶液浓度的吸光度取对数所得C值为横坐标，作抑制标准曲线，结果如图2所示。
由图2可知，所制备的抗血清（抗阿霉素多克隆抗体）分别对ADM、FA-ADM的竞争抑制曲线的IC50（酶标仪上测定信号降低一半所对应的ADM或FA-ADM浓度。反映在标准浓度游离ADM或FA-ADM的竞争作用下，能够与酶标板上抗原结合的能力）测定结果为：3.09ng/mL、4.10ng/mL（P>0.05，无显著性差异），检出限低，灵敏度高，对ADM和FA-ADM均可测定，也表明所制备的ADM-BSA的免疫原性好，进一步说明ADM-BSA合成成功。
实施例3 如式I所示的阿霉素-牛血清白蛋白偶联物的免疫原性考察
用健康Balb/c鼠（下一步双重靶向研究实验模型动物）制备多克隆抗体，考察实施例1提供的ADM-BSA对健康Balb/c鼠的免疫原性，共免疫3次（首次免疫和2次加强免疫）。首次免疫操作为：称取1～2mg实施例1提供的ADM-BSA溶于0.5～2mL的生理盐水中，加入0.5～3mL福氏完全佐剂制成混合液，在小鼠背部多点皮下注射混合液0.05～1mL/只；三次加强免疫（因为小鼠寿命及后期治疗需要，比兔子少2次免疫，但会影响所得抗体活性），具体操作为：在首次免疫1～3周后进行二免，用福氏不完全佐剂，其余与首次免疫相同。二免后间隔1～3周进行三免，三免操作与二免完全相同。并且分别在二免、三免后4～7天眼眶取血0.1～0.5mL，-4℃放置过夜，吸取上层清液（抗血清），备用。
用0.1mol/L PBS（pH7.4）加水至10倍所得溶液，将得到的抗血清以1:200稀释后进行抗体的检测。抗体的检测同样采用实施例2中的ELISA方法。结果如图3所示。
由图3可知，三免后ADM-BSA在Balb/c鼠体内产生的抗ADM多抗，对ADM竞争抑制曲线的IC50为167ng/mL。尽管因为鼠的生长周期限制和后期治疗需要，仅做了三免，但仍然获得了特异性抗体，说明ADM-BSA合成成功，同时说明后期实验模型动物选用Balb/c鼠是可行的。
实施例4 如式I所示的阿霉素-牛血清白蛋白偶联物促使荷瘤鼠体内产生抗阿霉素多抗的研究
将4T1细胞在37℃、5%CO2孵箱内培养。取对数生长期的细胞，用含10%胎牛血清无叶酸的1640培养基配制成5×105个细胞/mL，每只Balb/c鼠皮下注射100μL（含5×104个细胞），构建皮下瘤小鼠模型（荷瘤鼠模型）。经观察，4T1荷瘤Balb/c鼠模型动物构建成功。
以实施例1提供的ADM-BSA为免疫原对4T1荷瘤Balb/c鼠模型动物进行免疫，诱导其体内产生抗阿霉素多克隆抗体。共免疫3次（首次免疫和2次加强免疫，同实施例3中操作）。在三免后4～7天眼眶取血0.1mL（仅取少量血验证，不可影响接下来的抑瘤试验），-4℃放置过夜，吸取上层清液（抗血清），备用。
用0.1mol/L PBS（pH7.4）加水至10倍所得溶液，将得到的抗血清1:200稀释后进行抗阿霉素多克隆抗体的检测。抗体的检测同样采用实施例2中的ELISA方法，但仅对1:200被稀释后的抗血清及其加1μg/mL ADM测定。结果显示，抗血清的吸光度为0.84±0.13，抗血清+1μg/mL ADM的吸光度为0.28±0.04，表明ADM可对抗阿霉素多克隆抗体产生显著的抑制，说明荷瘤鼠体内已产生抗阿霉素多克隆抗体，可以注射FA-ADM启动治疗。
实施例5 如式II所示的叶酸-阿霉素偶联物的制备
取叶酸15mg（1eq）、N,N’-二环己基碳二亚胺（DCC）35mg（5eq）和N-羟基丁二酰亚胺（NHS）19.5mg（5eq），于1.5mL二甲亚砜（DMSO）中搅拌反应过夜后，8000rpm离心，取上清液，备用。
取阿霉素19.8mg（1eq）溶于1mL DMSO溶液中，加入40μL三乙胺（TEA），搅拌条件下，缓慢地加入得到的上清液中，反应12h后，注入10倍反应液体积的乙醚中，4℃放置过夜，充分沉淀后，滤取沉淀，水洗3次，真空干燥，即得白色固体粉末，于真空干燥器中保存备用。
采用1H-NMR谱对得到的白色固体粉末进行表征：用Bruker AMX-400核磁共振仪测试FA-ADM的核磁谱，以氘代二甲亚枫为溶剂，内标为TMS，400MHz，得到1H-NMR谱，见图4。高分辨率质谱（HR-MS）仪测试白色固体粉末的分子量，质谱图如图5所示。
试验结果显示，1H-NMR谱表征为：1.26(t,J=7.2Hz,3H,CH3),1.66(s,1H,CH-H),2.00(s,1H,CH-H),2.37(s,1H,CH-H),2.53(s,1H,CH-H),2.994-3.01(m,2H,CH2,),3.13(s,1H,CH),4.82-4.88(m,2H,CH+OH),6.04(s,1H,NH),6.48(d,J=8.0Hz,2H,ArH),6.86(d,J=8.0Hz,2H,ArH),6.94(d,J=7.2Hz,2H,ArH),7.31(d,J=7.31Hz,2H,ArH),8.51(s,2H,NH2)，表明白色固体粉末为FA-ADM。
HR-MS表征结果显示，白色固体粉末的分子量测定值m/z：967.4(M+1)；如式II所示的叶酸-阿霉素偶联物（FA-ADM）分子量理论值m/z：967.6(M+1)。
上述试验结果表明FA-ADM合成成功。
实施例6 如式II所示的叶酸-阿霉素偶联物的主动靶向抗癌作用考察
采用MTT法，通过实施例5制备的FA-ADM对人宫颈癌（Hela）细胞、鼠乳腺癌（4T1）细胞的细胞毒性作用，考察FA-ADM主动靶向抗癌作用。
在实施例5制备的FA-ADM对人宫颈癌（Hela）细胞的细胞毒性作用试验中，试验设定有试验组和对照组。其中，试验组加入实施例5制备的FA-ADM；对照组分为第一对照组和第二对照组，第一对照组中加入实施例5制备的FA-ADM和游离叶酸，第二对照组中加入ADM。按以下实验方法进行试验：将Hela细胞在37℃、5%CO2孵箱内培养。取对数生长期的细胞，用含10%胎牛血清无叶酸的1640培养基稀释成每孔1×104个细胞，加入96孔培养板，其中6个孔中不加细胞只加培养基作为测定时的基准。每孔100μL，培养12h后，弃去培养基。取实施例5提供的FA-ADM，以10%胎牛血清无叶酸的1640培养基配制系列浓度的FA-ADM溶液，以ADM计，浓度分别为1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL；以10%胎牛血清无叶酸的1640培养基配制系列浓度的ADM溶液，浓度分别为0μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL。于试验组的培养孔中分别加入系列浓度的实施例5制备的FA-ADM溶液100μL；于第一对照组的培养孔中分别加入系列浓度的实施例5制备的FA-ADM溶液100μL，另外在每孔中加入5mg游离叶酸；于第二对照组的培养孔中分别加入系列浓度的ADM溶液100μL。每个浓度设置6个重复。培养24h后，弃去培养基，加入普通的含10%胎牛血清1640培养基100μL，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）10μL，孵箱内孵育4h，弃去培养基，每孔加入150μL DMSO，避光振摇10min后，置酶标仪上于490nm检测，并计算细胞存活率。细胞存活率的计算公式为：细胞存活率=（A药物-A调零孔/A对照-A调零孔）×100%。
在实施例5制备的FA-ADM对鼠乳腺癌（4T1）细胞的细胞毒性作用试验中，试验设定有试验组和对照组，操作同Hela细胞。但由于细胞对药物的敏感性不同，加样浓度调整为FA-ADM溶液，以ADM计，浓度分别为0μg/mL、0.10μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL；以10%胎牛血清无叶酸的1640培养基配制系列浓度的ADM溶液，浓度分别为0μg/mL、0.10μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、5.00μg/mL。于试验组的培养孔中分别加入系列浓度的FA-ADM溶液100μL；于第一对照组的培养孔中分别加入系列浓度的FA-ADM溶液100μL，另外在每孔中加入5mg游离叶酸；于第二对照组的培养孔中分别加入系列浓度的ADM溶液100μL。每个浓度设置6个重复。培养24h后，弃去培养基，加入普通的含10%胎牛血清1640培养基（含叶酸）100μL，每孔加入MTT溶液（5mg/mL）10μL，孵箱内孵育4h，弃去培养基，每孔加入150μL DMSO，避光振摇10min后，置酶标仪上于490nm检测，并计算细胞存活率。细胞存活率的计算公式为：细胞存活率=（A药物-A调零孔/A对照-A调零孔）×100%。
分别以浓度（各组AMD浓度一致）为横坐标，存活率为纵坐标，得到不同浓度药物对癌细胞作用24h后的生长抑制曲线，并计算半数致死量IC50值。结果见图6、图7。
由图6、图7可知，试验组（实施例5提供的FA-ADM）对Hela细胞、4T1细胞存活率影响均大于对照组。其中，Hela细胞IC50：试验组（实施例5提供的FA-ADM）为5.4μg/mL，第一对照组（实施例5提供的FA-ADM+游离叶酸）为8.2μg/mL，第二对照组（ADM）为10.2μg/mL，可见试验组（实施例5提供的FA-ADM）对Hela细胞的毒性显著强于对照组，分别为第一对照组（实施例5提供的FA-ADM+游离叶酸）、第二对照组（ADM）的1.5倍、1.9倍（P＜0.05）。4T1细胞IC50：试验组（实施例5提供的FA-ADM）为1.1μg/mL，第一对照组（实施例5提供的FA-ADM+游离叶酸）为3.4μg/mL，第二对照组（ADM）为2.3μg/mL，试验组（实施例5提供的FA-ADM）对4T1细胞的毒性分别为第一对照组（实施例5提供的FA-ADM+游离叶酸）、第二对照组（ADM）的3.1倍、2.1倍（P＜0.05）。
由此可见，两种细胞试验的结果均说明FA-ADM杀伤癌细胞的优势显著，同时，其抗癌作用受游离叶酸干扰，IC50显著增加，说明FA-ADM抗癌作用的发挥与叶酸-叶酸受体介导作用的特异性靶向功能有关，从而证实了FA-ADM具有主动靶向化疗作用。
实施例7 如式II所示的叶酸-阿霉素偶联物的细胞摄取情况研究
试验设定有试验组（加入实施例5提供的FA-ADM）和对照组（加入ADM）。将Hela细胞在37℃、5%CO2孵箱内培养。取对数生长期的细胞，用含10%胎牛血清无叶酸的1640培养基稀释成每孔5×105个细胞加入12孔培养板，每孔1mL，培养12h。以ADM计，于试验组中加入含5μg/mL实施例5提供的FA-ADM的10%胎牛血清无叶酸的1640培养基；于对照组中加入含5μg/mL ADM的10%胎牛血清无叶酸的1640培养基。分别在0.25h、2h、6h用PBS洗去药物，每孔加入300μL DAPI染液，染色5min后，PBS洗三次，置于荧光显微镜下观察癌细胞对实施例5提供的FA-ADM、ADM（二者均具有荧光，可直接观察）的摄取情况。由于荧光显微镜配有不同滤光片，左图显蓝光，为用蓝色滤光片观察细胞对DAPI染料的摄取；中图显红光，为用红色滤光片观察细胞对自带荧光的阿霉素的摄取；右图为左图及中图的叠加图（使用奥林巴斯IX51自带的拍照软件中的Merge功能获得）。结果见图8、图9。
由图8、图9可知，细胞对药物（实施例5提供的FA-ADM、ADM）的摄取量均存在时间依赖性。在0.25h时癌细胞对药物（实施例5提供的FA-ADM、ADM）的摄取差异不明显，但从2h时起荧光度显示细胞摄取实施例5提供的FA-ADM明显强于ADM，表明FA修饰后阿霉素易于进入癌细胞，叶酸受体介导作用明显，且随时间延长FA-ADM的靶向作用更显著。这也说明了在细胞毒性试验中FA-ADM细胞毒性的提高，与进入细胞药量的增加有关。
实施例8 如式II所示的叶酸-阿霉素偶联物的连接桥作用考察
试验设定有试验组（加入含抗ADM抗体的抗血清和实施例5提供的FA-ADM）、第一对照组（加入正常动物血清和实施例5提供的FA-ADM）和第二对照组（加入PBS和实施例5提供的FA-ADM）。将Hela细胞在37℃、5%CO2孵箱内培养。取对数生长期的细胞，用含10%胎牛血清无叶酸的1640培养基稀释成每孔1×104个细胞加入96孔培养板，每孔100μL，培养12h，用含20%Tween20的磷酸盐缓冲溶液（PBST）洗三次后，备用。于试验组培养孔中加入100μl用PBS按1：5000稀释的含抗ADM抗体的抗血清和实施例5提供的100μl FA-ADM溶液（含ADM1ng/ml），（实验前将FA-ADM与抗血清一起放置振摇0.5h）；于第一对照组培养孔中加入100μl用PBS按1：:5000稀释的正常动物血清和100μl FA-ADM溶液（含ADM1ng/ml）；于第二对照组培养孔中加入100μlPBS溶液和100μl FA-ADM溶液（含ADM1ng/ml）。震荡1h后，PBST洗三次，再加入辣根过氧化物酶标记的IGg（标记二抗）反应1h后，用PBST洗三次，加入底物溶液：20mL纯水、1mL pH5.8的磷酸盐缓冲溶液、200μL 1%四甲基联苯胺（TMB）、20μL 5%过氧化氢显色。振摇20min后，加入5%H2SO4终止显色后，酶标仪490nm测定各组吸光度A值，结果见图10。
由图10可知，图中左柱所示的试验组（FA-ADM+抗ADM抗体）分别是中柱所示的第一对照组（FA-ADM+正常动物血清）、右柱所示的第二对照组（FA-ADM+PBS）的3.4和3.3倍（P＜0.01）；而且，中柱所示的第一对照组（FA-ADM+正常动物血清）与右柱所示的第二对照组（FA-ADM+PBS）则相似（无显著性差异，P＞0.05），证实了测定体系中FA-ADM的连接桥作用，即本发明提供的FA-ADM使癌细胞表面形成了“FR-FA-ADM-抗ADM抗体（叶酸受体-叶酸-阿霉素-抗阿霉素抗体）”复合物，为刺激机体自身免疫，对癌细胞发起免疫杀伤作用的奠定了基础。
实施例9 双重靶向免疫治疗对荷瘤鼠的疗效考察
将4T1细胞在37℃、5%CO2孵箱内培养。取对数生长期的细胞，用含10%胎牛血清无叶酸的1640培养基配制成5×105个细胞/mL，每只鼠皮下注射100μL（含5×104个细胞），构建皮下瘤小鼠模型（荷瘤鼠模型）。经观察，4T1荷瘤Balb/c鼠模型动物构建成功，用于FA-ADM与ADM-BSA双重靶向免疫治疗的疗效考察试验。
试验设定有试验组（体内有抗体，分子桥促进免疫治疗+主动靶向化疗）、第一阳性对照组（体内无抗体，主动靶向化疗）、第二阳性对照组（体内有抗体，普通化疗）、阴性对照组（体内有抗体，不治疗），每组6只荷瘤鼠。荷瘤鼠抑瘤试验分组如表1所示，具体操作为：取实施例1提供的ADM-BSA分别对试验组、第二阳性对照组、阴性对照组的荷瘤鼠进行免疫，诱导其体内产生抗阿霉素多克隆抗体。共免疫3次（首次免疫和2次加强免疫，具体操作同实施例4）。在三免后第1、2、3、5、7天，分别对试验组、第一阳性对照组、第二阳性对照组、阴性对照组的荷瘤鼠尾静脉注射药物，其中阳性对照组：100μl FA-ADM（实施例5提供，注射量为含ADM 0.33mg/kg/day）、100μl ADM溶液（注射量同样为含ADM 0.33mg/kg/day）；阴性对照组：100μl生理盐水。完成5次注射后，于双数日（2、4、6、8、10天）记录肿瘤体积，以天数为横坐标，肿瘤相对生长率为纵坐标绘制肿瘤生长曲线。肿瘤相对生长率的计算公式为：相对生长率=(Vt-V0)/V0，其中，Vt示t天时肿瘤体积；V0示给药前肿瘤体积；V（肿瘤体积）=a*b2/2，a示肿瘤长度，b示肿瘤宽度。结果如图11所示。
表1 荷瘤鼠抑瘤试验分组
Figure BDA0000457858490000161
由图11可知，图中第一阳性对照组、第二阳性对照组、阴性对照组的肿瘤相对生长速度明显快于试验组。在给药后第10天，以上各对照组的肿瘤体积分别为试验组的3.3、4.2和5.9倍（P＜0.01），表明本发明提供的ADM-BSA和FA-ADM药物组合可通过免疫治疗和主动靶向药物治疗的双重作用协同治疗肿瘤，且疗效显著。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.如式I所示的阿霉素-牛血清白蛋白偶联物，其特征在于，由阿霉素和牛血清白蛋白偶联制得；
2.根据权利要求1所述阿霉素-牛血清白蛋白偶联物在255nm和485nm波长有紫外吸收特征峰。
3.如权利要求1或2所述的阿霉素-牛血清白蛋白偶联物的制备方法为：阿霉素、牛血清白蛋白用戊二醛法，在二甲基甲酰胺中反应得到的偶联物。
4.如权利要求1或2所述的阿霉素-牛血清白蛋白偶联物是一种药物组合物之一，为治疗癌症而应用于刺激癌症机体产生抗体。
5.根据权利要求4所述，其特征在于，所述癌症为血癌、骨癌、淋巴癌、肠癌、肝癌、胃癌、盆腔癌、肺癌、脑癌、神经癌、宫颈癌、乳腺癌、食道癌或肾癌。
6.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如式II所示的叶酸-阿霉素偶联物和如权利要求1所述的阿霉素-牛血清白蛋白偶联物；
Figure FDA0000457858480000012
7.根据权利要求6所述的药物组合物，所述叶酸-阿霉素偶联物是在癌症机体产生抗阿霉素抗体后应用，通过在癌细胞表面产生“叶酸受体—叶酸-阿霉素—叶酸抗体”复合物，启动免疫系统发挥抗癌作用。
8.根据权利要求6所述叶酸-阿霉素偶联物，其制备方法为：叶酸经DCC和NHS的活化作用，得到叶酸活化物，所述叶酸活化物与阿霉素偶联，即得。
9.如权利要求6所述叶酸-阿霉素偶联物作为药物组合之一，在机体产生抗阿霉素抗体后应用，可发挥主动靶向作用治疗癌症。
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