CN104622865B - 巨大戟二萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种巨大戟二萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，该巨大戟二萜类化合物是如式（I）所示的巨大戟二萜类化合物中的一种或多种。该巨大戟二萜类化合物能够明显抑制乳腺癌细胞的增殖活性，与传统的肿瘤治疗方法相比，抑瘤效果好，毒副作用小，靶向性强，对于正常细胞无损害，安全性得到最大保证，为治疗乳腺癌提供了一种潜在的新药开发用途，可作为抗乳腺癌候选药物进一步研究。

Description

巨大戟二萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及一种巨大戟二萜类化合物的应用，特别是涉及一种巨大戟二萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
癌症，是严重危及人体生命的第一大恶性疾病，其中，乳腺癌已成为对妇女健康威胁最大的癌症之一。随着现代社会经济的发展，各种社会问题和家庭问题造成的不健康的生活环境因素，使女性乳腺癌发病率逐年增高，目前全球每年平均有130万人新患乳腺癌，且近年来呈现不断上升趋势，近年我国乳腺癌发病率的增长速度高出高发国家1-2个百分点，且呈明显年轻化趋势。
乳腺癌是乳房腺上皮细胞在多种致癌因子作用下，发生了基因突变，致使细胞增生失控。由于癌细胞的生物行为发生了改变，呈现出无序、无限制的恶性增生。乳腺细胞发生突变后便丧失了正常细胞的特性，组织结构紊乱，细胞连接松散，癌细胞很容易脱落游离，随血液或淋巴液等播散全身，形成早期的远端转移，给乳腺癌的临床治愈增加了很大困难。而全身重要脏器的转移如肺转移、脑转移、骨转移等都将直接威胁人的生命。因此，目前治疗各种乳腺癌症及相关病症已成为医学界的重要课题。
目前临床上治疗乳腺癌主要方式仍然是外科手术治疗，尽管手术方式有多种类型，但很多病人身体机能和状态不足以耐受手术，且手术的破坏性依然较大，局部复发性风险依然极高，且并发症严重。而放射治疗受目前的设备及生物学效应影响，较难达到完全杀灭肿瘤细胞的目的，多用于综合治疗。而目前现有的药物治疗不论是化学药物还是中草药，均有不同程度严重的副作用，因此，研究和开发药效明显，靶向性强，毒副作用小的天然产物势在必行，可以弥补手术治疗、放射治疗、化学治疗的不足，既能巩固放疗、化疗的效果，又能消除放化疗的毒副作用。
天然产物在药物研究领域占有重要的一席之地，迄今，在临床应用的药物三分之一以上来自天然产物或其衍生物或全合成产物，天然产物往往结构新颖，生物作用独特（徐任生等.《天然产物化学》科学出版社,2004年）。其中，二萜类化合物在抗肿瘤天然产物中活性突出，紫杉烷型二萜化合物紫杉醇（paclitaxel）做为代表，上市多年。此外，还有雷公藤属植物中分离得到的雷公藤甲素(triptolide)、从香茶菜属植物中分离得到的冬凌草甲素(oridonin)等均有较强的抗癌作用（许旭东,胡晓茹,杨峻山.抗肿瘤药用植物有效成分研究概况.中国中药杂志,2008,17:2073-2081）。因此，二萜类化合物结构的特异性和明确的抗肿瘤活性已经成为当今抗肿瘤药天然产物研发的热点之一，特别是在新药及其先导化合物发现中起着不可替代的作用。
甘遂为大戟科植物甘遂Euphorbia kansui T.N.liou ex T.P.Wang的干燥块根，性，苦、寒，有毒。具有泻水逐饮、消肿散结的功效。用于水肿胀满，胸腹积水，痰饮积聚，气逆咳喘，二便不利，风痰癫痫，痈肿疮毒。始载于《神农本草经》，目前《中国药典》2010年版收载。
甘遂化学成分目前研究主要以巨大戟二萜、假白榄酮二萜和甘遂烷型三萜为主，并有一定量的十八碳不饱和脂肪酸。其中，巨大戟二萜是从甘遂中分离最多的化学成分，此类化合物母核较单一，变化较少，由5/7/7/3四个环稠合而成，8位和10位存在一个酮桥，1\2位有一个双键，6、7位基本结构多为双键，从巨大戟二萜类的取代情况可以看出，主要取代位置在3、5、13、20位，而4位多为β-OH取代，取代基类型3、5、20位多为乙酰基、苯甲酰基、2,3二甲基丁酰基、癸二烯酰基、癸烯基、棕榈酰基等，13位取代多为癸酰基、十二碳酰基等。
巨大戟二萜也是甘遂中相关活性报道最多的成分，文献报道此类化合物有着良好的抗炎抗病毒活性（Li-Yan Wang，Nai-Li Wang，Xin-Sheng Yao，et al.Diterpenes fromthe Roots of Euphorbia kansui and Their in Vitro Effects on the Cell Divisionof Xenopus.J.Nat.Prod..2002(65):1246-1251;Li-Yan Wang，Nai-Li Wang，Xin-ShengYao，et al.Diterpenes from the Roots of Euphorbia kansui and Their in VitroEffects on the Cell Division of Xenopus(2).Chem.Pharm.Bull..2003，51(8):935—941）、抑制一氧化氮合酶（NOS）活性（郑维发.甘遂醇提物中4种二萜类化合物的体内抗病毒活性研究.中草药.2004(01)）等。另外，治疗乳腺癌的药物市场上，药效显著、毒副作用小、靶向性强的天然产物类药物基本空白，而在国内外专利文献报道中巨大戟二萜类成分均为涉及抗乳腺癌活性报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种巨大戟二萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。该巨大戟二萜类化合物可为甘遂中的巨大戟二萜类化合物，而且巨大戟二萜类化合物作为有效成分可用于在制备抗肿瘤及相关疾病的药物中的应用，特别是作为有效成分在制备治疗抗乳腺癌疾病的药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供一种巨大戟二萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，其中，所述巨大戟二萜类化合物是如式（I）所示的巨大戟二萜类化合物中的一种或多种；
其中，R1选自氢、乙酰基、苯甲酰基、癸二烯酰基、2,3二甲基丁酰基、癸酰基、癸单烯酰基或棕榈酰基；
R2选自氢、乙酰基、苯甲酰基、癸酰基、癸单烯酰基或棕榈酰基；
R3选自氢、羟基、乙酰基、苯甲酰基、癸二烯酰基、2,3二甲基丁酰基、癸酰基、癸烯酰基或棕榈酰基；
R4选自氢、羟基、癸酰基、十二碳酰基、癸酰基、癸单烯酰基或棕榈酰基。
优选地，所述R1选自氢、癸二烯酰基或2,3二甲基丁酰基；R2选自氢、癸二烯酰基或2,3二甲基丁酰基；R3选自乙酰基；R4选自氢。
所述巨大戟二萜类化合物优选为3-O-(2'E,4'Z-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇、3-O-(2'E,4'E-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇、3-O-(2,3二甲基丁酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇、5-O-(2'E,4'Z-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇、5-O-(2'E,4'E-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇中的一种或多种。
其中，优选化合物结构信息如下：
优选地，所述抗肿瘤药物为抗乳腺癌药物，即本发明的巨大戟二萜类化合物优选在制备抗乳腺癌药物中的应用。
所述抗肿瘤药物或抗乳腺癌药物（即药物组合物），其含有有效治疗量的上述巨大戟二萜类化合物和药学上可接受的载体。
本发明中，药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，包括：稀释剂、赋形剂（如水）、填充剂（如淀粉）、黏合剂（如明胶）、崩解剂（碳酸钙）、吸收促进剂（如季铵化合物）、表面活性剂（如十六烷醇）、润滑剂（如滑石粉）、矫味剂等。
本发明的巨大戟二萜类化合物可以药物组合物的方式以治疗上的有效量施用，其施用方式可以是口服、全身施用（例如，透过皮肤的、鼻吸入的或者用栓剂）或肠胃外施用（例如，肌肉内、静脉内或皮下）等。
本发明的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规方法制备。例如使总巨大戟二萜部位或巨大戟二萜类化合物与一种或者多种载体混合，然后将其制成所需的剂型，如片剂、药丸、胶囊、半固体、粉末、缓释剂型、溶液、混悬液、配剂、气雾剂等。
本发明药物组合物中的巨大戟二萜类化合物可以在本领域技术人员所用的全部范围内变动。通常，按重量百分比（wt%）记，剂型中含有占总剂型约0.1～99.5wt%的总巨大戟二萜部位或巨大戟二萜类化合物，并且还有一种或多种合适的药物赋形剂作为平衡物。优选的，化合物以大约0.5～95wt%的比例存在。
本发明的总巨大戟二萜部位或巨大戟二萜类化合物的实际施用量（即活性组分）依赖于许多因素，如待治疗疾病的严重性、治疗对象的年龄和相对健康程度、所使用的化合物的效能、施用途径和形式，以及其他因素，具体可为，大约日剂量为0.01～50mg/kg受体体重；优选约0.1～10mg/kg/day，可以一次或多次施用。
另外，上述巨大戟二萜类化合物是由包含以下步骤的方法制备得到的：
1）采用醇类对甘遂药材进行提取，过滤，合并滤液，回收至无醇味，加入第一有机试剂萃取，合并第一有机试剂层，回收溶剂，浓缩至干，得浸膏，备用；
2）浸膏加第一有机试剂溶解，过滤，上反相凝胶柱层析，分别采用不同的第二有机试剂洗脱，收集各部分洗脱液，进行高效液相色谱仪（HPLC）检测，收集含有巨大戟二萜类化合物的部位；
3）对步骤2）得到的含有巨大戟二萜类化合物的部位进行柱层析的粗分离，并用第三有机溶剂进行梯度洗脱，合并相同物质，经反复柱层析，得到巨大戟二萜类化合物。
所述步骤1）中，醇类包括：体积百分比浓度为80%～100%的乙醇；醇类与甘遂药材的用量重量比为4：1～20：1；提取的时间为1～3小时，提取的次数1～5次，提取的方式为热回流、40～80℃温浸搅拌或渗漉等；第一有机试剂包括：石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿或丙酮；第一有机试剂的用量为待需要进行萃取的液体体积的2～20倍，萃取的次数为1-5次。
所述步骤2）中，第一有机试剂与浸膏的体积比为5:1～1:2；反相凝胶柱层析优选为C18（YMC GEL-ODS）柱层析；第二有机试剂包括：体积浓度为50%～100%（如可为50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%这样的浓度递增）的甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇或二氯甲烷；第二有机试剂与浸膏的用量比为2000ml:1g～100ml:1g。
所述步骤2）中，高效液相色谱仪检测的条件为：
色谱柱：Agilent Poroshell120EC-C8(3mm×100mm，2.7μm)；配在线过滤器；流动相：
A相乙腈与B相体积百分比浓度为0.02%的磷酸水溶液的混合物；
流动相梯度程序为：0～1分钟，A相所占的体积比例35%～54%；1～6分钟，A相所占的体积比例为54%；6～7分钟，A相所占的体积比例为54%～70%；7～13分钟，A相所占的体积比例为70%～92%；13～15分钟，A相所占的体积比例为92%；15～17分钟，A相所占的体积比例为92%～100%；17～25分钟，A相所占的体积比例为100%；25.01～30分钟，换为100%甲醇冲洗；
流速：0.7ml/min；
柱温：30℃；程序波长：0～9.6min，230nm；9.55～12.5min，265nm；12.5～18min，220nm；18～25min，210nm。
所述步骤3）中，柱层析优选为硅胶柱层析；硅胶柱层析的条件为：100～300目硅胶装柱。含有巨大戟二萜类化合物的部位与硅胶的重量比范围为5:1～1:5；
第三有机溶剂包括：石油醚与二氯甲烷的混合液，或石油醚、二氯甲烷与甲醇的混合液；其中，石油醚与二氯甲烷的混合液中，石油醚与二氯甲烷的体积比为9:1～1：9的不同比例（如9:1，8:2，7:3，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8，1:9）；石油醚、二氯甲烷与甲醇的混合液中，比重为0.9-1.2的石油醚与二氯甲烷的混合液：甲醇的体积比为1:1（如石油醚与二氯甲烷的混合液用量为1-1000ml，甲醇1-1000ml）。
本发明首次发现一类巨大戟二萜类化合物具有良好的抗乳腺癌细胞活性及选择性，这类巨大戟二萜类化合物能够明显抑制乳腺癌细胞的增殖活性，与传统的肿瘤治疗方法相比，抑瘤效果好，毒副作用小，靶向性强，对于正常细胞无损害，安全性得到最大保证，为治疗乳腺癌提供了一种潜在的新药开发用途，可作为抗乳腺癌候选药物进一步研究。此外，本发明提供的这些化合物的制备分离工艺制得的部位药材得率低，有效的富集了巨大戟二萜类成分，最大程度上去除了非活性物质，这样增加了辅料空间，提高了载药量，降低了制剂的成本和难度，有利于开发成现代制剂。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1是甘遂乙醇提取物极性分段部位的HPLC色谱分段图，其中，横坐标为时间（分钟），纵坐标为AU（absorbance unit）；
图2是化合物16-18的剂量-效应曲线图；
图3是化合物04、07、19的剂量-效应曲线图；
图4是化合物08、09、20的剂量-效应曲线图。
具体实施方式
以下实施例中涉及的药材、化学试剂等如未特别说明，则为商业化产品。
实施例1总巨大戟二萜部位的制备及活性
一、总巨大戟二萜部位的分离
制备工艺：甘遂药材10公斤，8倍量（质量比）95%（体积百分比）乙醇，回流提取2小时，过滤，再加入6倍量95%乙醇回流提取1小时，过滤，合并滤液，回收至无醇味，加入等体积乙酸乙酯萃取，静置分层，萃取三次，合并乙酸乙酯层，回收溶剂，浓缩至干，浸膏加重量：体积比为1:1的甲醇溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，滤液上反相凝胶C18（YMC GEL-ODS）柱层析，分别采用体积浓度为75%的MeOH（甲醇）、85%MeOH、95%MeOH、MeOH、异丙醇、二氯甲烷洗脱，浸膏重量（g）与洗脱液的体积比为1g:500ml，收集各部分洗脱液，高效液相色谱仪（HPLC）检测，按如图1所示的色谱图分段为5个部位（部位1～部位5）。其中，部位2、部位3为总巨大戟二萜部位（即部位2和3按照图1中所示合并得到）。
HPLC检测条件：
色谱柱：Agilent Poroshell120EC-C8(3mm×100mm，2.7μm);配在线过滤器；流动相：A相乙腈与B相体积百分比浓度为0.02%的磷酸水溶液的混合物；
流动相梯度洗脱程序为：0～1分钟，A相所占的体积比例35%～54%；1～6分钟，A相所占的体积比例为54%；6～7分钟，A相所占的体积比例为54%～70%；7～13分钟，A相所占的体积比例为70%～92%；13～15分钟，A相所占的体积比例为92%；15～17分钟，A相所占的体积比例为92%～100%；17～25分钟，A相所占的体积比例为100%；25.01～30分钟，换为100%甲醇冲洗，流速：0.7ml/min；
柱温：30℃；程序波长：0～9.6min，230nm；9.55～12.5min，265nm；12.5～18min，220nm；18～25min，210nm。
二、增殖活性细胞系的筛选
采用MTS法，对上述的甘遂乙醇提取物极性分段5个部位进行了五种细胞株的细胞毒筛选。
1、实验材料及细胞：
甘遂乙醇提取物极性分段5个部位（部位1～部位5）。
阳性对照药选用Staurosporine（星孢菌素，一种蛋白酶抑制剂）。
选择表1所示的5种不同癌细胞株（美国菌种保藏中心（ATCC）），放置于10%RPM11640牛胎血清中。
表1细胞毒五种细胞株
试剂：
MTS试剂盒购自Promega（cat#G3581），0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO，cat#25200），RPMI-1640（GIBCO，cat#A10491-01），牛胎儿血清（GIBCO，cat#16000-044），盘尼西林链霉素（GIBCO，cat#15140-122），DMSO（Sigma，cat#D2650），丙酮（sinopahrm，cat#10000418），96孔板培养基（Corning，cat#3599）。
2、实验方法：
细胞悬浮于RPMI/10%FBS溶液中，调整到最佳生长数量，加150μl于96孔板中，培养24小时。24小时后，加入50μl不同浓度的部位1～部位5，继续培养72小时。采用MTS法分析细胞增殖量，并观察对细胞膜损伤情况。GraphPad Prism软件绘制数据曲线及计算IC50值。
加入样品前，部位1～部位5分别加DMSO制成浓度20mg/ml的贮备液，等比稀释后制备的最终浓度分别为：50、10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032和0.00064μg/ml。以体积比为0.25%DMSO或0.25%DMSO+0.25%丙酮作为空白对照。
3、实验结果：
结果显示（如表2所示）：甘遂乙醇提取物极性分段5个部位的抗增殖活性存在明显的细胞选择性；其中，部位2+部位3（如图1所示）为总巨大戟二萜部位，部位2和部位3对结肠癌Colo205及乳腺癌MDA-MB-435细胞系敏感，尤其对乳腺癌MDA-MB-435最为敏感；即说明总巨大戟二萜部位有极强的抗肿瘤活性。
部位1（如图1所示）主要化合物为假白榄酮二萜类化合物，该类化合物与抗肿瘤活性无关；部位4（如图1所示）主要化合物为三萜类化合物，细胞毒活性最小，也与抗肿瘤活性无关；部位5为极性小的化合物，含有少量长链脂肪酰基巨大戟二萜，也与抗肿瘤活性无关。
表2甘遂乙醇提取物极性分段5个部位的细胞毒半数抑制率（IC50μg/ml）（72小时）
实施例2巨大戟二萜类化合物的制备
一、巨大戟二萜类化合物的分离：
制备工艺：甘遂药材10公斤，10倍量（质量比）95%（体积百分比）甲醇，回流提取3小时，过滤，再加入8倍量甲醇回流提取2小时，过滤，合并滤液，回收至无醇味，加入等体积二氯甲烷萃取，静置分层，萃取三次，合并二氯甲烷层，回收溶剂，浓缩至干，浸膏加重量：体积比为1:1的甲醇溶解，0.45μm微孔滤膜过滤，上反相凝胶C18（YMC GEL-ODS）柱层析，分别采用体积浓度为60%丙酮、75%丙酮、85%丙酮、丙酮、异丙醇、二氯甲烷洗脱，浸膏重量（g）与洗脱液的体积比为1g:500ml，收集各部分洗脱液，按照实施例1的高效液相色谱仪的检测条件进行检测，按如图1所示的色谱图分段合并为5个部位（部位1～部位5）。
其中，部位2及部位3共得到60g，加入30g硅胶拌样，进行硅胶柱层析的粗分离，200-300目硅胶1000g装柱（8.5×60cm）。依次用石油醚:二氯甲烷的体积比=7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、以及由石油醚/二氯甲烷溶剂（比重约为1.065）与甲醇（1ml-100ml）所构成的混合溶剂进行梯度洗脱，合并相同流份，各流份使用反相C18柱制备液相分离，得到如下化合物。
化合物母核：
表3化合物取代基类型
表4化合物结构
制备化合物的详细物理化学参数：
1）化合物04：（kansuiphorin D）
无色胶状，UV（MeOH）λ231nm(S)，273nm(W)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.14(d,J=7.6Hz,2H),7.60(t,J=7.3Hz,1H),7.48(t,J=7.7Hz,2H),6.14(s,1H),5.89(d,J=4.5Hz,1H),5.53(s,1H),5.05(s,1H),4.27(d,J=11.8Hz,1H),3.39(d,J=70.4Hz,1H),2.54(dt,J=7.0,3.6Hz,1H),2.42–2.23(m,1H),2.06(s,3H),1.81–1.73(m,4H),1.62(s,1H),1.56(s,3H),1.13(s,3H),1.07(s,3H),1.01(d,J=7.1Hz,3H),0.94(dd,J=11.8,8.4Hz,1H),0.74–0.65(m,1H)；
分子式为C30H42O6（精确分子量计算值为：478.2355；不饱和度13）。
2）化合物07：(3-O-(2’E,4’Z-decadienoyl)-20-O-acetylingenol)
无色胶状，UV（MeOH）λ268.8nm；
13C NMR(151MHz,CDCl3)δ206.43,171.18,167.95,146.99,146.46,136.14,136.08,132.20,129.34,128.25,118.12,85.07,82.83,77.48,77.36,77.16,76.84,74.79,72.15,66.89,43.71,38.70,33.17,31.47,31.32,28.63,28.43,24.14,23.36,23.14,22.59,21.24,17.45,15.73,15.64,14.13；
分子式为C32H44O7（精确分子量计算值为：540.3087；不饱和度11）。
3）化合物08：(3-O-(2’E,4’E-decadienoyl)-20-O-acetylingenol)
无色胶状，UV（MeOH）λ265.3nm；
13C NMR(151MHz,CDCl3)δ206.43,171.18,167.95,146.99,146.46,136.14,136.08,132.20,129.34,128.25,118.12,85.07,82.83,77.48,77.36,77.16,76.84,74.79,72.15,66.89,43.71,38.70,33.17,31.47,31.32,28.63,28.43,24.14,23.36,23.14,22.59,21.24,17.45,15.73,15.64,14.13；
分子式为C32H44O7（精确分子量计算值为：540.3087；不饱和度11）。
4）化合物09：(3-O-(2’E,4’Z-decadienoyl)-20-deoxyingenol)
无色胶状，UV（MeOH）λ267.6nm；
13C NMR(151MHz,CDCl3)δ207.00,167.93,143.23,141.36,137.51,135.74,132.72,126.29,124.12,120.04,85.15,83.24,77.32,77.16,72.05,43.52,39.03,31.51,31.29,29.11,28.64,28.45,24.16,23.38,23.14,22.60,22.15,17.28,15.79,15.63,14.15。
分子式为C30H42O5（精确分子量计算值为：482.3032；不饱和度10）。
5）化合物16：(5-O-benzoyl-20-deoxyingenol)
无色胶状，UV（MeOH）λ231.0nm(S)，273.6nm(W)；
13C NMR(151MHz,CDCl3)δ15.55,15.84,17.70,21.77,23.32,23.46,24.18,28.66,31.28,39.74,44.26,73.16,77.82,80.48,85.41,126.14,128.73,128.73,129.42,130.23,130.23,130.35,133.69,134.95,139.20,166.43,207.27；
分子式为C27H32O5（精确分子量计算值为436.2249；不饱和度为12）。
6）化合物17：(3-O-benzoyl-20-deoxyingenol)
无色胶状，UV（MeOH）λ229.8nm(S)，273.6nm(W)；
13C NMR(126MHz,CDCl3)δ15.63,15.79,17.40,22.12,23.24,23.42,24.16,28.67,31.36,39.22,43.55,72.20,77.64,84.14,85.27,124.42,128.77,128.77,129.66,129.95,129.95,133.14,133.69,135.44,137.29,167.44,206.98；
分子式为C27H32O5（精确分子量计算值为436.2249；不饱和度为12）。
7）化合物18：(3-O-(2,3-dimethyl-butanoyl)-20-O-acetylingenol)
无色胶状，UV（MeOH）末端吸收；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.12(d,J=3.7Hz,1H),6.03(d,J=1.5Hz,1H),5.47(s,1H),4.75(d,J=12.6Hz,1H),4.47(d,J=12.5Hz,1H),4.09(dd,J=11.5,4.4Hz,1H),3.86(d,J=6.7Hz,1H),3.47(d,J=6.9Hz,1H),3.44(s,1H),2.33(p,J=7.0Hz,1H),2.05(s,3H),1.93(dd,J=13.7,6.8Hz,1H),1.78(d,J=1.3Hz,3H),1.15(d,J=7.0Hz,3H),1.08(s,3H),1.05(s,3H),0.74–0.66(m,1H)；
13C NMR(126MHz,CDCl3)δ14.15,15.66,15.76,17.40,19.30,20.81,21.24,23.15,23.40,24.16,28.66,31.24,31.24,38.70,43.74,46.52,66.97,72.12,74.93,82.84,85.03,129.83,132.34,135.97,136.02,171.23,177.40,206.34；
分子式为C28H40O7（精确分子量计算值为488.2774；不饱和度为9）。
8）化合物19：(5-O-(2'E,4'Z-decadienoyl)-20-O-acetylingenol)
无色胶状，UV（MeOH）λ271.2nm(S)；
13C NMR(101MHz,cdcl3)δ14.15,15.32,15.72,18.19,21.00,22.63,23.23,23.81,23.94,28.52,28.63,29.10,31.52,31.63,38.91,44.38,66.77,73.79,75.00,79.41,85.54,119.57,126.32,128.94,132.02,133.88,139.69,141.88,143.53,166.86,170.84,206.72；
分子式为C32H44O7（精确分子量计算值为540.3087；不饱和度为11）。
9）化合物20：(5-O-(2'E,4'E-decadienoyl)-20-O-acetylingenol)
无色胶状，UV（MeOH）λ267.6nm(S)；
13C NMR(101MHz,CDCl3)δ14.15,15.36,15.74,18.12,21.01,22.60,23.22,23.73,23.99,28.43,28.62,31.50,31.56,33.19,39.04,44.40,66.76,73.67,74.75,79.50,85.54,117.52,128.28,129.15,131.93,133.91,139.65,146.79,147.48,166.77,170.87,206.69；
分子式为C32H44O7（精确分子量计算值为540.3087，不饱和度为11）。
二、甘遂巨大戟二萜各化合物抗乳腺癌的增殖活性：
通过选择乳腺癌细胞系（MDA-MB-435）对甘遂巨大戟二萜类化合物的抗增殖活性（IC50）进行研究，采用MTS法设置了不同的浓度剂量测定各化合物在乳腺癌细胞中的细胞毒活性，用以评价巨大戟二萜类化合物的抗肿瘤细胞增殖活性。
1、实验材料
化合物：化合物04、07、08、09、16-20；
细胞系：乳腺癌细胞系MDA-MB-435由ATCC购买，放置于10%RPM11640牛胎血清中；
试剂：MTS试剂盒（Promega，cat#G3581），0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO，cat#25200），RPMI-1640（GIBCO，cat#A10491-01），牛胎儿血清（GIBCO，cat#16000-044），盘尼西林链霉素（GIBCO，cat#15140-122），DMSO（Sigma，cat#D2650），丙酮（sinopahrm，cat#10000418），96孔板培养基（Corning，cat#3599）。
2、试验方法
MDA-MB-435细胞悬浮至于RPMI/10%FBS溶媒中，调整到最佳生长数量，加150μl于96孔板中培养24小时，24小时后，加入50μl工作液（不同种类和浓度的化合物）继续培养72小时，通过MTS测定细胞增殖量。GraphPad Prism软件绘制数据曲线及计算IC50值。
在处理过程中，各化合物用DMSO分别制成20mg/ml的贮备液，等比稀释后制备的各化合物最终浓度分别为50、10、2、0.4、0.08、0.016、0.0032μg/ml。
以体积比为0.25%DMSO或0.25%DMSO+0.25%丙酮作为空白对照。
3、试验结果
在96孔板中，8个化合物分别用8个浓度对细胞处理，72小时后采用MTS法进行细胞增殖试验，甘遂化合物抑制细胞系的生长呈剂量关系。剂量效应曲线如图2-4所示，同时标注的各自的IC50值。
另外，各自化合物的平均抗增殖IC50百分比如表5所示，从表5中可以看出，甘遂各化合物对于乳腺癌细胞系MDA-MB-435有着很强的抗增殖作用，其中，化合物18、19、20、07、08显示了极强的抑制作用，即3-O-(2'E,4'Z-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇、3-O-(2'E,4'E-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇、3-O-(2,3二甲基丁酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇、5-O-(2'E,4'Z-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇、5-O-(2'E,4'E-癸二烯酰基)-20-O-乙酰基巨大戟二萜醇具有良好的抗乳腺癌活性。
再者，化合物04、07～09、16～20对MDA-MB-435细胞的生长抑制百分比结果分别如表6-表8所示。
表5甘遂巨大戟二萜类乳腺癌细胞毒半数抑制率
表6化合物16、17和18的MDA-MB-435细胞生长抑制百分比（%）
表7化合物04、19和07的MDA-MB-435细胞生长抑制百分比（%）
表8化合物08、09和20的MDA-MB-435细胞生长抑制百分比（%）
根据上述实验可知巨大戟二萜类化合物存在以下的构效关系：
巨大戟二萜类化合物07、08、18、19、20均集中在总巨大戟二萜部位中。
甘遂中巨大戟二萜类化合物在抑制乳腺癌细胞MDA-MB-435方面有较好的抗增殖活性，其中，化合物07、08、18、19、20的细胞毒活性最强。
巨大戟二萜类化合物的抗增殖活性有一定的构效关系：C-20存在酯基取代时，抗增殖活性显示了较高的水平，如化合物07、08、19、20；C-20无羟基和酯基取代的化合物活性较低，如化合物04、09、16、17；癸二烯酰基顺反取代不同对细胞毒结果影响不大。
因此，上述的总巨大戟二萜部位（部位2和部位3）或巨大戟二萜类化合物有着极强的抗乳腺癌细胞增殖活性，它们中的一种或几种可用于制备抗肿瘤药物，优选为在制备抗乳腺癌药物中的应用。

Claims (1)

1.一种巨大戟二萜类化合物在制备抗乳腺癌药物中的应用，其特征在于：所述巨大戟二萜类化合物是如式(I)所示的巨大戟二萜类化合物；
其中，R1选自2,3二甲基丁酰基；
R2选自氢；
R3选自乙酰基；
R4选自氢。
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