JP3373849B2 - ３価および４価の単一特異性抗原結合性タンパク質 - Google Patents

３価および４価の単一特異性抗原結合性タンパク質

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は３価および４価の単一特異性抗原結合性タン
パク質およびこれらのタンパク質の製造方法、およびま
たこれらのタンパク質を構築するための３価および４価
のリガンドに関するものである。排他的ではないものと
して、本発明は特に、組換えDNAテクノロジイを使用し
て、上記３価および４価の単一特異性抗原結合性タンパ
ク質を生成させることに関するものである。
近年に、抗体およびそれらのフラグメントに多大の興
味が示されている。完全抗体分子がＨ鎖とＬ鎖とのヘテ
ロダイマーからなることは周知である。たとえば、IgG
分子は、４つのポリペプチド鎖と２つのＨ鎖−Ｌ鎖ヘテ
ロダイマーとからなる。
Ｌ鎖はそれぞれ、２つのドメインからなり、Ｎ−末端
ドメインは可変ドメイン、すなわちVLドメインとして知
られており、そしてＣ−末端ドメインは定常ドメイン、
すなわちCLドメインとして知られている。Ｈ鎖はそれぞ
れ、抗体の種類によって、４または５のドメインからな
る。Ｎ−末端ドメインは可変ドメイン、すなわちVHドメ
インとして知られている。このドメインは、そのＣ末端
部で、引き続くドメインのＮ−末端に結合しており、こ
れは第一定常ドメイン、すなわちCH1ドメインとして知
られている。各Ｈ鎖の後続部分はヒンジ部として知ら
れ、この部分は次いで、第二、第三、およびまた或る場
合には第四の定常ドメイン、すなわちCH2、CH3、および
CH4ドメインにそれぞれ、連結している。
組立てられた抗体では、VLドメインとVHドメインとが
一緒になって、抗原結合部位を形成している。また、CL
ドメインをCL1ドメインとは一緒になって、１本のＬ鎖
をともなう１本のＨ鎖を維持している。２個のＨ鎖−Ｌ
鎖ヘテロダイマーは、部分的に、２本のＨ鎖のCH2、CH3
および存在する場合に、CH4ドメインとの相互反応によ
って、およびまた部分的に、２本のＨ鎖のヒンジ部間の
相互反応によって、一体に結合されている。
Ｈ鎖ヒンジ部はそれぞれ、少なくとも１個の、そして
多くの場合に、数個のシステイン残基を含有する。組立
られた抗体では、そのＨ鎖のヒンジ部は、鎖内ジスルフ
ィド結合がヒンジ部内のシステイン残基の間で形成され
て、２つのＨ鎖−Ｌ鎖ヘテロダイマーが一体に共有結合
されうるように、整列されている。したがって、充分に
組立られた抗体は少なくとも２個の抗原結合性部位を有
するという点で、少なくとも２価である。
抗体のヒンジ部内のジスルフィド結合が温和な還元に
よって破壊されると、１つだけのＨ鎖−Ｌ鎖ヘテロダイ
マーからなる１価の抗体が生成できることが、かなり以
前から知られている。
抗体を或る種のタンパク質分解酵素により処理する
と、種々の抗体フラグメントの生成が生じることも、か
なり以前から知られている。たとえば、抗体を各ヒンジ
部のＮ−末端部位に近い部位で分解させた場合には、２
個の抗原結合性フラグメント（Fab）と１個の定常部フ
ラグメント（Fc）が生じる。Fabフラグメントはそれぞ
れ、VHドメインとCH1ドメインとからだけからなる、先
端切断したＨ鎖と組合されたＬ鎖からなる。Fc部分はヒ
ンジ部によって１体に保持されているＨ鎖の中の残りの
ドメインからなる。
別様に、抗体はそのヒンジ部のＣ末端部位に近い部位
で分解することもできる。この分解では、Ｆ（ab′）２
フラグメントとして知られるフラグメントが生じる。こ
のフラグメントは基本的に、２個のFabフラグメントか
らなるが、ヒンジ部に依然として結合したCH1ドメイン
を有する。したがって、Ｆ（ab′）２フラグメントは、
ヒンジ部によって１体に結合した、２つの抗原結合性部
位を有する、２価のフラグメントである。Ｆ（ab′）２
フラグメントは還元によって分解することができ、１価
のFab′フラグメントを生成させることができる。これ
は、そこにヒンジ部を有するFabフラグメントであると
見做すことができる。
消化条件を注意深く制御することによって、抗体を、
そのVLドメインとCLドメインとの間で、およびまたVHド
メインとCH1ドメインとの間で分解させることができる
ことも証明されている。これによって、Fvフラグメント
として知られる２個のフラグメントが生じる。Fvフラグ
メントはそれぞれ、相互に連結しているVLドメインとVH
ドメインとからなる。FVフラグメントはそれぞれ、抗原
結合に関して１価である。
各可変ドメインのアミノ酸配列の研究の結果として、
その配列が格別に相違する各可変ドメイン内に、３つの
領域が存在することが証明された。これらの領域は、超
可変部、もしくは相補性決定部（CDR）と称されてい
る。これらのCDRの位置も発表されている〔Kabat等、Se
quences of Proteins of Immunological Interest,US D
epartement of Health and Human Sciences,NIH,USA,19
87およびWu,T.T.およびKabat,E.A.,J.Exp.Med.,132,211
〜250,1970〕。
結晶形Fvフラグメントに対する構造研究および分子モ
デリング研究の結果として、可変ドメインはそれぞれ、
β−プリーツシート構造部に支持されている３つのルー
プ部からなる。ハプテン抗原結合の場合には、このルー
プ部が抗原受入れ用のポケットを形成しているものと見
做される。
配列分析によって証明されるように、CDR間には格別
の重複があり、そしてまた構造分析によって証明される
ように、ループ部間にも格別の重複がある。しかしなが
ら、CDRはループ部内に存在する、いくつかの他の残基
と組合されている可能性があるが、CDRは初期には、抗
体の抗原結合特異性の決定に参加するという見解が一般
に受入れられている。
さらに最近になって、組換えDNAテクノロジイを使用
することによって、抗体またはそれらのフラグメントを
生成することに多大の興味が示されている。特許刊行物
には、この分野の記述が充分になされている。組換えDN
Aテクノロジイは、天然抗体の再生成にばかりでなく、
また新規抗体の生成にも使用されている。一例として、
今や、キメラ抗体を生成させることもできる。このキメ
ラ抗体は、一つの種からその可変ドメインがもう一つの
種からの定常ドメインに結合されているものである。
CDR内の残基、および必要に応じて、可変ドメイン内
の他の残基の数を変えて、異種の抗原が結合できるよう
にされた、変性抗体も生成することができる。これは、
たとえば抗体のヒト性を基本的に変えることなく、ヒト
抗体内に、マウスモノクロナル抗体（MAb）からの特異
性を作り出すことを可能にする有用な方法である。この
方法は、in vivoで抗体を使用することが望まれる場合
に利点を有する。詳細な説明はWO−Ａ−91/09967に見出
される。
WO−Ａ−90/09195およびWO−Ａ−90/09196は架橋結合
した抗体およびそれらの調製方法に関するものである。
架橋結合した抗体接合体は、レポーター分子またはエフ
ェクター分子を含有していてもよい。少なくとも１個の
非ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）鎖内架橋を有するものである
と開示されている。この架橋部はモホ−またはヘテロ−
官能性架橋剤の残基であることができ、そして抗体の抗
原結合ドメインから離れて位置している。この抗体接合
体は、増大した結合能、in vivoで良好な血液クリアラ
ンス、および腫瘍の存在の下では、高比率の腫瘍対血液
およびまた腫瘍対骨比率を有する。この接合体は腫瘍の
診断および治療に使用される。
これらの抗体接合体は、架橋剤と抗体またはそのフラ
グメントとの反応によって調製することができる。この
架橋剤は抗体分子上のチオール基またはアミノ酸残基、
たとえばグルタミン酸、アスパラギン酸、リジンまたは
チロシンの残基の側鎖のどちらかと反応させることがで
きる。
しかしながら、我々は、WO−Ａ−90/09195およびWO−
Ａ−90/09196に記載の架橋した抗体が天然免疫グロブリ
ンに優る改善された性質を有し、特に腫瘍細胞に対する
極めて充分な結合および血液からの良好なクリアランス
を示すけれども、これらの抗体は腎臓により多く吸収さ
れ、この組織に滞留することを見出した。この現象は、
特に抗体が治療および放射性像影に用いる際に放射性物
質でラベルされる場合の毒性の問題を提起する。したが
って、架橋した抗体の優れた結合性およびクリアランス
性を保有するが、腎臓組織により取り込まれず、または
保留されず、したがって腎臓毒性の問題が回避される抗
体分子が望まれる。
WO−Ａ−91/03493は、２価または３価の多特異性Fab
接合体に関するものである。開示されている接合体は、
オルトフェニレンジマレイミド架橋構造体を用いて一体
に連結された、３個または４個のFab′抗体フラグメン
トからなる。この開示されたトリマー状接合体は第一特
異性の２個のFab′フラグメントと第二特異性の１個のF
ab′フラグメントとから、またはそれぞれが相違する特
異性を有する３個の異なるFab′フラグメントからな
る。したがって、このトリマー状接合体は２特異性また
は３特異性である。同様の様相で、開示されているテト
ラマー状接合体は少なくとも２特異性であり、３特異性
または４特異性であることもある。
WO−Ａ−91/03943には、或る状況の下で、２特異性ダ
イマー状接合体による処置によって、Ｔリンパ細胞集団
に、標的細胞、たとえば腫瘍細胞の殺滅を生じさせうる
ことが報告されており、この場合に、１つの特異性はＴ
リンパ細胞集団上の特異抗原構造体を指向し、そしても
う１つの特異性は標的細胞上の抗原を指向するようにさ
れている。この効果は再指向細胞細胞毒性（redirect c
ellular cytotoxicity）（RCC）と称されている。
WO−Ａ−91/03494に記載の発明は、トリマー状または
テトラマー状の多特異性接合体の使用によって、RCCを
有意に改善できるという予想にもとづいている。このよ
うな接合体の使用はまた、特異性であることができるＴ
リンパ細胞抗原の範囲を広くすることを可能にする。し
たがって、WO−Ａ−91/03493に記載の発明では、トリマ
ー状またはテトラマー状接合体は少なくとも、２特異性
でなければならないことが必須である。
WO−Ａ−91/03493に記載の発明のさらに詳細な説明
は、Tutt,A等のEur.J.Immunol.,21、1353−1358、1991
に見出され、ここでは、RCCを増強するためには、少な
くとも２特異性であるトリマー状またはテトラマー状接
合体の使用が必須であることが確認されている。しかし
ながら、WO−Ａ−91/03493にも、またTutt等の上記刊行
物にも、説明されているトリマー状またはテトラマー状
Fab接合体のクリアランス性に関しては、どこにも記載
がないことに留意されるべきである。
我々の審査中の国際特許明細書No.WO91/19739には、
多価抗原結合性Fvフラグメントがin vivo腫瘍像影また
は処置に使用されることが示唆されている。
上記したものなどのような多価抗原結合性タンパク質
に係るもう一つの要件に、抗体フラグメントを一体に架
橋できる架橋分子に係る要件がある。その架橋機能に加
えて、これらの架橋分子は、抗体接合体にエフェクター
分子またはリポーター分子を導入する手段を有利に提供
することができる。
多くの架橋分子が開示されている。たとえば、ヨーロ
ッパ特許明細書No.0446071（Hybritech Incorporated）
には、２特異性のトリマー状抗体様分子の製造に使用す
るための３官能性架橋化合物（cross linker）の製造が
記載されている。ヨーロッパ特許出願0453082（Hybrite
ch Incorporated）には、このようなトリス−マレイミ
ド化合物を２特異性または３特異性３価抗体様化合物の
製造に使用することが記述されている。開示されている
抗体接合体のクリアランス性には触れられていない。開
示された、この架橋化合物の最大の欠点は、放射性同位
元素などの官能性基をそこに結合させることが困難であ
ることにある。特に、大環状架橋基は、このような架橋
化合物中に容易に導入することができない。
本発明は、３価および４価の単一特異性Fab様タンパ
ク質が抗癌治療に特に適していることを発見したことに
もとづいている。これらのタンパク質は、架橋した抗体
の優れた結合性およびクリアランス性を示すとともに、
腎臓組織を含む非腫瘍組織により取り込まれず、そして
（または）保留されない。さらにまた、本発明は、３価
または４価のFab様タンパク質への、リポーター基また
はエフェクター基の結合を、極めて助長する、新規架橋
分子を提供する。
したがって、本発明によって、連結構造基により相互
に結合した３個または４個のFabフラグメントからな
り、天然の免疫グロブリンではない、３価または４価の
単一特異性抗原結合性タンパク質が提供される。
本明細書において、本発明の多価抗原結合性タンパク
質を、TFM（tri−Fab）およびQFM（tetra−Fab）と記す
る。本明細書において使用されている「Fab」の用語
は、天然抗体または化学的に、あるいは組換えDNAテク
ノロジイのどちらかにより、合成された抗体に由来す
る、変性されていてもよい、FabおよびFab′抗体フラグ
メントを包含するものと理解する。「変性されていても
よい」の用語は、そのフラグメントの結合能が有害な作
用を受けないかぎりにおいて、当該FabまたはFab′フラ
グメントが、そのアミノ酸配列中に、多くの挿入、欠落
または変更を含みうることを意味する。
好ましくは、本発明に係わる化合物において、Fabフ
ラグメントは単一の架橋分子の使用により１体に共有結
合されている。
驚くべきことに、TFMおよびQFMは、完全抗体、Fab、
Ｆ（ab′）２およびこれらのフラグメントの単一特異性
架橋誘導体に比較して、格別に優れた特性を有すること
が見出された。
Fab、Ｆ（ab′）２およびそれらの架橋した片方が、i
n vivo使用の場合に、腫瘍細胞に対して比較的特異性
であるのに対してTFMおよびQFMは、これらに比較して格
別に増大した結合活性を示す。同時に、これらは完全抗
体よりもさらに効果的に血液から排除される。さらにま
た、従来技術で開示された単一特異性架橋FabおよびＦ
（ab′）２フラグメントに反して、TFMおよびQFMは腎臓
に蓄積しない。これによって、特に抗体分子が抗癌治療
用の放射性同位元素または毒素に結合される場合に、望
ましくない副作用が減少される。
好ましくは、本発明の多価Fab様タンパク質は腫瘍付
随抗原に対して特異性である。したがって、有利には、
Fabフラグメントのうちの少なくともCDRは腫瘍特異性モ
ノクロナル抗体（MAb）から誘導する。別様に、CDRは合
成されたものであることもできる。腫瘍特異性抗原のい
ずれもが、本発明のFab様タンパク質の標的になりうる
ことは明白である。
本発明のTFM化合物またはQFM化合物は、たとえば下述
のタイプのリポーター基またはエフェクター基の一つま
たは二つ以上によって、ラベルすることができる。ラベ
ルはTFM分子またはQFM分子のFab部分に、および（ある
いは）Fab部分を相互に結合している連続構造基に付加
することができる。Fab部分それ自体にラベルする場合
には、このラベルは一般に、このフラグメントの結合部
位に干渉しないような位置に存在すべきである。抗体を
リポーター基またはエフェクター基によりラベルする方
法は公知であり、我々の公開特許明細書EP238196、EP38
4624、EP385601、WO88/05433、WO89/01475、WO89/01476
およびWO90/01475に記載されている。連結構造基にリポ
ーター基またはエフェクター基を導入することが望まれ
る場合には、これはリポーター基またはエフェクター基
を、連結構造基中に存在する反応官能性基と、たとえば
Fabフラグメントのラベル付けに使用される方法と同様
の方法で反応させることによって達成することができ、
あるいはたとえば以下に記述するように、連結構造基に
有利に組入れることもできる。
好ましくは、本発明のTFM化合物およびQFM化合物にお
いて、Fabモノマーは、架橋化合物によって一体に架橋
させる。架橋化合物はFabフラグメントを一体に結合さ
せることができる、いずれの化学物質であることもでき
る。しかしながら、好ましくは、架橋化合物はEP−Ａ−
0446071およびEP−Ａ−0453082に記載のマレイミド化合
物のような特別にデザインされた化学化合物である。し
かしながら、抗体鎖に見出される、いずれの反応性アミ
ノ酸とも反応性である、３個または４個の官能性基を有
する構造基をいずれも、使用できるものと理解されるべ
きである。
好適態様の一つにおいて、本発明の化合物中の連結構
造基はポリリジン架橋化合物である。
したがって、本発明の第二の態様において、我々は下
記式（１）で表される架橋化合物を提供する。
R1CH（R2）NHCOR3 （１） 式中、R1はカルボキシル（−CO2H）またはエステル化
カルボキシル（−CO2R）基、あるいは基−COAであり、
ここでＡは直後に、またはスペーサー基を介して、−CO
基に結合して、炭素−炭素結合または炭素−ヘテロ原子
結合を形成するエフェクター分子またはリポーター分子
であり;R2およびR3は、同一または異なっていてもよ
く、それぞれ置換されていてもよい、直鎖状または分岐
鎖状アルキレン、アルケニレンまたはアルキニレン鎖で
あり〔これらの鎖は１個または２個以上の−Ｏ−または
−Ｓ−原子、あるいは−Ｎ（R4）（R4は水素原子または
C1-6アルキル基である）、−Ｎ（R4）CO−、−CON
（R4）−、C5-8シクロアルキレン、C6-12アリーレンま
たはC5-10ヘテロアリーレン基により中断されていても
よい〕、そしてまたR2およびR3は、R2およびR3中の反応
官能性基の総数が３個または４個以上であるような数
で、１個または２個以上の反応官能性基を含有する。
式（１）で表される化合物において、「エフェクター
基」の用語は、生物学的系において変化を誘引できる
か、もしくは生物学的系からの応答を誘引でき、またこ
の性質を式（１）の化合物に付与できる、基のいずれを
も意味するものと理解されるべきである。「リポーター
基」の用語は、in vitroおよび（または）in vivo分析
手段によって検出でき、かつまた式（１）の化合物にこ
の性質を付与できる基のいずれもを意味するものと理解
されるべきである。
エフェクター基の例には、生理学的活性物質、抗細菌
化合物、抗ウィルス化合物または抗菌化合物のいずれも
が包含される。特定の生理学的活性物質には、抗新生物
質剤、毒素（たとえば、細菌または植物に由来する酵素
的に活性な毒素およびその断片、たとえばリシンおよび
その断片）、酵素、抗炎症化合物および心臓血管系活性
物質、たとえばフィブリン分解活性物質および中枢神経
系に対する活性物質が含まれる。
特定の抗新生物質薬には、細胞毒性薬および細胞増殖
抑制薬、たとえばナイトロジエンマスタード類などのア
ルキル化剤（たとえばクロラムバシル〔chlorambuci
l〕、メルファラン〔melphalan〕、メクロレタミン〔me
chlorethamine〕、シクロホスファミド、あるいはウラ
シルマスタード）およびその誘導体、トリエチレンホス
ホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、ブスル
ファン（busulphan）あるいはシスプラチン（cisplati
n）；抗代謝薬、たとえばメトトレキセート（methotrex
ate）、フルオロウラシル、フロキシウリジン（floxuri
dine）、サイタラビン（cytarabine）、メルカプトプリ
ン、チオグアニン、フッ化酢酸またはフッ化クエン酸；
抗生物質、たとえばブレオマイシン類（bleomycins）
（たとえば、ブレオマイシン硫酸塩）、ドキソルビシン
（doxorubicin）、ダウノルビシン（daunorubicin）、
ミトマイシン類（たとえばミトマイシンＣ）、アクチノ
マイシン類（たとえば、ダクチノマイシン〔dactinomyc
ine〕）、プリカマイシン（plicamycin）、カリカエミ
シン（calichaemicin）およびその誘導体、あるいはエ
スペラミシン（esperamicin）およびその誘導体；分裂
抑制薬、たとえばエトポシド（etoposide）、ビンクリ
スチン（vincristine）またはビンブラスチン（vinblas
tine）およびその誘導体；アルカロイド類、たとえばエ
リプチシン（ellipticine）；ポリオール類、たとえば
タキシシン−Ｉ（taxicin−Ｉ）またはタキシシン−II;
ホルモン類、たとえばアンドロゲン類（たとえばドロモ
スタノロン〔dromostanolone〕またはテストラクト
ン）、プロゲスチン類（たとえば、メゲステロール（me
gesterol）アセテートまたはメドロキシプロゲステロン
（medroxyprogesterone）アセテート）、エストロゲン
類（たとえばジメチルスチルベステロールジホスフェー
ト、ポリエストラジオールホスフェートまたはエストラ
ムスチンホスフェート）あるいは抗エストロゲン類（た
とえばタモキシフェン〔tamoxifen〕）；アントラキノ
ン類、たとえばミトキサントロン；尿素類、たとえばヒ
ドロキシ尿素；ヒドラジン類、たとえばプロカルバジ
ン；あるいはイミダゾール類、たとえばダカルバジン；
が包含される。
特に有用なエフェクター基はカリカエミシン（calich
aemicin）およびその誘導体である（たとえば、南アフ
リカ国特許明細書No.85/8794、No.88/8127およびNo.90/
2839参照）。
適当なリポーター基はキレート化金属、蛍光化合物ま
たはNMRあるいはESRスペクトロスコーピィによって検出
することができる化合物を包含する。
キレート化金属は、２〜８の配位数を有する正２価ま
たは正３価の金属のキレート化物を包含する。このよう
な金属の特定の例には、テクネチウム（Tc）、レニウム
（Re）、コバルト（Co）、銅（Cu）、金（Au）、銀（A
g）、鉛（Pb）、ビスマス（Bi）、インジウム（In）、
ガリウム（Ga）、イットリウム（Ｙ）、タルビウム（T
b）、ガドリニウム（Gd）およびスカンジウム（Sc）が
含まれる。一般に、これらの金属は好ましくは、放射性
核種である。特定の放射性核種には、99mTc,186Re,188R
e,58Co,60Co,67Cu,195Au,199Au,110Ag,203Pb,206Bi,207
Bi,111In,67Ga,68Ga,88Y,90Y,160Tb,153Gdおよび47Scが
含まれる。
キレート化金属は、たとえば適当な多歯形キレート
剤、たとえば環状ポリアミン類、ポリエーテル類（たと
えばクラウンエーテル類およびその誘導体）；ポリアミ
ド類；ポルフィリン類；および炭素環状誘導体のいずれ
かによって、キレート化した上記種類の金属の１種であ
ることができる。
一般に、キレート剤の種類は、使用する金属に依存す
る。しかしながら、本発明に係る接合体における特に有
用なキレート剤の群の一つは、非環状および環状のポリ
アミン類、特にポリアミノカルボン酸、たとえばジエチ
レントリアミンペンタ酢酸およびその誘導体、およびま
た大環状アミン類、たとえば環状トリ−アザ−およびテ
トラ−アザ−誘導体、およびまたポリアミド類、特にデ
スフェリオキサミン（desfferioxamine）およびその誘
導体である。
特定の大環状アミン化合物の例には、下記式（２）で
表わされる化合物が含まれる： （式中、Ｌは反応性基を含有する置換基であり、Ｂは置
換されていてもよい１個または２個の窒素原子により中
断されているC2-14アルキレン鎖であり;W1およびW2は同
一または異なっていてもよく、それぞれ置換されていて
もよい窒素原子であり;pは０または１の整数であり、そ
してｑは０または１あるいは２の整数である、ただしｐ
が０である場合には、ｑは１または２の整数である）。
基Ｌが、式（１）の化合物の残りの部分に大環状基を
結合させる結合部位を提供することは明白である。代表
的基の例には、アミン（−NH2）含有基が含まれる。
式（２）の好適アミンには下記式（３）で表されるト
リ−アザ誘導体： （式中、W1およびW2は同一または異なっていてもよく、
それぞれ基−Ｎ［（CH2）rR1］−（式中、ｒは０または
１−６の整数であり、そしてR1はアルキル、アルコキシ
アルキル、−CO2H、−SO3H、−PO3H2またはアリール基
である）であり、そしてＢは基−CH2（CH2）sN（Ｒ）
（CH2）tCH2−（式中、ｓおよびｔは同一または異なっ
ていてもよく、それぞれ０または１、２あるいは３の整
数であり；そしてＲは−（CH2）rR1を表わし、ここでｒ
およびR1は直前に記載されているとおりである） および下記式（４）で表わされるテトラ−アザ誘導体： （式中、W1およびW2は同一または異なっていてもよく、
それぞれ基−Ｎ［（CH2）rR1］−（上記のとおり）であ
り、そしてＢは基 −CH2（CH2）sN（Ｒ）CH2（CH2）dN（Ｒ）（CH2）tCH2
−（式中、ｄは０または１、２あるいは３の整数であ
り、そしてＲは上記定義のとおりである）である〕 が包含される。
式（３）の特に有用なアミンは下記式（５）で表わさ
れる化合物である： 式（４）の特に有用なアミンは下記式（６）で表され
る化合物である： 本発明による接合体に好適なキレート化金属には、式
（３）で表される化合物、特に式（５）で表される化合
物によって、キレート形成したインジウム；あるいは式
（４）で表される化合物、特に式（６）で表わされる化
合物によって、キレート形成したイットリウムが包含さ
れる。111Inおよび90Yは特に好ましい。
エフェクター基またはリポーター基は一般に、この基
中に存在する、いずれか適当な炭素原子あるいはヘテロ
原子、とたえば窒素原子、酸素原子、イオウ原子または
リン原子を経て、式（１）で表される化合物の残りの部
分に結合して、直接に化合物Ａ−COCH（R2）NHCOR3を形
成するか、あるいは間接的に、化合物Ａ−Sp−COCH
（R2）NHCOR3を形成することができる。この化合物にお
いて、Spは上記のとおりの炭素−炭素結合または炭素−
ヘテロ原子結合を経てＡおよび−CO−基に独立して結合
しているスペーサー基である。適当なスペーサー基は非
環状または環状の脂肪族または芳香族残基、特にアルキ
レン〔たとえば、エチレン、プロピレン、ブチレン〕、
アルコキシアルキレン〔たとえばメトキシメチレン、エ
トキシメチレン、エトキシエチレン〕、アリーレン〔た
とえばフェニレン〕、アラルキレン〔たとえばフェネチ
レンなどのフェンアルキレンあるいはシクロアルキルア
ルキレン〔たとえばシクロヘキシルメチレン〕基を包含
する。
Ａと基−CO−との間の、あるいはＡとスペーサー基と
の間の結合は所望により、たとえばヨーロッパ特許明細
書No.175617に記載されているような、タンパク質分解
酵素によるなどによって、分解されるように選択するこ
とができる。
式（１）で表される化合物中のR1によって示されるエ
ステル化カルボキシル（−CO2R）基は、Ｒが有機基、た
とえば脂肪族−芳香族基、あるいは芳香族基またはヘテ
ロ芳香族基である基を包含する。
したがって、Ｒは置換されていてもよく、１個または
２個以上の−Ｏ−または−Ｓ原子により中断されていて
もよい、直鎖状または分岐鎖状のC1-20アルキル（たと
えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、
ｓ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、
ｔ−ブチル）、C2-20アルケニルまたはC2-20アルキニル
基；あるいはC5-8シクロアルキル（たとえば、シクロペ
ンチルまたはシクロヘキシル）、C5-8シクロアルキルC
1-6アルキル（たとえば、シクロペンチルメチル、シク
ロヘキシルメチル）、C6-12アリール（たとえば、置換
されていてもよいフェニルまたはナフチル）C6-12また
はC1-6アルキル（たとえば、置換されていてもよい、ベ
ンジル、フェネチルまたはナフチルメチル）、C5-10ヘ
テロアリール（たとえば、フラニル、ピリジル、チエニ
ル）、あるいはC5-10ヘテロアリールC1-6アルキル（た
とえば、フラニルメチル、ピリジルメチルまたはチエニ
ルメチル）基であることができる。
式（１）で表される化合物中の反応官能性基は一般
に、チオール、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシル、
アルデヒド、芳香族またはヘテロ芳香族基と反応するこ
とができる基のいずれでもあることができる。芳香族基
の例にはフェノール系基が含まれる。ヘテロ芳香族基の
例にはイミダゾリル基が含まれる。
したがって、反応官能性基は、たとえばハロゲン原
子、たとえば塩素、臭素またはヨウ素原子、あるいは−
SH、−Ｓ−Ｓ−Het（ここでHetは置換されていてもよい
ヘテロ環状基、たとえば置換されていてもよいピリジル
基である）、−NH2、ヒドラジン（NHNH2）またはその誘
導体〔たとえば、−Ｎ（CH3）NH2、−NHCONHNH2、−NHC
SNHNH2またはフェニルヒドラジン〕、ハロアセトアミド
（たとえば、ヨウドアセトアミドまたはブロモアセトア
ミド）、−NCO、−NCS、−COR10〔ここでR10は塩素また
は臭素原子などのハロゲン原子、あるいはN3、C1-6アル
コキシ、たとえばメトキシ、C6-12アリールオキシ（た
とえばニトロフェニルオキシまたはジニトロフェニルオ
キシ）、イミジルオキシ（たとえば、スクシニルイミジ
ルオキシ）またはイミダゾリルオキシ基〕、イミド、た
とえばマレイミド、式−Het1−Ｃ（Het2）＝CH2（ここ
でHet1およびHet2は同一または異なっていてもよく、そ
れぞれ窒素含有ヘテロ環状基、たとえばピリジル基であ
るか、あるいはHet1は窒素含有ヘテロ環状基であり、そ
してHet2は水素原子である）、たとえば下記式で示され
るビニルピリジル基： あるいは下記式で示されるジオン基： （式中、R11はC1-4アルキル、たとえばメチル基であ
る）であることができる。
一般に、式（１）において、反応官能性基が同一であ
る化合物が好ましいが、或る場合には、１種より多い種
類の反応官能性基を有するほうが好ましいこともある。
特に好適な官能性基はチオール基と反応できる基であ
る。この種の基はイミド基（特にマレイミド）、ハロア
セトアミド基（特にヨウドアセトアミド）、−SH基、He
t−Ｓ−Ｓ−基、−Het1（Het2）＝CH2基または 基を包含する。イミド基、特にマレイミド基は特に有用
である。
式（１）で表される化合物は、それらの意図する用途
に応じて、３個または４個以上の反応官能性基を含有す
ることができる。有用な化合物には、３個または４個の
反応官能性基、特に３個または４個のチオール反応性
基、たとえば３個または４個のマレイミド基を含有する
化合物が包含される。しかしながら、所望により、この
ような基を５個、６個、７個または８個も存在させるこ
ともできる。
反応官能性基はいずれか望ましい様相で、基R2および
基R3中に分布させることができる。したがって、たとえ
ばR2およびR3がそれぞれ、１個、２個、３個または４個
以上の反応官能性基を含有することができる（ただし、
両基中の総数は３個または４個以上とする）。別様に
は、この反応官能性基はR2またはR3のうちの一方のみに
存在させることもできる。
式（１）で表わされる化合物中の基R2および基R3は、
それの反応官能性基が結合して、いずれか所望のサイズ
および組成内で変化しうる、鋳型（テンプレート）を形
成している。すなわち、これに制限されないが、特に好
ましい例の一つとして、本発明の化合物の一群は、式
（１）において、R1が前記定義のとおりであり、そして
R2が、同一または異なっていてもよく、それぞれ、R2お
よびR3中の反応官能性基の総数が３個または４個以上で
あるような数で、１個または２個以上の反応官能性基を
含有しており、そして置換されていてもよい直鎖状また
は分岐鎖状C1-25アルキレン（たとえば、メチレン、エ
チレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレ
ンまたはヘプチレンなどのC1-16アルキレン）、C2-23ア
ルケニレンまたはC2-20アルキニレン鎖〔これらの鎖は
１個または２個以上の−Ｏ−または−Ｓ−原子、−Ｎ
（R4）−（ここでR4は水素原子またはC1-6アルキル基、
たとえばメチルまたはエチル基である）、−Ｎ（R4）CO
−、−CON（R4）−、C5-8シクロアルキレン（たとえ
ば、シクロペンチレンまたはシクロヘキシレン）、C
6-12アリーレン（たとえば、フェニレンまたは置換フェ
ニレン）、あるいはC5-10ヘテロアリーレン（たとえ
ば、フラニル、チエニルまたはピリジニル基）により中
断されていてもよい〕である。
基R2および基R3中に存在する任意の置換基は、カルボ
キシル（−CO2H）およびエステル化カルボキシル（−CO
2R）〔ここで、Ｒは前記定義のとおりである〕、および
またアミノ（−NH2）または置換アミノ（NR6R7）（ここ
で、R6およびR7は同一または異なっていてもよく、それ
ぞれ水素原子またはC1-6アルキル基、あるいは基−COR8
〔ここでR8はR2に係り定義されているとおりである〕で
あることができ、ただしR6およびR7の一つが水素原子で
ある場合には、他の一つは水素原子ではなく、またR6お
よびR7の一つが基−COR8である場合には、他の一つは水
素原子である〕を包含する。
R2およびR3の一方または両方が置換基−NHCOR8を含有
する場合には、この基が式（１）の化合物中に追加の反
応官能性基を持ち込むことを可能にすることが認識され
る。
特に有用な基R2または基R3は、構造式 −（CH2）mNHCOCH（NHCOR8）（CH2）nNHCO（CH2）pZ （式中、ｍ、ｎおよびｐは同一または異なっていてもよ
く、それぞれ１、２、３または４の整数であり、そして
Ｚは前記定義の反応官能性基である）を有す を有することができる。
本発明に係る化合物の特に有用な群は下記式（６）ま
たは式（７）、特に下記式（８）または式（９）を有す
る： もう一種の好ましい架橋剤は下記式（10）を有する： R9CH（R2）CONHCH（R2）CONHCH（R2）CONH2 （10） 式中、R9は−NH2または置換アミノ基、たとえば基−NHC
OAであり、そしてＡおよびR2は式（１）の化合物に関し
て定義されているとおりである。
この種の化合物中において、R2はそれぞれ同一である
ことができ、あるいは所望により、その隣りのものと相
違していてもよい。
式（１）および式（10）で表される化合物は、生物学
的材料、特にタンパク質、特に抗体が、これらの式
（１）または式（10）の化合物と反応できる１個または
２個以上の官能性基を有するかぎり、これらの生物学的
材料の架橋に使用される。これらの化合物は本発明によ
るTFMおよびQFM化合物の製造に特に有用である。
架橋反応は慣用の方法を使用して、たとえばFabフラ
グメントおよび必要な架橋化合物などの出発物質を水性
溶媒中で、たとえば周辺温度において、混合することに
よって達成することができる。使用する出発物質の相対
濃度はほとんど、式（１）または式（10）で表される化
合物に、およびまたそこに含まれる反応官能性基の数お
よび所望の生成物の種類に応じて変わるが、一般的に、
生物学的材料（１種または２種以上）、たとえば抗体、
たとえばFabフラグメントなどのタンパク質を過剰濃度
で存在させる。
式（１）および式（10）で表わされる化合物は多くの
方法によって、たとえば後記する例に記載の方法によっ
て、製造することができる。これらの方法において、反
応性基が特定の反応に関与しないことが望まれる場合に
は、これらの基を保護する必要があることがある。慣用
のカルボン酸はエステル化することができ（たとえば、
ベンジルエステルを生成させる）、そしてまたアミノ基
はアシル化することができる（たとえば、ベンジルオキ
シカルボニルアミノ基を生成させる）。これらの保護基
は慣用の方法を使用して、たとえばベンジルエステルの
場合には、ギ酸などの酸により処理することによって、
そしてまたベンジルオキシカルボニルアミノ基の場合に
は、トリメチルシリルヨウダイドなどの化合物により処
理することによって、分離することができる。
したがって、一例として、式（１）において、R1が基
−COAまたは−CO−SP−Ａである化合物は、R1が基−CO2
Hまたはその活性化誘導体（たとえば、この酸とＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドとをジシクロヘキシルカルボジ
イミドの存在の下に反応させることによって得られるス
クシンイミド）である相当する化合物を、場合により塩
基の存在の下に、溶媒、たとえばテトラヒドロフランの
ような環状エーテルなどのエーテル中で、基ＡまたはSP
−Ａと反応させることによって、製造することができ
る。この反応において、出発物質のＡまたはSP−Ａは、
上記酸−その活性化誘導体と反応できる基を必要とす
る。
式（１）において、R1が−CO2Hである化合物は、慣用
の方法、たとえば不活性溶媒、たとえばハロゲン化炭化
水素中で、三フッ化酢酸のような酸を使用する加水分解
によって、相当するエステル（−CO2R）を加水分解する
ことによって、製造することができる。
式（１）において、R1が−CO2R基である化合物は一般
に、下記式（11）で表わされるエステル化アミノ−酸出
発物質から、慣用の方法を使用する、相当する反応性基
を有する他の中間体を含む一連の置換または縮合反応を
用いて、段階的方法で製造することができる。一般的合
成原則は、本明細書に記載の中間体および例を引用して
説明することができ、例では、公知出発物質を用いて、
本発明に係る或る種の化合物の製造を説明する。本発明
に係るその他の化合物は同一の手段を使用するが、異な
る反応官能性基を含有する別の種類の基R2および基R3を
導入するために、異なる出発物質および中間体を用い
て、製造することができる。
式（10）で表わされる化合物は、本明細書に記載の中
間体および例に説明されているような置換および縮合反
応を用いて、同様の方法で製造することができる。
適当な反応官能性基の挙動はいずれも、架橋分子それ
自体により、この基に対して加えられる構造上の制約を
常に受ける。架橋分子の線状度合が増大するほど、大環
状基の付加およびエフェクター基のキレート化は推進さ
れることが見い出された。
したがって、本発明は、実質的に線状の骨格構造を有
し、大環状基を組合せて有することができる、新規な架
橋化合物を包含する。
特に好適な架橋化合物は下記の式で表される化合物で
ある： 式中、R1は前記定義のとおりであり、そしてMalはマ
レイミド基である。
好ましくは、本発明のTFMまたはQFMは、大環状基をそ
こに結合して有する架橋分子によって、相互に結合して
いる３個または４個のFabフラグメントからなる、３価
または４価の単一特異性抗原結合性タンパク質である。
本発明の係る架橋分子への大環状基の結合は好ましい
ものであるが、本発明の多価タンパク質中に配合されて
いるFabフラグメントの１個または２個以上に、大環状
基を結合させることもできるものと理解すべきである。
この手段は、使用架橋化合物が大環状基の結合を助長し
ないものである場合に、特に好適である。
したがって、好ましくは、本発明のTFMまたはQFMは放
射性ラベルを有する。この放射性ラベルは大環状基によ
りキレート形成させる。
もう一つの好適態様として、本発明に係るTFMまたはQ
FMはそれぞれ、各Fabフラグメント上のチオール基に結
合した連結構造分子によって、相互に結合されている。
本発明の特に好ましい、３価または４価のタンパク質
構築生成物はその連結構造分子が下記の架橋化合物の一
つであるタンパク質である： または： または： 天然産生Fab′フラグメントはヒンジ部に、多くのチ
オール基、代表的には２個、４個または11個にものぼ
る、チオール基を有する。
しかしながら、本発明の有利な態様においては、その
ヒンジ部に一つのみの遊離のチオール基を有する、遺伝
子的に変性されたFab′フラグメントが使用される。δc
yc Fab′フラグメントと称される、このようなFab′フ
ラグメントの組換えDNAテクノロジイによる構築は、我
々の審査中のヨーロッパ特許出願No.0347433に記載され
ている。
Fab′のようなFab様フラグメントのヒンジ部中のシス
テイン残基の数を減少させると、Fab様分子と架橋分子
との間の間違った相互反応の可能性が、有利に減少され
る。
正常では、組換えDNAテクノロジイによって生成され
た、精製Fab′フラグメントは、ブロックされたヒンジ
チオール基を有するものとして採取される。この場合
に、Fab′フラグメントは好ましくは、本発明のTFMまた
はQFM化合物に組み立てる前に、部分的に還元する。
好ましくは、Fab′フラグメントを式（１）または式
（10）で示される架橋化合物を使用して架橋させる。最
も好ましくは、この架橋化合物は、本明細書に記載の例
に示されている構造の一つを有する。最も好ましい架橋
化合物はCT998,CT557またはCT558である。
本発明の３価または４価の単一特異性抗原結合性タン
パク質は、in vivo診断または治療に使用することがで
きる。
したがって、本発明はまた、診断的に、または治療的
に、機能するエフェクター分子、原子またはその他を有
する、本発明に係わる３価または４価の単一特異性抗原
結合性タンパク質を包含する。前記のエフェクターまた
はリポーター基がいずれも包含される。
本発明のタンパク質は、in vivo診断または治療の目
的に使用されるものである。したがって、本発明はま
た、本発明に係わるタンパク質の有効量を、医薬的に許
容される希釈剤、賦形剤、または担体と組み合わせて含
有する、in vivo使用のための診断組成物または治療組
成物を包含する。
これらの組成物は、その他の活性成分を含有すること
ができる。
これらの組成物は、投与に適するいずれの形態もとる
ことができ、特に、非経口投与、たとえば注射または灌
注による、たとえば大量注射または連続灌注による投与
に適する形態であることができる。組成物が注射用また
は灌注用である場合には、本発明のタンパク質の油性ま
たは水性の媒質中の、懸濁液、溶液またはエマルジョン
の形態であることができ、助剤、たとえば懸濁安定剤お
よび（または）分散剤を含有することができる。別様に
は、この組成物は、使用前に適当な無菌液体により再構
成するための乾燥形態であることもできる。
本発明に係わるタンパク質を投与できる投与量は、こ
のタンパク質が診断に使用されるか、または治療に使用
されるかによって、診断または処置される状態の種類に
よって、このタンパク質が予防に使用されるか、または
存在する症状の処置に使用されるかによって、およびま
た選択された特定のFabフラグメントおよびエフェクタ
ーまたはリポータ基によって変わる。投与量はまた、患
者の年齢および症状にしたがって選択される。したがっ
て、たとえば0.01−10mg/kg/日の範囲の用量を使用する
ことができる。有利には、本発明に係わる化合物は血液
から迅速に排除されるので、多回の投与計画を使用する
ことができる。
さらにまた、本発明は、有効量の本発明のタンパク質
をヒトまたは動物対象に投与することからなる、診断方
法または治療方法を包含する。
最も好ましくは、本発明の方法は癌の処置または診断
に向けられる。
本発明はさらにまた、本発明の前記態様に記載の３価
または４価のタンパク質を、病気、好ましくは癌、の処
置に使用することを包含する。さらにまた、本発明は、
本発明に係わる３価または４価のタンパク質を病気の処
置用の組成物の製造に使用することを包含し、この病気
は、好ましくは癌である。
本発明をここで、添付図面を引用して、例によって説
明する。この図面において、 Fig 1は、下記の例で行われた架橋反応のHPLC分析を
示すグラフである； Fig 2は、モノマー状、ダイマー状、トリマー状およ
びテトラマー状のFab′タンパク質を比較する、抗原−
結合性ELISAの結果を示している； Fig 3は、本発明のトリマー状Fab′タンパク質（TF
M）の改善されたオフーレート（Off−rate）を示すグラ
フである； Fig 4は、完全IgGと比較した、TFMの血液クリアラン
スを示すグラフである； Fig 5は、腫瘍を有するマウスに投与されたTFMおよび
IgGの組織分布を比較するものである； Fig 6は、腫瘍を有するマウスに投与されたTFMおよび
IgGの腫瘍：血液比率を示している； Fig 7は、Fig 5に示されているデータと同様の生体分
布データを示すものであって、本発明の抗体構築物を投
与した後の、種々の経過時間の時点で採取したデータを
示している； Fig 8は、QFM（tetra−FaB）を生成するための架橋反
応のHPLC分析を示すグラフである； Fig 9は、QFM構築物に係わる生体分布データを示して
いる； Fig 10は、CT998架橋化合物を使用する、部位−特異
性および無作為のTFM構築物の生体分布を比較するもの
である； Fig 11は、IgGに優るTFMの抗原に対する増大した結合
活性をしめしている； Fig 12およびFig 13は、A5B7−特異性TFMの生体分布
挙動を示している。
例 A.架橋化合物の合成 下記の例は本発明に係る架橋化合物の合成を説明する
ものである。この架橋化合物の合成において、多くの中
間体化合物が使用される。本例において、下記の略語を
使用する： 中間化合物１ BOC−Lys（Ｅ−Ｚ）酸（8.02g）を、N2の下に、乾燥T
HF（80ml）中に溶解した。この反応混合物の温度を、−
20℃に下げ、次いで温度を−20℃に維持しながら、エチ
ルクロロホーメート（2.29g、2.02ml）およびＮ−メチ
ルモルホリン（2.13g、2.31ml）を加えた。30分後に、
アンモニア（メタノール中の2M溶液16ml）を加え、この
反応混合物を室温に戻した。この有機層を飽和重炭酸ナ
トリウム溶液に加え、次いでその水性層を酢酸エチルに
より抽出し、乾燥させ（MgSO4）、次いで蒸発させ、中
間体１（6.5g）を細い白色固形物として得た。1 HNMR（CO3OD）δ7.5−7.2（ｍ）5H,5.1（ｓ）2H,4.0
（ｍ）1H,3.12（ｔ）2H,1.84−1.32（ｍ）15H. 中間化合物２ 中間化合物１（4.1g）をTFAをCH2Cl2との1:1溶液（50
ml）中に溶解し、この反応混合物を室温で30分間攪拌し
た。溶媒を蒸発させ、残留物をエーテルとすりまぜ、次
いで乾燥させ、中間化合物２（4.1g）を白色固形物とし
て得た。1 HNMR（CO3OD）δ7.5−７（ｍ）5H,5.1（ｓ）2H,3.85
（ｔ）1H,3.15（ｔ）2H,1.95−1.75（ｍ）2H,1.6−1.35
（ｍ）4H. 中間化合物３ BOC−Lys（Ｅ−Ｚ）酸（4.21g）、中間化合物２（4.1
5g）、エチルクロロホーメート（1.21g、1.06ml）およ
びｎ−メチルモルホリン（1.12g、1.21ml）を一緒に、
中間化合物１に係り前記したとおりに反応させ、中間化
合物３（7.3g）を生成させた。1 HNMR（CO3OD）δ7.4−7.2（ｍ）10H,5.1（ｓ）4H,4.35
（ｑ）1H,4.0（ｑ）1H,3.2（ｔ）4H,1.95−1.30（ｍ）2
1H. 中間化合物４ 中間化合物３（4.3g）を、中間化合物２の製造方法を
使用して、TFA/CH2Cl2（1:1、50ml）により処理し、中
間化合物４（4.3g）を生成させた。1 HNMR（CO3OD）δ7.4−7.2（ｍ）10H,5.1（ｓ）4H,4.35
（ｔ）1H,3.85（ｔ）1H,3.12（ｑ）4H,1.9−1.3（ｍ）1
2H. 中間化合物５ 中間化合物１に係り前記したとおりにして、BOC−Lys
（Ｅ−Ｚ）酸（2.29g）、中間化合物４（3.76g）、エチ
ルクロロホーメート（665mg、0.577ml）およびＮ−メチ
ルモルホリン（607mg、660μｌ）を一緒に反応させ、中
間化合物５（5.1g）を生成させた。1 HNMR（CO3OD）δ7.5−7.2（ｍ）15H,5.1（ｓ）6H,4.3
（ｍ）2H,4.2（ｔ）1H,3.15（ｔ）6H,1.9−1.3（ｍ）27
H. 中間化合物６ 中間化合物５（4.0g）をメタノール（100ml）中に溶
解し、この溶液を窒素により、15分間脱気した。この溶
液を次いで、10％Pd/C（180mg）および水素バルーンを
用いて、室温で水素添加した。触媒を濾別し、溶液を減
圧の下に濃縮して、中間化合物６（2.3g）を淡黄色油状
物として得た。1 HNMR（CO3OD）δ4.45−4.25（ｍ）2H,4.0（b.t）1H,2.
65（ｓ）6H,2.0−1.3（ｍ）27H. 中間化合物７ Lys（Ｅ−Ｚ）ベンジルエステル（0.5g）を、僅かに
加熱しながら、ジメチルスルホキシド（3.0ml）中に溶
解した。Ｎ−メチルモルホリン（0.134g）を次いで加
え、引き続いてすぐに、ビス−Ｚ−Lys−Ｎ−ヒドロキ
シスクシンイミドエステル（0.754g）のジメチルスルホ
キシド（3.0ml）溶液を加えた。この反応混合物を室温
に数時間放置し、反応を逆相HPLCにより、反応の完了ま
で監視した〔To:A−70％,C＝30％,T15:A＝0,C＝100％,T
25:A＝0,C＝100％,A＝0.1/H2O;C−0.1％ TFA/CH3CN;生
成物は20.5分で溶出した〕。次いで、中間化合物７を反
応溶液から0.1％TFA/CH3CN:H2O中に採取し、凍結乾燥さ
せて、細い白色粉末（750mg）を生成した。
中間化合物８ 中間化合物７（0.25g）を、N2気体の下に攪拌しなが
ら、乾燥CH3Cl2（100ml）中に溶解し、次いでN2気体の
下に、トリメチルシリルヨウダイド（10μｇ、467μ
ｌ）により処理した。生成する淡黄色溶液は室温で一夜
にわたり攪拌し、その後で暗褐色に変わった。CH3Cl2を
減圧の下に蒸発させ、暗褐色残留物を得た。この残留物
をH2O（10ml）中に溶解し、次いでエーテル（３×10m
l）により抽出した。この水性層およびエーテル層を、
ニンヒドリンスプレイを用いて、遊離アミノ基の存在に
関して検査した。水性相は遊離アミノ物質の全部を含有
していた。この水性相を一夜にわたり凍結乾燥させ、中
間化合物７を淡黄色残留物として得た。
例 １ 乾燥したＮ−マレオイル−β−アラニン（444mg）にT
HF（10ml）を加え、この反応混合物を−20℃で10分間攪
拌した。エチルクロロホーメート（286mg、288μｌ）お
よびＮ−メチルモルホリン（266mg、288μｌ）を次いで
加え、この反応混合物を−20℃で30分間放置した。この
反応混合物を−20℃に保持しながら、乾燥DMF（10ml）
中の中間化合物５（400mg）を加えた。この混合物を室
温に戻るまで放置し、次いで逆層HPLC（Dyanamaxカラム
C60Å）を使用し、下記のプログラムにしたがい精製
し、本例の所望のトリマレイミド化合物６（保持時間1
0.7分、180mg）を生成させた： Ａ Ｃ T0 70 30 Ａ＝0.1％ TFA/H2O T20 50 50 Ｃ＝0.1％ TFA/CH3CN 1 HNMR（CO3OD）δ6.85（ｓ）6H,4.4−4.3（ｍ）2H,4.1
−4.0（ｍ）1H,3.8（ｔ）6H,3.15（ｔ）6H,2.5（ｔ）6
H,1.95−1.3（ｍ）27H. 例 ２ 例１の化合物（100mg）を、中間化合物２の製造に関
して前記したとおりに、TFA/CH3Cl2（1:1、10ml）によ
り処理した。溶媒／酸を蒸発乾燥させ、油状物を得た。
エーテルを加え、TFA塩を沈殿させ、この沈殿を次いで
数時間、凍結乾燥させ、所望の塩（86mg）を生成した。1 HNMR（CO3OD）δ6.8（ｓ）6H,4.4−4.2（ｍ）2H,3.95
（ｔ）1H,3.7（ｔ）6H,3.2−3.1（ｍ）6H,2.45（ｔ）6
H,1.95−1.3（ｍ）18H. 例 ３ ２−（４−アミノ）ブチルパーヒドロ−1,4,7,10−テ
トラアザデシン−1,4,7,10−テトラ（２−酢酸）〔この
化合物は国際特許明細書No.WO/89/01476の例１（ｂ）に
記載されている〕を、Ｎ−メチルモルホリンの存在の下
に20℃で３時間、ジメチルスルホキシド中のビス−（ｐ
−ニトロフェニル）スクシネートにより処理し、相当す
る活性エステル８を生成させた： この生成物は固形物（109mg）として採取された。こ
の生成物を、さらに精製することなく、DMF（5ml）中に
溶解した。生成する溶液に、DMF（5ml）中の例７の化合
物（86mg）を加え、次いでＮ−メチルモルホリン（98m
l、90mg）を加えた。この反応混合物を37℃で一夜にわ
たり放置し、所望の生成物CT998を逆相HPLC（Dynamaxカ
ラムC60Å）を用いて、下記のプログラムにしたがい、
単離した： Ａ Ｃ T0 70 30 Ａ＝0.1％ TFA/H2O T20 50 50 Ｃ＝0.1％ TFA/CH3CN T25 ０ 100 CT998の保持時間＝15分 収量＝11mg1 HNMR（D20）δ6.8（ｓ）6H,4.3−2.4（b.m）59H,2.0−
1.2（b.m）24H. FAB質量スペクトルP776M/Z+＝1412,1435（Na+付加物）1
415（K+付加物）． 例 ４ 中間化合物７（0.2g）をジメチルスルホキシド中に溶
解し、この溶液にＮ−メチルモルホリン（0.166g）を加
え、次いでジメチルスルホキシド（3.0ml）中のスクシ
ンイミジルマレイミドプロピオネート（0.44g）を加え
た。この混合物を僅かに加熱し、生成した淡黄色溶液を
放置し、白色沈殿（加水分解したプロピオネート）を得
た。この反応の進行はTLCおよびニンヒドリンスプレイ
を用いて監視した。室温で約30分後に、反応はニンヒド
リン陰性になった。これは遊離アミノ基の全部が反応し
たことを示している。この混合物を次いで、逆相HPLCを
使用し、下記のプログラムにしたがって、精製した： Ａ Ｃ T0 90 10 Ａ＝0.1％ TFA/H2O T20 ０ 100 Ｃ＝0.1％ TFA/CH3CN 生成物ピークは約14.0分で溶出した。生成物留分を、
0.1％三フッ化酢酸/H2O:CH3CN中に採取し、一夜にわた
り凍結乾燥させ、例４の化合物（CT557）を細い白色物
質として得た。
例 ５ この例の化合物は、例４のCT557の製造に関して記載
の方法と同様の一連の反応および反応剤を使用したが、
ビス−Ｚ−Lys Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ルとの反応に、Lys（Ｅ−Ｚ）ベンジルエステルの代り
に、Lysベンジルエステルを使用して、相当するテトラ
−Ｎ−Ｚ中間化合物を生成させ、この中間化合物を脱保
護し、次いで例４に記載のとおりにして、スクシンイミ
ジルマレイミドプロピオネートと反応させ、CT558を生
成させることによって製造した。
B.TFMおよびQFMの構築 例 ６ モノクローナル抗体B72.3は、TAG72の名称の腫瘍付随
糖タンパク質に対して特異性である（Colcher等によ
る、PNAS、78、3199−3203）。一個のみのヒンジチオー
ル基を含有する抗体B72.3のキメラFab′フラグメント
（cB72.3 Fab′δ Cys）を、国際特許明細書WO89/019
74およびWO89/01783に記載のとおりにして調製した。cB
72.3Fab′δ Cysのヒンジチオール基は多くの場合に、
ブロックされた形態で採取される。したがって、架橋を
進行させるためには、このcB72.3Fab′δ Cysの部分的
還元を行わなければならない。これは、cB72.3Fab′δ
Cysを、2mM EDTA含有0.1M酢酸／クエン酸ナトリウム
塩緩衝液（pH6.0）中の３〜7mg/mlとして、4.5mM β−
メルカプトエチルアミンとともに、37℃で30分間、イン
キュベートすることによって達成された。還元剤を次い
で、Sephadex Ｇ−25のカラムにおいて、2mM EDTA含
有0.1M酢酸塩／クエン酸塩緩衝液（pH6）中に脱塩処理
することによって、除去した。この還元の程度は、還元
され、脱塩した物質の一定量をジチオジピリジンにより
滴定することによって、試験した。この方法は代表的
に、cB72.3Fab′δ Cys分子の一つ当りで約１個のチオ
ールを生成させる。
tri−Fabに対するトリ−マレイミド架橋化合物CT557
の架橋結合は２種の方法のうちの一つによって行なっ
た。最初に、これらのCT557を乾燥DMF中に溶解し、次い
でCT557をFab′よりも５倍モル過剰にして新しく還元
し、脱塩したFab′に加えた。37℃で１時間インキュベ
ートした後に、過剰量のＮ−エチルマレイミドを加え、
さらに10分間、37℃におけるインキュベーションを行な
い、この混合物を次いでSephadec G−25のカラムで、2m
M EDTA含有0.1M酢酸塩／クエン酸塩（pH6.0）中に脱塩
処理した。この方法によって、CT557が結合した、cB72.
3Fab′δ Cysが生成される。これとは別に、新に還元
し、脱塩したcB72.3Fab′δ Cysのもう一つのバッチを
前記のとおりに調製し、これをFab′−CT557に2:1（Fa
b′:Fab′−CT557）の割合で加えた。この反応混合物を
37℃で一夜にわたり保持し、次いで架橋度合をHPLCゲル
濾過およびSDS−PAGEにより評価した。HPLCゲル濾過分
析は、DuPont ZorbaxGF−250カラムを0.2Mリン酸塩緩
衝液（pH7.0）中で1ml/分で操作して、行ない、そしてS
DS−PAGEはLaemmli（1970）によって開示されているよ
うに行なった。代表的にはこの方法で、cB72.3Fab′δC
ysの30〜50％がtri−Fabに架橋結合した。CT557を用い
る第二の架橋方法では、新に還元し、脱塩したcB72.3Fa
b′δ Cysを前記のとおりに調製し、次いで5:1のFa
b′:CT557のモル比が得られるような割合で、CT557を乾
燥DMF中の溶液として加えた。この混合物を37℃で、一
時間またはそれ以上の間、インキュベートし、次いで架
橋結合の度合をHPLCゲル濾過およびSDS−PAGEによっ
て、前記のとおりに評価した。この調製方法によるtri
−Fabに対する架橋結合度は代表的には、40〜60％であ
った。架橋混合物の代表的HPLC分析をFig １に示す。
tri−FabはDuPont Zorbax GF−250XLカラムにおいて
0.2Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）で3ml/分で操作するか、
またはSephacryl S−200HRの直径2.6cm×長さ183cmのカ
ラムにおいて、0.2M塩化カリウムおよび2mM EDTAを含
有する0.1M酢酸塩緩衝液（pH6.0）中で操作する、分取H
PLCを使用するゲル濾過クロマトグラフィによって精製
した。
tri−Fabの抗原結合能を、ムチン結合性ELISAを使用
し、IgG di−Fabおよびモノマー状Fab′と比較した。モ
ノマー状、ダイマー状およびトリマー状のキメラFabお
よびまたキメラB72.3IgGの滴定を行ない、微量滴定プレ
ートのくぼみ内の固体相ムチンに１時間、結合させた。
未結合抗体を洗出した後に、ヤギ抗ヒトFab−HRPO接合
体を加え、引き続いてテトラメチルベンジジン（TMB）
により現像した。得られたシグナルをnM結合部位で表さ
れる抗体濃度に対してグラフに描いた。抗原結合性ELIS
Aの結果をFig 2に示す。モノマー状Fab′は予想通り
に、貧弱な結合活性を示すのに対し、di−FabおよびIgG
の滴定でも、予想通りの極めて類似した様相が示され
た。tri−Fabに対する架橋結合は、抗原結合用の結合部
位の結合能を２〜３倍、有利にする結果が得られるよう
に見做される。分子の結合能の増大が架橋によって得ら
れたならば、分子のオフ−レートにおける有意の変化が
見られるはずである。tri−FabおよびcB72.3IgGをそれ
ぞれ、70nM（結合部位で表して）において、微量滴定プ
レートのくぼみ内の固体相ムチンに対して結合させるこ
とによって、cB72.3IgGのオフ−レートとtri−Fabのオ
フ−レートとを比較した。二列のくぼみを次いで、23時
間、８時間、４時間、２時間および１時間、連続洗浄に
付した。残留抗体はヤギ抗ヒトFab−HRPO接合体によ
り、次いでTMBによる現像により明らかにした。得られ
たシグナルを、tri−FabまたはIgGの標準曲線から読み
取り、このデータを経過時間に対するtri−Fabフォーマ
ットまたはIgGフォーマットにそれぞれ残留するnM結合
部位としてグラフに描いた。Fig 3はこの分析結果を示
すものである。オフレートの有意の改善が、tri−Fabに
見出され、このことはtri−Fabが長時間にわたって、抗
原に結合したまま残ることを示しており、これはこの分
子が極めて改善された能力を示している。
標準的方法にしたがい、Bolton Hunter試薬を使用し
て、cB72.3 IgGおよびtri−Fab（それぞれ、0.2Mリン
酸塩緩衝液pH7.0中の1mg/mlとして0.5mg）を125Iにより
ラベルした。ラベルしたtri−FabおよびIgGの品質はSDS
−PAGE/オートラジオグラフィによって評価した。この
ラベル付与方法によるtri−FabまたはIgGの分解は見ら
れなかった。脇腹の皮下に、２〜３週令のLS174Tヒト腫
瘍異種移植片を有する、一群４匹の雌のヌードマウス
に、tri−Fab約17μg/9μCiおよびIgG 19μCiを、尾静
脈から静脈注入した。各群の動物を３時間目、24時間
目、48時間目および168時間目に殺し、組織を採取し、
その重量を測定し、7M水酸化カリウム中に溶解し、次い
でLKBモデル1270ガンマーカウンターで測定した。結果
は、注射量／組織グラム±標準偏差（ｎ＝４）の平均パ
ーセンテージで表わした。
ヨード付加したIgGに係る生体分布結果は、以前の実
験（King等、1992）と一致した。ヨード付加したtri−F
abはIgGに比較して、これら２種の分子がほぼ同一の分
子量を有するにもかかわらず、動物から有意に迅速に排
除されることが見出された（Fig 4）。tri−Fabはま
た、他のいずれの組織にも有意の蓄積を示さず、腫瘍に
対し良好に局在することができた（Fig 5）。したがっ
て、tri−Fabの腫瘍：血液比は、IgGに関して見い出さ
れるものよりも、格別に良好であった（Fig 6）。腫
瘍：血液比は、この比が、腫瘍に対して与えられた放射
能量に係り、予想される血液照射による毒性が小さいこ
とを意味しており、重要である。
皮下にLS174T異種移植腫瘍を有するヌードマウスにお
ける、cB72.3tri−Fabの生体分析をまた、90Yによりラ
ベルした場合に係り評価した。90Yラベル用の12N4大環
状基を、12N4−マレイミド誘導体（CT77、この化合物は
国際特許明細書WO89/01476の例1bの化合物およびＮ−
（２−カルボキシエチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシ
スクシンイミドエステルから製造される）を使用して、
精製tri−Fabに結合させた。精製tri−Fabの試料を、2m
M EDTA含有0.1M重炭酸ナトリウム緩衝液中に緩衝剤交
換させた。tri−Fabに対して10倍モル過剰の２−イミノ
チオランを室温で30分間反応させることによって、チオ
ール基をtri−Fab中に導入した。チオール付加したtri
−Fabを次いで、Sephadex Ｇ−25（Pharmacia PD−1
0）のカラムを使用し、2mM EDTA含有0.1M重炭酸ナトリ
ウム緩衝液（pH8）中に脱塩処理して、未反応の２−イ
ミノチオランを除去した。チオール基の存在数は、ジチ
オジピリジンによる滴定によって測定した。12N4大環状
分子を次いでチオール化したtri−Fabに結合させた。こ
のためには、チオール基の存在数よりも10倍モル過剰の
CT77を添加し、次いで37℃で２時間インキュベートし
た。この接合体を次いで、Sephadex Ｇ−25カラム（Ph
armacia PD−10）において、0.1M酢酸カリウム（pH6）
中への脱塩によって精製した。この接合体に90YC13を添
加することによって、放射性ラベルを行なった。この際
に、この接合体溶液中の緩衝液を酸90YC13を緩衝するの
に充分にした。37℃で15分間のインキュベーションの後
に、10mM DTPAの添加により放射性ラベル付与を静止さ
せ、このラベルしたtri−Fabを0.2Mリン酸塩（pH7）中
のDuPont Zorbax GF−250カラムにおけるゲル濾過HPL
Cによって精製した。
90YによりラベルされたcB72.3tri−FabをSDS−PAGE/
オートラジオグラフィによって評価した。このラベル付
加方法によるtri−Fabの分解は見られなかった。脇腹皮
下に、２〜３週令のLS174Tヒト腫瘍異種移植片を有す
る、一群４匹の雌のヌードマウスに、tri−Fab約３μg/
3μCiを尾静脈から静脈注入した。各群の動物を2.5時間
目、24時間目、48時間目および120時間目に殺し、組織
を採取し、この組織の重量を測定し、7M水酸化カリウム
中に溶解し、次いでLKBモデル1270ガンマカウンターに
より測定した。結果は注射量／組織グラム±標準偏差
（ｎ＝４）の平均パーセンテージで表わした。
この生体分布実験の結果（Fig 7）として、125−ヨウ
素によりラベルした場合に見られた結果と同様に迅速
な、90Yラベル付加tri−Fabのクリアランスが見出され
た。良好な腫瘍局在が見られ、他の全部の組織では、低
レベルが検出された。重要なことは、腎臓において、低
レベルの活性が検出されたことである。FabおよびＦ（a
b′）２などの他の抗体フラグメントを投与した場合に
おける腎臓内の90Y滞留は、これらの有用性を制限して
いたことから、tri−Fabに係るこの腎臓低レベルは、他
の抗体フラグメントに比較して格別に有利であることを
示している。
例 ７ cB72.3tetra−Fabを、還元され、脱塩したFab′から
調製し、次いでテトラ−マレイミド架橋化合物CT558を
使用して行なった。CT558を乾燥DMA中に溶解し、次いで
Fab′に対してCT558を５倍モル過剰にして、新たに還元
し、脱塩したFab′に加えた。
37℃で１時間のインキュベーションの後に、過剰のＮ
−エチルマレイミドを加え、さらに10分間、37℃でイン
キュベーションを行い、この混合物を次いで、Sephadex
Ｇ−25のカラムにおいて、2mM EDTA含有0.1M酢酸塩
／クエン酸塩（pH6.0）中に脱塩処理した。この方法に
よって、CT558が結合したcB72.3Fab′δ Cysが生成さ
れた。これとは別に、新に還元し、脱塩した、cB72.3Fa
b′δ Cysのもう一つのバッチを、上記したとおりに調
製し、3:1（Fab′:Fab′−CT558）の比率で、Fab′−CT
558に加えた。この反応混合物を37℃で一夜にわたり保
持し、次いで架橋の度合いを、例６に記載のとおりにHP
LCゲル濾過およびSDS−PAGEによって評価した。代表的
には、この方法によって、cB72.3Fab′δ Cysの20−40
％がtetra−Fabに架橋結合した。架橋結合混合物の代表
的HPLC分析値をFig 8に示す。このtetra−Fabを、例６
にtri−Fabに関して前記したとおりのHPLCゲル濾過によ
って精製した。
このtetra−Fabの抗原結合能を、例６にtri−Fabに関
して記載されているとおりに評価した。結合能のIgGに
優る同様の改善が、この精製tetra−Fabについても見出
された（Fig 2）。
精製tetra−Fabを、2mM EDTA含有0.1M重炭酸ナトリ
ウム緩衝液（pH8）中に緩衝液交換し、次いでtetra−Fa
bよりも15倍過剰の２−イミノチオランとのインキュベ
ーションによって、室温で30分間のインキュベーション
でチオール化した。２−イミノチオランを次いで、燐酸
塩緩衝塩類溶液中で、Sephadex Ｇ−25（Pharmacia,PD
−10において、このチオール化tetra−Fabを脱塩するこ
とによって除去した。次いで、存在するチオール基の数
（上記したジチオジピリジンによる滴定によって測定さ
れたチオール基の数）に対して、10倍過剰のCT82（この
化合物は、国際特許明細書WO89/01475の例2bの化合物お
よびＮ−（２−カルボキシエチル）マレイミドのＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステルから製造される）の添
加によって、9N3大環状分子をtetra−Fabに接合させ
た。37℃で一夜にわたりインキュベートした後に、過剰
のＮ−エチルマレイミドを加え、さらに10分間のインキ
ュベーションを続けた。この接合したtetra−Fabを次い
で、Sephadex−Ｇ−25カラム（Pharmacia,PD−10）を使
用して、0.1M酢酸ナトリウム（pH5.0）中に脱塩するこ
とによって、精製した。この精製tetra−Fab 9N3接合
体に111−InC 13を直接に添加し、次いで、37℃で30分
間インキュベートすることによって、tetra−Fab接合体
に放射性物質をラベルした。DTPAを0.5mMまで添加する
ことによって、ラベル付加を静め、次いでこの放射性ラ
ベルしたtetra−Fabを、tri−Fabに関して前記したHPLC
ゲル濾過によって、精製した。
111−InによりラベルしたcB72.3tetra−Fabを、SDS−
PAGE/オートラジオグラフィによって、評価した。この
ラベル方法によるtetra−Fabの分解は見られなかった。
一群４匹の、脇腹皮下に２−３週令のLS174Tヒト腫瘍異
種移植片を有する雌のヌードマウスに、約3.5μg/11μC
iのtetra−Fabをその尾静脈に静脈注射した。各群の動
物を、24時間目、48時間目および168時間目に殺し、組
織を採取し、その重量を測定し、7M水酸化ナトリウム中
に溶解し、次いでLKBモデル1270ガンマカウンターで測
定した。結果は、注射量／組織グラム±標準偏差（ｎ＝
４）の平均パーセンテイジとして表した。
この生体分布実験の結果（Fig 9）は、tri−Fabに見
る出だされたものと同様に（例６）、tetra−Fabの迅速
な血液クリアランスおよび良好な腫瘍局在性を示した。
tri−Fabに関して見出されたもの（例６）と同様に、te
tra−Fabに関しても、有意の利点を示唆する、腎臓低レ
ベルがまた見出された。
例 ４ cB72.3tri−Fabを、tri−Fabに関してCT557を使用し
て記載された方法と同一の方法（例６）によって、架橋
化合物CT998を使用して調製した。この架橋化合物は90Y
または11Inラベル用の12N4大環状分子を含有する。CT99
8を使用して調製されたtri−Fabは、抗原結合に係わ
り、CT557を用いて調製されたtri−Fabと均等な活性を
有していた。90Yによりラベルした場合の、cB72.3tri−
Fab（998）のマウスにおける生体分布を評価した。90Y
ラベル付加は、例６において、cB72.3tri−Fab（998）
に関して記載されているとおりにして達成された。cB7
2.3tri−Fab（998）の場合には、大環状分子が架橋化合
物中にすでに存在するので、大環状分子の接合は不必要
であった。次いで、90YラベルしたcB72.3tri−Fab（99
8）の約４μg/8μCiを、一群４匹のマウスに注入するこ
とによって、生体分布実験を行った。各群の動物は、３
時間目、24時間目、48時間目、72時間目および168時間
目に殺し、その組織を採取し、その重量を測定し、7M水
酸化カリウム中に溶解し、次いでLKBモデル1270ガンマ
カウンターで測定した。結果は注射量／組織グラム±標
準偏差（ｎ＝５）の平均パーセンテイジとして表した。
この生体分布実験の結果は、tri−Fab（998）が架橋化
合物CT557を使用して形成されたcB72.3tri−Fabと同様
の様相を示すことを証明した。tri−Fab（988）は循環
系から迅速に排除され、他の組織のいずれにも有意に蓄
積することなく、腫瘍に充分に局在することができた
（Fig 10）。
例 ５ ネズミモノクローナル抗体A5B7は研究されており、癌
胎児性抗原（CEA）として知られる腫瘍付随抗原を認識
することが示されている（Harwood等、1986）。この抗
体のマウス：ヒトキメラ変種は精製されており、適当な
cA5B7′δ Cysに係わる遺伝子は、特許出願WO92/01059
に記載されているように、NS0細胞で使用される発現ベ
クターで構築されている。cA5B7 Fab′を生成するNS0
細胞は、プラスミドDNA（pHMC30）50μｇを酵素Fsp 1に
より線状化し、NS0細胞中に電気泳動に付し、次いで生
じるセルラインをキメラB72.3に関して開示されている
（Bebbington等、1992）ようにして選択することによっ
て調製された。
cA5B7 Fab′δ Cysは、NS0細胞培養上澄液から、先
ずこの上澄液のpHをHClにより５に調整し、次いで150mM
塩化ナトリウム含有100mM燐酸塩緩衝液（pH5.0）中で予
め平衡化したタンパク質Ｇセファロース（Hi−trap.Pha
rmacia）のカラムに通すことによって、精製した。上記
上澄液を負荷した後に、このカラムを平衡化した緩衝液
により洗浄し、次いで0.1Mクエン酸によりFab′を溶出
した。精製Fab′を含有するフラクションを、pHを６−
７に調整するのに充分の1M tri中に直接に集めた。Fa
b′を含有するフラクションを集め、次いで限外濾過に
よって濃縮した。CT557によるcA5B7 tri−Fabへの架橋
およびこのtri−Fabの精製は、例６において、cB72.3Fa
b′δ Cysに関して記載の方法と実質的に同一の方法に
よって、達成された。このcA5B7 tri−Fabの抗原結合
能を、CEA結合性ELISAを使用して、A5B7 IgGと比較し
た。これは、例６にムチン結合性ELISAに関して記載さ
れたとおりに実質的に従うが、ムチン塗布プレートの代
わりに、CEA塗布プレートを使用した。この結果は、IgG
に比較してcA5B7 tri−Fabが同様の改善された結合活
性を有することを証明した。cA5B7 tri−Fabの生体分
布はIgGより優れていた。cA5B7 tri−Fabの生体分布を
また、ヌードマウス異種移植片における実験によって評
価した。125Iによりラベルされた、cA5B7 tri−Fab約
３μg/2.4μCi（上記cB72.3に係わり記載したBolton Hu
nter試薬による）を、一群４匹の、皮下にLS174T異種移
植片を有するヌードマウスに注入し、24時間目および72
時間目に生体分布を測定した。この結果は、腫瘍に対す
る局在を伴う、cA5B7 tri−Fabの迅速なクリアランス
を示し（Fig 12）,cB72.3tri−Fabに見出されたものと
同様の好ましい性質を示した。
例 ６ A5B7 Fab′δ Cys（gA5B7 Fab′）のCDR移植変種
を特許出願WO92/01059に記載のとおりに調製した。pAL5
4（これはWO92/01059に記載されている）から、BamH1−
Clalフラグメント上のGSミニ遺伝子およびamp遺伝子を
取り除き、その代わりにampR遺伝子およびGS cDNAから
なるBamH2−Clalを置き換えることによって、プラスミ
ドpHMC53を構築した。これによって、NS0細胞内での発
現に適するベクターが得られる（Bebbington等、199
2）。CDR移植A5B7 Fab′δ Cysを分泌するNS0セルラ
インが、上記キメラFab′に係わる記載にしたがいpHMC5
3を使用して生成された。
gA5B7 Fab′は、NS0細胞培養上澄液から、先ずこの
上澄液のpHを1M trisによって、８に調製し、次いで、
150mM塩化ナトリウム含有100mM硼酸緩衝液（pH8）中で
予め平衡化したタンパク質Ａセファロース（Pharmaci
a）のカラムに通した。上澄液を負荷した後に、このカ
ラムを平衡緩衝液により、そしてFab′を0.1Mくえん酸
により洗浄した。この精製Fab′を含有するフラクショ
ンを、そのpHが６−７に調整されるのに充分の1M tris
中に、直接に採取した。このFab′含有フラクションを
集め、次いで限外濾過によって濃縮した。gA5B7 tri−
FabへのCT557の架橋およびtri−Fabの精製は、例６にcB
72.3Fab′δ Cysに係わり記載の方法に実質的にしたが
い達成された。抗原結合分析はまた、このgA5B7 tri−
Fabが高度に活性であることを示し、そしてまた前記の
方法と同様の方法で行われた125Iラベル付加物質の生体
分布実験は、同様の迅速な血液クリアランスおよび良好
な腫瘍局在を示した（Fig 13）。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｚ 33/574 Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 ビーリィ，ナイジェル，ロバート，アー ノルド イギリス国オーエックス９ ３エルキュ ー オックスフォードシャー，セーム, チェシャー ロード 16 (72)発明者 ミリカン，トーマス，アンドリュー イギリス国エスエル６ ０ディーワイ バークシャー，メイドンヘッド，ドーニ ィ リーチ，ハーコート クロース ３ (56)参考文献 特開 昭62−275128（ＪＰ，Ａ) 特表 昭63−501876（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／9159（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (16)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】３価の単一特異性抗原結合性タンパク質で
    あって、単一の連結分子によって相互に共有結合してい
    る３個のFabフラグメントを含有し、天然免疫グロブリ
    ンではない、３価の単一特異性抗原結合性タンパク質。
  2. 【請求項２】単一の連結分子がマレイミド架橋化合物で
    ある、請求項１に記載の抗原結合性タンパク質。
  3. 【請求項３】Fabフラグメントが、少なくとも１個のシ
    ステイン残基を有するヒンジ部を包含しており、そして
    連結分子が、各フラグメントにおいて少なくとも１個の
    システイン残基を介して連結する３価のマレイミド架橋
    化合物である、請求項２に記載の抗原結合性タンパク
    質。
  4. 【請求項４】ヒンジ部が、Fab′様フラグメントの天然
    ヒンジ部に比較して、減少した数のシステイン残基を有
    する、請求項３に記載の抗原結合性タンパク質。
  5. 【請求項５】連結分子が、下記一般式（１）： R1CH（R2）NHCOR3 （１） 〔式中、R1は、カルボキシル基（−CO2H）またはエステ
    ル化カルボキシル基、あるいは基−COAであり、Ａは、
    直接にまたはスペーサー基を経て、−CO基に結合して、
    炭素−炭素結合または炭素−ヘテロ原子結合を形成して
    いる、エフェクター分子またはリポーター分子であり;R
    2およびR3は、同一または異なっていてもよく、それぞ
    れこのR2およびR3の中の反応官能性基の総数が３個であ
    るような数で、１個または２個以上の反応官能性基を含
    有しており、置換されていてもよい、直鎖状または分岐
    鎖状のC1-25アルキレン、C2-23アルケニレン、またはC
    2-20アルキニレン鎖〔この鎖は、１個または２個以上の
    −Ｏ−または−Ｓ−原子、あるいはＮ（R4）（ここでR4
    は、水素原子またはC1-6アルキル基である）、−Ｎ
    （R4）CO−、−CON（R4）−、C5-8シクロアルキレン、C
    6-12アリーレンあるいはC5-10ヘテロアリーレン基によ
    り中断されていてもよい〕で表わされる架橋化合物であ
    る請求項１に記載の抗原結合性タンパク質。
  6. 【請求項６】連結分子が、下記一般式（10）： R9CH（R2）CONHCH（R2）CONHCH（R2）CONH2 （10） 〔式中R9は−NH2または置換アミノ基、たとえば基−NHC
    OAであり、そしてＡおよびR2は式（１）の化合物に関し
    て定義されている通りである〕で表わされる架橋化合物
    である請求項１に記載の抗原結合性タンパク質。
  7. 【請求項７】連結分子が、大環状分子を、さらに含有す
    る、請求項５または請求項６に記載の抗原結合性タンパ
    ク質。
  8. 【請求項８】大環状分子が、下記一般式 〔式中、Ｌは反応性基を含有する置換基であり、Ｂは１
    個または２個の、置換されていてもよい窒素原子により
    中断されているC2-14アルキレン鎖であり;W1およびW
    2は、同一または異なっていてもよく、それぞれ置換さ
    れていてもよい窒素原子であり;pは０または１の整数で
    あり、そしてｑは０または１あるいは２の整数である、
    ただしｐが０である場合には、ｑは１または２の整数で
    ある〕で表される基である、請求項７に記載の抗原結合
    性タンパク質。
  9. 【請求項９】大環状分子が、放射線同位元素をキレート
    化している、請求項７または請求項８に記載の抗原結合
    性タンパク質。
  10. 【請求項１０】放射性同位元素が111In,90Y,または125I
    である、請求項９に記載の抗原結合性タンパク質。
  11. 【請求項１１】連結分子が、下記式CT998: 〔式中、MACは大環状アミン、Malはマレイミド基であ
    る〕で表わされる架橋化合物である、請求項１に記載の
    抗原結合性タンパク質。
  12. 【請求項１２】連結分子が、下記式CT557: 〔式中、Malはマレイミド基、Ｚは反応性官能基であ
    る〕で表わされる架橋化合物である、請求項１に記載の
    抗原結合性タンパク質。
  13. 【請求項１３】腫瘍関連抗原に対して特異的である、請
    求項１から12のいずれかに記載の抗原結合性タンパク
    質。
  14. 【請求項１４】腫瘍関連抗原がCEAである、請求項13に
    記載の抗原結合性タンパク質。
  15. 【請求項１５】TAG72に対して特異的である、請求項14
    に記載の抗原結合性タンパク質。
  16. 【請求項１６】請求項１から15のいずれかに記載の抗原
    結合性タンパク質を含有する、癌診断用組成物。
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