WO2021230375A1 - ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーによって還元環境下または低ｐＨ環境下において開裂可能に修飾されたペプチドおよび該ペプチドを含む抗体 - Google Patents

ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーによって還元環境下または低ｐＨ環境下において開裂可能に修飾されたペプチドおよび該ペプチドを含む抗体 Download PDF

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泰孝 安楽
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Definitions

  • the present invention relates to a peptide that is cleavable in a reducing environment or a low pH environment with a non-charged hydrophilic polymer modified with a GLUT1 ligand.
  • the present invention also relates to an antibody containing the above peptide.
  • the development of a drug delivery system is to efficiently and selectively deliver the contained drug to a target tissue or organ.
  • the drug delivery system can play a role in increasing the retention of the contained drug in the blood.
  • Patent Document 1 discloses micelles whose surface is modified with glucose. Patent Document 1 clarifies that when an antibody conjugated with a GLUT1 ligand is administered while performing blood glucose manipulation, the accumulation of the conjugated antibody in the brain is significantly increased.
  • the present invention provides a peptide modified to be cleaved by a non-charged hydrophilic polymer modified with a GLUT1 ligand in a reducing environment or a low pH environment, and an antibody containing the peptide.
  • the present inventors have invented peptides and antibodies modified to be cleaved in a reducing environment or a low pH environment with a non-charged hydrophilic polymer modified with a GLUT1 ligand.
  • the linker is a peptide that can be cleaved with the modified moiety in the reduced environment of the brain parenchyma or in a low pH environment such as pH in the endosome of vascular endothelial cells, and its physiological activity in the brain (In particular, in the case of an antibody, it has been found that its binding property, which is reduced by modification, can be improved. It is clear from the examples that the same applies when the peptide is an antibody and when the antibody contains the peptide.
  • a non-charged hydrophilic polymer segment eg, polyethylene glycol or polyoxazoline
  • the uncharged hydrophilic polymer segment modified with the GLUT1 ligand and the peptide are ligated via a linker that can be cleaved in a reducing environment or in a low pH environment of pH 6.5 or less, whereby under a reducing environment.
  • the peptide according to the above [1] which is cleavably modified with the above segment in an environment of pH 6.5 or less.
  • the linker is -CO-OL 1- S-S-L 2- ⁇ where L 1 is a substituted or unsubstituted alkylene or a substituted or unsubstituted heteroalkylene, and L 2 is blood.
  • amide bond including amide bond
  • L 2 is uncharged.
  • composition for use in brain imaging which comprises the antibody according to the above [10].
  • composition according to the above [11] or [12] which is administered according to the following administration plan. Lowering the subject's blood sugar and then Inducing an increase in blood glucose level so that more antibody is transferred to the brain parenchyma in the subject as compared with the case where the increase in blood glucose level is not induced, and in the above [11] or [12]. Including administering the described composition, Composition.
  • the uncharged hydrophilic polymer segment and the peptide are linked via a linker that can be cleaved in a reducing environment or an environment of pH 6.5 or less, whereby the environment of reducing environment or pH 6.5 or less is used.
  • the linker is -CO-OL 1- S-S-L 2- ⁇ where L 1 is a substituted or unsubstituted alkylene or a substituted or unsubstituted heteroalkylene, and L 2 is blood.
  • L 2 is a stable linker in the flow ⁇ , linked via an amide bond to the side chain amino group of a lysine residue of the peptide, L 2 are connected to the uncharged hydrophilic polymer segment, according to the above [15] peptide.
  • the binding property to the antigen is 5% or less as compared with the unmodified antibody.
  • An antibody (modified antibody) cleavable with the above segment in a reducing environment or in an environment of pH 6.5 or less with a non-charged hydrophilic polymer segment (eg, polyethylene glycol or polyoxazoline) modified with GLUT1 ligand. ), The binding property to the antigen is 1% or less or disappears as compared with the unmodified antibody.
  • the antibody according to the above [17] wherein the antibody binds to a cell surface antigen or an extracellular antigen in the brain parenchyma.
  • [2A] The uncharged hydrophilic polymer segment modified with the GLUT1 ligand and the peptide are linked via a cleavable linker in a reducing environment or in an environment of pH 6.5 or less, whereby the reducing environment or pH 6 is used. ..
  • the linker is -CO-OL 1- S-S-L 2- ⁇ where L 1 is a substituted or unsubstituted alkylene or a substituted or unsubstituted heteroalkylene, and L 2 is a bond.
  • a blood-stable linker ⁇ linked to the side chain amino group of the lysine residue of the antibody via an amide bond, and L 2 linked to the uncharged hydrophilic polymer segment, supra.
  • [7A] The antibody according to the above [6A], wherein the extracellular antigen is A ⁇ 1-40.
  • [8A] The antibody according to any one of the above [1A] to [6A], which is further linked to a cytotoxic agent.
  • [9A] The antibody according to any one of [1A] to [7A] above, which is further linked to an imaging agent selected from the group consisting of a fluorescent dye, a radioisotope, and a contrast agent.
  • [10A] A pharmaceutical composition comprising the antibody according to any one of the above [1A] to [9A].
  • [11A] A composition for use in brain imaging, which comprises the antibody according to the above [9A].
  • [12A] The composition according to the above [10A] or [11A], which is administered according to the following dosing regimen.
  • the antibody modified with the uncharged hydrophilic polymer segment has a weaker binding affinity to the antigen than the unmodified antibody, and the antibody dissociated from the uncharged hydrophilic polymer segment is modified with the uncharged hydrophilic polymer segment.
  • the uncharged hydrophilic polymer segment and the antibody are linked via a disulfide bond, and the disulfide bond is cleaved in a reducing environment in the brain, and the uncharged hydrophilic polymer segment and the antibody are dissociated. , The antibody according to any one of the above [1B] to [3B].
  • the linker is -CO-OL 1- S-S-L 2- ⁇ where L 1 is a substituted or unsubstituted alkylene or a substituted or unsubstituted heteroalkylene, and L 2 is a bond. , Or a blood-stable linker ⁇ , linked to the side chain amino group of the lysine residue of the antibody via an amide bond, and L 2 linked to the uncharged hydrophilic polymer segment, supra.
  • FIG. 1 shows an example of an antibody bound to glucose-modified PEG via a reduction-sensitive linker under reducing conditions and, in that example, a scheme in which glucose-modified PEG dissociates under reducing conditions.
  • the ratio of amino groups of anti-BACE1 modified with PEG was evaluated by a function of reaction time and various ratios of PEG (the reaction was such that the ratio of PEG: amino group was 5: 1). I let you).
  • Panel (b) in FIG. 2 shows the proportion of PEG-modified amino groups in the antibody obtained by reacting at various ratios of PEG: amino groups for 6 hours.
  • FIG. 3 shows the results of characterization of PEGylated anti-BACE1.
  • Panel (a) shows the natural anti-BACE1, PEGylated anti-BACE1, and anti-BACE1 effluent spectra measured by gel permeation chromatography- (GPC) after incubating these antibodies under 2 mM GSH for 4 hours at 37 ° C. The result.
  • Panel (b) shows the results of dynamic light scattering (DLS) measurements of the hydrodynamic diameters of natural anti-BACE1 and PEGylated anti-BACE1.
  • DLS dynamic light scattering
  • Panel (c) a natural anti-A [beta] 1-40, and anti-A [beta] 1-40 induced the release of anti-A [beta] 1-40 from PEG anti A [beta] 1-40 or PEG anti A [beta] 1-40, A [beta] 1-
  • the results obtained by measuring the aggregation of A ⁇ 1-40 after incubation (6 hours, room temperature) by mixing 40 with various ratios by the thioflavin T assay are shown.
  • Panel (d) agglomerates A ⁇ 1-40 , natural anti-A ⁇ 1-40 and various PEGylated anti-A ⁇ 1-40 (PEG12.5-anti-A ⁇ 1-40 , PEG25.5-anti-A ⁇ 1-40 , A solution of PEG52.1-anti-A ⁇ 1-40 and PEG73.2-anti-A ⁇ 1-40 ) was measured after preincubating at 37 ° C. for 4 hours.
  • FIG. 4 shows a stained image of a nuclear pore complex protein (NPCP) in human breast cancer (MCF-7) cells with an antibody.
  • NPCP nuclear pore complex protein
  • Panel (a) was obtained by incubating with natural anti-NPCP, panel (b) with PEG25.5-anti-NPCP, and panel (c) with anti-NPCP in which the linker was cleaved under reducing conditions at room temperature for 4 hours. It is a stained image. Anti-NPCP was contacted with cells after fixation with 4% PFA. Cell nuclei were stained with Hoechst 33258 (blue) and anti-NPCP labeled with Alexa Fluor 488 (green). The scaler shows 20 ⁇ m.
  • FIG. 5 shows the accumulation and biological activity of anti-BACE1 in the brain.
  • Panel (a) shows after administration of unmodified anti-BACE1, G0-PEGylated anti-BACE1, G25-PEGylated anti-BACE1, G50-PEGylated anti-BACE1, G75-PEGylated anti-BACE1, and G100-PEGylated anti-BACE1.
  • the amount of anti-BACE1 antibody in the serum of C57BL / 6J mice at various times is shown by the relative fluorescence intensity of labeled Alexa 647.
  • Panel (b) shows the results of examining the accumulation of anti-BACE1 in the brain at 12, 24 and 48 hours after sample injection by quantifying Alexa647 fluorescence in the perfused brain homogenate.
  • mice C57BL / 6J mice were given natural anti-BACE1 and Gluc-PEGylated anti-BACE1 (all with Alexa647-labeled Fab, anti-BACE1 at a concentration of 0.15 mg / mL) under glycemic control conditions (24 hours fasting, 30 minutes prior to therapeutic injection).
  • Panel (c) shows the effect of glucose-modified PEG-conjugated anti-BACE1 on the production of A ⁇ 1-40 in a mouse model of Alzheimer's disease.
  • lowering blood glucose means lowering the blood glucose level in the subject than the blood glucose that would have been indicated if the treatment was not performed.
  • Examples of the method of lowering blood glucose include dietary restriction or administration of a diabetic drug.
  • lowering blood glucose it is permissible to take, for example, other drugs or drink beverages such as water, as long as the purpose of lowering blood sugar is achieved.
  • Lowering blood glucose may be accompanied by other treatments that have no substantial effect on blood glucose.
  • fasting means fasting to a subject, for example, 3 hours or more, 4 hours or more, 5 hours or more, 6 hours or more, 7 hours or more, 8 hours or more, 9 hours or more, 10 hours or more. 11 hours or more, 12 hours or more, 13 hours or more, 14 hours or more, 15 hours or more, 16 hours or more, 17 hours or more, 18 hours or more, 19 hours or more, 20 hours or more, 21 hours or more, 22 hours or more, 23 hours 24 hours or more, 25 hours or more, 26 hours or more, 27 hours or more, 28 hours or more, 29 hours or more, 30 hours or more, 31 hours or more, 32 hours or more, 33 hours or more, 34 hours or more, 35 hours or more, 36 hours or more, 37 hours or more, 38 hours or more, 39 hours or more, 40 hours or more, 41 hours or more, 42 hours or more, 43 hours or more, 44 hours or more, 45 hours or more, 46 hours or more, 47 hours or more or 48 hours It means to make the above fasting.
  • a subject's blood glucose can be lowered by fasting for a sufficient period of time.
  • the fasting period is determined by a doctor or the like in view of the health condition of the subject, and is preferably a period longer than the time when the subject reaches fasting blood glucose, for example.
  • the fasting period may be, for example, a period of time greater than increased expression of GLUT1 on the inner surface of blood vessels of cerebrovascular endothelial cells or reaching a plateau.
  • the fasting period can be, for example, the above period of 12 hours or more, 24 hours or more, or 36 hours or more. Fasting may also be accompanied by other treatments that do not substantially affect blood glucose levels or expression of GLUT1 on the inner surface of blood vessels.
  • inducing an increase in blood glucose level means increasing the blood glucose level in the subject.
  • blood glucose levels can be elevated by a variety of methods well known to those of skill in the art, eg, administration of one that induces an increase in blood glucose levels, eg, induces an increase in blood glucose levels such as glucose, fructose (fructose), galactose, etc.
  • administration of monosaccharides administration of polysaccharides that induce an increase in blood glucose level such as maltose, intake of carbohydrates that induce an increase in blood glucose level such as starch, or diet.
  • blood glucose manipulation means to lower the blood glucose of a subject and then raise the blood glucose level. After lowering the blood glucose of the subject, the lowered blood glucose level can be maintained.
  • the time for lowering the blood glucose level of the subject is, for example, 0 hours or more, 1 hour or more, 2 hours or more, 3 hours or more, 4 hours or more, 5 hours or more, 6 hours or more, 7 hours or more, 8 hours or more, 9 hours.
  • the blood sugar level can be raised.
  • "maintaining blood glucose” is permitted, for example, to take other agents or drink beverages such as water, as long as the purpose of maintaining the lowered blood glucose level in the subject is achieved. Is done. Lowering blood glucose may be accompanied by other treatments that have no substantial effect on blood glucose.
  • the "target” is a mammal including a human.
  • the subject may be a healthy subject or a subject suffering from some disease.
  • Diseases here include neurological disorders such as psychotic disorders, depression, mood disorders, anxiety, sleep disorders, dementia and substance-related disorders.
  • the dementia includes, but is not limited to, Alzheimer's disease and Creutzfeldt-Jakob disease.
  • an "antibody” is a complete immunoglobulin of any isotype (ie, two heavy chains (H chains) and two light chains (L chains) stabilized by a pair of disulfide bonds).
  • Antibodies include single non-human vertebrate-derived antibodies (eg, non-human mammalian-derived antibodies), chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies and bispecific antibodies.
  • the antibody may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody, and may be preferably a monoclonal antibody when administered to humans.
  • Antibody isotypes include IgG, IgM, IgA, IgD, and IgE.
  • the "humanized antibody” is an amino acid sequence characteristic of a non-human antibody, and means an antibody in which the corresponding position of the human antibody is substituted.
  • a heavy chain of an antibody prepared by immunizing a mouse or a rat. Examples thereof include those having CDRs 1 to 3 and light chains CDRs 1 to 3, and all other regions including four framework regions (FR) of heavy chain and light chain respectively derived from human antibody.
  • Such antibodies are sometimes referred to as CDR-transplanted antibodies.
  • a “human chimeric antibody” is an antibody in which the constant region of a non-human-derived antibody is replaced with a constant region of a human antibody in a non-human-derived antibody.
  • Antigen-binding fragments of an antibody include Fab consisting of VL, VH, CL and CH1 regions; F (ab') 2 in which two Fabs are linked by disulfide bonds in the hinge region; Fv consisting of VL and VH; VL.
  • scFv which is a single-chain antibody in which VH is linked with an artificial polypeptide linker
  • bispecific antibodies such as diabody type, scDb type, tandem scFv type, and leucine zipper type can be mentioned, but are limited thereto. Not done.
  • an antibody that binds to substance A may be referred to as "anti-substance A” or "anti-substance A”.
  • the "blood-brain barrier” refers to a functional barrier that exists between the blood circulation and the brain and has selectivity for substance permeation.
  • the actual state of the blood-brain barrier is thought to be cerebral vascular endothelial cells and the like.
  • There are many unclear points about the substance permeability of the blood-brain barrier but it is known that glucose, alcohol and oxygen easily pass through the blood-brain barrier, and fat-soluble substances and small molecules (for example, molecular weight less than 500) are used. It is believed that it tends to pass more easily than water-soluble molecules and macromolecules (eg, molecular weights of 500 or more).
  • Many brain disease therapeutic agents and brain diagnostic agents do not cross the blood-brain barrier, which is a major obstacle to the treatment of brain diseases and analysis of the brain.
  • GLUT1 ligand means a substance that specifically binds to GLUT1.
  • Various ligands are known as GLUT1 ligands, and examples thereof include, but are not limited to, molecules such as glucose and hexose, all of which are used in the present invention for the preparation of carriers or conjugates in place of glucose. be able to.
  • the GLUT1 ligand is glucose, or preferably a substance having an affinity for GLUT1 equal to or greater than glucose.
  • modified with a GLUT1 ligand means that the GLUT1 ligand is modified to be recognized by GLUT1.
  • alkyl includes straight-chain (i.e., unbranched) means or branched or combinations thereof, are completely saturated, also designated number of carbon atoms (i.e., C 1 ⁇ C 10 has 1 to 10 carbons).
  • saturated hydrocarbon radicals are, but are not limited to, methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, t-butyl, isobutyl, sec-butyl, (cyclohexyl) methyl, such as n.
  • -A group of allogenes such as pentyl, n-hexyl, n-heptyl, n-octyl, and isomers can be mentioned.
  • alkyl group C 1 ⁇ C 16 straight-chain saturated aliphatic hydrocarbon, C 1 ⁇ C 16 branched saturated aliphatic hydrocarbons, C 3 ⁇ C 8 cyclic saturated aliphatic hydrocarbons, and certain having the number of carbon atoms is substituted with C 3 ⁇ C 8 cyclic saturated aliphatic hydrocarbon group, sometimes refers to C 1 ⁇ C 16 straight-chain or branched-chain saturated aliphatic hydrocarbon groups.
  • I-Pr isobutyl (i-Bu), tert-butyl (t-Bu), sec-butyl (s-Bu), isopentyl, neopentyl, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, Cyclopropylmethyl and the like are mentioned.
  • alkylene means, but is not limited to, a divalent radical derived from an alkyl, but by way of example,-(CH 2 ) n- ⁇ where n is 1 to 1 to 1. It is a natural number of any of 24 ⁇ .
  • an alkyl (or alkylene) group has 1 to 24 carbon atoms, and these groups can preferably have 10 or less carbon atoms.
  • a “lower alkyl” or “lower alkylene” is a short-chain alkyl group or short-chain alkylene group, generally containing 8 or less, 6 or less, or 4 or less (eg, 2 or 3) carbon atoms. Have.
  • heteroalkyl means a stable linear or branched chain, or a combination thereof, at least selected from the group consisting of at least one carbon atom and O, N, P, Si and S. It consists of one hetero atom, N and S may be oxidized, and the N hetero atom may be quaternized. Heteroatoms (s) O, N, P, S and Si may be placed at any interior of the heteroalkyl group or where the alkyl group adheres to the rest of the molecule.
  • Heteroalkyl may contain, for example, two or less heteroatoms. Heteroalkyl may include, for example, one heteroatom. The heteroalkyl can be a lower heteroalkyl.
  • heteroalkylene means a linear or branched divalent radical derived from a heteroalkyl, and is not limited to, for example, -CH 2- CH 2-. S-CH 2 -CH 2 - and -CH 2 -S-CH 2 -CH 2 -NH-CH 2 - and the like.
  • the heteroatom is at one or both chain ends, especially at the ends (eg, alkyleneoxy, alkylenedioxy, alkyleneamino, alkylenediamino, etc.).
  • the orientation of the linking group equations described does not indicate the orientation of the linking group.
  • the heteroalkyl group is -C (O) R', -C (O) NR', -NR'R, which is attached to a molecular residue via a heteroatom.
  • These groups include'', -OR', -SR' and / or -SO 2 R'.
  • cycloalkyl and heterocycloalkyl mean cyclic forms of “alkyl” and “heterocycloalkyl", respectively. Further, for heterocycloalkyl, the heteroatom may be at the location where the heterocycle is attached to the molecular residue.
  • examples of cycloalkyl include, but are not limited to, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, 1-cyclohexenyl, 3-cyclohexenyl, cycloheptyl and the like.
  • heterocycloalkyl examples include, but are not limited to, 1- (1,2,5,6-tetrahydropyranyl), 1-piperidinyl, 2-piperidinyl, 3-piperidinyl, 4-morpholinyl, 3-. Examples thereof include morpholinyl, tetrahydrofuran-2-yl, tetrahydrofuran-3-yl, tetrahydrothien-2-yl, tetrahydrothien-3-yl, 1-piperazinyl, 2-piperazinyl and the like.
  • cycloalkylene and “heterocycloalkylene” mean divalent radical derivatives derived from cycloalkyl and heterocycloalkyl, respectively, alone or as part of another substituent.
  • a bloodstream-stable linker means a linker that is stable enough to be present in the blood for the time required for the transition from administration to the brain parenchyma in the bloodstream. Bonds selected from the group consisting of carbon-carbon bonds, amide bonds, phosphodiester bonds, ester bonds, ether bonds, thioester bonds, thioether bonds, and disulfide bonds can be stable linkers in the bloodstream. In the present invention, bloodstream stable linkers are pharmaceutically acceptable. Thus, the uncharged hydrophilic polymer segment and the antibody can be linked by these linkers.
  • the linker stable in blood flow is not particularly limited, and is, for example, a substituted or unsubstituted alkylene, or a substituted or unsubstituted heteroalkylene. Whether the linker is stabilized in the bloodstream can be determined, for example, by assessing the stability of the linker in isolated blood or physiological saline containing serum.
  • the time required for the transition from administration to the brain parenchyma can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the time required for the transition from administration to the brain parenchyma is, for example, 1 hour or more, 2 hours or more, 3 hours or more, 4 hours or more, 5 hours or more, 6 hours or more, 7 hours or more, 8 hours or more, 9 hours or more.
  • the time required for the transition from administration to the brain parenchyma can be, for example, 7 days or less, 6 days or less, 5 days or less, 4 days or less, 3 days or less, 2 days or less, or 1 day or less.
  • the time required for the transition from administration to the brain parenchyma can be, for example, 1 hour or more and 1 day or less.
  • the "substituent" is -OH, -NH 2 , -SH, -CN, -CF 3 , -NO 2 , oxo, halogen, -COOH, unsubstituted alkyl, unsubstituted heteroalkyl, unsubstituted. It can be selected from the group consisting of cycloalkyl, unsubstituted heterocycloalkyl, unsubstituted aryl, and unsubstituted aryl.
  • a substituted or unsubstituted alkyl is a C 1 ⁇ C 8 alkyl substituted or unsubstituted, each substituted or unsubstituted heteroalkyl, substituted or an unsubstituted 2 to 8 membered heteroalkyl, each substituted or unsubstituted cycloalkyl is a C 5 ⁇ C 7 cycloalkyl substituted or unsubstituted, each substituted or unsubstituted heterocycloalkyl, substituted or unsubstituted It is a substituted 5- to 7-membered heterocycloalkyl.
  • an antibody modified with an uncharged hydrophilic polymer segment wherein the antibody can bind to an antigen and in blood in the form of an antibody modified with an uncharged hydrophilic polymer segment.
  • the antibody is provided in a form dissociated from the uncharged hydrophilic polymer segment.
  • the antibody dissociates from a non-charged hydrophilic polymer segment in response to a lowered pH when it enters a low pH environment, such as pH in the endosomes of cerebrovascular endothelial cells, from a blood vessel. ..
  • the antibody is linked to a non-charged hydrophilic polymer segment with a pH-responsive bond, which bond is, for example, in an environment below pH 7, under pH 6.5, at pH 6.4. Cleavage is performed in the following environment, pH 6.3 or less, pH 6.2 or less, pH 6.1 or less, or pH 6 or less (for example, pH in endosomes).
  • the linker is selected from the group consisting of esters, sulfonic acid esters, boronic acid esters, phosphate esters, amides (including carbamates), acetals, ketals, hydrazone, imines, imides, enamin, and thiosuccinimidyl.
  • the linker can cleave in response to a lowered pH.
  • the linker is cleaved in a low pH environment according to the following scheme to release the antibody ⁇ L 3 is indicated as R in the following scheme ⁇ .
  • the effectiveness of the linker is that after cleavage of the linker, not only the uncharged hydrophilic segment (for example, PEG as shown in the above figure) is removed, but also the intact antibody (the amino group of the lysine side chain used for PEG modification) is removed. Is returned to the original amino group), which is also clear from the point that it is released.
  • the uncharged hydrophilic segment for example, PEG as shown in the above figure
  • the intact antibody the amino group of the lysine side chain used for PEG modification
  • the antibody dissociates from the uncharged hydrophilic polymer segment during or in the transcytosis of BBB.
  • the antibody is linked to a non-charged hydrophilic polymer segment with a reducing environment responsive linker and the binding is cleaved in the reducing environment in the brain.
  • the reducing environment responsive bond can be a disulfide bond.
  • an antibody dissociated from an uncharged hydrophilic polymer segment has a stronger binding affinity for an antigen than an antibody modified with an uncharged hydrophilic polymer segment.
  • the antibody can partially or completely restore (or reactivate) the binding affinity for the antigen.
  • the binding affinity of the recovered or reactivated antibody is 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% of the binding affinity of the unmodified antibody. It can be 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more.
  • an antibody modified with an uncharged hydrophilic polymer segment has a weaker binding affinity for an antigen than an unmodified antibody (unmodified antibody). The larger the reduction in the binding affinity, the more preferable.
  • the binding affinity of the modified antibody is 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less, 5% of the unmodified antibody. Below, it can be 4% or less, 3% or less, 2% or less, 1% or less, or 0.1% or less. Binding affinity can be measured, for example, in serum or in physiological saline.
  • the antibody of the invention can be inactivated by modification.
  • the antibody of the present invention may have its binding affinity reduced or eliminated by modification. That is, the antibody of the present invention can be an inactivated antibody.
  • the reduction or disappearance of the antibody's binding affinity for the antigen can be caused by steric hindrance due to the uncharged hydrophilic polymer block.
  • an antibody modified with an uncharged hydrophilic polymer segment has a weaker binding affinity for an antigen than an unmodified antibody (unmodified antibody), and is a non-charged hydrophilic polymer.
  • Antibodies dissociated from the segment have stronger binding affinity to the antigen than antibodies modified with the uncharged hydrophilic polymer segment.
  • the antibody modified with the uncharged hydrophilic polymer segment is cleaved with the segment in the brain parenchyma, and the binding property of the antibody that has been deteriorated by the modification can be restored.
  • Such antibodies can reach the brain parenchyma, for example, in patients with diseases with weakened blood-brain barriers, without special glycemic manipulation or without glucose modification, and within the brain parenchyma. It can be useful because it restores its binding properties.
  • the uncharged hydrophilic polymer segment may be modified with a GLUT1 ligand. Modification with the GLUT1 ligand is useful in the context of delivering the antibody within the endosomes or brain parenchyma of cerebrovascular endothelial cells in subjects with a normal blood-brain barrier.
  • the antibody and the uncharged hydrophilic polymer segment are —CO—OL 1 ⁇ S—S—L 2- ⁇ where L 1 is substituted or unsubstituted alkylene, or substituted or It is an unsubstituted heteroalkylene, L 2 is a blood-stable linker ⁇ , and is linked to the side chain amino group of the lysine residue of the peptide via an amide bond, and L 2 is uncharged. It is linked to a hydrophilic polymer segment.
  • L 1 is substituted or unsubstituted alkylene, or substituted or It is an unsubstituted heteroalkylene
  • L 2 is a blood-stable linker ⁇ , and is linked to the side chain amino group of the lysine residue of the peptide via an amide bond
  • L 2 is uncharged. It is linked to a hydrophilic polymer segment.
  • the above-CO-OL 1- S-S-L 2 -cleaves the SS-binding portion in the reducing
  • an antibody modified by a non-charged hydrophilic polymer via a linker, wherein the uncharged hydrophilic polymer is modified with a GLUT1 ligand is provided.
  • the antibody can bind to GLUT1 expressed on the luminal surface of cerebral vascular endothelial cells via the GLUT1 ligand.
  • glucose is administered (or GLUT1 ligand is administered) to a subject with reduced blood glucose
  • the substance bound to the luminal surface of the subject's cerebral vascular endothelial cells is taken up into the vascular endothelial cells by endocytosis.
  • At least a portion thereof is delivered within the brain parenchyma by transcytosis.
  • GLUT1 is expressed on the lumen-side surface of the cerebral vascular endothelial cells of the subject whose blood glucose is lowered, and the above-mentioned antibody of the present invention binds to GLUT1 via the GLUT1 ligand and administers glucose (or GLUT1 ligand). When administered), it is taken up into vascular endothelial cells by endocytosis, at least a portion of which is delivered into the brain parenchyma by transcytosis.
  • the binding between GLUT1 and the antibody can be confirmed in an in vitro experiment by an assay for evaluating the binding between the isolated GLUT1 and the antibody.
  • uncharged hydrophilic polymer examples include polyethylene glycol (PEG) and a non-charged hydrophilic polymer such as polyoxazoline.
  • PEG polyethylene glycol
  • non-charged hydrophilic polymer such as polyoxazoline.
  • uncharged means that the charge is neutralized in the entire polymer segment.
  • the uncharged hydrophilic polymer is biocompatible.
  • the antibodies of the invention may or may not have an uncharged hydrophilic polymer segment modified with a ligand (second ligand) for a receptor in the brain other than the GLUT1 ligand. be able to.
  • the linker in the above antibody of the present invention, can be linked to the side chain amino group of the lysine residue of the antibody.
  • the linkage may preferably be a covalent bond.
  • the linker-linked lysine residue can be present within the heavy and / or light chain variable regions of the antibody.
  • the linker-linked lysine residues can be present within the CDR regions of the heavy and / or light chain variable regions of the antibody. Modification with the GLUT1 ligand is used to translocate from the bloodstream to the brain parenchyma and may be unnecessary after translocation to the brain parenchyma.
  • the PEG modified with the GLUT1 ligand that modifies the antibody may be cleaved from the antibody.
  • modification of the side chain amino group of the lysine residue of the antibody may reduce the binding property of the antibody depending on the strength of the modification. Therefore, after the antibody has transferred to the brain parenchyma, the PEG modified with the GLUT1 ligand that modifies the antibody may be cleaved from the antibody.
  • the GLUT1 ligand can modify PEG.
  • the GLUT1 ligand can modify the carbon or oxygen atoms at the ends of the PEG. For example, the parenchyma of the brain has a reducing environment.
  • the reducing environment of the brain parenchyma is a reducing environment having the same intensity as that of a 2 mM glutathione (GSH) aqueous solution.
  • GSH 2 mM glutathione
  • the linker can be configured such that the linker is cleaved after the antibody has been delivered to the brain parenchyma.
  • Such a linker is called a linker that can be cleaved in a reducing environment.
  • the present invention provides an antibody modified via a linker that can be cleaved in a reducing environment with a non-charged hydrophilic polymer (eg, PEG) modified with a GLUT1 ligand.
  • a non-charged hydrophilic polymer eg, PEG
  • the antibodies of the invention are preferably capable of cleaving the linker in the brain parenchyma, which provides a reducing environment.
  • a linker capable of cleavage in a reducing environment may have, for example, a disulfide bond as the cleavage site.
  • a linker that can be cleaved in a reducing environment can be configured such that the side chain amino group of the lysine residue of the antibody becomes an unsubstituted amino group by cleavage.
  • a linker (antibody-NH) -CO-OC 2 H 4- S-S-L 2- (uncharged hydrophilic polymer) ⁇ where L 2 is bound or stable in bloodstream.
  • a GLUT1 ligand glucose (Gluc), uncharged hydrophilic polymer is polyethylene glycol (PEG), L 2 antibody of C 2 H 4 -O-CO- in which the present invention is in a reducing environment
  • PEG polyethylene glycol
  • L 2 antibody of C 2 H 4 -O-CO- L 2 antibody of C 2 H 4 -O-CO- in which the present invention is in a reducing environment
  • the mechanism by which it dissociates from the linker and returns to the original antibody is shown.
  • the GLUT1 ligand is a GLUT1 ligand other than glucose
  • the uncharged hydrophilic polymer is a non-charged hydrophilic polymer other than PEG
  • the antibody is a peptide other than the antibody (for example, a protein or a fragment thereof).
  • the modified peptide is 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2% or less, 1% or less, or 0 of the unmodified peptide. It can have a physiological activity of 1% or less. Further, in a reducing environment or the like, the modified peptide can partially or completely restore (or reactivate) its physiological activity. The larger the recovery or reactivation, the more preferable.
  • the binding affinity of the recovered or reactivated peptide is 50% or more, 55% or more, 60% or more, 65% of the binding affinity of the unmodified peptide. It can be 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more.
  • Cleavage dissociates the linker moiety from the side chain amino group of the lysine residue of the antibody, and the amino group is configured to return to the unsubstituted amino group.
  • the antibody can be returned to the unsubstituted state. It has been pointed out that the binding properties of the antibody may be reduced by modifying the side chain amino group of the lysine residue, and the binding property of the antibody is lowered by modifying the side chain amino group of the lysine residue.
  • the antibody of the present invention can be an antibody capable of recovering the binding properties of the antibody reduced by modification by cleavage of the linker.
  • Restoration of the binding property can be achieved by various methods, for example, the binding property can be restored by returning the side chain amino group of the lysine residue to an unsubstituted state as described above.
  • a linker (antibody-NH) -CO-OL 1- S-S-L 2- (uncharged hydrophilic polymer segment) ⁇ where L 1 is substituted or unsubstituted alkylene. , Or substituted or unsubstituted heteroalkylene, where L 2 is a bound or bloodstream stable linker ⁇ .
  • the linker has -NH-CO-OC 2 H 4- S-S-C 2 H 4- O-CO-, and the side chain amino group of the lysine residue of the antibody.
  • An antibody linked to an amide bond via an amide bond can be preferably used.
  • L 2 is a bloodstream stable linker ⁇ ⁇
  • the configuration in parentheses in () is not included in the linker.
  • the configuration in parentheses is shown ⁇ to explain the connection between the linker and the configuration.
  • the PEG-linked linker may be PEG modified with a GLUT1 ligand.
  • the GLUT1 ligand can be glucose.
  • glucose can be linked to PEG via, for example, the carbon atoms at its 2-position, 3-position or 6-position and can interact favorably with GLUT1.
  • the PEG can have a number average degree of polymerization of 2,000 to 12,000, for example 5,000.
  • 10 to 90%, 20 to 80%, 30 to 70%, or 40 to 60% of the side chain amino groups (primary amines) of the lysine residue are polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • the ratio of a PEG-modified amino group among the side chain amino groups of a lysine residue may be expressed by adding the ratio (%) after "PEG".
  • the antibody of the present invention may be modified with PEG modified with GLUT1 ligand and with PEG not modified with GLUT1 ligand.
  • PEGs that modify the antibody for example, 10 to 100%, 30 to 80%, or 40 to 60% of PEG can be modified with GLUT1.
  • the ratio of PEG modified with GLUT1 ligand among PEG may be expressed by adding the ratio (%) after "G".
  • the antibody of the present invention can be, for example, an antibody that binds to an antigen in the brain parenchyma (for example, intracellular antigen, cell surface antigen or extracellular antigen).
  • the antibody of the present invention can be an antibody that does not show significant binding to a component in blood.
  • antigens in the brain parenchyma include amyloid ⁇ (A ⁇ , eg, A ⁇ 1-40 and A ⁇ 1-42 ), its soluble oligomers, its extracellular deposits, ⁇ -secretase 1 (BACE1), and aberrant prion proteins. (Misfolded prion protein), superoxide dismutase 1 (SOD1), and ⁇ -sinucrane.
  • a ⁇ can preferably be an extracellular deposit.
  • the antibody can be an antibody having antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC activity) and / or complement-dependent cellular cytotoxicity (CDC activity). ADCC activity can be enhanced, for example, by subclassing the antibody to IgG1.
  • ADCC activity can be enhanced, for example, by subclassing the antibody to IgG1.
  • the antigen of the antibody is a surface antigen of a tumor in the brain parenchyma
  • the antibody may be in the form of an antibody-drug conjugate (ADC) with a cytotoxic agent.
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the antibody may be, for example, in the form of a non-ADC.
  • Imaging agents include, for example, biocompatible fluorescent dyes (eg, fluorescent dyes that fluoresce in the visible or near-infrared region) and luminescent dyes (eg, luciferase), as well as radioactive isotopes, super.
  • imaging agents such as a sonic probe, a contrast agent for MRI, and a contrast agent for CT.
  • a person skilled in the art can appropriately prepare a conjugate of an imaging agent and an antibody.
  • the antibody of the present invention may be linked to a physiologically active substance (for example, an enzyme and a nucleic acid).
  • a physiologically active substance for example, an enzyme and a nucleic acid.
  • the bioactive substance can be delivered to the brain parenchyma.
  • a person skilled in the art can appropriately prepare a conjugate of a physiologically active substance and an antibody.
  • a pharmaceutical composition comprising the peptide or antibody of the present invention for treating or preventing a brain disease.
  • Brain disorders include, for example, anxiety, depression, sleep disorders, Alzheimer's disease, Parkinson's disease and multiple sclerosis.
  • the antibody include an antibody that binds to a causal factor of these diseases and neutralizes the activity thereof.
  • a ⁇ an antibody of the invention that binds to its soluble oligomer and its extracellular deposits (eg, an antibody that binds to A ⁇ and / or its soluble oligomer and inhibits the formation or increase of extracellular deposits), A ⁇ .
  • Antibodies of the invention that bind to cell deposits and suppress the increase in deposits or reduce deposits are administered, for example, to patients with Alzheimer's disease or patients at risk of developing Alzheimer's disease, thereby treating Alzheimer's disease.
  • Antibodies of the invention that bind to aberrant prion proteins eg, antibodies that bind to aberrant prion proteins to suppress or reduce the accumulation of aberrant prion proteins
  • Creutzfeldt-Jakob disease e.g, antibodies that bind to aberrant prion proteins to suppress or reduce the accumulation of aberrant prion proteins
  • Antibodies of the invention that bind to SOD1 eg, antibodies that bind to and activate SOD1 variants found in amyotrophic lateral sclerosis (ALS), such as SOD1 and Derlin-1) are blocked.
  • Anti-SOD1 antibody or anti-Derlin-1 antibody can be administered, for example, to ALS patients or patients at risk of developing it, thereby being used in the treatment of ALS.
  • Antibodies of the invention that bind to ⁇ -synuclein include Lewy body dementias and Parkinson's disease.
  • treatment of a disease means prevention of a disease and treatment of a disease.
  • Disease prevention is used to include preventing the onset of the disease, delaying the onset, and reducing the incidence.
  • Treatment of a disease is used to include slowing the rate of exacerbation of the disease, delaying the exacerbation, preventing the exacerbation, reducing the symptoms of the disease, curing the disease, and relieving the disease.
  • the peptides or antibodies or pharmaceutical compositions of the present invention may be administered according to a dosing regimen.
  • the administration plan is Lowering the subject's blood sugar and then Inducing an increase in blood glucose level so that more antibody is transferred to the brain parenchyma in the subject as compared with the case where the increase in blood glucose level is not induced, and the peptide or antibody or drug of the present invention. It may include administering the composition.
  • the composition can be administered to the subject sequentially or sequentially at the same time as inducing an increase in blood glucose level in the subject.
  • the dosing regimen may or may not have an interval between administration of the composition to the subject and induction of elevated blood glucose levels in the subject. If the composition is administered simultaneously with the induction of an increase in blood glucose level in the subject, the composition may be administered to the subject in a mixed form with an agent that induces an increase in blood glucose level. , May be administered in a form different from the agent that causes the induction of an increase in blood glucose level in the subject.
  • the composition is prior to the induction of an increase in blood glucose level in the subject. May be administered to the subject or later, but preferably the composition can be administered to the subject prior to inducing an increase in blood glucose level in the subject.
  • inducing an increase in blood glucose level in the subject prior to administration of the composition to the subject within 1 hour, within 45 minutes, within 30 minutes after inducing the increase in blood glucose level in the subject. It is preferred to administer the composition to the subject within, within 15 minutes or within 10 minutes.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain a pharmaceutically acceptable excipient in addition to the antibody of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be in various forms, such as liquids (eg, injections), dispersants, suspensions, tablets, pills, powders, suppositories and the like.
  • the pharmaceutical composition of the invention is an injection and can be administered parenterally (eg, intravenously, transdermally, intraperitoneally, and intramuscularly).
  • a method of administering an antibody to a subject which comprises administering the antibody of the present invention to the subject.
  • a method of delivering an antibody to a subject's brain parenchyma comprising administering to the subject the antibody of the invention or a pharmaceutical composition comprising the antibody.
  • Administration can be intravenous administration.
  • the antibodies of the invention can be administered according to the dosing regimen according to the invention.
  • a method for producing an antibody which comprises linking a side chain amino acid of a lysine residue of an antibody to a glucose-modified polyethylene glycol via a linker that can be cleaved in a reducing environment.
  • the method is provided.
  • a linker (GLUT1 ligand -PEG) -L 2 '-C 2 H 4 -S-S-C 2 H 4 -O-CO- (NH- antibody) can be used ⁇ parentheses
  • the configuration of is not included in the linker.
  • the configuration in parentheses is shown to explain the connection between the linker and the configuration.
  • L 2 ' is a stable linker bond or bloodstream, preferably, it may be a carbamate bond NH-CO-O ⁇ .
  • peptides can be used in place of antibodies.
  • the peptide has multiple lysine residues.
  • the peptide has multiple lysine residues on its surface.
  • the peptide has a plurality of lysine residues on its surface, of which the plurality of lysine residues are mediated by a linker by an uncharged hydrophilic polymer modified with a GLUT1 ligand. It has been qualified.
  • the GLUT1 ligand can be glucose.
  • the uncharged hydrophilic polymer can be polyethylene glycol or polyoxazoline.
  • the linker is a linker that can be cleaved in a reducing environment.
  • the GLUT1 ligand can be glucose
  • the uncharged hydrophilic polymer can be polyethylene glycol or polyoxazoline
  • the linker can be a cleavable linker in a reducing environment. Dissociation of the linker from the peptide is preferably carried out so that the modified amino group is converted back to a primary amine. After the linker is dissociated, the peptide may have the peptide's inherent bioactivity.
  • having a -N-L 2 '-C 2 H 4 -S-S-C 2 H 4 -O-CO- modified lysine residue via a modified the PEG by GLUT1 ligand peptide ⁇ definition of L 2 'are as defined above ⁇ can be provided.
  • the peptides may have PEG in -NH-L 2 '-C 2 H 4 -S-S-C 2 H 4 -O-CO- further modified lysine residues through ⁇ L definition of 2 'are as defined above ⁇ .
  • modified peptides, a -L 2 -C 2 H 4 -S- S-C 2 H 4 -O-CO- modified lysine residue via a modified the PEG by GLUT1 ligand plurality may have ⁇ the definition of L 2 'as described above ⁇ .
  • a method for producing a peptide which comprises linking a side chain amino acid of a lysine residue of the peptide to a glucose-modified polyethylene glycol via a linker that can be cleaved in a reducing environment.
  • the method is provided.
  • a linker (GLUT1 ligand -PEG) -L 2 '-C 2 H 4 -S-S-C 2 H 4 -O-CO- can be used (peptide) ⁇ Configuration in parentheses Is not included in the linker.
  • the configuration in parentheses is shown to explain the connection between the linker and the configuration. As defined in the above-mentioned L 2 '. ⁇ .
  • a composition containing the modified peptide of the present invention is provided.
  • the modified peptide can be administered according to the dosing regimen of the invention, whereby it can be delivered to the brain and cleave the linker in the brain.
  • the composition can be a pharmaceutical composition.
  • the peptide can be a peptide used in peptide replacement therapy.
  • the peptide may contain the full-length amino acid sequence of the protein.
  • the peptide can be part of an antibody.
  • the peptide can be an antibody.
  • the antibodies of the invention may comprise the modified peptide.
  • the use of the peptide or antibody of the present invention in the production of the pharmaceutical composition of the present invention is provided.
  • Example 1 Materials and Methods Materials and Animals. 1,2: 3,4-di-O-isopropylidene- ⁇ -D-glucofuranoside (DIG), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), Tokyo Chemical Industry (EDC) Purchased from Tokyo, Japan). Ethylene oxide (EO) was obtained from Nippon Ekitan Corporation (Tokyo, Japan) and purified with CaH 2 by the trap-trap method. The solvent used for the polymerization (THF, CH 2 Cl 2 and DMF) was purified by passing it through two packed columns of neutral alumina purchased from Nikko Hansen Co., Ltd. (Osaka, Japan).
  • DIG 3,4-di-O-isopropylidene- ⁇ -D-glucofuranoside
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • EDC Tokyo Chemical Industry
  • Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS (-)
  • D- (+)-Glucose D- (+)-Glucose and Paraformaldehyde in Phosphate Buffered Solution were purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan). bottom. Cytolysis buffer was purchased from Promega Corporation (WI, Madison). Glutathione (GSH) was purchased from Thermo Fisher Scientific.
  • DMSO Dimethyl sulfoxide
  • Bis (2-hydroxyethyl) disulfide and 4-nitrophenyl chloroformate were purchased from Sigma.
  • Anti-nuclear pore complex proteins anti-NPCP, product number: ab60080
  • anti-A ⁇ 1-40 anti-A ⁇ 1-40
  • anti-BACE1 product number: ab2077
  • EO polymerization was carried out in accordance with our previous study 26. Briefly, 520 mg (2.0 mmol) DIG dissolved in THF was sublimated in a reaction tube in a vacuum at 70 ° C. Next, a 0.3 M naphthalene potassium solution (6.6 mL, 2.0 mmol) in THF (6.6 mL, 2.0 mmol) was added dropwise, and then 4.6 mL of EO (92 Alzheimer's disease) was added while stirring in an Ar atmosphere. Added to HF-dissolved DIG solution.
  • the PEGylated antibody was prepared as described below.
  • the effect of glucos modification on PEGylated antibody formation was demonstrated by Gluc- and MeO-PEG-CC-SS-CC-NP (complexed with 2 mg / ml antibody in phosphate buffer (200 mM, pH 8.5)). It was evaluated by changing the ratio of 10 mg / ml, DMF). The mixture was then stirred at 4 ° C. for various reaction times. The solution is then purified with Vivaspin 6 (3 times, cutoff MW is 30,000 Da, 10 mM pH 7.4 phosphate buffered saline), 0, 25, 50, 75, and Gluc with 100% glucos modification.
  • G0-PEGylated antibodies with 0, 25, 50, 75, and 100% glucos modification are G0-PEGylated antibody, G25-PEGylated antibody, G50-PEGylated antibody, G75-PEGylated antibody, G100, respectively. -Called a PEGylated antibody.
  • the PEGylated antibody was analyzed using size exclusion chromatography (Superose 6 Elight 10/300 column, GE).
  • the loaded sample volume was set to 100 ⁇ l, and the sample was eluted with phosphate buffered saline (10 mM, pH 7.4, 150 mM NaCl) at a flow rate of 0.5 mL / min. Fluorescent signals were detected at Ex and Em at 652 nm and 668 nm, respectively.
  • the DLS measurement of the size distribution of the PEGylated antibody was performed using Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK). It was carried out at 25 ° C in phosphate buffered saline (10 mM, pH 7.4).
  • Concentrations of labeled Alexa-Fluor 647 or Alexa-Fluor 488 were measured based on a standard calibration curve of serially diluted free Alexa-Fluor 647.
  • the molar ratio between the labeled Alexa-Fluor 647 or Alexa-Fluor 488 and the antibody was calculated to be 1.31 and 1.27, respectively, by comparing the concentrations of the dye and the antibody.
  • Anti-A ⁇ 1-40 and anti-NPCP were used to assess the biological activity of the recovered antibody.
  • MCF-7 cells were seeded on 8-chamber cover glass and incubated in 500 ⁇ L Dulbecco-modified Eagle's Medium (DMEM) (10% FBS) for 18 hours. MCF-7 cells were then fixed with 4% paraformaldehyde for 15 minutes and then treated with 0.2% Triton X-100 for 5 minutes to destroy the membrane. The cells were then treated with 1% BSA solution for 10 minutes to prevent non-specific recognition, with the same concentration of anti-NPCP content (2 ⁇ g / mL; 15 nM) in 1% BSA solution, along with Alexa-488-labeled natural anti.
  • DMEM Dulbecco-modified Eagle's Medium
  • ThT Thioflavin T assay.
  • free natural anti-A ⁇ to be anti-A ⁇ 1-40 A ⁇ 1-40 (1:50, 1:10, 1: 2.5, 1: 1 and 0: 1) in various molar ratios.
  • PEGylated anti-A ⁇ 1-40 and reducing agent (GSH) treated anti-A ⁇ 1-40 were added to the A ⁇ 1-40 solution.
  • 10 ⁇ M ThT was then added to the solution and A ⁇ 1-40 aggregation was monitored at room temperature with an excitation wavelength of 440 nm and an emission wavelength of 480 nm using an Infinite M1000 PRO spectrophotometer.
  • Antibody blood circulation 200 ⁇ l, 0.15 mg / ml Alexa647-labeled PEGylated antibody (G0-, G25-, G50-, G75-, and G100-PEGylated anti-BACE1 and free anti-BACE1 in 10 mM phosphate buffered saline) in mice. Concentrations of Alexa-647-labeled antibody) were administered intravenously. At various time points after injection, 30 ⁇ l of blood collected from mouse blood vessels was concentrated at a rate of 15,000 rpm to give serum.
  • Serum anti-BACE1 was diluted with 10 mM, pH 7.4 phosphate buffered saline buffer and then quantified by fluorescence measurement using an Infinite M1000 PRO spectrophotometer (Tekan Group Ltd., Menedorff, Switzerland).
  • a ⁇ 1-40 Suppression of amyloid ⁇ production in APP / PS1 mice. 30 brain A ⁇ 1-40 is taken in the same way as previously reported. Six-week-old mice were injected intravenously with antibody (20 mg / kg) and PBS. Mice were then perfused at various time points after injection. For the measurement of A ⁇ 1-40 , the collected brain samples were homogenized in 5M guanidine hydrochloride buffer. These samples were rotated at 25 ° C. for 3 hours and then diluted with PBS containing freshly added aprotinin (20 mg / ml) and leupeptin (10 mg / ml), 0.25% casein and 5 mM EDTA (pH 8.0). (1:10). The diluted homogenate was centrifuged at a rate of 14 Krpm for 20 minutes , a supernatant containing A ⁇ 1-40 was isolated, and the concentration of A ⁇ 1-40 was measured by sandwich ELISA (Wako, Japan).
  • the number of modified PEGs was quantified by the degree of modified amines determined by the number of unmodified amines that could be coupled with fluorescamine.
  • Pegging antibody (4 ⁇ L, 0.5 mg / mL; 10 mM phosphate buffer) was incubated with fluoresamine (2 ⁇ L, 3 mg / mL; DMF) at room temperature for 15 minutes and the fluorescence signal was signaled on the ND-3300 fluorescence spectrometer (Nanodrop). , Wilmington, DE, USA). The resulting fluorescent signal was used to estimate the concentration of the primary amine based on the standard calibration curve of a serially diluted BSA with 30 known primary amines.
  • the degree of conjugation to amines increased with increasing number of active PEG molecules (Fig. 2b).
  • the amine modification level reached 76.7% with a conjugation time of 6 hours, which is a PEG / amino group molar ratio of 1: 1. It is about 4 times (Fig. 2b).
  • the PEG-conjugated antibody was further analyzed by gel permeation chromatography (GPC).
  • GPC gel permeation chromatography
  • PEG25.5-anti-BACE1 is taken as an example, and the prepared PEGylated anti-BACE1 has a much faster elution peak time than the natural antibody when measured by GPC.
  • Means that PEG was successfully conjugated to the antibody (Fig. 3a).
  • the size of the antibody was also increased for the PEGylated antibody compared to the native antibody. For example, the size increases from 8.57 nm for natural anti-BACE1 to 11.51 nm for PEGylated anti-BACE1 (PEG25.5-anti-BACE1) in which 25.5% amine groups are conjugated to PEG.
  • PPI narrow particle size distribution
  • DLS dynamic light scattering
  • PEG modification is a widely studied technique for protein modification.
  • PEG carcinage can have a significant effect on the biological activity of the modifying protein.
  • the conjugate amino group can be recovered under reducing conditions and the conjugate PEG can be untraceably removed from the antibody.
  • PEGylated anti-BACE1 was treated with 2 mM GSH. 2 mM GSH provides the solution with a reducing environment equivalent to that in the brain. As shown in FIG.
  • anti-BACE1 treated with 2 mM GSH showed almost the same flow peak time as the natural one, which is because the treated anti-BACE1 is from the antibody. It means that the conjugated PEG was successfully removed and the molecular weight was restored to the same molecular weight as that of the natural antibody.
  • Anti-A ⁇ 1-40 (collected as described above, collected and reductively released) that received appropriate disruption from conjugate PEG to confirm the antibody and thus the biological activity was recovered under reducing conditions and was reduced. The ability to inhibit (quantified) A ⁇ 1-40 aggregation was evaluated (Fig. 3c). Inhibition of A ⁇ 1-40 aggregation by natural anti-A ⁇ 1-40 was first confirmed in vitro by the thioflavin T (ThT) assay. Co-culture of anti-A ⁇ 1-40 and soluble A ⁇ 1-40 (6 hours, in PBS, pH 7.4) resulted in overt dose-dependent inhibition of aggregation.
  • Thioflavin T Thioflavin T
  • anti-A ⁇ 1-40 A ⁇ 1-40 molar ratio 1: 1
  • aggregation inhibition was 92 compared to A ⁇ 1-40 incubated in the absence of anti-A ⁇ 1-40. It was .2% (Fig. 3c).
  • anti-A ⁇ 1-40 still showed a strong inhibitory effect (63.9% inhibition).
  • the inhibitory activity of PEGylated anti-A ⁇ 1-40 and released anti-A ⁇ 1-40 was investigated.
  • PEGylated anti-A ⁇ 1-40 was found to be much less effective at inhibiting A-aggregation than native anti-A ⁇ 1-40 at all concentrations tested (FIG. 3c).
  • the inhibitory activity of released anti-A ⁇ 1-40 is comparable to that of native anti-A ⁇ 1-40 (Fig. 3c), and the efficient conjugated PEG of released anti-A ⁇ 1-40. It shows destruction and recovery of biological activity.
  • the recovery of biological activity of various percent of PEG molecular binding anti-A ⁇ 1-40 was then evaluated while incubating for 4 hours under reducing conditions (2 mM GSH, 37 ° C.). As shown in FIG. 3d, the ratio of anti-A ⁇ 1-40 : A ⁇ 1-40 was set to 1: 2.5, reducing agent treated PEG 12.5% -anti-A ⁇ 1-40 and PEG 25.5% -anti. the solution of a [beta] 1-40, inhibition efficiency of a [beta] 1-40 aggregation were similar.
  • anti-NPCP anti-nuclear pore complex protein
  • Fig. 4a Natural anti-NPCP IgG can selectively recognize NPCP in immobilized MCF-7 cells (Fig. 4a), whereas PEG-modified anti-NPCP IgG (PEG25.5 anti-NPCP IgG) is this selectivity. Lose (Fig. 4b). However, the binding biological activity of anti-NPCP IgG to NPCP was largely restored after 4 hours of incubation with 2 mM GSH (Fig. 4c).
  • AD model mice AD mouse model by administration of this reduction-sensitive glucose-modified PEGylated anti-BACE1 after obtaining highly efficient brain accumulation of delivered anti-BACE1. Attempts were made to evaluate the effect of A ⁇ on the accumulated amount of A ⁇ .
  • a ⁇ 1-40 in the brain of APP / PS1 model mice (8 weeks old), which is an AD model mouse, is administered to physiological saline, free natural anti-BACE1 and G50PEGylated anti-BACE1 (anti-BACE1 20 mg / kg).
  • Quantitative analysis was performed with anti-A ⁇ ELISA (Wako) at various time points of 0, 12, 24 and 48 hours.
  • mice were harvested at various times post-dose and anti-A ⁇ 1-40 ELISA was used to quantify the production of A ⁇ 1-40. As shown in FIG. 6, in mice treated with saline, little change was observed in A ⁇ 1-40 levels at the time of these measurements. Mice treated with G50-PEGylated anti-BACE1 and natural anti-BACE1 are reduced 12 hours after dosing. Mice treated with G50-PEGylated anti-BACE1 had only 43.2% A ⁇ 1-40 levels 12 hours after dosing, and were treated with saline and free natural anti-BACE1 at all 12 hours of measurement. It was significantly lower compared to both animals (Fig. 5c). Even 48 hours after administration of G50-PEGylated anti-BACE1, a high decrease (39.4%) in A ⁇ 1-40 was still observed.
  • BACE1 SUMOylation increases its stability and escalates the protease activity in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 115, 3954-3959 (2016). 17. Atwal JK, Chen Y., Chiu C., Mortensen DL, Meilandt WJ, Liu Y., Heise CE, Hoyte K., Luk W., Lu Y., Peng K., Wu P., Rouge L., Zhang Y., Lazarus RA, Scearce-Levie K., Wang W., Wu Y., Tessier-Lavigne M., Watts RJ A therapeutic antibody targeting BACE1 inhibits amyloid- ⁇ production in vivo. Sci. Transl. Med.
  • Kholodenko IV Kalinovsky DV, Svirshchevskaya EV, Doronin II, Konovalova MV, Kibardin AV, Shamanskaya TV, Larin SS, Deyev SM, Kholodenko RV Multimerization through Pegylation improves pharmacokinetic properties of scFv fragments of GD2-specific antibodies. Molecules 24, 3835 (2019). 25. Xue X., Li D., Yu J., Ma G., Su Z., Hu T. Phenyl linker-induced dense PEG conformation improves the efficacy of C-terminally monoPEGylated staphylokinase. Biomacromolecules 14, 331-41 (2013) ).

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Abstract

本発明は、ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーセグメントによって還元環境下または低ｐＨ環境下において当該セグメントと開裂可能に修飾されたペプチドに関する。本発明ではまた、上記ペプチド部分を含む、抗体が提供される。

Description

ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーによって還元環境下または低ｐＨ環境下において開裂可能に修飾されたペプチドおよび該ペプチドを含む抗体
　本発明は、ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーによって還元環境下または低ｐＨ環境下において開裂可能に修飾されたペプチドに関する。本発明はまた、上記ペプチドを含む抗体に関する。
　薬剤送達システムの開発は、内包される薬物を効率的にかつ選択的に標的組織または臓器へと送達するものである。薬剤送達システムは、内包される薬物の血中滞留性を高める役割を果たし得る。
　脳に対する薬剤送達システムとしては、特許文献１では、表面をグルコースで修飾したミセルが開示されている。特許文献１では、血糖操作を行いつつ、ＧＬＵＴ１リガンドをコンジュゲートした抗体を投与すると、当該コンジュゲート抗体の脳への集積が顕著に高まることを明らかにしている。
ＷＯ２０１５／０７５９４２
発明の簡単な説明
　本発明は、ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーによって還元環境下または低ｐＨ環境下において開裂可能に修飾されたペプチド、および該ペプチドを含む抗体を提供する。
　本発明者らは、ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーによって還元環境下または低ｐＨ環境下において開裂可能に修飾されたペプチドおよび抗体を発明した。本発明者らは、ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーによって、例えば、リンカーを介して、修飾されたペプチドであって、修飾は、ペプチドのリジン残基の側鎖アミノ基と共有結合により連結しており、リンカーは、脳実質の還元環境下、または血管内皮細胞のエンドソーム内のｐＨなどの低ｐＨ環境下において当該修飾部分と開裂することができるペプチドが、脳においてその生理活性（特に、抗体の場合、修飾によって低下したその結合特性）を改善し得ることを見出した。当該ペプチドが抗体である場合、および抗体が当該ペプチドを含む場合も、同様であることが実施例から明らかである。
　本発明によれば、例えば、以下の産業上利用可能な発明が提供される。
［１］ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーセグメント（例えば、ポリエチレングリコールまたはポリオキサゾリン）によって還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において上記セグメントと開裂可能に修飾されたペプチド。
［２］ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーセグメントとペプチドとが、還元環境下またはｐＨ６．５以下の低ｐＨ環境下において開裂可能なリンカーを介して連結され、これにより、還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において上記セグメントと開裂可能に修飾された、上記［１］に記載のペプチド。
［３］リンカーが、リンカー内にジスルフィド結合を有し、還元環境下において前記セグメントと開裂可能に修飾された、上記［２］に記載のペプチド。
［４］リンカーが、－ＣＯ－Ｏ－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－｛ここで、Ｌ１は、置換若しくは非置換アルキレン、または置換若しくは非置換ヘテロアルキレンであり、Ｌ２は、血流で安定なリンカーである｝、ペプチドのリジン残基の側鎖アミノ基にカーバメート結合（以下、アミド結合を含め、「アミド結合」ということがある。）介して連結し、Ｌ２が非電荷親水性ポリマーセグメントと連結している、上記［１］～［３］のいずれかに記載のペプチド。
［５］ＧＬＵＴ１リガンドが、グルコースである、上記［１］～［４］のいずれかに記載のペプチド。
［６］上記［１］～［５］のいずれかに記載のペプチド部分を含む抗体。
［７］脳実質内の細胞表面抗原または細胞外抗原に対して結合する、上記［６］に記載の抗体。
［８］細胞外抗原が、Ａβ１－４０である、上記［７］に記載の抗体。
［９］細胞傷害剤とさらに連結してなる、上記［１］～［７］のいずれかに記載の抗体。
［１０］蛍光色素、放射性同位体、および造影剤からなる群から選択されるイメージング剤とさらに連結してなる、上記［１］～［８］のいずれかに記載の抗体。
［１１］上記［１］～［９］のいずれかに記載のペプチドまたは抗体を含む、医薬組成物。
［１２］上記［１０］に記載の抗体を含む、脳のイメージングに用いるための組成物。
［１３］以下の投与計画に従って投与される、上記［１１］または［１２］に記載の組成物であって、投与計画が、
　対象の血糖を低下させることと、その後、
　当該対象に対して、血糖値の上昇を誘発させない場合と比較してより多くの抗体が脳実質に移行するように、血糖値の上昇を誘発させること、および上記［１１］または［１２］に記載の組成物を投与することを含む、
組成物。
［１４］非電荷親水性ポリマーセグメント（例えば、ポリエチレングリコールまたはポリオキサゾリン）によって還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において上記セグメントと開裂可能に修飾されたペプチド。
［１５］非電荷親水性ポリマーセグメントとペプチドとが、還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において開裂可能なリンカーを介して連結され、これにより、還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において上記セグメントと開裂可能に修飾された、上記［１４］に記載のペプチド。
［１６］リンカーが、－ＣＯ－Ｏ－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－｛ここで、Ｌ１は、置換若しくは非置換アルキレン、または置換若しくは非置換ヘテロアルキレンであり、Ｌ２は、血流で安定なリンカーである｝、ペプチドのリジン残基の側鎖アミノ基にアミド結合を介して連結し、Ｌ２が非電荷親水性ポリマーセグメントと連結している、上記［１５］に記載のペプチド。
［１７］ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーセグメント（例えば、ポリエチレングリコールまたはポリオキサゾリン）によって還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において上記セグメントと開裂可能に修飾された抗体（修飾抗体）であって、未修飾の抗体と比較して、抗原に対する結合性が、１０％以下である、抗体。
［１８］ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーセグメント（例えば、ポリエチレングリコールまたはポリオキサゾリン）によって還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において上記セグメントと開裂可能に修飾された抗体（修飾抗体）であって、未修飾の抗体と比較して、抗原に対する結合性が、５％以下である、抗体。
［１９］ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーセグメント（例えば、ポリエチレングリコールまたはポリオキサゾリン）によって還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において上記セグメントと開裂可能に修飾された抗体（修飾抗体）であって、未修飾の抗体と比較して、抗原に対する結合性が、１％以下である、または消失している、抗体。
［２０］抗体が、脳実質内の細胞表面抗原または細胞外抗原に対して結合する、上記［１７］に記載の抗体。
［２１］抗体が、脳実質内の細胞表面抗原または細胞外抗原に対して結合する、上記［１８］に記載の抗体。
［２２］抗体が、脳実質内の細胞表面抗原または細胞外抗原に対して結合する、上記［１９］に記載の抗体。
［２３］抗体が、Ａβに結合する抗体である、上記［１７］に記載の抗体。
［２４］抗体が、Ａβに結合する抗体である、上記［１８］に記載の抗体。
［２５］抗体が、Ａβに結合する抗体である、上記［１９］に記載の抗体。
［２６］上記［１７］～［２５］のいずれかの記載の抗体を含む、組成物。
［２７］上記［１７］～［２５］のいずれかの記載の抗体を含む、医薬組成物。
［１Ａ］ＧＬＵＴ１リガンドで修飾されたポリエチレングリコールによって還元環境下またはｐＨ６．５以下の低ｐＨ環境下において上記ポリエチレングリコールと開裂可能に修飾された抗体。
［２Ａ］ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーセグメントとペプチドとが、還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において開裂可能なリンカーを介して連結され、これにより、還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において開裂可能に修飾された、上記［１Ａ］に記載の抗体。
［２Ａ］ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーセグメントとペプチドとが、還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において開裂可能なリンカーを介して連結され、これにより、還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において上記セグメントと開裂可能に修飾された、上記［１］に記載の抗体。
［４Ａ］リンカーが、－ＣＯ－Ｏ－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－｛ここで、Ｌ１は、置換若しくは非置換アルキレン、または置換若しくは非置換ヘテロアルキレンであり、Ｌ２は、結合、または血流で安定なリンカーである｝を有し、抗体のリジン残基の側鎖アミノ基にアミド結合を介して連結し、Ｌ２が非電荷親水性ポリマーセグメントと連結している、上記［１Ａ］～［３Ａ］のいずれかに記載の抗体。
［５Ａ］ＧＬＵＴ１リガンドが、グルコースである、上記［１Ａ］～［４Ａ］のいずれかに記載の抗体。
［６Ａ］脳実質内の細胞表面抗原または細胞外抗原に対して結合する、上記［１Ａ］～［５Ａ］のいずれかに記載の抗体。
［７Ａ］細胞外抗原が、Ａβ１－４０である、上記［６Ａ］に記載の抗体。
［８Ａ］細胞傷害剤とさらに連結してなる、上記［１Ａ］～［６Ａ］のいずれかに記載の抗体。
［９Ａ］蛍光色素、放射性同位体、および造影剤からなる群から選択されるイメージング剤とさらに連結してなる、上記［１Ａ］～［７Ａ］のいずれかに記載の抗体。
［１０Ａ］上記［１Ａ］～［９Ａ］のいずれかに記載の抗体を含む、医薬組成物。
［１１Ａ］上記［９Ａ］に記載の抗体を含む、脳のイメージングに用いるための組成物。
［１２Ａ］以下の投与計画に従って投与される、上記［１０Ａ］または［１１Ａ］に記載の組成物であって、投与計画が、
　対象の血糖を低下させることと、その後、
　当該対象に対して、血糖値の上昇を誘発させない場合と比較してより多くの抗体が脳実質に移行するように、血糖値の上昇を誘発させること、および上記［１０Ａ］または［１１Ａ］に記載の組成物を投与することを含む、
組成物。
［１３Ａ］ポリエチレングリコールによって還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において上記ポリエチレングリコールと開裂可能に修飾された抗体。
［１Ｂ］非電荷親水性ポリマーセグメントで修飾された抗体であって、抗体は、抗原に結合することができ、血中では、非電荷親水性ポリマーセグメントで修飾された抗体の形態であり、脳実質では、抗体は、非電荷親水性ポリマーセグメントと解離した形態である、抗体。
［２Ｂ］非電荷親水性ポリマーセグメントとの解離が、ｐＨ６．５以下の環境下において、または脳実質の還元環境下において誘発する、上記［１Ｂ］に記載の抗体。
［３Ｂ］非電荷親水性ポリマーセグメントで修飾された抗体は、未修飾抗体よりも抗原への結合親和性が弱く、非電荷親水性ポリマーセグメントと解離した抗体は、非電荷親水性ポリマーセグメントで修飾された抗体よりも、抗原への結合親和性が強い、上記［１Ｂ］または［２Ｂ］に記載の抗体。
［４Ｂ］非電荷親水性ポリマーセグメントと抗体とが、ジスルフィド結合を介して連結しており、脳内の還元環境下において当該ジスルフィド結合を開裂させ、非電荷親水性ポリマーセグメントと抗体とが解離する、上記［１Ｂ］～［３Ｂ］のいずれかに記載の抗体。［５Ｂ］非電荷親水性ポリマーセグメントがポリエチレングリコールである、上記［１Ｂ］～［４Ｂ］のいずれかに記載の抗体。
［６Ｂ］非電荷親水性ポリマーセグメントが、グルコースで修飾されたポリエチレングリコールである、上記［１Ｂ］～［５Ｂ］のいずれかに記載の抗体。
［７Ｂ］ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーセグメントとペプチドとが、還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において開裂可能なリンカーを介して連結され、これにより、還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において開裂可能に修飾された、上記［１Ｂ］～［６Ｂ］のいずれかに記載の抗体。
［８Ｂ］リンカーが、－ＣＯ－Ｏ－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－｛ここで、Ｌ１は、置換若しくは非置換アルキレン、または置換若しくは非置換ヘテロアルキレンであり、Ｌ２は、結合、または血流で安定なリンカーである｝を有し、抗体のリジン残基の側鎖アミノ基にアミド結合を介して連結し、Ｌ２が非電荷親水性ポリマーセグメントと連結している、上記［７Ｂ］に記載の抗体。
図１は、還元条件下での還元感受性のリンカーを介して、グルコース修飾されたＰＥＧを結合した抗体の一例と、当該一例において、還元条件下でグルコース修飾されたＰＥＧが解離するスキームを示す。 図２のパネル（ａ）は、ＰＥＧで修飾した抗ＢＡＣＥ１のアミノ基の割合を反応時間とＰＥＧの種々の比率の関数で評価した（ＰＥＧ：アミノ基の比は５：１となるように反応させた）。図２のパネル（ｂ）は、ＰＥＧ：アミノ基の様々な比率で６時間反応させて得られた抗体における、ＰＥＧで修飾したアミノ基の割合を示す。 図３は、ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１の特性評価の結果を示す。パネル（ａ）は、天然の抗ＢＡＣＥ１、ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１、および抗ＢＡＣＥ１の流出スペクトルは、これらの抗体を２ｍＭ　ＧＳＨ下で４時間、３７℃でインキュベートした後にゲル透過クロマトグラフィ－（ＧＰＣ）の測定結果である。パネル（ｂ）は、天然の抗ＢＡＣＥ１およびＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１の流体力学的直径を動的光散乱法（ＤＬＳ）で測定した結果を示す。パネル（ｃ）は、天然抗Ａβ１－４０、ＰＥＧ化抗Ａβ１－４０またはＰＥＧ化抗Ａβ１－４０からの抗Ａβ１－４０の放出を誘導した抗Ａβ１－４０と、Ａβ１－４０とを様々な比率で混合してインキュベ－ションした（６時間、室温）後のＡβ１－４０の凝集をチオフラビンＴアッセイで測定して得られた結果を示す。パネル（ｄ）は、Ａβ１－４０凝集を、天然抗Ａβ１－４０および種々のＰＥＧ化抗Ａβ１－４０（ＰＥＧ１２．５－抗Ａβ１－４０、ＰＥＧ２５．５－抗Ａβ１－４０、ＰＥＧ５２．１－抗Ａβ１－４０およびＰＥＧ７３．２－抗Ａβ１－４０）の溶液を３７℃で４時間プレインキュベ－トした後に測定した。パネル（ｄ）のアッセイでは、抗Ａβ１－４０抗体：Ａβ１－４０＝１：２．５とした。 図４は、ヒト乳がん（ＭＣＦ－７）細胞における核膜孔複合体タンパク質（ＮＰＣＰ）の抗体による染色像を示す。パネル（ａ）は天然抗ＮＰＣＰ、パネル（ｂ）はＰＥＧ２５．５－抗ＮＰＣＰ、パネル（ｃ）は還元条件下でリンカーを開裂させた抗ＮＰＣＰと室温で４時間インキュベ－トして得られた染色像である。抗ＮＰＣＰを４％ＰＦＡによる固定後に細胞に接触させた。細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ　３３２５８（青）で染色し、抗ＮＰＣＰをＡｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ　４８８（緑）で標識した。スケ－ルバ－は２０μｍを示す。 図５は、抗ＢＡＣＥ１の脳内蓄積及び生物活性を示す。パネル（ａ）は、未変性の抗ＢＡＣＥ１、Ｇ０－ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１、Ｇ２５－ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１、Ｇ５０－ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１、Ｇ７５－ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１、およびＧ１００－ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１の投与後の様々な時間におけるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの血清中の抗ＢＡＣＥ１抗体の量を、標識Ａｌｅｘａ　６４７の相対蛍光強度で表した図である。パネル（ｂ）は、灌流脳ホモジネ－ト中のＡｌｅｘａ６４７蛍光を定量することにより、試料注入後１２、２４、４８時間目の脳内への抗ＢＡＣＥ１の蓄積を調べた結果を示す。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに天然抗ＢＡＣＥ１およびＧｌｕｃ－ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１（全てＡｌｅｘａ６４７標識Ｆａｂ、０．１５ｍｇ／ｍＬの濃度で抗ＢＡＣＥ１を有する）を血糖制御条件下（２４時間絶食、治療注射の３０分前に腹腔内グルコ－ス注射）で静脈内投与した。パネル（ｃ）は、アルツハイマー病マウスモデルにおけるＡβ１－４０の産生に対するグルコ－ス修飾ＰＥＧを結合した抗ＢＡＣＥ１の効果を示す。ＡＰＰ／ＰＳ１マウス（６週齢）を、ＰＢＳ、遊離天然抗ＢＡＣＥ１またはグルコ－ス修飾ＰＥＧ修飾抗ＢＡＣＥ１（５０％グルコ－ス修飾、Ｇ５０－ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１）（両方とも２０ｍｇ／ｋｇの用量の抗ＢＡＣＥ１）で処理した。Ａβ１－４０の濃度は、全脳ホモジネ－トにおいて、投与後０、１２、２４、および４８時間の時点で、ＥＬＩＳＡ（ｎ＝５）により測定した。
発明の具体的説明
　　本明細書では、「血糖を低下させる」とは、対象において、その処置がされなければ示したはずの血糖よりも血糖値を低下させることをいう。血糖を低下させる方法としては、食事制限または糖尿病薬の投与などが挙げられる。例えば、血糖を低下させる際に、血糖を低下させるという目的を達する限りにおいて、例えば、他の薬剤を摂取し、または水などの飲料を飲むことは許容される。血糖を低下させることは、血糖に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
　本明細書では、「絶食させる」とは、対象に絶食、例えば、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、１２時間以上、１３時間以上、１４時間以上、１５時間以上、１６時間以上、１７時間以上、１８時間以上、１９時間以上、２０時間以上、２１時間以上、２２時間以上、２３時間以上、２４時間以上、２５時間以上、２６時間以上、２７時間以上、２８時間以上、２９時間以上、３０時間以上、３１時間以上、３２時間以上、３３時間以上、３４時間以上、３５時間以上、３６時間以上、３７時間以上、３８時間以上、３９時間以上、４０時間以上、４１時間以上、４２時間以上、４３時間以上、４４時間以上、４５時間以上、４６時間以上、４７時間以上または４８時間以上の絶食をさせることを意味する。十分な期間の絶食により対象の血糖は低下させることができる。絶食期間は、対象の健康状態に鑑みて医師等により決定され、例えば、対象が空腹時血糖に達する時間以上の期間とすることが好ましい。絶食期間は、例えば、脳血管内皮細胞の血管内表面でのＧＬＵＴ１の発現が増大する、またはプラトーに達する以上の時間としてもよい。絶食期間は、例えば、１２時間以上、２４時間以上または３６時間以上である上記期間とすることができる。また、絶食は、血糖値やＧＬＵＴ１の血管内表面での発現に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
　本明細書では、「血糖値の上昇を誘発させる」とは、対象において血糖値を上昇させることをいう。特に、血糖を低下させた対象、または、低下させた血糖値を維持させた対象において血糖値の上昇を誘発させることができる。血糖値は、当業者に周知の様々な方法により上昇させることができるが、例えば、血糖値の上昇を誘発するものの投与、例えば、グルコース、フルクトース（果糖）、ガラクトースなどの血糖値の上昇を誘発する単糖の投与、マルトースなどの血糖値の上昇を誘発する多糖の投与、若しくは、デンプンなどの血糖値の上昇を誘発する炭水化物の摂取、または、食事により上昇させることができる。
　本明細書では、「血糖操作」とは、対象の血糖を低下させ、その後、血糖値を上昇させることをいう。対象の血糖を低下させた後は、低下させた血糖値を維持することができる。対象の血糖値を低下させる時間は、例えば、０時間以上、１時間以上、２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、１２時間以上、１３時間以上、１４時間以上、１５時間以上、１６時間以上、１７時間以上、１８時間以上、１９時間以上、２０時間以上、２１時間以上、２２時間以上、２３時間以上、２４時間以上、２５時間以上、２６時間以上、２７時間以上、２８時間以上、２９時間以上、３０時間以上、３１時間以上、３２時間以上、３３時間以上、３４時間以上、３５時間以上、３６時間以上、３７時間以上、３８時間以上、３９時間以上、４０時間以上、４１時間以上、４２時間以上、４３時間以上、４４時間以上、４５時間以上、４６時間以上、４７時間以上、４８時間以上とすることができる。その後、血糖値を上昇させることができる。本明細書では、「血糖を維持する」とは、対象において低下させた血糖値を維持するという目的を達する限りにおいて、例えば、他の薬剤を摂取し、または水などの飲料を飲むことは許される。血糖を低下させることは、血糖に実質的に影響しない他の処置を伴ってもよい。
　本明細書では、「対象」とは、ヒトを含む哺乳動物である。対象は、健常の対象であってもよいし、何らかの疾患に罹患した対象であってもよい。ここで疾患としては、脳神経疾患、例えば、精神病性障害、うつ病、気分障害、不安、睡眠障害、認知症および物質関連障害が挙げられる。また、認知症としては、特に限定されないがアルツハイマー病およびクロイツフェルト・ヤコブ病が挙げられる。
　本明細書では、「抗体」とは、あらゆるアイソタイプの完全な免疫グロブリン（すなわち、一対のジスルフィド結合で安定化された２本の重鎖（Ｈ鎖）と２本の軽鎖（Ｌ鎖）が会合した構造をとるタンパク質）、または抗原への結合に関して完全な状態の抗体と競合することができるその断片を意味する。抗体としては、単一の非ヒト脊椎動物由来の抗体（例えば、非ヒト哺乳動物由来の抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体及び二重特異性抗体が挙げられる。抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、ヒトに投与される場合には、好ましくは、モノクローナル抗体であり得る。抗体のアイソタイプとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが挙げられる。
　「ヒト化抗体」とは、非ヒト由来の抗体に特徴的なアミノ酸配列で、ヒト抗体の対応する位置を置換した抗体を意味し、例えば、マウス又はラットを免疫して作製した抗体の重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３を有し、重鎖及び軽鎖のそれぞれ４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含むその他のすべての領域がヒト抗体に由来するものが挙げられる。かかる抗体は、ＣＤＲ移植抗体と呼ばれる場合もある。
　「ヒトキメラ抗体」は、非ヒト由来の抗体において、非ヒト由来の抗体の定常領域がヒトの抗体の定常領域に置換されている抗体である。
　抗体の抗原結合性断片としては、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１領域からなるＦａｂ；２つのＦａｂがヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結されているＦ（ａｂ’）２；ＶＬ及びＶＨからなるＦｖ；ＶＬ及びＶＨを人工のポリペプチドリンカーで連結した一本鎖抗体であるｓｃＦｖのほか、ダイアボディ型、ｓｃＤｂ型、タンデムｓｃＦｖ型、ロイシンジッパー型などの二重特異性抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本明細書では、物質Ａに結合する抗体を「抗－物質Ａ」または「抗　物質Ａ」と呼ぶことがある。
　本明細書では、「血液脳関門」とは、血行と脳の間に存在して物質の透過に対して選択性を持つ機能的障壁をいう。血液脳関門の実態は、脳血管内皮細胞などであると考えられている。血液脳関門の物質透過性については、不明な点が多いが、グルコース、アルコールおよび酸素は血液脳関門を通過し易いことが知られ、脂溶性物質や小分子（例えば、分子量５００未満）は、水溶性分子や高分子（例えば、分子量５００以上）に比べて通過し易い傾向があると考えられている。多くの脳疾患治療薬や脳診断薬が血液脳関門を通過せず、このことが脳疾患の治療や脳の分析等の大きな障害となっている。
　本明細書では、「ＧＬＵＴ１リガンド」とは、ＧＬＵＴ１と特異的に結合する物質を意味する。ＧＬＵＴ１リガンドとしては、様々なリガンドが知られ、特に限定されないが例えば、グルコースおよびヘキソースなどの分子が挙げられ、ＧＬＵＴ１リガンドは、いずれも本発明でグルコースの代わりにキャリアまたはコンジュゲートの調製に使用することができる。ＧＬＵＴ１リガンドは、グルコースであるか、好ましくはＧＬＵＴ１に対してグルコースと同等またはそれ以上の親和性を有する物質である。２－Ｎ－４－（１－アジ－２，２，２－トリフルオロエチル）ベンゾイル－１，３－ビス（Ｄ－マンノース－４－イルオキシ）－２－プロピルアミン（ＡＴＢ－ＢＭＰＡ）、６－（Ｎ－（７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール－４－イル）アミノ）－２－デオキシグルコース（６－ＮＢＤＧ）、４，６－Ｏ－エチリデン－α－Ｄ－グルコース、２－デオキシ－Ｄ－グルコースおよび３－Ｏ－メチルグルコースもＧＬＵＴ１と結合することが知られ、これらの分子もＧＬＵＴ１リガンドとして本発明に用いることができる。
　本明細書では、「ＧＬＵＴ１リガンドで修飾される」とは、ＧＬＵＴ１によりＧＬＵＴ１リガンドが認識されるように修飾されることを意味する。
　本明細書では、「アルキル」は、直鎖（すなわち、非分岐鎖）又は分枝鎖若しくはこれらの組み合わせを意味し、完全飽和であり、また、指定された炭素原子数（すなわち、Ｃ１～Ｃ１０は、１個から１０個の炭素）を有する。飽和炭化水素ラジカルの例としては、これに限定するものではないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、（シクロヘキシル）メチル、例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチルなどの同族体、異性体などの群が挙げられる。したがって、用語「アルキル基」は、Ｃ１～Ｃ１６直鎖飽和脂肪族炭化水素、Ｃ１～Ｃ１６分岐鎖飽和脂肪族炭化水素、Ｃ３～Ｃ８環状飽和脂肪族炭化水素、及び特定の炭素原子数を有する、Ｃ３～Ｃ８環状飽和脂肪族炭化水素基で置換される、Ｃ１～Ｃ１６直鎖又は分岐鎖飽和脂肪族炭化水素基を意味することもある。例えば、本定義では、これに限定するものではないが、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（Ｐｒ）、ブチル（Ｂｕ）、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、イソプロピル（ｉ－Ｐｒ）、イソブチル（ｉ－Ｂｕ）、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔ－Ｂｕ）、ｓｅｃ－ブチル（ｓ－Ｂｕ）、イソペンチル、ネオペンチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、シクロプロピルメチルなどを挙げるものとする。
　本明細書では、「アルキレン」は、アルキルから誘導された二価ラジカルを意味し、これに限定するものではないが、例示として、－（ＣＨ２）ｎ－｛ここで、ｎは、１～２４のいずれかの自然数である｝が挙げられる。典型的には、アルキル（又はアルキレン）基は、１～２４個の炭素原子を有し、これらの基は、好ましくは１０個以下の炭素原子を有し得る。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」は、短鎖アルキル基又は短鎖アルキレン基であり、概して、８個以下、６個以下、または４個以下（例えば、２個または３個）の炭素原子を有する。
　本明細書では、「ヘテロアルキル」は、安定直鎖又は分枝鎖、若しくはこれらの組み合わせを意味し、少なくとも１つの炭素原子及びＯ、Ｎ、Ｐ、Ｓｉ及びＳからなる群から選択される少なくとも１つのへテロ原子からなり、Ｎ及びＳは、酸化していてもよく、かつ、Ｎへテロ原子は、四級化されていてもよい。ヘテロ原子（複数可）Ｏ、Ｎ、Ｐ、Ｓ及びＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部又はアルキル基が分子残部に接着する場所に設置してもよい。例えば、これらに限定されないが、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ３、－ＣＨ２Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２、－Ｓ（Ｏ）－ＣＨ３、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ（Ｏ）２－ＣＨ３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｏ－ＣＨ３、－Ｓｉ（ＣＨ３）３、－ＣＨ２－ＣＨ＝Ｎ－ＯＣＨ３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｎ（ＣＨ３）－ＣＨ３、－Ｏ－ＣＨ３、－Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ３及び－ＣＮが挙げられる。最大二つのヘテロ原子は、例えば、－ＣＨ２－ＮＨ－ＯＣＨ３などのように鎖中で連続してもよい。ヘテロアルキルは、例えば、２つ以下のヘテロ原子を含み得る。ヘテロアルキルは、例えば、１つのヘテロ原子を含み得る。ヘテロアルキルは、低級ヘテロアルキルであり得る。
　本明細書では、「ヘテロアルキレン」は、ヘテロアルキルから誘導された直鎖状または分岐鎖状の二価ラジカルを意味し、例えば、これに限定するものではないが、－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－及び－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－ＣＨ２－ＮＨ－ＣＨ２－が挙げられる。アルキレンヘテロ基またはアルキレンジヘテロ基については、ヘテロ原子が一方又は両方の鎖端、特に末端にある（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノなど）。更に、アルキレン及びヘテロアルキレン連結基については、記述されている連結基の式の方向は、連結基の配向を示すものではない。例えば、式－Ｃ（Ｏ）２Ｒ’－は、－Ｃ（Ｏ）ＯＲ’－及び－Ｒ’Ｃ（Ｏ）Ｏ－をいずれも表す。上述のとおり、本明細書で使用するとき、ヘテロアルキル基としては、ヘテロ原子を介して分子残基に結合する、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、－ＮＲ’Ｒ’’、－ＯＲ’、－ＳＲ’及び／又は－ＳＯ２Ｒ’など、これらの基が挙げられる。
　用語「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」は、それぞれ「アルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」の環状型を意味する。さらに、ヘテロシクロアルキルについては、へテロ原子は、複素環が分子残基に結合している場所にあってもよい。シクロアルキルの例としては、これに限定するものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、１－シクロヘキセニル、３－シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルの例としては、これに限定するものではないが、１－（１，２，５，６－テトラヒドロピリジル）、１－ピペリジニル、２－ピペリジニル、３－ピペリジニル、４－モルホリニル、３－モルホリニル、テトラヒドロフラン－２－イル、テトラヒドロフラン－３－イル、テトラヒドロチエン－２－イル、テトラヒドロチエン－３－イル、１－ピペラジニル、２－ピペラジニルなどが挙げられる。用語「シクロアルキレン」及び「ヘテロシクロアルキレン」は、単独又は別の置換基の一部として、それぞれシクロアルキル及びヘテロシクロアルキルから誘導された二価ラジカル誘導体を意味する。
　血流で安定なリンカーは、血流で投与から脳実質への移行に必要な時間にわたって安定に血中で存在し得る程度に安定であるリンカーを意味する。炭素間結合、アミド結合、ホスホジエステル結合、エステル結合、エーテル結合、チオエステル結合、チオエーテル結合、およびジスルフィド結合からなる群から選択される結合は、血流で安定なリンカーであり得る。本発明では、血流で安定なリンカーは、薬学的に許容可能である。従って、非電荷親水性ポリマーセグメントと抗体とは、これらのリンカーによって連結され得る。血流で安定なリンカーとしては、特に限定されないが例えば、置換若しくは非置換アルキレン、または置換若しくは非置換ヘテロアルキレンである。リンカーが血流で安定化どうかは、例えば、単離された血液、または血清を含む生理食塩水中で、リンカーの安定性を評価することによって決定することができる。投与から脳実質への移行に必要な時間は、当業者であれば適宜決定することができる。投与から脳実質への移行に必要な時間は、例えば、１時間以上、２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上、６時間以上、７時間以上、８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１２時間以上、１５時間以上、１８時間以上、２１時間以上、２４時間以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、または７日以上であり得る。投与から脳実質への移行に必要な時間は、例えば、７日以下、６日以下、５日以下、４日以下、３日以下、２日以下、または１日以下であり得る。投与から脳実質への移行に必要な時間は、例えば、１時間以上～１日以下であり得る。
　本明細書では、「置換基」は、－ＯＨ、－ＮＨ２、－ＳＨ、－ＣＮ、－ＣＦ３、－ＮＯ２、オキソ、ハロゲン、－ＣＯＯＨ、非置換アルキル、非置換ヘテロアルキル、非置換シクロアルキル、非置換ヘテロシクロアルキル、非置換アリール、および非置換アリールからなる群から選択され得る。本明細書では、「置換基」は「低級置換基」であり得、置換若しくは非置換アルキルは、置換若しくは非置換のＣ１～Ｃ８アルキルであり、各置換若しくは非置換ヘテロアルキルは、置換若しくは非置換の２～８員ヘテロアルキルであり、各置換若しくは非置換シクロアルキルは、置換若しくは非置換のＣ５～Ｃ７シクロアルキルであり、各置換若しくは非置換ヘテロシクロアルキルは、置換若しくは非置換の５～７員ヘテロシクロアルキルである。
　本発明によれば、非電荷親水性ポリマーセグメントで修飾された抗体であって、抗体は、抗原に結合することができ、血中では、非電荷親水性ポリマーセグメントで修飾された抗体の形態であり、血管内から脳実質に移行した後の脳実質では、抗体は、非電荷親水性ポリマーセグメントと解離した形態である、抗体が提供される。
　本発明のある態様によれば、上記抗体は、血管から脳血管内皮細胞のエンドソーム内のｐＨなどの低ｐＨ環境下に入ると、低下したｐＨに応答して非電荷親水性ポリマーセグメントと解離する。この態様では、上記抗体は、非電荷親水性ポリマーセグメントと、ｐＨ応答性の結合で連結されており、当該結合は、例えば、ｐＨ７未満の環境下、ｐＨ６．５以下の環境下、ｐＨ６．４以下の環境下、ｐＨ６．３以下の環境下、ｐＨ６．２以下の環境下、ｐＨ６．１以下の環境下、またはｐＨ６以下の環境下（例えば、エンドソーム内のｐＨ）で開裂する。リンカーが、エステル、スルホン酸エステル、ボロン酸エステル、リン酸エステル、アミド（カーバメートを含む。）、アセタール、ケタール、ヒドラゾン、イミン、イミド、エナミン、およびチオスクシンイミジルからなる群から選択されるｐＨ感受性の部位を有する場合、当該リンカーは、低下したｐＨに応答して開裂し得る。ある態様では、リンカーは、－ＮＨ－ＣＯ－ＣＨ＝ＣＨ－Ｌ３－ＣＯ－ＮＨ－を有し得る｛式中、Ｌ３は、血液中で安定なリンカー部分である。｝。当該リンカーは以下のスキームによって低ｐＨ環境下で開裂し、抗体を遊離させる｛以下スキームではＬ３がＲと表示されている｝。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　上記リンカーの有効性は、リンカー開裂後に、非電荷親水性セグメント（例えば、上図のようにＰＥＧ）が除去されるのみならず、インタクトの抗体（ＰＥＧ修飾に用いていたリジン側鎖のアミノ基が元通りのアミノ基に戻る）が放出される点からも明らかである。
　本発明のある態様によれば、上記抗体は、血管内皮細胞を通過して脳実質に入ると、ＢＢＢのトランスサイトーシス中に、または脳実質で、非電荷親水性ポリマーセグメントと解離する。この態様では、上記抗体は、非電荷親水性ポリマーセグメントと、還元環境応答性のリンカーで連結されており、当該結合は脳内の還元環境下で開裂する。この態様において、還元環境応答性の結合は、ジスルフィド結合であり得る。
　本発明のある態様によれば、非電荷親水性ポリマーセグメントと解離した抗体は、非電荷親水性ポリマーセグメントで修飾された抗体よりも、抗原への結合親和性が強い。還元環境下等において、抗体は、抗原に対する結合親和性を部分的にまたは完全に回復（または再活性化）させることができる。回復、または再活性化は、大きいほど好ましく、例えば、回復または再活性化された抗体の結合親和性は、未修飾抗体の結合親和性の５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上であり得る。
　本発明にある態様によれば、非電荷親水性ポリマーセグメントで修飾された抗体は、修飾前の抗体（未修飾の抗体）よりも抗原への結合親和性が弱い。この結合親和性の低減は、大きいほど好ましく、例えば、修飾された抗体の結合親和性は、未修飾抗体の３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、または０．１％以下であり得る。結合親和性は、例えば、血清中または生理食塩水中で測定することができる。このように、本発明の抗体は、修飾によって不活性化されていることができる。特に、本発明の抗体は、修飾によってその抗原に対する結合親和性を低減または消失していてよい。すなわち、本発明の抗体は、不活性化型抗体であり得る。
　抗体の抗原に対する結合親和性の低減や消失は、非電荷親水性ポリマーブロックによる立体障害により引き起こされ得る。したがって、非電荷親水性ポリマーブロックを嵩高くすることにより、および／または、修飾率を向上させることによって抗体の抗原に対する結合親和性をより大きく低減させるまたは消失させることができる。
　本発明のある態様によれば、非電荷親水性ポリマーセグメントで修飾された抗体は、修飾前の抗体（未修飾の抗体）よりも抗原への結合親和性が弱く、かつ、非電荷親水性ポリマーセグメントと解離した抗体は、非電荷親水性ポリマーセグメントで修飾された抗体よりも、抗原への結合親和性が強い。
　本発明によれば、非電荷親水性ポリマーセグメントで修飾された抗体は、脳実質内では、前記セグメントと開裂しており、修飾によって低下していた抗体の結合特性を回復させることができる。このような抗体は、例えば、血液脳関門が脆弱化した疾患の患者においては、特別な血糖操作をしなくても、グルコースによる修飾をしなくても、脳実質に到達し得、脳実質内でその結合特性を回復させることから有用であり得る。本発明によれば、この態様において前記非電荷親水性ポリマーセグメントは、ＧＬＵＴ１リガンドで修飾されていてもよい。ＧＬＵＴ１リガンドによる修飾は、正常な血液脳関門を有する対象において、当該抗体を脳血管内皮細胞のエンドソーム内または脳実質内に送る観点で有用である。
　本発明のある態様では、抗体と非電荷親水性ポリマーセグメントとは、－ＣＯ－Ｏ－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－｛ここで、Ｌ１は、置換若しくは非置換アルキレン、または置換若しくは非置換ヘテロアルキレンであり、Ｌ２は、血流で安定なリンカーである｝により連結されており、ペプチドのリジン残基の側鎖アミノ基にアミド結合を介して連結し、Ｌ２が非電荷親水性ポリマーセグメントと連結している。上記の－ＣＯ－Ｏ－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－は、脳実質の還元環境下では、Ｓ－Ｓ結合部分を開裂させる。これにより、Ｓ－Ｌ２－非電荷親水性ポリマーセグメント部分は、抗体から解離する。抗体は、－ＣＯ－Ｏ－Ｌ１－Ｓと連結した状態となるか、または、ＳがＣ＝Ｏを攻撃して環を形成して、抗体から遊離する。ＳがＣ＝Ｏを攻撃して環を形成して、抗体から遊離すると、抗体は、元の抗体（修飾前の抗体または未修飾の抗体）に戻り得る。
　本発明によれば、非電荷親水性ポリマーによってリンカーを介して修飾された抗体であって、非電荷親水性ポリマーがＧＬＵＴ１リガンドで修飾された抗体が提供される。当該抗体は、脳血管内皮細胞の管腔側表面に発現したＧＬＵＴ１と、ＧＬＵＴ１リガンドを介して結合することができる。血糖を低下させた対象に対して、グルコースを投与（またはＧＬＵＴ１リガンドを投与）すると、当該対象の脳血管内皮細胞の管腔側表面に結合した物質はエンドサイトーシスによって血管内皮細胞内に取り込まれ、その少なくとも一部は、トランスサイトーシスによって脳実質内に送達される。血糖を低下させた対象の脳血管内皮細胞の管腔側表面にはＧＬＵＴ１が発現しており、本発明の上記抗体は、ＧＬＵＴ１リガンドを介してＧＬＵＴ１に結合し、グルコースを投与（またはＧＬＵＴ１リガンドを投与）すると、エンドサイトーシスによって血管内皮細胞内に取り込まれ、その少なくとも一部は、トランスサイトーシスによって脳実質内に送達される。ここで、ＧＬＵＴ１と当該抗体との結合は、インビトロ実験において、単離したＧＬＵＴ１と当該抗体との結合を評価するアッセイによって確認することができる。非電荷親水性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびポリオキサゾリンなどの非電荷親水性のポリマーが挙げられる。ここで、「非電荷」とは、当該ポリマーセグメント全体において、電荷が中和していることを意味する。非電荷親水性ポリマーは、生体適合性である。
　ある態様では、本発明の抗体は、上記ＧＬＵＴ１リガンドとは別の脳内の受容体に対するリガンド（第２のリガンド）で修飾された非電荷親水性ポリマーセグメントを有することができ、または、有しないことができる。
　本発明によれば、本発明の上記抗体においてリンカーは、抗体のリジン残基の側鎖アミノ基に連結させることができる。当該連結は、好ましくは、共有結合であり得る。ある態様では、リンカーを連結したリジン残基は、抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域内に存在し得る。ある態様では、リンカーを連結したリジン残基は、抗体の重鎖および／または軽鎖可変領域のＣＤＲ領域内に存在し得る。
　ＧＬＵＴ１リガンドによる修飾は、血流から脳実質に移行するために用いられ、脳実質に移行した後に不要となり得る。従って、抗体が脳実質に移行した後には、抗体を修飾するＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されたＰＥＧは、抗体から切り離されてもよい。また、本発明によれば、抗体のリジン残基の側鎖アミノ基の修飾は、修飾の強度によっては抗体の結合特性を低下させ得る。従って、抗体が脳実質に移行した後には、抗体を修飾するＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されたＰＥＧは、抗体から切り離されてもよい。ＧＬＵＴ１リガンドは、ＰＥＧを修飾し得る。ＧＬＵＴ１リガンドは、ＰＥＧの末端の炭素原子または酸素原子を修飾し得る。
　例えば、脳の実質は、還元環境を有する。脳実質の還元環境は、２ｍＭのグルタチオン（ＧＳＨ）水溶液と同等の強度の還元環境である。リンカー中に、還元環境下で開裂することができる開裂部位を含めておくことによって、抗体が脳実質に送達された後に、リンカーが切断されるようにリンカーを構成することができる。このようなリンカーを還元環境下において開裂可能なリンカーという。本発明では、ＧＬＵＴ１リガンドにより修飾された非電荷親水性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）によって還元環境下において開裂可能なリンカーを介して修飾された抗体が提供される。本発明の抗体は、好ましくは、還元的環境を提供する脳実質においてリンカーを開裂させ得る。還元環境下において開裂可能なリンカーは、例えば、開裂部位としてジスルフィド結合を有し得る。還元環境下において開裂可能なリンカーを用いて、抗体とＧＬＵＴ１リガンドにより修飾されたＰＥＧを連結することによって、抗体が脳実質に送達された後に、リンカーが切断され、脳実質内で抗体を放出させることができる。
　還元環境下において開裂可能なリンカーは、開裂によって抗体のリジン残基の側鎖アミノ基を非置換のアミノ基となるように構成することができる。例えば、リンカーとして、（抗体－ＮＨ）－ＣＯ－Ｏ－Ｃ２Ｈ４－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－（非電荷親水性ポリマー）｛ここで、Ｌ２は、結合、または血流で安定なリンカーである｝を用いた場合には、リンカー中のジスルフィド結合が開裂すると以下のような反応によって、抗体のリジン残基の側鎖アミノ酸を回復させる。以下では、ＧＬＵＴ１リガンドがグルコース（Ｇｌｕｃ）であり、非電荷親水性ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、Ｌ２がＣ２Ｈ４－Ｏ－ＣＯ－である本発明の抗体が還元環境下でリンカーと解離して元の抗体に戻る機構が示される。この機構は、ＧＬＵＴ１リガンドがグルコース以外のＧＬＵＴ１リガンドであり、非電荷親水性ポリマーがＰＥＧ以外の非電荷親水性ポリマーである場合も同様であり、抗体が抗体以外のペプチド（例えば、タンパク質またはその断片）である場合も同様である。修飾ペプチドは、未修飾ペプチドの３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、または０．１％以下の生理活性を有し得る。また、還元環境下等において、修飾ペプチドは、その生理活性を部分的にまたは完全に回復（または再活性化）させることができる。回復、または再活性化は、大きいほど好ましく、例えば、回復または再活性化されたペプチドの結合親和性は、未修飾ペプチドの結合親和性の５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、または９５％以上であり得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　開裂によって抗体のリジン残基の側鎖アミノ基からリンカー部分が解離し、当該アミノ基が非置換のアミノ基に戻るように構成されることによって、還元環境下において開裂可能なリンカーは、脳実質において、抗体を非置換の状態に戻すことができる。抗体の結合特性は、リジン残基の側鎖アミノ基を修飾すると低下する可能性があることが指摘されており、リジン残基の側鎖アミノ基が修飾されることによって抗体の結合特性が低下した場合であっても、当該抗体が脳実質の還元環境下に送達されると、抗体のリジン残基の側鎖アミノ基の修飾が外れ、非置換の状態に戻り、これにより抗体は、その結合特性を回復させ得る。このようなリンカーの設計は、当業者であれば適宜行うことができる。
　従って、本発明の抗体は、リンカーが開裂することによって、修飾によって低下した抗体の結合特性を回復させることができる抗体であり得る。結合特性の回復は、種々の手法により達成し得、例えば、上記のようにリジン残基の側鎖アミノ基を非置換の状態に戻すことによって結合特性を回復させることができる。そしてこの際には、リンカーとして、（抗体－ＮＨ）－ＣＯ－Ｏ－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－（非電荷親水性ポリマーセグメント）｛ここで、Ｌ１は、置換若しくは非置換アルキレン、または置換若しくは非置換ヘテロアルキレンであり、Ｌ２は、結合または血流で安定なリンカーである｝を用いることができる｛（）の括弧内の構成は、リンカーには含まれない。リンカーと当該構成との連結関係を説明するために括弧内の構成が示された｝。このように本発明の抗体は、リンカーが－ＮＨ－ＣＯ－Ｏ－Ｃ２Ｈ４－Ｓ－Ｓ－Ｃ２Ｈ４－Ｏ－ＣＯ－を有し、抗体のリジン残基の側鎖アミノ基にアミド結合を介して連結している、抗体を好ましく用いることができる。本発明によれば、（抗体）－ＣＯ－Ｏ－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－（非電荷親水性ポリマーセグメント）｛ここで、Ｌ１は、置換若しくは非置換アルキレン、または置換若しくは非置換ヘテロアルキレンであり、Ｌ２は、血流で安定なリンカーである｝｛（）の括弧内の構成は、リンカーには含まれない。リンカーと当該構成との連結関係を説明するために括弧内の構成が示された｝が提供される。本発明によれば、さらに、（抗体）－ＣＯ－Ｏ－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－ＰＥＧ（非電荷親水性ポリマーセグメント）｛ここで、Ｌ１は、置換若しくは非置換アルキレン、または置換若しくは非置換ヘテロアルキレンであり、Ｌ２は、結合または血流で安定なリンカーである｝で表される構造を有するＰＥＧ連結リンカーが提供される。当該ＰＥＧ連結リンカーは、ＧＬＵＴ１リガンドによってＰＥＧが修飾されていてもよい。
　本発明のある好ましい態様では、Ｌ１は、エチレンであり、Ｌ２は－Ｃ２Ｈ４－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）－であり得る。
　本発明の抗体において、好ましい態様において、ＧＬＵＴ１リガンドは、グルコースであり得る。この態様において、グルコースは、例えば、その２位、３位または６位の炭素原子を介してＰＥＧと連結され得、ＧＬＵＴ１との好適に相互作用し得る。
　本発明の抗体において、ＰＥＧは、数平均重合度において、２，０００～１２，０００、例えば、５，０００であり得る。
　本発明の抗体において、リジン残基の側鎖アミノ基（第１級アミン）のうちの１０～９０％、２０～８０％、３０～７０％、または４０～６０％が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によってリンカーを介して修飾され得る。本明細書では、リジン残基の側鎖アミノ基のうちのＰＥＧ修飾されたアミノ基の割合を「ＰＥＧ」の後に当該割合（％）を付して表すことがある。
　本発明の抗体は、ＧＬＵＴ１リガンドで修飾されたＰＥＧによる修飾と、ＧＬＵＴ１リガンドで修飾されていないＰＥＧによる修飾の両方を受けていてもよい。本発明の抗体において、抗体を修飾するＰＥＧのうち、例えば、１０～１００％、３０～８０％、または４０～６０％のＰＥＧがＧＬＵＴ１で修飾され得る。本明細書では、ＰＥＧのうち、ＧＬＵＴ１リガンドで修飾されたＰＥＧの割合を「Ｇ」の後に当該割合（％）を付して表すことがある。
　本発明の抗体は、例えば、脳実質内の抗原（例えば、細胞内抗原、細胞表面抗原または細胞外抗原）に対して結合する抗体とすることができる。この態様において、本発明の抗体は、血中の成分に対しては、有意な結合を示さない抗体とすることができる。脳実質内の抗原としては、例えば、アミロイドβ（Ａβ、例えば、Ａβ１－４０およびＡβ１－４２）、その可溶性オリゴマー、その細胞外沈着物、β－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、異常型プリオンタンパク質（ミスフォールド型プリオンタンパク質）、スーパーオキサイドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、およびα－シヌクレインが挙げられる。Ａβは、好ましくは細胞外沈着物であり得る。
　抗体の抗原が脳実質内の腫瘍の表面抗原である場合、当該抗体は、抗体依存的細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）および／または補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ活性）を有する抗体とし得る。ＡＤＣＣ活性は、例えば、抗体のサブクラスをＩｇＧ１とすることにより増強され得る。抗体の抗原が脳実質内の腫瘍の表面抗原である場合、当該抗体は、細胞傷害剤との抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の形態であってもよい。抗体は、例えば、非ＡＤＣの形態であってもよい。
　本発明の抗体は、イメージング剤と連結していてもよい。イメージング剤としては、例えば、生体適合性の蛍光色素（例えば、可視光領域の蛍光、または近赤外領域の蛍光を発する蛍光色素）および発光色素（例えば、ルシフェラーゼ）、並びに、放射性同位体、超音波プローブ、ＭＲＩ用造影剤およびＣＴ用造影剤などのイメージング剤が挙げられる。イメージング剤と抗体とのコンジュゲートは、当業者であれば適宜作製することができる。
　本発明の抗体は、生理活性物質（例えば、酵素および核酸）と連結していてもよい。これにより、生理活性物質を脳実質に送達し得る。生理活性物質と抗体とのコンジュゲートは、当業者であれば適宜作製することができる。
　本発明によれば、本発明のペプチド若しくは抗体を含んでなる、脳疾患を処置または予防するための医薬組成物が提供される。脳疾患としては、例えば、不安、うつ病、睡眠障害、アルツハイマー病、パーキンソン病および多発性硬化症などが挙げられる。また、抗体としては、これら疾患の原因因子に結合し、その活性を中和する抗体が挙げられる。例えば、Ａβ、その可溶性オリゴマーおよびその細胞外沈着物に結合する本発明の抗体（例えば、Ａβおよび／またはその可溶性オリゴマーに結合して細胞外沈着物の形成または増加を阻害する抗体）、Ａβの細胞沈着物に結合して沈着物の増加を抑制する、または沈着物を減少させる本発明の抗体は、例えば、アルツハイマー病患者またはその発症リスクを有する患者に投与され、これによってアルツハイマー病の処置に用いられ得る。異常型プリオンタンパク質に結合する本発明の抗体（例えば、異常型プリオンタンパク質に結合して異常型プリオンタンパク質の蓄積の増加を抑制する、または蓄積を減少させる抗体）は、例えば、クロイツフェルト・ヤコブ病の患者またはその発症リスクを有する患者に投与され、これによってクロイツフェルト・ヤコブ病の処置に用いられ得る。ＳＯＤ１に結合する本発明の抗体（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）で発見されるＳＯＤ１変異体に結合して活性化させる抗体、例えば、ＳＯＤ１とＤｅｒｌｉｎ－１との結合を遮断する抗ＳＯＤ１抗体または抗Ｄｅｒｌｉｎ－１抗体）は、例えば、ＡＬＳ患者またはその発症リスクを有する患者に投与され、これによってＡＬＳの処置に用いられ得る。α－シヌクレインに結合する本発明の抗体（例えば、α－シヌクレインに結合してα－シヌクレインの蓄積の増加を抑制する抗体または蓄積を減少させる抗体）は、レビー小体型認知症およびパーキンソン病などのシヌクレイノパチーの患者若しくはそのリスクを有する患者に投与され、これによってシヌクレイノパチーの処置に用いられ得る。本発明によれば、このように疾患の処置に用いられる抗体もまた提供される。本明細書では、「病気の処置」は、病気の予防および病気の治療を意味する。病気の予防は、病気の発症を防止すること、発症を遅延させること、発症率を低下させること、を含む意味で用いられる。病気の治療は、病気の悪化の速度の低下、悪化の遅延、悪化の防止、病気の症状の軽減、病気の治癒、および病気の寛解を含み意味で用いられる。
　本発明のペプチド若しくは抗体または医薬組成物は、投与計画に従って投与され得る。ここで投与計画は、
　対象の血糖を低下させることと、その後、
　当該対象に対して、血糖値の上昇を誘発させない場合と比較してより多くの抗体が脳実質に移行するように、血糖値の上昇を誘発させること、および、本発明のペプチド若しくは抗体または医薬組成物を投与することを含み得る。
　本発明による投与計画では、該組成物は、該対象における血糖値の上昇の誘発と、同時に、連続してまたは逐次的に該対象に投与され得る。投与計画は、該対象への組成物の投与と該対象における血糖値の上昇の誘発との間にインターバルを有してもよいし、有さなくてもよい。該組成物が該対象における血糖値の上昇の誘発と同時に投与される場合には、該組成物は、血糖値の上昇の誘発を引き起こす薬剤と混合した形態で該対象に投与してもよいし、該対象における血糖値の上昇の誘発を引き起こす薬剤とは別の形態で投与してもよい。また、該組成物は、該対象における血糖値の上昇の誘発と、連続してまたは逐次的に該対象に投与される場合には、該組成物は該対象における血糖値の上昇の誘発より前に該対象に投与してもよいし、後に投与してもよいが、好ましくは、該組成物は該対象における血糖値の上昇の誘発より前に該対象に投与することができる。該対象への該組成物の投与よりも先に該対象において血糖値の上昇を誘発させる場合には、該対象において血糖値の上昇を誘発させてから、１時間以内、４５分以内、３０分以内、１５分以内または１０分以内に該対象に該組成物を投与することが好ましい。また、該対象への該組成物の投与よりも後に該対象において血糖値の上昇を誘発させる場合には、該対象に該組成物を投与してから、６時間以内、４時間以内、２時間以内、１時間以内、４５分以内、３０分以内、１５分以内または１０分以内に該対象において血糖値の上昇を誘発させることが好ましい。上記の投与計画のサイクルは、２回以上行なってもよい。グルコース投与とサンプル投与の前後関係は、血液脳関門を通過させるタイミングにより決定することができる。
　本発明の医薬組成物は、本発明の抗体に加えて、医薬上許容可能な賦形剤をさらに含んでいてもよい。本発明の医薬組成物は、様々な形態、例えば、液剤（例えば注射剤）、分散剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末剤、坐剤などとすることができる。好ましい態様では、本発明の医薬組成物は、注射剤であり、非経口（例えば、静脈内、経皮、腹腔内、および筋内）で投与され得る。
　本発明によれば、対象に抗体を投与する方法であって、前記対象に本発明の抗体を投与することを含む、方法が提供される。本発明によれば、対象の脳実質に抗体を送達する方法であって、前記対象に本発明の抗体または当該抗体を含む医薬組成物を投与することを含む、方法が提供される。投与は、静脈投与であり得る。これらの方法においては、本発明の抗体は、本発明による投与計画に従って投与され得る。
　本発明によれば、抗体を製造する方法であって、抗体のリジン残基の側鎖アミノ酸に還元環境下で開裂可能なリンカーを介して、グルコースで修飾されたポリエチレングリコールを連結させることを含む、方法が提供される。本発明においては、リンカーとして、（ＧＬＵＴ１リガンド－ＰＥＧ）－Ｌ２’－Ｃ２Ｈ４－Ｓ－Ｓ－Ｃ２Ｈ４－Ｏ－ＣＯ－（ＮＨ－抗体）を用いることができる｛括弧内の構成は、リンカーには含まれない。リンカーと当該構成との連結関係を説明するために括弧内の構成が示された。Ｌ２’は結合または血流で安定なリンカーであり、好ましくは、カーバメート結合ＮＨ－ＣＯ－Ｏであり得る｝。
　本発明のすべての態様において、抗体に代えてペプチドを用いることができる。本発明のある態様では、ペプチドは、複数のリジン残基を有する。本発明のある態様では、ペプチドは、その表面に複数のリジン残基を有する。本発明のある態様では、ペプチドは、その表面に複数のリジン残基を有し、当該リジン残基のうち複数の残基が、ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーによってリンカーを介して修飾されている。これらの態様において、ＧＬＵＴ１リガンドは、グルコースであり得る。これらの態様において、非電荷親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールまたはポリオキサゾリンであり得る。これらの態様において、リンカーは、還元環境下において開裂可能なリンカーである。これらの態様において、ＧＬＵＴ１リガンドは、グルコースであり得、非電荷親水性ポリマーは、ポリエチレングリコールまたはポリオキサゾリンであり得、リンカーは、還元環境下において開裂可能なリンカーであり得る。ペプチドからのリンカーの解離は、好ましくは、修飾されていたアミノ基を第１級アミンに戻すように行われる。リンカーが解離した後では、ペプチドは、ペプチド本来の生理活性を有し得る。
　本発明によれば、ＧＬＵＴ１リガンドで修飾されたＰＥＧで－Ｎ－Ｌ２’－Ｃ２Ｈ４－Ｓ－Ｓ－Ｃ２Ｈ４－Ｏ－ＣＯ－を介して修飾されたリジン残基を有するペプチド｛Ｌ２’の定義は上記の通り｝が提供される。当該ペプチドは、ＰＥＧで－ＮＨ－Ｌ２’－Ｃ２Ｈ４－Ｓ－Ｓ－Ｃ２Ｈ４－Ｏ－ＣＯ－を介して修飾されたリジン残基をさらに有していてもよい｛Ｌ２’の定義は上記の通り｝。本発明によれば、修飾ペプチドは、ＧＬＵＴ１リガンドで修飾されたＰＥＧで－Ｌ２－Ｃ２Ｈ４－Ｓ－Ｓ－Ｃ２Ｈ４－Ｏ－ＣＯ－を介して修飾されたリジン残基を複数有し得る｛Ｌ２’の定義は上記の通り｝。
　本発明によれば、ペプチドを製造する方法であって、ペプチドのリジン残基の側鎖アミノ酸に還元環境下で開裂可能なリンカーを介して、グルコースで修飾されたポリエチレングリコールを連結させることを含む、方法が提供される。本発明においては、リンカーとして、（ＧＬＵＴ１リガンド－ＰＥＧ）－Ｌ２’－Ｃ２Ｈ４－Ｓ－Ｓ－Ｃ２Ｈ４－Ｏ－ＣＯ－（ペプチド）を用いることができる｛括弧内の構成は、リンカーには含まれない。リンカーと当該構成との連結関係を説明するために括弧内の構成が示された。Ｌ２’の定義は上記の通り。｝。
　本発明によれば、本発明の修飾ペプチドを含む、組成物が提供される。修飾ペプチドは、本発明の投与計画に従って投与することができ、それにより、脳に送達され、脳内でリンカーを開裂させることができる。当該組成物は、医薬組成物であり得る。ペプチドは、ペプチド補充療法に用いられるペプチドであり得る。ペプチドは、タンパク質の全長のアミノ酸配列を含み得る。ある態様では、ペプチドは、抗体の一部であり得る。ある態様では、ペプチドは、抗体であり得る。ある態様では、本発明の抗体は、上記修飾ペプチドを含み得る。
　本発明によれば、本発明の医薬組成物の製造における、本発明のペプチドまたは抗体の使用が提供される。
実施例１：材料と方法
　材料および動物。１，２：３，４－ジ－Ｏ－イソプロピリデン－α－Ｄ－グルコフラノシド（ＤＩＧ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を東京化学工業（東京、日本）から購入した。エチレンオキシド（ＥＯ）は日本液炭（東京、日本）から入手し、トラップ－トラップ法によりＣａＨ２で精製した。
重合に用いた溶媒（ＴＨＦ、ＣＨ２Ｃｌ２およびＤＭＦ）を、ニッコー・ハンセン株式会社（大阪、日本）から購入した中性アルミナの２つの充填カラムに通して精製した。α－メトキシ－ω－アミノポリ（エチレングリコ－ル）（ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２）（ＰＥＧのＭｗは２，２００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０５）は、ＮＯＦ　Ｃｏ．、　Ｌｔｄ．（東京）から購入した。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ－ＰＢＳ（－））、リン酸緩衝液中のＤ－（＋）－グルコ－スおよびパラホルムアルデヒドは、和光純薬工業株式会社（大阪、日本）から購入した。細胞溶解バッファ－はＰｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＷＩ、マディソン）から購入した。グルタチオン（ＧＳＨ）はＴｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，　Ｉｎｃ．（京都、日本）から購入した。ビス（２－ヒドロキシエチル）ジスルフィドおよび４－ニトロフェニルクロロホルメ－トをＳｉｇｍａ社から購入した。抗核孔複合体タンパク質（抗ＮＰＣＰ、製品番号：ａｂ６００８０）、抗Ａβ１－４０、および抗ＢＡＣＥ１（製品番号：ａｂ２０７７）は、Ａｂｃａｍ　Ｉｎｃ．から購入した。
　動物実験はすべて、ｉＣＯＮＭ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，　Ｋａｗａｓａｋｉ，　Ｊａｐａｎ）が定めた実験動物の飼養および使用に関するガイドラインを遵守して実施した。
　１，２：５，６－ジ－Ｏ－イソプロピリデン－α－Ｄ－グルコフラノシド（ＤＩＧ）からのエチレンオキシド（ＥＯ）の開環重合。ＥＯ重合は我々の以前の研究に従って行った２６。簡単に説明すると、ＴＨＦに溶解した５２０ｍｇ（２．０ｍｍｏｌ）のＤＩＧを、７０℃の真空中で反応管中で昇華させた。次に、ＴＨＦ（６．６ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）中の０．３Ｍナフタレンカリウム溶液（６．６ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）を滴下した後、Ａｒ雰囲気中で撹拌しながら４．６ｍＬのＥＯ（９２アルツハイマーＨＦ溶解ＤＩＧ溶液に添加した。２５℃で４８時間攪拌後、２ｍＬのＭｅＯＨを溶液に添加した。次いで、混合物を撹拌を介して氷冷ジエチルエ－テルで洗浄して、ＤＩＧ－ＰＥＧ－ＯＨの白色沈殿を得た。ここでＰＥＧは、数平均分子量が５，０００であった。
　ＤＩＧ－ＰＥＧ－ＯＨの末端アミノ化。ＤＩＧ－ＰＥＧ－ＯＨのω－ヒドロキシル基を、我々の以前の作業２８で報告されている通常の方法により、ω－アミノ基に変換した：２．０ｇのＤＩＧ－ＰＥＧ－ＯＨ（１ｍｍｏｌ、ＴＨＦ中）および８３０μＬのＴＥＡ（６．０ｍｍｏｌ）を、氷中のメタンスルホニルクロライド（３８７μＬ、５．０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ溶液中に添加した。溶液を２５℃で６時間撹拌し、次いでそれを氷冷ジエチルエ－テル中に滴下して、ＤＩＧ－ＰＥＧ－ＯＭｓの白色沈殿を得た。真空中で乾燥後、ＤＩＧ－ＰＥＧ－ＯＭｓの白色固体を、２００ｍＬ、２５％アンモニア水溶液に溶解し、そして２５℃で４８時間撹拌した。蒸発、透析、凍結乾燥を混合物のために行い、イオン交換クロマトグラフィ－（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｃ－２５、ＧＥヘルスケア）を行い、アミノ化されていないＰＥＧ画分を除去した。蒸発および凍結乾燥後、純粋なＤＩＧ－ＰＥＧ－ＮＨ２の白色粉末を得た。
ペグ化抗体の調製および特徴付け
　ビス（ＮＰ－エチル）ジスルフィド（ＮＰ－ＣＣ－ＳＳ－ＣＣ－ＮＰ）の調製。最初に、ビス（２－ヒドロキシエチル）ジスルフィド（０．５ｍｍｏｌ）および４－ニトロフェニルクロロホルメ－ト（ＮＰＣ、１．５ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（８ｍＬ）に溶解した。溶液を０℃で１０分間撹拌し、次いでトリメチルアミン（１．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応は室温で５時間行った。シリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィ－で精製後、二硫化ビス（ＮＰ－エチル）を回収し、１Ｈ　ＮＭＲで分析した（図Ｓ１）。
　ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＣＣ－ＳＳ－ＣＣ－ＮＰ及びグルコース（Ｇｌｕｃ）－ＰＥＧ－ＣＣ－ＳＳ－ＣＣ－ＮＰの調製合成したビス（ＮＰ－エチル）ジスルフィドを、ビス（ＮＰ－エチル）ジスルフィド：ＤＩＧ－ＰＥＧ－ＮＨ２またはＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２＝２０：１のモル比で、ＤＭＦに溶解したＤＩＧ－ＰＥＧ－ＮＨ２およびＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２にそれぞれ添加し、１２時間反応させて、それぞれＤＩＧ－ＰＥＧ－ＣＣ－ＳＳ－ＣＣ－ＮＰおよびＭｅＯ－ＰＥＧ－ＣＣ－ＳＳ－ＣＣ－ＮＰを得た。１Ｈ　ＮＭＲで同定されたように、８０％ＴＦＡを用いてＤＩＧの脱保護し、Ｇｌｕｃ－ＰＥＧ－ＣＣ－ＳＳ－ＣＣ－ＮＰを得た（図Ｓ２）。
　ＰＥＧ化抗体は以下の説明の通りに調製した。ＰＥＧ化抗体形成に対するグルコ－ス修飾の効果を、リン酸緩衝液（２００ｍＭ、ｐＨ８．５）中で２ｍｇ／ｍｌ抗体と複合体形成したＧｌｕｃ－およびＭｅＯ－ＰＥＧ－ＣＣ－ＳＳ－ＣＣ－ＮＰ（１０ｍｇ／ｍｌ、ＤＭＦ）の割合を変えることによって評価した。次いで、混合物を４℃で種々の反応時間撹拌した。その後、溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ　６で精製し（３回、カットオフＭＷは３０，０００Ｄａ、１０ｍＭ　ｐＨ７．４リン酸緩衝食塩水）、０、２５、５０、７５、および１００％グルコ－ス修飾を有するＧｌｕｃ－ＰＥＧ化抗体（ポリマ－組成百分率で決定）を得た。０、２５、５０、７５、および１００％グルコ－ス修飾を有するＧｌｕｃ－ＰＥＧ化抗体をそれぞれ、Ｇ０－ＰＥＧ化抗体、Ｇ２５－ＰＥＧ化抗体、Ｇ５０－ＰＥＧ化抗体、Ｇ７５－ＰＥＧ化抗体、Ｇ１００－ＰＥＧ化抗体と呼ぶ。
　ＰＥＧ化抗体は、サイズ排除クロマトグラフィ－（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　６　Ｅｌｉｇｈｔ　１０／３００カラム、ＧＥ）を用いて分析した。ロードした試料容量は１００μｌに設定し、流速０．５　ｍＬ／分でリン酸緩衝食塩水（１０　ｍＭ、ｐＨ　７．４、１５０　ｍＭ　ＮａＣｌ）で溶出した。蛍光シグナルは、それぞれ６５２ｎｍと６６８ｎｍのＥｘとＥｍで検出した。
　ＰＥＧ化抗体のサイズ分布のＤＬＳ測定は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ．，　Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，　ＵＫ）を用いて実施した。リン酸緩衝生理食塩水（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中２５°Ｃで実施した。
　抗体の蛍光標識。蛍光標識抗体を、ＰＥＧ化抗体からの抗体の回復（ＰＥＧ修飾の離脱、すなわち、遊離抗体への回復。図１参照）の測定のために調製した。抗体をｐＨ８．０、０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ３緩衝液に溶解した。次いで、Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ　６４７またはＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ　４８８スクシンイミジルエステル（米国インビトロジェン）（ＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍＬ；抗体１０当量）を抗体溶液に加え、４℃で４時間撹拌した。試料をＶｉｖａｓｐｉｎ　６（ＭＷＣＯ＝１０，０００）（×４、０．０１Ｍ、ｐＨ＝７．４　ＰＢＳ）で精製した。標識されたＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ　６４７またはＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ　４８８の濃度を、連続希釈された遊離Ａｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ　６４７の標準検量線に基づいて測定した。標識したＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ　６４７またはＡｌｅｘａ－Ｆｌｕｏｒ　４８８と抗体との間のモル比は、染料および抗体の濃度を比較することにより、それぞれ１．３１および１．２７と算出された。
　ＰＥＧ化抗体のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの回復。ＰＥＧ化抗体を脳内の還元条件を模倣する２ｍＭ　グルタチオン（ＧＳＨ）と共に３７℃で４時間インキュベ－トした。図１に示されるように、ＰＥＧ化修飾部分は、還元環境においてＰＥＧ化抗体から離脱し、抗体は、修飾前の状態に回復すると考えられる（抗体の回復工程）。その後、溶液をＶｉｖａｓｐｉｎ　６で精製した（３回、カットオフＭＷは３０，０００Ｄａ、１０ｍＭ、ｐＨ７．４リン酸緩衝生理食塩水緩衝液）。回復した抗体は、上記の方法と同じ方法でＧＰＣにより確認された。抗Ａβ１－４０および抗ＮＰＣＰを用いて、回復した抗体の生物活性を評価した。ＭＣＦ－７細胞を８チャンバーカバーガラス上に播種し、５００μＬのダルベッコ改変イ－グル培地（ＤＭＥＭ）（１０％ＦＢＳ）中で１８時間インキュベ－トした。次いで、ＭＣＦ－７細胞を４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、次いで０．２％トリトンＸ－１００で５分間処理して膜を破壊した。次いで、細胞を非特異的認識を防止するために１％ＢＳＡ溶液で１０分間処理し、１％ＢＳＡ溶液中で同濃度の抗ＮＰＣＰ含量（２μｇ／ｍＬ；１５ｎＭ）と共に、Ａｌｅｘａ－４８８標識天然抗ＮＰＣＰ、ＰＥＧ化抗ＮＰＣＰ、および回復した抗ＮＰＣＰとそれぞれ１時間インキュベ－トした。全試料を観察し、ＤＡＰＩによる核染色後に共焦点レ－ザ－走査顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）を用いて画像を撮影した。抗Ａβ１－４０の生物活性を、ＴｈＴアッセイを用いてＡβ１－４０の凝集に対するその影響により評価した２９。
　チオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイ。Ａβ１－４０の凝集に及ぼす抗Ａβ１－４０の影響をＴｈＴアッセイで分析した２９。簡単に述べると、ヘキサフルオロイソプロパノ－ル中に溶解したＡβ１－４０を風乾し、次いでそれを５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ＝７．４）中に２０μＭの一定濃度で溶解した。次に、様々なモル比の抗Ａβ１－４０：Ａβ１－４０（１：５０、１：１０、１：２．５、１：１および０：１）となるように、遊離天然抗Ａβ１－４０、ＰＥＧ化抗Ａβ１－４０および還元剤（ＧＳＨ）処理抗Ａβ１－４０をＡβ１－４０溶液に添加した。次いで、１０μＭのＴｈＴを溶液に添加し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００　ＰＲＯ分光光度計を用いて室温で４４０ｎｍの励起波長および４８０ｎｍの発光波長でＡβ１－４０凝集をモニターした。
　抗体の血液循環。マウスに２００μｌ、０．１５ｍｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ６４７標識ＰＥＧ化抗体（１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中のＧ０－、Ｇ２５－、Ｇ５０－、Ｇ７５－、およびＧ１００－ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１および遊離抗ＢＡＣＥ１（全て同濃度のＡｌｅｘａ－６４７標識抗体である）を静脈内投与した。注射後の種々の時点でマウスの血管から採取した３０μｌの血液を１５，０００ｒｐｍの速度で濃縮し、血清を得た。次に、血清抗ＢＡＣＥ１を１０ｍＭ、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水緩衝液で希釈した後にＩｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００　ＰＲＯ分光光度計（Ｔｅｃａｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｌｔｄ．，　メネドルフ，　スイス）を用いた蛍光測定により定量した。
　ｉｎ　ｖｉｖｏ試験における抗体の蓄積。インビボで送達された抗体の分布を分析するために、ＷＯ２０１５／０７５９４２Ａに記載される方法に従って、絶食したマウスに対して抗体を投与し、その後にグルコースを投与して血糖値を上昇させ、これにより、抗体の脳への移行を促進させた。具体的には、ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週間、ｎ＝５）を２４時間絶食させた。その後、これらのマウスに０．１５ｍｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ６４７で標識したＰＥＧ化抗体（１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水中のＧ０－、Ｇ２５－、Ｇ５０－、Ｇ７５－、およびＧ１００－ＰＥＧ化抗体および遊離抗体）２００μｌを静脈内投与し、３０分後に２００μｌの２０ｗｔ％Ｄ－（＋）－グルコ－スを含むＤ－ＰＢＳ（－）を腹腔内投与した。マウスを屠殺し、抗体の注射後、様々な時点（１２、２４、および４８時間）でＤ－ＰＢＳ（－）の灌流により過剰な血液を洗い流した。脳を切除し、Ｄ－ＰＢＳ（－）で洗浄し、その重量を測定し、過剰な洗浄液を除去した後、６００μＬの細胞溶解緩衝液でホモジナイズした。下大静脈から血液を採取し、ヘパリン処理し、遠心分離して血漿を得た。Ａｌｅｘａ　６４７標識抗体の蓄積を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００　ＰＲＯ分光光度計（Ｔｅｃａｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｌｔｄ．、メネドルフ、スイス）を用いた蛍光測定により定量した。
　ＡＰＰ／ＰＳ１マウスにおけるアミロイドβ産生の抑制。脳内Ａβ１－４０は既報と同じ方法で採取された３０。６週齢のマウスに、抗体（２０ｍｇ／ｋｇ）およびＰＢＳを静脈内注射した。次いで、マウスに対し、注射後様々な時点で潅流を実施した。Ａβ１－４０の測定では、採取した脳試料を５Ｍグアニジン塩酸塩緩衝液中でホモジナイズした。これらのサンプルを２５℃で３時間回転させ、次いで、新たに添加したアプロチニン（２０ｍｇ／ｍｌ）およびロイペプチン（１０ｍｇ／ｍｌ）、０．２５％カゼインおよび５ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を含むＰＢＳで希釈した（１：１０）。希釈したホモジネ－トを１４Ｋ　ｒｐｍの速度で２０分間遠心し、Ａβ１－４０を含む上清を単離し、サンドイッチＥＬＩＳＡ（和光、日本）でＡβ１－４０の濃度を測定した。
結果と考察
ペグ化抗体の調製および特徴付け
　最初に、ビス（ＮＰＣ－エチル）ジスルフィドを、無水ＤＣＭ溶解ビス（２－ヒドロキシエチル）ジスルフィドおよび４－ニトロフェニルクロロホルメ－トから合成した。次いで、合成したビス（ＮＰＣ－エチル）ジスルフィドを、ＤＭＦ溶解ＤＩＧ－ＰＥＧ－ＮＨ２およびＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２溶液にそれぞれ１２時間添加して、ＤＩＧ－ＰＥＧ－ＳＳ－ＮＰＣおよびＭｅＯ－ＰＥＧ－ＳＳ－ＮＰＣを得た。ＤＩＧは、１Ｈ　ＮＭＲにより同定されたように、脱保護され、Ｇｌｕｃ－ＰＥＧ－ＳＳ－ＮＰＣを得た（図Ｓ２）。反応進行の全てを、材料および方法のセクションに詳細に記述した。
　修飾されたＰＥＧ数を、フルオレサミンとカップリングできる未修飾アミンの数によって決定される修飾されたアミンの程度で定量した。ペグ化抗体（４μＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ；１０ｍＭリン酸緩衝液）をフルオレサミン（２μＬ、３ｍｇ／ｍＬ；ＤＭＦ）と共に室温で１５分間インキュベ－トし、蛍光シグナルをＮＤ－３３００蛍光分光計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ，ＵＳＡ）を用いて測定した。得られた蛍光シグナルを、既知の３０個の第１級アミンを有する連続希釈ＢＳＡの標準較正曲線に基づいて第１級アミンの濃度を推定した。例えば、抗ＢＡＣＥ１について、結果として、天然の抗体中の合計８０個の第一級アミンが計算され、１００％と定義された。まず、ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＳＳ－ＮＰＣを用いて、有効なペグ化およびペグ化抗体を評価する。図２ａに示すように、ＰＥＧ：アミノ基のモル比を５：１として実施し、アミンに対するコンジュゲーションは反応時間の延長に伴って増加し、１５時間の反応時間で７３．２％のプラトーに到達した。次いで、結合時間を制御することにより、抗体中の第一級アミンの修飾度は、１２．５％、２５．５％、５２．１％および７３．２％と決定され、それぞれ、ＰＥＧ１２．５抗体、ＰＥＧ２５．５抗体、ＰＥＧ５２．１抗体、およびＰＥＧ７３．２抗体と命名された。一方、アミンに対するコンジュゲーションの程度は活性ＰＥＧ分子の増加に伴い増加した（図２ｂ）。例えば、１０：１と設定したＰＥＧ／アミノ基のモル比の場合、６時間のコンジュゲーション時間でアミン修飾レベルは７６．７％に達し、これはＰＥＧ／アミノ基のモル比＝１：１の約４倍である（図２ｂ）。
　次いで、ＰＥＧをコンジュゲートした抗体をゲル透過クロマトグラフィ－（ＧＰＣ）でさらに分析した。ここでは、ＰＥＧ２５．５－抗－ＢＡＣＥ１を例として取り上げ、調製したＰＥＧ化抗－ＢＡＣＥ１は、ＧＰＣで測定した場合、天然の抗体よりもはるかに早い溶出ピ－ク時間を有し、このことは、ＰＥＧが抗体に首尾よくコンジュゲートされたことを意味する（図３ａ）。抗体のサイズはまた、天然の抗体と比較して、ＰＥＧ化抗体について増加した。例えば、サイズは、天然の抗ＢＡＣＥ１の８．５７ｎｍから、２５．５％のアミン基がＰＥＧとコンジュゲートしているＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１（ＰＥＧ２５．５－抗－ＢＡＣＥ１）の１１．５１ｎｍに増加し、動的光散乱（ＤＬＳ）により特徴付けられるように、狭い粒度分布（ＰＤＩ＜０．１５）を有する（図３ｂ）。
還元剤で処理したＰＥＧ化抗体の生物活性の回復
　ＰＥＧ修飾は蛋白質修飾のための広く研究されている技術である。しかし、ＰＥＧしゅう蝕は、修飾するタンパク質の生物活性に大きく影響し得る。ここでは、復帰可能なリンカーであることから、還元条件下でコンジュゲ－トアミノ基を回復して、コンジュゲ－トＰＥＧを抗体から追跡不能に除去できることを実証した。抗体の回復を実施するために、ＰＥＧ化された抗ＢＡＣＥ１を２ｍＭ　ＧＳＨで処理した。２ｍＭ　ＧＳＨは、脳内の還元的環境と同等の還元環境を溶液にもたらす。ＧＰＣによる抗ＢＡＣＥ１の特徴付けに関して図３ａに示すように、２ｍＭ　ＧＳＨで処理した抗ＢＡＣＥ１は、天然のものとほとんど同じ流動ピ－ク時間を示し、これは、処理された抗ＢＡＣＥ１が、抗体からコンジュゲ－トされたＰＥＧを除去することに成功し、天然の抗体と同等の分子量に分子量を回復させたことを意味する。
　抗体を確認するために、コンジュゲ－トＰＥＧから適切な破壊を受け、従って、生物活性は還元条件下で回収され、還元的に放出された抗Ａ・１－４０（上記のように収集され、定量された）Ａβ１－４０凝集を阻害する能力が評価された（図３ｃ）。天然の抗Ａβ１－４０によるＡβ１－４０凝集の阻害は、チオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイによりｉｎ　ｖｉｔｒｏで初めて確認された。抗Ａβ１－４０と可溶性Ａβ１－４０との共培養（６時間、ＰＢＳ中、ｐＨ７．４）は、凝集の明白な用量依存的阻害を生じた。試験した最高濃度（抗Ａβ１－４０：Ａβ１－４０モル比１：１）では、抗Ａβ１－４０の非存在下でインキュベ－トしたＡβ１－４０と比較して、凝集阻害は９２．２％であった（図３ｃ）。低モル比（１：５０）でさえ、抗Ａβ１－４０は依然として強い阻害作用（６３．９％抑制）を示した。次に、ＰＥＧ化抗Ａβ１－４０および放出された抗Ａβ１－４０の阻害活性を調べた。ＰＥＧ化抗Ａβ１－４０は、試験した全濃度において、天然の抗Ａβ１－４０と比較して、Ａ・凝集に対する阻害効率がはるかに弱いことがわかった（図３ｃ）。重要なことに、放出された抗Ａβ１－４０の阻害活性は天然の抗Ａβ１－４０の阻害活性に匹敵し（図３ｃ）、放出された抗Ａβ１－４０の共役ＰＥＧの効率的な破壊と生物活性の回復を示している。
　次いで、還元条件下（２ｍＭ　ＧＳＨ、３７℃）で４時間インキュベ－トしながら、種々のパ－セントのＰＥＧ分子結合抗Ａβ１－４０の生物活性の回復を評価した。図３ｄに示すように、抗Ａβ１－４０：Ａβ１－４０の比率は１：２．５と設定され、還元剤処理したＰＥＧ１２．５％－抗Ａβ１－４０とＰＥＧ２５．５％－抗Ａβ１－４０の溶液について、Ａβ１－４０凝集の阻害効率はほぼ同じであった。しかし、還元剤で処理したＰＥＧ５２．１－抗Ａβ１－４０およびＰＥＧ７３．２－抗Ａβ１－４０の溶液では、Ａβ１－４０凝集の阻害効率は明らかに低下し、この還元条件下では抗Ａβ１－４０の生物活性は完全には回復できず、ＰＥＧ化の効果が高い抗体の還元条件下では完全には回復しなかった。他方、ナノ粒子上の十分なグルコ－ス数がＢＢＢ通過に必要であることを考慮し、以下のＢＢＢ通過実験および治療実験に関してはＰＥＧ２５．５％抗Ａβ１－４０抗体を選択した。
　抗－核孔複合体蛋白質（抗ＮＰＣＰ）の微量放出抗体の生物活性も共焦点イメ－ジングを用いて評価した。抗ＮＰＣＰは核膜孔複合体タンパク質を標的とする抗体であるが、核膜孔複合体タンパク質は、核膜を通過する生体分子の輸送を制御する３１。天然の抗ＮＰＣＰ　ＩｇＧは固定されたＭＣＦ－７細胞のＮＰＣＰを選択的に認識することができるが（図４ａ）、ＰＥＧで修飾された抗ＮＰＣＰ　ＩｇＧ（ＰＥＧ２５．５抗ＮＰＣＰ　ＩｇＧ）はこの選択性を失う（図４ｂ）。しかし、ＮＰＣＰに対する抗ＮＰＣＰ　ＩｇＧの結合生物活性は、２ｍＭ　ＧＳＨで４時間インキュベ－トした後に大部分が回復した（図４ｃ）。
抗体の血液循環時間
　次に、Ｇｌｕｃ－ＰＥＧ－ＳＳ－ＮＰＣおよびＭｅＯ－ＰＥＧ－ＳＳ－ＮＰＣを対応する種々のモル比で混合することにより、０％，２５％，５０％，７５％および１００％の様々なグルコ－ス修飾比率（全ポリマーに対するグルコース修飾ポリマーの比率）が得られた。次に、これらの混合ポリマ－を抗ＢＡＣＥ１に結合させて、種々のグルコ－ス修飾比率を有するＰＥＧ化抗体を得た。これらは、そのグルコース修飾比率に従って、それぞれ、Ｇ０－ＰＥＧ－抗－ＢＡＣＥ１、Ｇ２５－ＰＥＧ－抗－ＢＡＣＥ１、Ｇ５０－ＰＥＧ－抗－ＢＡＣＥ１、Ｇ７５－ＰＥＧ－抗－ＢＡＣＥ１およびＧ１００－ＰＥＧ－抗－ＢＡＣＥ１と命名した。マウスに静脈内投与した場合のＡｌｅｘａ　６４７で標識したこれらのＰＥＧ化抗体の薬物動態プロフィ－ルを測定した。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００　ＰＲＯ分光光度計（Ｔｅｃａｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｌｔｄ．メネドルフ、スイス）を用いて、マウスの尾静脈から採取した血清の蛍光シグナルに基づいて、血中滞留時間を検討した。図５ａに示すように、ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１はいずれもグルコース修飾比率（すなわち、表面グルコ－ス密度）に関係なく血中滞留時間が延長し、Ｇ０－ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１、Ｇ２５－ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１、Ｇ５０－ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１、Ｇ７５－ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１およびＧ１００－ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１に対する半減期はそれぞれ２．３４日、３．０１日、３．５９日、３．３０日であった。一方、Ａｌｅｘａ－６４７を標識した天然の抗体は、循環時間が短く、半減期は１．７３日であった。この結果は、ＰＥＧ化抗体系が抗体の血中滞留時間を有意に改善し、その治療効果を増強する可能性があることを示した。また、抗体の血中滞留時間は、ＰＥＧの末端のグルコース修飾比率が向上すると改善したが、少なくとも血中大量時間に対する低下などの悪影響は認められなかった。
脳内における抗体の蓄積
　その後、脳内での抗体蓄積の検定を行い、ＧＬＵＴ１のリサイクリング機構を介してこのＧｌｕｃ－ＰＥＧ－抗体によりＢＢＢを越えてＣＮＳに機能的な抗体が十分に送達できるかどうかを検証した。血糖誘発性のＧＬＵＴ１リサイクリングの手順に関する著者らの以前の報告によれば、著者らは、より多くのＧＬＵＴ１がＢＣＥＣの管腔細胞膜上に局在するように、マウスを２４時間絶食させ、次いで２０％遊離グルコ－スの腹腔内注射により３０分で最高血中グルコ－ス濃度を達した。Ａｌｅｘａ６４７で標識したＰＥＧ化抗体およびＡｌｅｘａ６４７で標識した遊離抗体を、尾静脈注射により投与した。これらの抗体注入の９０分後に屠殺した時点で、脳組織を採取し、洗浄およびホモジェナイズに供した。次いで、これらの試料の蛍光強度を、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｍ１０００　Ｐｒｏマイクロプレ－トリ－ダ－（ＴＥＣＡＮ　Ｌｔｄ．）を用いて決定した。図５ｂに示すように、脳内には微量の遊離抗体しか蓄積せず、その量はわずか０．０７％用量／ｇ脳であった。非グルコース修飾ＰＥＧ化抗体はまた、長い血液循環時間を有するにもかかわらず、わずか０．１４％用量／ｇ脳の非常に限定された脳への抗体蓄積しか示さなかった。しかし、グルコース修飾ＰＥＧ化抗体では脳内への顕著な蓄積が観察され、Ｇ５０－ＰＥＧ化抗体は１．３８％用量／ｇ脳の最高蓄積率を示し、これは遊離抗体の約２０倍、Ｇ０－ＰＥＧ化抗体の１０倍であった。これらの結果は、このグルコース修飾ＰＥＧによるデリバリーシステムを通して抗体の蓄積の増強が達成可能であることを示すものであり、抗体の脳蓄積はグルコース部分密度を調節することによって制御できるという著者らの以前の理論を支持した。
アルツハイマ－病（ＡＤ）モデルマウスにおけるアミロイドβの蓄積の減少
　送達された抗－ＢＡＣＥ１の高効率脳蓄積を得た後、この還元感受性のグルコース修飾ＰＥＧ化抗－ＢＡＣＥ１を投与することによるＡＤマウスモデルにおけるＡβの蓄積量に対する影響を評価することを試みた。一般に、ＡＤモデルマウスであるＡＰＰ／ＰＳ１モデルマウス（８週齢）の脳におけるＡβ１－４０を、生理食塩水、遊離天然抗ＢＡＣＥ１およびＧ５０ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１（抗ＢＡＣＥ１　２０ｍｇ／ｋｇ）の投与後、０、１２、２４および４８時間の種々の時点で抗Ａβ　ＥＬＩＳＡ（Ｗａｋｏ）で定量的に分析した。投与後種々の時間に脳を採取し、抗Ａβ１－４０ＥＬＩＳＡを用いてＡβ１－４０の産生を定量した。図６に示すように、生理食塩水を投与したマウスでは、これらの測定時点でＡβ１－４０レベルにはほとんど変化がみられない。Ｇ５０－ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１および天然抗ＢＡＣＥ１で処理したマウスは、投与後１２時間で減少する。Ｇ５０－ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１で処理したマウスは、投与１２時間後に４３．２％のＡβ１－４０レベルしか有さず、１２時間の全測定時点において、生理食塩水処理動物および遊離天然抗ＢＡＣＥ１処理動物の両方と比較して有意に低かった（図５ｃ）。Ｇ５０－ＰＥＧ化抗ＢＡＣＥ１投与４８時間後でも、依然としてＡβ１－４０値の高い低下（３９．４％）が認められた。
結論
　本研究では、低血糖後のグルコース投与時に誘発されるＧＬＵＴ１リサイクリングを利用して、ＢＢＢを横切る治療用抗体の送達のための新規な還元感受性のグルコース修飾ＰＥＧリンカーを用いるアプロ－チを開発し、脳における抗ＢＡＣＥ１抗体の著しく高い蓄積を達成した上で、その脳内での抗体機能の回復を達成した。さらに重要なことに、送達され、その後、脳内の還元的環境下でその機能を回復させた抗ＢＡＣＥ１抗体は、アルツハイマー病モデルマウスにおいてＡβ１－４０産生を有意に抑制することができた。したがって、我々のアプロ－チは、神経変性疾患の治療のためにＢＢＢを横切って抗体を送達するための実行可能な戦略を表す。
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Claims (20)

  1. 　ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーセグメントによって還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において開裂可能に修飾されたペプチド。
  2. 　ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーセグメントとペプチドとが、還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において開裂可能なリンカーを介して連結され、これにより、還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において上記セグメントと開裂可能に修飾された、請求項１に記載のペプチド。
  3. 　リンカーが、リンカー内にジスルフィド結合を有し、還元環境下において前記セグメントと開裂可能に修飾された、請求項２に記載のペプチド。
  4. 　リンカーが、－ＣＯ－Ｏ－Ｌ１－Ｓ－Ｓ－Ｌ２－｛ここで、Ｌ１は、置換若しくは非置換アルキレン、または置換若しくは非置換ヘテロアルキレンであり、Ｌ２は、血流で安定なリンカーである｝を有し、ペプチドのリジン残基の側鎖アミノ基にアミド結合を介して連結し、Ｌ２が非電荷親水性ポリマーセグメントと連結している、請求項１～３のいずれか一項に記載のペプチド。
  5. 　ＧＬＵＴ１リガンドが、グルコースである、請求項１～４のいずれか一項に記載のペプチド。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載のペプチド部分を含む抗体。
  7. 　脳実質内の細胞表面抗原または細胞外抗原に対して結合する、請求項６に記載の抗体。
  8. 　細胞外抗原が、Ａβ１－４０である、請求項７に記載の抗体。
  9. 　細胞傷害剤とさらに連結してなる、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。
  10. 　蛍光色素、放射性同位体、および造影剤からなる群から選択されるイメージング剤とさらに連結してなる、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体。
  11. 　請求項１～９のいずれか一項に記載のペプチドまたは抗体を含む、医薬組成物。
  12. 　請求項１０に記載の抗体を含む、脳のイメージングに用いるための組成物。
  13. 　以下の投与計画に従って投与される、請求項１１または１２に記載の組成物であって、投与計画が、
    　対象の血糖を低下させることと、その後、
    　当該対象に対して、血糖値の上昇を誘発させない場合と比較してより多くのペプチドが脳実質に移行するように、血糖値の上昇を誘発させること、および請求項１１または１２に記載の組成物を投与することを含む、
    組成物。
  14. 　ＧＬＵＴ１リガンドで修飾された非電荷親水性ポリマーセグメント（例えば、ポリエチレングリコールまたはポリオキサゾリン）によって還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下において上記セグメントと開裂可能に修飾された抗体（修飾抗体）であって、未修飾の抗体と比較して、抗原に対する結合性が、１０％以下である、抗体。
  15. 　未修飾の抗体と比較して、抗原に対する結合性が、１％以下である、または消失している、請求項１４に記載の抗体。
  16. 　修飾抗体が、還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下においてその結合性を未修飾抗体の５０％以上にまで回復するものである、請求項１４に記載の抗体。
  17. 　　修飾抗体が、還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下においてその結合性を未修飾抗体の５０％以上にまで回復するものである、請求項１５に記載の抗体。
  18. 　修飾抗体が、還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下においてその結合性を未修飾抗体の８０％以上にまで回復するものである、請求項１４に記載の抗体。
  19. 　修飾抗体が、還元環境下またはｐＨ６．５以下の環境下においてその結合性を未修飾抗体の８０％以上にまで回復するものである、請求項１５に記載の抗体。
  20. 　請求項１４～１９のいずれか一項の抗体を含む、組成物。

     
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