CN104292306B - 一种多肽alkg及其在治疗白血病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽ALKG,其氨基酸序列为Lys‑Phe‑Val‑Cys‑Gly‑Val‑Ser‑Leu‑Cys‑Leu‑Leu‑Gly,分子量为1238.57。本发明还公开了该多肽ALKG在制备白血病药物中的应用。本发明还公开了该多肽ALKG在治疗白血病药物中的应用。本发明多肽ALKG与现有抗肿瘤多肽无同源性,该肽作用于白血病细胞系,能够抑制白血病肿瘤细胞生长并诱导肿瘤细胞凋亡,为广谱、高效、低副作用的靶向性白血病治疗策略提供新的药物候选和物质基础。
Description
技术领域
本发明属于生物化学中的多肽药物技术领域,具体涉及一种多肽ALKG及其在治疗白血病药物中的应用。
背景技术
白血病是一组具有高度异质性的血液系统恶性肿瘤,属于造血干细胞克隆性疾病,白血病细胞失去进一步分化成熟的能力,停滞在细胞发育过程中不同阶段,大量聚集在骨髓和其他造血组织中,并浸润其他组织器官,导致正常造血功能受到抑制,危及正常器官的功能。据统计,我国白血病好发于青少年阶段,其发病率排在青少年肿瘤的第一位。白血病的治疗近年来取得了许多新的进展,但仍然有许多不足之处。不断涌现的新的化疗药物、多药联合化疗及造血干细胞移植的的应用使急性白血病的预后获得了很大改善,但难治性和复发性病例以及患者的耐药性仍缺乏有效的应对策略。近年来,针对白血病细胞生存、增殖等复杂过程中某些环节的靶向治疗成为治疗研究中的一个重要领域,通过小分子靶向药物与化疗药物或其他信号途径抑制剂联合应用,提高患者的CR率和长期生存率成为目前白血病治疗的一个重要方向。
白血病的发生发展与细胞的增殖、周期、凋亡、信号转导等过程中生物大分子间相互作用的异常密切相关。白血病发生、发展相关的基因表达产物及调控因子间的相互作用决定着细胞的命运。多肽类分子由于其靶向性与特异性高、免疫原性低、易于结构的修饰改造等诸多优点,寻找与白血病相关靶点特异性作用的多肽,为白血病的诊断与治疗提供高亲和性和特异性的多肽分子,已成为白血病治疗药物研究的新热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种多肽ALKG,并提供其制备方法和在治疗白血病药物中的应用。
本发明所采用的技术方案是,多肽ALKG,其氨基酸序列为:Lys-Phe-Val-Cys-Gly-Val-Ser-Leu-Cys-Leu-Leu-Gly,分子量为1238.57。
多肽ALKG在制备白血病药物中的应用。
本发明的有益效果是,本发明多肽ALKG与现有抗肿瘤多肽无同源性,该肽作用于白血病细胞系,能够抑制白血病肿瘤细胞生长并诱导肿瘤细胞凋亡,为白血病的靶向性治疗策略提供新的药物候选和物质基础。
附图说明
图1是本发明多肽ALKG的ESI-MS鉴定图,检测到的正离子峰[M+H]+=1238.80(MW=1238.57);
图2是本发明多肽ALKG的RP-HPLC分析图,其保留时间tR=8.803 min,纯度为95.47%;
图3是本发明多肽ALKG抑瘤活性MTT实验HL60与U937细胞时间依赖的生长曲线图;其中,图3-1为HL60细胞时间依赖的生长曲线,图3-2为U937细胞时间依赖的生长曲线,图3-3为正常PBMC细胞时间依赖的生长曲线。横坐标代表处理时间,纵坐标代表处理后细胞存活率。
图4是本发明多肽ALKG诱导白血病细胞系HL60与U937凋亡的流式细胞仪分析图;图4-1、图4-3和图4-5分别为HL60细胞中加入本发明多肽ALKG后24h、36h和48h的凋亡诱导图,图4-7、图4-9和图4-11分别为U937细胞中加入本发明多肽ALKG后24h、36h和48h的凋亡诱导图,图4-2、图4-4和图4-6图分别为对应图4-1、图4-3和图4-5的空白对照组,图4-8、图4-10和图4-12图分别为对应图4-7、图4-9和图4-11的空白对照组。
具体实施方式
本发明多肽ALKG,氨基酸序列为:
Lys-Phe-Val-Cys-Gly-Val-Ser-Leu-Cys-Leu-Leu-Gly(赖氨酸-苯丙氨酸-缬氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-亮氨酸-半胱氨酸-亮氨酸-亮氨酸-甘氨酸),分子式为C56H95N13O14S2,分子量为1238.57。本发明多肽ALKG作用于白血病细胞系,能够抑制白血病肿瘤细胞生长并诱导肿瘤细胞凋亡。
说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义如下:
Lys 赖氨酸
Phe 苯丙氨酸
Val 缬氨酸
Cys 半胱氨酸
Gly 甘氨酸
Ser 丝氨酸
Leu 亮氨酸
Fmoc 9-芴甲氧羰基
MBHA 甲苯氢胺树脂
DCM 二氯甲烷
THF 四氢呋喃
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DIC N,N-二异丙基碳二亚胺
HOBt 1-羟基苯并三唑
DMAP 4-二甲氨基吡啶
MeOH 甲醇
PIP 哌啶
TIS 三异丙基硅烷
TFA 三氟乙酸
CH3CN 乙腈
RP-HPLC 反相高效液相色谱
ESI-MS 电喷雾电离质谱
MTT 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐
实施例1
本实施例采用常规方法Fmoc固相多肽合成法合成本发明多肽ALKG,具体合成步骤如下:
1、第一个氨基酸Fmoc-Gly-OH与Rink Amide MBHA树脂的连接:
步骤1.1、称取2g(1mmol,0.5mol/g)Rink Amide MBHA树脂置于反应器中,加入10ml DCM溶胀树脂,振荡2h之后真空抽滤除去DCM,得到溶胀后的树脂。
步骤1.2、吸取10ml THF与DMF混合液(V:V=11:9)溶解2.5mmol Fmoc-Gly-OH,待溶解后加入3mmol DIC和2.5mmol HOBt,冰浴下搅拌反应30min。然后过滤除去沉淀,将该滤液加入步骤1.1得到的溶胀后的树脂中,再加入0.5mmol DMAP,室温下反应4h。真空抽滤除去反应液得到接合有Gly的树脂,用DMF、DCM、MeOH分别洗涤该接合有Gly的树脂三次,每次3min。
步骤1.3、将4ml无水吡啶、4ml乙酸酐与20ml DMF混合,得到脱Fmoc试剂,将该混合物加入上述步骤1.2得到的接合有Gly的树脂中,反应2h;反应结束后分别用DMF、DCM、MeOH各10ml依次洗涤该得到的树脂,每次3min,真空干燥;再向该树脂中加入10ml PIP与DMF混合液(V:V=1:4),反应20min,脱去Fmoc保护基;最后依次加入10ml DMF、MeOH、DCM分别洗涤树脂三遍,真空抽滤。
2、肽链的延伸:
将2.5mmol Fmoc-Leu-OH和2.5mmol HOBt溶解于10ml THF与DMF(V:V=11:9)混合液中,逐滴加入2.5mmol DIC,20℃下反应1h,过滤去掉沉淀,将所得滤液加入到步骤1得到的树脂中反应。反应进程采用Chloranil方法检测。反应结束后,真空抽滤除去反应液,依次加入10ml的DMF、MeOH和DCM洗涤树脂三遍,真空抽滤。向树脂中加入5ml PIP与DMF混合液(V:V=1:4),反应20min,脱去Fmoc保护基。向反应后的树脂中依次加入10ml DMF、MeOH、DCM洗涤树脂三遍,真空抽滤。
按照缩合Fmoc-Leu-OH的操作步骤,依次缩合其余10个氨基酸(Leu、Cys、Leu、Ser、Val、Gly、Cys、Val、Phe和Lys),得到12肽-树脂。加入DCM洗涤该12肽-树脂,真空干燥过夜。
3、肽树脂的切割及纯化:
将步骤2得到的12肽-树脂置于砂芯反应器中,加入20ml切割试剂(0.5ml H2O,0.5ml TIS,19ml TFA),反应2h。反应完成后,抽滤,旋转蒸发浓缩滤液。向浓缩液中加入100ml冰乙醚,析出沉淀。4℃下,5000rpm下离心10min,然后弃去上清液,真空干燥沉淀即得粗肽产物。
将得到的粗肽溶于水中,冷冻干燥。将干燥后的粗肽溶于水中,10000r/min离心10min,除去沉淀后使用制备级RP-HPLC色谱纯化。
色谱纯化条件:色谱柱(4.6*250mm,VYDAC-C18),流动相A为0.1%TFA/CH3CN,流动相B为0.1%TFA/H2O,检测波长为220nm。洗脱梯度为10-60%A,25min。收集保留时间tR=17.23min处目标峰,冷冻干燥得到本发明ALKG肽纯品。
本发明多肽ALKG还能根据本发明中氨基酸序列,使用其他常规合成法(如采用其他缩合方式的固相合成法、液相合成法、自动多肽合成仪等)合成其全序列。本实施例1不限制本发明多肽ALKG的制备方法。
实施例2
本发明多肽ALKG的质谱鉴定及RP-HPLC分析:
ESI-MS质谱分析:检测方法为正离子检测。实施例1制备的多肽ALKG的检测结果为:[M+H]+=1238.80(多肽ALKG分子量为1238.57)。质谱分析结果符合预测,可以确定产物为多肽ALKG,结果如图1所示。
RP-HPLC分析:取1mg ALKG肽纯化制品,溶解于1ml双蒸水,经直径0.22μm滤膜过滤以备分析。液相分析条件:色谱分析柱(4.6*250mm,phenomenex C18-5);流动相A:0.1%TFAin 100%CH3CN;流动相B:0.1%TFA in 100%H2O,流速:1.0ml/min,检测波长220nm。分析梯度为36-61%A,25min。保留时间tR=8.803min,纯度为95.47%,结果如图2所示。
实施例3
本发明多肽ALKG抑制肿瘤活性实验:
A.MTT实验。
培养白血病细胞系HL60与U937及正常PBMC细胞,待细胞生长至对数期后,分别加入100μM、10μM、1μM、0.1μM本发明多肽ALKG,5%CO2、37℃条件下分别孵育24h、48h、72h,MTT法检测捕获肽对正常细胞与白血病细胞系的生长抑制作用。
如图3所示,本发明多肽ALKG的肿瘤抑制活性随着加药时间的增高而升高,而对正常PBMC细胞没有明显的抑制作用。在100μM时,多肽ALKG对白血病细胞HL60与U937的生长均有明显的抑制作用(P≤0.05)。100μM肽浓度下,多肽ALKG对于HL60的24h、48h、72h肿瘤抑制率分别为46.33%、50.79%、59.75%,对于U937的24h、48h、72h肿瘤抑制率分别为24.3%、60.86%、63.75%,均具有时间依赖性。
B.流式细胞仪检测凋亡。
培养白血病细胞系HL60与U937,待细胞生长至对数期。实验组与对照组分别加入100μM本发明多肽ALKG,5%CO2、37℃条件下孵育,分别于24h、36h、48h收集一次细胞,流式细胞仪检测本发明多肽ALKG对白血病细胞的凋亡诱导效应。
流式细胞仪检测条件,激发波长Ex=488nm,发射波长Em=530nm,Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道(FL1)检测;PI红色荧光通过PI通道(FL3)检测。荧光补偿调节:使用未经凋亡诱导处理的细胞作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。
如图4所示,与对照组相比,100μM肽浓度下,本发明多肽ALKG对于HL60的24h、36h、48h凋亡诱导率分别为:18.2%、29.58%、32.53%,对于U937的24h、36h、48h凋亡诱导率分别为:19.89%、19.92%、25.81%。本发明多肽ALKG对白血病细胞系HL60与U937具有明显的凋亡诱导效应。从图中可以看出,本发明多肽ALKG作用于HL60与U937后,细胞出现了明显的早期凋亡迹象。
以上研究结果表明,本发明多肽ALKG对于白血病细胞系HL60与U937具有明显的肿瘤生长抑制与促凋亡活性,为白血病的分子靶向治疗提供了新的药物候选与物质基础。
Claims (1)
1.一种多肽ALKG,其特征在于,其氨基酸序列为:Lys-Phe-Val-Cys-Gly-Val-Ser-Leu-Cys-Leu-Leu-Gly,分子量为1238.57。
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