WO2020218481A1 - 抗体の抗原結合性断片を脳へ送達するための方法および組成物 - Google Patents

抗体の抗原結合性断片を脳へ送達するための方法および組成物 Download PDF

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antigen
fab
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brain
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片岡　一則
泰孝 安楽
ジンビン シェ
乃理子 中村
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公益財団法人川崎市産業振興財団
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Definitions

  • the present invention relates to a method and composition for delivering an antigen-binding fragment of an antibody to the brain.
  • Antibodies have the potential as therapeutic agents for treating neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and dementia with Lewy bodies (see Documents 1 to 10).
  • BBB blood-brain barrier
  • Attempts have been made to pass the BBB using an antibody having bispecificity, but its application is limited by the complexity of the antibody design strategy and the low efficiency of brain accumulation (References 12 and 13).
  • the amino groups of amino acids in the polymer can be modified with succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP) to crosslink the polymers, thereby retaining the micelles in the blood.
  • SPDP succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate
  • the present invention provides methods and compositions for delivering antigen-binding fragments of antibodies to the brain.
  • the present inventors formed micelles from glucose-coated polycations and antigen-binding fragments of negatively charged antibodies, and the micelles were stable in solution even in the presence of serum. It was revealed that it exists in.
  • the present inventors formed micelles from glucose-coated polycations and antigen-binding fragments of a negatively charged antibody, raised the blood glucose level of fasted mice, and administered the micelles. We have found that the micelles can cross the blood-brain barrier (BBB) and deliver antigen-binding fragments of antibodies to the parenchyma of the brain.
  • BBB blood-brain barrier
  • the present invention provides the following industrially applicable inventions.
  • L 1 and L 2 are independently selected from the group consisting of alkylene, alkenylene, or alkynylene which may be substituted ⁇ , and the antigen binding property of the antibody according to (2) above. fragment.
  • the antigen-binding fragment of the antibody according to any one of (1) to (3') above which binds to an antigen in the brain.
  • the micelle according to (7) above which contains a block copolymer of polyethylene glycol and a polycation, and at least a part of the block copolymer is linked to a GLUT1 ligand at the end on the polyethylene glycol side.
  • Micelle (9) A composition for use in delivering an antigen-binding fragment of an antibody to the parenchyma of the brain, which comprises the micelles according to (7) or (8) above.
  • the pharmaceutical composition comprising the micelle according to (8) above, which comprises an antigen-binding fragment of an antibody having a negative charge and neutralizing the aggregate formation of A ⁇ .
  • FIG. 1A shows an example of a glucose-modified block copolymer that can be used in the present invention.
  • FIG. 1B shows an example of a block copolymer that can be used in the present invention.
  • FIG. 1C shows the conversion of Fab'to Fab'-cit by citraconic anhydride and the conversion of Fab'-cit to Fab' under low pH conditions (eg, in cell endosomes).
  • Fab'-cit means Fab'bonded to citraconic anhydride.
  • FIG. 2 shows the results of a characteristic analysis of micelles (Gluc (Fab'-cit) / m) of Fab'-cit and FIG. 1A (and FIG. 1B).
  • (A) shows the particle size distribution of micelles measured by a dynamic light scattering method (DLS), and (b) shows a transmission electron microscope image showing a morphology of Gluc (Fab'-cit) / m.
  • (C) is the result of an in vitro experiment showing the degree of Fab'release from Gluc (Fab'-cit) / m under various pH and reduction conditions.
  • (D) is a diagram showing Fab'-cit uptake by Caco-2 cells after incubation with Gluc (Fab'-cit) / m containing Alexa647-labeled Fab'-cit for 3 hours or 6 hours by fluorescence intensity. Is.
  • FIG. 3 shows the pharmacokinetic profile of Gluc (Fab'-cit) / m.
  • A shows the time course of the relative intensity of the fluorescence signal of Gluc (Fab'-cit) / m containing Alexa647-labeled Fab'-cit and the free form of Fab'-cit in the tail vein-administered mouse.
  • FIG. 1 shows the accumulation ratio of Fab'in the tissue in the mouse to which Gluc (Fab'-cit) / m containing Fab'-cit was administered to the mouse to which the free form of Fab'-cit was administered.
  • D shows the accumulation of Fab'in each organ of the mouse 90 minutes after administration.
  • a sample micelle or free form Fab' was administered 30 minutes after intraperitoneal administration of 200 ⁇ L of a 20 wt% glucose solution to a mouse fasted for 24 hours.
  • -Cit was administered intravenously.
  • FIG. 4 shows how Gluc (Fab'-cit) / m passes through the blood-brain barrier (BBB) and diffuses into the brain parenchyma.
  • A shows a time-series image of mouse brain tissue observed using IVRT-CLSM. Gluc (Fab'-cit) / m was intravenously administered to the mice fasted for 24 hours 30 minutes after the intraperitoneal administration of 200 ⁇ L of 20 wt% glucose solution. The scale bar indicates 200 ⁇ m.
  • (B) shows the time course of the average value of the fluorescence intensity of Gluc (Fab'-cit) / m in the desired region (ROI) of the brain parenchyma selected in the above (a). In (b), the time when micelles are administered is set to 0.
  • FIG. 1 shows the results of immunohistochemical analysis of the brain after Gluc (Fab'-cit) / m administration
  • (c) are cerebrovascular endothelial cells
  • (d) are astrocytes
  • (f) is the result of staining nerve cells with anti-PECAM1 antibody, anti-GFAP antibody, anti-IbaI antibody, and anti-Tuji1 antibody, respectively.
  • the nuclei were stained with DAPI.
  • the scale bar in the inset view is 10 ⁇ m and the scale bar in the outer view is 20 ⁇ m.
  • FIG. 5 shows the results of an in vitro inhibition experiment of A ⁇ aggregate formation using the Fab of the anti-A ⁇ antibody 3D6, and the result of an A ⁇ plaque suppression experiment in Alzheimer's disease model mice.
  • A is when incubated with ThT fluorescence intensity (10 ⁇ M) at various molar ratios of 1:50, 1:10, 1: 2, and 0: 1 (3D6 Fab / A ⁇ 1-42 ratio). The result of analyzing the agglomerate formation efficiency of A ⁇ 1-42 is shown.
  • (B) and (c) are insoluble A ⁇ 1-42 (insoluble A ⁇ 1-42) in the brains of mice to which Gluc (Fab-cit) / m containing 1.8 mg / kg 3D6 Fab-cit was administered weekly from 6 to 16 weeks of age.
  • (D) is a scheme showing the passage of Gluc (Fab'-cit) / m through BBB and the suppression of A ⁇ plaque by the anti-A ⁇ antibody Fab.
  • Figure 6 shows the 1 H-NMR spectrum of the block copolymer of polyethylene glycol and polylysine in D 2 O (PEG-PLys) .
  • Figure 7 shows a 1 H-NMR spectrum of PEG-P (Lys-PDP) in a D 2 O.
  • Figure 8 shows the 1 H-NMR spectrum of the DIG-PEG-PLys in a D 2 O.
  • Figure 9 shows a 1 H-NMR spectrum of Gluc- PEG-PLys in a D 2 O.
  • Figure 10 shows the 1 H-NMR spectrum of Gluc-PEG-P (Lys- PDP) in a D 2 O.
  • FIG. 11 shows the results of DLS measurement and TEM of 0% Gluc (Fab'-cit) / m, 50% Gluc (Fab'-cit) / m, and 100% Gluc (Fab'-cit) / m, respectively, from the top. Show the image. The scale bar is 200 ⁇ m.
  • FIG. 12 shows the molecular weight distribution of 25% Gluc (Fab'-cit) / m measured using an analytical ultracentrifugation system.
  • FIG. 13 shows a 0.01 M PBS buffer solution containing or not containing 10% fetal bovine serum (FBS) with a diffusion time of various Gluc (Fab'-cit) / m and a diffusion time of free form Fab'-cit.
  • FBS fetal bovine serum
  • FIG. 14 shows changes in blood glucose levels before and after intraperitoneal administration of 200 ⁇ L of 20 wt% D- (+)-glucose solution in mice fasted for 24 hours.
  • micelle means a vesicle formed by a single-layer molecular membrane.
  • examples of micelles include micelles formed by amphipathic molecules such as surfactants and micelles formed by polyion complexes (PIC micelles). It is known that the outer surface of micelles is preferably modified with polyethylene glycol from the viewpoint of blood retention time.
  • liposome means a vesicle formed by a two-layer molecular membrane.
  • the molecular membrane is usually a phospholipid double membrane.
  • the "polyion complex type polymersome” (hereinafter, also referred to as "PICsome”) means hollow fine particles formed by the polyion complex. From the viewpoint of blood retention time, it is known that the outer surface of PICsome is preferably modified with polyethylene glycol.
  • the "polyion complex” (hereinafter, also referred to as "PIC”) means that a copolymer of PEG and an anionic block and a copolymer of PEG and a cationic block are charged in an aqueous solution. It is an ionic layer formed between the cationic block and the anionic block of both block copolymers when mixed so as to neutralize.
  • PEG polyion complex
  • the significance of binding PEG to the above-mentioned charged chain is to prevent the polyion complex from aggregating and precipitating, thereby forming a monodisperse core-shell structure with a particle size of several tens of nm. It is to form the nanoparticles to have.
  • PEG covers the outer shell (shell) of the nanoparticles, it is known to be highly biocompatible and convenient in improving the retention time in blood. It has also been shown that in polyion complex formation, one charged block copolymer does not require a PEG moiety and may be replaced with homopolymers, detergents, nucleic acids and / or enzymes. Then, in the formation of the polyion complex, at least one of the anionic polymer and the cationic polymer may form a copolymer with PEG, and both of them may form a copolymer with PEG. It is also well known that increasing the PEG content facilitates the formation of PIC micelles, and decreasing the PEG content facilitates the formation of PICsome.
  • polyion complex polymersomes which are hollow particles having an average particle size of about 80 nm to 1,000 nm (particularly about 100 nm to 1,000 nm), are formed. It is known to be easy to do. Since PIC / some is a hollow particle having a film structure formed by PIC and an internal cavity, an aqueous solution (for example, an aqueous solution containing a substance such as a physiologically active substance or a contrast medium) is contained in the internal cavity. Can be done.
  • for drug delivery means that it is biocompatible and that the drug can be encapsulated in vesicles.
  • the term “for drug delivery” may mean an application utilizing the action of prolonging the blood retention time of a drug as compared with the blood retention time of a naked drug.
  • the drug can be dissolved or suspended in an aqueous solution introduced into an internal cavity.
  • inducing hypoglycemia or lowering the blood glucose level means lowering the blood glucose level in the subject than the blood glucose level that would have been shown if the treatment was not performed.
  • the method for inducing hypoglycemia include administration of a diabetic drug.
  • inducing hypoglycemia it is permissible to take, for example, other drugs or drink beverages such as water, as long as the purpose of inducing hypoglycemia is achieved.
  • Inducing hypoglycemia may be accompanied by other treatments that have no substantial effect on blood glucose.
  • fasting means fasting to a subject, for example, 3 hours or more, 4 hours or more, 5 hours or more, 6 hours or more, 7 hours or more, 8 hours or more, 9 hours or more, 10 hours or more. 11 hours or more, 12 hours or more, 13 hours or more, 14 hours or more, 15 hours or more, 16 hours or more, 17 hours or more, 18 hours or more, 19 hours or more, 20 hours or more, 21 hours or more, 22 hours or more, 23 hours 24 hours or more, 25 hours or more, 26 hours or more, 27 hours or more, 28 hours or more, 29 hours or more, 30 hours or more, 31 hours or more, 32 hours or more, 33 hours or more, 34 hours or more, 35 hours or more, 36 hours or more, 37 hours or more, 38 hours or more, 39 hours or more, 40 hours or more, 41 hours or more, 42 hours or more, 43 hours or more, 44 hours or more, 45 hours or more, 46 hours or more, 47 hours or more or 48 hours It means to fast as above.
  • the subject causes hypoglycemia by fasting.
  • the fasting period is determined by a doctor or the like in consideration of the health condition of the subject, and is preferably a period longer than the time when the subject reaches fasting blood glucose, for example.
  • the fasting period may be, for example, longer than the expression of GLUT1 on the inner surface of blood vessels of cerebrovascular endothelial cells increases or reaches a plateau.
  • the fasting period can be, for example, the above period of 12 hours or more, 24 hours or more, or 36 hours or more.
  • Fasting may also be accompanied by other treatments that do not substantially affect blood glucose levels or expression of GLUT1 on the inner surface of blood vessels.
  • blood glucose levels can be elevated by a variety of methods well known to those skilled in the art, for example, administration of one that induces elevated blood glucose levels, eg, induction of elevated blood glucose levels such as glucose, fructose (fructose), galactose, etc. It can be increased by administration of monosaccharides, administration of polysaccharides such as maltose that induce an increase in blood glucose level, intake of carbohydrates that induce an increase in blood glucose level such as starch, or diet.
  • blood glucose manipulation means to induce hypoglycemia in a subject and then raise the blood glucose level. After inducing hypoglycemia in the subject, the subject's blood glucose level can be maintained at hypoglycemia.
  • the time to maintain the target blood glucose level at hypoglycemia is, for example, 0 hours or more, 1 hour or more, 2 hours or more, 3 hours or more, 4 hours or more, 5 hours or more, 6 hours or more, 7 hours or more, 8 hours or more.
  • the blood sugar level can be raised.
  • "maintaining blood glucose” is permitted, for example, to take other agents or drink beverages such as water, as long as the subject achieves the purpose of maintaining hypoglycemia. Inducing hypoglycemia may be accompanied by other treatments that have no substantial effect on blood glucose.
  • the "target” is a mammal including a human.
  • the subject may be a healthy subject or a subject suffering from some disease.
  • Diseases here include neurological disorders such as psychotic disorders, depression, mood disorders, anxiety, sleep disorders, dementia and substance-related disorders.
  • dementia includes, but is not particularly limited, Alzheimer's disease and Creutzfeldt-Jakob disease.
  • treatment is used to include both therapeutic and prophylactic treatment.
  • the "blood-brain barrier” refers to a functional barrier that exists between the blood (or blood circulation) and the brain and has selectivity for the permeation of substances.
  • the actual state of the blood-brain barrier is thought to be cerebral vascular endothelial cells and the like.
  • There are many unclear points about the substance permeability of the blood-brain barrier but it is known that glucose, alcohol and oxygen easily cross the blood-brain barrier, and fat-soluble substances and small molecules (for example, molecular weight less than 500) are used. It is believed that it tends to pass more easily than water-soluble molecules and macromolecules (eg, molecular weights of 500 or more).
  • blood nerve barrier refers to a functional barrier that exists between blood circulation and peripheral nerves and has selectivity for substance permeation.
  • blood cerebrospinal fluid barrier refers to a functional barrier that exists between blood circulation and cerebrospinal fluid and has selectivity for substance permeation.
  • blood-retinal barrier refers to a functional barrier that exists between blood circulation and retinal tissue and is selective for the permeation of substances.
  • the entities of the blood-brain barrier, blood-cerebrospinal fluid barrier, and blood-retinal barrier are considered to be vascular endothelial cells existing in each barrier, and their functions are considered to be similar to those of the blood-brain barrier.
  • GLUT1 ligand means a substance that specifically binds to GLUT1.
  • Various ligands are known as GLUT1 ligands, and examples thereof include, but are not limited to, molecules such as glucose and hexose, all of which are used in the present invention for the preparation of carriers or conjugates instead of glucose. be able to.
  • the GLUT1 ligand preferably has an affinity for GLUT1 equal to or better than glucose.
  • antibody means immunoglobulin and has a structure in which two heavy chains (H chains) stabilized by a pair of disulfide bonds and two light chains (L chains) are associated with each other.
  • the heavy chain consists of a heavy chain variable region VH, a heavy chain constant region CH1, CH2, CH3, and a hinge region located between CH1 and CH2, and the light chain includes a light chain variable region VL and a light chain constant region CL. Consists of. Among them, the variable region fragment (Fv) composed of VH and VL is a region that is directly involved in antigen binding and imparts diversity to the antibody.
  • the antigen-binding region consisting of VL, CL, VH, and CH1 is referred to as a Fab region, and the region consisting of a hinge region, CH2, and CH3 is referred to as an Fc region.
  • the regions that come into direct contact with the antigen have a particularly large change and are called complementarity-determining regions (CDRs).
  • CDRs complementarity-determining regions
  • the part other than the CDR with relatively few mutations is called a framework (FR).
  • FR framework
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • the antibody may be of any isotype of IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. It may be produced by immunizing non-human animals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, and chickens, or it may be a recombinant antibody, and it may be a chimeric antibody, a humanized antibody, or a fully humanized antibody. And so on.
  • a chimeric antibody is an antibody in which fragments of antibodies derived from different species are linked.
  • Humanized antibody is an amino acid sequence characteristic of a non-human antibody, and means an antibody in which the corresponding position of the human antibody is substituted.
  • a heavy chain of an antibody prepared by immunizing a mouse or rat examples include those having CDRs 1-3 and light chains CDR1-3, all of which are derived from human antibodies, including four framework regions (FRs) for each of the heavy and light chains.
  • Such antibodies are sometimes referred to as CDR-transplanted antibodies.
  • the term “humanized antibody” may also include human chimeric antibodies.
  • a "human chimeric antibody” is a non-human antibody in which the constant region of a non-human-derived antibody is replaced with a constant region of a human antibody.
  • the term "antigen-binding fragment of an antibody” refers to a fragment of an antibody that maintains its binding property to an antigen. Specifically, it consists of a Fab consisting of VL, VH, CL and CH1 regions and a Fab'having a hinge region; F (ab') 2 in which two Fabs are linked by a disulfide bond in the hinge region; VL and VH. Fv; In addition to scFv, which is a single-chain antibody in which VL and VH are linked with an artificial polypeptide linker, bispecific antibodies such as diabody type, scDb type, tandem scFv type, and leucine zipper type are mentioned. Not limited to.
  • the term "antigen-binding fragment of an antibody having a negative charge” refers to a fragment in which the fragment is negatively charged by modification and the molecule as a whole has a negative charge in a physiological environment.
  • Carboxyl groups granted additional antigen binding fragment of an antibody having a negative charge, during physiological environment and micelles containing, ionized, -COO - may have.
  • antigen refers to a substance to which an antibody can bind.
  • the antigen can be immunogenic.
  • Antigens can be proteins, nucleic acids, metabolites and the like.
  • alkyl means a linear (ie, non-branched) or branched carbon chain, or a combination thereof.
  • the alkyl is not particularly limited, but includes, for example, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, t-butyl, isobutyl, n-pentyl, n-hexyl, n-heptyl, and n-octyl, and these. Examples include isomers.
  • the alkyl can be C 1 alkyl, C 2 alkyl, C 3 alkyl, C 4 alkyl, C 5 alkyl, C 6 alkyl, C 7 alkyl, or C 8 alkyl. When referring collectively these are sometimes referred C 1 -C 8 alkyl.
  • alkenyl refers to a group having a double bond between two adjacent carbons of an alkyl.
  • alkynyl refers to a group having a triple bond on two adjacent carbon rings of an alkyl.
  • an antigen-binding fragment of an antibody having a negative charge is provided. Negatively charged antibody antigen-binding fragments can achieve polycation and micelle formation if they have a negative charge in a physiological environment.
  • the antigen-binding fragment of a negatively charged antibody may have a negatively charged substituent containing one or more carboxyl groups, or the substituent may be introduced thereby having a negative charge. Then, in order to form a polyion complex micelle with a polycation, the antigen-binding fragment of the antibody need only have a negative charge, and it is considered that the content of the negative charge does not matter.
  • micelles containing an antigen-binding fragment of a negatively charged antibody and a block copolymer of PEG and a polycation were stable in blood.
  • the particle size is about 100 nm
  • the polyion complex micelle is formed by using an antigen-binding fragment of an antibody and a polycation.
  • the particle size was about 40 nm.
  • micelles having a particle size of about 40 nm easily break through the blood-brain barrier as described in, for example, WO2015507942A, they can reach the brain parenchyma even when injected intravenously.
  • micelles having a particle size of about 40 nm can reach cancerous tissues due to the enhanced permeability and retention effect (Enhanced permeability and retention effect; EPR effect). Therefore, micelles containing an antigen-binding fragment of a negatively charged antibody and a block copolymer of PEG and a polycation are expected to be stable in blood and highly permeable to tissues. ..
  • the substituent having a negative charge containing one or more carboxyl groups is a substituent containing one or more carboxyl groups, and the substituent as a whole has a negative charge.
  • the substituent is not excluded from having a positively charged functional group, but preferably does not have a positively charged functional group.
  • ) -CH C (R 2 ) -COOH ⁇
  • R 2 is an optionally substituted alkyl, alkenyl, or alkynyl, and at least one of the carbon atoms of R 2 is substituted with a carboxyl group.
  • An antigen-binding fragment of the antibody can be obtained.
  • R 1 and R 2 can be independently C 1-6 alkyl, C 1-6 alkenyl, C 1-6 alkynyl, or carboxy C 1-3 alkyl, respectively.
  • L 1 and L 2 are alkylene, alkenylene, or alkynylene which may be substituted independently, respectively.
  • An antigen-binding fragment of an antibody having a substituent represented by COOH for example, a ⁇ -carboxy-dithiodialkylcarbonyl group
  • COOH for example, a ⁇ -carboxy-dithiodialkylcarbonyl group
  • amino acids, lysine and arginine have an amino group in the side chain. Therefore, the amino acid side chain amino group of the antigen-binding fragment of an antibody can be the transamination of lysine and / or arginine.
  • micelles (particularly polyion complex micelles) containing an antigen-binding fragment of a negatively charged antibody and a block copolymer of PEG and a polycation are provided.
  • micelles (particularly polyion complex micelles) containing a negatively charged antibody or antigen-binding fragment thereof and a block copolymer of GLUT1 ligand-modified PEG and polycation are stable in blood. Yes, and could be used favorably for delivery of antibodies or antigen-binding fragments thereof to the brain. Therefore, according to the present invention, a micelle containing a negatively charged antibody or an antigen-binding fragment thereof and a block copolymer of GLUT1 ligand-modified PEG and a polycation is provided.
  • the carrier whose outer surface is modified with a GLUT1 ligand eg, glucose
  • a GLUT1 ligand eg, glucose
  • the dosing regimen according to the invention does not have to induce fasting or hypoglycemia and / or an increase in blood glucose levels.
  • Carriers whose outer surface is modified with glucose so that glucose is exposed to the surface specifically vesicles such as micelles or polyion complex polymersomes (PICsomes), are administered according to a dosing regimen and these carriers are prominent. It is delivered across the blood-brain barrier into the brain (brain parenchyma) (see WO2015507542A).
  • the dosing regimen according to the invention preferably comprises fasting or administering the composition to a subject who has induced hypoglycemia, but more preferably the dosing regimen according to the invention is fasting. , Or to administer the composition to a subject who has induced hypoglycemia and to induce an increase in blood glucose level in the subject.
  • the composition can be administered to the subject continuously or sequentially at the same time as inducing an increase in blood glucose level in the subject.
  • the dosing regimen may or may not have an interval between administration of the composition to the subject and induction of elevated blood glucose levels in the subject.
  • the composition may be administered to the subject in a mixed form with an agent that induces an increase in blood glucose level. , It may be administered in a form different from the drug that induces an increase in blood glucose level in the subject.
  • the composition when the composition is administered to the subject continuously or sequentially, the composition is prior to the induction of the increase in blood glucose level in the subject. May be administered to the subject or later, but preferably the composition can be administered to the subject prior to inducing an increase in blood glucose level in the subject.
  • inducing an increase in blood glucose level in the subject prior to administration of the composition to the subject within 1 hour, within 45 minutes, within 30 minutes after inducing the increase in blood glucose level in the subject.
  • compositions it is preferred to administer the composition to the subject within, within 15 minutes or within 10 minutes.
  • administration of the composition to the subject when inducing an increase in blood glucose level in the subject after administration of the composition to the subject, within 6 hours, within 4 hours, or 2 hours after the administration of the composition to the subject. Within 1 hour, within 45 minutes, within 30 minutes, within 15 minutes or within 10 minutes, it is preferable to induce an increase in blood glucose level in the subject.
  • the administration planning cycle described above may be performed more than once.
  • the context of glucose administration and sample administration can be determined by the timing of crossing the blood-brain barrier.
  • administration of glucose can be converted into dietary intake.
  • Examples of the polyion complex type polymersome used in the present invention include PICsome for drug delivery.
  • a PICsome for drug delivery a PICsome formed by a block copolymer is known.
  • the block copolymer forming PICsome include a block copolymer and a homopolyanion of a PEG block and a polycation block, or a block copolymer and a homopolycation of a PEG block and a polycation block.
  • As the block copolymer it is preferable to use a block copolymer that is biodegradable, and various copolymers are known as such a copolymer, and it is possible in principle to use any of them. ..
  • block copolymers having high biocompatibility and biodegradability include, for example, polylysine block copolymers, polyornithine block copolymers, and poly (aspartate-diethylenetriamine (Asp-DET) block copolymers.
  • Poly (asparaginate-triethylenetetraamine (Asp-TET)) block copolymer, poly (asparaginate-tetraethylenepentamine (Asp-TEP)) block copolymer, and polyethylene glycol-poly ((5). -Aminopentyl) -aspartic acid) block copolymers can be used ⁇ where block copolymers can be block copolymers with PEG ⁇ .
  • block copolymers amino acid side chains
  • the amino group of is 3- (2-pyridyldithio) propionate (PDP) -modified.
  • PDP (2-pyridyldithio) propionate
  • block copolymers can be crosslinked by reduction treatment or the like, and the blood of micelles can be cross-linked. Stability can be improved.
  • stabilized micelles migrate from the blood to other tissues having a reducing environment, they become unstable or disintegrate in the other tissues and contain the antibodies.
  • the antigen-binding fragment can be released.
  • PICsome by linking the GLUT1 ligand to the terminal on the PEG side, the GLUT1 ligand is exposed on the outer surface of the PICsome.
  • the GLUT1 ligand can be glucose.
  • the GLUT1 ligand is glucose, which can be linked to PEG via carbon atoms at the 2-, 3- or 6-positions, such as those skilled in the art to retain affinity for GLUT1.
  • the surface of a PIC micelle or PICsome can be modified with a GLUT1 ligand.
  • the surface of a PICsome and a PIC micelle does not necessarily have to be modified with a GLUT1 ligand when used for purposes that do not require targeting GLUT1.
  • the block copolymer of the following formula (III) can be used as the cationic polymer.
  • m is an integer of 5 to 20,000, preferably an integer of 10 to 5,000, more preferably an integer of 40 to 500, and even more preferably an integer of 5 to 1,000
  • x + y is an integer of 2 to 20,000, preferably an integer of 2 to 5,000, more preferably an integer of 40 to 500, even more preferably an integer of 5 to 1,000, and even more preferably an integer of 10 to 200.
  • a block copolymer of the following formula (IV) can be used as the cationic polymer.
  • m is an integer of 5 to 20,000, preferably an integer of 10 to 5,000, more preferably an integer of 40 to 500, and even more preferably an integer of 5 to 1,000;
  • x + y is an integer of 2 to 20,000, preferably an integer of 2 to 5,000, more preferably an integer of 40 to 500, even more preferably an integer of 5 to 1,000, and even more preferably an integer of 10 to 200.
  • the block copolymers of formulas (III) and (IV) have PDPs in the side chains of lysine residues and are capable of cleaving disulfide bonds in PDPs in a reducing environment, after which micelles By forming, crosslinks can be formed between block copolymers in micelles.
  • the cross-linking can contribute to the stabilization of micelles in the blood, but can be re-cleaved in a reducing environment.
  • micelles made by the block copolymers of formulas (III) and (IV) can destabilize or disintegrate in tissues with a reducing environment and contain antigen-binding fragments of the antibody. Can be released.
  • antigen-binding fragments of antibodies can be delivered to the brain (eg, brain parenchyma or vascular endothelial cells of the brain).
  • the antigen-binding fragment of an antibody can be an antigen-binding fragment of an antibody that binds to an intracellular antigen or an antigen-binding fragment of an antibody that binds to an extracellular antigen.
  • the antigen can be an intracellular antigen.
  • the antigen-binding fragment of an antibody can bind to an antigen that can be expressed in brain cells.
  • the antigen that can be expressed in the brain cell examples include an antigen that can be expressed in cells other than the brain cell and an antigen that can be specifically expressed in the brain cell.
  • the antigen-binding fragment of an antibody can bind to an antigen expressed on a cell selected from the group consisting of vascular endothelial cells, brain nerve cells, astrocytes, pericytes, and microglia.
  • the antigen-binding fragment of an antibody can bind to an antigen present in the parenchyma of the brain.
  • the antigen-binding fragment of an antibody can specifically bind to an antigen present in the parenchyma of the brain.
  • the antigen-binding fragment of the antibody can bind to amyloid ⁇ (A ⁇ ).
  • the antigen-binding fragment of an antibody can be an antigen-binding fragment of a 3D6 antibody that binds to A ⁇ (eg, A ⁇ 1-42).
  • the antigen-binding fragment of the antibody can bind to A ⁇ and inhibit (or neutralize) the formation of aggregates of A ⁇ .
  • the antigen-binding fragment of the antibody can bind to A ⁇ and can inhibit the formation of A ⁇ aggregates, thereby suppressing the formation of A ⁇ aggregates and / or the coagulation of A ⁇ . It can be used to treat diseases associated with aggregation (eg, Alzheimer's disease).
  • the antigen-binding fragment of the antibody is leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2), receptor interaction serine threonine kinase 1 (RIPK1), RIPK3, isulonic acid 2-sulfatase, ⁇ -sinucrane, TNF receptor-related death. It binds to an antigen selected from the group consisting of domain (TRADD), Fas-related protein (FADD) having a death domain, evoked receptor 2 (TREM2) expressed on bone marrow cells, and ⁇ -secretase (BACE1) / Tau. obtain.
  • TRADD domain
  • FADD Fas-related protein
  • TNF receptor-related death domain a death domain
  • TNF receptor-related death TNF receptor-related death
  • BACE1 ⁇ -secretase
  • An antigen-binding fragment of an antibody that binds to LRRK2 can suppress Tau phosphorylation.
  • An antigen-binding fragment of an antibody that binds to LRRK2 can inhibit the binding of LRRK2 to Tau.
  • Antigen-binding fragments of antibodies that bind RIPK1 can be used in the treatment of Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and / or multiple sclerosis (MS).
  • the antigen-binding fragment of an antibody can inhibit the binding of RICK1 to TRADD, the binding of RICK1 to FADD, the binding of RICK1 to RIDK3, and / or the binding of TRADD to FADD ⁇ antigen-binding fragment of antibody. Can bind to either antigen ⁇ .
  • Antigen-binding fragments of antibodies that bind ⁇ -synuclein can be used to treat synucleinopathy such as Parkinson's disease, dementia with Lewy bodies, and multiple system atrophy. Antigen-binding fragments of antibodies that bind ⁇ -secretase can inhibit the activity of ⁇ -secretase that cleaves amyloid ⁇ precursor protein (APP) by ⁇ -secretase. An antigen-binding fragment of an antibody that binds ⁇ -secretase can inhibit the binding of ⁇ -secretase to APP. An antigen-binding fragment of an antibody that binds Tau can bind to the non-phosphorylated and / or phosphorylated forms of Tau. An antigen-binding fragment of an antibody that binds Tau may have a stronger affinity for the phosphorylated form of Tau than for the non-phosphorylated form.
  • APP amyloid ⁇ precursor protein
  • the antigen-binding fragment of an antibody binds to an intracellular antigen. In some aspects of the invention, it can be an antibody having an antigen-neutralizing activity. In some aspects of the invention, the antigen-binding fragment of an antibody can be an antigen-binding fragment of an antibody that has the activity of neutralizing the binding of two interacting substances.
  • the antigen-binding fragment of an antibody can be used for detecting an antigen in the brain. Therefore, the antigen-binding fragment of an antibody can bind to an antigen in the brain.
  • the antigen-binding fragment of the antibody may be labeled (eg, near-infrared fluorescent label, fluorescent label, chemiluminescent label, radioisotope label, etc.).
  • an antigen-binding fragment of an unlabeled antibody is used for detection of an antigen in the brain, for example, a section of the brain is prepared and then the unlabeled antibody is prepared, as is performed in immunohistochemical analysis. An antigen-binding fragment can be detected with a labeled secondary antibody capable of binding to the fragment.
  • an acidic substituent for example, a substituent having a carboxyl group, for example, one or more carboxyl groups
  • Negatively charged substituents, including can be attached.
  • the "acidic substituent” includes an acidic group, for example, a carboxyl group in a body fluid (for example, human body fluid, for example, human blood).
  • an antigen-binding fragment of an antibody and an acid anhydride for example, in order to bind to an acid (for example, a substituent having a carboxyl group) and obtain an antigen-binding fragment of an antibody having a negative charge, for example.
  • a compound of formula (Ia) such as citraconic acid anhydride, aconitic acid anhydride
  • a dicarboxylic acid eg, dithiodicarboxylic acid
  • the acid anhydride is mixed with the antigen-binding fragment of the antibody to react with the amino group of the peptide side chain of the antigen-binding fragment of the antibody to obtain the antigen-binding fragment of the antibody bound to the acid anhydride.
  • the antigen-binding fragment of an antibody bound to an acid anhydride can be dissociated from the acid anhydride under low pH (eg, the endosome environment of a cell) and converted into an antigen-binding fragment of the original antibody.
  • the acid anhydride can react with the side chain having the amino group of the amino acid residue of the antibody.
  • the oxygen atom of the furan ring of the acid anhydride reacts with the amino group, the furan ring is opened, and the amino group of the antibody is expressed by the following formula. It is converted into a side chain having a negative charge as in (V).
  • V a side chain having a negative charge purified by the reaction of the compound of the formula (Ia) with the amino group of the antibody is shown.
  • micelles containing an antigen-binding fragment of an antibody having a negative charge and a block copolymer of polyethylene glycol and a polycation are provided.
  • the antigen-binding property of an antibody that binds to an acidic substituent for example, a substituent having a carboxyl group, for example, a negatively charged substituent containing one or more carboxyl groups
  • an acidic substituent for example, a substituent having a carboxyl group, for example, a negatively charged substituent containing one or more carboxyl groups
  • a pharmaceutical composition containing micelles (or PIC micelles) according to the present invention is provided.
  • the micelles (or PIC micelles) according to the invention are surface coated with a GLUT1 ligand (eg, glucose).
  • the pharmaceutical composition according to the invention can be a pharmaceutical composition for use in delivering to the brain.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject after the blood glucose level is manipulated and the blood glucose level rises, and after the blood glucose level rises or before the blood glucose level rises.
  • a method of delivering an antigen-binding fragment of an antibody to a target brain, which has a negative charge an antigen-binding fragment of the antibody (eg, having an acidic substituent (eg, a carboxyl group)).
  • an antigen-binding fragment of an antibody that binds to a substituent for example, a negatively charged substituent containing one or more carboxyl groups and has a negative charge
  • a block copolymer of polyethylene glycol and a polycation e.g, a block copolymer of polyethylene glycol and a polycation.
  • a micelle which comprises and at least a portion of the block copolymer is linked to a GLUT1 ligand, eg, glucose, at the end on the polyethylene glycol side.
  • a GLUT1 ligand eg, glucose
  • compositions or pharmaceutical compositions for use in delivering antigen-binding fragments of antibodies to the brain binds to citraconic acid anhydride.
  • Negatively charged it binds to an antigen-binding fragment of an antibody (eg, an acidic substituent (eg, a carboxyl group-bearing substituent, eg, a negatively charged substituent containing one or more carboxyl groups) and is negative.
  • an acidic substituent eg, a carboxyl group-bearing substituent, eg, a negatively charged substituent containing one or more carboxyl groups
  • the use of micelles linked to is provided.
  • compositions or pharmaceutical compositions for use in delivering an antigen-binding fragment of an antibody to the brain (brain parenchyma or cerebrovascular endothelial cell), the antibody having a negative charge.
  • Antigen binding of an antibody having a negative charge by binding to an antigen-binding fragment for example, an acidic substituent (for example, a substituent having a carboxyl group, for example, a negatively charged substituent containing one or more carboxyl groups)).
  • an antigen-binding fragment for example, an acidic substituent (for example, a substituent having a carboxyl group, for example, a negatively charged substituent containing one or more carboxyl groups)).
  • Compositions or pharmaceutical compositions are provided.
  • micellar for use in delivering an antigen-binding fragment of an antibody to the brain (brain parenchyma or cerebrovascular endothelial cell), wherein the micellar is a negatively charged antibody antigen.
  • Antigen-binding property of a negatively charged antibody that binds to a binding fragment for example, an acidic substituent (for example, a substituent having a carboxyl group, for example, a negatively charged substituent containing one or more carboxyl groups)).
  • Fragments and block copolymers of polyethylene glycol and polycations are provided, and micelles are provided in which at least a portion of the block copolymer is linked to a GLUT1 ligand, eg, glucose, at the end on the polyethylene glycol side.
  • a GLUT1 ligand eg, glucose
  • compositions or pharmaceutical composition of the present invention may be provided in a form suitable for in vivo administration (particularly intravenous administration, ventricular administration, etc.).
  • the compositions or pharmaceutical compositions of the present invention are (i) negatively charged, antigen-binding fragments of an antibody (eg, an acidic substituent (eg, a substituent having a carboxyl group, eg, one or more carboxyl groups).
  • the moiety may include micelles linked to glucose at the end on the polyethylene glycol side and (ii) excipient. Excipients include stabilizers, pH regulators, isotonic agents, and pharmaceutically acceptable salts.
  • Fab or Fab' can be preferably used as the antigen-binding fragment of the antibody.
  • citraconic acid can be preferably used from the viewpoint of dissociating the acid anhydride in the cell and recovering the antigen-binding fragment of the antibody.
  • Fab or Fab' is preferably used as the antigen-binding fragment of the antibody, and citraconic acid is used as the acid anhydride, which can be preferably used for modifying the fragment in the present invention.
  • R 2 is methyl ⁇ , which can be an antigen-binding fragment of an antibody in which the amino group of the amino acid side chain is substituted.
  • substituting the amino group of the amino acid side chain of the fragment include mono (N-succinimidyl) 3,3'-dithiodipropionic acid, which can be preferably used for repairing the fragment in the present invention.
  • Each of 2 is a 1,2-ethylene group ⁇ , which can be preferably used for modifying the fragment in the present invention.
  • the present invention provides micelles containing the antigen-binding fragment of the negatively charged antibody described above and a polycation. Negatively charged antibody antigen-binding fragments and polycations can form micelles under physiological conditions.
  • the present invention also provides polyion complex micelles (ie, PIC micelles) containing an antigen-binding fragment of a negatively charged antibody and a polycation.
  • PIC micelles polyion complex micelles
  • a pharmaceutical composition comprising a polyion complex micelle containing an antigen-binding fragment of a negatively charged antibody and a polycation.
  • the present invention provides for the use of an antigen-binding fragment of a negatively charged antibody in the manufacture of a medicament comprising a polyion complex micelle containing a negatively charged antibody antigen-binding fragment and a polycation.
  • the antigen-binding fragment of the antibody having a negative charge is as exemplified above.
  • the polycations are as exemplified above.
  • the present invention provides a method comprising mixing an antigen-binding fragment of a negatively charged antibody with a polycation.
  • polyion complex micelles are spontaneously produced.
  • the method can be a method of producing polyion complex micelles, or a method of producing a pharmaceutical composition containing polyion complex micelles.
  • the polycation of the present invention can be, for example, a block copolymer with a hydrophilic block.
  • the polycation of the present invention is a block copolymer with a hydrophilic block, and the hydrophilic block can be modified with a GLUT1 ligand (eg, glucose) at its terminal.
  • GLUT1 ligand eg, glucose
  • Such polyion complex micelles of GLUT1 modified polycations and antigen-binding fragments of negatively charged antibodies can be delivered to the brain, for example, by intravenous administration.
  • the subject Upon delivery to the brain, the subject can be kept hypoglycemic and then the polyion complex micelles can be administered before, during, or after elevated blood glucose. By doing so, as described above, polyion complex micelles can be effectively taken up by brain parenchyma or vascular endothelial cells (see, eg, WO2015 / 075942).
  • Ethylene oxide (EO) was obtained from Nippon Ekitan Corporation (Tokyo, Japan) and purified by a conventional method using CaH 2 .
  • the solvents used for the polymerization tetrahydrofuran (THF), CH 2 Cl 2 , and N, N-dimethylformamide (DMF)) were described in Nikko Hansen & Co. , Ltd.
  • the anti-Tuji1 antibody (MMS-435P) was purchased from Covance (Princeton, NJ).
  • the anti-Iba1 antibody (019-19741) was purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the anti-GFAP antibody (ab16997) and anti-GLUT1 antibody (ab40084) were purchased from Abcam (Cambridge, UK).
  • Anti-Rab11a antibody (# 2413S) was purchased from Cell Signaling Technology (Davers, MA).
  • Alexa Fluor 488-labeled goat anti-rabbit IgG antibody (A11034), goat anti-rat IgG (H + L) antibody (A11006), Alexa Fluor 488-labeled goat anti-rabbit IgG antibody F (ab') 2 fragment, DAPI-containing ProLong TM Gold
  • the anti-fading agent was purchased from Invitrogen Molecular Probes (Eugene, OR).
  • Dithiothreitol (DTT) is available from Thermo Fisher Scientific Inc. I bought from.
  • Dimethyl sulfoxide (DMSO) is available from Nacalai Tesque, Inc. Purchased from (Kyoto, Japan).
  • mice Female, 5 weeks old were used in Charles River Laboratories Japan, Inc. Purchased from (Yokohama, Japan).
  • Alzheimer's disease model mice (APP / PS1) were purchased from Jackson Laboratory. All animal experiments were carried out according to the guidelines for the management and use of laboratory animals at the Center for Nanomedical Innovation (Kawasaki, Japan).
  • Polymer PEG-PLys which is a block copolymer of PEG and polylysine, consists of PEG having a molecular weight (Mw) of 5 k and polylysine having a degree of polymerization (DP) of 70, and was synthesized by a conventional method (for example, literature). 1). Polymerized hemorrhoids (DP) were determined using a JEOL AL 300 spectrometer (JEOL Ltd., Tokyo, Japan). DIG-PEG-OH was synthesized in the same manner as WO2015507542A. Sublimation was carried out in a reaction tube during promotion at 70 ° C., and DIG (260 mg, 1.0 mmol) was dissolved in THF.
  • Mw molecular weight
  • DP degree of polymerization
  • the degree of polymerization of PLys in DIG-PEG-PLys was determined to be 66 by NMR measurement. Then, DIG-PEG-PLys was deprotected as described in WO2015507542A to obtain PEG-PLys (Gluc-PEG-PLys) in which glucose was added to the PEG terminal. A thiol group was introduced into a portion of the side chains of Gluc-PEG-Plys and PEG-PLys using succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate (SPDP).
  • SPDP succinimidyl 3- (2-pyridyldithio) propionate
  • PEG-PLys 51 mg, 1.90 ⁇ mol was diluted to 2 mL N-methylpyrrolidone (NMP) containing 5 wt% LiCl, and SPDP (30 mg, 96 ⁇ mol) was diluted to 6 mL containing 5 wt% LiCl. Diluted to NMP. 2.5 mL of SPDP solution was added to the PEG-PLys solution, 10% volume of N, N-diisopropylethylamine was added and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. The mixture was then precipitated in more than 20-fold volume of diethyl ether. The precipitate was washed twice with diethyl ether to give a white powder.
  • NMP N-methylpyrrolidone
  • SPDP 30 mg, 96 ⁇ mol was diluted to 6 mL containing 5 wt% LiCl. Diluted to NMP. 2.5 mL of SPDP solution was added to the PEG-PLys solution, 10% volume of N,
  • the obtained modified product was purified by ultrafiltration using 10 mM PB buffer (pH 7.4).
  • the degree of modified amine was determined by the lerolecamine method to be 65%.
  • a modified version of the Fab'fragment (6 ⁇ L, 0.4 mg / mL; 0.1 M PB buffer) was incubated in fluorescamine (3 ⁇ L, 3 mg / mL; DMF) for 10 minutes at room temperature for fluorescence. It was measured using an ND-3300 room temperature protector (Nanodrop, Wilmington, DE, USA). The resulting signal was converted to a primary amine concentration based on a standard calibration curve using a dilution series of BSA.
  • Molecular weight of micelles is assessed by monitoring the absorption of Fab'labeled dyes of Alexa 488 using an analytical ultracentrifugation system of the proteinLab TM XL-1 protein characterization system (Beckman Coulter Inc., USA). did.
  • Fab'-cit-encapsulating micelles (25% Gluc (Fab'-cit) / m) having a glucose modification rate of 25% were measured to evaluate the number of Fab'-encapsulated micelles per micelle.
  • the molar average molecular weight (Wm) of micelles is about 2,000,000 Da (see FIG. 12), the molecular weight (Wf) of Fab'is about 50,000 Da, and MeO-PEG-p (Lys-PDP).
  • PIC micelles Fab'encapsulating glucose-modified micelles (Gluc / m) and Fab'encapsulating glucose-unmodified micelles (Null / m) were prepared as follows, respectively.
  • Gluc-PEG-P (Lys-PDP) 0.5 mg / ml
  • MeO-PEG-P LiO-PEG-P
  • Micellars with different modifications 0%, 25%, 50%, and 100%
  • the solution was purified 3 times with Vivaspin 6. The cutoff molecular weight was 10,000 Da and 10 mM PB was used.
  • the brain, lungs, liver, spleen, kidneys, heart, and thigh muscles were removed and washed with D-PBS (-). After removing the lavage fluid, these organs were weighed and homogenized with 600 ⁇ L of lysis buffer. Blood collected from the inferior vena cava was treated with heparin and centrifuged to obtain plasma. The accumulation of Fab'was evaluated by fluorescence measurement using the Infinite M1000 PRO spectrophotometer (Tekan Group Ltd., Mannedorf, Switzerland).
  • the brain was frozen in liquid nitrogen and sliced into 14 ⁇ m pressure sections using CM3050 Cryostat (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). Sections are immunolabeled with antibodies against Tuji1 (1: 300), PECAM1 (1: 300), GFAP (1: 100) and Iba1 (1: 300) and incubated with Alexa488-labeled secondary antibody for neurons, brain. Capillary endothelial cells (BCECs), astrocytes, and microglia were visualized, respectively. Images were acquired by observing all sections using a confocal laser scanning microscope (Zeiss, Germany) after nuclear staining with DAPI.
  • CM3050 Cryostat Leica Microsystems, Wetzlar, Germany. Sections are immunolabeled with antibodies against Tuji1 (1: 300), PECAM1 (1: 300), GFAP (1: 100) and Iba1 (1: 300) and incubated with Alexa488-labeled secondary antibody for neurons, brain. Capillar
  • ThT Thioflavin T Assay
  • Hexafluoroisopropanol (HFIP) in which A ⁇ 1-42 was dissolved was air-dried, and then dissolved in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) at a constant concentration of 20 ⁇ M to obtain various Fab / A ⁇ 1-42 molar ratios.
  • 3D6 Fab was added to achieve the above.
  • 10 ⁇ M ThT was added to the solution and A ⁇ aggregates were monitored at room temperature using an Infinite M1000 PRO spectrophotometer (excitation wavelength 440 nm, fluorescence wavelength 480 nm).
  • the recovered brain is homogenized with 50 mM Tris-HCl buffer containing 600 ⁇ L protease inhibitor (Sigma) and 150 mM NaCl, followed by 700 ⁇ L containing the protease inhibitor for extraction of degradable A ⁇ . It was homogenized with the sample extraction buffer (Invitrogen). The resulting tissue lysate was analyzed using an anti-A ⁇ 1-42 sandwich ELISA (Wako, Japan).
  • Gluc-PEG-P Lys-PDP
  • MeO-PEG-P MeO-PEG-P
  • FIGS. 6-10 Ring-opening polymerization of ⁇ -trifluoroacetyl-L-lysine N-carboxyampridride with the starting materials of DIG-PEG-NH 2 and MeO-PEG-NH 2 was performed.
  • the controlled degree of polymerization of pLys (TFA) in the diblock copolymers of DIG-PEG-pLys (TFA) and MeO-PEG-PLys (TFA) was 66 and 70, respectively, as determined by 1 1 H NMR. there were.
  • Gluc-PEG-PLys and MeO-PEG-PLys were obtained (see FIGS. 8 and 9).
  • About 20% of Lys in the polymer was modified with SPDP at its amino group to give Gluc-PEG-p (Lys-PDP) and MeO-PEG-p (Lys-PDP) (see FIGS. 7 and 8).
  • Gluc-PEG-p (Lys-PDP) and MeO-PEG-p (Lys-PDP) were mixed in various molar ratios to give glucose modification rates of 0%, 25%, 50% and 100%. ..
  • the disulfide bonds in these polymers were reduced at 37 ° C. for 3 hours in the presence of 100 mM DTT to give free thiol groups. After purification by ultracentrifugation, these polymers are mixed with Fab'-cit or succinyl Fab'(Fab'-suc) at room temperature in 10 mM PB (pH 7.4) containing 0.5% DMSO. Incubation was carried out for 24 hours to form crosslinked disulfide bonds between the polymers.
  • Gluc Fab'/ m was observed using dynamic light scattering (DLS) and a transmission electron microscope (TEM) (Fig. 2). All Gluc (Fab'-cit) / m had a sharp particle size distribution (PDI ⁇ 0.15) and a homogeneous spherical morphology, with a particle size of approximately 45 nm (FIGS. 2, 11 and Table). 1). The molecular weight of the micelles was analyzed and it was calculated that 20.65 molecules of Fab'and 54.7 molecules of polymer were contained in one micelle. This indicates a high Fab'loading efficiency of 51.6% in this nanocarrier system.
  • DLS dynamic light scattering
  • TEM transmission electron microscope
  • the stability and dispersion time of micelles in PB buffer containing 10% FBS was evaluated by fluorescence correlation spectroscopy (FCS) (see FIG. 13).
  • FCS fluorescence correlation spectroscopy
  • the dispersion time of micelles in buffer was consistent with particle size.
  • Fab'-loaded micelles showed a higher dispersion time than free Fab', and no obvious changes were observed in PB buffer containing 10% FBS. This indicates that these micelles are extremely stable in serum.
  • Alexa647-labeled Fab'from micelles was tested at 37 ° C. under various pH and reducing conditions. 2
  • the mM GSH solution was used to simulate the reducing environment in the brain, and PBS having a pH of 5.5 was used to simulate the low pH condition in the intracellular lysosomal storage disease.
  • the released Fab' was recovered using Vivaspin 6 (cutoff molecular weight 100,000 Da, 10 mM PBS, pH 7.4), and the fluorescence intensity of Alexa647 label was quantified.
  • Vivaspin 6 cutoff molecular weight 100,000 Da, 10 mM PBS, pH 7.4
  • the release of Fab' was only about 10% even after 24 hours of incubation, whereas Fab' from micelles after 24 hours under pH 5.5 environment and reducing conditions.
  • the cells treated with the cells treated with glucose-modified micelles not only improved the intracellular uptake efficiency, but also showed an improvement in the glucose density-dependent uptake efficiency of the micelle surface. That is, as the density of micelle modification with glucose increased, the intracellular uptake efficiency improved. This result suggests that the interaction between glucose-modified micelles and glucose transporters on the cell membrane is polyvalent, which contributes to the efficiency of micelle uptake into cells. Is shown.
  • the blood retention time of micelles can greatly affect the tissue accumulation of drugs delivered by micelles. Therefore, the blood retention time of micelles was evaluated based on real-time fluorescence signals (obtained using a confocal microscope) in the veins of the ear of mice.
  • the Alexa647-labeled free Fab'-cit had a half-time (t1 / 2) of 8 minutes and showed very short blood retention (see FIG. 3a).
  • all of Gluc / PICm glucose modification rates 0%, 25%, 50%, and 100%
  • the half-time of Gluc / PICm was 59 minutes, 53 minutes, 48 minutes, and 39 minutes, respectively (see FIG. 3a).
  • the blood retention of micelles containing the Fab'fragment was significantly longer than that of micelles prepared by the same method containing an intact antibody (full-length antibody before fragmentation).
  • GLUT1 glucose transporter
  • BCEC brain capillary endothelial cells
  • Fab'-cit delivered to the brain parenchyma The distribution and localization of Fab'-cit delivered into the brain was further investigated. Sections of the cross section of the brain were stained with antibodies against Tuji1, PECAM1, GFAP, and Iba1 and observed by CLSM to observe nerve cells, BCEC, astrocytes, and microglia, respectively, and Fab delivered into the brain. The intracellular distribution of'-cit was confirmed. The results were as shown in FIGS. 4c, 4d, 4e and 4f. The delivered Fab'showed predominantly neuronal accumulation, partial accumulation in microglia, but no accumulation in BCEC and astrocytes. Successful delivery of antibodies to these cells is expected to be useful for treatment, diagnosis, and theranostics.
  • the 3D6 antibody which is an anti-A ⁇ monoclonal antibody, can bind to both soluble A ⁇ and insoluble A ⁇ .
  • the Fab fragment of the 3D6 antibody was delivered to the brain by micelles to test whether it could suppress A ⁇ plaque formation in APP / PS1 Alzheimer's disease model mice.
  • 25% Gluc (3D6 Fab-cit) / m is a block copolymer (25%) of PEG-cationic block obtained by treating a Fab fragment of 3D6 treated with citraconic anhydride with glucose modification and PEG without glucose modification.
  • -Micelle obtained by mixing with a block copolymer (75%) of a cationic block.
  • mice intravenously administered 25% Gluc (3D6 Fab-cit) / m the amount of A ⁇ deposited in the brain was significantly lower after 10 weeks (see FIG. 5b).
  • the amount of A ⁇ plaque newly formed after the start of the experiment, calculated by the difference from time 0, was 47.63 pg / mg-brain (1 mg brain) in mice treated with 25% Gluc (3D6 Fab-cit) / m. 47.63 pg) per mouse, which was 94.28 pg / mg-brain in mice treated with the free form of 3D6 Fab.
  • mice treated with 25% Gluc (3D6 Fab-cit) / m had 19.59 pg / mg-brain, and 89.81 pg / mg when treated with free Fab. -The amount was reduced to only 21.81% of the brain.
  • Fab does not show activity in the state treated with citraconic anhydride.
  • the fact that Fab showed activity in the brain means that citraconic anhydride was desorbed in the brain environment (particularly in the reducing pH environment of endosomes) and converted to the original Fab as designed. It suggests.
  • the glucose-modified micelles of the present invention can deliver citraconic anhydride-treated antibody, Fab or Fab'into the brain, and can be combined with glycemic manipulation by fasting and glucose administration. It was revealed that the acid anhydride treatment was released in the brain.
  • Wiley DT Webster P, Gale A, Davis ME. Transferrin uptake of transferrin-contining nanoparticles by tuning avidity to transferrin receptor. Proceedings of the National Academia of Sciences of the United States of America 2013, 110 (21): 8662-8667. 24. Park TE, Sing B, Li H, Lee JY, Kang SK, Choi YJ, et al. Enhanced BBB permeability of osmotically active poly (mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease. Biomaterials 2015, 38: 61-71. 25.
  • L-selectin lidands in rat high endothelium multivalent sialyl-lewis x glycans are high-affinity inhibitors of lymphocyte.

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Abstract

本発明は、抗体またはその抗原結合性断片を脳へ送達するための方法および組成物を提供する。本発明は、シトラコン酸無水物と結合し、負の電荷を有する、抗体またはその抗原結合性断片と、ポリエチレングリコールとポリカチオンとのブロック共重合体とを含み、当該ブロック共重合体の少なくとも一部がポリエチレングリコール側の末端でＧＬＵＴ１、例えば、グルコースと連結しているミセル、及び当該ミセルを含む組成物を提供する。

Description

抗体の抗原結合性断片を脳へ送達するための方法および組成物
　本発明は、抗体の抗原結合性断片を脳へ送達するための方法および組成物に関する。
　抗体は、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびレビー小体型認知症などの神経変性疾患を処置するための治療剤としての可能性を秘めている（文献１～１０参照）。しかしながら、抗体を血液脳関門（ＢＢＢ）を超えて脳の実質に送達することは容易ではなく、ＢＢＢを通過すると報告されているのは、疎水性の低分子化合物（約４００Ｄａ）のみである（文献１１）。二重特異性を有する抗体を用いてＢＢＢを通過させる試みがなされているが、抗体の設計戦略の複雑さや脳蓄積効率の低さによってその応用は限定されている（文献１２および１３）。抗アミロイドβ抗体のｓｃＦｖをコードするｍＲＮＡを中枢神経系に直接局所投与してＡβ凝集体形成を阻害することが報告されている（文献１４）。しかし、このような薬の投薬は実践的には不都合である。細胞におけるエンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス経路のメカニズムの研究によって、ナノキャリアにＢＢＢを通過させるための戦略開発が促進されている（文献１５～１９）。本発明者らは、表面をグルコースで修飾したミセルを血糖操作した動物に投与することによって当該ミセルにＢＢＢを効果的に通過させる方法論を開発してきた（文献２５～２７）。
　抗体のリジン残基のε－アミノ基をシトラコン酸無水物（ｃｉｔ）で修飾することによって抗体を負に帯電させることが可能である（文献２８および２９）。
　ポリイオンコンプレックスミセルの形成において、ポリマー中のアミノ酸のアミノ基に対してスクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）を修飾してポリマー間を架橋することができ、これによりミセルの血中滞留性を向上させると共に、細胞内環境（還元環境）においてミセルを崩壊させる技術が開発されている（文献３０および３１）。
　本発明は、抗体の抗原結合性断片を脳へ送達するための方法および組成物を提供する。
　本発明者らは、グルコースで被覆したポリカチオンと、負の電荷を付与した抗体の抗原結合性断片からミセルを形成したところ、当該ミセルは、溶液中において、血清存在下であっても、安定に存在することを明らかにした。本発明者らは、グルコースで被覆したポリカチオンと、負の電荷を付与した抗体の抗原結合性断片からミセルを形成し、絶食させたマウスの血糖値を上昇させて当該ミセルを投与したところ、当該ミセルが血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して、抗体の抗原結合性断片を脳の実質に送達できることを見出した。
　本発明によれば、以下の産業上利用可能な発明が提供される。
（１）負の電荷を有する、抗体の抗原結合性断片。
（２）１以上のカルボキシル基を含む負の電荷を有する置換基を有し、これにより負の電荷を有する、上記（１）に記載の抗体の抗原結合性断片。
（３）１以上のカルボキシル基を含む負の電荷を有する置換基が、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）－ＣＯＯＨ｛ここで、Ｒ１およびＲ２は、独立に、水素原子、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、Ｒ１およびＲ２の炭素原子の少なくとも１つはカルボキシル基で置換されていてもよい｝、および－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－ＣＯＯＨ｛ここで、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、置換されていてもよいアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレンである｝からなる群から選択される、上記（２）に記載の抗体の抗原結合性断片。
（３’）１以上のカルボキシル基を含む負の電荷を有する置換基が、－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ＝Ｃ（Ｒ２）－ＣＯＯＨ｛ここで、Ｒ２は、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、Ｒ２の炭素原子の少なくとも１つはカルボキシル基で置換されていてもよい｝、および－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－ＣＯＯＨ｛ここで、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、置換されていてもよいアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレンである｝からなる群から選択される、上記（２）に記載の抗体の抗原結合性断片。
（４）脳内の抗原に結合する、上記（１）～（３’）のいずれかに記載の抗体の抗原結合性断片。
（５）抗体の抗原結合性断片が、ＦａｂまたはＦａｂ’である、上記（１）～（４）のいずれかに記載の抗体の抗原結合性断片。
（６）上記（１）～（５）のいずれかに記載の抗体の抗原結合性断片を含む、ミセル。
（７）ＧＬＵＴ１リガンドによってその表面が修飾された、上記（６）に記載のミセル。
（８）上記（７）に記載のミセルであって、ポリエチレングリコールとポリカチオンとのブロック共重合体とを含み、当該ブロック共重合体の少なくとも一部がポリエチレングリコール側の末端でＧＬＵＴ１リガンドと連結している、ミセル。
（９）抗体の抗原結合性断片を脳の実質に送達することに用いるための組成物であって、上記（７）または（８）に記載のミセルを含む、組成物。
（１０）脳内のＡβの蓄積を抑制することに用いるための医薬組成物であって、
　負の電荷を有する、Ａβの凝集体形成を中和する抗体の抗原結合性断片を含む、上記（８）に記載のミセルを含む、医薬組成物。
図１Ａは、本発明で用い得るグルコース修飾されたブロック共重合体の一例を示す。 図１Ｂは、本発明で用い得るブロック共重合体の一例を示す。 図１Ｃは、シトラコン酸無水物によるＦａｂ’のＦａｂ’－ｃｉｔへの変換と低ｐＨ条件（例えば、細胞のエンドソーム内）でのＦａｂ’－ｃｉｔのＦａｂ’への変換を示す。ここでＦａｂ’－ｃｉｔは、シトラコン酸無水物と結合したＦａｂ’を意味する。 図２は、Ｆａｂ’－ｃｉｔと図１Ａ（および図１Ｂ）とのミセル（Ｇｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍ）の特性分析の結果を示す。（ａ）は、動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定されたミセルの粒径分布を示し、（ｂ）は、Ｇｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍの形態を示す透過電子顕微鏡像を示す。（ｃ）は、様々なｐＨ条件および還元条件におけるＧｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍからのＦａｂ’の放出の度合いを示すインビトロ実験の結果である。（ｄ）は、Ａｌｅｘａ６４７標識したＦａｂ’－ｃｉｔを内包するＧｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍと３時間または６時間インキュベートした後のＣａｃｏ－２細胞によるＦａｂ’－ｃｉｔ取り込みを蛍光強度によって示す図である。遊離形態のＡｌｅｘａ６４７標識Ｆａｂ’－ｃｉｔを対照として用いた（Ｆａｂ’濃度は８　μｇ／ｍＬであり、ｎ＝５であった）。 図３は、Ｇｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍの薬物動態プロファイルを示す。（ａ）は、尾静脈投与されたマウスにおけるＡｌｅｘａ６４７標識Ｆａｂ’－ｃｉｔを含むＧｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍと、遊離形態のＦａｂ’－ｃｉｔの蛍光シグナルの相対強度の経時変化を示す。（ｂ）は、投与９０分後のマウスにおけるＦａｂ’の脳内への蓄積を示す（各ｎ＝５）。（ｃ）は、遊離形態のＦａｂ’－ｃｉｔを投与したマウスに対する、Ｆａｂ’－ｃｉｔを含むＧｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍを投与したマウスでのＦａｂ’の組織への蓄積比率を示す。（ｄ）は、投与９０分後のマウスの各臓器におけるＦａｂ’の蓄積を示す。上記（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）では、２４時間絶食させたマウスに対して、２００μＬの２０重量％のグルコース溶液を腹腔内投与した３０分後にサンプル（ミセルや遊離形態のＦａｂ’－ｃｉｔ）を静脈内投与した。 図４は、Ｇｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍが血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して脳実質内へ拡散する様子を示す。（ａ）は、ＩＶＲＴ－ＣＬＳＭを用い観察したマウスの脳組織の時系列イメージを示す。２４時間絶食させたマウスに対して、２００μＬの２０重量％のグルコース溶液を腹腔内投与した３０分後にＧｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍを静脈内投与した。スケールバーは２００μｍを示す。（ｂ）は、上記（ａ）において選択された脳実質の所望の領域（ＲＯＩ）におけるＧｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍの蛍光強度の平均値の経時的変化を示す。（ｂ）では、ミセルを投与した時を０としている。（ｃ）～（ｆ）は、Ｇｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍ投与後の脳の免疫組織化学分析の結果を示し、（ｃ）は脳血管内皮細胞、（ｄ）はアストロサイト、（ｅ）はマイクログリア、および（ｆ）は神経細胞をそれぞれ、抗ＰＥＣＡＭ１抗体、抗ＧＦＡＰ抗体、抗ＩｂａＩ抗体、および抗Ｔｕｊ１抗体で染色した結果である。核は、ＤＡＰＩで染色した。挿入図のスケールバーは１０μｍであり、外側の図のスケールバーは２０μｍである。 図５は、抗Ａβ抗体３Ｄ６のＦａｂを用いたインビトロでのＡβの凝集体形成の阻害実験の結果、および、アルツハイマー病モデルマウスにおけるＡβプラークの抑制実験の結果を示す。（ａ）は、ＴｈＴ蛍光強度（１０μＭ）を用いて、１：５０、１：１０、１：２、および０：１の様々なモル比（３Ｄ６のＦａｂ／Ａβ１－４２比）でインキュベートしたときのＡβ１－４２の凝集体形成効率を分析した結果を示す。（ｂ）および（ｃ）は、１．８ｍｇ／ｋｇ　３Ｄ６　Ｆａｂ－ｃｉｔを含むＧｌｕｃ（Ｆａｂ－ｃｉｔ）／ｍを６週齢から１６週齢まで毎週投与されたマウスの脳における不溶性Ａβ１－４２（ｂ）と可溶性Ａβ１－４２の脳への蓄積を示す（ｎ　＝　５，　ｐ＜０．０５，　ｔ検定）。時間０の群（６週齢、Ｎ＝５）は、試験開始時に犠牲にした。（ｄ）は、Ｇｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍのＢＢＢ通過と、抗Ａβ抗体のＦａｂによるＡβプラークの抑制を示すスキームである。 図６は、Ｄ２Ｏ中でのポリエチレングリコールとポリリジンとのブロック共重合体（ＰＥＧ－ＰＬｙｓ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。 図７は、Ｄ２Ｏ中でのＰＥＧ－Ｐ（Ｌｙｓ－ＰＤＰ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。 図８は、Ｄ２Ｏ中でのＤＩＧ－ＰＥＧ－ＰＬｙｓの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。 図９は、Ｄ２Ｏ中でのＧｌｕｃ－　ＰＥＧ－ＰＬｙｓの１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。 図１０は、Ｄ２Ｏ中でのＧｌｕｃ－ＰＥＧ－Ｐ（Ｌｙｓ－ＰＤＰ）の１Ｈ－ＮＭＲスペクトルを示す。 図１１は、上からそれぞれ０％　Ｇｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍ、５０％　Ｇｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍ、および１００％　Ｇｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍのＤＬＳ測定の結果およびＴＥＭ像を示す。スケールバーは２００μｍである。 図１２は、分析的超遠心システムを用いて測定した２５％　Ｇｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍの分子量分布を示す。 図１３は、各種Ｇｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍの拡散時間と遊離形態のＦａｂ’－ｃｉｔの拡散時間を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む、または含まない０．０１　Ｍ　ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ　７．４，　１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ）で観察した結果（ｎ＝４）を示す。 図１４は、２４時間絶食させたマウスにおける２００μＬの２０重量％Ｄ－（＋）－グルコース溶液を腹腔内投与する前および後の血糖値の変化を示す。
発明の具体的な説明
　本明細書では、「ミセル」とは、１層の分子膜により形成される小胞を意味する。ミセルとしては、界面活性剤などの両親媒性分子により形成されるミセル、および、ポリイオンコンプレックスにより形成されるミセル（ＰＩＣミセル）が挙げられる。ミセルは、血中滞留時間の観点では、その外表面をポリエチレングリコールで修飾することが好ましいと知られている。
　本明細書では、「リポソーム」とは、２層の分子膜により形成される小胞を意味する。分子膜は通常はリン脂質による二重膜である。
　本明細書では、「ポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム」（以下、「ＰＩＣｓｏｍｅ」ともいう）とは、ポリイオンコンプレックスにより形成される中空の微粒子を意味する。ＰＩＣｓｏｍｅは、血中滞留時間の観点では、その外表面をポリエチレングリコールで修飾することが好ましいと知られている。
　本明細書では、「ポリイオンコンプレックス」（以下、「ＰＩＣ」ともいう）とは、ＰＥＧとアニオン性ブロックとの共重合体と、ＰＥＧとカチオン性ブロックとの共重合体とを水溶液中で荷電を中和するように混合すると両ブロック共重合体のカチオン性ブロックとアニオン性ブロックとの間で形成されるイオン層である。ＰＥＧと上記の荷電性連鎖とを結合させる意義は、ポリイオンコンプレックスが凝集して沈殿することを抑制すること、および、それにより、ポリイオンコンプレックスが粒径数十ｎｍの単分散なコア－シェル構造を有するナノ微粒子を形成することである。この際、ＰＥＧはナノ微粒子の外殻（シェル）を覆うため、生体適合性が高く、血中滞留時間を向上させる点で都合がよいことでも知られている。また、ポリイオンコンプレックス形成において、一方の荷電性ブロックコポリマーは、ＰＥＧ部分を必要とせず、ホモポリマー、界面活性剤、核酸および／または酵素に置き換えてもよいことが明らかとなっている。そして、ポリイオンコンプレックス形成においては、アニオン性ポリマーおよびカチオン性ポリマーの少なくとも１つがＰＥＧとの共重合体を形成しており、その両方がＰＥＧとの共重合体を形成していてもよい。また、ＰＥＧ含有量を増加させるとＰＩＣミセルが形成されやすく、ＰＥＧ含有量を低減させるとＰＩＣｓｏｍｅが形成されやすいことがよく知られている。または共重合体濃度を増加させると粒径８０ｎｍ～１，０００ｎｍ程度（特に、１００ｎｍ～１，０００ｎｍ程度）の平均粒径を有する中空の粒子であるポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム（ＰＩＣ／ｓｏｍｅ）が形成されやすいことが知られている。ＰＩＣ／ｓｏｍｅは、ＰＩＣにより形成される膜構造と内部の空洞を有する中空の粒子であるため、内部の空洞に水溶液（例えば、生理活性物質や造影剤等の物質を含む水溶液）を内包させることができる。
　本明細書では、「薬剤送達用の」とは、生体適合性であること、および、薬剤を小胞に内包できることを意味する。本明細書では、「薬剤送達用の」とは、薬剤の血中滞留時間を、裸の薬剤の血中滞留時間と比べて長期化する作用を利用した用途を意味することがある。ＰＩＣｓｏｍｅ中では、薬剤は、内部の空洞に導入された水溶液に溶解または懸濁させ得る。
　本明細書では、「低血糖を誘発させる」または血糖値を低下させるとは、対象において、その処置がされなければ示したはずの血糖よりも血糖値を低下させることをいう。低血糖を誘発させる方法としては、糖尿病薬の投与などが挙げられる。例えば、低血糖を誘発させる際に、低血糖を誘発させるという目的を達する限りにおいて、例えば、他の薬剤を摂取し、または水などの飲料を飲むことは許容される。低血糖を誘発させることは、血糖に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
　本明細書では、「絶食させる」とは、対象に絶食、例えば、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、１２時間以上、１３時間以上、１４時間以上、１５時間以上、１６時間以上、１７時間以上、１８時間以上、１９時間以上、２０時間以上、２１時間以上、２２時間以上、２３時間以上、２４時間以上、２５時間以上、２６時間以上、２７時間以上、２８時間以上、２９時間以上、３０時間以上、３１時間以上、３２時間以上、３３時間以上、３４時間以上、３５時間以上、３６時間以上、３７時間以上、３８時間以上、３９時間以上、４０時間以上、４１時間以上、４２時間以上、４３時間以上、４４時間以上、４５時間以上、４６時間以上、４７時間以上または４８時間以上の絶食をさせることを意味する。絶食により対象は低血糖を引き起こす。絶食期間は、対象の健康状態に鑑みて医師等により決定され、例えば、対象が空腹時血糖に達する時間以上の期間とすることが好ましい。絶食期間は、例えば、脳血管内皮細胞の血管内表面でのＧＬＵＴ１の発現が増大する、またはプラトーに達する以上の時間としてもよい。絶食期間は、例えば、１２時間以上、２４時間以上または３６時間以上である上記期間とすることができる。また、絶食は、血糖値やＧＬＵＴ１の血管内表面での発現に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
　本明細書では、「血糖値の上昇を誘発させる」とは、低血糖を誘発させた対象、または、低血糖状態を維持させた対象において血糖値を上昇させることをいう。血糖値は、当業者に周知の様々な方法により上昇させることができるが、例えば、血糖値の上昇を誘発するものの投与、例えば、グルコース、フルクトース（果糖）、ガラクトースなどの血糖値の上昇を誘発する単糖の投与、マルトースなどの血糖値の上昇を誘発する多糖の投与、若しくは、デンプンなどの血糖値の上昇を誘発する炭水化物の摂取、または、食事により上昇させることができる。
　本明細書では、「血糖操作」とは、対象に対して、低血糖を誘発させ、その後、血糖値を上昇させることをいう。対象に対して低血糖を誘発させた後は、対象の血糖値を低血糖に維持することができる。対象の血糖値を低血糖に維持する時間は、例えば、０時間以上、１時間以上、２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、１２時間以上、１３時間以上、１４時間以上、１５時間以上、１６時間以上、１７時間以上、１８時間以上、１９時間以上、２０時間以上、２１時間以上、２２時間以上、２３時間以上、２４時間以上、２５時間以上、２６時間以上、２７時間以上、２８時間以上、２９時間以上、３０時間以上、３１時間以上、３２時間以上、３３時間以上、３４時間以上、３５時間以上、３６時間以上、３７時間以上、３８時間以上、３９時間以上、４０時間以上、４１時間以上、４２時間以上、４３時間以上、４４時間以上、４５時間以上、４６時間以上、４７時間以上、４８時間以上とすることができる。その後、血糖値を上昇させることができる。本明細書では、「血糖を維持する」とは、対象において低血糖を維持するという目的を達する限りにおいて、例えば、他の薬剤を摂取し、または水などの飲料を飲むことは許される。低血糖を誘発させることは、血糖に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
　本明細書では、「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物である。対象は、健常の対象であってもよいし、何らかの疾患に罹患した対象であってもよい。ここで疾患としては、脳神経疾患、例えば、精神病性障害、うつ病、気分障害、不安、睡眠障害、認知症および物質関連障害が挙げられる。また、認知症としては、特に限定されないがアルツハイマー病およびクロイツフェルト・ヤコブ病が挙げられる。
　本明細書では、「処置」とは、治療的処置と予防的処置の両方を含む意味で用いられる。
　本明細書では、「血液脳関門」とは、血液（または血行）と脳の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。血液脳関門の実態は、脳血管内皮細胞などであると考えられている。血液脳関門の物質透過性については、不明な点が多いが、グルコース、アルコールおよび酸素は血液脳関門を通過し易いことが知られ、脂溶性物質や小分子（例えば、分子量５００未満）は、水溶性分子や高分子（例えば、分子量５００以上）に比べて通過し易い傾向があると考えられている。多くの脳疾患治療薬や脳診断薬が血液脳関門を通過せず、このことが脳疾患の治療や脳の分析等の大きな障害となっている。本明細書では、「血液神経関門」とは、血行と末梢神経の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。本明細書では、「血液髄液関門」とは、血行と脳脊髄液との間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。本明細書では、「血液網膜関門」とは、血行と網膜組織の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。血液神経関門、血液髄液関門および血液網膜関門の実体は、それぞれの関門に存在する血管内皮細胞などであると考えられており、その機能は血液脳関門と同様であると考えられている。
　本明細書では、「ＧＬＵＴ１リガンド」とは、ＧＬＵＴ１と特異的に結合する物質を意味する。ＧＬＵＴ１リガンドとしては、様々なリガンドが知られ、特に限定されないが例えば、グルコースおよびヘキソースなどの分子が挙げられ、ＧＬＵＴ１リガンドは、いずれも本発明でグルコースの代わりにキャリアまたはコンジュゲートの調製に使用することができる。ＧＬＵＴ１リガンドは、好ましくはＧＬＵＴ１に対してグルコースと同等またはそれ以上の親和性を有する。２－Ｎ－４－（１－アジ－２，２，２－トリフルオロエチル）ベンゾイル－１，３－ビス（Ｄ－マンノース－４－イルオキシ）－２－プロピルアミン（ＡＴＢ－ＢＭＰＡ）、６－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース（６－ＮＢＤＧ）、４，６－Ｏ－エチリデン－α－Ｄ－グルコース、２－デオキシ－Ｄ－グルコースおよび３－Ｏ－メチルグルコースもＧＬＵＴ１と結合することが知られ、これらの分子もＧＬＵＴ１リガンドとして本発明に用いることができる。
　本明細書では、「抗体」は、免疫グロブリンを意味し、一対のジスルフィド結合で安定化された２本の重鎖（Ｈ鎖）と２本の軽鎖（Ｌ鎖）が会合した構造をとるタンパク質をいう。重鎖は、重鎖可変領域ＶＨ、重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ１とＣＨ２の間に位置するヒンジ領域からなり、軽鎖は、軽鎖可変領域ＶＬと軽鎖定常領域ＣＬとからなる。この中で、ＶＨとＶＬからなる可変領域断片（Ｆｖ）が、抗原結合に直接関与し、抗体に多様性を与える領域である。また、ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ、ＣＨ１からなる抗原結合領域をＦａｂ領域と呼び、ヒンジ領域、ＣＨ２、ＣＨ３からなる領域をＦｃ領域と呼ぶ。
　可変領域のうち、直接抗原と接触する領域は特に変化が大きく、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ：　ＣＤＲ）と呼ばれる。ＣＤＲ以外の比較的変異の少ない部分をフレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ　ｒｅｇｉｏｎ：　ＦＲ）と呼ぶ。軽鎖と重鎖の可変領域には、それぞれ３つのＣＤＲが存在し、それぞれＮ末端側から順に、重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３と呼ばれる。
　本明細書では、抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。本明細書ではまた、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのいずれのアイソタイプであってもよい。マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリなどの非ヒト動物を免疫して作製したものであってもよいし、組換え抗体であってもよく、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体等であってもよい。キメラ型抗体とは、異なる種に由来する抗体の断片が連結された抗体をいう。
　「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体に特徴的なアミノ酸配列で、ヒト抗体の対応する位置を置換した抗体を意味し、例えば、マウス又はラットを免疫して作製した抗体の重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３を有し、重鎖及び軽鎖のそれぞれ４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含むその他のすべての領域がヒト抗体に由来するものが挙げられる。かかる抗体は、ＣＤＲ移植抗体と呼ばれる場合もある。用語「ヒト化抗体」は、ヒトキメラ抗体を含む場合もある。
　「ヒトキメラ抗体」は、非ヒト由来の抗体において、非ヒト由来の抗体の定常領域がヒトの抗体の定常領域に置換されている抗体である。
　本明細書では、「抗体の抗原結合性断片」とは、抗体のフラグメントであって、抗原への結合性を維持した断片をいう。具体的には、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１領域からなるＦａｂおよびヒンジ領域を有するＦａｂ’；２つのＦａｂがヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されているＦ（ａｂ’）２；ＶＬ及びＶＨからなるＦｖ；ＶＬ及びＶＨを人工のポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体であるｓｃＦｖのほか、ｄｉａｂｏｄｙ型、ｓｃＤｂ型、ｔａｎｄｅｍ　ｓｃＦｖ型、ロイシンジッパー型などの二重特異性抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書では、「負電荷を有する抗体の抗原結合性断片」とは、当該断片が修飾によって負の電荷を付与され、分子全体として生理的環境下において負の電荷を有する断片をいう。負電荷を有する抗体の抗原結合性断片に追加で付与されたカルボキシル基は、生理的環境下およびミセル内包時には、電離し、－ＣＯＯ－を有し得る。
　本明細書では、「抗原」は、抗体が結合し得る物質をいう。抗原は、免疫原性を有していることができる。抗原は、タンパク質、核酸、および代謝物等であり得る。
　本明細書では、「アルキル」とは、直鎖（即ち、分岐でない）若しくは分岐炭素鎖、またはその組み合わせを意味する。アルキルとしては、特に限定されないが例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、およびｎ－オクチル、並びにこれらの異性体が挙げられる。本明細書では、アルキルは、Ｃ１アルキル、Ｃ２アルキル、Ｃ３アルキル、Ｃ４アルキル、Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、Ｃ７アルキル、またはＣ８アルキルであり得る。これらをまとめて表すときは、Ｃ１－Ｃ８アルキルということがある。
　本明細書では、「アルケニル」とは、アルキルが有する２つの隣接する炭素間に二重結合を有する基を言う。本明細書では、「アルキニル」とは、アルキルが有する２つの隣接する炭素環に三重結合を有する基を言う。
　本明細書では、「置換されていてもよい」とは、化合物または基が他の基によって置換されていても、置換されていなくてもよいことを意味する。前記他の基としては、ハロゲン、ヒドロキシル基、Ｃ１－Ｃ８アルキル基、および、好ましくは負の電荷を有する基、例えば、カルボキシル基が挙げられる。
　本発明によれば、負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片が提供される。負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片は、生理的環境下において負の電荷を有すれば、ポリカチオンとミセル形成を達成することができる。負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片は、１以上のカルボキシル基を含む負の電荷を有する置換基を有するか、または当該置換基が導入され、これにより負の電荷を有することができる。そして、ポリカチオンとポリイオンコンプレックスミセルを形成するためには、抗体の抗原結合性断片は、負の電荷を有しさえすればよく、負の電荷の内容は問われないと考えられる。本発明では、負電荷を有する抗体の抗原結合性断片と、ＰＥＧとポリカチオンとのブロック共重合体とを含むミセル（特に、ポリイオンコンプレックスミセル）は、血中において安定であった。特に、抗体とポリカチオンとを用いてポリイオンコンプレックスミセルを形成させた場合には、粒径が約１００ｎｍ前後になるのに対して、抗体の抗原結合性断片とポリカチオンとを用いてポリイオンコンプレックスミセルを形成させた場合には、粒径がより小さくなり、ＦａｂまたはＦａｂ’とポリカチオンとを用いてポリイオンコンプレックスミセルを形成させた場合には、粒径が約４０ｎｍ前後となった。そして、約４０ｎｍの粒径を有するミセルは、例えば、ＷＯ２０１５０７５９４２Ａに記載されるように、血液脳関門を突破し易いので、静注した場合であっても脳実質に到達し得る。また、約４０ｎｍの粒径を有するミセルは、増強された透過性と保持の効果（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｅｆｆｅｃｔ；ＥＰＲ効果）によってがん組織に到達し得る。したがって、負電荷を有する抗体の抗原結合性断片と、ＰＥＧとポリカチオンとのブロック共重合体とを含むミセルは、血中で安定である上に、組織に対する浸透性が高いことが期待される。
　本発明において、１以上のカルボキシル基を含む負の電荷を有する置換基としては、カルボキシル基を１または複数含む置換基であり、かつ、置換基全体として負の電荷を有する。この意味で、当該置換基は、正電荷を有する官能基を有することは除外されないが、好ましくは、正電荷を有する官能基を有しない。１以上のカルボキシル基を含む負の電荷を有する置換基としては、例えば、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）－ＣＯＯＨ｛ここで、Ｒ１およびＲ２は、水素原子、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、Ｒ１およびＲ２の炭素原子の少なくとも１つはカルボキシル基で置換されていてもよい｝、好ましくは、－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ＝Ｃ（Ｒ２）－ＣＯＯＨ｛ここで、Ｒ２は、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、Ｒ２の炭素原子の少なくとも１つはカルボキシル基で置換されていてもよい｝および－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－ＣＯＯＨ｛ここで、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、置換されていてもよいアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレンである｝
が挙げられる。
　－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）－ＣＯＯＨ、－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ＝Ｃ（Ｒ２）－ＣＯＯＨは、環状酸無水物として抗体の抗原結合性断片と反応させることによって、抗体の抗原結合性断片が有するアミノ酸側鎖のアミノ基と当該置換基とを連結させることができる。すなわち、例えば、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）－ＣＯＯＨの場合、式（Ｉａ）の化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 と抗体の抗原結合性断片が有するアミノ酸側鎖のアミノ基とを反応させることによって、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）－ＣＯＯＨで修飾されたアミノ基を有する抗体の抗原結合性断片を得ることができる。－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）－ＣＯＯＨで修飾されたアミノ基を有する抗体の抗原結合性断片は、低ｐＨ条件下（例えば、細胞のエンドソーム内のｐＨ条件下）において不安定化し、抗体の抗原結合性断片から解離する。これによって、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）－ＣＯＯＨで修飾されたアミノ基を有する抗体の抗原結合性断片は、細胞内において機能的な抗体の抗原結合性断片に戻り得る。ある態様では、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルケニル、Ｃ１－６アルキニル、またはカルボキシＣ１－３アルキルであり得る。
　また、次式（ＩＩａ）の化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 ｛ここで、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、置換されていてもよいアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレンである。｝
と抗体の抗原結合性断片が有するアミノ酸側鎖のアミノ基とを反応させることによって、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－ＣＯＯＨで表される置換基を有する抗体の抗原結合性断片を得ることができる。抗体の抗原結合性断片のアミノ基に結合した－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－ＣＯＯＨは、還元環境下において分子内のジスルフィド結合部分で開裂する。開裂した箇所の硫黄原子は、上記基と上記抗体の抗原結合性断片のアミノ基とのアミド結合を解離させ得、これによって、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－ＣＯＯＨで表される置換基（例えば、γ－カルボキシ－ジチオジアルキルカルボニル基）を有する抗体の抗原結合性断片は、還元環境下において機能的な抗体の抗原結合性断片に戻り得る。
　アミノ酸は、リジンおよびアルギニンは、側鎖にアミノ基を有する。したがって、抗体の抗原結合性断片が有するアミノ酸側鎖のアミノ基は、リジンおよび／またはアルギニンのアミノ基であり得る。
　本発明によれば、負電荷を有する抗体の抗原結合性断片と、ＰＥＧとポリカチオンとのブロック共重合体とを含むミセル（特に、ポリイオンコンプレックスミセル）が提供される。
　本発明では、負電荷を有する抗体またはその抗原結合性断片と、ＧＬＵＴ１リガンド修飾されたＰＥＧとポリカチオンとのブロック共重合体とを含むミセル（特に、ポリイオンコンプレックスミセル）は、血中において安定であり、また、脳への抗体またはその抗原結合性断片の送達に有利に用い得た。従って、本発明によれば、負電荷を有する抗体またはその抗原結合性断片と、ＧＬＵＴ１リガンド修飾されたＰＥＧとポリカチオンとのブロック共重合体とを含むミセルが提供される。
　ＧＬＵＴ１リガンド（例えば、グルコース）でその外表面を修飾した上記キャリアは、対象に投与するだけでも脳への蓄積を示す（ＷＯ２０１５０７５９４２Ａ参照）。従って、本発明による投与計画では、絶食若しくは低血糖を誘発させなくてよく、および／または、血糖値の上昇を誘発させなくてもよい。グルコースが表面に露出するようにグルコースでその外表面を修飾したキャリア、具体的にはミセルまたはポリイオンコンプレックス型ポリマーソーム（ＰＩＣｓｏｍｅ）などの小胞をある投与計画に従って投与すると、顕著にこれらのキャリアが血液脳関門を超えて脳内（脳実質部）に送達される（ＷＯ２０１５０７５９４２Ａ参照）。従って、本発明による投与計画は、好ましくは、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することを含むが、より好ましくは、本発明による投与計画は、絶食させるか、または低血糖を誘発させた対象に該組成物を投与することおよび該対象において血糖値の上昇を誘発させることを含む。本発明による投与計画では、該組成物は、該対象における血糖値の上昇の誘発と、同時に、連続してまたは逐次的に該対象に投与され得る。投与計画は、該対象への組成物の投与と該対象における血糖値の上昇の誘発との間にインターバルを有してもよいし、有さなくてもよい。該組成物が該対象における血糖値の上昇の誘発と同時に投与される場合には、該組成物は、血糖値の上昇の誘発を引き起こす薬剤と混合した形態で該対象に投与してもよいし、該対象における血糖値の上昇の誘発を引き起こす薬剤とは別の形態で投与してもよい。また、該組成物は、該対象における血糖値の上昇の誘発と、連続してまたは逐次的に該対象に投与される場合には、該組成物は該対象における血糖値の上昇の誘発より前に該対象に投与してもよいし、後に投与してもよいが、好ましくは、該組成物は該対象における血糖値の上昇の誘発より前に該対象に投与することができる。該対象への該組成物の投与よりも先に該対象において血糖値の上昇を誘発させる場合には、該対象において血糖値の上昇を誘発させてから、１時間以内、４５分以内、３０分以内、１５分以内または１０分以内に該対象に該組成物を投与することが好ましい。また、該対象への該組成物の投与よりも後に該対象において血糖値の上昇を誘発させる場合には、該対象に該組成物を投与してから、６時間以内、４時間以内、２時間以内、１時間以内、４５分以内、３０分以内、１５分以内または１０分以内に該対象において血糖値の上昇を誘発させることが好ましい。上記の投与計画のサイクルは、２回以上行なってもよい。グルコース投与とサンプル投与の前後関係は、血液脳関門を通過させるタイミングにより決定することができる。本発明においてグルコースの投与は、食事摂取に変えることができる。
　本発明で用いられるポリイオンコンプレックス型ポリマーソームとしては、薬剤送達用のＰＩＣｓｏｍｅが挙げられる。薬剤送達用のＰＩＣｓｏｍｅとしては、ブロック共重合体により形成されるＰＩＣｓｏｍｅが知られている。ＰＩＣｓｏｍｅを形成するブロック共重合体としては、ＰＥＧブロックとポリカチオンブロックとのブロック共重合体およびホモポリアニオン、または、ＰＥＧブロックとポリアニオンブロックとのブロック共重合体およびホモポリカチオンが挙げられる。ブロック共重合体としては、生分解性であるブロック共重合体を用いることが好ましく、そのような共重合体としては様々な共重合体が知られ、いずれを用いることも原理的に可能である。例えば、生体適合性が高く、生分解性であるブロック共重合体としては、例えば、ポリリジンブロック共重合体、ポリオルニチンブロック共重合体、ポリ（アスパラギン酸－ジエチレントリアミン（Ａｓｐ－ＤＥＴ）ブロック共重合体、ポリ（アスパラギン酸－トリエチレンテトラアミン（Ａｓｐ－ＴＥＴ））ブロック共重合体、ポリ（アスパラギン酸－テトラエチレンペンタアミン（Ａｓｐ－ＴＥＰ））ブロック共重合体、および、ポリエチレングリコール－ポリ（（５－アミノペンチル）－アスパラギン酸）ブロック共重合体を用いることができる｛ここで、ブロック共重合体は、ＰＥＧとのブロック共重合体であり得る｝。これらのブロック共重合体では、アミノ酸側鎖のアミノ基が３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＰＤＰ）修飾されていてもよい。このようにすることで、還元処理等によってブロック共重合体間を架橋することができ、ミセルの血中安定性を向上させ得る。一方で、安定化したミセルは、血中から還元環境を有する他の組織へ移行すると、当該他の組織において不安定化するか、または、崩壊して内包した抗体の抗原結合性断片を放出し得る。ＰＩＣｓｏｍｅでは、ＰＥＧ側の末端にＧＬＵＴ１リガンドを連結させることで、ＧＬＵＴ１リガンドはＰＩＣｓｏｍｅの外表面に露出する。本発明のある態様では、ＧＬＵＴ１リガンドはグルコースであり得る。本発明のある態様では、ＧＬＵＴ１リガンドはグルコースであり、ＰＥＧに２位、３位または６位の炭素原子を介して連結し得る。当業者であれば、ＧＬＵＴ１に親和性を保持するようにＧＬＵＴ１リガンドでＰＩＣミセルまたはＰＩＣｓｏｍｅの表面を修飾することができる。ＰＩＣｓｏｍｅおよびＰＩＣミセルは、ＧＬＵＴ１を標的化する必要の無い目的に用いられるときには、必ずしも表面をＧＬＵＴ１リガンドで修飾する必要は無い。
　本発明では、カチオン性ポリマーとして下記式（ＩＩＩ）のブロック共重合体を用い得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ｛式中、
　ｍは、５～２０，０００の整数、好ましくは１０～５，０００の整数、より好ましくは４０～５００の整数、さらに好ましくは５～１，０００の整数であり；
　ｘ＋ｙは、２～２０，０００の整数、好ましくは２～５，０００の整数、より好ましくは４０～５００の整数、さらに好ましくは５～１，０００の整数、さらにより好ましくは１０～２００の整数であり、例えば、５０～１００の整数であり、または６０～９０の整数であり；および
　ｘは、１０～４０の整数、１５～３５の整数、または２０～３０の整数であり得る。｝
　本発明では、カチオン性ポリマーとして下記式（ＩＶ）のブロック共重合体を用い得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 ｛式中、
　ｍは、５～２０，０００の整数、好ましくは１０～５，０００の整数、より好ましくは４０～５００の整数、さらに好ましくは５～１，０００の整数であり；
　ｘ＋ｙは、２～２０，０００の整数、好ましくは２～５，０００の整数、より好ましくは４０～５００の整数、さらに好ましくは５～１，０００の整数、さらにより好ましくは１０～２００の整数であり、例えば、５０～１００の整数であり、または６０～９０の整数であり；および
　ｘは、１０～４０の整数、１５～３５の整数、または２０～３０の整数であり得る。｝
　式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）に記載されたブロック共重合体は、リジン残基の側鎖にＰＤＰを有し、還元環境下でＰＤＰ中のジスルフィド結合を開裂させることができ、その後、ミセルを形成させることによって、ミセルにおいてブロック共重合体間に架橋を形成させ得る。当該架橋は、血中においてミセルを安定化させることに寄与し得るが、還元環境下において再び開裂し得るものである。したがって、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）に記載されたブロック共重合体によって作成されるミセルは、還元環境を有する組織内で不安定化し得る、または崩壊して内包した抗体の抗原結合性断片を放出し得る。
　本発明では、抗体の抗原結合性断片を脳（例えば、脳の実質または脳の血管内皮細胞）に送達することができる。
　本発明では、抗体の抗原結合性断片は、細胞内の抗原に結合する抗体の抗原結合性断片、または、細胞外の抗原に結合する抗体の抗原結合性断片とすることができる。本発明では、好ましくは、抗原は、細胞内の抗原であり得る。
　本発明では、抗体の抗原結合性断片は、脳細胞内に発現し得る抗原に結合し得る。脳細胞内に発現し得る抗原としては、脳細胞以外の細胞にも発現する抗原の他、脳細胞に特異的に発現し得る抗原が挙げられる。
　本発明では、抗体の抗原結合性断片は、血管内皮細胞、脳神経細胞、アストロサイト、ペリサイト、及びマイクログリアからなる群から選択される細胞に発現する抗原に結合し得る。
　本発明では、抗体の抗原結合性断片は、脳の実質内に存在する抗原に結合し得る。本発明では、抗体の抗原結合性断片は、脳の実質内に存在する抗原に特異的に結合し得る。
　本発明では、抗体の抗原結合性断片は、アミロイドβ（Ａβ）に結合し得る。本発明では、抗体の抗原結合性断片は、Ａβ（例えば、Ａβ１－４２）に結合する３Ｄ６抗体の抗原結合性断片であり得る。本発明では、抗体の抗原結合性断片は、Ａβに結合することができ、Ａβの凝集体形成を阻害（または中和）し得る。本発明では、抗体の抗原結合性断片は、Ａβに結合することができ、Ａβの凝集体形成を阻害し得、これによってＡβの凝集体の形成を抑制すること、および／または、Ａβの凝集体を伴う疾患（例えば、アルツハイマー病）を処置することに用いることができる。本発明では、抗体の抗原結合性断片は、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、受容体相互作用セリンスレオニンキナーゼ１（ＲＩＰＫ１）、ＲＩＰＫ３、イズロン酸２－スルファターゼ、α－シヌクレイン、ＴＮＦ受容体関連デスドメイン（ＴＲＡＤＤ）、デスドメインを有するＦａｓ関連タンパク質（ＦＡＤＤ）、骨髄細胞に発現する誘発受容体２（ＴＲＥＭ２）、および、β－セクレターゼ（ＢＡＣＥ１）／Ｔａｕからなる群から選択される抗原に結合し得る。ＬＲＲＫ２に結合する抗体の抗原結合性断片は、パーキンソン病の処置に用い得る。ＬＲＲＫ２に結合する抗体の抗原結合性断片は、Ｔａｕのリン酸化を抑制し得る。ＬＲＲＫ２に結合する抗体の抗原結合性断片は、ＬＲＲＫ２とＴａｕとの結合を阻害し得る。ＲＩＰＫ１に結合する抗体の抗原結合性断片は、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および／または多発性硬化症（ＭＳ）の処置に用い得る。抗体の抗原結合性断片は、ＲＩＰＫ１とＴＲＡＤＤとの結合、ＲＩＰＫ１とＦＡＤＤとの結合、ＲＩＰＫ１とＲＩＰＫ３との結合、および／または、ＴＲＡＤＤとＦＡＤＤとの結合を阻害し得る｛抗体の抗原結合性断片はどちらかの抗原に結合し得る｝。α－シヌクレインに結合する抗体の抗原結合性断片は、パーキンソン病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症などのシヌクレイノパチーの処置に用いられ得る。β－セクレターゼに結合する抗体の抗原結合性断片は、β－セクレターゼによるアミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を切断するβ－セクレターゼの活性を阻害し得る。β－セクレターゼに結合する抗体の抗原結合性断片は、β－セクレターゼとＡＰＰとの結合を阻害し得る。Ｔａｕに結合する抗体の抗原結合性断片は、Ｔａｕの非リン酸化型形態および／またはリン酸化型形態に結合し得る。Ｔａｕに結合する抗体の抗原結合性断片は、Ｔａｕのリン酸化形態に対して、非リン酸化形態に対するよりも強い親和性を有し得る。
　本発明のある態様では、抗体の抗原結合性断片は、細胞内の抗原に結合する。本発明のある態様では、抗原の中和活性を有する抗体であり得る。本発明のある態様では、抗体の抗原結合性断片は、相互作用する２つの物質の結合を中和する活性を有する抗体の抗原結合性断片であり得る。
　本発明では、抗体の抗原結合性断片は、脳内の抗原の検出のために用いられ得る。従って、抗体の抗原結合性断片は、脳内の抗原に結合し得る。検出のためには、抗体の抗原結合性断片は、標識（例えば、近赤外蛍光標識、蛍光標識、化学発光標識、放射線同位体標識など）をされていてもよい。標識されていない抗体の抗原結合性断片を脳内の抗原の検出のために用いる場合には、例えば、脳の切片を作製した上で、免疫組織化学分析においてなされるように、非標識抗体の抗原結合性断片を、当該断片に結合することができる標識した二次抗体で検出することができる。
　本発明では、抗体の抗原結合性断片に負の電荷を付与するために、抗体の抗原結合性断片に、酸性の置換基（例えば、カルボキシル基を有する置換基、例えば、１以上のカルボキシル基を含む負の電荷を有する置換基）を結合させることができる。ここで、「酸性の置換基」とは、体液（例えば、ヒトの体液、例えば、ヒトの血液）中で、酸性を有する基、例えば、カルボキシル基が挙げられる。本発明で用いられる１以上のカルボキシル基を含む負の電荷を有する置換基は、例えば、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）－ＣＯＯＨ｛ここで、Ｒ１およびＲ２は、上記で定義した通りである｝、好ましくは、－Ｃ（＝Ｏ）－ＣＨ＝Ｃ（Ｒ２）－ＣＯＯＨ｛ここで、Ｒ２は、上記で定義された通りである｝、および－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－ＣＯＯＨ｛ここで、Ｌ１およびＬ２は、上記で定義された通りである｝が挙げられる。例えば、本発明では、酸（例えば、カルボキシル基を有する置換基）と結合し、負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片を得るために、抗体の抗原結合性断片と酸無水物、例えば、フラン環を有する酸無水物、例えば、式（Ｉａ）の化合物、例えば、シトラコン酸無水物、アコニット酸無水物；またはジカルボン酸（例えば、ジチオジカルボン酸）またはＮ－スクシンイミジル基と連結した－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－ＣＯＯＨとを反応させ得る。
　酸無水物は、抗体の抗原結合性断片と混合することによって、抗体の抗原結合性断片が有するペプチド側鎖のアミノ基と反応し、酸無水物と結合した抗体の抗原結合性断片を得ることができる。酸無水物と結合した抗体の抗原結合性断片は、低ｐＨ（例えば、細胞のエンドソームの環境）下において酸無水物と解離して、オリジナルの抗体の抗原結合性断片に変換され得る。
　酸無水物は、抗体が有するアミノ酸残基のアミノ基を有する側鎖と反応し得る。酸無水物と抗体が有するアミノ酸残基のアミノ基とが反応すると、酸無水物のフラン環の酸素原子とアミノ基とが反応し、フラン環が開環して、抗体のアミノ基が以下式（Ｖ）のように負の電荷を有する側鎖に変換される。以下式（Ｖ）では、式（Ｉａ）の化合物と抗体のアミノ基との反応によって精製される負電荷を有する側鎖が示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ｛式中、“Ａｂ”は、抗体または抗体の抗原結合性断片を表し、ｎは、抗体または抗体の抗原結合性断片に結合した無水物の数を示す。｝
　本発明によれば、負の電荷を有する、抗体の抗原結合性断片と、ポリエチレングリコールとポリカチオンとのブロック共重合体とを含む、ミセル（またはＰＩＣミセル）が提供される。
　本発明によれば、酸性の置換基（例えば、カルボキシル基を有する、例えば、１以上のカルボキシル基を含む負の電荷を有する置換基）と結合し、負の電荷を有する、抗体の抗原結合性断片と、ポリエチレングリコールとポリカチオンとのブロック共重合体とを含む、ミセル（またはＰＩＣミセル）が提供される。
　本発明によれば、本発明によるミセル（またはＰＩＣミセル）を含む医薬組成物が提供される。本発明のある態様では、本発明によるミセル（またはＰＩＣミセル）は、ＧＬＵＴ１リガンド（例えば、グルコース）によって表面が被覆されている。本発明によれば、本発明による医薬組成物は、脳に送達することに用いるための医薬組成物であり得る。本発明の医薬組成物は、血糖操作を行い、血糖値が上昇すると共に、血糖値が上昇した後に、または、血糖値が上昇する前に、対象に投与することができる。
　本発明によれば、抗体の抗原結合性断片を対象の脳に送達する方法であって、負の電荷を有する、抗体の抗原結合性断片（例えば、酸性の置換基（例えば、カルボキシル基を有する置換基、例えば、１以上のカルボキシル基を含む負の電荷を有する置換基）と結合し負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片）と、ポリエチレングリコールとポリカチオンとのブロック共重合体とを含み、当該ブロック共重合体の少なくとも一部がポリエチレングリコール側の末端でＧＬＵＴ１リガンド、例えば、グルコースと連結している、ミセルを、当該対象に投与する（例えば、静脈内投与する）ことを含む、方法が提供される。
　本発明によれば、脳（脳の実質または脳血管内皮細胞）に抗体の抗原結合性断片を送達することに用いるための組成物または医薬組成物の製造における、シトラコン酸無水物と結合し、負の電荷を有する、抗体の抗原結合性断片（例えば、酸性の置換基（例えば、カルボキシル基を有する置換基、例えば、１以上のカルボキシル基を含む負の電荷を有する置換基）と結合し負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片）と、ポリエチレングリコールとポリカチオンとのブロック共重合体とを含み、当該ブロック共重合体の少なくとも一部がポリエチレングリコール側の末端でＧＬＵＴ１リガンド、例えば、グルコースと連結しているミセルの使用が提供される。
　本発明によれば、脳（脳の実質または脳血管内皮細胞）に抗体の抗原結合性断片を送達することに用いるための組成物または医薬組成物であって、負の電荷を有する、抗体の抗原結合性断片（例えば、酸性の置換基（例えば、カルボキシル基を有する置換基、例えば、１以上のカルボキシル基を含む負の電荷を有する置換基）と結合し負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片）と、ポリエチレングリコールとポリカチオンとのブロック共重合体とを含み、当該ブロック共重合体の少なくとも一部がポリエチレングリコール側の末端でＧＬＵＴ１リガンド、例えば、グルコースと連結しているミセルを含む、組成物または医薬組成物が提供される。
　本発明によれば、脳（脳の実質または脳血管内皮細胞）に抗体の抗原結合性断片を送達することに用いるためのミセルであって、当該ミセルは、負の電荷を有する、抗体の抗原結合性断片（例えば、酸性の置換基（例えば、カルボキシル基を有する置換基、例えば、１以上のカルボキシル基を含む負の電荷を有する置換基）と結合し負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片）と、ポリエチレングリコールとポリカチオンとのブロック共重合体とを含み、当該ブロック共重合体の少なくとも一部がポリエチレングリコール側の末端でＧＬＵＴ１リガンド、例えば、グルコースと連結しているミセルが提供される。
　本発明の組成物または医薬組成物は、インビボにおける投与（特に、静脈内投与、脳室投与等）に適した形態で提供され得る。本発明の組成物または医薬組成物は、（ｉ）負の電荷を有する、抗体の抗原結合性断片（例えば、酸性の置換基（例えば、カルボキシル基を有する置換基、例えば、１以上のカルボキシル基を含む負の電荷を有する置換基）と結合し負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片）と、ポリエチレングリコールとポリカチオンとのブロック共重合体とを含み、当該ブロック共重合体の少なくとも一部がポリエチレングリコール側の末端でグルコースと連結しているミセルと、（ｉｉ）賦形剤とを含み得る。賦形剤としては、安定化剤、ｐＨ調整剤、等張剤、および医薬的に許容可能な塩などが挙げられる。
　本発明では、抗体の抗原結合性断片としては、ＦａｂまたはＦａｂ’が好ましく用いられ得る。本発明では、酸無水物としては、細胞内で酸無水物が解離して抗体の抗原結合性断片が回復する観点で、シトラコン酸が好ましく用いられ得る。本発明では、抗体の抗原結合性断片としては、ＦａｂまたはＦａｂ’が好ましく用いられ、かつ、酸無水物としては、シトラコン酸が挙げられ、本発明における断片の修飾に好ましく用いられ得る。シトラコン酸と抗体の抗原結合性断片とを反応させて得られる化合物は、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）－ＣＯＯＨ｛ここで、Ｒ１は水素であり、かつＲ２はメチルである｝でアミノ酸側鎖のアミノ基が置換された抗体の抗原結合性断片であり得る。本発明では、細胞内で酸無水物が解離して抗体の抗原結合性断片が回復する観点で、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－ＣＯＯＨで抗体の抗原結合性断片のアミノ酸側鎖のアミノ基を置換するためには、３，３’－ジチオジプロピオン酸モノ（Ｎ－スクシンイミジル）が挙げられ、本発明における断片の修に好ましく用いられ得る。本発明では、抗体の抗原結合性断片としては、ＦａｂまたはＦａｂ’が好ましく用いられ、かつ、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－ＣＯＯＨ｛ここで、Ｌ１およびＬ２がそれぞれ１，２－エチレン基である｝が挙げられ、本発明における断片の修飾に好ましく用いられ得る。
　本発明では、上記で説明された負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片とポリカチオンとを含むミセルが提供される。負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片とポリカチオンは、生理的条件下でミセルを形成し得る。本発明ではまた、負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片とポリカチオンとを含むポリイオンコンプレックスミセル（すなわち、ＰＩＣミセル）が提供される。本発明によれば、負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片とポリカチオンとを含むポリイオンコンプレックスミセルを含む、医薬組成物が提供される。本発明によれば、負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片とポリカチオンとを含むポリイオンコンプレックスミセルを含む医薬の製造における負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片の使用が提供される。負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片は、上記に例示した通りである。ポリカチオンは、上記に例示した通りである。
　本発明では、負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片とポリカチオンとを混合することを含む、方法が提供される。当該方法では、例えば、自発的にポリイオンコンプレックスミセルが産生される。当該方法は、ポリイオンコンプレックスミセルを製造する方法であり得、ポリイオンコンプレックスミセルを含む医薬組成物を製造する方法であり得る。
　本発明のポリカチオンは、例えば、親水性ブロックとのブロック共重合体であり得る。本発明のポリカチオンは、親水性ブロックとのブロック共重合体であり、かつ、親水性ブロックは、その末端においてＧＬＵＴ１リガンド（例えば、グルコース）で修飾され得る。このようなＧＬＵＴ１で修飾されたポリカチオンと負の電荷を有する抗体の抗原結合性断片とのポリイオンコンプレックスミセルは、例えば、静脈内投与により脳に送達することができる。この脳への送達の際には、投与対象を低血糖状態に維持し、その後、血糖上昇の前に、間に、または後に当該ポリイオンコンプレックスミセルを投与することができる。このようにすることで、上述のように、ポリイオンコンプレックスミセルが、効果的に脳の実質または血管内皮細胞に取り込まれることができる（例えば、ＷＯ２０１５／０７５９４２参照）。
（１）材料の入手
　α－メトキシ－ω－アミノポリ（エチレングリコール）（ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２）（ＰＥＧのＭｗは、５，０００であり、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０５であった）をＮＯＦ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．　（Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）から購入した。β－ベンジル－Ｌ－アスパルタートＮ－カルボキシ－アンヒドリド（ＢＬＡ－ＮＣＡ）をＣｈｕｏ　Ｋａｓｅｉｈｉｎ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．　（Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）から購入した。１，２：５，６－ジ－Ｏ－イソプロピリデン－α－Ｄ－グルコフラノシド（ＤＩＧ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）をＴｏｋｙｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．　（Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）から購入した。エチレンオキサイド（ＥＯ）をＮｉｐｐｏｎ　Ｅｋｉｔａｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　（Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）から入手し、ＣａＨ２を用いて常法により精製した。重合に用いた溶媒（テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ＣＨ２Ｃｌ２、およびＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））は、Ｎｉｋｋｏ　Ｈａｎｓｅｎ　＆　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．　（Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）から購入した中性アルミナのカラムを通過させることにより精製した。ベンズアルデヒド、Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ－ＰＢＳ（－））、Ｄ－（＋）－グルコース、および４％パラホルムアルデヒドを含むリン酸緩衝液を、Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，　Ｌｔｄ．　（Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）から購入した。細胞溶解緩衝液は、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　（Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）から購入した。抗ＰＥＣＡＭ１抗体（５５７３５５）は、ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ　（Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ，　ＮＪ）から購入した。抗Ｔｕｊ１抗体（ＭＭＳ－４３５Ｐ）は、Ｃｏｖａｎｃｅ　（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，　ＮＪ）から購入した。抗Ｉｂａ１抗体（０１９－１９７４１）はＷａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，　Ｌｔｄから購入した。抗ＧＦＡＰ抗体（ａｂ１６９９７）及び抗ＧＬＵＴ１抗体（ａｂ４００８４）は、Ａｂｃａｍ　（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，　ＵＫ）から購入した。抗Ｒａｂ１１ａ抗体（＃２４１３Ｓ）は、Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（Ｄａｎｖｅｒｓ，　ＭＡ）から購入した。Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａ１１０３４）、ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ａ１１００６）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体のＦ（ａｂ’）２断片、ＤＡＰＩ含有ＰｒｏＬｏｎｇ（商標）Ｇｏｌｄ退色防止剤は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　（Ｅｕｇｅｎｅ，　ＯＲ）から購入した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）は、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．から購入した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，　Ｉｎｃ．　（Ｋｙｏｔｏ，　Ｊａｐａｎ）から購入した。
（２）動物
　ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、５週齢）をＣｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｊａｐａｎ，　Ｉｎｃ．　（Ｙｏｋｏｈａｍａ，　Ｊａｐａｎ）から購入した。アルツハイマー病モデルマウス（ＡＰＰ／ＰＳ１）をＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。全ての動物実験は、ナノ医療イノベーションセンター（Ｋａｗａｓａｋｉ，　Ｊａｐａｎ）の実験動物の管理と使用に関する指針に従って行った。
（３）ポリマーの合成
　ＰＥＧとポリリジンとのブロック共重合体であるＰＥＧ－ＰＬｙｓは、分子量（Ｍｗ）５ｋのＰＥＧと重合度（ＤＰ）７０のポリリジンからなり、常法により合成した（例えば、文献１）。重合痔（ＤＰ）は、ＪＥＯＬ　ＡＬ　３００スペクトロメーター（ＪＥＯＬ　Ｌｔｄ．，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いて決定した。
　ＤＩＧ－ＰＥＧ－ＯＨは、ＷＯ２０１５０７５９４２Ａと同様に合成した。７０℃の進級中の反応チューブ中で昇華させ、ＤＩＧ（２６０　ｍｇ，　１．０　ｍｍｏｌ）をＴＨＦに溶解した。その後、このＤＩＧ溶液に０．３Ｍのナフタレンカリウムを含むＴＨＦ溶液を滴下した後に、Ａｒ雰囲気下で攪拌しながらＥＯ（２．３　ｍＬ，　４６　ｍｍｏｌ）を添加した。室温で４８時間攪拌し、１ｍＬのメタノールを添加した。混合物を氷冷ジエチルエーテルに攪拌条件下で滴下し、白色沈殿物を得てＤＩＧ－ＰＥＧ－ＯＨとした。
　ＤＩＧ－ＰＥＧ－ＯＨのω－ヒドロキシ基は、ＷＯ２０１５０７５９４２Ａ記載の通りにアミノ基に変換した。ＤＩＧ－ＰＥＧ－ＰＬｙｓは、上記と同様に合成した。ＮＭＲ測定によってＤＩＧ－ＰＥＧ－ＰＬｙｓにおけるＰＬｙｓの重合度は６６と決定された。その後、ＷＯ２０１５０７５９４２Ａ記載の通りにＤＩＧ－ＰＥＧ－ＰＬｙｓを脱保護してＰＥＧ末端にグルコースが付加したＰＥＧ－ＰＬｙｓ（Ｇｌｕｃ－ＰＥＧ－ＰＬｙｓ）を得た。
　Ｇｌｕｃ－ＰＥＧ－ＰｌｙｓとＰＥＧ－ＰＬｙｓの側鎖の一部に対して、スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）を用いてチオール基を導入した。ＰＥＧ－ＰＬｙｓ　（５１　ｍｇ，　１．９０　μｍｏｌ）を５重量％ＬｉＣｌを含む２ｍＬのＮ－メチルピロリドン（ＮＭＰ）に希釈し、およびＳＰＤＰ（３０　ｍｇ，　９６　μｍｏｌ）を５重量％ＬｉＣｌを含む６ｍＬのＮＭＰに希釈した。２．５　ｍＬのＳＰＤＰ溶液をＰＥＧ－ＰＬｙｓ溶液に添加し、１０％容積のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンを添加して室温で２４時間攪拌した。その後、混合液を２０倍を超える容量のジエチルエーテル中で沈殿させた。沈殿物をジエチルエーテルで２回洗浄し、白色粉末を得た。白色粉末を０．０１ＮのＨＣｌ溶液に溶解し、蒸留水で一晩透析し、凍結乾燥して最終生成物を得た。重水中２５℃で測定された１Ｈ　ＮＭＲにおける、ＰＥＧ　（（ＯＣＨ２ＣＨ２，　δ）　３．５　ｐｐｍ）のメチレンプロトンの３－（２－ピリジルジチオ）プロピオニル基（（Ｃ５Ｈ４Ｎ，　δ）　７．２－８．３　ｐｐｍ）に対するピーク強度比からチオール化の度合いは２５と決定された。同様にして、チオールの導入度合いが２０である、Ｇｌｕｃ－ＰＥＧ－Ｐ（Ｌｙｓ－ＰＤＰ）を得た。
（４）シトラコン酸無水物で修飾したＦａｂ’　（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）の調製
　市販のＦ（ａｂ’）２断片からＦａｂ’断片を得た。０．５　ｍｇ／ｍＬのＦ（ａｂ’）２断片を０．５　ｍＭ　ＤＴＴ溶液中で３７℃で３０分間攪拌した。生成物を限外ろ過で３回精製した（Ｖｉｖａｓｐｉｎ　６，　ＭＷＣＯ：　３０　Ｋ）。Ｆａｂ’断片溶液をＮａＨＣＯ３緩衝液（０．１Ｍ，　ｐＨ　＝　９．０）で希釈して、０．５　ｍｇ／ｍＬのＦａｂ’断片溶液を得て、４℃で１０分間攪拌した。アミン基の５倍量のシトラコン酸無水物を溶液にゆっくりと添加し、その後、室温で１時間攪拌した。得られた修飾体を限外ろ過により１０　ｍＭ　ＰＢ緩衝液（ｐＨ７．４）を用いて精製した。修飾されたアミンの度合いは、６５％であることをレルオレスカミン法で決定した。Ｆａｂ’断片の修飾体（６　μＬ，　０．４　ｍｇ／ｍＬ；　０．１Ｍ　ＰＢ緩衝液）をフルオレスカミン（３　μＬ，　３　ｍｇ／ｍＬ；　ＤＭＦ）中で室温で１０分間インキュベートし、蛍光をＮＤ－３３００　ｆｌｕｏｒｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ　（Ｎａｎｏｄｒｏｐ，　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，　ＤＥ，　ＵＳＡ）を用いて測定した。得られたシグナルをＢＳＡの希釈系列を用いた標準キャリブレーション曲線に基づいて一級アミンの濃度に変換した。
（５）蛍光相関分光法（ＦＣＳ）によるミセルの測定
　Ａｌｅｘａ６４７標識Ｆａｂ’－ｃｉｔを内包したミセルを１０％　ＦＢＳおよび１５０　ｍＭ　ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液（１０　ｍＭ，　ｐＨ　７．４）（Ｆａｂ’濃度：１μｇ／ｍＬ）中で規定した時間インキュベートした。これらのミセルを８ウェルガラスチャンバーに写し、Ｃｏｎｆｏｒｃｏｒ３モジュールとＣ－Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ　４０×水浸対物レンズを備えたＣＬＳＭ（ＬＳＭ８８０，　Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察した。資料は、６３３　ｎｍのＨｅ－Ｎｅレーザーを用いて励起し、６５０　ｎｍのパスフィルターを通して蛍光を検出した。ミセルの拡散時間は、Ｚｅｉｓｓ　Ｃｏｎｆｏｃｏｒ　３　ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて得た。
（６）ミセル１つ当たりに内包されたＦａｂ’－ｃｉｔの数の評価
　ミセルに内包されたＦａｂ’の数をミセルの分子量に従って算出した。ミセルの安定性を向上させるため、１０　ｍｇ／ｍＬのＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ’－エチルカルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）溶液２００μＬを、４００μＬの調製済みのＦａｂ’を内包したミセル溶液に添加して１５時間インキュベートし、架橋する共有結合を形成させた。ミセルの分子量は、ｐｒｏｔｅｏｍｅＬａｂＴＭ ＸＬ－１　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｉｎｃ．，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）の分析的超遠心システムを用いて、Ａｌｅｘａ４８８のＦａｂ’標識色素の吸光をモニターすることによって評価した。一例としてグルコース修飾率が２５％であるＦａｂ’－ｃｉｔ内包ミセル（２５％　Ｇｌｕｃ　（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍ）を測定してミセル１つ当たりに内包されたＦａｂ’の数を評価した。
　ミセルのモル平均分子量（Ｗｍ）は、約２，０００，０００Ｄａであり（図１２参照）、Ｆａｂ’の分子量（Ｗｆ）は、約５０，０００Ｄａであり、ＭｅＯ－ＰＥＧ－ｐ（Ｌｙｓ－ＰＤＰ）｛ＰＥＧ部分が５ｋ、Ｌｙｓの重合度は７０、そのうちＰＤＰの修飾は２５｝の分子量は，１７８５７Ｄａであり、Ｇｌｕｃ－ＰＥＧ－ｐ（Ｌｙｓ－ＰＤＰ）｛ＰＥＧ部分が５ｋ、Ｌｙｓの重合度は６６、そのうちＰＤＰの修飾は２０｝の分子量は、１７１４６．６Ｄａであった。
　ミセルにおいてＦａｂ’に対するポリマーのモル比は、２．６５であると仮定すると、下記式により、ミセル１つに内包されたＦａｂ’の数（Ｎｆ）およびポリマーの数（Ｎｐ）はそれぞれ、５４．７および２０．６であると計算された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000006
（７）インビトロにおけるミセルからのＦａｂ’の放出
　２５％　Ｇｌｕｃ　（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍを４群に分けて、３７℃条件下で、ｐＨ７．４、ｐＨ５．５、ｐＨ７．４かつ２ｍＭグルタチオン（ＧＳＨ）、およびｐＨ５．５かつ２ｍＭ　ＧＳＨ（１００　ｍＭ　ＰＢＳ溶液、１５０　ｍＭ　ＮａＣｌを含む）でインキュベートした。放出されたＦａｂ’を３００，０００　Ｄａのカットオフサイズを有するＶｉｖａｓｐｉｎｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ　ｆｉｌｔｅｒ　（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、１５００Ｇの速度（かつ異なる時間）で回収した。放出Ｆａｂ’の定量に関しては、Ａｌｅｘａ４８８標識Ｆａｂ’の蛍光強度をＩｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００　Ｐｒｏ　ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ　（Ｔｅｃａｎ，　Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて測定した。
（８）ポリイオンコンプレックスミセル（ＰＩＣミセル）の調製と特性分析
　Ｆａｂ’内包グルコース修飾ミセル（Ｇｌｕｃ／ｍ）およびＦａｂ’内包グルコース非修飾ミセル（Ｎｕｌｌ／ｍ）はそれぞれ、下記の通り調製した。まず、様々な容積比率でＧｌｕｃ－ＰＥＧ－Ｐ（Ｌｙｓ－ＰＤＰ）　（０．５　ｍｇ／ｍｌ）とＭｅＯ－ＰＥＧ－Ｐ（Ｌｙｓ－ＰＤＰ）　（０．５　ｍｇ／ｍｌ）を混合して、グルコース修飾率の異なるミセル（０％、２５％、５０％、および１００％）を調製した。ポリマーを３７℃で２００　ｍＭ　ジチオスレイトール（ＤＴＴ）中でインキュベートしてポリマー中に遊離チオール基を露出させた。溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ　６を用いて３回精製した。カットオフ分子量は、１０，０００　Ｄａとし、１０　ｍＭ　ＰＢを用いた。調製した６０　μＬの０．４　ｍｇ／ｍＬのＦａｂ’誘導体（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）を、０．５％　ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むＰＢ中で、得られたポリマー溶液（０．５　ｍｇ／ｍＬ）と混合（モル比：ポリマー／Ｆａｂ’　＝　２．６５）した。その後、溶液を室温で２４時間インキュベートした。
　Ｆａｂ’内包ミセルの粒径分布に関する動的光散乱の測定は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ９０　（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ．，　Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，　ＵＫ）を用い、ＰＢ緩衝液（１０　ｍＭ，　ｐＨ　７．４）で２５℃条件下で行った。ミセルの透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）像は、５μＬのミセル溶液（０．１５　ｍｇ／ｍＬのＦａｂ’を含む）をカーボン被覆メッシュ銅グリッド上に配置した。２重量％の酢酸ウランを含むエタノール溶液（水／エタノール＝１／１）で染色し、過剰な染色液を除去した後でＪＥＭ－１４００　（ＪＥＯＬ　Ｌｔｄ．，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いてサンプルを観察した。
（９）インビトロにおけるミセルの細胞内取り込み
　Ｃａｃｏ－２細胞を１ウェル当たり５，０００細胞の密度で９６割るプレートに播種した。２４時間の培養後、Ｃａｃｏ－２細胞をＰＢＳ中で１時間インキュベートして栄養枯渇させた。次いで、細胞をＡｌｅｘａ６４７標識したＦａｂ’－ｃｉｔを搭載したＧｌｕｃ／ｍ（０％のＮｕｌｌ／ｍ、２５％のＧｌｕｃ／ｍ、５０％のＧｌｕｃ／ｍ、及び１００％のＧｌｕｃ／ｍ）及び遊離Ｆａｂ’－ｃｉｔで処理した。３または６時間のインキュベート後に、Ｃａｃｏ－２細胞を回収して、溶解緩衝液で処理し、その後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００　ＰＲＯ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いてＦａｂ’－ｃｉｔの取り込みを定量した。
（１０）インビボにおけるＦａｂ’の蓄積
　インビボにおけるＦａｂ’の分布を分析するために、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、６週齢、ｎ＝５）を２４時間絶食させた。その後、マウスに２０重量％のＤ－（＋）－グルコースを含む２００μＬ　のＤ－ＰＢＳ（－）を腹腔内投与し、３０分後に、０．１５　ｍｇ／ｍｌ　Ａｌｅｘａ　６４７標識Ｆａｂ’内包ミセルまたは遊離Ｆａｂ’を含む２００μＬの１０　ｍＭ　ＰＢを静脈内投与した。マウスは、ミセルの投与から９０分後に過剰の血液をＤ－ＰＢＳ（－）の灌流で洗い流すことにより、犠牲にした。脳、肺、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、及び大腿筋を摘出し、Ｄ－ＰＢＳ（－）で洗浄した。洗浄液を取り除いてから、これらの臓器の重量を計量し、６００μＬの溶解緩衝液でホモジェナイズした。下大静脈から回収した血液をヘパリン処理し、遠心分離して血漿を得た。Ｆａｂ’の蓄積は、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００　ＰＲＯ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ　（Ｔｅｃａｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｌｔｄ．，　Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，　Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いた蛍光計測によって評価した。
（１１）ミセルの血液脳関門（ＢＢＢ）通過の直接観察
　２４時間絶食させたマウスを２．５％イソフルラン（Ａｂｂｏｔｔ，　Ｎｏｒｔｈ　Ｃｈｉｃａｇｏ，　ＩＬ）を用いて麻酔し、マウスの頭蓋を部分的に切除して開き、ｔｈｅｒｍｏｐｌａｔｅ　（Ｔｏｋａｉ　Ｈｉｔ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）の上に載せた。適切な圧力下で、脳表面にカバーガラス（Ｍｕｔｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，　Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を接触させた。その後、マウスに２０重量％のＤ－（＋）－グルコース溶液を腹腔内投与し、３０分後に０．１５　ｍｇ／ｍｌ　Ａｌｅｘａ　６４７標識Ｆａｂ’内包ミセルを含む２００μＬの１０　ｍＭ　ＰＢを静脈内投与した。ミセルがＢＢＢを通過することは、正立ＥＣＬＩＰＳＥ　ＦＮ１　（Ｎｉｋｏｎ　Ｃｏｒｐ．，　Ｊａｐａｎ）に装着されたＡ１Ｒ共焦点レーザー走査顕微鏡システム（Ｎｉｋｏｎ　Ｃｏｒｐ．，　Ｊａｐａｎ）を用いて観察した。
（１２）脳の組織切片の免疫組織化学分析
　マウスを２４時間絶食させて、２０重量％グルコース溶液を腹腔内に投与した。３０分後に、Ａｌｅｘａ６４７標識したＦａｂ’を内包したミセル（ここでは、２５％　Ｇｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍ）を当該マウスに静脈内投与した。４８時間後に、マウスを犠牲にして、１５　ｍＬのＰＢＳと４％パラホルムアルデヒド溶液で灌流した。脳を回収し、４％パラホルムアルデヒド溶液中で一晩固定し、その後、２０重量％スクロース溶液および３０重量％スクロース溶液に４℃で一晩浸漬した。脳を液体窒素中で凍結させ、ＣＭ３０５０　Ｓ　ｃｒｙｏｓｔａｔ　（Ｌｅｉｃａ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，　Ｗｅｔｚｌｅｒ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１４μｍ圧の切片にスライスした。切片をＴｕｊ１　（１：３００），　ＰＥＣＡＭ１　（１：３００），　ＧＦＡＰ　（１：１００）　および　Ｉｂａ１　（１：３００）に対する抗体で免疫標識し、Ａｌｅｘａ４８８標識二次抗体とインキュベートして、神経細胞、脳毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣｓ）、アストロサイト、およびマイクログリアをそれぞれ可視化した。全ての切片をＤＡＰＩによる核染色の後に共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察して画像を取得した。
（１３）チオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイ
　ＴｈＴアッセイによってＡβ１－４２の凝集体に対する３Ｄ６　Ｆａｂの影響を調べた。Ａβ１－４２を溶解したヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を風乾させ、その後、５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に２０μＭの一定濃度で溶解し、様々なＦａｂ／Ａβ１－４２のモル比を達成するために３Ｄ６　Ｆａｂを添加した。１０μＭのＴｈＴを溶液に添加してＩｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００　ＰＲＯ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（励起波長４４０ｎｍ、蛍光波長４８０ｎｍ）を用いて、室温でＡβ凝集体をモニターした。
（１４）アミロイドβ（Ａβ）プラークの阻害
　６週齢のＡＰＰ／ＰＳ１マウスを３つの群（ｎ＝５）に分けた。毎週、２４時間絶食させたマウスに２００μＬの２０重量％のＤ－（＋）－グルコース溶液を腹腔内投与し、その３０分後に、マウスに１．６　ｍｇ／ｍＬの３Ｄ６　Ｆａｂ－ｃｉｔを内包した２５％のＧｌｕｃ／ｍを静脈内投与した。ＰＢＳを投与されたマウスを対象とした。処理前のＡＰＰ／ＰＳ１のＡβの量を処理開始時間（時間０）において分析した。１０週間の処理後に、マウスを犠牲にしてＰＢＳで灌流し、脳を回収した。可溶性Ａβの抽出のために、回収した脳を６００μＬプロテアーゼインヒビター（Ｓｉｇｍａ）および１５０　ｍＭ　ＮａＣｌを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液でホモジェナイズし、その後、分解性Ａβの抽出のためにプロテアーゼインヒビターを含む７００μＬのｔｉｓｓｕｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｂｕｆｆｅｒ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でホモジェナイズした。得られた組織溶解物を抗Ａβ１－４２　サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｗａｋｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いて分析した。
結果
Ｇｌｕｃ　（Ｆａｂ’）／ｍの形成と特性分析
　Ｇｌｕｃ－ＰＥＧ－Ｐ（Ｌｙｓ－ＰＤＰ）およびＭｅＯ－ＰＥＧ－Ｐ（Ｌｙｓ－ＰＤＰ）を図６～１０に記載される通りに合成した。ε－トリフルオロアセチル－Ｌ－リジンＮ－カルボキシアンヒドリドのＤＩＧ－ＰＥＧ－ＮＨ２およびＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２の出発材料との開環重合を行った。ＤＩＧ－ＰＥＧ－ｐＬｙｓ（ＴＦＡ）およびＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＬｙｓ（ＴＦＡ）のジブロック共重合体におけるｐＬｙｓ（ＴＦＡ）の制御された重合度は１Ｈ　ＮＭＲにより決定されたように、それぞれ６６及び７０であった。ｐＬｙｓ（ＴＦＡ）及びＤＩＧの脱保護の後で、Ｇｌｕｃ－ＰＥＧ－ＰＬｙｓおよびＭｅＯ－ＰＥＧ－ＰＬｙｓを得た（図８および９参照）。ポリマーにおける約２０％のＬｙｓがそのアミノ基においてＳＰＤＰで修飾され、Ｇｌｕｃ－ＰＥＧ－ｐ（Ｌｙｓ－ＰＤＰ）及びＭｅＯ－ＰＥＧ－ｐ（Ｌｙｓ－ＰＤＰ）を得た（図７および８参照）。
　Ｇｌｕｃ－ＰＥＧ－ｐ（Ｌｙｓ－ＰＤＰ）およびＭｅＯ－ＰＥＧ－ｐ（Ｌｙｓ－ＰＤＰ）を、グルコースの修飾率が０％、２５％、５０％および１００％となるように様々なモル比で混合した。これらのポリマーにおけるジスルフィド結合は、１００　ｍＭ　ＤＴＴの存在下で３７℃で３時間還元し、遊離のチオール基をもたらした。超遠心による精製後、これらのポリマーを、Ｆａｂ’－ｃｉｔまたはスクシニルＦａｂ’（Ｆａｂ’－ｓｕｃ）と混合して、０．５％　ＤＭＳＯを含む１０　ｍＭ　ＰＢ　（ｐＨ　７．４）中で室温で２４時間インキュベートし、ポリマー間に架橋ジスルフィド結合を形成させた。Ｇｌｕｃ　Ｆａｂ’／ｍを動的光散乱（ＤＬＳ）および透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて観察した（図２）。全てのＧｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍは、鋭い粒径分布（ＰＤＩ＜０．１５）と均質な球形形態を有し、粒径は約４５　ｎｍであった（図２、図１１および表１）。ミセルの分子量を分析し、２０．６５分子のＦａｂ’と５４．７分子のポリマーが１つのミセル中に含まれていると算出した。このことは、このナノキャリアシステムにおける５１．６％の高いＦａｂ’搭載効率を示すものである。
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　１０％　ＦＢＳを含むＰＢ緩衝液におけるミセルの安定性と分散時間を、蛍光相関分光法（ＦＣＳ）によって評価した（図１３参照）。緩衝液中におけるミセルの分散時間は、粒径と一貫した。ＰＢ緩衝液中では、Ｆａｂ’搭載ミセルは、遊離Ｆａｂ’よりも高い分散時間を示し、１０％　ＦＢＳを含むＰＢ緩衝液中において、明らかな変化を認めなかった。このことは、これらのミセルが血清中において極めて安定であることを示すものである。
　３７℃で様々なｐＨおよび還元条件下で、ミセルからのＡｌｅｘａ６４７標識Ｆａｂ’の放出を試験した。２　ｍＭ　ＧＳＨ溶液を脳内の還元環境を模擬するものとして用い、ｐＨ５．５のＰＢＳを細胞内ライソゾーム中の低ｐＨ条件を模擬するものとして用いた。放出されたＦａｂ’は、Ｖｉｖａｓｐｉｎ　６（カットオフ分子量１００，０００　Ｄａ、１０　ｍＭ　ＰＢＳ，　ｐＨ　７．４）を用いて回収し、Ａｌｅｘａ６４７標識の蛍光強度を定量した。ｐＨ７．４のＰＢＳにおいては２４時間のインキュベーション後においてもＦａｂ’の放出は約１０％に過ぎなかったのに対して、ｐＨ５．５環境下および還元条件下における２４時間後のミセルからのＦａｂ’の放出はそれぞれ、約４０％および約３５％であった。しかし、ｐＨ５．５の還元環境下では、ミセルからのＦａｂ’の放出は８０％を超えた（図２ｃ）。これらの結果は、今回作製したミセルが低ｐＨと還元環境の両方に対して感受性を有することを明確に示す。
インビトロでのミセルの細胞内取り込み
　ヒト大腸がん細胞株（Ｃａｃｏ－２）をＢＢＢの代替モデル（サロゲートモデル）の細胞培養モデルとして適用する（文献３２、３３）。そこで、抗体内包Ｇｌｕｃ／ｍ（ＰＩＣミセルなのでＧｌｕｃ／ＰＩＣｍとも称する）の細胞内取り込みに対するグルコース強度の影響をＣａｃｏ－２細胞株を用いて評価した。ＰＢＳ中での１時間の飢餓状態の後で、播種されたＣａｃｏ－２細胞をＡｌｅｘａ６４７標識Ｆａｂ’－ｃｉｔを内包したＧｌｕｃ／ＰＩＣｍ（グルコース修飾率０％、２５％、５０％、および１００％）および遊離Ｆａｂ’－ｃｉｔでそれぞれ処理した。３または６時間のインキュベーションの後で、Ｃａｃｏ－２細胞を回収し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００　ＰＲＯ　ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて分析した。結果は、図２ｄに示される通りであった。図２ｄに示されるように、遊離Ｆａｂ’－ｃｉｔで処理した細胞では、とても弱い蛍光強度しか観察されなかった。このことは、遊離Ｆａｂ’－ｃｉｔは、細胞内への取り込み効率が低いことを示す。これに対して、Ｇｌｕｃ／ＰＩＣｍ（グルコース修飾率０％、２５％、５０％、および１００％）のいずれにおいても、遊離Ｆａｂ’－ｃｉｔよりも高い細胞内への取り込み効率を示すことが蛍光強度から評価された（図２ｄ参照）。また、グルコース修飾されたミセルで処理された細胞で処置された細胞は、細胞内取り込み効率を向上させただけではなく、ミセル表面のグルコース密度依存的な取り込み効率の向上を示した。すなわち、グルコースによるミセル修飾の密度が増加すると、細胞内取り込み効率が向上した。この結果は、グルコース修飾ミセルと細胞膜上におけるグルコース輸送体との相互作用が、多価的であることを示唆するものであり、このことが細胞内へのミセルの取り込み効率に寄与していることを示すものである。
ミセルの血中滞留時間
　ミセルの血中滞留時間は、ミセルにより送達される薬剤の組織蓄積に大きく影響し得る。そこで、ミセルの血中滞留時間を、マウスの耳の静脈におけるリアルタイムの蛍光シグナル（共焦点顕微鏡を用いて得た）に基づいて評価した。Ａｌｅｘａ６４７標識した遊離Ｆａｂ’－ｃｉｔは半減時間（ｔ１／２）が８分であり、とても短い血液滞留性しか示さなかった（図３ａ参照）。これに対して、Ｇｌｕｃ／ＰＩＣｍ（グルコース修飾率０％、２５％、５０％、および１００％）のいずれにおいても、遊離Ｆａｂ’－ｃｉｔよりも長い血中滞留時間を示した。Ｇｌｕｃ／ＰＩＣｍ（グルコース修飾率０％、２５％、５０％、および１００％）の半減時間はそれぞれ、５９分、５３分、４８分、および３９分であった（図３ａ参照）。なお、Ｆａｂ’断片を含むミセルの血中滞留性は、インタクトの抗体（断片化前の全長の抗体）を含む同じ方法で作製されたミセルと比較して血中滞留性が顕著に長かった。
Ｆａｂ’－ｃｉｔの脳への蓄積
　これまでの研究から飢餓状態の対象の血糖を上昇させながらグルコース修飾したミセルを当該対象に投与すると、ミセルがＢＢＢを超えて脳の実質にまで到達することが明らかとなっている（ＷＯ２０１５０７５９４２Ａ）。そこで、グルコース修飾したミセルにＦａｂ’－ｃｉｔを内包させて脳への送達を観察した。Ｆａｂ’の脳組織への蓄積を算出することによって、Ｇｌｕｃ　（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍがＢＢＢを突破してＦａｂ’を脳神経系へ送達できたかを評価した。マウスを２４時間飢餓状態にして、その後、２０％のグルコース溶液を腹腔内投与した。血中グルコース濃度は３０分後に最大に達した。図１４に示されるように、グルコース投与前後の血糖濃度は、生理学的に耐えうるものであった。そして、Ａｌｅｘａ６４７標識したＦａｂ’－ｃｉｔを含むＧｌｕｃ　（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍと同様に標識した遊離Ｆａｂ’－ｃｉｔを尾静脈内投与した。投与９０分後にマウスを犠牲にし、脳を回収して洗浄してホモジェナイズした。その後、試料の蛍光強度をＩｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００　Ｐｒｏ　ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　ｒｅａｄｅｒ　（ＴＥＣＡＮ　Ｌｔｄ．）を用いて測定した。ミセル投与９０分後のＦａｂ’－ｃｉｔの脳への蓄積は図３ｂに示される通りであった。図３ｂに示されるように、遊離Ｆａｂ’－ｃｉｔはほとんど脳への蓄積を示さなかった（脳１ｇに対して用量の約０．０５％蓄積した）。また、グルコース修飾率０％のミセルは、脳への蓄積をほとんど示さなかった（脳１ｇに対して用量の約０．１％蓄積した）。これに対して、グルコース修飾率５０％および１００％のミセルはそれぞれ、脳１ｇに対して用量の約１．２２％および約０．４７％の蓄積を示した（図３ｂ参照）。また、グルコース修飾率２５％のミセルは、脳１ｇに対して用量の約２．９５％の蓄積を示した（図３ｂ参照）。この結果は、これまで報告された抗体の脳への蓄積の研究史において最高の蓄積量と考えられる。脳以外の組織では、グルコース修飾ミセルは、高い蓄積を示さなかった（図３ｃ参照）。Ｆａｂ’の高い蓄積が肝臓および腎臓において観察されたが、これは、投与されたミセルの残りがこれらの臓器においてクリアランスされている可能性を示唆するものである（図３ｄ参照）。培養系においてはグルコース修飾率の高いミセルの方が細胞
内への取り込み効率が高かったのに対して、インビボでは、グルコース修飾率の高いミセル（５０％および１００％）は、グルコース修飾率が２５％のミセルよりも脳への蓄積量は少なかった。グルコース修飾ミセルの脳の取り込みは、グルコースの多価効果に依存する一方で、強すぎる細胞表面への親和性は、ＢＢＢ内へのミセルの蓄積を誘発し、脳実質へのミセルの移行を阻害する可能性がある。上述のように１つのミセル当たり約５４．７本のポリマーが含まれている。そうすると１つのミセルを修飾するグルコースの個数は、１３．７個（修飾率２５％）、２７．３５個（修飾率５０％）、５４．７個（修飾率１００％）であると計算される。１つのミセルの表面積（Ｓ）は、５，９６０　ｎｍ２であるので（Ｓ＝４πｒ２、ｒは約２１．６　ｎｍ）、１つのグルコース当たりが占める面積は、４２７．７４　ｎｍ２（修飾率２５％），　２１３．８７　ｎｍ２（修飾率５０％）、および１０６．９４　ｎｍ２（修飾率１００％）と計算される。これに対して、１細胞あたり約８×１０５個のＧＬＵＴ１（グルコース輸送体）が発現していることを仮定し、脳毛細血管内皮細胞（ＢＣＥＣ）の表面積を約１．０×１０８ ｎｍ２と仮定し、かつ、２４時間の絶食条件下の低血糖の条件において全てのＧＬＵＴ１が細胞のルーメン側（血管内腔側）に発現していると仮定すると、１つのＧＬＵＴ１がＢＣＥＣ上で占める面積は約６２．５　ｎｍ２となる。ＢＣＥＣ上でのＧＬＵＴ１密度は、ミセル上でのグルコース密度よりも遙かに高いため、ミセル上のグルコース密度がミセルのＢＢＢ通過（ＢＣＥＣへのミセルの結合、ミセルの細胞内移行、ミセルの細胞内通過、および／またはミセルの脳実質側の細胞外への放出）において決定的要素となり得る。そして、本実施例の結果によれば、グルコース修飾率２５％のＧｌｕｃ　（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍが最も高い脳実質への蓄積を示した。
ＢＢＢを通過するＦａｂ’－ｃｉｔ内包ミセルの直接観察
　グルコース修飾率２５％のＧｌｕｃ　（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍ（以下、「２５％　Ｇｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍ」という）がＢＢＢを通過する過程の観察を試みた。まず、２４時間絶食したマウスに２０重量％のグルコース溶液を腹腔内投与した。その３０分後に、２５％　Ｇｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍを静脈投与した。Ａｌｅｘａ６４７標識したＦａｂ’－ｃｉｔを含む２５％　Ｇｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍの観察は、体内リアルタイム今日小弟レーザー走査顕微鏡法（ＩＶＲＴ－ＣＬＳＭ）により、蛍光シグナルに基づいて行った。ＩＶＲＴ－ＣＬＳＭによる脳の顕微鏡画像は、図４ａに示される通りであった。図４ａに示されるように、血管内の蛍光シグナル強度が迅速に最大に達し、その後、ゆっくりと低下した。この低下はおそらく組織への吸収による。ミセル投与の直後に、脳実質への蛍光強度の増加が観察されたが、このことは、２５％　Ｇｌｕｃ（Ｆａｂ’－ｃｉｔ）／ｍがＢＢＢを通過したことを示すものである。脳実質のいくつかの領域の蛍光強度を測定し、グラフ化した（図４ｂ参照）。蛍光シグナル強度は、ミセル投与２０分後に最大値に達した。
脳実質に送達されたＦａｂ’－ｃｉｔの分布プロファイル
　脳内に送達されたＦａｂ’－ｃｉｔの分布と局在をさらに調べた。脳の横断面の切片をＴｕｊ１、ＰＥＣＡＭ１、ＧＦＡＰ、およびＩｂａ１に対する抗体で染色してＣＬＳＭにより観察して、神経細胞、ＢＣＥＣ、アストロサイト、およびマイクログリアをそれぞれ観察し、脳内に送達されたＦａｂ’－ｃｉｔの細胞内分布を確認した。結果は、図４ｃ、４ｄ、４ｅおよび４ｆに示される通りであった。送達されたＦａｂ’は、主に神経細胞への蓄積を示し、マイクログリアには部分的な蓄積を示したが、ＢＣＥＣおよびアストロサイトには蓄積を示さなかった。抗体のこれらの細胞への送達の成功は、治療、診断、およびセラノスティクス（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ）への活用が期待される。
アルツハイマー病モデルマウスにおけるＡβプラーク形成の抑制
　抗Ａβモノクローナル抗体である３Ｄ６抗体は、可溶性Ａβおよび不溶性Ａβのいずれにも結合することができる。３Ｄ６抗体のＦａｂ断片をミセルによって脳に送達し、ＡＰＰ／ＰＳ１アルツハイマー病モデルマウスにおけるＡβプラーク形成を抑制することができるかを試験した。
　まず、インビトロにおいて、ＴｈＴアッセイによってインビトロでのＡβの凝集体形成を３Ｄ６抗体のＦａｂ断片が抑制できるかをまず調べた。結果は、図５ａに示されるように、Ａβの凝集体形成がミセル投与によって顕著に抑制された。Ａβ１－４２と３Ｄ６のＦａｂとのモル比に依存してＡβの凝集体形成は阻害されたが、モＡβ１－４２と３Ｄ６のＦａｂとのル比が５０：１である場合でさえ、Ａβの凝集体の形成が約６５％抑制された。そこで、インビボの実験では、２５％　Ｇｌｕｃ　（３Ｄ６　Ｆａｂ－ｃｉｔ）／ｍを用いた。２５％　Ｇｌｕｃ　（３Ｄ６　Ｆａｂ－ｃｉｔ）／ｍとは、シトラコン酸無水物処理した３Ｄ６のＦａｂ断片をグルコース修飾を有するＰＥＧ－カチオン性ブロックのブロック共重合体（２５％）およびグルコース修飾を有しないＰＥＧ－カチオン性ブロックのブロック共重合体（７５％）と混合して得られるミセルである。
　ＡＰＰ／ＰＳ１マウス（６週齢）に対して１．８　ｍｇ／ｋｇ　３Ｄ６　Ｆａｂの用量となるように２５％　Ｇｌｕｃ　（３Ｄ６Ｆａｂ－ｃｉｔ）／ｍを週１回の間隔で１０週間静脈内投与した。対照として、ＰＢＳまたは遊離Ｆａｂ’で同様に週１回の間隔で１０週間静脈内投与したＡＰＰ／ＰＳ１マウスを用いた。ミセル投与の前には、２４時間の絶食と、グルコース溶液投与による血糖上昇を行い、血糖が最大になるグルコース溶液投与の３０分後にミセルを投与した。
　これらのマウスにおけるＡβプラークの形成は、抗Ａβ１－４２　ＥＬＩＳＡを用いて実施した。ＡＰＰ／ＰＳ１マウスの処置前のＡβプラークの量は、処置開始時間（時間０）において測定した。２５％　Ｇｌｕｃ　（３Ｄ６　Ｆａｂ－ｃｉｔ）／ｍを静脈投与したマウスでは、１０週後において脳におけるＡβの沈着量が顕著に低かった（図５ｂ参照）。３Ｄ６抗体自体は、そのままではＡβプラークの低減効果を示すことはなかった（文献３４参照）。時間０との差分により算出される実験開始後に新しく形成されたＡβプラークの量は、２５％　Ｇｌｕｃ　（３Ｄ６　Ｆａｂ－ｃｉｔ）／ｍで処理したマウスでは、４７．６３　ｐｇ／ｍｇ－脳（脳１ｍｇ当たり４７．６３　ｐｇ）であり、３Ｄ６　Ｆａｂの遊離形態で処理したマウスでは、９４．２８　ｐｇ／ｍｇ－脳であった。従って、２５％　Ｇｌｕｃ　（３Ｄ６　Ｆａｂ－ｃｉｔ）／ｍは、脳内で新しく形成されるＡβプラークの約半分を抑制することができた。また、可溶型Ａβに関しては、２５％　Ｇｌｕｃ　（３Ｄ６　Ｆａｂ－ｃｉｔ）／ｍで処理したマウスでは、１９．５９　ｐｇ／ｍｇ－脳であり、遊離Ｆａｂで処理した場合の８９．８１　ｐｇ／ｍｇ－脳のわずか２１．８１％まで量が低減していた。ところで、シトラコン酸無水物処理した状態ではＦａｂは活性を示さない。Ｆａｂが脳内で活性を示したということは、脳内環境（特に、エンドソームの還元的な低ｐＨ環境）下においてシトラコン酸無水物が脱離して、設計通りに元々のＦａｂに変換されたことを示唆するものである。
　これらの結果から、本発明のグルコース修飾ミセルは、絶食およびグルコース投与による血糖操作と組み合わせることによって、シトラコン酸無水物処理した抗体、ＦａｂまたはＦａｂ’を脳内に送達することができ、かつ、シトラコン酸無水物処理は、脳内で解除されることが明らかとなった。
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１２．　Ｗｅｃ　ＡＺ，　Ｎｙａｋａｔｕｒａ　ＥＫ，　Ｈｅｒｂｅｒｔ　ＡＳ，　Ｈｏｗｅｌｌ　ＫＡ，　Ｈｏｌｔｓｂｅｒｇ　ＦＷ，　Ｂａｋｋｅｎ　ＲＲ，　ｅｔ　ａｌ．　Ａ　“Ｔｒｏｊａｎ　ｈｏｒｓｅ”　ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ－ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏｒ　ｂｒｏａｄ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｇａｉｎｓｔ　ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓｅｓ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０１６，　３５４（６３１０）：　３５０－３５４．

１３．　Ｙｕ　ＹＪ，　Ａｔｗａｌ　ＪＫ，　Ｚｈａｎｇ　Ｙ，　Ｔｏｎｇ　ＲＫ，　Ｗｉｌｄｓｍｉｔｈ　ＫＲ，　Ｔａｎ　Ｃ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｃｒｏｓｓ　ｔｈｅ　ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ　ｂａｒｒｉｅｒ　ｉｎ　ｎｏｎｈｕｍａｎ　ｐｒｉｍａｔｅｓ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２０１４，　６（２６１）：　２６１ｒａ１５４．

１４．　Ｐｅｒｃｈｅ　Ｆ，　Ｕｃｈｉｄａ　Ｓ，　Ａｋｉｂａ　Ｈ，　Ｌｉｎ　ＣＹ，　Ｉｋｅｇａｍｉ　Ｍ，　Ｄｉｒｉｓａｌａ　Ａ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　Ｂｒａｉｎ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉ－Ａｍｙｌｏｉｄ　ｂｅｔａ　ｓｃＦｖ　ｂｙ　Ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍＲＮＡ　Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ａ　Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ＰＥＧ－ｂａｓｅｄ　Ｂｌｏｃｋ　Ｃａｔｉｏｍｅｒ．　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　２０１７，　１４（３）：　２９５－３０２．

１５．　Ｅｙｓｔｅｒ　ＣＡ，　Ｈｉｇｇｉｎｓｏｎ　ＪＤ，　Ｈｕｅｂｎｅｒ　Ｒ，　Ｐｏｒａｔ－Ｓｈｌｉｏｍ　Ｎ，　Ｗｅｉｇｅｒｔ　Ｒ，　Ｗｕ　ＷＷ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｎｅｗ　ｃａｒｇｏ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｔｈａｔ　ｅｎｔｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｃｌａｔｈｒｉｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ．　Ｔｒａｆｆｉｃ　２００９，　１０（５）：　５９０－５９９．

１６．　Ｒｉｓｋｉｎ　Ａ，　Ｎａｎｎｅｇａｒｉ　ＶＨ，　Ｍｏｎｄ　Ｙ．　Ａｃｕｔｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ　ｏｆ　ＧＬＵＴ１　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｉｎ　ＣＩＴ３　ｍｏｕｓｅ　ｍａｍｍａｒｙ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ．　Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　２００８，　６３（１）：　５６－６１．

１７．　Ｇｒａｎｔ　ＢＤ，　Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ　ＪＧ．　Ｐａｔｈｗａｙｓ　ａｎｄ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ　ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ．　Ｎａｔｕｒｅ　ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｅｌｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ　２００９，　１０（９）：　５９７－６０８．

１８．　Ｌｅｔｏ　Ｄ，　Ｓａｌｔｉｅｌ　ＡＲ．　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｂｙ　ｉｎｓｕｌｉｎ：　ｔｒａｆｆｉｃ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ＧＬＵＴ４．　Ｎａｔｕｒｅ　ｒｅｖｉｅｗｓ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｅｌｌ　ｂｉｏｌｏｇｙ　２０１２，　１３（６）：　３８３－３９６．

１９．　Ｆｏｌｅｙ　Ｋ，　Ｂｏｇｕｓｌａｖｓｋｙ　Ｓ，　Ｋｌｉｐ　Ａ．　Ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ，　ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ，　ａｎｄ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｅｘｏｃｙｔｏｓｉｓ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　４．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０１１，　５０（１５）：　３０４８－３０６１．

２０．　Ｌａｊｏｉｅ　ＪＭ，　Ｓｈｕｓｔａ　ＥＶ．　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ｆｏｒ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ　ａｃｒｏｓｓ　ｔｈｅ　ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ　ｂａｒｒｉｅｒ．　Ａｎｎｕａｌ　ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　２０１５，　５５：　６１３－６３１．

２１．　Ｇｒａｂｒｕｃｋｅｒ　ＡＭ，　Ｒｕｏｚｉ　Ｂ，　Ｂｅｌｌｅｔｔｉ　Ｄ，　Ｐｅｄｅｒｚｏｌｉ　Ｆ，　Ｆｏｒｎｉ　Ｆ，　Ｖａｎｄｅｌｌｉ　ＭＡ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ａｃｒｏｓｓ　ｔｈｅ　ｂｌｏｏｄ　ｂｒａｉｎ　ｂａｒｒｉｅｒ．　Ｔｉｓｓｕｅ　ｂａｒｒｉｅｒｓ　２０１６，　４（１）：　ｅ１１５３５６８．

２２．　Ｆａｎ　Ｋ，　Ｊｉａ　Ｘ，　Ｚｈｏｕ　Ｍ，　Ｗａｎｇ　Ｋ，　Ｃｏｎｄｅ　Ｊ，　Ｈｅ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｆｅｒｒｉｔｉｎ　Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ　Ｔｒａｖｅｒｓｅｓ　ｔｈｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｂｒａｉｎ　Ｂａｒｒｉｅｒ　ａｎｄ　Ｋｉｌｌｓ　Ｇｌｉｏｍａ．　ＡＣＳ　ｎａｎｏ　２０１８，　１２（５）：　４１０５－４１１５．

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２４．　Ｐａｒｋ　ＴＥ，　Ｓｉｎｇｈ　Ｂ，　Ｌｉ　Ｈ，　Ｌｅｅ　ＪＹ，　Ｋａｎｇ　ＳＫ，　Ｃｈｏｉ　ＹＪ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　ＢＢＢ　ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｏｓｍｏｔｉｃａｌｌｙ　ａｃｔｉｖｅ　ｐｏｌｙ（ｍａｎｎｉｔｏｌ－ｃｏ－ＰＥＩ）　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｒａｂｉｅｓ　ｖｉｒｕｓ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｖｉａ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｖｅｏｌａｒ　ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ　ｆｏｒ　ＲＮＡｉ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ　ｉｎ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ．　Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ　２０１５，　３８：　６１－７１．

２５．　Ａｎｒａｋｕ　Ｙ，　Ｋｕｗａｈａｒａ　Ｈ，　Ｆｕｋｕｓａｔｏ　Ｙ，　Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ　Ａ，　Ｉｓｈｉｉ　Ｔ，　Ｎｉｔｔａ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｇｌｙｃａｅｍｉｃ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｂｏｏｓｔｓ　ｇｌｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ　ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ　ｃｒｏｓｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ＢＢＢ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｂｒａｉｎ．　Ｎａｔｕｒｅ　ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　２０１７，　８（１）：　１００１．

２６．　Ｑｉｎ　Ｙ，　Ｆａｎ　Ｗ，　Ｃｈｅｎ　Ｈ，　Ｙａｏ　Ｎ，　Ｔａｎｇ　Ｗ，　Ｔａｎｇ　Ｊ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｌｕｃｏｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｒａｉｎ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｄｒｕｇ　ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　２０１０，　１８（７）：　５３６－５４９．

２７．　Ｔｏｐｐｉｌａ　Ｓ，　Ｌａｕｒｏｎｅｎ　Ｊ，　Ｍａｔｔｉｌａ　Ｐ，　Ｔｕｒｕｎｅｎ　ＪＰ，　Ｐｅｎｔｔｉｌａ　Ｌ，　Ｐａａｖｏｎｅｎ　Ｔ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｌ－ｓｅｌｅｃｔｉｎ　ｌｉｇａｎｄｓ　ｉｎ　ｒａｔ　ｈｉｇｈ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ：　ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ　ｓｉａｌｙｌ　Ｌｅｗｉｓ　ｘ　ｇｌｙｃａｎｓ　ａｒｅ　ｈｉｇｈ－ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ　ａｄｈｅｓｉｏｎ．　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１９９７，　２７（６）：　１３６０－１３６５．

２８．　Ｌｅｅ　Ｙ，　Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ　Ｓ，　Ｂａｅ　Ｙ，　Ｈｉｋｉ　Ｓ，　Ｉｓｈｉｉ　Ｔ，　Ｋａｔａｏｋａ　Ｋ．　Ａ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ　ｆｒｏｍ　ｃｈａｒｇｅ－ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ｐｏｌｙｍｅｒ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｅｎｄｏｓｏｍａｌ　ｐＨ．　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　２００７，　１２９（１７）：　５３６２－５３６３．

２９．　Ｌｅｅ　Ｙ，　Ｉｓｈｉｉ　Ｔ，　Ｃａｂｒａｌ　Ｈ，　Ｋｉｍ　ＨＪ，　Ｓｅｏ　ＪＨ，　Ｎｉｓｈｉｙａｍａ　Ｎ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｈａｒｇｅ－ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎａｌ　ｐｏｌｙｉｏｎｉｃ　ｃｏｍｐｌｅｘ　ｍｉｃｅｌｌｅｓ－ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｉｎｔｏ　ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．　Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ　２００９，　４８（２９）：　５３０９－５３１２．

３０．　Ｓｕｎ　Ｘ，　Ｓｈｉｈ　ＡＹ，　Ｊｏｈａｎｎｓｓｅｎ　ＨＣ，　Ｅｒｂ　Ｈ，　Ｌｉ　Ｐ，　Ｍｕｒｐｈｙ　ＴＨ．　Ｔｗｏ－ｐｈｏｔｏｎ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｏｆ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｉｎ　ｉｎｔａｃｔ　ｂｒａｉｎ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｒｅｄｏｘ　ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ　ｉｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｎｅｕｒｏｎｓ　ａｎｄ　ｃｅｌｌｓ　ａｔ　ｔｈｅ　ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ　ｆｌｕｉｄ　ａｎｄ　ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．　Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２００６，　２８１（２５）：　１７４２０－１７４３１．

３１．　Ｓａｔｏｈ　Ｔ，　Ｙｏｓｈｉｏｋａ　Ｙ．　Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｅｄｕｃｅｄ　ａｎｄ　ｏｘｉｄｉｚｅｄ　ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｔｏ　ｓｉｇｎａｌｓ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｍａｇｎｅｔｉｃ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ　ａｓ　ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ　ｏｆ　ｌｏｃａｌ　ｂｒａｉｎ　ｒｅｄｏｘ　ｓｔａｔｅ．　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　２００６，　５５（１）：　３４－３９．

３２．　Ｈａｋｋａｒａｉｎｅｎ　ＪＪ，　Ｊａｌｋａｎｅｎ　ＡＪ，　Ｋａａｒｉａｉｎｅｎ　ＴＭ，　Ｋｅｓｋｉ－Ｒａｈｋｏｎｅｎ　Ｐ，　Ｖｅｎａｌａｉｎｅｎ　Ｔ，　Ｈｏｋｋａｎｅｎ　Ｊ，　Ｍｏｎｋｋｏｎｅｎ　Ｊ，　Ｓｕｈｏｎｅｎ　Ｍ，　Ｆｏｒｓｂｅｒｇ　ＭＭ．　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｃｅｌｌ　ｍｏｄｅｌｓ　ｉｎ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｂｒａｉｎ　ｅｎｔｒｙ　ｏｆ　ｄｒｕｇｓ．　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ　２０１０，４０２　（１－２）：　２７－３６．

３３．　Ｈｅｌｌｉｎｇｅｒ　Ｅ，　Ｖｅｓｚｅｌｋａ　Ｓ，　Ｔｏｔｈ　ＡＥ，　Ｗａｌｔｅｒ　Ｆ，　Ｋｉｔｔｅｌ　Ａ，　Ｂａｋｋ　ＭＬ，　Ｔｉｈａｎｙｉ　Ｋ，　Ｈａｄａ　Ｖ，　Ｎａｋａｇａｗａ　Ｓ，　Ｄｕｙ　ＴＤ，　Ｎｉｗａ　Ｍ，　Ｄｅｌｉ　ＭＡ，　Ｖａｓｔａｇ　Ｍ．　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｂｒａｉｎ　ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ　ａｎｄ　ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　（ＭＤＣＫ－ＭＤＲ１，　Ｃａｃｏ－２，　ａｎｄ　ＶＢ－Ｃａｃｏ－２）　ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ　ｓｕｒｒｏｇａｔｅ　ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ　ｂａｒｒｉｅｒ　ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ　ｍｏｄｅｌｓ．　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ　２０１２，８２（２）：３４０－５１．

３４．　ＤｅＭａｔｔｏｓ　ＲＢ，　Ｌｕ　Ｊ，　Ｔａｎｇ　Ｙ，　Ｒａｃｋｅ　ＭＭ，　ＤｅＬｏｎｇ　ＣＡ，　Ｔｚａｆｅｒｉｓ　ＪＡ，　Ｈｏｌｅ　ＪＴ，　Ｆｏｒｓｔｅｒ　ＢＭ，　ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ　ＰＣ，　Ｌｉｕ　Ｆ，　Ｋｉｎｌｅｙ　ＲＤ，　Ｊｏｒｄａｎ　ＷＨ，　Ｈｕｔｔｏｎ　ＭＬ．　Ａ　Ｐｌａｑｕｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃｌｅａｒｓ　Ｅｘｉｓｔｉｎｇ　β－ａｍｙｌｏｉｄ　Ｐｌａｑｕｅｓ　ｉｎ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｍｉｃｅ．　Ｎｅｕｒｏｎ　２０１２，　７６（５）：　９０８－９２０．

３５．　Ｂａｒｔｏｌｉｎｉ　Ｍ，　Ｎａｌｄｉ　Ｍ，　Ｆｉｏｒｉ　Ｊ，　Ｖａｌｌｅ　Ｆ，　Ｂｉｓｃａｒｉｎｉ　Ｆ，　Ｎｉｃｏｌａｕ　ＤＶ，　Ａｎｄｒｉｓａｎｏ　Ｖ．　Ｋｉｎｅｔｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｍｙｌｏｉｄ－ｂｅｔａ　１－４２　ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍｕｌｔｉｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ．　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２０１１，４１４（２）：２１５－２５．


 

Claims (10)

  1. 　負の電荷を有する、抗体の抗原結合性断片。
  2. 　１以上のカルボキシル基を含む負の電荷を有する置換基を有し、これにより負の電荷を有する、請求項１に記載の抗体の抗原結合性断片。
  3. 　１以上のカルボキシル基を含む負の電荷を有する置換基が、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）－ＣＯＯＨ｛ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、置換されていてもよいアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、Ｒ１およびＲ２の炭素原子の少なくとも１つはカルボキシル基で置換されていてもよい｝、および－Ｃ（＝Ｏ）－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－ＣＯＯＨ｛ここで、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、置換されていてもよいアルキレン、アルケニレン、またはアルキニレンである｝からなる群から選択される、請求項２に記載の抗体の抗原結合性断片。
  4. 　脳内の抗原に結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体の抗原結合性断片。
  5. 　抗体の抗原結合性断片が、ＦａｂまたはＦａｂ’である、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体の抗原結合性断片。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体の抗原結合性断片を含む、ミセル。
  7. 　グルコースによってその表面が修飾された、請求項６に記載のミセル。
  8. 　請求項７に記載のミセルであって、ポリエチレングリコールとポリカチオンとのブロック共重合体とを含み、当該ブロック共重合体の少なくとも一部がポリエチレングリコール側の末端でグルコースと連結している、ミセル。
  9. 　抗体の抗原結合性断片を脳の実質に送達することに用いるための組成物であって、
    　請求項７または８に記載のミセルを含む、組成物。
  10. 　脳内のＡβの蓄積を抑制することに用いるための医薬組成物であって、
    　負の電荷を有する、Ａβの凝集体形成を中和する抗体の抗原結合性断片を含む、請求項８に記載のミセルを含む、医薬組成物。

     
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