CN108743956B

CN108743956B - 一种白蛋白结合型蒽环类抗肿瘤抗生素制剂及其制备方法

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Publication number: CN108743956B
Application number: CN201810371439.3A
Authority: CN
Inventors: 龚涛; 宋旭; 周楚楚; 张志荣; 孙逊; 朱义; 丁洋; 李�杰
Original assignee: Chengdu Shichuang Biomedical Technology Co ltd; Sichuan Baili Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Sichuan Baili Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-04-24
Filing date: 2018-04-24
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2038-04-24
Also published as: CN108743956A

Abstract

本发明公开了一种蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物，包括重量比为1:1‑1000的蒽环类抗肿瘤抗生素或其药学上可接受的盐和白蛋白。本发明还公开了上述蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物的冻干粉针、制剂、应用及制备方法。本发明高效低毒，药物稳定性好，制备方法简单、方便临床使用。

Description

一种白蛋白结合型蒽环类抗肿瘤抗生素制剂及其制备方法

技术领域

本发明属于制药技术领域，涉及一种白蛋白结合型蒽环类抗肿瘤抗生素制剂及其制备方法。

背景技术

蒽环类抗肿瘤抗生素是一类临床常用的广谱抗肿瘤药物，广泛用于治疗各种癌症，如乳腺癌、肝癌、肺癌、白血病、淋巴瘤及多种其他实体瘤。该类抗肿瘤药物对机体可产生广泛的生物化学效应，具有强烈的细胞毒性作用，其作用机制主要是药物分子嵌入DNA碱基对之间，抑制核酸的合成，主要包括：阿霉素(Doxorubicin，ADM)、柔红霉素(Daunorubicin，DNR)、表阿霉素(Epirubicin，EPI)、吡喃阿霉素(吡柔比星)(Pirarubicin，THP-ADM)、阿克拉霉素(Aclacinomycin，ACM)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、伊达比星(Idarubicin)等。然而，像其他细胞毒抗肿瘤药物一样，蒽环类抗肿瘤抗生素缺乏对肿瘤组织的选择性，毒副作用大。除了造成骨髓抑制、恶心、呕吐及脱发外，由于蒽环类抗生素能特异性地结合心磷脂，可引起严重的心脏毒性，一般表现为各种心率失常，更严重的是，反复用药，药物累积量大时可发生不可逆的心肌损伤乃至充血性心力衰竭。这些毒副作用严重限制了其长期重复用于临床。

为减轻蒽环类抗肿瘤抗生素的毒副作用，药学工作者进行了不懈的努力，包括调整给药方案，研制类似物及剂型改进等。国内外开发出一系列纳米制剂改变蒽环类抗肿瘤抗生素的组织分布和提高其对肿瘤组织的选择性，其中最为成功的是脂质体。已上市的蒽环类抗肿瘤抗生素脂质体产品有阿霉素脂质体(

多喜)、阿霉素柠檬酸盐脂质体注射液

和柔红霉素脂质体(Dauno

)等。但是，脂质体本身的诸多缺点限制了其发展：稳定性不好，储存和使用条件苛刻；制备过程复杂，工业生产成本相对偏高，价格昂贵。目前还有一些专利公开了其他纳米剂型。专利CN101810570A公开了蒽环类抗肿瘤抗生素脂肪酸复合物纳米制剂及其制备方法。专利CN102973525A公开了一种担载蒽环类抗肿瘤抗生素的纳米胶束制剂及制备方法。专利CN101322681A公开了一种制备蒽环类抗肿瘤抗生素的纳米胶束制剂的方法。虽然这些载体的研究解决了蒽环类抗肿瘤抗生素的载药问题，但缺乏肿瘤主动靶向性。因此，开发安全有效的方式传递蒽环类抗肿瘤抗生素仍然是药剂学亟待解决的问题。

白蛋白纳米粒是以白蛋白为载体，包封或吸附药物，经过固化分离而形成的实心球体。白蛋白纳米粒已成为一种相对成熟的药物传递系统，可通过细胞膜上的白蛋白受体(gp60、gp30、gp18及富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted protein acidicand richin cysteine，SPARC))介导的跨膜转运这一机制，将肿瘤处的血管内皮细胞屏障转化为一种天然生物通路，将药物转运至肿瘤细胞(季秀峰,et al.白蛋白纳米粒药物传递系统的研究进展,沈阳药科大学学报27(2010)968–78)。白蛋白材料具有安全无毒、无免疫原性、可生物降解、生物相容性好等特点。但是白蛋白纳米粒传统制备方法涉及到化学交联或热变性，使其失去了生物学特征而不具有肿瘤趋向性。美国生物科学有限公司公开了一种基于二硫键形成的白蛋白纳米粒制备技术(CN1237901A)，该技术是以药物纳米粒为核心，白蛋白以二硫键部分交联包裹在纳米粒表面，将紫杉醇类药物制成了适合临床需要的、稳定的白蛋白纳米粒制剂。然而，白蛋白纳米粒作为药物载体，需要药物具有较好的脂溶性。发明人之前的研究证明，需要对蒽环类抗肿瘤抗生素活性成分进行亲脂化处理，且需要加入除白蛋白外其它表面活性剂，才能制备出具有较高包封率、粒径均匀、稳定的蒽环类抗肿瘤抗生素的白蛋白纳米粒制剂。然而，这种方法需要加入除白蛋白外大量辅料，且制备方法较为繁琐。

因此，急需探寻一种高效低毒，药物稳定性好，生产成本低，制备方法简单适于大工业生产和临床使用的蒽环类抗肿瘤抗生素新制剂。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供一种蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物。

一种蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物，包括重量比为1:1-1000的蒽环类抗肿瘤抗生素或其药学上可接受的盐和白蛋白,蒽环类抗肿瘤抗生素与白蛋白之间通过非共价键的分子间作用力，形成溶于水的非微粒结合物。作为优选，还包括表面活性剂，所述蒽环类抗肿瘤抗生素或其药学上可接受的盐与表面活性剂的重量比为1:1-10。

作为优选，蒽环类抗肿瘤抗生素或其药学上可接受的盐和白蛋白的重量比为1:5-100。进一步优选，还包括表面活性剂，所述蒽环类抗肿瘤抗生素或其药学上可接受的盐与表面活性剂的重量比为1:1-5。

进一步优选，所述蒽环类抗肿瘤抗生素选自阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、吡喃阿霉素、阿克拉霉素、米托蒽醌或伊达比星一种或多种。

进一步优选，所述白蛋白为人血清白蛋白，加入的浓度为0.1-25％w/v。

更进一步优选，所述白蛋白加入的浓度为05-5％w/v。

更进一步优选，所述表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、Solutol HS 15、吐温、卖泽、苄泽或泊洛沙姆中的一种或多种。

再进一步优选，所述表面活性剂选自Solutol HS 15或泊洛沙姆。

本发明的另一个目的是提供上述蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物的冻干粉针，包括蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物、表面活性剂、冻干保护剂和其他药学上可接受辅料，重量比为1:1-1000：1-10:0.1-1000。

作为优选，所述冻干保护剂选自：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、海藻糖、甘氨酸或右旋糖酐中的一种或多种。

本发明的另一个目的是提供上述蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物的药物制剂。

作为优选，所述药物制剂为注射制剂、口服制剂、缓释制剂、控释制剂或粘膜吸收制剂。

本发明的另一个目的是提供上述蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物在制备降低蒽环类抗肿瘤抗生素副作用的药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供上述蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物的制备方法，包括以下步骤：

A、取蒽环类抗生素或其药学上可接受的盐溶解于缓冲液或水中，取白蛋白溶解于适量的水中；

B、将步骤A中的溶液混合，水浴超声或者孵育或者高压均质，至溶液澄清透明；

C、将步骤B中的溶液微孔滤膜过滤除菌，静置除去气泡，即得蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物。

本发明的另一个目的是提供上述蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物的另一种制备方法，包括以下步骤：

A、取蒽环类抗肿瘤抗生素溶于脂溶性溶剂，减压浓缩除去脂溶性溶剂，固型物在器壁上形成薄膜；或者取蒽环类抗肿瘤抗生素的药学上可接受的盐，用碱性物质中和对应酸；

B、取白蛋白溶解于适量的水中；

C、将步骤A中的所得物与步骤B中的溶液混合，水浴超声或者孵育或者高压均质，至溶液澄清透明；

D、将步骤C中的溶液微孔滤膜过滤除菌，静置除去气泡，即得蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物。

作为优选，所述步骤A中，碱性物质选自氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾、三乙胺或氨水中的一种或多种。

作为优选，所述步骤A中，脂溶性溶剂选自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或甲基吡咯烷酮中的一种或多种。

作为优选，所述步骤A中，减压浓缩的温度为20-70℃。

发明人在研究中意外地发现，白蛋白和蒽环类抗肿瘤抗生素活性成分可形成澄清透明的溶液，且制备方法简单。蒽环类抗肿瘤抗生素活性成分与白蛋白结合，不同于简单的增溶，不仅显著提高了药效而且降低了毒性，这是现有技术中预料不到的结果。

本发明的有益效果在于：由于白蛋白材料具有安全无毒、无免疫原性、可生物降解、生物相容性好等特点，使本发明具有以下优点：

(1)可达到靶向输送的目的；

(2)可降低蒽环类抗肿瘤抗生素的毒副反应；

(3)对蒽环类抗肿瘤抗生素及其盐形式均有很好的载药能力；

(4)可提高药物的稳定性，有利于储存；

(5)制备方法简单，适用于大工业生产；

(6)药物稳定性高，成药性好。

附图说明

图1为相同时间内，阿霉素白蛋白结合型制剂与同浓度的盐酸阿霉素溶液葡聚糖凝胶柱截留情况。

图2为吡柔比星原药和吡柔比星白蛋白结合型制剂的体外释放曲线。

图3为吡柔比星原药和吡柔比星白蛋白结合型制剂细胞摄取。

图4为吡柔比星原药和吡柔比星白蛋白结合型制剂MTT实验。

图5为吡柔比星原药和吡柔比星白蛋白结合型制剂药动学实验。

图6为吡柔比星原药和吡柔比星白蛋白结合型制剂抗肿瘤结果。

图6-1为体内抗肿瘤活性。

图6-2为30天各组肿瘤大小。

图6-3为30天各组瘤重的变化。

图6-4为30天各组抑瘤率。

图6-5为荷瘤小鼠体重的变化。

图7为吡柔比星原药和吡柔比星白蛋白结合型制剂毒性结果。

图7-1为各组骨髓抑制。

图7-2为各组胃肠道毒性。

图7-3为各组器官毒性。

图8为吡柔比星原药和吡柔比星白蛋白结合型制剂分布结果。

图8-1为15min时各器官、肿瘤和血浆中药物的分布。

图8-2为1h时各器官、肿瘤和血浆中药物的分布。

图8-3为4h时各器官、肿瘤和血浆中药物的分布。

图8-4为不同时间点两组小鼠中肿瘤部位药物的分布情况。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

实施例1：

取人血清白蛋白300mg，加入10mL注射用水溶解得人血清白蛋白溶液。取吡柔比星20mg和F6840mg溶于适量二氯甲烷，旋蒸除去二氯甲烷。加入人血清白蛋白溶液，水浴超声10min成澄清透明溶液，过滤灭菌。在无菌条件下冷冻干燥得到吡柔比星白蛋白结合型制剂。

实施例2：

取人血清白蛋白300mg，加入10mL注射用水溶解得人血清白蛋白溶液。取吡柔比星20mg和F6840mg溶于适量二氯甲烷，加入66.7mg葡萄糖，旋蒸除去二氯甲烷。加入人血清白蛋白溶液，水浴超声10min成澄清透明溶液，过滤灭菌。在无菌条件下冷冻干燥得到吡柔比星白蛋白结合型制剂。

实施例3：

取人血清白蛋白300mg，F6840mg，加入6mL注射用水溶解得人血清白蛋白溶液。取吡柔比星20mg，溶解于5mLpH＝6的水中。将两者混合，孵育10min，微孔滤膜过滤除菌，静置片刻以除去制剂中的气泡，即得吡柔比星白蛋白结合物制剂。

实施例4：

取人血清白蛋白300mg，加入10mL注射用水溶解得人血清白蛋白溶液。取吡柔比星20mg和SolutolHS1540mg溶于适量二氯甲烷，旋蒸除去二氯甲烷。加入人血清白蛋白溶液，水浴超声10min成澄清透明溶液，过滤灭菌。在无菌条件下冷冻干燥得到吡柔比星白蛋白结合型制剂。

实施例5：

取人血清白蛋白300mg，加入10mL注射用水溶解得人血清白蛋白溶液。取吡柔比星20mg和SolutolHS1540mg溶于适量二氯甲烷，加入66.7mg葡萄糖，旋蒸除去二氯甲烷。加入人血清白蛋白溶液，水浴超声10min成澄清透明溶液，过滤灭菌。在无菌条件下冷冻干燥得到吡柔比星白蛋白结合型制剂。

实施例6：

取人血清白蛋白300mg，SolutolHS1540mg，加入6mL注射用水溶解得人血清白蛋白溶液。取吡柔比星20mg，溶解于5mLpH＝6的水中。将两者混合，孵育10min，微孔滤膜过滤除菌，静置片刻以除去制剂中的气泡，即得吡柔比星白蛋白结合物制剂。

实施例7：

取人血清白蛋白300mg，加入10mL注射用水溶解得人血清白蛋白溶液。取吡柔比星20mg溶于适量二氯甲烷，旋蒸除去二氯甲烷。加入人血清白蛋白溶液，水浴超声30min成澄清透明溶液，过滤灭菌。在无菌条件下冷冻干燥得到吡柔比星白蛋白结合型制剂。

实施例8：

取人血清白蛋白200mg，加入10mL注射用水溶解得人血清白蛋白溶液。取盐酸阿霉素5mg，溶解于1ml水中，加入50mg/mL的NaHCO3溶液20μL，漩涡一分钟，离心得阿霉素。将阿霉素溶于氯仿，旋蒸除去氯仿。加入人血清白蛋白溶液，水浴超声10min成澄清透明溶液，过滤灭菌，加入冻干保护剂蔗糖配制成含10％的蔗糖阿霉素白蛋白结合型溶液，在无菌条件下冷冻干燥，得到阿霉素白蛋白结合型制剂。

实施例9：

取人血清白蛋白100mg，加入10mL注射用水溶解得人血清白蛋白溶液。取吡柔比星1mg，溶解于10mLpH＝6的磷酸盐缓冲液中。将两者混合，孵育10min，微孔滤膜过滤除菌，静置片刻以除去制剂中的气泡，即得吡柔比星白蛋白结合物制剂。

实施例10：

取人血清白蛋白500mg，加入9mL注射用水溶解得人血清白蛋白溶液，在溶液中加入十二烷基硫酸钠50mg。取盐酸阿霉素5mg，溶解于1mL水中。将两者混合，孵育60min，微孔滤膜过滤除菌，静置片刻以除去制剂中的气泡，即得阿霉素白蛋白结合物制剂。

实施例11：

取人血清白蛋白100mg，加入10mL注射用水溶解得人血清白蛋白溶液。取阿克拉霉素5mg和SolutolHS1510mg溶于适量氯仿，旋蒸除去氯仿。加入人血清白蛋白溶液，水浴超声10min成澄清透明溶液，过滤灭菌。加入冻干保护剂5％葡萄糖和5％甘露糖配制成含5％葡萄糖和5％甘露糖阿霉素白蛋白结合型溶液，在无菌条件下冷冻干燥，得到阿克拉霉素白蛋白结合型制剂。

实施例12：

取人血清白蛋白80mg，加入10mL注射用水溶解得人血清白蛋白溶液。取盐酸柔红霉素5mg，溶解于1mL水中，加入50mg/mL的NaHCO3溶液40ul，漩涡一分钟，离心得柔红霉素。将柔红霉素和SolutolHS1520mg溶于氯仿，旋蒸除去氯仿。加入人血清白蛋白溶液，水浴超声10min成澄清透明溶液，过滤灭菌，加入冻干保护剂蔗糖配制成含10％的蔗糖柔红霉素白蛋白结合型溶液，在无菌条件下冷冻干燥，得到柔红霉素白蛋白结合型制剂。

实施例13：

取人血清白蛋白30mg，加入10mL注射用水溶解得人血清白蛋白溶液，再将50mgSolutolHS15加入溶解。取伊达比星10mg，溶解于2mL水中，加入50mg/mL的碳酸氢钠溶液40μL，漩涡二分钟，离心得沉淀。将沉淀溶于丙酮，旋蒸除去丙酮。加入人血清白蛋白溶液，水浴超声30min成澄清透明溶液，过滤灭菌，加入冻干保护剂蔗糖配制成含10％的蔗糖伊达比星白蛋白结合型溶液，在无菌条件下冷冻干燥，得到伊达比星白蛋白结合型制剂。

实施例14：

取人血清白蛋白300mg，加入10mL注射用水溶解得人血清白蛋白溶液。取吡柔比星20mg和SolutolHS1520mg溶于适量氯仿，旋蒸除去氯仿。加入人血清白蛋白溶液，高压均质成澄清透明溶液，过滤灭菌。在无菌条件下冷冻干燥得到吡柔比星白蛋白结合型制剂。

实验例1

按照实施例1、实施例4的制备方法，将实施例1和实施例4处方中白蛋白溶液换成等体积的水得实施例1和实施例2。观察按照实施例1、4和7制备的制剂以及实施例1和实施例2的外观。

实施例1、实施例4为红色澄清透明溶液。实施例1和实施例2只加吡柔比星和SolutolHS15，没有白蛋白；与实施例1、实施例4相比，实施例1及实施例2药物无法分散，不能制备成溶液。实施例7不加SolutolHS15，有吡柔比星和白蛋白，为红色澄清透明溶液。

不加白蛋白则不能形成溶液，而不加SolutolHS15可以形成溶液。说明白蛋白和吡柔比星有相互作用。

实验例2

按照实施例1的制备吡柔比星白蛋白结合型制剂与用注射用水作为溶剂调pH制备同浓度的吡柔比星溶液(实施例3)同时过G75葡聚糖凝胶柱。结果如图1所示，相同时间内，吡柔比星溶液截留在葡聚糖凝胶柱上没有被注射用水洗脱，实施例1的产品随着注射用水洗脱。说明本发明所制备的制剂与吡柔比星分子量不同。可见，吡柔比星和白蛋白形成了结合物。

实验例3

采用超滤法对实施例1、实施例4的结合物的结合率进行测定。

将上述实施例1、实施例4溶液超滤(分子量10k)离心(10000r/min，10min)，测定上清液吡柔比星浓度为C1，实施例1溶液的吡柔比星浓度为C2。结合率＝(1-C1/C2)*100％。

结果表明制剂中吡柔比星和白蛋白结合率分别为91％和92％。

实验例4

不同制备方法对吡柔比星结合率影响

测定实施例1、实施例2和实施例3三种方法制备的溶液按照实验例3的方法测定吡柔比星和白蛋白的结合率，结果如下

表1不同制备方法对吡柔比星结合率的影响

组别	实施例1	实施例2	实施例3
				结合率	91％	94％	63％

结果表明：实施例1和实施例2通过薄膜分散-重悬的方法制备的制剂结合率相差不大，冻干保护剂的加入与否不影响结合率。通过溶液直接结合的方法，结合率比薄膜分散-重悬的方法制备的制剂结合率低。

实验例5

分别取2mL吡柔比星原药溶液(取10mg吡柔比星，精密称定，用pH＝6的PBS溶液配制成5mL，0.22μm无菌滤头过滤除菌，4℃冰箱保存，24h内给药)(实施例4)、吡柔比星白蛋白结合型制剂于8000-14000Da的透析袋中，将透析袋两端用细绳扎紧，置于25mL0.2％Tween-80的PBS溶液中，容器口密闭，于37℃下恒速(100r/min)振荡，分别在0.25h、0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h、36h、48h、60h、72h取出全部释放介质，并加入新鲜的37℃释放介质。用已经建立的荧光分光光度法测定释放介质中吡柔比星的含量。比较两种制剂在体外释放速度的快慢。

结果如图2所示，可以看出，游离吡柔比星在8h内已经基本释放完全，达90％以上。而吡柔比星白蛋白制剂中的药物释放缓慢，72h内累计释放量约为72.04％，呈一定的缓慢释放特性。

实验例6

对实施例2冻干品中吡柔比星的稳定性进行考察。可以看出，在4℃避光放置12个月内制剂中主药的含量没有变化，没有新的杂质出现，原有杂质的出峰时间和含量也没有明显的改变。

实验例7

对细胞摄取进行了考察。

将4T1细胞接种于12孔细胞板上，每孔含有约1×105个细胞，加入1mL相应培养液，然后孵育24h。然后将初始的培养液分别换为含有实施例4和实施例1产品的相应培养液。细胞在37℃条件下孵育2h后，弃去培养基，用胰酶消化。将得到的细胞混悬于PBS中，然后在3000rpm、4℃条件下离心3min。除去上清液，然后用PBS清洗细胞除去背景荧光。离心后，细胞在0.3mLPBS中重悬，细胞的荧光强度用流式细胞仪测定。

结果如图3所示，白蛋白结合型吡柔比星制剂可以显著提高吡柔比星的细胞摄取。

实验例8

我们对体外细胞毒性进行了考察。

通过MTT细胞毒性试验来比较实施例4和实施例1产品的细胞毒性。选取状态良好，处于对数生长期的4T1细胞，我们将细胞以1×104每孔的浓度接种于96孔板中，在37℃、5％CO₂孵箱中静置培养24h。弃掉培养基，加入用完全培养基稀释成一系列浓度梯度的实施例4和实施例1产品以及空白辅料组。每组7个浓度梯度，每个浓度设置5个复孔，再设置一组不加药的阳性对照孔和只加培养基无细胞的阴性对照孔。加药后，于37℃，5％CO₂的恒温培养箱中使药液与细胞共同培养24h后，弃去含药培养基，每孔加100μLMTT溶液(0.5mg/mL)，37℃、5％CO₂下继续孵育4h，将96孔板从恒温培养箱取出，小心吸出孔内上清液。每孔加入150μLDMSO，置于37℃恒温摇床中，100rpm振摇15min，使结晶物甲臢充分溶解。使用酶联免疫检测仪上测定各孔在570nm处吸光值，记录结果。按下列公式计算细胞存活率，细胞存活率＝(实验组吸光值-阴性对照组吸光值)/(阳性对照组吸光值-阴性对照组吸光值)×100％，并以给药浓度为横轴，细胞存活率为纵轴绘制药物对肿瘤细胞生长抑制曲线图。

结果如图4所示，可以看出，与原药组相比，吡柔比星白蛋白制剂组肿瘤细胞的生存率明显较低，吡柔比星原药的IC50为31.61μg/mL，而吡柔比星白蛋白制剂的IC50为18.02μg/mL，说明该制剂相比原药组具有更好的体外抗肿瘤效果。

实验例9

我们对体内药动学行为进行了考察。

生物样品处理方法：取SD大鼠全血于用1％肝素钠润洗晾干的0.5mL离心管中，于6000rpm离心5min，吸取上清液即血浆用于血药浓度检测。精密吸取血浆0.1mL，置于1.5ml离心管中，加入0.1mL溶剂(0.1％甲酸水溶液:乙腈＝1:9(V/V)再加入0.3mL有机溶剂(甲醇:乙腈＝1:5(V/V)沉淀蛋白，涡旋10min，13500rpm，离心10min，0.22μm有机系滤头过滤，弃去初滤液，续滤液置于进样瓶中，LC-MS/MS检测。

标准曲线的制备：向0.1mL空白血浆中分别加入浓度为0.0379、0.0758、0.1516、0.3031、1.2125、2.425、4.85、9.7、19.4μg/ml的吡柔比星标准系列溶液0.1ml，配成一系列浓度的血浆样品，涡旋10min混匀，按生物样品处理方法进行操作，进样1μL，进行LC-MS/MS分析，记录色谱图及峰面积，以A＝峰面积，对C＝吡柔比星浓度(μg/mL)进行线性回归，得到吡柔比星的标准曲线，药物浓度与峰面积之间有良好的线性关系，A＝25200C-4427，R2＝0.9986。

吡柔比星白蛋白溶液的体内药动学实验：取健康的200±20g的雄性Wistar大鼠，随机分为2组，每组6只。其中1组大鼠按4mg/kg的剂量实施例4产品，另外1组大鼠按4mg/kg的剂量尾静脉注射实施例1产品。然后分别于给药后2min、5min、15min、30min、1h、2h、4h、6h眼眶取血300μl于用1％肝素钠润过的0.5ml塑料离心管中，于6000rpm/min离心5min，取上层的血浆0.1ml，按上述血浆样品处理方法处理和用建立的LC-MS/MS测定血浆药物浓度。

结果如图5所示，尾静脉注射给药后，前2h内，实施例1产品吡柔比星在大鼠血浆中的药物浓度一直均高于实施例4产品，2h后，两组的大鼠血药浓度没有显著性差异，白蛋白溶液组(实施例1产品)的Cmax是游离药物组的4.3倍，AUC也有了明显的提高。

实验例10

我们对体内抗肿瘤效果进行了考察。

取生长状态良好处于对数生长期的4T1细胞，常规收集后，用细胞计数仪计数，调整细胞至适宜浓度。用75％酒精给BALB/c小鼠右侧腋下皮肤消毒，接种细胞悬液于此部位(1×106cellsin100μLPBS)。接种后的第8天，肿瘤长至约150mm³，将建模成功荷瘤小鼠随机分为3组，每组15只，分别尾静脉注射给予以下药物：0.9％NaCl、实施例1产品(4mg/kg)、实施例4产品(4mg/kg),每4天给药一次，连续给药4次，每2天用游标卡尺测定一次肿瘤长径与短径，并称量小鼠体重，记录实验结果，根据此公式计算肿瘤体积:Tumorvolume(mm³)＝1/2×Width2×Length。接种30天后，每组随机处死6只小鼠，将肿瘤组织取出，洗净后拍照并称重，计算各组的肿瘤抑制率(Tumorinhibitionrate,TIR)，计算公式为：TIR＝(Wsaline-Wdrug)/Wsaline*100％，其中，Wsaline和Wdrug分别代表生理盐水组和治疗组的瘤重。同时每组随机选取1只小鼠，将心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、空肠、回肠、结肠、肿瘤、腿骨取出，洗净后浸泡于4％多聚甲醛固定液中，送去做HE切片染色观察。同时记录剩余荷瘤小鼠的死亡时间并做出各组小鼠生存曲线。

在第30天时，生理组的肿瘤体积平均值达到了2264mm³。其他两组药物治疗组与其相比均有一定的肿瘤生长抑制作用。原药组(实施例4产品)的肿瘤体积为1608mm³，制剂组(实施例1产品)的肿瘤体积为796mm³，远小于原药组的肿瘤体积，两者存在显著性差异，结果如下图6-1所示，肿瘤取出洗净后拍照如图6-2所示。

计算肿瘤抑制率时，生理盐水组的平均瘤重达到了2.2g，制剂组的平均瘤重达到了0.605g，肿瘤抑制率达到了72.5％，原药组的平均瘤重为1.41g，抑瘤率只有35.9％，两者存在显著性差异，说明给药剂量为4mg/kg时，制剂组具有更好的抑瘤效果。结果如图6-3、图6-4所示。

比较各组小鼠的平均体重时，发现制剂组的小鼠体重在给药开始后没有明显的变化，30天内的小鼠的体重基本上均高于原药组的小鼠体重，结果如图6-5所示。

综上所述，吡柔比星白蛋白结合型制剂显著提高了药效。

实验例11

我们对毒性进行了考察。

骨髓抑制：取饲养一周左右的200±20g的健康雄性Wistar大鼠，随机分为5组，每组8只，分组情况为：A组：生理盐水组；B组：原药组(实施例4产品)(7mg/kg)；C组：制剂组(实施例1产品)(7mg/kg)；D组：3％白蛋白溶液组(等同于C组的白蛋白给药量)；E组：原药组和3％白蛋白混合给药组(即将相同剂量的原药组和3％白蛋白溶液分别注入大鼠体内)。

给药前，各组大鼠眼眶取血0.5mL左右全血，置于EDTA-2K管内，轻微晃动，防止凝血，用血细胞分析仪测定各组给药前血液白细胞水平，记录实验结果。给药24h后开始每两天取血测定白细胞，直到白细胞水平降至最低值并开始回升。我们以给药后的天数为横坐标，以测得WBC的值与初始值的比值为纵坐标，绘制各组大鼠给药后的白细胞数量变化如下图7-1所示。

可以看出，相同给药剂量下，生理盐水组(A组)和3％白蛋白溶液组(D组)的大鼠的白细胞均没有显著性的变化，而其余三组的白细胞值在给药后均有一定程度的下降，并且均在给药后第三天达到最低值，然后开始回升，至给药后第七天，制剂组的白细胞数目已经回升至5.3(*109/L)，在正常范围内(5-25*109/L)，而原药组的白细胞数目为2.5(*109/L)，两者存在显著性差异；到给药后的第九天，制剂组的白细胞数目为16.75(*109/L)，基本上恢复至给药前的白细胞水平，而原药组的白细胞数目为3.35(*109/L)，仍然低于正常值范围，与制剂组存在显著性差异。这说明，吡柔比星原药具有明显的骨髓抑制作用，而将其制备为吡柔比星白蛋白结合型制剂后可以有效的降低骨髓抑制毒性。

脏器和胃肠道毒性实验：取200±20g的健康雄性Wistar大鼠，随机分为5组，每组1只，具体分组情况与上述骨髓抑制实验一致，具体为：A组：生理盐水组；B组：原药组(实施例4产品)(7mg/kg)；C组：制剂组(实施例1产品)(7mg/kg)；D组：3％白蛋白溶液组(等同于C组的白蛋白给药量)；E组：原药组和3％白蛋白混合给药组(即将相同剂量的原药组和3％白蛋白溶液分别注入大鼠体内)。

给药剂量为4mg/kg，每2天给药一次，共给药2次，第一次给药7天后，股动脉放血处死所有大鼠，解剖取心、肝、脾、肺、肾、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、腿骨，生理盐水洗净，浸泡于4％多聚甲醛固定液中，过夜后换一次固定液，继续固定48h。将组织浸泡脱水，浸蜡包埋，切成4-5μm薄片，经过脱蜡，H&E染色，最后封片，于光镜下观察各器官及胃肠道病理损伤情况。脏器和胃肠道毒性结果如图7-2所示。

结果表明，在胃肠道毒性方面，结果如图7-2所示，生理盐水组对各器官和胃肠道均无病理损伤，其病理切片可作为正常对照组。吡柔比星原药组可见严重胃肠道毒性，大部分肠道坏死脱落，肠粘膜重度炎细胞浸润伴坏死。而吡柔比星白蛋白制剂组为正常肠组织，仅有少量的炎症细胞浸润。在脏器毒性方面，结果如图7-3所示，吡柔比星原药组导致明显的心脏、肺、肾毒性，如心肌纤维变细，肌束膜破裂，心肌间充血出血，肌核固缩；肺间质可见出血；肾小管间质出血，小管上皮部分坏死脱落，小球萎缩数量减少，体积减小等。而吡柔比星白蛋白制剂的心脏、肺、肾毒性显著降低。结果表明，将吡柔比星制成白蛋白制剂后可以有效降低脏器和胃肠道毒性。

实验例12

对体内分布进行考察。

生物样品处理方法：取荷瘤BALB/c小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织，用生理盐水洗净，滤纸吸干水分，加入2倍质量的生理盐水，再用自动匀浆机制备成组织匀浆液。取小鼠全血于用1％肝素钠润洗晾干的0.5mL离心管中，于6000rpm离心8min，吸取上清液即血浆用于血药浓度检测。精密吸取组织匀浆液或血浆0.1mL，置于1.5ml离心管中，加入0.1mL溶剂(0.1％甲酸水溶液:乙腈＝1:9(V/V)再加入0.3mL有机溶剂(甲醇:乙腈＝1:5(V/V)沉淀蛋白，涡旋10min，13500rpm，离心10min，0.22μm有机系滤头过滤，弃去初滤液，续滤液置于进样瓶中，LC-MS/MS检测。

吡柔比星白蛋白溶液的体内分布实验：取6-10周龄的健康雌性BALB/c小鼠，以75％酒精消毒小鼠右侧腋下皮肤，皮下注射接种4T1细胞(1×106cellsin100μLPBS)，正常饲养3周至肿瘤生长到300mm³，取造模成功的荷瘤小鼠随机分为6组，每组6只，其中3组尾静脉注射给予实施例4吡柔比星原药溶液5mg/kg，另外3组尾静脉注射给予实施例1吡柔比星白蛋白制剂5mg/kg。分别于给药后15min、1h、4h各处死一组荷瘤小鼠，摘取眼球取血，同时解剖取心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织，用生理盐水洗净，滤纸吸干水分、称重，置于-80℃冰箱中冷冻保存备用。按照上述生物样品处理方法处理并用LC-MS/MS检测各组织中药物浓度。

结果如图8所示，可以看出，与游离药物组相比，制剂组各小鼠在肿瘤组织以及血浆中药物的浓度在各个时间点均显著高于原药组，在15min，1h，4h分别是游离药物组肿瘤部位药物浓度的1.87、2.26、2.54倍，是游离药物组血浆中药物浓度的3.90、1.69、1.58倍，制剂组药物在心肝脾肺肾的浓度也显著高于原药组，结合药动学结果推测是由于吡柔比星原药在体内被迅速代谢。

实验例13

表面活性剂及冻干保护剂对药效和毒性的影响

我们对比了加表面活性剂、不加表面活性剂及冻干保护剂体内抗肿瘤效果和毒性。实施例1和实施例4为不加冻干保护剂产品，实施例2和实施例5为加冻干保护剂产品，实施例7为不加表面活性剂产品。

取生长状态良好处于对数生长期的4T1细胞，常规收集后，用细胞计数仪计数，调整细胞至适宜浓度。用75％酒精给BALB/c小鼠右侧腋下皮肤消毒，接种细胞悬液于此部位(1×106cellsin100μLPBS)。接种后的第8天，肿瘤长至约150mm³，将建模成功荷瘤小鼠随机分为7组，每组15只，分别尾静脉注射给予以下药物：0.9％NaCl、制剂组1(实施例1产品)(4mg/kg)、制剂组2(实施例2产品)(4mg/kg)、制剂组3(实施例4产品)(4mg/kg)、制剂组4(实施例5产品)(4mg/kg)、制剂组5(实施例7产品)(4mg/kg),原药组(实施例4产品)(4mg/kg)每4天给药一次，连续给药4次。接种30天后，每组随机处死6只小鼠，将肿瘤组织取出，计算各组的肿瘤抑制率(Tumorinhibitionrate,TIR)，计算公式为：TIR＝(Wsaline-Wdrug)/Wsaline*100％，其中，Wsaline和Wdrug分别代表生理盐水组和治疗组的瘤重。

骨髓抑制：取饲养一周左右的200±20g的健康雄性Wistar大鼠，随机分为7组，每组8只，分组情况为：A组：生理盐水组；B组：制剂组1(实施例1产品)(7mg/kg)；C组：制剂组2(实施例2产品)(7mg/kg)；D组：制剂组3(实施例4产品)(7mg/kg)；E组：制剂组4(实施例5产品)(7mg/kg)；F组：制剂组5(实施例7产品)(7mg/kg)；E.原药组(实施例4产品)(7mg/kg)给药前，各组大鼠眼眶取血0.5mL左右全血，置于EDTA-2K管内，轻微晃动，防止凝血，用血细胞分析仪测定各组给药前血液白细胞水平，记录实验结果。给药24h后开始每两天取血测定白细胞，直到白细胞水平降至最低值并开始回升。最终测得WBC的值与初始值的比值考察各组大鼠给药后的白细胞数量变化。

结果如表2，制剂组和原药组比，肿瘤抑制率提高，药效提高。制剂组中制剂组5抑瘤率略低于制剂组1～4，制剂组1～4组的抑瘤率没有显著性差异。表明白蛋白制剂均可提高药效，表面活性剂加入有利于提高药效，表面活性剂的种类对药效没有影响而冻干保护剂对药效没有影响。相同给药条件下，三组制剂均可以有效的降低骨髓抑制毒性，没有显著性差异。表面白蛋白制剂可以降低毒性，表面活性剂和冻干保护剂对毒性的影响没有显著性差异。

表2：表面活性剂及冻干保护剂对药效和毒性的影响

综上所述，吡柔比星白蛋白结合型制剂显著提高了药效，降低了毒性。表面活性剂加入有利于提高药效，对毒性没有显著性影响。冻干保护剂的加入对药效和毒性均没有显著性影响。

实验例14

其他蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物制剂抗肿瘤效果及毒性研究

1.阿霉素白蛋白结合物制剂抗肿瘤效果及毒性

取生长状态良好处于对数生长期的LLC细胞，常规收集后，用细胞计数仪计数，调整细胞至适宜浓度。用75％酒精给C57小鼠右侧腋下皮肤消毒，接种细胞悬液于此部位(1×106cellsin100μLPBS)。接种后的第8天，肿瘤长至约150mm³，将建模成功荷瘤小鼠随机分为3组，每组15只，分别尾静脉注射给予以下药物：0.9％NaCl、制剂组(实施例8产品)(5mg/kg)、原药组(0.5mg盐酸阿霉素直接溶解于10mL生理盐水)(5mg/kg)每4天给药一次，连续给药4次。接种30天后，每组随机处死6只小鼠，将肿瘤组织取出，计算各组的肿瘤抑制率(Tumorinhibitionrate,TIR)，计算公式为：TIR＝(Wsaline-Wdrug)/Wsaline*100％，其中，Wsaline和Wdrug分别代表生理盐水组和治疗组的瘤重。

骨髓抑制：取饲养一周左右的200±20g的健康雄性Wistar大鼠，随机分为5组，每组8只，分组情况为：A组：生理盐水组；B组：制剂组(实施例8产品)(7mg/kg)；C组：原药组(7mg/kg)给药前，各组大鼠眼眶取血0.5mL左右全血，置于EDTA-2K管内，轻微晃动，防止凝血，用血细胞分析仪测定各组给药前血液白细胞水平，记录实验结果。给药24h后开始每两天取血测定白细胞，直到白细胞水平降至最低值并开始回升。最终测得WBC的值与初始值的比值考察各组大鼠给药后的白细胞数量变化。

结果如表3，制剂组和原药组比，肿瘤抑制率提高，药效提高。相同给药条件下，制剂组可以有效的降低骨髓抑制毒性。

表3：阿霉素白蛋白制剂对药效和毒性的影响

2.柔红霉素白蛋白结合物制剂抗肿瘤效果及毒性

取生长状态良好处于对数生长期的LLC细胞，常规收集后，用细胞计数仪计数，调整细胞至适宜浓度。用75％酒精给C57小鼠右侧腋下皮肤消毒，接种细胞悬液于此部位(1×106cellsin100μLPBS)。接种后的第8天，肿瘤长至约150mm³，将建模成功荷瘤小鼠随机分为3组，每组15只，分别尾静脉注射给予以下药物：0.9％NaCl、制剂组(实施例12产品)(1mg/kg)、原药组(0.5mg盐酸柔红霉素注射液直接溶解于10mL生理盐水)(1mg/kg)隔天给药一次，共给7次。接种30天后，每组随机处死6只小鼠，将肿瘤组织取出，计算各组的肿瘤抑制率(Tumorinhibitionrate,TIR)，计算公式为：TIR＝(Wsaline-Wdrug)/Wsaline*100％，其中，Wsaline和Wdrug分别代表生理盐水组和治疗组的瘤重。

骨髓抑制：取饲养一周左右的200±20g的健康雄性Wistar大鼠，随机分为5组，每组8只，分组情况为：A组：生理盐水组；B组：制剂组(实施例12产品)(2mg/kg)；C组：原药组(2mg/kg)给药前，各组大鼠眼眶取血0.5mL左右全血，置于EDTA-2K管内，轻微晃动，防止凝血，用血细胞分析仪测定各组给药前血液白细胞水平，记录实验结果。给药24h后开始每两天取血测定白细胞，直到白细胞水平降至最低值并开始回升。最终测得WBC的值与初始值的比值考察各组大鼠给药后的白细胞数量变化。

结果如表4，制剂组和原药组比，肿瘤抑制率提高，药效提高。相同给药条件下，制剂组可以有效的降低骨髓抑制毒性。

表4：柔红霉素白蛋白制剂对药效和毒性的影响

3.阿克拉霉素白蛋白结合物制剂抗肿瘤效果及毒性

取生长状态良好处于对数生长期的LLC细胞，常规收集后，用细胞计数仪计数，调整细胞至适宜浓度。用75％酒精给C57小鼠右侧腋下皮肤消毒，接种细胞悬液于此部位(1×106cellsin100μLPBS)。接种后的第8天，肿瘤长至约150mm³，将建模成功荷瘤小鼠随机分为3组，每组15只，分别尾静脉注射给予以下药物：0.9％NaCl、制剂组(实施例11产品)(5mg/kg)、原药组(5mg盐酸阿克拉霉素直接溶解于10mL生理盐水)(5mg/kg)每4天给药一次，连续给药4次。接种30天后，每组随机处死6只小鼠，将肿瘤组织取出，计算各组的肿瘤抑制率(Tumorinhibitionrate,TIR)，计算公式为：TIR＝(Wsaline-Wdrug)/Wsaline*100％，其中，Wsaline和Wdrug分别代表生理盐水组和治疗组的瘤重。

骨髓抑制：取饲养一周左右的200±20g的健康雄性Wistar大鼠，随机分为5组，每组8只，分组情况为：A组：生理盐水组；B组：制剂组(实施例11产品)(7mg/kg)；C组：原药组(7mg/kg)给药前，各组大鼠眼眶取血0.5mL左右全血，置于EDTA-2K管内，轻微晃动，防止凝血，用血细胞分析仪测定各组给药前血液白细胞水平，记录实验结果。给药24h后开始每两天取血测定白细胞，直到白细胞水平降至最低值并开始回升。最终测得WBC的值与初始值的比值考察各组大鼠给药后的白细胞数量变化。

结果如表5，制剂组和原药组比，肿瘤抑制率提高，药效提高。相同给药条件下，制剂组可以有效的降低骨髓抑制毒性。

表5：表面活性剂及冻干保护剂对药效和毒性的影响

4.伊达比星白蛋白结合物制剂抗肿瘤效果及毒性

取生长状态良好处于对数生长期的LLC细胞，常规收集后，用细胞计数仪计数，调整细胞至适宜浓度。用75％酒精给C57小鼠右侧腋下皮肤消毒，接种细胞悬液于此部位(1×106cellsin100μLPBS)。接种后的第8天，肿瘤长至约150mm³，将建模成功荷瘤小鼠随机分为3组，每组15只，分别尾静脉注射给予以下药物：0.9％NaCl、制剂组(实施例13产品)(5mg/kg)、原药组(5mg盐酸伊达比星直接溶解于10mL生理盐水)(5mg/kg)每4天给药一次，连续给药4次。接种30天后，每组随机处死6只小鼠，将肿瘤组织取出，计算各组的肿瘤抑制率(Tumorinhibitionrate,TIR)，计算公式为：TIR＝(Wsaline-Wdrug)/Wsaline*100％，其中，Wsaline和Wdrug分别代表生理盐水组和治疗组的瘤重。

骨髓抑制：取饲养一周左右的200±20g的健康雄性Wistar大鼠，随机分为5组，每组8只，分组情况为：A组：生理盐水组；B组：制剂组(实施例13产品)(7mg/kg)；C组：原药组(7mg/kg)给药前，各组大鼠眼眶取血0.5mL左右全血，置于EDTA-2K管内，轻微晃动，防止凝血，用血细胞分析仪测定各组给药前血液白细胞水平，记录实验结果。给药24h后开始每两天取血测定白细胞，直到白细胞水平降至最低值并开始回升。最终测得WBC的值与初始值的比值考察各组大鼠给药后的白细胞数量变化。

结果如表6，制剂组和原药组比，肿瘤抑制率提高，药效提高。相同给药条件下，制剂组可以有效的降低骨髓抑制毒性。

表6：表面活性剂及冻干保护剂对药效和毒性的影响

综上所述，本发明所制备的蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物制剂不仅辅料用量少，制备非常简单，药物稳定性好，辅料生物相容性好，而且本发明所制备的制剂可以显著提高药效，降低毒性。因此，本发明所制备的制剂有望用于大工业生产，供临床使用。

本发明并不局限于前述的具体实施方式。本发明扩展到任何在本说明书中披露的新特征或任何新的组合，以及披露的任一新的方法或过程的步骤或任何新的组合。

Claims

1.一种蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.一种蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

B、取白蛋白溶解于适量的水中；

3.根据权利要求2所述的一种蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物的制备方法，其特征在于：所述步骤A中，碱性物质选自氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾、三乙胺或氨水中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的一种蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物的制备方法，其特征在于：所述步骤A中，脂溶性溶剂选自氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、丙酮、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或甲基吡咯烷酮中的一种或多种。

5.根据权利要求2所述的一种蒽环类抗肿瘤抗生素白蛋白结合物的制备方法，其特征在于：所述步骤A中，减压浓缩的温度为20-70℃。