CN105899192A - 药物递送用载体、偶联物及含有这些成分的组合物以及它们的施予方法 - Google Patents

药物递送用载体、偶联物及含有这些成分的组合物以及它们的施予方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于将药物递送至脑的囊泡、偶联物及含有这些成分的组合物以及它们的施予方法。本发明提供含有药物递送用载体、用于按照施予计划施予至对象的组合物，所述施予计划包括：将所述组合物施予至已使其禁食或已诱发低血糖的对象，并且诱发所述对象的血糖值上升，所述载体的外表面经GLUT1配体修饰。

Description

药物递送用载体、偶联物及含有这些成分的组合物以及它们 的施予方法
相关申请的相互参考
本申请享受日本特愿2013－242347号(申请日：2013年11月22日)及日本特愿2014－96935号(申请日：2014年5月8日)的优先权权益，上述申请通过引用整体并入本说明书中。
技术领域
本发明涉及药物递送用载体、偶联物及含有这些成分的组合物以及它们的制造方法和施予方法。
背景技术
已知在血液与脑之间，存在限制物质交换的血脑屏障。可以认为，其成因是脑血管内皮细胞形成密合连接，细胞的间隙极其狭窄，以及，细胞自身进行选择性的物质摄入及排出。
血脑屏障的选择透过性高，除了一部分物质(例如，酒精、咖啡因、尼古丁及葡萄糖)之外几乎无法通过。因此，这一现象使得利用脑治疗药的脑疾病治疗、利用脑诊断剂的脑疾病诊断或利用造影剂的脑造影变得困难。
利用葡萄糖通过血脑屏障的特性，开发了将抗体递送至脑的技术(专利文献1)。但是，该抗体仅涉及对抗体进行糖基化的技术，效果有限。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2007/068429
发明内容
本发明提供药物递送用载体、偶联物及含有这些成分的组合物以及它们的施予方法。
本申请的发明人发现，将其外表面经葡萄糖修饰的胶束等囊泡施予至已诱发了低血糖的对象、之后使血糖值上升，囊泡将被极其高效地递送至脑。本发明是基于上述见解完成的。
即，本发明提供以下的发明。
(1)一种组合物，其是含有药物递送用载体、用于按照施予计划施予至对象的组合物，
所述施予计划包括：将所述组合物施予至已使其禁食、或已诱发低血糖的对象，并且，诱发所述对象的血糖值上升，
所述载体的外表面经GLUT1配体修饰。
(2)一种组合物，其是含有药物与GLUT1配体的偶联物而成的、用于按照施予计划施予至对象的组合物，
所述施予计划包括：将所述组合物施予至已使其禁食、或已诱发低血糖的对象，并且，诱发所述对象的血糖值上升。
(3)如上述(1)或(2)所述的组合物，其是用于将药物递送至脑的组合物。
(4)如上述(1)或(2)所述的组合物，其是用于使药物通过血脑屏障的组合物。
(5)如上述(1)或(2)所述的组合物，其是用于使药物通过血神经屏障、血视网膜屏障或血脑脊液屏障的组合物。
(6)如上述(1)或(2)所述的组合物，其是用于将药物递送至脑血管内皮细胞的组合物。
(7)如上述(1)～(6)中任一项所述的组合物，血糖值上升是通过施予葡萄糖而被诱发的。
(8)如上述(7)所述的组合物，其中，组合物的施予与葡萄糖的施予同时进行，或或者在施予葡萄糖之前施予组合物。
(9)如上述(1)～(8)中任一项所述的组合物，组合物被输液施予至静脉内，输液施予持续10分钟以上。
(10)如上述(1)及(3)～(9)中任一项所述的组合物，其中，载体为囊泡，形成囊泡的高分子中的10～40摩尔％经GLUT1配体修饰。
(11)如上述(1)及(3)～(9)中任一项所述的组合物，其中，载体为囊泡，形成囊泡的高分子中的40～100摩尔％经GLUT1配体修饰。
(12)如上述(1)及(3)～(11)中任一项所述的组合物，其中，载体中包封待递送的药物。
(13)如上述(1)及(3)～(12)中任一项所述的组合物，其中，载体为囊泡，囊泡为直径400nm以下的囊泡。
(14)如上述(2)～(9)中任一项所述的组合物，其中，偶联物是药物与GLUT1配体经由连接体连接而成的。
(15)如上述(1)～(14)中任一项所述的组合物，其中，GLUT1配体为葡萄糖。
(16)如上述(1)～(15)中任一项所述的组合物，其中，药物为选自生理活性物质、抗体、核酸、生物相容性荧光色素、及造影剂中的至少1种药物。
(17)、一种偶联物，其是1分子GLUT1配体与1分子高分子的偶联物，偶联物能够以使得GLUT1配体露出囊泡表面的方式形成囊泡。
(18)如上述(17)所述的偶联物，其中，GLUT1配体为葡萄糖。
(19)如上述(18)所述的偶联物，其中，葡萄糖经由其6号碳原子与高分子偶联。
(20)如上述(19)所述的偶联物或其药学上允许的盐，所述偶联物由下述式(I)、下述式(II)、下述式(III)或者下述式(XVI)表示：
{式中，n1及m1分别为5～20,000。}
{式中，n2及m2分别为5～20,000。}
{式中，n3及m3分别为5～20,000。}
{式中，n16为5～20,000的整数，m16为2～5,000的整数。}。
(21)一种囊泡，其是含有上述(17)～(20)中任一项所述的偶联物而成的药物递送用囊泡，
所述偶联物占形成囊泡的全部高分子中的10～40摩尔％。
(22)一种囊泡，其是含有上述(17)～(20)中任一项所述的偶联物而成的药物递送用囊泡，
所述偶联物占形成囊泡的全部高分子中的40～100摩尔％。
(23)GLUT1配体的用于制造上述(1)～(16)中任一项所述的组合物、或上述(21)或者(22)所述的囊泡的用途。
附图说明
图1表示外表面被葡萄糖修饰而得的聚离子复合型胶束(PIC胶束)与其制备方法。
图2表示实施例1中得到的Glc(6)－Cy5－PIC胶束的粒径分布的动态光散射测定(DLS)的结果和利用透射电子显微镜(TEM)获得的粒子图像。此处，Glc(6)表示经由葡萄糖的6号碳与形成胶束的高分子结合。
图3是表示实施例1中得到的Glc(6)－Cy5－PIC胶束向脑中的选择性的且有效的蓄积的图。
图4是表示使葡萄糖经由其3号或6号碳与高分子结合而得的胶束向脑中的蓄积的图。
图5是表示胶束被摄入到脑中时的脑实质部的荧光显微镜图像(图5A)及血糖值和向脑中的摄入量的推移(图5B)的图。
图6是表示直径为100nm的PICsome向脑中的蓄积的图。
图7表示用葡萄糖修饰外表面而得的siRNA胶束向脑中的蓄积。图7A表示siRNA胶束与其制备方法，图7B表示向脑中的蓄积量的推移。
图8表示siRNA胶束向脑细胞内的蓄积的荧光显微镜图像。
图9是表示偶联有1分子葡萄糖的高分子向脑中的蓄积的图。
图10是表示经由连接体连接有葡萄糖的IgG抗体向脑中的蓄积的图。G－IgG表示连接有葡萄糖的IgG。
图11是表示在腹腔内(i.p.)施予葡萄糖30分钟后，静脉内(i.v.)施予Glc(6)－Cy5－PIC胶束时的脑实质的荧光强度变化的图。
图12是表示Glc(6)－Cy5－PIC胶束的一部分可以在脑血管内皮细胞中蓄积的图。
图13是表示小鼠大脑皮质中的静脉施予后的PIC胶束的偏在的图。
图14是表示小鼠大脑皮质的切片中的静脉施予后的PIC胶束的偏在的图。
图15是表示小鼠大脑皮质中的静脉施予后的PIC胶束的经时偏在变化的图。
具体实施方式
本发明中，所谓“药物运送体”，是指用于药物递送的载体，可以举出可以包封药物的微粒，例如，囊泡、树枝状大分子(dendrimer)、水凝胶及纳米球等。药物转运体一般具有直径为10nm～400nm的大小。
本说明书中，所谓“囊泡”，是指胶束、中空微粒。囊泡优选具有生物相容性的外壳，其外表面经GLUT1配体修饰。由此，囊泡能够与GLUT1相互作用。
本说明书中，所谓“胶束”，是指由1层分子膜形成的囊泡。作为胶束，可以举出由表面活性剂等两亲性分子形成的胶束、及由聚离子复合物形成的胶束(PIC胶束)。对于胶束而言，已知从血中滞留时间的观点考虑，优选用聚乙二醇修饰其外表面。
本说明书中，所谓“脂质体”，是指由2层分子膜形成的囊泡。分子膜通常为由磷脂形成的双层膜。
本说明书中，所谓“聚离子复合型聚合物囊泡”(以下也称为“PICsome”)，是指由聚离子复合物形成的中空的微粒。对于PICsome而言，已知从血中滞留时间的观点考虑，优选用聚乙二醇修饰其外表面。
本说明书中，所谓“聚离子复合物”(以下也称为“PIC”)，是指通过以下方式形成的离子层：在水溶液中将PEG与阴离子性嵌段的共聚物和PEG与阳离子性嵌段的共聚物以中和电荷的方式混合时，在两嵌段共聚物的阳离子性嵌段与阴离子性嵌段之间形成离子层。使PEG与上述荷电性链结合的意义是，抑制聚离子复合物凝集并沉淀，以及，由此使聚离子复合物形成粒径为数十nm的具有单分散核－壳结构的纳米微粒。此时，已知由于PEG覆盖纳米微粒的外壳(壳)，因此，从生物相容性高、延长血中滞留时间的方面考虑是合适的。另外，已经发现在聚离子复合物形成过程中，荷电性嵌段共聚物之一可以不需要PEG部分，而取代为均聚物、表面活性剂、核酸及/或酶。并且，在聚离子复合物形成过程中，可以是阴离子性聚合物及阳离子性聚合物中的至少1种与PEG形成共聚物，也可以是上述两者与PEG形成共聚物。另外，已知如果增加PEG含量，则PIC胶束容易被形成，如果减少PEG含量，则PICsome容易被形成。作为广泛用于聚离子复合物的制造的阴离子性聚合物或嵌段，例如，可以举出聚谷氨酸、聚天冬氨酸及核酸(例如，DNA、mRNA及siRNA)，作为阳离子性聚合物或嵌段，例如，可以举出聚赖氨酸及聚(5－氨基戊基天冬氨酸)。此处，所谓mRNA，是指用于通过翻译进行蛋白质合成的信使RNA，所谓siRNA，是指可以诱导RNA干扰(RNAi)的双链RNA(核酸)。siRNA不受特别限定，是由20～30bp组成的双链RNA，优选为21～23bp、25bp、27bp，是具有与靶基因的序列相同的序列的双链RNA。
本说明书中，所谓“药物递送用”，是指具有生物相容性、以及能够将药物包封于囊泡内。本说明书中，所谓“药物递送用”，有时指利用了使药物的血中滞留时间较之未包封药物的血中滞留时间而言延长的作用的用途。
本说明书中，所谓“诱发低血糖”，是指使对象的血糖值较之如果未实施相应处置而应呈现的血糖而言进一步降低。作为诱发低血糖的方法，可以举出糖尿病药的施予等。例如，诱发低血糖时，只要达到诱发低血糖这一目的，例如也可以允许摄取其他药物、或饮用水等饮料。诱发低血糖也可以伴有实质上不影响血糖的其它处置。
本说明书中，所谓“使之禁食”，是指使对象禁食，例如，使之禁食3小时以上、4小时以上、5小时以上、6小时以上、7小时以上、8小时以上、9小时以上、10小时以上、11小时以上、12小时以上、13小时以上、14小时以上、15小时以上、16小时以上、17小时以上、18小时以上、19小时以上、20小时以上、21小时以上、22小时以上、23小时以上、24小时以上、25小时以上、26小时以上、27小时以上、28小时以上、29小时以上、30小时以上、31小时以上、32小时以上、33小时以上、34小时以上、35小时以上、36小时以上、37小时以上、38小时以上、39小时以上、40小时以上、41小时以上、42小时以上、43小时以上、44小时以上、45小时以上、46小时以上、47小时以上或48小时以上。通过禁食，引起对象的低血糖。禁食时间由医生等根据对象的健康状态决定，例如，优选采用对象达到空腹时血糖水平的时间以上的时间。对于禁食时间而言，例如，可以是GLUT1在脑血管内皮细胞的血管内表面的表达上升或达到平稳状态以上的时间。对于禁食时间而言，例如，可以是上述时间中的12小时以上、24小时以上或36小时以上。另外，禁食可以伴有实质上不影响血糖值、GLUT1在血管内表面的表达的其他处置。
本说明书中，所谓“诱发血糖值上升”，是指使已诱发低血糖的对象、或使之维持低血糖状态的对象的血糖值上升。可以利用本领域技术人员已知的各种方法使血糖值上升，例如，诱发血糖值上升的物质的施予，例如，葡萄糖、果糖(fructose)、半乳糖等诱发血糖值上升的单糖的施予、麦芽糖等诱发血糖值上升的多糖的施予、或者淀粉等诱发血糖值上升的碳水化合物的摄取、或通过进食使血糖上升。
本说明书中，所谓“血糖操作”，是指针对对象诱发低血糖，之后，使血糖值上升。在针对对象诱发低血糖之后，可以将对象的血糖值维持为低血糖。将对象的血糖值维持为低血糖的时间可以采用例如0小时以上、1小时以上、2小时以上、3小时以上、4小时以上、5小时以上、6小时以上、7小时以上、8小时以上、9小时以上、10小时以上、11小时以上、12小时以上、13小时以上、14小时以上、15小时以上、16小时以上、17小时以上、18小时以上、19小时以上、20小时以上、21小时以上、22小时以上、23小时以上、24小时以上、25小时以上、26小时以上、27小时以上、28小时以上、29小时以上、30小时以上、31小时以上、32小时以上、33小时以上、34小时以上、35小时以上、36小时以上、37小时以上、38小时以上、39小时以上、40小时以上、41小时以上、42小时以上、43小时以上、44小时以上、45小时以上、46小时以上、47小时以上、48小时以上。之后，可以使血糖值上升。本说明书中，所谓“维持血糖”，只要达到维持对象的低血糖这一目的，例如也可以允许摄取其他药物、或饮用水等饮料。诱发低血糖也可以伴有实质上不影响血糖的其他处置。
本说明书中，所谓“对象”，是指包括人在内的哺乳动物。对象可以是健康的对象，也可以是罹患某种疾病的对象。此处作为疾病，可以举出脑神经疾病，例如，精神病性障碍、抑郁症、情绪障碍、焦虑、睡眠障碍、痴呆症及物质相关障碍。另外，作为痴呆症，不受特别限定，可以举出阿兹海默症及克罗伊茨费尔特－雅各布病(Creutzfeldt-Jakob)。
本说明书中，所谓“血脑屏障”，是指存在于血液循环与脑之间、对于物质的透过持有选择性的功能性障壁。可以认为，血脑屏障的实体是脑血管内皮细胞等。关于血脑屏障的物质透过性，存在许多不明之处，但已知葡萄糖、酒精及氧容易通过血脑屏障，脂溶性物质、小分子(例如，分子量小于500)较之水溶性分子、高分子(例如，分子量为500以上)而言有容易通过的趋势。多种脑疾病治疗药、脑诊断剂无法通过血脑屏障，这一现象成为脑疾病的治疗、脑的分析等的巨大障碍。本说明书中，所谓“血神经屏障”，是指存在于血液循环与末梢神经之间、对于物质的透过持有选择性的功能性障壁。本说明书中，所谓“血脑脊液屏障”，是指存在于血液循环与脑脊髓液之间、对于物质的透过持有选择性的功能性障壁。本说明书中，所谓“血视网膜屏障”，是指存在于血液循环与视网膜组织之间、对于物质的透过持有选择性的功能性障壁。可以认为，血神经屏障、血脑脊液屏障及血视网膜屏障的实体是存在于各屏障的血管内皮细胞等，其功能与血脑屏障相同。
本说明书中，所谓“GLUT1配体”，是指与GLUT1特异性结合的物质。作为GLUT1配体，已知各种配体，不受特别限定，例如，可以举出葡萄糖及己糖等分子，GLUT1配体均可以在本发明中代替葡萄糖用于载体或偶联物的制备。对于GLUT1配体而言，优选相对于GLUT1具有与葡萄糖等同或其以上的亲和性。已知2－N－4－(1－叠氮基－2,2,2－三氟乙基)苯甲酰基－1,3－双(D－甘露糖－4－基氧基)－2－丙胺(ATB－BMPA)、6－(N－(7－硝基苯基－2－氧杂－1,3－二唑－4－基)氨基)－2－脱氧葡萄糖(6－NBDG)、4,6－O－亚乙基－α－D－葡萄糖、2－脱氧－D－葡萄糖及3－O－甲基葡萄糖也与GLUT1结合，这些分子也可以作为GLUT1配体而用于本发明。
根据本发明，发现用葡萄糖修饰其外表面而得的上述载体仅通过施予至对象即显示出向脑中的蓄积。因此，本发明的施予计划中，可以不禁食或者不诱发低血糖，及/或可以不诱发血糖值上升。另外，本申请人的发明人发现，将用葡萄糖以使得葡萄糖露出表面的方式修饰其外表面而得的载体(具体而言，胶束或聚离子复合型聚合物囊泡(PICsome)等囊泡)按照某施予计划施予时，这些载体显著跨越血脑屏障并被递送至脑内(脑实质部)。因此，本发明的施予计划优选包括将该组合物施予至使之禁食或已诱发低血糖的对象，更优选的是，本发明的施予计划包括：将该组合物施予至使之禁食或已诱发低血糖的对象，并且诱发该对象的血糖值上升。本发明的施予计划中，该组合物可以与该对象的血糖值上升的诱发同时地、连续地或逐次地被施予至该对象。对于施予计划而言，对该对象的组合物的施予与该对象的血糖值上升的诱发之间可以有间隔，也可以没有间隔。与该对象的血糖值上升的诱发同时施予该组合物时，所述组合物可以以与引起血糖值上升的诱发的药物混合的形态施予该对象，也可以以与引起该对象的血糖值上升的诱发的药物不同的形态进行施予。另外，该组合物与该对象的血糖值上升的诱发连续或逐次地被施予至该对象时，该组合物可以在该对象的血糖值上升的诱发之前被施予至该对象，也可以在之后被施予，优选的是，该组合物可以在该对象的血糖值上升的诱发之前施予至该对象。在对于该对象施予该组合物之前诱发该对象的血糖值上升时，优选在诱发该对象的血糖值上升后1小时以内、45分钟以内、30分钟以内、15分钟以内或10分钟以内将该组合物施予至该对象。另外，在对于该对象施予该组合物之后诱发该对象的血糖值上升时，优选在将该组合物施予至该对象后6小时以内、4小时以内、2小时以内、1小时以内、45分钟以内、30分钟以内、15分钟以内或10分钟以内诱发该对象的血糖值上升。上述的施予计划的循环可以实施2次以上。葡萄糖施予与样品施予的前后关系可以根据使其通过血脑屏障的时机决定。
大脑皮质由6层构成，自表层起，存在分子层(第1层)、外颗粒层(第2层)、外锥体细胞层(第3层)、内颗粒层(第4层)、内锥体细胞层(第5层)及多形细胞层(第6层)，根据本发明，可以在上述任一层中将载体递送至脑实质。这些层中，特别地，在外锥体细胞层(第3层)及内颗粒层(第4层)中，本发明的载体的递送显著有效。
本发明中，像胶束或PICsome这样的巨大载体(直径为约40nm～100nm)可以被极其高效地递送至脑也是非常出乎意料的。即使是这样的囊泡也能够被递送至脑这一事实是指，通过将用葡萄糖修饰而得的各种巨大分子及载体按照上述施予计划施予，可以使这些巨大分子及载体有效地通过血脑屏障。
以下，对本发明的葡萄糖的血脑屏障的作用进行说明。可以认为，本发明的葡萄糖的作用是与在脑的血管内皮细胞的血管内表面表达的葡萄糖转运体即GLUT1结合。因此，本发明中，GLUT1配体也可以起到与葡萄糖相同的作用。另外，本发明中，GLUT1配体可以以露出载体外表面的方式与载体结合，从而可以与在脑的血管内皮细胞的血管内表面表达的葡萄糖转运体结合。因此，可以认为，如果是可以对GLUT1呈递GLUT1配体的分子、复合体及囊泡等，则可以与GLUT1结合，结合后，在GLUT1利用葡萄糖而被摄入细胞内时，被一同摄入血管内皮细胞内。另外，如果被血管内皮细胞摄入，则被摄入的囊泡通过血脑屏障并移动至脑实质。如果修饰囊泡的葡萄糖分子多，则到达脑实质的囊泡的比例略微降低。这一现象暗示，如果修饰囊泡的葡萄糖分子多，则囊泡通过内吞作用被细胞摄入，并直接朝向脑实质通过细胞，及，囊泡从血管内皮细胞向脑实质移动时，囊泡与血管内皮细胞的分离效率下降。换言之，通过内吞作用而被细胞摄入的囊泡的一部分没有与脑血管内皮细胞分离，而是在脑血管内皮细胞中蓄积。因此，本发明的组合物或偶联物可以用于递送至脑血管内皮细胞。另外，本发明的葡萄糖的作用在血神经屏障、血视网膜屏障及血脑脊液屏障中也相同。特别地，在血神经屏障、血视网膜屏障及血脑脊液屏障中，GLUT1也在低血糖时的血管内皮细胞中表达。因此，本发明的组合物或偶联物可以用于使药物通过血神经屏障、血视网膜屏障及血脑脊液屏障。本发明的组合物或偶联物还可以用于递送至存在于血神经屏障、血视网膜屏障及血脑脊液屏障的血管内皮细胞中。
本发明者还发现，较之使用经由葡萄糖的3号碳偶联有葡萄糖的高分子而得到的胶束，使用经由葡萄糖的6号碳偶联有葡萄糖的高分子(例如，参见图1(a))而得到的胶束向脑中的摄入效率更高。已知GLUT1与葡萄糖的结合和1号、3号及4号碳原子的取代基即OH基显著相关。经由不被用于与GLUT1的结合的6号碳原子修饰高分子而得的胶束更容易在脑中高效地蓄积，这一事实揭示了GLUT1与脑蓄积的关系。另外，经由被认为是对于与GLUT1的识别而言重要的3号碳原子修饰高分子而得的胶束也显示出向脑中的蓄积。这一事实表明，经由与和GLUT1的结合相关度低的2号碳原子修饰高分子而得的胶束引发了更多胶束向脑中的蓄积。因此，葡萄糖可以经由其1号、3号及4号碳原子中的任1个碳原子、优选经由其2号碳或6号碳原子与高分子、药物偶联。在一种实施方式中，偶联的葡萄糖的至少1号、3号及4号碳的OH基为还原末端。这样，本发明中，GLUT1配体可以以不丧失其作为配体的功能的方式修饰其他分子，本领域技术人员可以基于与GLUT1的结合形式容易地决定与药物的结合位置。本说明书中，有时将经由n号碳原子结合的葡萄糖记为“Glc(n)”{其中，n是1～4及6中的任一个整数}。例如，本说明书中，有时将经由6号碳原子结合的葡萄糖记为“Glc(6)”，将经由2号碳原子结合的葡萄糖记为“Glc(2)”，将经由3号碳原子结合的葡萄糖记为“Glc(3)”。
本发明中，也可以使用与GLUT1结合的葡萄糖的衍生物代替葡萄糖。
本发明中，作为可以用GLUT1配体修饰外表面的载体，可以举出药物递送用胶束、脂质体及PICsome等囊泡、以及树枝状大分子、纳米球及水凝胶。本发明中，使用药物递送用载体的优点在于，例如，将药物包封于载体内部，提高在靶部位的药物浓度，或者，减轻在靶部位以外的由药物导致的副作用。本发明中使用的载体不受特别限定，例如，其直径为400nm以下、200nm以下、150nm以下、100nm以下或80nm以下，例如，为20nm以上、30nm以上或40nm以上。本发明中使用的载体具有例如30nm～150nm、或、例如30nm～100nm的直径。
作为本发明中使用的胶束，可以举出药物递送用胶束。作为药物递送用胶束，已知由嵌段共聚物形成的胶束。形成胶束的嵌段共聚物不受特别限定，为PIC胶束时，可以采用荷电性聚合物嵌段(例如，聚阴离子嵌段或聚阳离子嵌段)与生物相容性嵌段(例如，聚乙二醇嵌段)的共聚物或其药学上允许的盐。另外，作为嵌段共聚物，优选使用生物降解性的嵌段共聚物，作为这样的共聚物，已知各种共聚物，原理上均可以使用。例如，作为生物相容性高、为生物降解性的嵌段共聚物，例如，可以使用聚乙二醇－聚天冬氨酸、聚乙二醇－聚谷氨酸、及聚乙二醇－聚((5－氨基戊基)－天冬氨酸)嵌段共聚物等。作为聚离子复合型胶束(PIC胶束)，已知具有聚离子复合物层的胶束，所述聚离子复合物层通过聚阴离子和聚阳离子的静电相互作用而形成。从在胶束内部使疏水性部分之间稳定化的观点考虑，可以使各荷电性嵌段在与形成外壳的PEG不同的末端与胆甾烯基等疏水性部分连接(例如，参见实施例的siRNA胶束)。用荧光色素对嵌段共聚物的标记可以通过用荧光色素修饰嵌段共聚物的与聚乙二醇侧相反的末端来进行(例如，图1(a)的化合物的NH2末端)。PIC胶束中，通过使GLUT1配体连接至PEG侧的末端，GLUT1配体露出至胶束的外表面。
作为本发明中使用的聚离子复合型聚合物囊泡，可以举出药物递送用PICsome。作为药物递送用PICsome，已知由嵌段共聚物形成的PICsome。作为形成PICsome的嵌段共聚物，可以举出PEG嵌段与聚阳离子嵌段的嵌段共聚物及均聚阴离子，或PEG嵌段与聚阴离子嵌段的嵌段共聚物及均聚阳离子。作为嵌段共聚物，优选使用为生物降解性的嵌段共聚物，作为这样的共聚物，已知各种共聚物，原理上均可以使用。例如，作为生物相容性高、为生物降解性的嵌段共聚物，例如，可以使用聚(天冬氨酸－四亚乙基五胺(Asp－TEP))嵌段共聚物、及聚乙二醇－聚((5－氨基戊基)－天冬氨酸)嵌段共聚物。PICsome中，通过使GLUT1配体连接至PEG侧的末端，GLUT1配体露出至PICsome的外表面。
根据本发明，分别提供下述式(I)～(XV)表示的化合物或其盐。盐优选为药学上允许的盐。
Glc(6)－PEG－聚天冬氨酸
{式中，n1及m1分别为5～20,000。}
Glc(6)－PEG－聚谷氨酸
{式中，n2及m2分别为5～20,000。}
Glc(6)－PEG－聚((5－氨基戊基)－天冬氨酸)
{式中，n3及m3分别为5～20,000。}
PEG－聚天冬氨酸
{式中，n4及m4分别为5～20,000。}
PEG－聚谷氨酸
{式中，n5及m5分别为5～20,000。}
PEG－聚((5－氨基戊基)－天冬氨酸)
{式中，n6及m6分别为5～20,000。}
聚天冬氨酸
{式中，m7为5～20,000。}
聚谷氨酸
{式中，m8为5～20,000。}
聚((5－氨基戊基)－天冬氨酸)
{式中，m9为5～20,000。}
Glc(3)－PEG－聚天冬氨酸
{式中，n10及m10分别为5～20,000。}
Glc(3)－PEG－聚谷氨酸
{式中，n11及m11分别为5～20,000。}
Glc(3)－PEG－聚((5－氨基戊基)－天冬氨酸)
{式中，n12及m12分别为5～20,000。}
Glc(2)－PEG－聚天冬氨酸
{式中，n13及m13分别为5～20,000。}
Glc(2)－PEG－聚谷氨酸
{式中，n14及m14分别为5～20,000。}
Glc(2)－PEG－聚((5－氨基戊基)－天冬氨酸)
{式中，n15及m15分别为5～20,000。}
上述式(I)～式(XV)的化合物或其盐可以用于形成其外表面被葡萄糖修饰的PIC胶束或PICsome。为了使上述式(I)～式(XV)的化合物的盐形成聚离子复合物，n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8、n9、n10、n11、n12、n13、n14及n15各自独立并可以为5～20,000的整数，优选为10～5,000的整数，较优选为40～500的整数，更优选为5～1,000的整数，进一步优选为10～200的整数。另外，m1、m2、m3、m4、m5、m6、m7、m8、m9、m10、m11、m12、m13、m14及m15各自独立并可以为2～20,000的整数，优选为2～5,000的整数，较优选为40～500的整数，更优选为5～1,000的整数，进一步优选为10～200的整数。盐优选为药学上允许的盐。
在一种实施方式中，PIC胶束可以通过将式(I)的化合物或者其盐、式(X)的化合物或者其盐或式(XIII)的化合物或者其盐、以及式(IV)的化合物或者其盐、以及式(VI)的化合物或者其盐。在PIC胶束的更具体的实施方式中，上述式中n1、n10、n13、n4及n6为44，m1、m10、m13、及m4为80，m6为72。盐优选为药学上允许的盐。
在一种实施方式中，PICsome可以通过将以下成分混合而得到：式(I)的化合物或者其盐、式(X)的化合物或者其盐或式(XIII)的化合物或者其盐、以及式(IV)的化合物或者其盐、以及式(IX)的化合物或者其盐。在PICsome的更具体的实施方式中，上述式中n1、n10、n13、n4及n9为44，m1、m10、m13、及m4为80，m9为72。盐优选为药学上允许的盐。
在一种实施方式中，siRNA胶束可以通过将以下成分混合而得到：偶联有胆固醇的siRNA、以及偶联有式(XVI)所示的胆固醇的Glc(6)－PEG－聚(Asp－TEP)或其盐。盐优选为药学上允许的盐。偶联有胆固醇的siRNA不受特别限定，是在RNA链的5’末端或3’末端偶联有胆固醇的siRNA，该siRNA可以由本领域技术人员以合适的方式合成，或可以通过定制合成购买获得，并在本发明中使用。siRNA不受特别限定，优选可以使胆固醇偶联至有义链的3’末端或反义链的5’末端或者3’末端。
Glc(6)－PEG－聚(Asp－TEP)－Chol
【化20】
{式中，n16及m16分别为5～20,000。}
n16为5～20,000的整数，优选为10～5,000的整数，较优选为40～500的整数，更优选为5～1,000的整数。m16为2～20,000的整数，优选为2～5,000的整数，较优选为40～500的整数，更优选为5～1,000的整数，进一步优选为10～200的整数。siRNA胶束的更具体的实施方式中，上述中n16为440，m16为60。
作为本发明中使用的脂质体，不受特别限定，可以举出由磷脂，例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)形成的脂质体。一直以来已知多种脂质体，本领域技术人员可以以合适的方式进行制备。本领域技术人员可以使药物以合适的方式包封于脂质体内。
利用GLUT1配体的囊泡的修饰不受特别限定，例如，可以在利用GLUT1配体修饰形成囊泡的高分子后形成囊泡而进行。从露出囊泡的外表面的观点考虑，高分子的修饰部位可以设为形成囊泡时位于外表面的部位。被这样的GLUT1配体修饰的高分子可以由本领域技术人员适当制备。作为一例，以下对被葡萄糖修饰的高分子(特别地，Glc(6)－PEG－聚(阴离子)嵌段共聚物或Glc(6)－PEG－聚(阳离子)嵌段共聚物)的制备方法的例子进行说明。例如，Glc(6)－PEG－聚(阴离子)嵌段共聚物或Glc(6)－PEG－聚(阳离子)嵌段共聚物可以在保护葡萄糖的6号以外的碳上的羟基的基础上，使葡萄糖与嵌段共聚物聚合而得到。
合成路径1A列举了式(I)的化合物的合成路径，其中，n1为44，m1为80。
合成路径1A
合成路径1A中，EO表示环氧乙烷；K－Naph表示萘化钾(Potassium naphthalene)；TEA表示三乙胺；MsCl表示甲磺酰氯；NH3aq.表示氨水；NCA－BLA表示L－天冬氨酸－β－苄酯－N－羧酸酐。
以下，简单地说明合成路径1A。对于葡萄糖的保护基的导入而言，例如，利用1,2－O－异亚丙基5,6－O－亚苄基－α－D－呋喃葡萄糖(以下也称为“BIG”)达成。例如，制造PIC胶束或PICsome时，使环氧乙烷聚合至BIG，合成BIG－PEG－OH。对于BIG而言，例如，可以通过用苄基保护1，2－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖(以下也称为“MIG”)的3号和5号碳的取代基即OH基而得到。具体而言，BIG可以通过使MIG与苯甲醛反应，并用乙酸乙酯提取而得到。接着，从使PEG的分子量统一为一定数值的观点考虑，优选以下操作：在聚合反应前，在反应容器内用苯使BIG－OH冷冻干燥，之后，使其减压干燥(例如，于70℃过夜减压干燥)，使BIG－OH附着于容器壁面。另外，聚合度可以通过添加的环氧乙烷的量进行适当调节。聚合后，将BIG－PEG－OH的OH基进行氨基化得到BIG－PEG－NH2，进一步地，通过使以下成分聚合至BIG－PEG－NH2的NH2基，可以得到BIG－PEG－聚(阴离子)或BIG－PEG－聚(阳离子)：聚阳离子或聚阴离子或者其被保护的前体(例如，作为聚天冬氨酸的被保护的单体的L－天冬氨酸－β－苄酯－N－羧酸酐(BLA－NCA)或者作为聚谷氨酸的被保护的单体的L－谷氨酸－γ－苄酯－N－羧酸酐(BLG－NCA))。聚合度可以通过聚阳离子或聚阴离子或者其被保护的前体的量进行适当调节。最后，将葡萄糖及阴离子或阳离子的保护基脱保护，可以得到葡萄糖－PEG－聚(阴离子)或葡萄糖－PEG－聚(阳离子)。结合有葡萄糖的共聚物可以用于PIC胶束或PICsome的制备。具体而言，如果在水溶液中以中和电荷的比率将具有聚阳离子嵌段的聚合物和具有聚阴离子嵌段的聚合物混合，则PIC胶束或PICsome自发地形成。通过上述操作，可以得到PIC胶束或PICsome，其中，聚离子复合物被生物相容性部分覆盖，所述生物相容性部分被葡萄糖修饰。
同样地，Glc(3)－PEG－聚(阴离子)及Glc(3)－PEG－聚(阴离子)可以通过用例如1,2,5,6－二－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖(DIG)代替上述中的BIG作为起始物质而合成，其他部分与上述完全相同(参见合成路径1B)。另外，同样地，Glc(2)－PEG－聚(阴离子)及Glc(2)－PEG－聚(阴离子)也可以由本领域技术人员适当合成。
合成路径1B中，列举了式(X)的化合物的合成路径，其中，n1为44，m1为80。对于合成路径1B而言，除了用DIG代替BIG作为起始物质以外，与合成路径1A相同。
合成路径1B
合成路径1B中，EO表示环氧乙烷；K－Naph表示萘化钾；TEA表示三乙胺；MsCl表示甲磺酰氯；NH3aq.表示氨水；NCA－BLA表示L－天冬氨酸－β－苄酯－N－羧酸酐。
根据本发明，提供式(I)表示的偶联物或其药学上允许的盐的制造方法，其包括以下步骤：
(i)使式(Ia)表示的的1,2－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖与苯甲醛反应，得到式(Ib)表示的1,2－O－异亚丙基5,6－O－亚苄基－α－D－呋喃葡萄糖(BIG)；
(ii)使式(Ib)表示的BIG与环氧乙烷反应，得到式(Ic)表示的BIG－聚乙二醇(BIG－PEG－OH)；
(iii)将式(Ic)表示的BIG－PEG－OH进行氨基化，得到式(Id)表示的BIG－PEG－NH2；
(iv)使L－天冬氨酸－β－苄酯－N－羧酸酐与式(Id)表示的BIG－PEG－NH2聚合，之后，将保护基脱保护。
{式中，n1及m1分别为5～20,000。}
{式中，n17与n1相同。}
根据本发明，提供式(II)表示的偶联物或其药学上允许的盐的制造方法，其包括以下步骤：
(i)使式(Ia)表示的1,2－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖与苯甲醛反应，得到式(Ib)表示的1,2－O－异亚丙基5,6－O－亚苄基－α－D－呋喃葡萄糖(BIG)；
(ii)使式(Ib)表示的BIG与环氧乙烷反应，得到式(Ic)表示的BIG－聚乙二醇(BIG－PEG－OH)；
(iii)将式(Ic)表示的BIG－PEG－OH进行氨基化，得到式(Id)表示的BIG－PEG－NH2；
(iv)使BIG－PEG－NH2与L－谷氨酸－γ－苄酯－N－羧酸酐反应，之后，将保护基脱保护。
{式中，n2及m2分别为5～20,000。}
{式中，n17与n2相同。}
根据本发明，提供式(III)表示的偶联物或其药学上允许的盐的制造方法，其包括以下步骤：
(i)使式(Ia)表示的1,2－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖与苯甲醛反应，得到式(Ib)表示的1,2－O－异亚丙基5,6－O－亚苄基－α－D－呋喃葡萄糖(BIG)；
(ii)使式(Ib)表示的BIG与环氧乙烷反应，得到式(Ic)表示的BIG－聚乙二醇(BIG－PEG－OH)；
(iii)将式(Ic)表示的BIG－PEG－OH进行氨基化，得到式(Id)表示的BIG－PEG－NH2；
(iv)使式(Id)表示的BIG－PEG－NH2与L－天冬氨酸－β－苄酯－N－羧酸酐聚合；
(v)使得到的化合物与1，5－二氨基戊烷(DAP)反应，之后，将保护基脱保护。
{式中，n3及m3分别为5～20,000。}：
{式中，n17与n3相同。}
根据本发明，提供式(X)表示的偶联物或其药学上允许的盐的制造方法，其包括以下步骤：
(i)使式(Xa)表示的1,2,5,6－二－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖(DIG)与环氧乙烷反应，合成式(Xb)表示的DIG－聚乙二醇(DIG－PEG－OH)；
(ii)将式(Xb)表示的DIG－PEG－OH的OH基取代为氨基，得到式(Xc)表示的DIG－PEG－NH2；
(iii)使L－天冬氨酸－β－苄酯－N－羧酸酐聚合到DIG－PEG－NH2的氨基，之后，将保护基脱保护。
{式中，n10及m10分别为5～20,000。}
{式中，n18与n10相同。}
根据本发明，提供式(XI)表示的偶联物或其药学上允许的盐的制造方法，其包括以下步骤：
(i)使式(Xa)表示的1,2,5,6－二－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖(DIG)与环氧乙烷反应，合成式(Xb)表示的DIG－聚乙二醇(DIG－PEG－OH)；
(ii)将式(Xb)表示的DIG－PEG－OH的OH基取代为氨基，得到式(Xc)表示的DIG－PEG－NH2；
(iii)使L－谷氨酸－γ－苄酯－N－羧酸酐与DIG－PEG－NH2的氨基反应，之后，将保护基脱保护。
{式中，n11及m11分别为5～20,000。}
{式中，n18与n11相同。}
根据本发明，提供式(XII)表示的偶联物或其药学上允许的盐的制造方法，其包括以下步骤：
(i)使式(Xa)表示的1,2,5,6－二－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖(DIG)与环氧乙烷反应，合成式(Xb)表示的DIG－聚乙二醇(DIG－PEG－OH)；
(ii)将式(Xb)表示的DIG－PEG－OH的OH基取代为氨基，得到式(Xc)表示的DIG－PEG－NH2；
(iii)使L－天冬氨酸－β－苄酯－N－羧酸酐聚合到DIG－PEG－NH2的氨基；
(iv)使得到的化合物与1，5－二氨基戊烷(DAP)反应，之后，将保护基脱保护。
{式中，n12及m12分别为5～20,000。}
{式中，n18与n10相同。}
同样地，Glc(2)－PEG－聚(阴离子)及Glc(2)－PEG－聚(阴离子)也可以由本领域技术人员适当合成。Glc(2)－PEG－聚(阴离子)及Glc(2)－PEG－聚(阴离子)不限于以下，可以将取代2号碳的OH基以外的OH基被保护的葡萄糖用作起始物质而合成，例如，将1,3,4,6－四－O－乙酰基－β－D－吡喃甘露糖用作起始化合物，利用苄基保护取代2号碳的OH基，之后，将乙酰基碱性水解为OH基，利用甲硅烷基系化保护基(例如，TBS基)进行保护后，利用钯催化剂或白金催化剂和氢气将苄基脱保护，通过光延反应使取代2号碳的OH基立体性反转，可以得到取代2号碳的OH基以外的OH基被保护的葡萄糖。并且，本领域技术人员可以容易地理解，可以将该分子用于代替BIG、DIG，此外，通过与制造Glc(3)、Glc(6)－PEG－聚(阴离子)及Glc(2)－PEG－聚(阴离子)相同的方法进行合成。
根据本发明，提供式(XVI)表示的偶联物的制造方法，其包括以下步骤：
(i)使式(Ia)表示的1,2－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖与苯甲醛反应，得到式(Ib)表示的1,2－O－异亚丙基5,6－O－亚苄基－α－D－呋喃葡萄糖(BIG)；
(ii)使式(Ib)表示的BIG与环氧乙烷反应，得到式(Ic)表示的BIG－聚乙二醇(BIG－PEG－OH)；
(iii)将式(Ic)表示的BIG－PEG－OH进行氨基化，得到式(Id)表示的BIG－PEG－NH2；
(iv)使L－天冬氨酸－β－苄酯－N－羧酸酐聚合到式(Id)表示的BIG－PEG－NH2，得到BIG－PEG－PBLA；
(v)使BIG－PEG－PBLA与4－胆甾烯基氨基－4－丁酸反应，得到式(XVIa)表示的BIG－PEG－PBLA－Chol；
(vi)使BIG－PEG－PBLA－Chol与四亚乙基五胺(TEP)反应，得到式(XVIb)表示的BIG－PEG－聚(Asp－TEP)－chol，之后，将保护基脱保护。
{式中，n16及m16分别为5～20,000。}
{式中，n17与n1相同。}
囊泡可以用上述聚合物通过公知的方法形成。一般而言，囊泡可以通过搅拌以一定浓度以上的浓度溶解有上述那样的聚合物的溶液而得到。另外，对于基于聚离子复合物而形成的囊泡的情况而言，可以将具有聚阳离子部分的高分子和具有聚阴离子部分的高分子以相同比例混合而得到。将药物包封于囊泡的方法为本领域技术人员所公知，在本发明中也可以使用公知的方法。例如，为了将药物包封于PIC胶束，在胶束形成后，在胶束溶液中添加药物即可。药物可以通过其电荷自发地包封于PIC胶束中。另外，例如，对于PICsome的情况而言，制备形成PICsome的高分子和药物的混合液，搅拌混合即可将药物包封于PICsome。对于脂质体而言，制备形成脂质体的高分子和药物的混合液，搅拌混合即可将药物包封于脂质体。也可以将聚离子复合物的阴离子性嵌段与阳离子性嵌段交联。作为用于该目的的交联剂，不受特别限定，例如，可以优选使用可以使氨基与羧基缩合的1－乙基－3－(3－二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)。
构成囊泡的高分子中的葡萄糖结合高分子的比例为10～40％时，组合物向脑实质的递送效率尤其高，形成囊泡的高分子中的葡萄糖结合高分子的比例可以设为10～40％，优选为20～30％，较优选为22～28％，更优选为24～26％(例如，约25％)。另外，构成囊泡的高分子中的葡萄糖结合分子的比例为40％以上时，组合物向脑血管内皮细胞的递送效率尤其高，形成囊泡的高分子中的葡萄糖结合高分子的比例可以设为40～100％，例如，40～60％。为了用GLUT1配体修饰囊泡的外表面，可以以囊泡为对象进行GLUT1配体修饰(例如，糖基化)，从控制囊泡表面上的GLUT1配体修饰的比例的观点考虑，优选事先使构成囊泡的高分子分别与GLUT1配体结合，调节与未被GLUT1配体修饰的高分子的配合比，继而使高分子形成囊泡。
本发明中，药物与GLUT1配体的偶联物也可以通过本发明的血糖操作向脑递送。可以经由连接体使药物与GLUT1配体偶联。连接体可以采用生物相容性的连接体，例如，可以使用聚乙二醇。药物可以与2分子以上的GLUT1配体偶联。2分子以上的GLUT1配体优选可以经由连接体与药物偶联。将2分子以上的GLUT1配体经由连接体偶联至药物时，例如，可以用在侧链上结合有多个GLUT1配体的聚氨基酸(例如，聚天冬氨酸)进行偶联。在药物和聚氨基酸之间，也可以经由PEG等连接体。作为在侧链上结合有多个GLUT1配体的聚氨基酸(例如，聚天冬氨酸)，例如，可以使用下述式(XIX)表示的化合物。
{式中，n19为5～20,000的整数，及m19为2～5,000的整数。}
n19为5～20,000的整数，优选为10～5,000的整数，较优选为40～500的整数，更优选为5～1,000的整数，进一步优选为10～200的整数。m19为2～20,000的整数，优选为2～5,000的整数，较优选为40～500的整数，更优选为5～1,000的整数，进一步优选为10～200的整数。某实施方式中，n19为273，m19为48。
PEG与结合有多个GLUT1配体的聚天冬氨酸的共聚物可以如下合成。
合成路径2
DMF表示N,N’－二甲基甲酰胺，Bn表示苄基，EDC表示1－乙基－3－(3－二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。其他简称与上述合成路径相同。
以下，简单地说明合成路径2。作为合成路径2的起始化合物，式(XIXa)表示的化合物可以如以下这样得到：
{式中，n19为5～20,000的整数。}。
使2－(2－羟基乙氧基)四氢吡喃与环氧乙烷反应，得到THP－PEG－OH。接着，用甲磺酰氯等将THP－PEG－OH的OH基进行甲磺酰化。使得到的MsO－PEG－THP与叠氮化钠反应，得到在一个末端具有叠氮基的四氢吡喃基的聚乙二醇(N3－PEG－THP)。之后，将THP保护基脱保护，得到式(XIXa)表示的一个末端带叠氮基的3－羟丙基的聚乙二醇(N3－PEG－OH)。聚合度可以通过添加的环氧乙烷的量适当调节。
像上述那样操作，得到式(XIXa)表示的化合物后，将N3－PEG－OH的OH基氨基化而得到N3－PEG－NH2，进一步地，使L－天冬氨酸－β－苄酯－N－羧酸酐(BLA－NCA)与N3－PEG－NH2的NH2基反应，得到N3－PEG－PBLA。通过碱性水解将保护基脱保护，之后，在EDC的存在下使其与保护的氨基葡萄糖即6－氨基－6－脱氧－1,2：3,5－二－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖(P－氨基葡萄糖)反应，使氨基葡萄糖的氨基与天冬氨酸残基的羧基之间缩合。之后，通过将保护基脱保护，可以得到一个末端为叠氮基的聚乙二醇－聚天冬氨酸嵌段共聚物(N3－PEG－P(Asp))。
6－氨基－6－脱氧－1,2：3,5－二－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖(P－氨基葡萄糖)可以基于例如Carbohydr.Res.19,197-210(1971)的记载制造。根据Carbohydr.Res.19,197-210(1971)，P－氨基葡萄糖可以通过以下的合成路径3得到。
合成路径3
TsCl表示甲苯磺酰氯。
以下，简单地说明合成路径3。首先，将1,2－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖(1)进行甲苯磺酰化，得到1,2－O－异亚丙基－6－O－对甲苯磺酰基－α－D－呋喃葡萄糖(2)。接着，使得到的1,2－O－异亚丙基－6－O－对甲苯磺酰基－α－D－呋喃葡萄糖(2)与2,2－二甲氧基丙烷反应，得到1,2：3,5－二－O－异亚丙基－6－O－对甲苯磺酰基－α－D－呋喃葡萄糖(3)。之后，使1,2：3,5－二－O－异亚丙基－6－O－对甲苯磺酰基－α－D－呋喃葡萄糖(3)与邻苯二甲酰亚胺钾反应，得到6－脱氧－1,2：3,5－二－O－异亚丙基－6－邻苯二甲酰亚胺－α－D－呋喃葡萄糖(4)。使6－脱氧－1,2：3,5－二－O－异亚丙基－6－邻苯二甲酰亚胺－α－D－呋喃葡萄糖(4)与肼水合物反应，可以得到6－氨基－6－脱氧－1,2：3,5－二－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖(P－氨基葡萄糖)(5)。
本发明中，提供式(XIX)表示的多葡萄糖聚合物(multiglucose polymer)的制造方法，其包括以下步骤：
(i)将式(XIXa)表示的N3－PEG－OH的OH基进行氨基化，得到式(XIXb)表示的N3－PEG－NH2；
(ii)使得到的N3－PEG－NH2与L－天冬氨酸－β－苄酯－N－羧酸酐反应，得到式(XIXc)表示的N3－PEG－PBLA；
(iii)将得到的N3－PEG－PBLA的保护基通过碱性水解脱保护；
(iv)使得到的N3－PEG－聚天冬氨酸的羧基与6－氨基－6－脱氧－1,2：3,5－二－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖的氨基缩合，之后，将OH基的保护基脱保护。
{式中，n19为5～20,000的整数，及m19为2～5,000的整数。}
{式中，Bn表示作为保护基的苄基。}
作为本发明中使用的药物，不受特别限定，可以使用生理活性物质、抗体、核酸、生物相容性荧光色素、以及超声波、MRI及CT用造影剂等造影剂。本发明中，可以将药物高选择性地递送至脑。因此，作为药物，不受特别限定，例如，可以使用提高脑的生理功能的生理活性物质、可以处置脑的疾病的生理活性物质、识别脑疾病的特征性抗原的抗体、调节脑疾病相关基因的表达的核酸、可以将脑染色的生物相容性荧光色素、以及超声波、MRI及CT用造影剂等造影剂。例如，使用了作为药物提高脑的生理功能的生理活性物质、可以处置脑的疾病的生理活性物质、识别脑疾病的特征性抗原的抗体、调节脑疾病相关基因的表达的核酸的本发明的组合物可以以药物组合物的形式提供。使用了作为药物可以将脑染色的生物相容性荧光色素、以及超声波、MRI及CT用造影剂等造影剂的本发明的组合物可以以诊断剂的形式提供。
本发明的组合物或偶联物可以直接施予对象，也可以基于本发明的施予计划施予。本发明的施予计划中，优选的是，首先，使对象禁食、或诱发对象的低血糖，之后，将该组合物施予该对象。本发明的施予计划中，更优选的是，首先，使对象禁食、或诱发对象的低血糖，之后，将该组合物施予至该对象及诱发该对象的血糖值上升。此处，本发明的施予计划中，该组合物对该对象的施予与该对象的血糖值上升的诱发同时、连续或逐次地实施。可以认为，低血糖状态的诱发对于使GLUT1在血管内皮细胞(例如，脑血管内皮细胞)的内表面表达有用。但是，根据本发明，对于本发明的组合物或偶联物而言，施予对象的血糖值上升对于这些成分向脑的递送极其有效。根据本发明，当使之禁食、或已诱发低血糖的对象的本发明的组合物(载体等)或偶联物的血中浓度为一定值以上时，通过使血糖值上升，可以将本发明的组合物(载体等)或偶联物极其有效地递送至脑内。另外，根据本实施例，在诱发对象的血糖值上升后的短时间内，本发明的组合物(载体等)或偶联物也会被递送至该对象的脑内。
从将本发明的组合物(载体等)或偶联物的血中浓度保持为一定值以上的观点考虑，优选将本发明的组合物或偶联物输液施予至对象。通过这样操作，即使是血中滞留时间短的组合物或偶联物，也容易确保一定的血中浓度。例如，如果将包封血中滞留时间短的siRNA的siRNA胶束通过输液施予至对象，则效果容易提高。输液施予可以优选实施10分钟以上、15分钟以上、30分钟以上、45分钟以上、60分钟以上、90分钟以上、或2小时以上。输液施予优选以一定的输液速度进行。例如，如果使用精密施予泵，则可以按照一定的输液速度施予。输液施予可以与对象的血糖值上升的诱发同时实施，也可以在输液施予过程中诱发对象的血糖值上升。
对于本发明的组合物或偶联物而言，如果基于本发明的施予计划施予，则向脑的递送效率会选择性提高。因此，本发明的组合物或偶联物可以用于将药物递送至脑。本发明的组合物或偶联物还可以使药物通过血脑屏障。因此，本发明的组合物或偶联物可以用于将生理活性物质、抗体、核酸、生物相容性荧光色素、以及超声波、MRI及CT用造影剂等造影剂等药物递送至以往难以递送到达的脑实质。本发明的组合物或偶联物还可以使药物在脑血管内皮细胞蓄积。因此，本发明的组合物或偶联物可以用于将生理活性物质、抗体、核酸、生物相容性荧光色素、以及超声波、MRI及CT用造影剂等造影剂等药物递送至以往难以递送到达的脑血管内皮细胞。另外，本发明的组合物或偶联物也可以用于将减弱或破坏脑血管内皮细胞间的连接的药物递送至脑血管内皮细胞。同样地，本发明的组合物或偶联物可以用于将生理活性物质、抗体、核酸、生物相容性荧光色素、以及超声波、MRI及CT用造影剂等造影剂等药物递送至视网膜、末梢神经及/或脊髓液。本发明的组合物或偶联物还可以用于将生理活性物质、抗体、核酸、生物相容性荧光色素、以及超声波、MRI及CT用造影剂等造影剂等药物递送至各自存在于血神经屏障、血视网膜屏障或血脑脊液屏障的血管内皮细胞。本发明的组合物或偶联物也可以用于将减弱或破坏各自存在于血神经屏障、血视网膜屏障或血脑脊液屏障的血管内皮细胞间的连接的药物递送至脑血管内皮细胞。通过减弱或破坏血管内皮细胞间的连接，可以减弱屏障的功能，使各种药物通过屏障。
本发明的组合物及偶联物可以通过口服施予及非口服施予(例如，静脉内施予或腹腔内施予)施予。
本发明提供一种靶向脑组织的方法，所述方法包括将外表面被GLUT1配体修饰的药物递送用载体按照施予计划施予至对象。本发明还提供一种靶向脑血管内皮细胞的方法，所述方法包括将外表面被GLUT1配体修饰的药物递送用载体按照施予计划施予至对象。本发明的施予计划优选包括将该载体施予至使之禁食、或已诱发低血糖的对象，更优选的是，本发明的施予计划包括将该组合物施予至使之禁食、或已诱发低血糖的对象及诱发该对象的血糖值上升。同样地，本发明提供一种靶向末梢神经组织、视网膜及/或脊髓液的方法，所述方法包括将外表面被GLUT1配体修饰的药物递送用载体按照施予计划施予至对象。本发明还提供一种靶向各自存在于血神经屏障、血视网膜屏障或血脑脊液屏障的血管内皮细胞的方法，所述方法包括将外表面被GLUT1配体修饰的药物递送用载体按照施予计划施予至对象。
根据本发明，可以将生理活性物质、抗体、核酸、生物相容性荧光色素、以及超声波、MRI及CT用造影剂等造影剂等药物包封于载体，由此，可以将包封于载体的药物有效地递送至脑、末梢神经组织、视网膜及/或脊髓液。
本发明提供一种靶向脑组织的方法或将药物递送至脑组织的方法，所述方法包括将药物与GLUT1配体的偶联物或药物与GLUT1配体经由连接体连接而成的偶联物按照施予计划施予至对象。本发明还提供一种靶向脑血管内皮细胞的方法，所述方法包括将药物与GLUT1配体的偶联物或药物与GLUT1配体经由连接体连接而成的偶联物按照施予计划施予至对象。本发明的施予计划优选包括将该组合物施予至使之禁食、或已诱发低血糖的对象，更优选的是，本发明的施予计划包括将该组合物施予至使之禁食、或已诱发低血糖的对象及诱发该对象的血糖值上升。同样地，本发明提供一种靶向末梢神经组织、视网膜及/或脊髓液的方法，所述方法包括将药物与GLUT1配体的偶联物或药物与GLUT1配体经由连接体连接而成的偶联物按照施予计划施予至对象。本发明还提供一种靶向各自存在于血神经屏障、血视网膜屏障或血脑脊液屏障的血管内皮细胞的方法，所述方法包括将药物与GLUT1配体的偶联物或药物与GLUT1配体经由连接体连接而成的偶联物按照施予计划施予至对象。
根据本发明，作为偶联物中含有的药物，可以使用生理活性物质、抗体、核酸、生物相容性荧光色素、以及超声波、MRI及CT用造影剂等造影剂等药物，由此，可以将药物有效地递送至脑、末梢神经组织、视网膜及/或脊髓液。
根据本发明，作为药物，可以使用脑疾病治疗药或预防药。这种情况下，本发明提供一种脑疾病的治疗或预防方法，所述方法包括将药物递送用载体按照施予计划施予至需要的对象，所述药物递送用载体的外表面被GLUT1配体修饰，且包封有脑疾病治疗药或预防药。同样地，本发明提供一种脑疾病的治疗或预防方法，所述方法包括将药物递送用载体按照施予计划施予至需要的对象，所述药物递送用载体的外表面被GLUT1配体修饰，且包封有末梢神经疾病治疗药或预防药。同样地，本发明提供一种脑疾病的治疗或预防方法，所述方法包括将药物递送用载体按照施予计划施予至需要的对象，所述药物递送用载体的外表面被GLUT1配体修饰，且包封有视网膜疾病治疗药或预防药。本发明的施予计划优选包括将该组合物施予至使之禁食、或已诱发低血糖的对象，更优选的是，本发明的施予计划包括将该组合物施予至使之禁食、或已诱发低血糖的对象及诱发该对象的血糖值上升。
根据本发明，作为药物，可以使用脑疾病治疗药或预防药。这种情况下，本发明提供一种脑疾病的治疗或预防方法，所述方法包括将脑疾病治疗药或者预防药与GLUT1配体的偶联物或脑疾病治疗药或者预防药与GLUT1配体经由连接体连接而成的偶联物按照施予计划施予至需要的对象。同样地，本发明提供一种末梢神经疾病的治疗或预防方法，所述方法包括将末梢神经疾病治疗药或者预防药与GLUT1配体的偶联物或末梢神经疾病治疗药或者预防药与GLUT1配体经由连接体连接而成的偶联物按照施予计划施予至需要的对象。同样地，本发明提供一种视网膜疾病的治疗或预防方法，所述方法包括将视网膜疾病治疗药或者预防药与GLUT1配体的偶联物或视网膜疾病治疗药或者预防药与GLUT1配体经由连接体连接而成的偶联物按照施予计划施予至需要的对象。本发明的施予计划优选包括将该组合物施予至使之禁食、或已诱发低血糖的对象，更优选的是，本发明的施予计划包括将该组合物施予至使之禁食、或已诱发低血糖的对象及诱发该对象的血糖值上升。
因此，本发明提供一种用于处置或预防脑疾病的药物组合物，所述组合物是含有脑疾病治疗药或预防药而成的。根据本发明可知，药物向脑中的摄入提高，本发明的药物组合物对于脑疾病的治疗或治疗有用。本发明还提供一种用于处置或预防末梢神经疾病的药物组合物，所述药物组合物是含有末梢神经疾病治疗药或者预防药而成的。根据本发明可知，药物向末梢神经中的摄入提高，本发明的药物组合物对于末梢神经疾病的治疗或预防有用。本发明还提供一种用于处置或预防视网膜疾病的药物组合物，所述组合物是含有视网膜疾病治疗药或者预防药而成的。根据本发明可知，药物向视网膜中的摄入提高，本发明的药物组合物对于视网膜疾病的治疗或预防有用。根据本发明，上述治疗药或预防药可以以包封于载体的形态包含在组合物中，或者，可以经由或未经由连接体而与GLUT1配体进行偶联的形态包含在组合物中。
作为脑疾病，可以举出可以通过使脑疾病治疗药通过血脑屏障来治疗的脑疾病，例如，焦虑、抑郁症、睡眠障碍、阿兹海默症、帕金森病及多发性硬化症等。因此，本发明中，为了治疗这些脑疾病，可以使用抗焦虑剂、抗抑郁药、睡眠诱导剂、阿兹海默症治疗药、帕金森病治疗药及多发性硬化症治疗药等脑疾病治疗药或预防药。作为阿兹海默症治疗药，例如，已知Aβ抗体，作为帕金森病治疗药，例如，已知多巴胺受体激动剂及左旋多巴，作为多发性硬化症治疗药，例如，已知肾上腺类固醇剂、干扰素β(IFNβ)、及免疫抑制剂，这些治疗药可以用于本发明。作为末梢神经疾病，可以举出可以通过使末梢神经疾病治疗药通过血脑屏障治疗的末梢神经疾病，例如，吉兰－巴雷综合征、菲希尔综合征及慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病。作为视网膜疾病，可以举出可以通过使视网膜疾病治疗药通过血脑屏障治疗的视网膜疾病，例如，视网膜色素变性症、脉络膜视网膜环状萎缩、无脉络膜症、结晶样视网膜病变、先天性黑朦、先天性静止性夜盲、小口病、白点状眼底、白点状视网膜炎、色素性静脉旁视网膜脉络膜萎缩、斯特格(Stargardt)病、卵黄状黄斑营养不良、青年性视网膜分离症、中心性轮状脉络膜萎缩、隐匿性黄斑营养不良、家族性渗出性玻璃体视网膜病变及眼底血管样条纹。
实施例
实施例1：Glc(6)－PIC胶束的制造
实施例1中，进行了形成胶束所需要的高分子的合成。
1－1.Glc(6)－PEG－P(Asp)的合成
首先，合成了1,2－O－异亚丙基－5,6－O－亚苄基－α－D－呋喃葡萄糖(以下也称为“BIG－OH”)。具体而言，在烧瓶中将10g 1,2－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖(以下也称为“MIG”)(和光纯药工业公司制)、40mL苯甲醛混合，一边在旋转式蒸发器中旋转一边混合4小时，使之反应。反应后，添加66mL乙酸乙酯，用120mL蒸馏水清洗，仅回收有机层(乙酸乙酯层)，于0℃添加500mL己烷进行重结晶，得到9.2g BIG－OH(收率为85％)。
接着，由得到的BIG－OH合成BIG－聚乙二醇(BIG－PEG－OH)。具体而言，为了使BIG均匀地附着于反应容器的玻璃壁面，将苯冷冻干燥后于70℃过夜减压干燥而得的0.72gBIG－OH溶解于5mL四氢呋喃(THF)。由此，得到具有分子量统一的单峰性的峰的凝胶渗透色谱图(数据未示出)。在BIG－OH溶液中滴入含有0.3M的萘化钾的THF溶液3.3mL，在氩气气氛下添加2.2mL环氧乙烷(EO)并于常温使之反应48小时。之后，在反应液中添加1mL的甲醇，用含有10％甲醇的冷却醚使之再沉淀，回收2.8g BIG－PEG－OH(收率为89％)。
进一步地，将得到的BIG－PEG－OH的OH基进行氨基化，合成具有氨基乙基的BIG－PEG－NH2。具体而言，在溶解有0.8mL的三乙胺的THF溶液20mL中溶解2.0g经过苯冷冻干燥的BIG－PEG－OH。在将570mg甲磺酰氯溶解于20mL冷THF中而得的溶液中，添加上述的BIG－PEG－OH溶液，于室温使之过夜反应。通过过滤除去沉淀的盐，用包含含有10％甲醇的乙醚的制冷剂500mL使滤液再沉淀，过滤后，减压干燥。将得到的粉末溶解于100mL25％氨水溶液，于室温使之反应2天。用透析膜(截留分子量为1,000)在稀释2000倍的氨水溶液中透析，之后，在纯水中透析。之后，用sephadex C－25(GE healthcare)除去未进行氨基化的馏分，实施冷冻干燥，回收1.6g BIG－PEG－NH2(收率为85％)。纯化后的BIG－PEG－NH2的H1NMR谱图中未观察到由杂质引起的峰(数据未示出)。
进一步地，由得到的BIG－PEG－NH2合成BIG－PEG－聚(L－天冬氨酸－β－苄酯)(以下也称为“BIG－PEG－PBLA”)。具体而言，在3.5mL DMF中溶解1.7g L－天冬氨酸－β－苄酯－N－羧酸酐(以下也称为“BLA－NCA”)，用30mL的二氯甲烷稀释。在4mL的二氯甲烷中溶解苯冷冻干燥后的BIG－PEG－NH2 200mg，在BLA－NCA溶液中添加该溶液，在氩的存在下，于35℃聚合40小时。通过IR分析确认到聚合反应结束后，在500mL己烷/乙酸乙酯＝6：4中滴入反应混合物，通过抽滤回收沉淀了的聚合物，真空干燥，得到1.39g BIG－PEG－PBLA(收率为58％)。得到的BIG－PEG－PBLA显示了具有分子量统一的单峰性的峰的凝胶渗透色谱图(数据未示出)。
进一步地，由得到的BIG－PEG－PBLA合成BIG－PEG－聚天冬氨酸(以下也称为“BIG－PEG－P(Asp.)”)。一边在0.5N氢氧化钠中悬浊500mg BIG－PEG－PBLA，一边于室温水解苄基酯。共聚物溶解后，用透析膜(截留分子量为1,000)在水中透析。将膜内的溶液冷冻干燥，得到132mg BIG－PEG－P(Asp.)(收率为68％)。
之后，由BIG－PEG－P(Asp.)合成Glc(6)－PEG－P(Asp.)。此处，Glc(6)是指葡萄糖通过其6号碳与PEG结合。在10mL三氟乙酸/纯水(8：2)中溶解100mg BIG－PEG－P(Asp.)，使之反应1小时。用透析膜(截留分子量为1,000)以0.01N NaOH、纯水的顺序进行透析。将膜内的溶液冷冻干燥，得到70mg Glc(6)－PEG－P(Asp.)(收率为70％)。
1－2.PEG－P(Asp)及PEG－P(Asp.－AP)的合成
首先，通过L－天冬氨酸－β－苄酯－N－羧酸酐(BLA－NCA)(委托中央化制品公司制造而得)的聚合得到聚乙二醇－聚(L－天冬氨酸－β－苄酯)嵌段共聚物(PEG－PBLA)。具体而言，将18.9g BLA－NCA溶解于20mL N,N’－二甲基甲酰胺(DMF)中。在20mL DMF中溶解2.0g具有甲氧基末端和氨基乙基末端的聚乙二醇(PEG－NH2)(分子量为2,000)，在BLA－NCA溶液中加入该溶液。一边使混合溶液保持为35℃，一边聚合40小时。通过红外吸收光谱(IR)分析确认到聚合反应结束之后，在2L乙醚中滴入反应混合物，通过抽滤回收沉淀了的聚合物，用乙醚清洗后真空干燥，得到15.51g PEG－PBLA(收率为79％)。
接着，由PEG－PBLA合成聚乙二醇－聚天冬氨酸嵌段共聚物(PEG－P(Asp.)。具体而言，一边在0.5N氢氧化钠中悬浊1.0g PEG－PBLA，一边于室温水解苄基酯。共聚物溶解后，用透析膜(截留分子量为6,000－8,000)在水中透析。将膜内的溶液冷冻干燥，得到654mg PEG－P(Asp.)(收率为78％)。
接着，由PEG－PBLA合成聚乙二醇－聚((5－氨基戊基)－天冬氨酸)嵌段共聚物(PEG－P(Asp.－AP))。具体而言，在10mL DMF中溶解1g经过苯冷冻干燥的PEG－PBLA。在PEG－PBLA溶液中加入8mL 1,5－二氨基戊烷(DAP)。一边将混合溶液保持为5℃，一边使之反应1小时。之后，在反应液中添加15.2mL 20重量％的乙酸水溶液，用透析膜(截留分子量为6,000－8,000)在水中透析。将膜内的溶液冷冻干燥，得到954mg PEG－P(Asp.－AP)(收率为81％)。
1－3.荧光标记化聚合物Cy5－PEG－P(Asp.)的合成
将500mg通过上述得到的PEG－PBLA溶解于20mL二甲基亚砜(DMSO)。在PEG－PBLA溶液中添加25mg磺酸基型Cy5－N－羟基琥珀酰亚胺酯(Lumiprobe公司制，制品编号：43320)，于常温使之反应2天。之后，添加75mL 0.5N氢氧化钠，于室温水解苄基酯。用透析膜(截留分子量为6,000－8,000)以乙醇、水的顺序透析。将膜内的溶液冷冻干燥，得到456mgCy5－PEG－P(Asp.)(收率为86％)。
1－4.Glc(3)－PEG－P(Asp)的合成
首先，由经过苯冷冻干燥的1,2,5,6－二－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖(DIG)得到DIG－PEG－OH。具体而言，在5mL THF中溶解0.72g DIG(TCI公司制)，得到DIG－OH溶液。之后，在得到的DIG－OH溶液中滴入3.5mL含有0.3M的萘化钾的THF溶液，在氩气气氛下添加2.5mL环氧乙烷(EO)，于常温使之反应48小时。之后，在反应液中添加1mL的甲醇，用使用制冷剂充分冷却的含有10％甲醇的醚使之再沉淀，回收3.2g DIG－PEG－OH(收率为86％)。
接着，将得到的DIG－PEG－OH进行氨基化，得到DIG－PEG－NH2。具体而言，在32mL溶解有0.8mL的三乙胺的THF溶液中溶解3.2g经过苯冷冻干燥的DIG－PEG－OH。在上述的DIG－PEG－OH溶液中添加将912mg甲磺酰氯溶解于32mL冷THF而得的溶液，于室温使之过夜反应。通过过滤除去沉淀了的盐，用500mL包含含有10％甲醇的乙醚的制冷剂使滤液再沉淀，过滤后减压干燥。在100mL 25％氨水溶液中溶解得到的粉末，于室温使之反应2天。用透析膜(截留分子量为1,000)以稀释2000倍的氨水溶液中、纯水的顺序透析。之后，用sephadex C－25(GE healthcare)除去未进行氨基化的馏分，实施冷冻干燥，回收2.95gDIG－PEG－NH2(收率为89％)。
进一步地，由得到的DIG－PEG－NH2合成DIG－PEG－PBLA。具体而言，在3.5mL DMF中溶解1.7g BLA－NCA，用30mL的二氯甲烷稀释。在4mL的二氯甲烷中溶解苯冷冻干燥后的DIG－PEG－NH2 200mg，在BLA－NCA溶液中添加所述溶液，在氩的存在下，于35℃聚合40小时。通过IR分析确认到聚合反应结束后，在500mL己烷/乙酸乙酯(己烷/乙酸乙酯＝6：4)中滴入反应混合物，通过抽滤回收沉淀了的聚合物，真空干燥，得到1.32g DIG－PEG－PBLA(收率为70％)。
进一步地，由得到的DIG－PEG－PBLA合成DIG－PEG－聚天冬氨酸(DIG－PEG－P(Asp.))。具体而言，一边在0.5N氢氧化钠中悬浊500mg DIG－PEG－PBLA，一边于室温水解苄基酯。共聚物溶解后，用透析膜(截留分子量为1,000)在水中透析。将膜内的溶液冷冻干燥，得到145mg DIG－PEG－P(Asp.)(收率为54％)。
进一步地，由得到的DIG－PEG－P(Asp.)合成Glc(3)－PEG－P(Asp.)。此处，Glc(3)是指葡萄糖通过其3号碳与PEG结合。具体而言，在10mL三氟乙酸/纯水(三氟乙酸：水＝8：2)中溶解100mg DIG－PEG－P(Asp.)，使之反应1小时。用透析膜(截留分子量为1,000)以0.01N NaOH、纯水的顺序透析。将膜内的溶液冷冻干燥，得到75mg Glc(3)－PEG－P(Asp.)(收率为86％)。
1－5.Cy5－PIC胶束的制备
在50mL10mM磷酸缓冲液(PB，pH7.4，0mM NaCl)中溶解50mg Cy5－PEG－P(Asp.)，制备1mg/mL的Cy5－PEG－P(Asp.)溶液。同样地，在50mL PB中溶解50mg PEG－P(Asp.－AP)，制备1mg/mL的PEG－P(Asp.－AP)溶液。在50mL的离心管中分别添加4mL Cy5－PEG－P(Asp.)和7.0mL PEG－P(Asp.－AP)这2种水溶液，用漩涡混合器(Votrex)搅拌2分钟(2000rpm)。之后，加入含有水溶性缩合剂即1－乙基－3－(3－二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)(10mg/mL)的PB溶液5.6mL，过夜静置并将聚离子复合物的核交联。之后，用附有截留分子量为100,000的膜的超滤管除去与胶束形成无关的聚合物及EDC的副产物等。
1－6.得到的Cy5－PIC胶束的表征
用Zetasizer(Malvern)测定得到的Cy5－PIC胶束的大小(Z平均粒径)及多分散指数(PDI)。关于大小，测定通过布朗运动移动的粒子的扩散，将其测定结果利用斯－爱氏(Stokes－Einstein)方程转换为粒径和粒度分布。此外，用透射电子显微镜(TEM，JEM－1400)评价胶束的形状。此处，所谓Z平均粒径，是指将粒子分散物等的动态光散射法的测定数据用累积量(cumulant)解析法解析而得的数据。累积量解析中，得到粒径的平均值和多分散指数(PDI)，本发明中，将该平均粒径定义为Z平均粒径。严格而言，将使多项式拟合在测定中得到的G1相关函数的对数的操作称为累积量解析，以下式：
LN(G1)＝a+bt+ct2+dt3+et4+……中的常数b被称为二次累积量或Z平均扩散系数。用分散介质的粘度和几个装置常数将Z平均扩散系数的值换算为粒径而得的值为Z平均粒径，其作为分散稳定性的指标适于品质管理目的。
1－7.Glc(6)－Cy5－PIC胶束的制备
在60mL 10mM磷酸缓冲液(PB，pH7.4，0mMNaCl)中溶解20mg Glc(6)－PEG－P(Asp.)和40mg Cy5－PEG－P(Asp.)，制备1mg/mL的Cy5－Glc(6)－PEG－P(Asp.)与PEG－P(Asp.)的混合溶液。同样地，在50mL PB中溶解50mg PEG－P(Asp.－AP)，制备1mg/mL的PEG－P(Asp.－AP)溶液。在50mL的离心管中分别添加Cy5－PEG－P(Asp.)与PEG－P(Asp.)的混合液4mL PEG－P(Asp.－AP)溶液和7.0mL这2种水溶液，利用漩涡混合器搅拌2分钟(2000rpm)。之后，添加5.6mL含有水溶性缩合剂EDC(10mg/mL)的PB溶液，过夜静置并将聚离子复合物的核交联。之后，用附有截留分子量为100,000的膜的超滤管除去与胶束形成无关的聚合物、EDC的副产物等。
1－8.Glc(6)－Cy5－PIC胶束的表征
用Zetasizer(Malvern)测定得到的Glc(6)－Cy5－PIC胶束的大小(Z平均粒径)及多分散指数(PDI)。其结果表明，得到了平均粒径为40nm、粒径均匀的胶束(图2A)。另外，对于胶束的形状而言，使用透射电子显微镜(TEM，JEM－1400)，在用乙酸双氧铀染色后进行观察(图2B)。
1－9.Glc(3)－Cy5－PIC胶束的制备
在60mL pH为7.4的10mM磷酸缓冲液(PB，0mM NaCl)中溶解20mg Glc(3)－PEG－P(Asp.)和40mg Cy5－PEG－P(Asp.)，制备1mg/mL的Cy5－Glc(3)－PEG－P(Asp.)与PEG－P(Asp.)的混合溶液。同样地，在50mL PB中溶解50mg PEG－P(Asp.－AP)，制备1mg/mL的PEG－P(Asp.－AP)溶液。在50mL的离心管中分别添加4mL Cy5－PEG－P(Asp.)、PEG－P(Asp.)的混合液和4.3mL PEG－P(Asp.－AP)溶液这2种水溶液，用漩涡混合器搅拌2分钟(2000rpm)。之后，添加5.6mL含有水溶性缩合剂即EDC(10mg/mL)的PB溶液，过夜静置并将聚离子复合物的核交联。之后，用附有截留分子量为100,000的膜的超滤管除去与胶束形成无关的聚合物、EDC的副产物等。用Zetasizer(Malvern)测定得到的Glc(6)－Cy5－PIC胶束的大小(Z平均粒径)及多分散指数(PDI)。另外，用透射电子显微镜(TEM，JEM－1400)评价胶束的形状。得到的胶束的直径为32nm(PDI＝0.043)(数据未示出)。
实施例2.PIC胶束的体内动态评价实验
将实施例1中制造的胶束静脉施予至小鼠，调查其体内动态。施予胶束时，也对血糖操作的效果进行评价。
以下的实施例中，向脑中的蓄积基于相对于总施予量而言每1g脑中蓄积的量(％)进行评价。
对24小时未喂食的禁食小鼠(Balb/c♀6周龄)与自由喂食的小鼠分别静脉施予(i.v.)200μL上述的各胶束溶液(即，Glc(6)－Cy5－PIC胶束、Glc(3)－Cy5－PIC胶束或Cy5－PIC胶束的溶液(浓度为1mg/mL))。此处记载的1mg/mL是通过用NanoDrop测定源于与各自的聚阴离子结合的Cy5的荧光的结果求得的值。需要说明的是，禁食的小鼠组在胶束溶液施予6小时后重新开始喂食。待经过规定的时间后，对小鼠实施麻醉开腹后，从腹部大动脉采集血液，继而取出脑、肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺及大腿肌肉。于4℃、15,000rpm将采集的血液离心5分钟，制备血浆，分注于96孔板(Thermo Fisher，美国)，通过使用TecanInfinite M1000PRO的荧光测定根据血浆的荧光强度定量血中的胶束浓度。此时，作为对照，使用了未施予样品的小鼠的血液。另外，假定小鼠的全血为2mL、其中血浆的量为55％，评价药物的体内动态。分别对脑、肝脏、脾脏、肾脏、心脏、肺及大腿肌肉添加溶解缓冲液和金属锥(metal cone)，粉碎并制成悬浊液，分别注入96孔板(Thermo Fisher，美国)，通过使用Tecan Infinite M1000PRO的荧光测定定量胶束向各脏器中的蓄积效率(％)。
其结果是，将外表面经由葡萄糖的6号碳而被修饰的胶束(Glc(6)－PIC胶束)在使小鼠禁食后施予至小鼠时，向脑中的蓄积量与喂食的重新开始同时显著增大，相对于1g脑而言最多蓄积了总施予胶束量的约3.8％(图3A)。此时，血中胶束浓度与喂食的重新开始同时减少(数据未示出)。在未用葡萄糖修饰其外表面的胶束中，未观察到上述向脑中的胶束的蓄积量的增大。因此，由该结果可见，对于Glc(6)－PIC胶束向脑中的蓄积而言，通过禁食使小鼠的血糖值降低、及在胶束施予前后使该小鼠的血糖值上升是重要的。但是，将胶束施予使之禁食的小鼠后，即使在喂食重新开始前，一部分胶束也被脑摄入(图3A的黑色方块)。另外，将胶束施予未使之禁食的小鼠后，一部分胶束也被脑摄入(图3A的白色方块)。另外，评价了胶束向各脏器中的累积量，其结果是，血糖操作导致向脑中的蓄积量选择性地增大(图3B)。因此，由血糖操作导致的蓄积量的增大可以理解为是脑特异性的。需要说明的是，对于肝脏、肾脏而言，无论有无血糖操作，均分别显示了约8％及4％的蓄积(数据未示出)。另外，如果将制备其外表面经由葡萄糖的6号碳而被修饰的胶束(Glc(6)－PIC胶束)时使用的阳离子性高分子全部设为Glc(6)－PEG－P(Asp.)，则可以得到葡萄糖导入率为50％的胶束，如果将一半设为Glc(6)－PEG－P(Asp.)，则可以得到葡萄糖导入率为25％的胶束。若通过上述方法施予得到的胶束，则葡萄糖导入率为25％的胶束显示了大于3％的向脑中的蓄积，相对于此，葡萄糖导入率为50％的胶束显示了约1.3％的向脑中的蓄积。
进一步地，比较了其外部表面经由葡萄糖的3号碳而被修饰的胶束(Glc(3)－PIC胶束与Glc(6)－PIC胶束)的向脑中的蓄积量。具体而言，通过上述的方法将Glc(6)－Cy5－PIC胶束和Glc(3)－Cy5－PIC胶束i.v.施予至禁食小鼠，在6小时后重新开始喂食，在施予起8小时后(喂食重新开始起2小时后)摘取脑，通过上述的方法算出各自的样品向脑中的累积量。结果，Glc(6)－PIC胶束显示了较之Glc(3)－PIC胶束更多的向脑中的蓄积(图4B)。
为了更详细地调查胶束向脑内的蓄积部位，实施了In vivo共焦显微镜观察。具体而言，首先，在2.5％异氟烷麻醉下实施24小时禁食后的小鼠(Balb/c，♀，6周龄)的开颅。接着，一边维持麻醉，一边在微静脉内设置用于样品的i.v.施予的导管，另外，在腹腔内设置用于葡萄糖溶液的腹腔内施予(i.p.)的导管，并置于共焦显微镜(Nikon A1R)的载物台。在观察开始5分后将Glc(6)－Cy5－PIC胶束(1mg/mL、200μL)通过导管i.v.施予(示意图5B的0分钟为样品施予的时机)。接着，在样品施予30分钟后将20v/v％葡萄糖溶液通过导管i.p.施予。用激发波长为638nm的激光在约3小时内实时观察脑内的样品的荧光变化(荧光波长为662～737nm)。结果，观察到原本仅在血管内观察到的荧光随着时间经过渗出至脑实质(例如，虚线部)的现象(图5A)。根据上述的观察中得到的视频，以观察经过的时间作为横轴，以与脑血管不重叠的5个区域(图5A所示脑实质的虚线部)的ROI(感兴趣区域，regionof interest)的荧光强度的平均值作为纵轴进行绘图。结果，胶束的向脑实质中的摄入追随血糖值的上升而上升(图5B)。需要说明的是，小鼠的血糖值是通过以下方法求得的：分别在即将i.p.施予葡萄糖溶液之前、施予20分钟后、30分钟后、50分钟后或90分钟后通过微静脉采集5μL血液，用实验动物用血糖值测定仪测定血糖值(图5B)。由于胶束向脑中的摄入伴随血糖值上升后的血糖值的降低而发生，可以认为，胶束的施予也可以在血糖值上升之后。
接着，确认到即使在血糖值上升之后实施胶束的施予，胶束也会移动至脑实质。具体而言，首先，在2.5％异氟烷麻醉下实施24小时禁食的小鼠(Balb/c，♀，6周龄)的开颅。接着，一边维持麻醉，一边在腹腔内设置用于葡萄糖溶液的腹腔内施予(i.p.)的导管，并设置于共焦显微镜(Nikon A1R)的载物台。通过导管i.p.施予20v/v％葡萄糖溶液，接着，在葡萄糖施予30分钟后，通过导管i.v.施予Glc(6)－Cy5－PIC胶束(1mg/mL，200μL)，或不使用导管而进行i.p.施予，开始观察(示意图11B的0分钟表示样品施予的时机)。关于荧光，用激发波长为638nm的激光在约3小时内以荧光强度为指标实时观察图11A所示的4个脑实质区域中的样品的蓄积(荧光波长为662～737nm)。结果，如图11B表示的那样，样品的i.v.施予之后立刻观察到向脑实质内的样品的摄入，随着时间经过，摄入量稳定地增大，在3小时内持续摄入。通过改变葡萄糖施予与样品施予的前后关系，样品向脑实质中的摄入量的经时模式变化。这意味着，通过改变葡萄糖施予与样品施予的前后关系，可以控制通过血脑屏障的时机。
由此可见，本发明的组合物可以利用血糖操作而通过血脑屏障，有效地到达脑实质。
实施例3.PICsome的制造与体内动态评价实验
作为直径为约100nm的中空载体，制造PICsome，通过体内动态评价验证对于脑的靶向效果。
3－1.均P(Asp.－AP)的合成
首先，通过BLA－NCA的聚合得到聚(L－天冬氨酸－β－苄酯)(PBLA均聚物)。具体而言，在33.3mL N,N’－二甲基甲酰胺(DMF)、300mL二氯甲烷中溶解20g L－天冬氨酸－β－苄酯－N－羧酸酐(BLA－NCA)。在上述BLA－NCA溶液中添加89.0μL N－丁胺。一边将混合溶液保持为35℃，一边聚合40小时。通过红外吸收光谱(IR)分析确认聚合反应结束之后，在1L己烷/乙酸乙酯溶液(己烷：乙酸乙酯＝6：4)中滴入反应混合物，通过抽滤回收沉淀了的聚合物，用乙醚清洗后真空干燥，得到14.82g(79％)PBLA均聚物。
接着，通过得到的PBLA均聚物合成聚((5－氨基戊基)－天冬氨酸)(均P(Asp.－AP))。具体而言，在10mL N－甲基－2－吡咯烷酮(NMP)中溶解1g经过苯冷冻干燥的均PBLA。在17.2mL NMP中溶解17.2mL DAP，然后添加至均PBLA溶液。一边将混合溶液保持为5℃，一边反应40分钟。之后，在反应液中添加10mL20重量％的乙酸水溶液，用透析膜(截留分子量为6,000－8,000)在水中透析。将膜内的溶液冷冻干燥，得到0.76g(82％)P(Asp.－AP)。
3－2.Glc(6)－Cy5－PICsome的制备
在10mM磷酸缓冲液(PB、pH7.4、0mMNaCl)60mL中溶解20mg实施例1中得到的Glc(6)－PEG－P(Asp.)和40mg Cy5－PEG－P(Asp.)，制备1mg/mL的Glc(6)－PEG－P(Asp.)与Cy5－PEG－P(Asp.)的混合溶液。另外，同样地，在50mL PB中溶解50mg均P(Asp.－AP)，制备1mg/mL的均P(Asp.－AP)溶液。接着，在50mL的离心管中分别混合4.0mL Glc(6)－PEG－P(Asp.)与Cy5－PEG－P(Asp.)的混合液及5.0mL均P(Asp.－AP)溶液这2种水溶液，利用漩涡混合器搅拌2分钟(2000rpm)。之后，添加5.6mL含有水溶性缩合剂即EDC(10mg/mL)的PB溶液，过夜静置并将聚离子复合物的核交联。之后，用附有截留分子量为100,000的膜的超滤管除去与PICsome形成无关的聚合物、EDC的副产物等。用Zetasizer(Malvern)测定得到的Glc(6)－Cy5－PICsome的大小(Z平均粒径)及多分散指数(PDI)。另外，对于胶束的形状而言，使用透射电子显微镜(TEM，JEM－1400)，在用乙酸双氧铀染色后观察。结果表明，得到了直径为100nm(PDI＝0.086)的PICsome(数据未示出)。
3－3.体内动态评价
除了施予得到的PICsome代替PIC胶束以外，用与实施例2完全相同的方法，将PICsome施予小鼠，观察PICsome的向脑中的蓄积。结果，观察到仅有其外表面被葡萄糖修饰的PICsome在喂食后在脑内急剧蓄积(图6)。其外表面被葡萄糖修饰的PICsome的每1g脑的蓄积量为约2％(图6)。
由此可见，囊泡即使直径为100nm也可以毫无问题地通过血脑屏障。
进一步地，用2光子显微镜(高速共焦激光显微镜用多光子激发激光NikonA1RMP－IS－S33)观察囊泡在脑(大脑皮质)深部的偏在。得到的结果如图13所示。即，较之脑表层，在脑深部观察到更强的源于PIC胶束的荧光。
观察自脑的表层起0μm、60μm、200μm、300μm、500μm或600μm的位置的切片的荧光图像。结果，在任一深度均确认到PIC胶束向脑实质的移动，特别地，在200μm～500μm，大量的荧光偏在于脑实质(图14)。
进一步地，确认到大脑皮质中的经时性荧光强度变化。如图15所示，在1日后～1周后期间，大量的荧光偏在于脑实质。
由此可见，若用葡萄糖修饰其表面而得的PIC胶束伴随本发明的血糖操作被施予至对象，则即使在脑深部(例如，60μm～600μm)也可以使胶束在脑实质蓄积。另外，所述蓄积即使在施予1星期后也持续。对于脑而言，自表层起，存在分子层、外颗粒层、外锥体细胞层、内颗粒层、内锥体细胞层及多形细胞层(例如，参见图13～图15)，在上述任一层中均实现了将载体递送至脑实质。这些层中，特别地，在外锥体细胞层及内颗粒层中的载体的递送显著有效。
实施例4：siRNA胶束的制造与体内动态评价
本实施例中，用血中滞留时间短且递送效率低的siRNA与实施例2及3同样地实施了体内动态评价。更具体而言，本实施例中，使用了由偶联有葡萄糖的PEG－聚阳离子和荧光标记siRNA形成的胶束评价siRNA向脑中的蓄积。
4－1.Glc(6)－PEG－P(Asp.－TEP)－Chol的合成
首先，由通过实施例1所述的方法得到的BIG－PEG－PBLA合成BIG－PEG－PBLA－Chol。具体而言，在10mL NMP中溶解120mg BIG－PEG－PBLA，添加相对于PBLA的末端的氨基而言为10当量的4－胆甾烯基氨基－4－丁酸及催化剂量的二甲基氨基吡啶，之后，于室温搅拌6小时。在乙醚/2－丙醇(9：1)溶液中滴入反应溶液，使目标物沉淀。过滤沉淀物使之减压干燥，得到130mg BIG－PEG－PBLA－Chol(收率为95％)。
接着，由得到的(BIG)－PEG－PBLA－Chol合成BIG－PEG－P(Asp－TEP)－Chol。具体而言，在5mL NMP中溶解100mg BIG－PEG－PBLA－Chol，在用NMP稀释的四亚乙基五胺(TEP)溶液中滴入聚合物溶液，之后，于20℃反应1小时。在冰冷却的1N盐酸中滴入反应溶液，于4℃用截留分子量为12,000－14,000的透析膜透析。作为透析外液，使用0.01N盐酸，之后，将纯水用作透析外液进行透析后，将得到的溶液冷冻干燥，回收56mg的BIG－PEG－P(Asp－TEP)－Chol(收率为73％)。
最后，由BIG－PEG－P(Asp－TEP)－Chol得到Glc(6)－PEG－P(Asp－TEP)－Chol。具体而言，在8mL三氟乙酸/纯水(8：2)溶液中溶解56mg BIG－PEG－P(Asp－TEP)－Chol，使之反应1小时。用透析膜(截留分子量为1,000)使用0.01N NaOH作为透析外液进行透析，继而在纯水中透析。将得到的溶液冷冻干燥，得到67mg的Glc(6)－PEG－P(Asp－TEP)－Chol(收率为82％)。
4－2.Glc(6)－siRNA胶束的制备
按照图7A的合成路径制备Glc(6)－siRNA胶束。具体而言，用437.5μL HEPES缓冲液稀释262.5μL溶解有Glc(6)－PEG－P(Asp.－TEP)－Chol(2mg/mL)的10mM HEPES缓冲液。用1121μL HEPES缓冲液稀释279μL Cy5－siRNA－chol(75μm)(北海道System Science公司制的随机序列(scramble)siRNA)。将得到的2种溶液混合并吹吸(pipetting)10次，得到Glc(6)－siRNA胶束。在In vivo实验即将开始之前在2.1mL的胶束溶液中添加65μL的5M NaCl溶液，通过吹吸制成等渗溶液后用于施予。用Zetasizer(Malvern)测定得到的Glc(6)－Cy5－siRNA胶束的大小(Z平均粒径)及多分散指数(PDI)。另外，对于胶束的形状而言，使用透射电子显微镜(TEM，JEM－1400)，用乙酸双氧铀染色后观察。结果表明，得到了直径为80nm(PDI＝0.104)的siRNA胶束。
4－3.体内动态评价
将得到的Glc(6)－Cy5－siRNA胶束以200μL/2小时的速度使用注射泵(Harvard公司)通过静脉施予在30分钟或2小时内进行精密持续静注，在施予开始5分钟后腹腔内施予20％葡萄糖溶液。在siRNA胶束的施予结束起1小时后摘取脑，在用多珠振荡器(Multi－beads Shocker)粉碎后，使用商用IVIS成像系统(Xenogen公司)评价各自的亮度。结果，如果静脉施予的时间变长，则脑的亮度上升，2小时的静脉施予导致的向脑中的蓄积多于30分钟的静脉施予导致的向脑中的蓄积(图7B)。另外，算出向脑中的蓄积量，结果表明，就siRNA胶束而言，在2小时的静脉施予过程中，可以将其施予量的1.3％递送至脑(每1g)。进一步地，在施予结束6小时后摘取脑，用共焦显微镜(LSM510)实施观察，测定脑实质的荧光强度。结果表明，siRNA胶束在脑细胞内蓄积(图8)。
由实施例4的结果可见，即使是血中滞留时间短、递送效率低的siRNA这样的物质，通过本发明的方法也可以极其有效地递送至脑。根据本发明的血糖操作，即使通过急速静注也可以实质上将siRNA胶束递送至脑实质，本实施例中表明，通过持续静注，可以大幅度改善siRNA胶束向脑实质中的递送量。
实施例5：葡萄糖修饰而得的嵌段共聚物的体内动态评价
本实施例中，将未形成胶束的Glc(6)－PEG－聚天冬氨酸施予小鼠并评价其体内动态。
作为Glc(6)－PEG－聚天冬氨酸，使用了实施例1中合成的Glc(6)－PEG－聚天冬氨酸。作为对照，使用了PEG－聚天冬氨酸。
对Balb/c小鼠(♀，6周龄，n＝3)分别静脉内施予200μL的3mg/mL的Glc(6)－PEG－聚天冬氨酸及对照。以一定速度实施2小时施予。在施予开始5分后腹腔内施予20％葡萄糖溶液。在Glc(6)－PEG－聚天冬氨酸及对照的施予结束1小时后分析葡萄糖修饰而得的嵌段共聚物的体内动态。
结果如图9所示。如图9所示，未偶联有葡萄糖的PEG－聚天冬氨酸未显示向脑中的蓄积，相对于此，偶联有葡萄糖的Glc(6)－PEG－聚天冬氨酸显示了每1g脑中总施予量的0.4％的脑的蓄积。这样，上述聚合物只要被1分子葡萄糖修饰，则向脑中的递送充分。而即使是被认为极其容易突破血脑屏障的盐酸多奈哌齐，相对于总施予量而言每1g脑也只蓄积0.13％(Drug Metabolism and Disposition,1999,27(12):1406-1414)。
实施例6：葡萄糖偶联物抗体的制备和体内动态评价
本实施例中，使葡萄糖偶联至抗体，评价体内动态。结果，抗体通过血糖操作也显示了向脑中的蓄积。
作为抗体，使用了市售的小鼠IgG、同型对照(Southern BiotechnologyAssociates Inc.)。如下制造了抗体与葡萄糖的偶联物。
6－1.DyLight488荧光标记葡萄糖导入聚乙二醇－聚天冬氨酸嵌段共聚物的合成
首先，合成THP－PEG－OH。具体而言，在100mL四氢呋喃(THF)中溶解0.104mL 2－(2－羟基乙氧基)四氢吡喃(THP)。在THP溶液中滴入2.8mL含有0.3M的萘化钾的THF溶液，在氩气气氛下添加8.9mL环氧乙烷(EO)，于40℃使之反应1天。之后，用乙醚使反应液再沉淀，得到8.56g一个末端为四氢吡喃基、一个末端为3－羟丙基的聚乙二醇(THP－PEG－OH)(分子量为12,000)(收率为95％)。
接着，将得到的THP－PEG－OH的OH基进行甲磺酰化。具体而言，在20mL THF中溶解19.7μL甲磺酰氯(MsCl)。另外，在10mL四氢呋喃(THF)中溶解1.4g THP－PEG－OH(分子量为12,000)，在该溶液中添加89μL三乙胺。在用水浴冷却的MsCl溶液中滴入THP－PEG－OH溶液，搅拌3小时30分钟。在200mL乙醚中滴入反应混合物，通过抽滤回收沉淀的聚合物，用乙醚清洗后真空干燥，由此，得到1.50g一个末端为3－甲磺酰基、一个末端为四氢吡喃基的聚乙二醇(MsO－PEG－THP)(收率为100％)。
接着，由得到的MsO－PEG－THP合成N3－PEG－THP。具体而言，在100mL N,N’－二甲基甲酰胺(DMF)中溶解15g MsO－PEG－THP(分子量为12,000)。一边于室温搅拌反应溶液，一般添加1.63g叠氮化钠。一边将混合溶液保持为45℃，一边搅拌71小时。使混合溶液恢复室温后，添加200mL纯水。对于混合溶液，使用分液漏斗，用二氯甲烷200mL提取6次，将得到的有机层利用旋转式蒸发器浓缩至150mL。在2L乙醇中滴入浓缩液，通过抽滤回收沉淀的聚合物后，真空干燥，得到14.3g一个末端为叠氮基、一个末端为四氢吡喃基的聚乙二醇(N3－PEG－THP)(收率为95％)。
接着，将N3－PEG－THP脱保护，得到N3－PEG－THP。具体而言，在200mL甲醇中溶解14.1g N3－PEG－THP(分子量为12，000)。于室温下在混合溶液中加入24mL 1N HCl水溶液。一边将反应温度保持为25℃，一边搅拌4小时。在2.5L乙醚中滴入反应混合物，通过抽滤回收沉淀的聚合物，用乙醚清洗后真空干燥，由此，得到13.7g一个末端为叠氮基、一个末端为3－羟丙基的聚乙二醇(N3－PEG－OH)(收率为96％)。
接着，将N3－PEG－OH进行氨基化，得到N3－PEG－NH2。具体而言，在30mL四氢呋喃(THF)中溶解1.02gN3－PEG－OH(分子量为12,000)，在该溶液中添加47.4μL三乙胺。在20mLTHF中溶解19.7μL甲磺酰氯，一边用室温水浴冷却N3－PEG－OH溶液，一边加入至N3－PEG－OH溶液中。于室温将混合溶液搅拌6小时。通过过滤除去沉淀的盐，在950mL乙醚与50mL 2－丙醇的混合溶液中滴入反应混合物，通过抽滤回收沉淀的聚合物，用乙醚清洗后真空干燥。在8mL 28％氨水溶液中溶解得到的粉末，于室温使之反应3天。用透析膜(截留分子量为6000－8000)在纯水中透析。之后，用sephadex C－25(GE healthcare)除去未氨基化的馏分，实施冷冻干燥，回收620mg一个末端为叠氮基、一个末端为3－氨基丙基的聚乙二醇(N3－PEG－NH2)(收率为61％)。
接着，由N3－PEG－NH2合成N3－PEG－PBLA。具体而言，在5.4mL的二氯甲烷中溶解苯冷冻干燥后的N3－PEG－NH2(分子量为12,000)150mg。在0.6mL DMF中溶解218mg L－天冬氨酸－β－苄酯－N－羧酸酐，在N3－PEG－NH2溶液中添加所述溶液，在氩存在下于35℃聚合2天。通过IR分析确认聚合反应结束后，在150mL乙醚中滴入反应混合物，通过抽滤回收沉淀的聚合物，真空干燥，得到250mg一个末端为叠氮基的聚乙二醇－聚(L－天冬氨酸－β－苄酯)嵌段共聚物(N3－PEG－PBLA)(分子量为12,000)(收率为91％)。
接着，由N3－PEG－PBLA得到N3－PEG－P(Asp)。具体而言，在4mL乙腈中溶解250mgN3－PEG－PBLA，在该溶液中加入5.5mL 0.5N氢氧化钠水溶液，于室温搅拌1小时。用透析膜(截留分子量为6000－8000)在水中透析反应液。将膜内的溶液冷冻干燥，得到189mg一个末端为叠氮基的聚乙二醇－聚天冬氨酸嵌段共聚物(N3－PEG－P(Asp))(分子量为12,000)(收率为89％)。
接着，合成了6－氨基－6－脱氧－1,2：3,5－二－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖(P－氨基葡萄糖)。P－氨基葡萄糖基于Carbohydr.Res.19,197-210(1971)的记载合成。
合成了导入了保护葡萄糖的聚乙二醇－聚天冬氨酸嵌段共聚物。具体而言，在4mLN,N’－二甲基甲酰胺(DMF)中溶解137mg6－氨基－6－脱氧－1,2：3,5－二－O－异亚丙基－α－D－呋喃葡萄糖(P－氨基葡萄糖)。在4mL DMF及1mL水的混合溶剂中溶解40mg一个末端为叠氮基的聚乙二醇－聚天冬氨酸嵌段共聚物(N3－PEG－P(Asp))(分子量为12,000)，在上述P－氨基葡萄糖溶液中加入该溶液。之后，进一步添加203mg 1－乙基－3－(3－二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。于室温下将得到的混合溶液搅拌13小时。之后，用透析膜(截留分子量为6，000－8，000)在DMSO中透析混合溶液，继而在水中透析。将膜内的溶液冷冻干燥，得到49mg导入了保护葡萄糖的聚乙二醇－聚天冬氨酸嵌段共聚物(收率为96％)。
接着，将葡萄糖的保护基脱保护，得到葡萄糖导入聚乙二醇－聚天冬氨酸嵌段共聚物。具体而言，对于49mg保护葡萄糖导入聚乙二醇－聚天冬氨酸嵌段共聚物，添加将18mL三氟乙酸及2mL水混合而得的溶液，于室温搅拌20分钟。之后，使用透析膜(截留分子量为6,000－8,000)，一边保持为4℃一边在水中透析。将膜内的溶液冷冻干燥，得到40mg葡萄糖导入聚乙二醇－聚天冬氨酸嵌段共聚物(收率为87％)。
进一步地，用荧光色素DyLight488标记了得到的共聚物。具体而言，在10mL二甲基亚砜(DMSO)中溶解40mg葡萄糖导入聚乙二醇－聚天冬氨酸嵌段共聚物。另外，在5mL DMSO中溶解DyLight488N－琥珀酰亚胺酯，在葡萄糖导入聚乙二醇－聚天冬氨酸嵌段共聚物溶液中加入所述溶液。于室温下将混合溶液搅拌48小时。接着，用透析膜(截留分子量为6,000－8,000)在水中透析混合溶液。将膜内的溶液冷冻干燥，得到黄色的固体。利用PD－10柱(GE Healthcare社)纯化得到的固体。用透析膜(截留分子量为6,000－8,000)在水中透析溶出液。将膜内的溶液冷冻干燥，得到33mg DyLight488荧光标记的葡萄糖导入聚乙二醇－聚天冬氨酸嵌段共聚物。
6－2.葡萄糖导入抗体的制备
接着，使得到的DyLight488荧光标记葡萄糖导入聚乙二醇－聚天冬氨酸嵌段共聚物与抗体偶联，得到葡萄糖导入抗体。具体如下。
首先，用Cy5标记IgG抗体。具体而言，将市售的小鼠IgG、同型对照(SouthernBiotechnology Associates Inc.)(5mg/mL)溶液5mL注入VIVASPIN(截留分子量为10,000)的上部部件。此处，在添加0.1M磷酸缓冲液(pH8.4)后，重复于4℃、2000rpm离心操作，将溶剂置换为0.1M磷酸缓冲液(pH8.4)，之后，浓缩直到溶液量变为2.5mL。接着，在Cy5N－琥珀酰亚胺酯(Cy5－NHS酯)(1mg蛋白质标记用)(GE Healthcare公司)中添加300μL N,N－二甲基甲酰胺，实施吹吸，在IgG溶液中添加所述溶液中的250μL。之后，于室温将混合溶液平稳震荡4小时。并且，用VIVASPIN(截留分子量为10,000)反复于4℃、2000rpm进行超滤，在实施IgG溶液的精制的同时，将溶剂置换为D－PBS(－)，得到被Cy5标记的IgG(Cy5－IgG)(0.9mg/mL)溶液5mL。
接着，为了得到抗体与6－1中得到的共聚物的偶联物，将二苄基环辛炔(DBCO)导入抗体。具体而言，将2mL Cy5－IgG 0.9mg/mL溶液注入VIVASPIN(截留分子量为10,000)的上部部件。在上部部件中添加0.1M磷酸缓冲液(pH8.4)后，反复于4℃、2000rpm重复进行超滤，将溶剂置换为0.1M磷酸缓冲液(pH8.4)，之后，浓缩直到溶液量变为2mL。接着，在IgG溶液中加入二苄基环辛炔－N－琥珀酰亚胺酯(DBCO－NHS酯)的0.41mg/mL DMF溶液200μL。将混合溶液于室温下平稳震荡4小时。反应结束后，将反应液注入VIVASPIN(截留分子量为10,000)的上部部件，在添加D－PBS(－)后，反复于4℃、2000rpm进行超滤，在进行IgG溶液的精制的同时，将溶剂置换为D－PBS(－)，得到4mL的导入了DBCO的Cy5标记－IgG(Cy5标记DBCO－IgG)溶液。
进一步地，通过使DBCO与6－1中得到的共聚物的叠氮基反应，得到抗体与共聚物的偶联物。具体而言，首先，在800μL D－PBS(－)中溶解3.5mg葡萄糖导入DyLight488荧光标记聚乙二醇－聚天冬氨酸嵌段共聚物。在2mL Cy5标记DBCO－IgG溶液中加入得到的溶液。于－30℃将混合溶液静置36小时，之后，于4℃静置4小时，使之缓慢融解。将得到的反应液注入VIVASPIN(截留分子量为50,000)的上部部件。在上部部件中添加D－PBS(－)，反复于4℃、2000rpm进行超滤，实施IgG溶液的精制，得到相对于1分子抗体而言平均结合2分子DyLight488荧光标记聚乙二醇－聚天冬氨酸嵌段共聚物而得的Cy5标记IgG(Glc－polymerconjugated IgG)溶液(0.11mg/mL)3mL。
6－3.抗体的体内动态评价
对8只6周龄的Balb/C♀小鼠停止喂食24小时。将8只小鼠分为A组、B组及对照组(分别为3只、3只及2只)。对于A组的小鼠、B组的小鼠分别静脉内注射200μL各为750nM的Glc－polymer conjugated IgG和Cy5－IgG，在5分钟后腹腔内施予200μL20％葡萄糖溶液。需要说明的是，各抗体的源于Cy5的荧光强度相同。在对A组及B组的小鼠各3只施予抗体后57分钟后施加乙醚麻醉，在3分钟后实施采血和脏器摘取(脑、肝脏、肾脏、肺、心脏、脾脏及大腿肌肉)。对于对照组的2只也另行实施采血和脏器摘取。将通过采血得到的血液分别于4℃、15,000rpm离心，回收上清。将8只小鼠的摘取的脏器首先测定总重量之后，分别切去一半脑、约200mg肝脏，另外，取得一侧的肾脏，实施重量的测定，在多珠振荡器用的管中加入脏器和金属锥。另外，分别在除了对照组中的1只以外的7只脑及肝脏的样品中加入600μL 1×Passive Lysis Buffer，在脾脏、心脏及大腿肌肉的样品中加入300μL，在肾脏及肺的样品中加入400μL。另一方面，对于对照组中剩下的1只小鼠(100％对照)的脏器的样品，计算假定静脉内注射的样品全部累积于对应脏器时的样品量，在脏器的样品中加入对应量的Cy5－IgG溶液，并进一步添加1×Passive Lysis Buffer，使添加的溶液量的合计与其他7只小鼠相同。利用多珠振荡器将全部脏器样品以2000rpm操作30秒，反复5次，将脏器均化。从脏器的管中除去锥后，在多孔板的各孔中加入100μL各样品，用多孔板检测仪(Multiplate Reader)以激发波长643nm、荧光波长667nm实施荧光强度的测定。将对照组中未加入Cy5－IgG溶液的样品作为空白，将加入溶液的样品作为100％，计算各脏器的抗体的累积率，除了血液以外，算出将得到的累积率除以脏器的重量(g)而得的值。
结果，偶联有葡萄糖的抗体突破血脑屏障，到达了脑实质。抗体向脑实质中的到达量为对照(Cy5－IgG)的2倍(图10)。
根据上述实施例1～6，将用葡萄糖修饰外表面而得的PIC胶束(实施例2)、PICsome(实施例3)、siRNA胶束(实施例4)、葡萄糖偶联物高分子(实施例5)及葡萄糖偶联物抗体(实施例6)伴随血糖操作施予小鼠后，通过血脑屏障，在脑中显著蓄积。血脑屏障的物质透过性是限定性的，许多药物无法通过血脑屏障，无法呈现其本来的效果。根据本发明，用葡萄糖修饰药物、或用葡萄糖修饰包封药物的囊泡，并伴随血糖操作施予后，即使是胶束、PICsome这样的巨大的囊泡也可以通过血脑屏障。该成果提供了将以往不能通过血脑屏障的分子递送至脑的划时代性手法，可以适用于各种现存或今后研发的脑疾病药及脑图像诊断剂，开拓了脑疾病治疗或脑图像诊断的新途径。
实施例7.向血管内皮细胞的递送
根据上述实施例2，葡萄糖导入率为25％的胶束显示了大于3％的向脑中的蓄积，相对于此，葡萄糖导入率为50％的胶束显示了约1.3％的向脑中的蓄积。可以认为，这一现象意味着葡萄糖的导入率增加导致了被脑血管内皮细胞摄入的胶束和脑血管内皮细胞的分离降低。于是，本实施例中，确认了葡萄糖导入率与胶束向脑血管内皮细胞中的蓄积的关系。
首先，如实施例1－7及实施例2所述，调节Glc(6)－PEG－P(Asp.)与PEG－P(Asp.)的混合量，制备葡萄糖导入率为10％的胶束、葡萄糖导入率为25％的胶束或葡萄糖导入率为50％的胶束。
在将得到的胶束分别i.v.施予小鼠2日后，通过通常方法制作脑的组织切片(厚度：14μm)，通过免疫荧光染色将脑血管内皮细胞染色，观察胶束的荧光的偏在。对于脑血管内皮细胞而言，将抗PECAM－1抗体(Santa Cruz公司制，制品编号：SC18916，Ratmonoclonal)用作一级抗体，将Alexa488偶联－山羊抗大鼠IgG(H+L)抗体(Invitrogen公司制，制品编号：A11006)用作二次抗体进行检测。另外，利用Cy5的荧光检测胶束。
结果，如图12A所示，在施予了葡萄糖导入率为50％的胶束的小鼠的脑中，特别频繁地观察到脑血管内皮细胞与胶束的共偏在(图12A内的箭头)。另外，如图12B所示，葡萄糖导入率为10％、25％及50％的胶束也均观察到了脑血管内皮细胞的与胶束的共偏在，但葡萄糖导入率为50％时，胶束在脑血管内皮细胞中的偏在频率显著增加。
实施例1～6显示，可以将表面覆盖有葡萄糖的胶束等囊泡、偶联有葡萄糖的抗体等化合物通过脑血管内皮细胞极其高效地递送至脑实质内，另一方面，也暗示了在脑血管内皮细胞内蓄积一部分囊泡、化合物的可能性。特别地，对于表面覆盖有葡萄糖的胶束而言，葡萄糖的导入率越高，从脑血管内皮细胞脱离而进入脑实质的胶束的量越低，由此表明，胶束也可以在脑血管内皮细胞中部分蓄积。实施例7进一步确认了这一事实，结果表明，胶束确实也在脑血管内皮细胞中蓄积。另外，在葡萄糖导入率为50％时，也显示出胶束在脑血管内皮细胞中显著蓄积。

Claims (23)

1.一种组合物，其是含有药物递送用载体、用于按照施予计划施予至对象的组合物，
所述施予计划包括：将所述组合物施予至已使其禁食或已诱发低血糖的对象，并且，诱发所述对象的血糖值上升，
所述载体的外表面经GLUT1配体修饰。
2.一种组合物，其是含有药物与GLUT1配体的偶联物、用于按照施予计划施予至对象的组合物，
所述施予计划包括：将所述组合物施予至已使其禁食、或已诱发低血糖的对象，并且，诱发所述对象的血糖值上升。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其是用于将药物递送至脑的组合物。
4.如权利要求1或2所述的组合物，其是用于使药物通过血脑屏障的组合物。
5.如权利要求1或2所述的组合物，其是用于使药物通过血神经屏障、血视网膜屏障或血脑脊液屏障的组合物。
6.如权利要求1或2所述的组合物，其是用于将药物递送至脑血管内皮细胞的组合物。
7.如权利要求1～6中任一项所述的组合物，血糖值上升是通过施予葡萄糖而被诱发的。
8.如权利要求7所述的组合物，其中，组合物的施予与葡萄糖的施予同时进行，或者在施予葡萄糖之前施予组合物。
9.如权利要求1～8中任一项所述的组合物，组合物被输液施予至静脉内，输液施予持续10分钟以上。
10.如权利要求1及3～9中任一项所述的组合物，其中，载体为囊泡，形成囊泡的高分子中的10～40摩尔％被GLUT1配体修饰。
11.如权利要求1及3～9中任一项所述的组合物，其中，载体为囊泡，形成囊泡的高分子中的40～100摩尔％被GLUT1配体修饰。
12.如权利要求1及3～11中任一项所述的组合物，其中，载体中包封待递送的药物。
13.如权利要求1及3～12中任一项所述的组合物，其中，载体为囊泡，囊泡为直径400nm以下的囊泡。
14.如权利要求2～9中任一项所述的组合物，其中，偶联物是药物与GLUT1配体经由连接体连接而成的。
15.如权利要求1～14中任一项所述的组合物，其中，GLUT1配体为葡萄糖。
16.如权利要求1～15中任一项所述的组合物，其中，药物为选自生理活性物质、抗体、核酸、生物相容性荧光色素、及造影剂中的至少1种药物。
17.一种偶联物，其是1分子GLUT1配体与1分子高分子的偶联物，偶联物能够以使得GLUT1配体露出囊泡表面的方式形成囊泡。
18.如权利要求17所述的偶联物，其中，GLUT1配体为葡萄糖。
19.如权利要求18所述的偶联物，其中，葡萄糖经由其6号碳原子与高分子偶联。
20.如权利要求19所述的偶联物或其药学上允许的盐，所述偶联物由下述式(I)、下述式(II)、下述式(III)或者下述式(XVI)表示：
式(I)中，n1及m1分别为5～20,000，
式(II)中，n2及m2分别为5～20,000，
式(III)中，n3及m3分别为5～20,000，
式(XVI)中，n16为5～20,000的整数，m16为2～5,000的整数。
21.一种囊泡，其是含有权利要求17～20中任一项所述的偶联物的药物递送用囊泡，
所述偶联物占形成囊泡的全部高分子中的10～40摩尔％。
22.一种囊泡，其是含有权利要求17～20中任一项所述的偶联物的药物递送用囊泡，
所述偶联物占形成囊泡的全部高分子中的40～100摩尔％。
23.GLUT1配体用于制造权利要求1～16中任一项所述的组合物、或权利要求21或者权利要求22所述的囊泡的用途。
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