JPH06502657A - ３価および４価の単一特異性抗原結合性タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３価および４価の単一特異性 抗原結合性タンパク質 本発明は３価および４価の単一特異性抗原結合性タンパク質およびこれらのタン パク質の製造方法、およびまたこれらのタンパク質を構築するための３価および ４価のリガンドに関するものである。排他的ではないものとして、本発明は特に 、組換えＤＮＡチクノロシイを使用して、上記３価および４価の単一特異性抗原 結合性タンパク質を生成させることに関するものである。

近年に、抗体およびそれらのフラグメントに多大の興味か示されている。完全抗 体分子がＨｊＪｌとＬ鎖とのへテロダイマーからなることは周知である。たとえ ば、ＩｇＧ分子は、４つのポリペプチド鎖と２つのＨｉｌｌ−ＬＭへテロダイマ ーとからなる。

ＬＭはそれぞれ、２つのドメインからなり、Ｎ−末端ドメインは可変ドメイン、 すなわちＶＬドメインとして知られており、モしてＣ−末端ドメインは定常ドメ イン、すなわちＣＬドメインとして知られている。Ｈ鎖はそれぞれ、抗体の種類 によって、４または５のドメインからなる。Ｎ−末端ドメインは可変ドメイン、 すなわちＶＨドメインとして知られている。このドメインは、そのＣ末端部で、 引き続くドメインのＮ−末端に結合しており、これは第一定常ドメイン、すなわ ちＣＨＩドメインとして知られている。各Ｈ鎖の後続部分はヒンジ部として知ら れ、この部分は次いて、第二、第三、およびまた成る場合には第四の定常ドメイ ン、すなわちＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメインにそれぞれ、連結している 。

組立てられた抗体では、ＶＬドメインとＶＨドメインとか一緒になって、抗原結 合部位を形成している。また、ＣＬドメインとＣＨＩドメインとは一緒になって 、１本のＬＭをともなう１本のＨＭを維持している。２個のＨ鎖−Ｌ鎖へテロダ イマーは、部分的に、２本のＨ鎖のＣＨ２、ＣＨ３および存在する場合に、ＣＨ ４ドメインとの相互反応によって、およびまた部分的に、２本のＨ鎖のヒンジ部 間の相互反応によって、一体に結合されている。

Ｈｊｌヒンジ部はそれぞれ、少なくとも１個の、そして多くの場合に、数個のシ スティン残基を含存する。組立られた抗体では、そのＨ鎖のヒンジ部は、部内ジ スルフィド結合かヒンジ部内のシスティン残基の間で形成されて、２つのＨｌ− Ｌ鎖へテロダイマーが一体に共有結合されうるように、整列されている。したか って、充分に組立られな抗体は少な（とも２個の抗原結合性部位を有するという 点て、少なくとも２価である。

抗体のヒンジ部内のジスルフィド結合が温和な還元によって破壊されると、１つ だけのＨ鎖−り鎖へテロダイマーからなる１価の抗体か生成てきることか、かな り以前から知られている。

抗体を成る種のタンパク質分解酵素により処理すると、種々の抗体フラグメント の生成か生じることも、かなり以前から知られている。たとえば、抗体を各ヒン ジ部の゛Ｎ−末端部位に近い部位で分解させた場合には、２個の抗原結合性フラ グメント（Ｆａｂ）と１個の定常部フラグメント（Ｆｃ）が生じる。Ｐａｂフラ グメントはそれぞれ、ＶＨドメインとＣＨＩドメインとからだけからなる、先端 切断したＨ鎖と組合されたし鎖からなる。Ｆｃ部分はヒンジ部によって１体に保 持されているＨ鎖の中の残りのドメインからなる。

別様に、抗体はそのヒンジ部のＣ末端部位に近い部位で分解することもてきる。

この分解では、　Ｆ（ａｂ’　）！フラグメントとして知られるフラグメントが 生じる。このフラグメントは基本的に、２個のＦａｂフラグメントからなるが、 ヒンジ部に依然として結合したＣＨＩドメインを有する。したがって、Ｆ（ａｂ ’　）ｔフラグメントは、ヒンジ部によって１体に結合した、２つの抗原結合性 部位を有する、２価のフラグメントである。Ｆ（ａｂ’　）！フラグメントは還 元によって分解することができ、１価のＦａｂ’フラグメントを生成させること ができる。これは、そこにヒンジ部を有するＦａｂフラグメントであると見做す ことかできる。

消化条件を注意深く制御することによって、抗体を、そのＶＬドメインとＣＬド メインとの間で、およびまたＶＩｉｌ−メインとＣＨｌドメインとの間で分解さ せることかできることも証明されている。これによって、Ｆｖフラグメントとし て知られる２個のフラグメントか生しる。

Ｆｖフラグメントはそれぞれ、相互に連結しているＶＬドメインとＶＨＩ〜メイ ンとからなる。Ｆｖフラグメントはそれぞれ、抗原結合に関して１価である。

各可変ドメインのアミノ酸配列の研究の結果として、その配列か格別に相違する 各可変ドメイン内に、３つの領域か存在することか証明された。これらの領域は 、超可変部、もしくは相補性決定部（ＣＤＲ）と称されている。これらのＣＤＲ の位置も発表されているＣＫａｂａｔ等、５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔ ｅｉｎｓ　ｏｆ　［ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ。

ＵＳ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｃ ｉｅｎｃｅｓ、Ｎ［Ｈ。

ＵＳＡ、　１９８７およびＷｕ、　Ｔ、Ｔ、およびＫａｂａｔ、　Ｅ、Ａ、、　 Ｊ、　ＥＸｐ。

Ｍｅｄ、、１３２，２１１〜２５０．１９７０）。

結晶形Ｆｖフラグメントに対する構造研究および分子モデリング研究の結果とし て、可変ドメインはそれぞれ、β−プリーツシート構造部に支持されている３つ のループ部からなる。ハプテン抗原結合の場合には、このループ部か抗原受入れ 用のポケットを形成しているものと見做される。

配列分析によって証明されるように、ＣＤＲ間には格別の重複かあり、そしてま た構造分析によって証明されるように、ループ部間にも格別の重複がある。しか しなから、ＣＤＲはループ部内に存在する、いくつかの池の残基と組合されてい る可能性かあるか、ＣＤＲは初期には、抗体の抗原結合特異性の決定に参加する という見解か一般に受入れられている。

さらに最近になって、組換えＤＮＡチクノロシイを使用することによって、抗体 またはそれらのフラグメントを生成することに多大の興味か示されている。特許 刊行物には、この分野の記述か充分になされている。組換えＤＮＡチクノロシイ は、天然抗体の再生成にばかりでなく、また新規抗体の生成にも使用されている 。−例として、今や、キメラ抗体を生成させることもてきる。このキメラ抗体は 、一つの種からのその可変ドメインがもう一つの種からの定常ドメインに結合さ れているものである。

ＣＤＲ内の残基、および必要に応じて、可変ドメイン内の他の残基の数を変えて 、異種の抗原が結合できるようにされた、変性抗体も生成することができる。こ れは、たとえば抗体のヒト性を基本的に変えることなく、ヒト抗体内に、マウス モノクロナル抗体（ＭＡｂ）からの特異性を作り出すことを可能にする有用な方 法である。この方法は、ｉｎ　ｖｉｖｏで抗体を使用することが望まれる場合に 利点を有する。詳細な説明はＷＯ−Ａ−９１１０９９６７に見出される。

ＷＯ−Ａ−９０１０９１９５およびＷＯ−Ａ−９０１０９１９６は架橋結合した 抗体およびそれらの調製方法に関するものである。架橋結合した抗体接合体は、 レポーター分子またはエフェクター分子を含存していてもよい。少なくとも１個 の非ジスルフィド（Ｓ−３）部内架橋を仔するものであると開示されている。こ の架橋部はモホーまたはへテロ−官能性架橋剤の残基であることかでき、そして 抗体の抗原結合ドメインから離れて位置している。この抗体接合体は、増大した 結合能、ｉｎ　ｖｉｖ。

で良好な血液クリアランス、および腫瘍の存在の下では、高比率の腫瘍対血液お よびまた腫瘍対置比率を存する。

この接合体は腫瘍の診断および治療に使用される。

これらの抗体接合体は、架橋剤と抗体またはそのフラグメントとの反応によって 調製することかできる。この架橋剤は抗体分子上のチオール基またはアミノ酸残 基、たとえばグルタミン酸、アスパラギン酸、リジンまたはチロシンの残基の側 鎖のどちらかと反応させることかできる。

しかしながら、我々は、ＷＯ−Ａ−９０１０９１９５およびＷＯ−Ａ−９０１０ ９１９６に記載の架橋した抗体が天然免疫グロブリンに優る改善された性質を有 し、特に腫瘍細胞に対する極めて充分な結合および血液からの良好なりリアラン スを示すけれども、これらの抗体は腎臓により多く吸収され、この組織に滞留す ることを見出した。この現象は、特に抗体か治療および放射性像影に用いる際に 放射性物質でラベルされる場合の毒性の問題を提起する。したがって、架橋した 抗体の優れた結合性およびクリアランス性を保存するか、腎臓組織により取り込 まれず、または保留されず、したかって腎臓毒性の問題か回避される抗体分子か 望まれる。

ＷＯ−Ａ−９１１０３４９３は、２価または３価の多特異性Ｆａｂ接合体に関す るものである。開示されている接合体は、オルトフェニレンジマレイミド架橋構 造体を用いて一体に連結された、３個または４個のＦａｂ’抗体フラグメントか らなる。この開示されたトリマー状接合体は第一特異性の２個のＦａｂ　’フラ グメントと第二特異性の１個のＦａｂ’フラグメントとから、またはそれぞれか 相違する特異性を有する３個の異なるＦａｂ’フラグメントからなる。したがっ て、このトリマー状接合体は２特異性または３特異性である。同様の様相で、開 示されているテトラマー状接合体は少なくとも２特異性であり、３特異性または ４特異性であることもある。

ＷＯ−Ａ−９１１０３９４３には、成る状況の下て、２特異性ダイマ一状接合体 による処置によって、Ｔリンパ細胞集団に、標的細胞、たとえば腫瘍細胞の殺滅 を生じさせうることが報告されており、この場合に、１つの特異性はＴリンパ細 胞集団上の特異抗原構造体を指向し、そしてもう１つの特異性は標的細胞上の抗 原を指向するようにされている。この効果は再指向細胞細胞毒性（ｒｅｄｉｒｅ ｃｔ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）　（ＲＣＣ）と称されて いる。

ＷＯ−Ａ−９１１０３４９４に記載の発明は、トリマー状またはテトラマー状の 多特異性接合体の使用によつて、ＲＣＣを存意に改善できるという予想にもとづ いている。このような接合体の使用はまた、特異性であることかてきるＴリンパ 細胞抗原の範囲を広くすることを可能にする。したかって、ＷＯ−Ａ−９１１０ ３４９３に記載の発明ては、トリマー状またはテトラマー状接合体は少なくとも 、２特異性でなければならないことか必須である。

ＷＯ−Ａ−９１１０３４９３に記載の発明のさらに詳細な説明は、Ｔｕｔｔ、　 Ａ等のＥｕｒ、　Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ、、２１．１３５１−１３５８．１９９ １に見出され、ここでは、ＲＣＣを増強するためには、少なくとも２特異性であ るトリマー状またはテトラマー状接合体の使用か必須であることか確認されてい る。しかしながら、ＷＯ−Ａ−９１１０３４９３にも、またＴｕｔｔ等の上記刊 行物にも、説明されているトリマー状またはテトラマー状Ｆａｂ接合体のクリア ランス性に関しては、とこにも記載がないことに留意されるへきである。

我々の審査中の国際特許明細書Ｎｏ、　ＷＯ９１／　ｌ　９７３９には、多価抗 原結合性Ｆｖフラグメントかｉｎ　ｖｉｖｏ腫瘍像影または処置に使用されるこ とか示唆されている。

上記したものなとのような多価抗原結合性タンパク質に係るもう一つの要件に、 抗体フラグメントを一体に架橋できる架橋分子に係る要件かある。その架橋機能 に加えて、これらの架橋分子は、抗体接合体にエフェクター分子またはリポータ −分子を導入する手段を有利に提供することかできる。

多くの架橋分子か開示されている。たとえは、ヨーロッパ特許明細書Ｎｏ、０４ ４６０７１　（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ（口ｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）には、２特異性 のトリマー状抗体様分子の製造に使用するための３官能性架橋化合物（ｃｒｏｓ ｓｌ　１ｎｋｅｒ）の製造か記載されている。ヨーロッパ特許出願０４５３０８ ２　（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）には、このようなトリ ス−マレイミド化合物を２特異性または３特異性３価抗体様化合物の製造に使用 することか記述されている。開示されている抗体接合体のクリアランス性には触 れられていない。開示された、この架橋化合物の最大の欠点は、放射性同位元素 などの官能性基をそこに結合させることが困難であることにある。特に、大環状 架橋基は、このような架橋化合物中に容易に導入することかできない。

本発明は、３価および４価の単一特異性Ｆａｂ様タンパク質が抗癌治療に特に適 していることを発見したことにもとづいている。これらのタンパク質は、架橋し た抗体の優れた結合性およびクリアランス性を示すとともに、腎臓組織を含む非 腫瘍組織により取り込まれず、そして（または）保留されない。さらにまた、本 発明は、３価または４価のＦａｂ様タンパク質への、リポータ−基またはエフェ クター基の結合を、極めて助長する、新規架橋分子を提供する。

したかって、本発明によって、連結構造基により相互に結合した３個または４個 のＦａｂフラグメントからなり、天然の免疫グロブリンではない、３ｆｉｌｌｉ または４価の単一特異性抗原結合性タンパク質か提供される。

本明細書において、本発明の多価抗原結合性タンパク質を、Ｔ　Ｆ　Ｍ　（ｔｒ ｉ−Ｆａｂ）およびＱ　Ｆ　Ｍ　（ｔｅｔｒａ−Ｆａｂ）と記する。本明細書に おいて使用されているｒ　ＦａｂＪの用語は、天然抗体または化学的に、あるい は組換えＤＮＡテクノロノイのとちらかにより、合成された抗体に由来する、変 性されていてもよい、ＦａｂおよびＦａｂ　’抗体フラグメントを包含するもの と理解する。「変性されていてもよい」の用語は、そのフラグメントの結合能か 有害な作用を受けないかぎりにおいて、当該ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメント か、そのアミノ酸配列中に、多くの挿入、欠落または変更を含みうろことを意味 する。

好ましくは、本発明に係る化合物において、Ｆａｂフラグメントは単一の架橋分 子の使用により１体に共有結合されている。

驚くへきことに、Ｔ　Ｆ　ＭおよびＱＦＭは、完全抗体、Ｆａｂ、　Ｆ（ａｂ” ｒおよびこれらのフラグメントの単一特異性架橋誘導体に比較して、格別に優れ た特性を有することか見出された。

Ｆａｂ、　Ｆ（ａｂ’　）２およびそれらの架橋した片方か、１ｎｖｉｖｏ使用 の場合に、腫瘍細胞に対して比較的特異性であるのに対してＴ　Ｆ　Ｎ、１およ びＱＦＭは、これらに比較して格別に増大した結合活性を示す。同時に、これら は完全抗体よりもさらに効果的に血液から排除される。さらにまた、従来技術で 開示された単一特異性架橋ＦａｂおよびＦ（ａｂ’　）２フラグメントに反して 、ＴＦＭおよびＱＦＭは腎臓に蓄積しない。これによって、特に抗体分子か抗癌 治療用の放射性同位元素または毒素に結合される場合に、望ましくない副作用か 減少される。

好ましくは、本発明の多価Ｆａｂ様タンパク質は腫瘍付随抗原に対して特異性で ある。したかって、有利には、Ｆａｂフラグメントのうちの少なくともＣＤＲは 腫瘍特異性モノクロナル抗体（Ｍ　Ａ　ｂ　）から誘導する。別様に、ＣＤＲは 合成されたものであることもてきる。腫瘍特異性抗原のいずれもか、本発明のＦ ａｂ様タンパク質の標的になりうることは明白である。

本発明のＴ　Ｆ　Ｍ化合物またはＱＦＭ化合物は、たとえば下達のタイプのリポ ータ−基またはエフェクター基の一つまたは二つ以上によって、ラベルすること かできる。

ラベルはＴＦＭ分子またはＱＦＭ分子のＦａｂ部分に、および（あるいは）　Ｆ ａｂ部分を相互に結合している連続構造基に付加することかできる。Ｆａｂ部分 それ自体にラベルする場合には、このラベルは一般に、このフラグメントの結合 部位に干渉しないような位置に存在すべきである。抗体をリポータ−基またはエ フェクター基によりラベルする方法は公知であり、我々の公開特許明細書ＥＰ２ ３８１９６、ＥＰ３８４６２４、ＥＰ３８５６０１、ＷＯ３８１０５４３３、Ｗ Ｏ３９１０１４７５、ＷＯ８９１０１４７６およびＷＯ９０１０１４７５に記載 されている。連結構造基にリポータ−基またはエフェクター基を導入することか 望まれる場合には、これはリポータ−基またはエフェクター基を、連結構造基中 に存在する反応官能性基と、たとえばＦａｂフラグメントのラベル付けに使用さ れる方法と同様の方法で反応させることによって達成することかでき、あるいは たとえば以下に記述するように、連結構造基に宥和に組入れることもてきる。

好ましくは、本発明のＴ　Ｆ　Ｍ化合物およびＱＦＭ化合物において、Ｆａｂモ ノマーは、架橋化合物によって一体に架橋させる。架橋化合物はＦａｂフラグメ ントを一体に結合させることかてきる、いずれの化学物質であることもてきる。

しかしなから、好ましくは、架橋化合物はＥＰ−Ａ−０４４６０７１およびＥＰ −Ａ−０４５３０８２に記載のマレイミド化合物のような特別にデザインされた 化学化合物である。しかしながら、抗体鎖に見出される、いずれの反応性アミノ 酸とも反応性である、３個または４個の官能性基を有する構造基をいずれも、使 用できるものと理解されるへきである。

好適態様の一つにおいて、本発明の化合物中の連結構造基はポリリジン架橋化合 物である。

したがって、本発明の第二の態様において、我々は下記式（１）で表される架橋 化合物を提供する。

Ｒ’Ｃ）（（Ｒ２）Ｎｌ（ＣＯＲ’　（＋）式中、Ｒ１はカルボキシル（−ＣＯ ，Ｈ）またはエステル化カルボキシル（−〇Ｏ□Ｒ）基、あるいは基−ＣＯＡで あり、ここでＡは直接に、またはスペーサー基を介して、−ＣＯ基に結合して、 炭素−炭素結合または炭素−へテロ原子結合を形成するエフェクター分子または リポータ−分子てあり：Ｒ２およびＲ′ｌは、同一または異なっていてもよく、 それぞれ置換されていてもよい、直鎖状または分枝鎖状アルキレン、アルケニレ ンまたはアルキニレン鎖であり〔これらの鎖は１個または２個以上の一〇−また は−Ｓ−原子、あるいは−Ｎ（Ｒ’）　（Ｒ’は水素原子またはＣ１−６アルキ ル基である）　、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−１Ｃ６−８シクロア ルキレン、Ｃ＠−□２アリーレンまたはＣｓ−＋ｏヘテロアリーレン基により中 断されていてもよい〕、そしてまたＲ２およびＲ３は、Ｒ２およびＲ３中の反応 官能性基の総数が３個または４個以上であるような数で、１個または２個以上の 反応官能性基を含有する。

式（１）で表される化合物において、「エフェクター基」の用語は、生物学的系 において変化を誘引できるか、もしくは生物学的系からの応答を誘引でき、また この性質を式（１）の化合物に付与できる、基のいずれをも意味するものと理解 されるべきである。「リポータ−基」の用語は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏおよび（また は）　ｉｎ　ｖｉｖｏ分析手段によって検出てき、かつまた式（１）の化合物に この性質を付与できる基のいずれもを意味するものと理解されるべきである。

エフェクター基の例には、生理学的活性物質、抗炎症化合物、抗ウィルス化合物 または抗菌化合物のいずれもか包含される。特定の生理学的活性物質には、抗新 生物質剤、毒素（たとえば、細菌または植物に由来する酵素的に活性な毒素およ びその断片、たとえばリジンおよびその断片）、酵素、抗炎症化合物および心臓 血管系活性物質、たとえばフィブリン分解活性物質および中枢神経系に対する活 性物質が含まれる。

特定の抗新生物質薬には、細胞毒注薬および細胞増殖抑制薬、たとえばナイトク ジエンマスタード類なとのアルキル化剤（たとえばクロラムバシル（ｃｈｌｏｒ ａｍｂｕｃｉｌ）、メルフアランＣｍｅｌｐｈａｌａ口〕、メクロレタミン（ｍ ｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ　）　、シクロホスファミド、あるいはウラシル マスタード）およびその誘導体、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチ オホスホルアミド、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｐｈａｎ）あるいはシスプラチン （ｃｉｓｐｌａｔｉ口）：抗代謝薬、たとえばメトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔ ｒｅｘａｔｅ）　、フルオロウラシ／Ｌ、、フロキシウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉ ｄｉｎｅ）、サイタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）　、メルカプトプリン、チ オグアニン、フッ化酢酸またはフッ化クエン酸；抗生物質、たとえばプレオマイ シン類（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｓ）　（たとえば、ブレオマイシン硫酸塩）、ドキ ソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉ ｃｉｎ）　、ミドマイシン類（たとえばミトマインンＣ）、アクナノマイシン類 （たとえば、ダクチノマインン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎｅ　）　）　、ブレ オマイシン（ｐｌｉｃａｍｙｃｉｎ）　、カリカニミシン（ｃａｌｉｃｈａｅｍ ｉｃｉｎ）およびその誘導体、あるいはニスベラミシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉ ｎ）およびその誘導体；分裂抑制薬、たとえばエトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）またはビンブラスチン（ｖｉｎ ｂｌａｓｔｉｎｅ）およびその誘導体：アルカロイト類、たとえばエリブチシン （ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）　：ポリオール類、たとえばタキシシンーＩ　（ｔ ａｘｉｃｉｎ　−１）またはタキシシン−ＩＩ：ホルモン類、たとえばアンドロ ゲン類（たとえばトロモスタラロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅｌまたはテ ストラクトン）、プロゲスチン類（たとえば、メゲステロール（ｍｅｇｅｓｔｅ ｒｏｌ）アセテートまたはメトロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇ ｅｓ　ｔｅｒｏｎｅ）アセテート）、エストロゲン類（たとえばジメチルスチル ベステロールジホスフエート、ポリエストラジオールホスフェートまたはエスド ラムスチンホスフエート）あるいは抗エストロゲン類（たとえばタモキシフェン （ｔａｍｏｘｉｆｅｎ　）　）　：アントラキノン類、たとえばミドキサントロ ン；尿素類、たとえばヒドロキシ尿素：ヒドラジン類、たとえばプロカルバジン ：あるいはイミダゾール類、たとえばダカルバジン：か包含される。

特に有用なエフェクター基はカリカニミシン（ｃａｌｉｃｈａｅｍｉｃｉｎ）お よびその誘導体である（たとえば、南アフリカ国特許明細書Ｎｏ、８５／８７９ ４、Ｎｏ、８８／８１２７およびＮｏ、９０／２８３９参照）。

適当なリポータ−基はキレート化金属、蛍光化合物またはＮ　Ｍ　ＲあるいはＥ ＳＲスベクトロスコーピイによって検出することかできる化合物を包含する。

キレ−１・化金属は、２〜８の配位数を有する正２価または正３　ｆｉの金属の キレート化物を包含する。このような金属の特定の例には、テクネチウム（ＴＣ ）、レニウム（Ｒｅ’）　、コバルト（Ｃｏ）　、銅（Ｃｕ）　、金（Ａｕ’） 、銀（Ａｇ）、鉛（Ｐｂ）　、ビスマス（Ｂｉ）　、インジウム（Ｉｎ）、ガリ ウム（Ｇａ）　、イツトリウム（Ｙ）、タルヒウム（Ｔｂ）、ガドリニウム（Ｇ ｄ）およびスカンジウム（Ｓｃ）か含まれる。一般に、これらの金属は好ましく は、放射性核種である。特定の放射性核種には、９９′″Ｔ、ｉ＠Ｒｅ、１″８ １１７．６１ＣＯ２・ＯＣｏ、　＠７Ｃｕ、”ＳＡｕ、目ＩＡｕ、ＩＩＡ、　１ ０３ｐ１．２０Ｊｉ。

！６７３ｉ、　ｌ１１［口、　６７Ｇ、６１に、８１Ｙ、＠ＯＹ、１＠６７１． 　１５２にｄおよび４７　Ｓｃ　か含まれる。

キレート化金属は、たとえば適当な多歯形キレート剤、たとえば環状ポリアミン 類、ポリエーテル類（たとえばクラウンエーテル類およびその誘導体）；ポリア ミド類：ボルフィリン類；および炭素環状誘導体のいずれかによって、キレート 化した上記種類の金属の１種であることかできる。

一般に、キレート剤の種類は、使用する金属に依存する。しかしながら、本発明 に係る接合体における特に有用なキレート剤の群の一つは、非環状および環状の ポリアミン類、特にポリアミノカルボン酸、たとえばジエチレントリアミンペン タ酢酸およびその誘導体、およびまた大環状アミン類、たとえば環状トリーアサ −およびテトラ−アザ−誘導体、およびまたポリアミド類、特にデスフェリオキ サミン（ｄｅｓｆｆｅｒｉｏｘａｍｉｎｅ）およびその誘導体である。

特定の大環状アミン化合物の例には、下記式（２）で表わされる化合物か含まれ る （ＣＨ２）。□Ｗ１ Ｌ　−ＣＨＢ　（２） （ＣＨ２）、−Ｗ２ （式中、Ｌは反応性基を含有する置換基であり、Ｂは置換されていてもよい１個 または２個の窒素原子により中断されているＣ　２−１４アルキレン鎖てあり、 Ｗ＋およびＷ２は同一または異なっていてもよ（、それぞれ置換されていてもよ い窒素原子であり；ｐは０またはｌの整数であり、そしてｑは０または１あるい は２の整数である、ただしｐがＯである場合には、ｑは１または２の整数である ）。

基しか、式（１）の化合物の残りの部分に大環状基を結合させる結合部位を提供 することは明白である。代表的基の例には、アミン（−ＮＨり含有基が含まれる 。

式（２）の好適アミンには下記式（３）で表されるトリーアザ誘導体・ ＣＨ２−Ｗ　’ Ｌ　−ＣＨＢ　（３’） （ＣＨ２’）　、−Ｗ２ （式中、Ｗ！およびＷ２は同一または異なっていてもよく、それぞれ基−Ｎ［（ ＣＨ２）、　Ｒ’］　−（式中、ｒは０または１−６の整数であり、そしてＲ’ はアルキル、アルコキシアルキル、−ＣＯ□Ｈ１−３Ｏ３Ｈ１ＰＯ３Ｈ２または アリール基である）であり、そしてＢは基 −ＣＨ２（ＣＨ２）、　Ｎ（Ｒ）　（ＣＨ２）、　ＣＨ２−（式中、Ｓおよびｔ は同一または異なっていてもよく、それぞれ０または１１２あるいは３の整数て あり：そしてＲは−（ＣＨ２）、Ｒ’を表わし、ここてｒおよびＲ１は直前に記 載されているとおりである） および下記式（４）で表わされるテトラ−アサ誘導体：（式中、Ｗ＋およびＷ２ は同一または異なっていてもよく、それぞれ基−Ｎ［（ＣＨ，）、　Ｒ’］　− （上記のとおり）であり、そしてＢは基 −ＣＨ２（ＣＨ２）、　Ｎ（Ｒ）ＣＨ，（ＣＨ２）、　Ｎ（Ｒ）（ＣＨ２）　、 　ＣＨ２−（式中、ｄは０またはｌ、２あるいは３の整数であり、そしてＲは上 記定義のとおりである）である〕 か包含される。

式（３）の特に有用なアミンは下記式（５）で表わされる化合物である・ 式（４）の特に有用なアミンは下記式（６）で表される化合物である 本発明による接合体に好適なキレート化金属には、式（３）で表される化合物、 特に式（５）で表される化合物によって、キレート形成したインジウム；あるい は式（４）で表される化合物、特に式（６）で表わされる化合物によって、キレ ート形成したイツトリウムか包含される。

１１１ｎおよびｓｏｙは特に好ましい。

エフェクター基またはリポータ−基は一般に、この基中に存在する、いずれか適 当な炭素原子あるいはへテロ原子、たとえば窒素原子、酸素原子、イ才つ原子ま たはリン原子を経て、式（１）で表される化合物の残りの部分に結合して、直接 に化合物Ａ−ＣＯＣＨ（Ｒ２）ＮＨＣＯＲ’を形成するか、あるいは間接的に、 化合物Ａ−３ｐ−ＣＯＣＨ（Ｒ２）ＮＨＣＯＲ３を形成することかできる。この 化合物において、ｓｐは上記のとおりの炭素−炭素結合または炭素−へテロ原子 結合を経てＡおよび−Ｃ〇−基に独立して結合しているスペーサー基である。適 当なスペーサー基は非環状または環状の脂肪族または芳香族残基、特にアルキレ ン〔たとえば、エチレン、プロピレン、ブチレン〕、アルコキシアルキレン〔た とえばメトキシメチレン、エトキシメチレン、エトキシエチレン〕、アリーレン 〔たとえばフェニレン〕、アラルキレン〔たとえばフェネチレンなとのフェンア ルキレンあるいはシクロアルキルアルキレン〔たとえばシクロへキシルメチレン 〕基を包含する。

Ａと基−ＣＯ−との間の、あるいはＡとスペーサー基との間の結合は所望により 、たとえばヨーロッパ特許明細書Ｎｏ、１７５６１７に記載されているような、 タンパク質分解酵素によるなどによって、分解されるように選択することができ る。

式（１）で表される化合物中のＲ１によって示されるエステル化カルボキシル（ −ＣＯ，Ｒ）基は、Ｒか有機基、たとえば脂肪族−芳香族基、あるいは芳香族基 またはへテロ芳香族基である基を包含する。

したかって、Ｒは置換されていてもよ（，１個または２＠以上の一〇−または− Ｓ−原子により中断されていてもよい、直鎖状または分枝鎖状のＣｌ−２０アル キル（たとえば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、Ｓ−プロピル 、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、Ｓ−ブチル、ｔ−ブチル）　、Ｃ２−２０アルケニ ルまたはＣ２−２０アルキニル基；あるいはＣ５−、シクロアルキル（たとえば 、シクロペンチルまたはシクロヘキシル）、Ｃ，、シクロアルキルＣ０−６アル キル（たとえば、シクロペンチルメチル、シクロヘキシルメチル）　、Ｃ＝−１ ２アリール（たとえば、置換されていてもよいフェニルまたはナフチル）Ｃ，、 。

またはＣ３−８アルキル（たとえば、置換されていてもよい、ベンジル、フェネ チルまたはナフチルメチル）、Ｃ６−１゜ヘテロアリール（たとえば、フラニル 、ピリジル、チェニル）、あるいはＣ６−１゜ヘテロアリールＣ０４アルキル（ たとえば、フラニルメチル、ピリジルメチルまたはチェニルメチル）基であるこ とができる。

式（１）で表される化合物中の反応官能性基は一般に、チオール、アミノ、カル ボキシル、ヒドロキシル、アルデヒド、芳香族またはへテロ芳香族基と反応する ことができる基のいずれでもあることかできる。芳香族基の例にはフェノール系 基か含まれる。ヘテロ芳香族基の例にはイミダゾリル基か含まれる。

したかって、反応官能性基は、たとえばハロゲン原子、たとえば塩素、臭素また はヨウ素原子、あるいは−ＳＨ。

−５−Ｓ−Ｈｅｔ　（ここて）ｌｅｔは置換されていてもよいヘテロ環状基、た とえば置換されていてもよいピリジル基である）、Ｎｌ２、ヒドラジン（ＮＨＮ Ｈ２）またはその誘導体〔たとえは、−Ｎ（ＣＨ，）Ｎｌ２、−Ｎｌ（ＣＯＮＨ ＮＨ２、−ＮＨＣ３ＮＨＮＨ２またはフエニノしヒドラジン〕、ハロアセトアミ ド（たとえば、ヨウトアセトアミトまたはブロモアセトアミド）、−ＮＣＯ、− ＮＣ３、−ＣＯＲ”　（ここてＲＩＧは塩素または臭素原子なとのハロケン原子 、あるいはＮ３、Ｃ，−、アルコキノ、たとえはメトキン、Ｃ＠−１２アリール オキシ（たとえばニトロフェニルオキシまたはジニトロフェニルオキソ）、イミ ジルオキシ（たとえは、スクシニルイミジルオキシ）またはイミダゾリルオキシ 基〕、イミド、たとえばマレイミド、式−Ｈｅｔ’　Ｃ（Ｈｅｔ２）　＝ＣＨ２ （ここてＨｅｔ’およびＨｅｔ２は同一または異なっていてもよく、それぞれ窒 素含有へテロ環状基、たとえばピリジル基であるか、あるいはＨｅｔ’は窒素含 有へテロ環状基であり、そしてＨｅｔ２は水素原子である）、たとえば下記式で 示されるビニルピリジル基− 特に、 あるいは下記式で示されるジオン基 （式中、Ｒ１１はＣ１−４アルキル、たとえばメチル基である）であることかで きる。

一般に、式（１）において、反応官能性基か同一である化合物か好ましいか、成 る場合には、１種より多い種類の反応官能性基を有するほうか好ましいこともあ る。特に好適な官能性基は千オール基と反応できる基である。

この種の基はイミド基（特にマレイミド）、ハロアセトアミド基（特にヨウドア セトアミド）、−３ｔ（基、Ｈｅｔ−３−３−基、−Ｈｅｔ’（Ｈｅｔ”）＝Ｃ Ｈｚ基　またはマレイミド基は特に有用である。

式（１）で表される化合物は、それらの意図する用途に応じて、３個または４個 以上の反応官能性基を含有することかできる。有用な化合物には、３個または４ 個の反応官能性基、特に３個または４個のチオール反応性基、たとえば３個また は４個のマレイミド基を含有する化合物が包含される。しかしながら、所望によ り、このような基を５個、６個、７個または８個も存在させることもできる。

反応官能性基はいずれか望ましい様相て、基Ｒ２および基Ｒ３中に分布させるこ とかできる。したかつて、たとえばＲ２およびＲ３かそれぞれ、１個、２個、３ 個または４個以上の反応官能性基を含有することかできる（たたし、両基中の総 数は３個または４個以上とする）。別様には、この反応官能性基はＲ２またはＲ ３のうちの一方のみに存在させることもてきる。

式（１）で表わされる化合物中の基Ｒ２および基Ｒ３は、その反応官能性基か結 合して、いずれか所望のサイズおよび組成内で変化しうる、鋳型（テンプレート ）を形成している。すなわち、これに制限されないか、特に好ましい例の一つと して、本発明の化合物の一群は、式（１）において、Ｒ１か前記定義のとおりで あり、モしてＲ２が、同一または異なっていてもよく、それぞれ、Ｒ２およびＲ ３中の反応官能性基の総数か３個または４個以上であるような数て、１個または ２個以上の反応官能性基を含有しており、そして置換されていてもよい直鎖状ま たは分枝鎖状Ｃ１−２５アルキレン（たとえば、メチレン、エチレン、プロピレ ン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレンまたはヘブチレンなとのＣｌ−１６アル キレン＞　、Ｃ，−、、アルケニレンまたはＣ２−２゜アルキニレン鎖（これら の鎖は１個または２個以上の一〇−または−Ｓ−原子、−Ｎ（Ｒ’）　−（ここ てＲ４は水素原子またはＣ＋−ｓアルキル基、たとえばメチルまたはエチル基で ある）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃｏ　−１−ＣＯＮ（Ｒ’）−１Ｃ３−８ンクロアルキレ ン（たとえは、シクロペンチレンまたはシクロヘキンレン）、Ｃ６−＋２アリー レン（たとえは、フェニレンまたは置換フェニレン）、アルイハＣｓ−＋。ヘテ ロアリーレン（たとえば、フラニル、チェニルまたはピリジニル基）により中断 されていてもよい〕である。

基Ｒ２および基Ｒ３中に存在する任意の置換基は、カルボキシル（−Ｃ０２Ｈ） およびエステル化カルボキシル（−ＣＯ□Ｒ）　［ここて、Ｒは前記定義のとお りである〕、およびまたアミノ（−ＮＲ２）または置換アミノ（ＮＲ”Ｒ７）（ ここて、Ｒ６およびＲ７は同一または異なっていてもよく、それぞれ水素原子ま たはＣ１−６アルキル基、あるいは基−ＣＯＲ＠（ここでＲ１はＲ２に係り定義 されているとおりである）であることができ、ただしＲ６およびＲ’＋の一つが 水素原子である場合には、他の一つは水素原子ではなく、またＲ６およびＲ７の 一つが基−ＣＯＲ”である場合には、他の一つは水素原子である〕を包含する。

Ｒ２およびＲ３の一方または両方か置換基−ＮＨＣＯＲ’を含有する場合には、 この基が式（１）の化合物中に追加の反応官能性基を持ち込むことを可能にする ことか認識される。

特に有用な基Ｒ２または基Ｒ３は、構造式％式％） （式中、ｍ、ｎおよびｐは同一または異なっていてもよく、それぞれｌ、２．３ または４の整数てあり、そしてＺは前記定義の反応官能性基である）を有すを有 することかできる。

本発明に係る化合物の特に有用な群は下記式（６）または式（７）、特に下記式 （８）または式（９）を存する：もう一種の好ましい架橋剤は下記式（１０）を 有する：Ｒ”ＣＨ（Ｒ”）、Ｃ０ＮＨＣＨ（Ｒ２）ＣＯＮＨＣＨ（Ｒ２）ＣＯＮ Ｈ２（１０）式中、Ｒ９は−ＮＨ，または置換アミノ基、たとえば基−ＮＨＣＯ Ａであり、そしてＡおよびＲ２は式（１）の化合物に関して定義されているとお りである。

この種の化合物中において、Ｒ２はそれぞれ同一であることができ、あるいは所 望により、その隣りのものと相違していてもよい。

式（１）および式（１０）で表される化合物は、生物学的材料、特にタンパク質 、特に抗体か、これらの式（１）または式（ｌＯ）の化合物と反応できる１個ま たは２個以上の官能性基を有するかぎり、これらの生物学的材料の架橋に使用さ れる。これらの化合物は本発明によるＴＦＭおよびＱＦＭ化合物の製造に特に有 用である。

架橋反応は慣用の方法を使用して、たとえばＦａｂフラグメントおよび必要な架 橋化合物なとの出発物質を水性溶媒中で、たとえは周辺温度において、混合する ことによって達成することかできる。使用する出発物質の相対濃度はほとんと、 式（１）または式（１０）て表される化合物に、およびまたそこに含まれる反応 官能性基の数および所望の生成物の種類に応して変わるか、一般的に、生物学的 材料（１種または２種以上）、たとえば抗体、たとえばＦａｂフラグメントなと のタンパク質を過剰濃度て存在させる。

式（１）および式（１０）で表わされる化合物は多くの方法によって、たとえば 後記する例に記載の方法によって、製造することかできる。これらの方法におい て、反応性基か特定の反応に関与しないことか望まれる場合には、これらの基を 保護する必要があることかある。慣用のカルホン酸はエステル化することができ （たとえば、ベンジルエステルを生成させる）、そしてまたアミノ基はアシル化 することかできる（たとえば、ベンジルオキシカルボニルアミノ基を生成させる ）。これらの保護基は慣用の方法を使用して、たとえばヘンシルエステルの場合 には、ギ酸なとの酸により処理することによって、そしてまたベンジルオキシカ ルボニルアミノ基の場合には、トリメチルシリルヨウダイトなとの化合物により 処理することによって、分離することかできる。

したかって、−例として、式（１）において、Ｒ１か基−ＣＯＡまたは−ＣＯ− ３Ｐ−Ａである化合物は、Ｒ１が基−ＣＯ，）（またはその活性化誘導体（たと えば、この酸とＮ−ヒドロキソスクシンイミドとをジシクロへキシルカルホシイ ミ１−の存在の下に反応させることによって得られるスクノンイミト）である相 当する化合物を、場合により塩基の存在の下に、溶媒、たとえばテトラヒドロフ ランのような環状エーテルなとのエーテル中で、基Ａまたは５Ｐ−Ａと反応させ ることによって、製造することができる。この反応において、出発物質のＡまた は５Ｐ−Ａは、上記酸−その活性化誘導体と反応できる基を必要とする。

式（１）において、Ｒ’か−ＣＯ２Ｈである化合物は、慣用の方法、たとえば不 活性溶媒、たとえばハロゲン化炭化水素中で、三フッ化酢酸のような酸を使用す る加水分解によって、相当するエステル（−ＣＯ，Ｒ）を加水分解することによ って、製造することができる。

式（１）において、Ｒ’か−ＣＯ□Ｒ基である化合物は一般に、下記式（１１） て表わされるエステル化アミノ−酸出発物質から、慣用の方法を使用する、相当 する反応性基を有する他の中間体を含む一連の置換または縮合反応を用いて、段 階的方法で製造することができる。一般的合成原則は、本明細書に記載の中間体 および例を引用して説明することかでき、例では、公知出発物質を用いて、本発 明に係る成る種の化合物の製造を説明する。本発明に係るその他の化合物は同一 の手段を使用するが、異なる反応官能性基を含存する別の種類の基Ｒ２および基 Ｒ３を導入するために、異なる出発物質および中間体を用いて、製造することか できる。

式（１０）で表わされる化合物は、本明細書に記載の中間体および例に説明され ているような置換および縮合反応を用いて、同様の方法で製造することかできる 。

適当な反応官能性基の挙動はいずれも、架橋分子それ自体により、この基に対し て加えられる構造上の制約を常に受ける。架橋分子の線状度合か増大するほど、 大環状基の付加およびエフェクター基のキレート化は推進されることか見い出さ れた。

したかって、本発明は、実質的に線状の骨格構造を存し、大環状基を組合せて有 することかできる、新規な架橋化合物を包含する。

特に好適な架橋化合物は下記の式で表される化合物である 式中、Ｒ１は前記定義のとおりてあり、そしてＭａｌはマレイミド基である。

好ましくは、本発明のＴＦＭまたはＱＦＭは、大環状基をそこに結合して有する 架橋分子によって、相互に結合している３個または４個のＦａｂフラグメントか らなる、３価または４価の単一特異性抗原結合性タンパク質である。

本発明の係る架橋分子への大環状基の結合は好ましいものであるか、本発明の多 価タンパク質中に配合されているＦａｂフラグメントの１個または２個以上に、 大環状基を結合させることもてきるものと理解すべきである。−この手段は、使 用架橋化合物か大環状基の結合を助長しないものである場合に、特に好適である 。

したかって、好ましくは、本発明のＴＦＭまたはＱＦＭは放射性ラベルを有する 。この放射性ラベルは大環状基によりキレート形成させる。

もう一つの好適態様として、本発明に係るＴＦＭまたはＱ　Ｆ　Ｍはそれぞれ、 各Ｆａｂフラグメント上のチオール基に結合した連結構造分子によって、相互に 結合されている。

本発明の特に好ましい、３価または４価のタンパク質構築生成物はその連結構造 分子が下記の架橋化合物の−っであるタンパク質である： （ＣＴ９９８） または。

ＮＨへ１ａ１ 天然産生Ｆａｂ　’フラグメントはヒンジ部に、多くの千オール基、代表的には ２個、４個または１１個にものぼる、チオール基を有する。

しかしなから、本発明の有利な態様においては、そのヒンジ部に一つのみの遊離 のチオール基を有する、遺伝子的に変性されたＦａｂ　’　フラグメントが使用 される。δｃｙｃ　Ｆａｂ　’　フラグメントと称される、このようなＦａｂ　 ’フラグメントの組換えＤＮＡチクノロシイによる構築は、我々の審査中のヨー ロッパ特許出願Ｎｏ、０３４７４３３に記載されている。

Ｆａｂ　’のようなＦａｂ様フラグメントのヒンジ部中のシスティン残基の数を 減少させると、Ｆａｂ様分子分子橋分子との間の間違った相互反応の可能性が、 有利に減少される。

正常では、組換えＤＮＡチクノロシイによって生成された、精製Ｆａｂ　’　フ ラグメントは、ブロックされたヒンジチオール基を存するものとして採取される 。この場合に、Ｆａｂ　’　フラグメントは好ましくは、本発明のＴＦＭまたは Ｑ　Ｆ　Ｍ化合物に組み立てる前に、部分的に還元する。

好ましくは、Ｆａｂ　’フラグメントを式（１）または式（１０）で示される架 橋化合物を使用して架橋させる。最も好ましくは、この架橋化合物は、本明細書 に記載の例に示されている構造の一つを有する。最も好ましい架橋化合物＋ＩＣ Ｔ９９８．Ｃｒ２５７また１ｔＣＴ５５８てｔ６゜本発明の３価または４価の単 一特異性抗原結合性タンパク質は、ｉｎ　ｖｉｖｏ診断または治療に使用するこ とかできる。

したがって、本発明はまた、診断的に、または治療的に、機能するエフェクター 分子、原子またはその他を存する、本発明に係わる３価または４価の単一特異性 抗原結合性タンパク質を包含する。前記のエフェクターまたはリポータ−基がい ずれも包含される。

本発明のタンパク質は、ｉｎ　ｖｉｖｏ診断または治療の目的に使用されるもの である。したがって、本発明はまた、本発明にｔＳわるタンパク質の存効量を、 医薬的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体と組み合わせて含有する、ｉｎ 　ｖｉｖｏ使用のための診断組成物または治療組成物を包含する。

これらの組成物は、その他の活性成分を含有することかできる。

これらの組成物は、投与に適するいずれの形態もとることかでき、特に、非経口 投与、たとえば注射または潅注による、たとえは大量注射または連続潅注による 投与に適する形態であることかてきる。組成物か注射用または潅注用である場合 には、本発明のタンパク質の油性または水性の媒質中の、懸濁液、溶液またはエ マルジョンの形態であることかてき、助剤、たとえば懸濁安定剤および（または ）分散剤を含有することかできる。別様には、この組成物は、使用前に適当な無 菌液体により再構成するための乾燥形態であることもできる。

本発明に係わるタンパク質を投与できる投与量は、このタンパク質か診断に使用 されるか、または治療に使用されるかによって、診断または処置される状態の種 類によって、このタンパク質が予防に使用されるか、または存在する症状の処置 に使用されるかによって、およびまた選択された特定のＦａｂフラグメントおよ びエフェクターまたはリポータ基によって変わる。投与量はまた、患者の年齢お よび症状にしたかって選択される。したがって、たとえは０．０１−１０　ｍｇ ／ｋｇ／日のｉｆ！［ｌＵの用量を使用することかできる。有利には、本発明に 係わる化合物は血液から迅速に排除されるので、多回の投与計画を使用すること かできる。

さらにまた、本発明は、存効量の本発明のタンパク質をヒトまたは動物対象に投 与することからなる、診断方法または治療方法を包含する。

最も好ましくは、本発明の方法は癌の処置または診断に向けられる。

本発明はさらにまた、本発明の前記態様に記載の３価または４価のタンパク質を 、病気、好ましくは癌、の処置に使用することを包含する。さらにまた、本発明 は、本発明に係わる３価または４価のタンパク質を病気の処置用の組成物の製造 に使用することを包含し、この病気は、好ましくは癌である。

本発明をここで、添付図面を引用して、例によって説明する。この図面において 、 Ｆｉｇ　１は、下記の例で行われた架橋反応のＨＰＬＣ分析を示すグラフである ； Ｆｉｇ　２は、モノマー状、ダイマー状、トリマー状およびテトラマー状のＦａ ｂ　’タンパク質を比較する、抗原−結合性ＥＬ［ＳＡの結果を示している：Ｆ ｉｇ　３は、本発明のトリマー状Ｆａｂ　’タンパク質（ＴＦ〜１）の改善され たオフ−レート（０ｆｆ−ｒａｔｅ）を示すグラフである： Ｆｉｇ　４は、完全ｆｇＧと比較した、Ｔ　Ｆ　Ｍの血液クリアランスを示すグ ラフである： Ｆｉｇ５は、腫瘍を有するマウスに投与されたＴＦＭおよびＩｇＧの組織分布を 比較するものである。

Ｆｉｇ　６は、腫瘍を有するマウスに投与されたＴＦＭおよび［ｇＧの腫瘍：血 液比率を示している；Ｆｉｇ　７は、Ｆｉｇ　５に示されているデータと同様の 生体分布データを示すものであって、本発明の抗体構築物を投与した後の、種々 の経過時間の時点て採取したデータを示している： Ｆｉｇ　８は、Ｑ　Ｆ　Ｍ　（ｔｅｔｒａ−ＦａＢ　）を生成するための架橋反 応のＨＰＬＣ分析を示すグラフである；Ｆｉｇ　９は、ＱＦＭ構築物に係わる生 体分布データを示している： Ｆｉｇ　］　Ｏは、ＣＴ９９８架橋化合物を使用する、部位−特異性および無作 為のＴＦＭ構築物の生体分布を比較するものである： Ｆｉｇ　１１は、［ｇＧに優るＴＦＭの抗原に対する増大した結合活性をしめし ている： Ｆｉｇ１２およびＦｉｇ１３は、Ａ３Ｂ７−特異性ＴＦＭの生体分布挙動を示し ている。

例 Ａ　架橋化合物の合成 下記の例は本発明に係る架橋化合物の合成を説明するものである。この架橋化合 物の合成において、多くの中間体化合物か使用される。本例において、下記の略 語を使用する ＢＯＣｔ−ブトキシカルボニル Ｚ　ヘンジルオキシカルボニル ＴＨＦ　テトラヒドロフラン ＴＦＡ　三フッ化酢酸 ＤＭＦ　ジメチルホルムアミド ＢＯＣ−Ｌｙｓ　（Ｅ　−Ｚ　）酸（８，０２ｇ）を、Ｎ２の下に、乾燥Ｔ、Ｈ Ｆ　（８０ｍ１）中に溶解した。この反応混合物の温度を、−２０°Ｃに下げ、 次いて温度を一２０°Ｃに維持しながら、エチルクロロホーメート（２，２９ｇ 、　２．０２ｍ１）およびＮ−メチルモルホリン（２，１３ｇ、２．３１ｍ１） を加えた。３０分後に、アンモニア（メタノール中の２Ｍ溶液１６ｍ１）を加え 、この反応混合物を室温に戻した。

この有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液に加え、次いてその水性層を酢酸エチル により抽出し、乾燥させ（ＭｇＳＯ，）　、次いて蒸発させ、中間体１（６，５ ｇ）を細い白色固形物として得た。

’ＨＮＭＲ（ＣＯ，ＯＤ　）６７．５−７．２　（ｍ）　５Ｈ，５，１（ｓ）２ Ｈ，４，０（ｍ）ＩＨ，３，１２（ｔ）２Ｈ，１，８４−１，３２（ｍ）　１５ Ｈ。

中間化合物１（４，１ｇ）をＴＦＡとＣ１２Ｃ１２との１＝１溶液（５０ｍｌ） 中に溶解し、この反応混合物を室温て３０分間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残留 物をエーテルとすりまぜ、次いて乾燥させ、中間化合物２（４，１ｇ）を白色固 形物として得た。

’ＨＮＭＲ（ＣＤ、ＯＤ　）６７．５−７　（ｍ）　５Ｈ，５，１（ｓ）２Ｈ， ３，８５（ｔ）ＩＨ，３，１５（ｔ）２Ｈ，１，９５−１，７５（ｍ）２Ｈ，１ ，６−１，３５（ｍ）４Ｈ。

中間化合物３ ＢＯＣ−Ｌｙｓ　（Ｅ　−Ｚ　）酸（４，２１ｇ）、中間化合物２（４，１５ｇ ）、エチルクロロホーメート（１，２１ｇＳｌ、０６ｍ１）およびｎ−メチルモ ルホリン（１，１２ｇ、１．２１ｍ１）を−緒に、中間化合物ｌに係り前記した とおりに反応させ、中間化合物３（７，３ｇ）を生成させた。

’ＨＮＭＲ（ＣＤ、ＯＤ　’）δ７．４−７．２　（ｍ）　１０Ｈ，５，１（ｓ ）４Ｈ，４，３５（ｑ）ＩＨ，４，０（Ｑ）ＩＨ，３，２（ｔ）　４Ｈ，１，９ ５−１，３０（ｍ）　２１Ｈ。

中間化合物４ Ｈｚ 中間化合物３（４，３ｇ）を、中間化合物２の製造方法を使用して、Ｔ　Ｆ　Ａ ／ＣＨ２Ｃｌ、　（１：　ｌ、５０ｍ１）により処理し、中間化合物４（４，３ ｇ）を生成させた。

’ＨＮＭＲ（ＣＤ、００　）６７．４−７．２　（ｍ）　ＩＯＨ，５，１（ｓ） ４Ｈ，４，３５（ｔ）ＬＨ，３，８５（ｔ）ＩＨ，３゜１２　（ｑ）　４Ｈ，１ ，９−１，，３（ｍ）　Ｉ　２Ｈ。

中間化合物ｌに係り前記したとおりにして、ＢＯＣ−Ｌｙｓ（Ｅ−Ｚ）酸（２， ２９ｇ）、中間化合物４（３，７６ｇ）、エチルクロローメート（６６５ｍｇ、 　０．５７７ｍ１）およびＮ−メチルモルホリン（６０７ｍｇ、６６０μｌ）を −緒に反応させ、中間化合物５（５，１ｇ）を生成させた。

’ＨＮＭＲ（ＣＤ、ＯＤ　）６７．５−７．２　（ｍ）　１５Ｈ，５，１（ｓ） ６Ｈ，４，３（ｍ）２Ｈ，４，２（ｔ）ＩＨ，３，１５（ｔ）６Ｈ，１，９−１ ，３（ｍ）２７Ｈ。

中間化合物５（４，０ｇ）をメタノール（ｌｏｏｍｌ）中に溶解し、この溶液を 窒素により、１５分間脱気した。

この溶液を次いて、ｌＯ％Ｐ　ｄ／Ｃ（１８０ｍｇ）および水素バルーンを用い て、室温で水素添加した。触媒を濾別し、溶液を減圧の下に濃縮して、中間化合 物６（２，３ｇ）を淡黄色油状物として得た。

’ＨＮＭＲ（ＣＤ３０Ｄ　）δ４．４５−４．２５　（ｍ）　２Ｈ，４゜０　（ ｂ、ｔ）ＩＨ，２，６５（ｔ）６Ｈ，２，０−１，３（Ｌｙｓ　（Ｅ　−Ｚ　） ベンジルエステル（０，５ｇ）を、僅かに加熱しながら、ジメチルスルホキシｊ ’（３，０ｍ１）中に溶解した。Ｎ−メチルモルホリン（０，１３４ｇ）を次い で加え、引き続いてすぐに、ビスーＺ−Ｌｙｓ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル（０，７５４ｇ）のジメチルスルホキシド（３，０ｍｌ）溶液を加えた 。この反応混合物を室温に数時間放置し、反応を逆相ＨＰＬＣにより、反応の完 了まで監視した（Ｔｏ：Ａ−７０％、Ｃ＝３０％、　Ｔ　Ｉｓ　：　Ａ　＝　０ 　、　Ｃ＝　１００％、Ｔ２Ｓ：Ａ＝０．Ｃ＝１００％、　Ａ＝０．１　／Ｈ２ ０；　Ｃ−０，１％　ＴＦＡ／ＣＨ，ＣＮ　、生成物は２０．５分て溶出した〕 。次いで、中間化合物７を反応溶液から０．１％ＴＦＡ／ＣＨ，ＣＮ　：Ｈ２Ｏ 中に採取し、凍結乾燥させて、細い白色粉末（７５０ｍｇ）を生成した。

中間化合物８ ＮＨ２ＮＨ２ 中間化合物７（０，２５ｇ）を、Ｎ２気体の下に攪拌しなから、乾燥ＣＨ３Ｃ１ ２（１００ｍｌ）中に溶解し、次いてＮ２気体の下に、トリメチルシリルヨウダ イト（１０ｇｇ１４６７μｌ）により処理した。生成する淡黄色溶液は室温で一 夜にわたり攪拌し、その後て暗褐色に変わった。

Ｃｔ（３ｃＩ２を減圧の下に蒸発させ、暗褐色残留物を得た。この残留物を８２ ０　（ｌ　０ｍ１）中に溶解し、次いてエーテル（３Ｘ１０ｍｌ）により抽出し た。この水性層およびエーテル層を、ニンヒドリンスプレィを用いて、遊離アミ ノ基の存在に関して検査した。水性相は遊離アミノ物質の全部を含有していた。

この水性相を一夜にわたり凍結乾燥させ、中間化合物７を淡黄色残留物として得 た。

乾燥したＮ−マレオイル−β−アラニン（４４４ｍｇ）にＴＨＦ　（ｌ　０ｍ１ ）を加え、この反応混合物を一２０°Ｃて１０分間攪拌した。エチルクロロホー メート（２８６ｍｇ、２８８．ｃｚｌ）およびＮ−メチルモルホリン（２６６ｍ ｇ、２８８μＩ）を次いて加え、この反応混合物を一２０°Ｃて３０分間放置し た。この反応混合物を一２０°Ｃに保持しなから、乾燥ＤＭＦ　（１０ｍ１）中 の中間化合物５（４００ｍｇ）を加えた。この混合物を室温に戻るまで放置し、 次いて逆層ＨＰ　Ｌ　Ｃ（ＤｙａｎａｍａｘカラムＣ６０人）を使用し、下記の プログラムにしたかい精製し、本例の所望のトリマレイミド化合物６（保持時間 １０．７分、１８０ｍｇ）を生成させた： Ｃ Ｔ、７０　３０　Ａ＝０．１％　Ｔ　Ｆ　Ａ／Ｈ２ＯＴ２Ｏ５０５０Ｃ＝０．１ ％　Ｔ　Ｆ　Ａ　／ＣＨ３ＣＮ’ＨＮＭＲ（ＣＤ、ＯＤ　）δ６．８５　（Ｓ） 　６８．４．４−４．３（ｍ）２Ｈ，４，１−４，０（ｍ）ＩＨ，３，８（ｔ） ６Ｈ。

３．１５　（ｔ）　６Ｈ，２，５（ｔ）　６Ｈ，１，９５−１，３（ｍ）２７Ｈ 。

例　２ 例１の化合物（１００ｍｇ）を、中間化合物２の製造（二関して前記したとおり に、ＴＦＡ／ＣＨ３Ｃｌ、　（１：　１．　１０　ｍｌ）により処理した。溶媒 ／酸を蒸発乾燥させ、油状沈殿を次いて数時間、凍結乾燥させ、所望の塩（８６ ｍｇ）を生成した。

ＩＨＮＭＲ（ＣＤ、ＯＤ　）６６．８　（ｓ）　６Ｈ，４，４−４，２（ｍ）２ Ｈ，３，９５（ｔ）ＬＨ，３，７（ｔ）６Ｈ，３，２−３，１（ｍ）　６Ｈ，２ ，４５（ｔ）　６Ｈ，１，９５−１，３Ｃ ２−（４−アミノ）ブチルパーヒドロ−１，４，７゜１０−テトラアサデノン− １，４，７，１０−テトラ（２−酢酸）〔この化合物は国際特許明細書Ｎｏ、Ｗ Ｏ／８９１０１４７６の例１　（ｂ）に記載されている〕を、Ｎ−メチルモルホ リンの存在の下に２０°Ｃて３時間、ジメチルスルホキシド中のビス−（ｐ−ニ トロフェニル）スクン不一トにより処理し、相当する活性エステル８を生成させ た： この生成物は固形物（１０９ｍｇ）として採取された。

この生成物を、さらに精製することな（、ＤＭＦ　（５ｍｌ）中に溶解した。生 成する溶液に、ＤＭＦ（５ｍｌ）中の例７の化合物（８６ｍｇ）を加え、次いで Ｎ−メチルモルホリン（９８ｍｌ、９０ｍｇ）を加えた。この反応混合物を３７ °Ｃで一夜にわたり放置し、所望の生成物ＣＴ９９８を逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃ（Ｄｙ ｎａｍａｘカラムＣ６０人）を用いて、下記のプログラムにしたがい、単離した ：ンスブレイを用いて監視した。室温で約３０分後に、反脱保護し、次いて例４ に記載のとおりにして、スクシンイミンルマレイミドプロピオネートと反応させ 、ＣＴ５５８を生成させることによって製造した。

Ｂ、ＴＦＭおよびＱＦＭの構築 例　６ モノクローナル抗体８７２．３は、ＴＡＧ７２の名称の腫瘍付随糖タンパク質に 対して特異性である（　Ｃｏ１ｃｈｅｒ等による、ＰＮＡＳ、７８．３１９９− ３２０３）。−個のみのヒンジチオール基を含有する抗体Ｂ７２．３のキメラＦ ａｂ　’　フラグメント（ｃＢ７２．３　Ｆａｂ’　δ　Ｃｙｓ）を、国際特許 明細書ＷＯ３９１０１９７４およびＷＯ３９１０１７８３に記載のとおりにして 調製した。ｃＢ７２．３Ｆａｂ’　δ　Ｃｙｓのヒンジチオール基は多くの場合 に、ブロックされた形態で採取される。したがって、架橋を進行させるためには 、このｃ　Ｂ　７２．３Ｆａｂ　’　δ　Ｃｙｓの部分的還元を行なわなければ ならない。これは、ｃＢ７２．３Ｆａｂ’　δ　Ｃｙｓを、２　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　 Ｔ　Ａ含有０．１Ｍ酢酸／クエン酸ナトリウム塩緩衝液（＋）８６．０　’）中 の３〜７ｍｇ／ｍ＋として、４．５ｍ＾（β−メルカプトエチルアミンとともに 、３７°Ｃて３０分間、インキュベートすることによって達成された。還元剤を 次いで、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２５のカラムにおいて、２　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　 Ｔ　Ａ含有０．１Ｍ酢酸塩／クエン酸塩緩衝液（ｐＨ６）中に脱塩処理すること によって、除去した。この還元の程度は、還元され、脱塩した物質の一定量をジ チオジピリジンにより滴定することによって、試験した。この方法は代表的に、 ｃＢ７２．３Ｆａｂ　’　δ　Ｃｙｓ分子の一つ当りで約１個の千オールを生成 させる。

ｔｒｉ−Ｆａｂに対するトリーマレイミド架橋化合物ＣＴ５５７の架橋結合は２ 種の方法のうちの一つによって行なった。最初に、これらのＣＴ５５７を乾燥Ｄ ＭＦ中に溶解し、次いてＣＴ５５７をＦａｂ　’よりも５倍モル過剰にして新し く還元し、脱塩したＦａｂ　’に加えた。３７℃で１時間インキュベートした後 に、過剰量のＮ−エチルマレイミドを加え、さらに１０分間、３７°Ｃにおける インキュベーションを行ない、この混合物を次いて５ｅｐｈａ−ｄｅｃＧ−２５ のカラムて、２　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ含有０．１　Ｍ酢酸塩／クエン酸塩（ｐ Ｈ６，０）中に脱塩処理した。この方法によって、Ｃｒ２５７が結合した、ｃ　 Ｂ　７２．３Ｆａｂ’δ　Ｃｙｓが生成される。これとは別に、新に還元し、脱 塩したｃ　Ｂ　７２．３Ｆａｂ　’　δ　Ｃｙｓのもう一つのバッチを前記のと おりに調製し、これをＦａｂ　’　−Ｃｒ２５７に２　：　ｌ　（Ｆａｂ　’　 ：Ｆａｂ　’　−Ｃｒ２５７）の割合で加えた。

この反応混合物を３７°Ｃで一夜にわたり保持し、次いで架橋度合をＨＰＬＣゲ ル濾過および５ＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。ＨＰＬＣゲル濾過分析は、Ｄｕ ＰｏｎｔＺｏｒｂａｘＧ　Ｆ　−２５０カラムを０．２　Ｍリン酸塩緩衝液（ｐ Ｈ７，０）中で１　ｍｌ／分て操作して、行ない、そして５ＤＳ−ＰＡＧεｌ＋ Ｌａｅｍｍｌｉ　（１９７０）によって開示されているように行なった。代表的 にはこの方法で、ｃＢ７２．３Ｆａｂ　’　δＣｙｓの３０〜５０％かｔｒｉ− Ｆａｂに架橋結合した。

ＣＴ５５７を用いる第二の架橋方法では、新に還元し、脱塩したｃ　Ｂ　７２． ３Ｆａｂ’　δ　Ｃｙｓを前記のとおりに調製し、次いて５・１のＦａｂ’：Ｃ Ｔ５５７のモル比が得られるような割合で、ＣＴ５５７を乾燥Ｄ　Ｍ　Ｆ中の溶 液として加えた。この混合物を３７°Ｃて、一時間またはそれ以上の間、インキ ュベートし、次いて架橋結合の度合をＨＰＬＣゲル濾過および５ＤＳ−ＰＡＧＥ によって、前記のとおりに評価した。この調製方法によるｔｒｉ−Ｆａｂに対す る架橋結合度は代表的には、４０〜６０％であった。

架橋混合物の代表的ＨＰＬＣ分析をＦｉｇ　１に示す。

ｔｒｉ−ＦａｂはＤｕＰｏｎｔ　Ｚｏｒｂａｘ　Ｇ　Ｆ　−２５０Ｘ　Ｌカラム において０．２Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７，０）で３ｍ１／分で操作するか、ま たは５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−２００ＨＲの直径２．６ｃｍｘ長さ１８３Ｃｍ のカラムにおいて、０．２Ｍ塩化カリウムおよび２　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａを含 有する０、１Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ６，０）中で操作する、分取ＨＰＬＣを使用 するゲル濾過クロマトグラフィによって精製した。

ｔｒｉ−Ｆａｂの抗原結合能を、ムチン結合性ＥＬ［ＳＡを使用し、［ｇＧ　ｄ ｉ−Ｆａｂおよびモノマー状Ｆａｂ　’　と比較した。モノマー状、ダイマー状 およびトリマー状のキメラＦａｂおよびまたキメラＢ　７２．３　［ｇＧの滴定 を行ない、微量滴定プレートのくほみ内の固体用ムチンに１時間、結合させた。

未結合抗体を洗出しだ後に、ヤギ抗ヒトＦａｂ　−ＨＲＰＯ接合体を加え、引き 続いてテトラメチルベンジジン（Ｔ〜ｉＢ）により現像した。得られたシグナル をｎＭ結合部位て表される抗体濃度に対してグラフに描いた。抗原結合性ＥＬＩ ＳＡの結果をＦｉｇ　２に示す。モノマー状Ｆａｂ　’は予想通りに、貧弱な結 合活性を示すのに対し、ｄｉ−Ｆａｔｒおよび［ｇＧの滴定ても、予想通りの極 めて類似した様相か示された。ｔｒｉ−Ｆａｂに対する架橋結合は、抗原結合用 の結合部位の結合能を２〜３倍、有利にする結果か得られるように見做される。

分子の結合能の増大か架橋によって得られたならば、分子のオフ−レートにおけ る有意の変化か見られるはずである。ｔｒｉ−ＦａｂおよびｃＢ７２゜３　［ｇ Ｇをそれぞれ、７０ｎＭ（結合部位で表して）において、微量滴定プレートのく ぼみ内の固体用ムチンに対して結合させることによって、ｃ　Ｂ　７２．３　［ ｇＧのオフ−レートとｔｒｉ−Ｆａｂのオフ−レートとを比較した。二列のくほ みを次いて、２３時間、８時間、４時間、２時間および１時間、連続洗浄に付し た。残留抗体はヤギ抗ヒトＦａｂ−ＨＲＰＯ接合体により、次いでＴＭＢによる 現像により明らかにした。得られたシグナルを、ｔｒｉ−Ｆａｂまたは［ｇＧの 標準曲線から読み取り、このデータを経過時間に対するｔｒｉ−Ｆａｂフォーマ ットまたはＩｇＧフォーマットにそれぞれ残留するｎＭ結合部位としてグラフに 描いた。

Ｆｉｇ　３はこの分析結果を示すものである。オフレートの有意の改善か、ｔｒ ｉ−Ｆａｂに見出され、このことはｔｒｉ−Ｆａｂか長時間にわたって、抗原に 結合したまま残ることを示しており、これはこの分子か極めて改善された能力を 示している。

標準的方法にしたかい、Ｂｏｌｔｏｎ　）Ｉｕｎｔｅｒ試薬を使用して、ｃＢ７ ２．３　［ｇＧおよびｔｒｉ−Ｆａｂ　（それぞれ、０．２Ｍリン酸塩緩衝液ｐ Ｈ７，０中の１ｍｇ／ｍｌとして０．５　ｍｇ）を１２５１によりラベルした。

ラベルしたｔｒｉ−ＦａｂおよびＩｇＧの品質は５ＤＳ−ＰＡＧＥ／オートラジ オグラフィによって評価した。このラベル付与方法によるｔｒｉ−Ｆａｂまたは ［ｇＧの分解は見られなかった。脇腹の皮下に、２〜３週令のＬＳＩ７４Ｔヒト 腫瘍異種移植片を有する、一群４匹の雌のヌードマウスに、ｔｒｉ−Ｆａｂ約１ ７μｇ／９μＣｉおよびＩｇＧ１９μＣｉを、尾静脈から静脈注入した。

各群の動物を３時間目、２４時間目、４８時間目および１６８時間時間段し、組 織を採取し、その重量を測定し、７　＆ｉ氷水酸化カリウム中溶解し、次いてＬ ＫＢモデル１２７０ガンマ−カウンターで測定した。結果は、注射量／組織ダラ ム士標準偏差（ｎ＝４）の平均パーセンテージで表わした。

ヨード付加したＩｇＧに係る生体分布結果は、以前の実験（Ｋｉｎｇ等、１９９ ２）と一致した。ヨード付加したｔｒｉ−ＦａｂはＩｇＧに比較して、これら２ 種の分子がほぼ同一の分子量を有するにもかかわらず、動物から有意に迅速に排 除されることか見出された（Ｆｉｇ４）。ｔｒｉ−Ｆａｂはまた、他のいずれの 組織にも存意の蓄積を示さず、腫瘍に対し良好に局在することかできた（Ｆｉｇ ５）。したかって、ｔｒｉ−Ｆａｂの腫瘍：血液比は、ＩｇＧ　（：関して見い 出されるものよりも、格別に良好であった（Ｆｉｇ６）。

腫瘍　血液比は、この比か、腫瘍に対して与えられた放射能量に係り、予想され る血液照射による毒性か小さいことを意味しており、重要である。

皮下にＬＳ１７４Ｔ異種移植腫瘍を存するヌードマウスにおける、ｃ　Ｂ　７２ ．３　ｔｒｉ−Ｆａｂの生体分布をまた、９０ｙによりラベルした場合に係り評 価した。”Ｙラベル用の１２Ｎ４大環状基を、１２Ｎ４−マレイミド誘導体（Ｃ Ｔ７７、この化合物は国際特許明細書ＷＯ３９１０１４７６の例１ｂの化合物お よびＮ−（２−カルボキシエチル）マレイミドのＮ−ヒドロキシスクシンイミド エステルから製造される）を使用して、精製ｔｒｉ−Ｆａｂに結合させた。精製 ｔｒｉ−Ｆａｂの試料を、２　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ含有０．１Ｍ重炭酸ナトリ ウム緩衝液中に緩衝剤交換させた。

ｔｒｉ−Ｆａｂに対して１０倍モル過剰の２−イミノチオランを室温で３０分間 反応させることによって、チオール基をｔｒｉ−Ｆａｂ中に導入した。チオール 付加したｔｒｉ−Ｆａｂを次いで、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２５（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ　ＰＤ　−１０）のカラムを使用し、２　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ含有０ ．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）中に脱塩処理して、未反応の２−イミ ノチオランを除去した。千オール基の存在数は、ジチオジピリジンによる滴定に よって測定した。１２Ｎ４大環状分子を次いてチオール化したｔｒｉ−Ｆａｂに 結合させた。このためには、チオール基の存在数よりも１０倍モル過剰のＣＴ７ ７を添加し、次いで３７℃で２時間インキュヘートした。この接合体を次いて、 ５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｐ　Ｄ　−１０）に おいて、０．１Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ６）中への脱塩によって精製した。

この接合体（−’ＭＣｌ３を添加することによって、放射性ラベルを行なった。

この際に、この接合体溶液中の緩衝液を酸”ＹＣｌ３を緩衝するのに充分にした 。３７°Ｃて１５分間のインキュベーションの後に、１０ｍＭ　ＤＴＰＡの添加 により放射性ラベル付与を静止させ、このラベルしたｔｒｉ−Ｆａｂを０．２Ｍ リン酸塩（ｐＨ７）中のＤｕＰｏｎｔＺｏｒｂａｘ　Ｇ　Ｆ　−２５０カラムに おけるゲル濾過ＨＰＬＣによって精製した。

ｓａｙによりラベルされたｃ　Ｂ　７２．３　ｔｒｉ−Ｆａｂを５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ／オートラジオグラフィによって評価した。

このラベル付加方法によるｔｒｉ−Ｆａｂの分解は見られなかった。脇腹皮下に 、２〜３週令のＬＳＩ７４Ｔヒト腫瘍異種移植片を有する、一群４匹の雌のヌー ドマウスに、ｔｒｉ−Ｆａｂ約３μｇ／３μＣ１を尾静脈から静脈注入した。

各群の動物を２．５時間目、２４時間目、４８時間目および１２０時間時間段し 、組織を採取し、この組織の重量を測定し、７Ｍ水酸化カリウム中に溶解し、次 いでＬＫＢモデル１２７０ガンマカウンターにより測定した。結果は注射量／組 織ダラム士標準偏差（ｎ＝４）の平均パーセンテージで表わした。

この生体分布実験の結果（Ｆｉｇ７）として、１２５−ヨウ素によりラベルした 場合に見られた結果と同様に迅速な、９０　Ｙラベル付加ｔｒｉ−Ｆａｂのクリ アランスか見出された。良好な腫瘍局在か見られ、池の全部の組織では、低レベ ルか検出された。重要なことは、腎臓において、低レベルの活性か検出されたこ とである。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’　）２などの他の抗体フラグメントを投与し た場合における腎臓内の９０Ｙ滞留は、これらの有用性を制限していたことから 、ｔｒｉ−Ｆａｂに係るこの腎臓低レベルは、他の抗体フラグメントに比較して 格別に有利であることをｃ　Ｂ　７２．３　ｔｅｔｒａ−Ｆａｂを、還元され、 脱塩したＦａｂ　’から調製し、次いてテトラ−マレイミド架橋化合物ＣＴ５５ ８を使用して行なった。ＣＴ５５８を乾燥ＤＭＡ中に溶解し、次いてＦａｂ　’ に対してＣ７０５８を５倍モル過剰にして、新たに還元し、脱塩したＦａｂ　’ に加えた。

３７°Ｃで１時間のインキュベーションの後に、過剰のＮ−エチルマレイミドを 加え、さらに１０分間、３７°Ｃでインキュベーションを行い、この混合物を次 いて、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２５のカラムにおいて、２　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ 　Ａ含有０．１Ｍ酢酸塩／クエン酸塩（ｐＨ６，０）中に脱塩処理した。この方 法によって、Ｃ７０５８が結合したｃＢ７２．３Ｆａｂ’　δ　Ｃｙｓが生成さ れた。これとは別に、新に還元し、脱塩した、ｃ　Ｂ　７２．３Ｆａｂ　’δ　 Ｃｙｓのもう一つのバッチを、上記したとおりに調製し、３：１（Ｆａｂ　’　 ：Ｆａｂ　’　−Ｃ７０５８）の比率で、Ｆａｂ’　−ＣＴ５５８に加えた。こ の反応混合物を３７°Ｃて一夜にわたり保持し、次いて架橋の度合いを、例６に 記載のとおりにＨＰＬＣゲル濾過および５ＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。代 表的には、この方法によって、ＣＢ７２．３Ｆａｂ　’δ　Ｃｙｓの２０−４０ ％かｔｅｔｒａ−Ｆａｂに架橋結合した。架橋結合混合物の代表的ＨＰＬＣ分析 値をＦｉｇ　８に示す。このｔｅｔｒａ−Ｆａｂを、例６にｔｒｉ−Ｆａｂに関 して前記したとおりのＨＰＬＣゲル濾過によって精製した。

このｔｅｔｒａ−Ｆａｂの抗原結合能を、例６にｔｒｉ−Ｆａｂに関して記載さ れているとおりに評価した。結合能のＩｇＧに優る同様の改善か、この精製ｔｅ ｔｒａ−Ｆａｂについても見出された（Ｆｉｇ　２）。

精製ｔｅｔｒａ−Ｆａｂを、２　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ含有０．１Ｍ重炭酸すト リウム緩衝液（ｐＨ８）中に緩衝液交換し、次いでｔｅｔｒａ−Ｆａｂよりも１ ５倍過剰の２−イミノチオランとのインキュベーションによって、室温で３０分 間のインキュベーションでチオール化した。２−イミノチオランを次いて、燐酸 塩緩衝塩類溶液中て、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　、 Ｐ　Ｄ　−１０において、このチオール化ｔｅｔｒａ−Ｆａｂを脱塩することに よって除去した。次いで、存在するチオール基の数（上記したジチオジピリジン による滴定によって測定されたチオール基の数）に対して、１０倍過剰のＣｒ８ ２（この化合物は、国際特許明細書ＷＯ３９１０１４７５の例２ｂの化合物およ びＮ−（２−カルボキシエチル）マレイミドのＮ−ヒトロキシスクノンイミドエ ステルから製造される）の添加によって、９Ｎ３大環状分子をｔｅｔｒａ−Ｆａ ｂに接合させた。３７°Ｃて一夜にわたりインキュベートした後に、過剰のＮ− エチルマレイミドを加え、さらに１０分間のインキュベーションを続けた。この 接合したｔｅｔｒａ−Ｆａｂを次いて、５ｅｐｈａｄｅｘ　−Ｇ　−２５カラム （Ｐｈａｒｍａｃｉａ　、　Ｐ　Ｄ　−１０）を使用して、０．１Ｍ酢酸ナトリ ウム（ｐＨ５，０）中に脱塩することによって、精製した。この精製ｔｅｔｒａ −Ｆａｂ　９Ｎ３接合体に１１１−［ｎＣｌ　３を直接に添加し、次いて、３７ °Ｃて３０分間インキュベー１・することによって、ｔｅｔｒａ−Ｆａｂ接合体 に放射性物質をラベルした。ＤＴＰＡを０．５　ｍＭまで添加することによって 、ラベル付加を静め、次いてこの放射性ラベルしたｔｅｔｒａ−Ｆａｂを、ｔｒ ｉ−Ｆａｂに関して前記したＨＰＬＣゲル濾過によって、精製した。

１１１−Ｉｎによりラベルしたｃ　Ｂ　７２．３　ｔｅｔｒａ−Ｆａｂを、５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥ／オートラジオグラフィによって、評価した。このラベル方法によ るｔｅｔｒａ−Ｆａｂの分解は見られなかった。一群４匹の、脇腹皮下に２−３ 週令のＬＳＩ７４Ｔヒト腫瘍異種移植片を有する雌のヌードマウスに、約３．５ ｕｇ／　１１　μｃｉのｔｅｔｒａ−Ｆａｂをその尾静脈に静脈注射した。各群 の動物を、２４時時間口４８時時間口よび１６８時間時間段し、組織を採取し、 その重量を測定し、７Ｍ水酸化ナトリウム中に溶解し、次いてＬＫＢモデル１２ ７０ガンマカウンターで測定した。結果は、注射量／組織ダラム士標準偏差（ｎ ＝４）の平均バーセシテイノとして表した。

この生体分布実験の結果（Ｆｉｇ９）は、ｔｒｉ−Ｆａｂに見出たされたものと 同様に（例６　）　、ｔｅｔｒａ−Ｆａｂの迅速な血液クリアランスおよび良好 な腫瘍局在性を示した。

ｔローＦａｂに関して見出されたもの（例６）と同様に、ｔｅｔｒａ−Ｆａｂに 関しても、１１ｒ意の利点を示唆する、腎臓低レベルかまた見出された。

例　４ ｃ　Ｂ　７２．３　ｔｒｉ−Ｆａｂを、ｔｒｉ−Ｆａｂに関してＣｒ５５７を使 用して記載された方法と同一の方法（例６）によって、架橋化合物ＣＴ９９８を 使用して調製した。この架橋化合物は”Ｙまたは１１Ｉｎラヘル用の１２Ｎ４大 環状分子を含有する。Ｃｒ９９８を使用して調製されたｔｒｉ−Ｆａｂは、抗原 結合に係わり、Ｃｒ２５７を用いて調製されたｔｒｉ−Ｆａｂと均等な活性を育 していた。”Ｙによりラベルした場合の、ｃＢ７２．３ｔｒｉ−Ｆａｂ　（９９ ８）のマウスにおける生体分布を評価した。９０Ｙラベル付加は、例６において 、ｃ　Ｂ　７２．３ｔｒｉ−Ｆａｂ　（９９８）に関して記載されているとおり にして達成された。ｃ　Ｂ　７２．３　ｔｒｉ−Ｆａｂ（９９８）の場合には、 大環状分子か架橋化合物中にすてに存在するので、大環状分子の接合は不必要で あった。次いて、”Ｙラベルしたｃ　Ｂ　７２．３　ｔｒｉ−Ｆａｂ　（９９８ ）の約４μｇ／８μＣｉを、一群４匹のマウスに注入することによって、生体分 布実験を行った。各群の動物は、３時間口、２４時時間口４８時時間口７２時時 間口よび１６８時間時間段し、その組織を採取し、その重量を測定し、７　Ｍ水 酸化カリウム中に溶解し、次いてＬＫ　Ｂモデル１２７０ガンマカウンターで測 定した。結果は注射量／組織ダラム士標準偏差（ｎ＝５）の平均バーセンテイジ として表した。この生体分布実験の結果は、ｔｒｉ−Ｆａｂ　（９８８）か架橋 化合物ＣＴ５５７を使用して形成されたｃ　Ｂ　７２．３　ｔｒｉ−Ｆａｂと同 様の様相を示すことを証明した。ｔｒｉ−Ｆａｂ　（９８８）は循環系から迅速 に排除され、他の組織のいずれにも存意に蓄積することなく、腫瘍に充分に局在 することかできた（ＦｉｇｌＯ）。

例　５ ネズミモノクローナル抗体Ａ３Ｂ７は研究されており、癌胎児性抗原（ＣＥＡ） として知られる腫瘍付随抗原を認識することか示されている（　Ｈａｒｗｏｏｄ 等、１９８６）。

この抗体のマウス：ヒトキメラ変種は精製されており、適当なｃＡ５Ｂ７’δ　 Ｃｙｓに係わる遺伝子は、特許圧１ｊｉＷＯ９２１０１０５９ｉ：記載されテい るように、ＮＳＯ細胞で使用される発現ベクターで構築されている。ＣＡ３Ｂ７ Ｆａｂ’を生成するＮＳＯ細胞は、プラスミドＤＮＡ　（ｐＨＭｃ３０）５０ｕ ｇを酵素Ｆｓｐ　１により線状化し、ＮＳＯ細胞中に電気泳動に付し、次いて生 じるセルラインをキメラＢ７２．３に関して開示されている（　Ｂｅｂｂｉｎｇ ｔｏｎ等、１９９２）ようにして選択することによって調製された。

ｃＡ５Ｂ７　Ｆａｂ’　δ　Ｃｙｓは、ＮＳＯ細胞培養上澄液から、先ずこの上 澄液のｐＨをＨＣｌにより５に調整し、次いて１５０ｍＭ塩化ナトリウム含存１ ００耐１燐酸塩緩衝液（ｐＨ５，０）中で予め平衡化したタンパク質Ｇセファロ ース（Ｈｉ−ｔｒａｐ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラムに通すことによって、 精製した。上記上澄液を負荷した後に、このカラムを平衡化した緩衝液により洗 浄し、次いて０．１Ｍクエン酸によりＦａｂ　’を溶出した。精製Ｆａｂ　’を 含有するフラクションを、ｐＨを６−７に調整するのに充分のＩＭｔｒｉ中に直 接に集めた。Ｆａｂ　’を含有するフラクションを集め、次いて限外濾過によっ て濃縮した。ＣＴ５５７によるｃ　Ａ　５　Ｂ　７　ｔｒｉ−Ｆａｂ　ヘの架橋 およびこのｔｒｉ−Ｆａｂの精製は、例６において、＝ｃ　Ｂ　７２．３Ｆａｂ 　’δ　Ｃｙｓ　ｌ、：関して記載の方法と実質的に同一の方法によって、達成 された。このｃ　Ａ　５　Ｂ　７　ｔｒｉ−Ｆａｂの抗原結合能を、ＣＥＡ結合 性ＥＬＩＳＡを使用して、Ａ　５　Ｂ　７　［ｇＧと比較した。

これは、例６にムチン結合性ＥＬＩＳＡに関して記載されたとおりに実質的に従 うか、ムチン塗布プレートの代わりに、ＣＥＡ塗布プレートを使用した。この結 果は、［ｇＧに比較してｃ　Ａ　５　Ｂ　７　ｔｒｉ−Ｆａｂか同様の改善され た結合活性を有することを証明した。ｃ　Ａ　５　Ｂ　７　ｔｒｉ−Ｆａｂの生 体分布は［ｇＧより優れていた。ｃ　Ａ　５　Ｂ　７　ｔｒｉ−Ｆａｂの生体分 布をまた、ヌードマウス異種移植片における実験によって評価した。　１２″Ｉ によりラベルされた、ｃＡ５　Ｂ　７　ｔｒｉ−Ｆａｂ約３　ｕ　ｇ／２．４　 μｃｉ　（上記ｃＢ７２．３に係わり記載したＢｏｌｔｏｎ　１（ｕｎｔｅｒ試 薬による）を、一群４匹の、皮下にＬＳＩ７４Ｔ異種移植片を存するヌードマウ スに注入し、２４時間目および７２時間目に生体分布を測定した。この結果は、 腫瘍に対する局在を伴う、ｃ　Ａ　５　Ｂ　７　ｔｒｉ−Ｆａｂの迅速なりリア ランスを示しくＦｉｇ　ｌ　２　）　、ｃ　Ｂ　７２．３　ｔｒｉ−Ｆａｂに見 出されたものと同様の好ましい性質を示した。

例　６ Ａ　５　Ｂ　７　Ｆａｂ　’δ　Ｃｙｓ　（ｇＡ５Ｂ７　Ｆａｂ　’　）のＣＤ Ｒ移植変種を特許出願ＷＯ９２１０１０５９＋＝記載のとおりに調製した。ｐＡ Ｌ５４（これはＷＯ９２１０１０５９に記載されている）から、ＢａｍＨ１−Ｃ １ａｌフラグメント上のＧＳミニ遺伝子およびａｍｐＲ遺伝子を取り除き、その 代わりにａｍｐＲ遺伝子およびＧＳ　ｃＤＮＡからなるＢａｍＨ２−Ｃ１ａｌを 置き換えることによって、プラスミドｐＨＭＣ５３を構築した。これによって、 ＮＳＯ細胞内での発現に適するベクターが得られる（　Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ等 、１９９２）、ＣＤＲ移植Ａ３Ｂ７　Ｆａｂ’δ　Ｃｙｓを分泌するＮＳＯセル ラインが、上記キメラＦａｂ　’に係わる記載にしたがいｐＨＭＣ５３を使用し て生成された。

ｇＡ５Ｂ７　Ｆａｂ’は、ＮＳＯ細胞培養上澄液から、先ずこの上澄液のｐＨを ＩＭ　ｔｒｉｓによって、８に調製し、次いて、１５０ｍＭ塩化ナトリウム含有 １００ｍＭ硼酸緩衝液（ｐＨ８）中で予め平衡化したタンパク質Ａセファロース （Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）のカラムに通した。上澄液を負荷した後に、このカラ ムを平衡緩衝液により、モしてＦａｂ　’を０川Ｍ　＜えん酸により洗浄した。

この精製Ｆａｂ　’を含有するフラクションを、そのｐＨか６−７に調整される のに充分の１〜ｉ　ｔｒｉｓ中に、直接に採取した。このＦａｂ　’含有フラク ションを集め、次いて限外濾過によって濃縮した。ｇ　Ａ　５　Ｂ　７　ｔｒｉ −Ｆａｂ　ヘのＣＴ５５７の架橋およびｔｒｉ−Ｆａｂの精製は、例６にｃ　Ｂ 　７２．３Ｆａｂ　’δ　Ｃｙ　ｓに係わり記載の方法に実質的にしたかい達成 された。抗原結合分析はまた、このｇＡ５８７　をローＦａｂが高度に活性であ ることを示し、そしてまた前記の方法と同様の方法で行われた　１５　）ラベル 付加物質の生体分布実験は、同様の迅速な血液クリアランスおよび良好な腫瘍局 在を示した（Ｆｉｇ　１３）。

Ｌｆａ　にる　Ｃ ＦＩＧ、　１ （フ ％ｉ、ｄ、／９ ｅ　ａ−ａ　にる　Ｃ ＦＩＧ、　８ ■ ヒ Ｏ ％ＩＤ／ダラム組織 Ａ　６３０ｎｍ ％ｉ、ｄ、／ｇ組織 国際調査報告　。、７．。。。５Ｖ、、、。１７＋ｍ　Ａｍ−Ｎ・　ＰＣＴ／Ｇ Ｂ　９２１０１０４７フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，Ｓ　識別記号庁内整理番号Ｃ０７Ｃ２３７／１２　 ７１０６−４ＨＧＯＩＮ　３３１５３１　Ａ　８３１０−２Ｊ／／　Ｃ１２Ｐ　 ２１１０４　８２１４−４Ｂ（７２）発明者　ビーリイ、ナイジエル、ロバート 、アーノルド イギリス国オーエックス９３エルキユーオツクスフオードシヤー、セーム、チェ シャー　ロード　１６ Ｉ （７２）発明者　ミリカン、トーマス、アンドリューイギリス国ニスエル６０デ イーワイ　パークシャー、メイドンヘッド、ドーニイリーチ、バーコード　クロ ース　３

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．連結構造分子によって、相互に結合している３個または４個のＦａｂフラグ メントを含有し、天然免疫グロブリンではない、３価または４価の単一特異性抗 原結合性タンパク質。
2. ２．上記Ｆａｂフラグメントか、単一の連結分子によって相互に共有結合してい る、請求項１に記載の抗原結合性タンパク質。
3. ３．上記Ｆａｂフラグメントが、少なくとも１個のシステイン残基を有するヒン ジ部を包含しており、そして上記連結分子が、各フラグメントにおいて少なくと も１個のシステイン残基を介して連結する３価または４価のマレイミド架橋化合 物である、請求項２に記載の抗原結合性タンパク質。
4. ４．上記ヒンジ部がＦａｂ′様フラグメントの天然ヒンジ部に比較して、減少し た数のｃｙｓ残基を有する、請求項２または請求項３に記載の抗原結合性タンパ ク質。
5. ５．増大した抗原結合活性、改善された血液クリアランス性能および動物に投与 された場合に、抗原含有組織に対して優れた局在化性を示す、前記請求項のいず れか一項に記載の抗原結合性タンパク質。
6. ６．上記連結分子が、マレイミド架橋化合物である、請求項３−５のいずれか一 項に記載の抗原結合性タンパク質。
7. ７．腫瘍付随抗原に対して特異性である、前記請求項のいずれか一項に記載の抗 原結合性タンパク質。
8. ８．ＣＥＡに対して特異性である、請求項７に記載の抗原結合性タンパク質。
9. ９．ＴＡＧ７２に対して特異性である、請求項７に記載の抗原結合性タンパク質 。
10. １０．下記一般式（１）で表される架橋化合物：Ｒ１ＣＨ（Ｒ２）ＮＨＣＯＲ３ 式中、Ｒ１は、カルボキシル基（−ＣＯ２Ｈ）またはエステル化カルボキシル基 、あるいは基−ＣＯＡであり、Ａは、直接にまたはスペーサー基を経て、−ＣＯ 基に結合して、炭素−炭素結合または炭素−ヘテロ原子結合を形成している、エ フェクター分子またはリポーター分子であり；Ｒ２およびＲ３は、同一または異 なっていてもよく、それぞれこのＲ２およびＲ３の中の反応官能性基の総数が３ 個または４個以上であるような数で、１個または２個以上の反応官能性基を含有 しており、置換されていてもよい、直鎖状または分枝鎖状のアルキレン、アルケ ニレン、またはアルキニレン鎖〔この鎖は、１個または２個以上の−Ｏ−または −Ｓ−原子、あるいはＮ（Ｒ４）（ここでＲ４は、水素原子またはＣ１−６アル キル基である）、−Ｎ（Ｒ４）ＣＯ−、−ＣＯＮ（Ｒ４）−、Ｃ５−８シクロア ルキレン、Ｃ６−１２アリーレンあるいはＣ５−１０ヘテロアリーレン基により 中断されていてもよい〕である。
11. １１．下記一般式（１０）で表される架橋化合物：Ｒ９ＣＨ（Ｒ２）ＣＯＮＨＣ Ｈ（Ｒ２）ＣＯＮＨＣＨ（Ｒ２）ＣＯＮＨ２（１０）式中Ｒ９は−ＮＨ２または 置換アミノ基、たとえば基−ＮＨＣＯＡであり、そしてＡおよびＲ２は式（１） の化合物に関して定義されているとおりである。
12. １２．大環状分子を、さらに含有する、請求項１０または請求項１１に記載の架 橋化合物。
13. １３．上記大環状分子が、下記一般式で表される基である、請求項１２に記載の 架橋化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼ 式中、Ｌは反応性基を含有する置換基であり、Ｂは１個または２個の、置換され ていてもよい窒素原子により中断されているＣ２−１４アルキレン鎖であり；Ｗ １およびＷ２は、同一または異なっていてもよく、それぞれ置換されていてもよ い窒素原子であり；ｐは０または１の整数であり、そしてｑは０または１あるい は２の整数である、ただしｐが０である場合には、ｑは１または２の整数である 。
14. １４．大環状分子が、放射性同位元素をキレート化している、請求項１０−１１ ３のいずれか一項に記載の架橋剤。
15. １５．放射性同位元素が１１１Ｉｎ，９０Ｙ，または１２５Ｉである、請求項１ ４に記載の架橋化合物。
16. １６．式ＣＴ９９８で示される架橋化合物：▲数式、化学式、表等があります▼
17. １７．式ＣＴ５５７で示される架橋化合物：▲数式、化学式、表等があります▼
18. １８．式ＣＴ５５８で示される架橋化合物：▲数式、化学式、表等があります▼
19. １９．請求項１０−１８のいずれか一項に記載の架橋分子を含有する、請求項１ ０−９のいずれか一項に記載のＦａｂ様タンパク質。
20. ２０．適当な治療剤または診断剤に結合させた請求項１−９のいずれか一項に記 載のＦａｂ様タンパク質の有効量を、ヒトまたは動物の対象に投与することから なる、癌の治療または診断方法。
21. ２１．請求項１−９のいずれか一項に記載のＦａｂ様タンパク質を癌の処置また は診断に使用すること。
22. ２２．請求項１−９のいずれか一項に記載のＦａｂ様タンパク質を癌の処置また は診断用の組成物の製造に使用すること。