CN106177972A - 一种白蛋白与蒽环霉素类抗癌药的分子复合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明以白蛋白或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白作为药物载体，采用分子包裹的方法，将蒽环霉素类抗癌药分子装载到白蛋白的天然“口袋”中，形成分子复合物。这种复合物增加了蒽环霉素类抗癌药在体内的肿瘤靶向能力，提高了抗肿瘤效果，并且显著降低了心脏毒性，提高了治疗窗口。

Description

一种白蛋白与蒽环霉素类抗癌药的分子复合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体来说，涉及一种白蛋白与蒽环霉素类抗癌药的分子复合物及其制备方法。

背景技术

蒽环霉素类抗癌药，例如阿霉素(doxorubicin，DOX)，广泛应用于临床，主要用于治疗白血病、淋巴瘤、软组织肿瘤和固体肿瘤，特别对乳腺癌和肺癌具有显著疗效。普遍认为，蒽环霉素类抗癌药通过与DNA的相互作用，或者对拓扑异构酶II的抑制作用，干扰DNA的复制和转录，进而起到杀伤细胞的作用。但是蒽环霉素类抗癌药对肝、肾和心脏等正常组织的副作用严重危害患者的健康，特别是其心脏毒性，可以造成患者心肌衰竭，甚至导致患者的死亡。因此，减少蒽环霉素类抗癌药的副作用、增加其肿瘤靶向性，对于改善蒽环霉素类抗癌药的治疗效果显得尤为重要。

现有技术已知用白蛋白纳米粒包裹阿霉素，即，使白蛋白变性发生分子之间共价交联团聚成直径大约为200nm的颗粒，从而将阿霉素固定在纳米粒的内部。由于白蛋白分子之间发生了相互共价连接团聚成纳米颗粒，导致白蛋白的空间结构发生了改变，从而增加了人体发生免疫反应的可能性。

发明内容

本发明将蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐分子用白蛋白分子或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白分子非共价地包裹形成分子复合物，在分子复合物中，无论是蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐分子还是白蛋白分子或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白分子，均保持了原有的分子结构，一方面不会改变蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐在人体内的代谢，另一方面也不会因白蛋白分子或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白分子的空间结构发生改变而导致其免疫原性增加。更重要的是，本发明的分子复合物不仅降低了蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐的毒性，特别是心脏毒性，而且还显著提高了蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐的抗癌效果。

根据本发明的一个方面，本发明涉及一种分子复合物，其中所述分子复合物由白蛋白或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白与蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐形成，在该分子复合物中，至少1个蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐分子被非共价地包裹在1个白蛋白分子或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白分子中。

本发明的肿瘤靶向基团选自由尿激酶受体抑制剂、RGD肽及其衍生物和转铁蛋白所组成的组，优选尿激酶受体抑制剂，包括但不限于有机小分子抑制剂、多肽或蛋白抑制剂，例如尿激酶受体的抗体抑制剂、尿激酶受体的天然配体的氨基末端，更优选由尿激酶受体的天然配体的氨基末端143个氨基酸所组成的多肽。靶向基团可以通过共价或非共价方式连接到白蛋白上。修饰有尿激酶受体抑制剂的白蛋白统称为尿激酶受体靶向白蛋白(uPAR targeting albumin，UTA)。本发明所使用的修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白可以通过市售得到或者利用本领域已知的方法制备得到。

本发明中所使用的白蛋白可以为人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)或其他动物的血清白蛋白，优选人血清白蛋白。

本发明中的蒽环霉素类抗癌药选自阿霉素、柔红霉素、吡柔比星、表阿霉素和阿克拉霉素，优选阿霉素。蒽环霉素类抗癌药的可药用盐包括从有机酸或无机酸生成的盐，例如(但不限于)盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、硼酸盐、甲磺酸盐、草酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、山梨酸盐和水杨酸盐组成的组，优选盐酸盐。

在本发明中，所述白蛋白分子或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白分子中至少包裹1个，优选包裹2个，或者3个蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐分子，最优选包裹1个蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐分子。该包裹利用的是被包裹的蒽环霉素类抗癌药物或其可药用盐分子的空间结构的尺寸大小和自身疏水性与白蛋白的口袋结构的匹配性。

根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种制备白蛋白或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白与蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐形成的分子复合物的方法，包括如下步骤：

(1)将含有蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐的溶液加入到含有盐和白蛋白或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白的缓冲溶液中，避光反应2-24小时，优选8-16小时，更优选10-14小时，最优选约12小时，其中：蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐的浓度优选不超过20μM，更优选5-15μM，最优选约10μM；蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐与白蛋白或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白的摩尔比优选至少为2:1，更优选3-8:1，最优选约5:1；缓冲溶液中盐的浓度优选为20-100mM，更优选40-60mM，最优选约50mM，缓冲溶液的pH值优选为7.5-8.5，更优选7.8-8.2，最优选约8.0；

(2)用预处理的阴离子交换柱进行纯化，用含盐的缓冲溶液洗脱，其中：缓冲溶液中盐的浓度优选为100-500mM，更优选200-400mM，最优选约300mM，缓冲溶液的pH值优选为7.5-8.5，更优选7.8-8.2，最优选约8.0；

(3)透析并浓缩后得到所述分子复合物，其中，至少1个(优选2个或3个，最优选1个)蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐分子被非共价地包裹在1个白蛋白分子或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白分子中。

在上述制备方法中，含有蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐的溶液为DMSO溶液、水溶液或DMF溶液，优选DMSO溶液；含有盐和白蛋白或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白的缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液，优选Tris-HCl缓冲溶液，盐为NaCl或KCl，优选NaCl；阴离子交换柱为DEAE柱或Q sepharose柱，优选DEAE柱；洗脱用的缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液，优选Tris-HCl缓冲液，其中含有的盐为NaCl或KCl，优选NaCl；透析用PBS缓冲溶液；浓缩用超滤管。其中，阴离子交换柱在使用前按照本领域的常规方法进行预处理，例如，先用水将阴离子交换柱冲洗干净，再用含有10-150mM，更优选20-100mM，最优选约50mM的盐(NaCl或KCl)的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8)对阴离子交换柱进行平衡。

本发明的另一方面，本发明涉及含有本发明的分子复合物的药物组合物。本发明的药物组合物可以是经口药物组合物或者注射用药物组合物，优选注射用药物组合物。本发明的注射用药物组合物可以为液体注射药物组合物或冻干粉针剂。本发明的药物组合物中优选进一步含有本领域常用的可药用辅料，本领域的技术人员能够根据实际需要选择合适的可药用辅料。在本发明的药物组合物中所含有的分子复合物的量是治疗有效量的(例如，0.125-0.25μM/kg)，本领域技术人员能够通过本领域的常规实验确定药物组合物中分子复合物的合适含量。

本发明的另一方面，本发明还涉及本发明的分子复合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。本发明的分子复合物可治疗的肿瘤包括但不限于霍奇金病、淋巴肉瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、未分化小细胞性和非小细胞性肺癌、乳腺癌、急性淋巴细胞及粒细胞白血病、骨肉瘤、软组织肉瘤、卵巢癌、睾丸肿瘤、膀胱癌、肾母细胞癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞癌、食管癌、胃癌、原发性肝癌、宫颈癌及头颈癌、多发性骨髓瘤、胰腺癌、子宫内膜癌及脑瘤等等。

在本发明的分子复合物中，蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐分子被非共价地包裹在白蛋白或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白分子的内部，具体来说结合在靠近白蛋白分子W214色氨酸的位点(药物结合位点I，位于白蛋白的IIA结构域)，这种包裹并不适用于所有的药物分子，对于阿霉素等蒽环霉素类抗癌药物来说，其空间结构的尺寸大小和自身疏水性与白蛋白的“口袋”是相匹配的。本发明的有益效果体现在：

(1)蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐分子与白蛋白或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白分子以非共价的方式形成分子复合物，从而在分子复合物中均保持了各自原有的分子结构。包裹了蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐分子的白蛋白或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白分子彼此不发生团聚。一方面不会改变蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐在人体内的代谢，另一方面也不会因白蛋白分子或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白分子的空间结构发生改变而导致其免疫原性增加；

(2)本发明的制备工艺操作简单，易于大量生产；

(3)本发明的分子复合物具有很好的稳定性，易储存；

(4)本发明的分子复合物进一步提高了蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐对肿瘤的靶向性，降低了细胞特别是非肿瘤细胞的摄取量，降低了蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐的毒性，特别是心脏毒性，而且还显著提高了蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐的抗癌效果。

附图说明：

图1为分子复合物的表征。

图2为UTA:DOX分子复合物与负载DOX的白蛋白纳米颗粒(Nab:DOX)的结构对比图。

图3为H1299和HELF两种细胞对UTA:DOX和DOX的摄取。

图4为H1299和HELF两种细胞对UTA:DOX和HSA:DOX的摄取。

图5为UTA:DOX、HSA:DOX和DOX对H1299细胞的毒性。

图6为UTA:DOX对肿瘤的靶向能力。

图7为UTA:DOX的抗肿瘤效果及心脏毒性分析。

具体实施方式

本发明通过如下实施例对本发明进行详细说明。但是本领域技术人员了解，以下实施例不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改进和变化都在本发明的保护范围之内。

实施例1、阿霉素与白蛋白分子复合物(HSA:DOX)或阿霉素与尿激酶受体靶向白蛋白分子(UTA:DOX)复合物(UTA:DOX)的制备

(1)UTA的表达、纯化与表征：

将载有表达有尿激酶受体的天然配体的氨基末端143个氨基酸所组成的多肽修饰的人血清白蛋白(UTA)(其中尿激酶受体的天然配体氨基末端的第143位氨基酸与人血清白蛋白第1位氨基酸相连)基因的毕赤酵母在真核表达体系中表达，每隔24h，补加甲醇至终浓度为1％。诱导表达4d后，4℃，7000rpm，10min离心去除菌体，调节上清液pH为7.4，用0.22μm滤膜过滤，然后将镍填料用水冲洗干净，将0.2M的硫酸镍溶液流过镍填料，使填料与硫酸镍充分相互作用，随后用20mM Tris-HCl缓冲溶液(pH7.4)冲洗镍柱，将硫酸镍溶液冲洗干净，同时达到平衡镍柱的目的，将上述除去菌体的滤液用预处理的镍柱纯化，用含有500mM咪唑的Tris-HCl缓冲溶液洗脱，然后透析除去咪唑，得到目的蛋白UTA，用12％的SDS-PAGE检测目的蛋白的情况，结果如图1a所示。

(2)UTA:DOX的制备与纯化：

将20mM的阿霉素DMSO溶液滴加到含有UTA的缓冲溶液(20mMTris-HCl，50mM NaCl，pH 8.0)中，阿霉素的浓度为10μM，并且阿霉素与UTA的摩尔比为5:1，避光反应12小时后，随后，对DEAE柱进行预处理，先用水将DEAE柱冲洗干净，再用含有50mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8)对DEAE柱进行平衡，反应溶液用经过预处理的DEAE柱纯化，用含有300mM NaCl的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)洗脱，除去没有被UTA包裹的DOX，用PBS透析，除去NaCl，通过超滤管浓缩，得到UTA:DOX，于4℃避光保存。

(3)HSA:DOX的制备与纯化：

将20mM的阿霉素DMSO溶液滴加到含有HSA的缓冲溶液(20mMTris-HCl，50mM NaCl，pH 8.0)中，阿霉素的浓度为10μM，并且阿霉素与HSA的摩尔比为5:1，避光反应12小时后，随后，对DEAE柱进行预处理，先用水将DEAE柱冲洗干净，再用含有50mM NaCl的20mM Tris-HCl缓冲溶液(pH 8)对DEAE柱进行平衡，反应溶液用经过预处理的DEAE柱纯化，用含有300mM NaCl的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)洗脱，除去没有被HSA包裹的DOX，用PBS透析，除去NaCl，通过超滤管浓缩，得到HSA:DOX，于4℃避光保存。

(4)HSA:DOX和UTA:DOX的表征

用12％的SDS-PAGE检测UTA:DOX和HSA:DOX，结果如图1a所示，将UTA:DOX与UTA进行比较，将HSA:DOX与HSA进行比较，UTA:DOX和HSA:DOX的分子量均与其目的分子量一致，分别为84kD和66kD。

检测UTA、DOX和UTA:DOX的紫外可见光谱，结果如图1b所示，UTA:DOX与UTA不同，具有DOX的特征吸收峰，这表明DOX确实存在于UTA:DOX中。

进一步检测UTA:DOX与UTA在280nm激发下的荧光光谱，以及UTA:DOX与DOX在490nm激发下的荧光光谱，结果分别如图1c和图1d所示，UTA:DOX的荧光与相同浓度的UTA相比有少许淬灭，UTA:DOX的荧光与相同浓度的DOX相比有明显的淬灭。UTA与DOX之间存在相互淬灭现象，证明其存在相互作用。由于在HSA中只有W214位的色氨酸是荧光基团，因此，DOX结合在靠近W214色氨酸的位点(药物结合位点I，位于白蛋白的IIA结构域)，由此判断，在UTA:DOX中，DOX是被包裹在UTA的口袋中。

分别对UTA:DOX和HSA:DOX中的白蛋白和DOX分别进行定量，其中，采用DOX标准曲线法对DOX进行定量，采用BCA试剂盒对白蛋白进行定量。结果表明，在UTA:DOX和HSA:DOX中，UTA/HSA和DOX的比例都是1:1。

本发明的分子复合物，由于制备条件温和，保持了HSA的天然空间结构，与现有技术中用白蛋白纳米粒包裹阿霉素明显不同的是，本发明的分子复合物不存在白蛋白的团聚现象(～200nm)。本发明分子复合物和现有技术中包裹阿霉素的白蛋白纳米粒在结构上的区别参见图2。

实施例2、UTA:DOX和HSA:DOX的体外毒性试验

(1)H1299细胞和HELF细胞对UTA:DOX和HSA:DOX的体外摄取

H1299(购自中国科学院上海细胞生物学研究所，使用购自美国Gibco公司的1640培养基培养)是尿激酶受体(uPAR)高表达的细胞，而HELF(购自中国科学院上海细胞生物学研究所，使用购自美国Gibco公司的1640培养基培养)是uPAR低表达的细胞。

将H1299的细胞悬液(2×10⁵个细胞/ml)200μl加入到96孔板中，待细胞贴壁后分别加入DOX和UTA:DOX，使其终浓度均为5μM，分别于孵育0h、4h、8h、16h、24h后，用2％SDS和1％NaOH溶液裂解细胞，分别采用DOX标准曲线法和BCA试剂盒检测裂解液中的DOX和白蛋白的含量。按照前述相同的方法进行HELF细胞对DOX和UTA:DOX的摄取实验，结果如图3所示，无论是uPAR高表达的H1299细胞，还是uPAR低表达的HELF细胞，摄取DOX的量均明显高于其摄取UTA:DOX的量，8h后这种差别达到了10倍以上。这种细胞摄取量的减少，特别是uPAR低表达的细胞摄取量的减少，对于降低阿霉素的副作用是有利的。

另外，按照前述相同的方法进行H1299细胞和HELF细胞对UTA:DOX和HSA:DOX的摄取实验，结果如图4所示，uPAR高表达的H1299细胞摄取UTA:DOX的量高于其摄取HSA:DOX的量，24h时前者是后者的大约2倍，而uPAR低表达的HELF细胞摄取UTA:DOX的量和HSA:DOX的量基本一致。UTA:DOX在uPAR高表达细胞中相对较高的摄取量表明UTA:DOX具有靶向性。

(2)UTA:DOX和HSA:DOX对uPAR高表达的H1299细胞的毒性

使用ECIS技术评价UTA:DOX的细胞毒性，由于死细胞不会贴壁从而不会像活的贴壁细胞一样对电阻有贡献，因此ECIS技术通过测量贴壁细胞的电阻值，来反映细胞的存活状态。选取能够贴壁的肿瘤细胞H1299作为实验细胞，在5％CO2,37℃培养箱中按常规细胞培养的方法培养、传代，直至细胞生长旺盛。将2×10⁵个细胞置于ECIS检测板(8W10E)中，仪器参数为16000Hz，数据采集间隔为60s，待细胞贴壁、电阻值稳定后，分别加入DOX、HSA:DOX和UTA:DOX，使其终浓度均为50μM，以PBS缓冲液为阴性对照组，数据记录12h后，对细胞进行拍照，记录细胞密度和形态，结果如图5所示：

图5a显示，对照组细胞的电阻曲线持续增长，表明细胞存活良好，HSA:DOX组的电阻曲线增长较对照组慢，UTA:DOX组的电阻曲线增长较HSA:DOX组慢，明UTA:DOX和HSA:DOX具有一定的细胞毒性，UTA:DOX的细胞毒性比HSA:DOX大可能是由于细胞对UTA:DOX的摄取量比HSA:DOX大。DOX组的电阻曲线基本上未增长，并自5h后电阻曲线逐渐下降，即细胞开始逐渐死亡，表明DOX具有比UTA:DOX和HSA:DOX更强的细胞毒性。图5b显示，与对照组和UTA:DOX组细胞相比，DOX组细胞大部分变成了细胞碎片。

实施例3、UTA:DOX对的荷瘤小鼠肿瘤的靶向能力、抗肿瘤效果以及心脏毒性

(1)UTA:DOX对的荷瘤小鼠肿瘤的靶向能力

按标准实验步骤建立雄性昆明种小鼠H22肝癌模型：将uPAR高表达的H22肝癌细胞(购自中国科学院上海细胞生物学研究所)接种在雄性昆明种小鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)腹腔内，5-7天后取其腹水瘤液，用无菌生理盐水将腹水瘤液中的H22肝癌细胞稀释为浓度为1.0×10⁷个细胞/ml，在无菌条件下，接种于各受试鼠背部皮下，0.2ml/只。

将建模成功的10只小鼠随机分为2组，每组5只，分别为：UTA:DOX实验组(UTA:DOX的剂量为5μM/kg小鼠体重)和DOX对照组(DOX的剂量为5μM/kg小鼠体重)。待小鼠背部肿瘤长至约75mm³，按上述剂量于尾静脉注射给药，分别于注射后3h、6h、12h、24h和48h用IVIS Lumina II小动物成像系统(Caliper Life Sciences,Inc.Hopkinton,MA,USA)进行肿瘤靶向性的分析，图6a显示成像结果，图6b显示成像结果经过IVIS图像处理软件处理后的定量结果。结果表明，在实验中每一时间点，小鼠肿瘤部位UTA:DOX的量比DOX的量都要多，特别是在开始的6h内，UTA:DOX能快速地富集到肿瘤部位，比DOX的量高出大约4倍。

(2)UTA:DOX对的荷瘤小鼠的抗肿瘤效果及心脏毒性

将按照前述方法建模成功的24只小鼠随机分为3组，每组8只，分别为：UTA:DOX实验组(UTA:DOX剂量为5μM/kg小鼠体重)、DOX对照组(DOX剂量为5μM/kg小鼠体重)和生理盐水阴性对照组(剂量为0.1ml/10g小鼠体重)。待小鼠背部肿瘤长至约75mm³，按上述剂量于尾静脉注射给药，分别于注射后，每天使用游标卡尺测量肿瘤长、宽，按1/2×(长×宽²)公式计算并记录肿瘤体积，在第7天将小鼠处死，摘除心脏，用石蜡包埋，切片后对心脏进行组织病理学分析。结果如图7所示：

图7a为肿瘤生长曲线，DOX初期对肿瘤显示出抑制作用，但4天之后这种作用逐渐变弱，失去对肿瘤生长的抑制作用，UTA:DOX显示出比DOX明显更好的抑瘤效果，6天后，UTA:DOX实验组的小鼠肿瘤体积仅是DOX对照组的大约60％。图7b、7c和7d分别为生理盐水阴性对照组、UTA:DOX实验组、DOX对照组小鼠的心脏切片，与生理盐水阴性对照组小鼠的心脏组织切片相比，经过DOX对照组小鼠的心脏组织切片显示其心肌细胞肿胀，细胞间的连接出现裂缝，并且肌原纤维明显减少，表明DOX对小鼠心脏造成严重的损伤，而UTA:DOX实验组的心脏组织切片与生理盐水阴性对照组小鼠相比没有明显变化，这表明UTA:DOX的心脏毒性比DOX明显要低。

实施例4、UTA:DOX注射用水针剂

取1.5g UTA:DOX溶解于30ml注射用水中，经0.22μm过滤膜过滤后，分装于5ml安剖瓶中，每瓶5ml，得注射用水针剂。

实施例5、HSA:DOX注射用粉针剂

取1.2g HSA:DOX溶解于30ml注射用水中，经0.22μm过滤膜过滤后，分装于5ml安剖瓶中，每瓶5ml，冷冻干燥得注射用粉针剂。

实施例6、稳定性实验

将实施例4制备得到的注射用水针剂于4℃避光保存，分别于保存1m、3m、6m后，分别经实施例1中的DEAE柱纯化，去除可能存在的未被包裹的DOX，利用实施例1中的方法检测并计算UTA和DOX的偶合比，结果见下表：

	1m	3m	6m
				DOX与UTA偶合比	0.98:1	1.05:1	1.07:1

上述结果表明UTA:DOX分子复合物具有较高的稳定性。

参考文献

[1]S.Bae,K.Ma,T.H.Kim,E.S.Lee,K.T.Oh,E.-S.Park,K.C.Lee,Y.S.Youn,Doxorubicin-loaded human serum albumin nanoparticles surface-modified withTNF-related apoptosis-inducing ligand and transferrin for targeting multipletumor types,Biomaterials,33(2012)1536-1546.

[2]Y.Barenholz,Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug:lessons learned,JControl Release,160(2012)117-134.

[3]A.O.Elzoghby,W.M.Samy,N.A.Elgindy,Albumin-based nanoparticles aspotential controlled release drug delivery systems,J Control Release,157(2012)168-182.

[4]J.A.Ho,N.C.Fan,A.F.Jou,L.C.Wu,T.P.Sun,Monitoring the subcellularlocalization of doxorubicin in CHO-K1using MEKC-LIF:liposomal carrier forenhanced drug delivery,Talanta,99(2012)683-688.

[5]Y.Kalender,M.Yel,S.Kalender,Doxorubicin hepatotoxicity and hepatic freeradical metabolism in rats.The effects of vitamin E and catechin,Toxicology,209(2005)39-45.

[6]F.Kratz,DOXO-EMCH(INNO-206):the first albumin-binding prodrug ofdoxorubicin to enter clinical trials,Expert Opinion on Investigational Drugs,16(2006)855-866.

[7]Y.Octavia,C.G.Tocchetti,K.L.Gabrielson,S.Janssens,H.J.Crijns,A.L.Moens,Doxorubicin-induced cardiomyopathy:from molecular mechanisms totherapeutic strategies,J Mol Cell Cardiol,52(2012)1213-1225.

[8]F.Perche,N.R.Patel,V.P.Torchilin,Accumulation and toxicity ofantibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cellspheroid model,J Control Release,164(2012)95-102.

[9]Blasi,F.；Carmeliet,P.uPAR:a versatile signalling orchestrator.Nature reviews.Molecular cell biology 2002,3,(12),932-943.

[10]Smith,H.W.；Marshall,C.J.Regulation of cell signalling by uPAR.Naturereviews.Molecular cell biology 2010,11,(1),23-36.

这些文献全文引入本文作为参考。

Claims (10)

1.一种分子复合物，其由白蛋白或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白与蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐形成，其特征在于，至少1个(优选2个或3个，最优选1个)蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐分子被非共价地包裹在1个白蛋白分子或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白分子中。

2.如权利要求1所述的分子复合物，其特征在于，所述肿瘤靶向基团选自由尿激酶受体抑制剂、RGD肽及其衍生物和转铁蛋白所组成的组，优选尿激酶受体抑制剂，例如尿激酶受体的抗体抑制剂或尿激酶受体的天然配体的氨基末端，更优选由尿激酶受体的天然配体的氨基末端143个氨基酸所组成的多肽。

3.如权利要求1或2所述的分子复合物，其特征在于，所述白蛋白为人血清白蛋白、牛血清白蛋白或其他动物血清白蛋白，优选人血清白蛋白；所述蒽环霉素类抗癌药选自由阿霉素、柔红霉素、吡柔比星、表阿霉素和阿克拉霉素所组成的组，优选阿霉素。

4.一种制备白蛋白或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白与蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐形成的分子复合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将含有蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐的溶液加入到含有盐和白蛋白或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白的缓冲溶液中，避光反应2-24小时，优选8-16小时，更优选10-14小时，最优选约12小时，其中：蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐的浓度优选不超过20μM，更优选5-15μM，最优选约10μM；蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐与白蛋白或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白的摩尔比优选至少为2:1，更优选3-8:1，最优选约5:1；缓冲溶液中盐的浓度优选为20-100mM，更优选40-60mM，最优选约50mM，缓冲溶液的pH值优选为7.5-8.5，更优选7.8-8.2，最优选约8.0；

(2)用预处理的阴离子交换柱进行纯化，用含盐的缓冲溶液洗脱，其中：缓冲溶液中盐的浓度优选为100-500mM，更优选200-400mM，最优选约300mM，缓冲溶液的pH值优选为7.5-8.5，更优选7.8-8.2，最优选约8.0；

(3)透析并浓缩后得到所述分子复合物，其中，至少1个(优选2个或3个，最优选1个)蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐分子被非共价地包裹在1个白蛋白分子或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白分子中。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述肿瘤靶向基团选自由尿激酶受体抑制剂、RGD肽及其衍生物和转铁蛋白所组成的组，优选尿激酶受体抑制剂，例如尿激酶受体的抗体抑制剂、尿激酶受体的天然配体的氨基末端，更优选由尿激酶受体的天然配体的氨基末端143个氨基酸所组成的多肽。

6.如权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述白蛋白为人血清白蛋白、牛血清白蛋白或其他动物血清白蛋白，优选人血清白蛋白；所述蒽环霉素类抗癌药选自由阿霉素、柔红霉素、吡柔比星、表阿霉素和阿克拉霉素所组成的组，优选阿霉素。

7.如权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于，含有蒽环霉素类抗癌药或其可药用盐的溶液为DMSO溶液、水溶液或DMF溶液，优选DMSO溶液；含有盐和白蛋白或修饰有肿瘤靶向基团的白蛋白的缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液，优选Tris-HCl缓冲溶液，盐为NaCl或KCl，优选NaCl；阴离子交换柱为DEAE柱或Q sepharose柱，优选DEAE柱；洗脱用的缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液或磷酸盐缓冲溶液，优选Tris-HCl缓冲溶液，其中含有的盐为NaCl或KCl，优选NaCl；透析用PBS缓冲溶液；浓缩用超滤管。

8.如权利要求4-7中任一项所述的方法制备得到的分子复合物。

9.一种药物组合物，其特征在于，含有如权利要求1-3或8所述的分子复合物，优选该药物组合物为注射用药物组合物。

10.如权利要求1-3和8中任一项所述的分子复合物在制备用于治疗肿瘤的药物中的用途。