CN112430588B - 一种抗新型冠状病毒感染的短肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗新型冠状病毒感染的短肽及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112430588B
CN112430588B CN202011356758.0A CN202011356758A CN112430588B CN 112430588 B CN112430588 B CN 112430588B CN 202011356758 A CN202011356758 A CN 202011356758A CN 112430588 B CN112430588 B CN 112430588B
Authority
CN
China
Prior art keywords
resin
short peptide
amino acid
washing
dmf
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011356758.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112430588A (zh
Inventor
王成
王军平
韩松伶
赵高梅
陈银
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Third Military Medical University TMMU
Original Assignee
Third Military Medical University TMMU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Third Military Medical University TMMU filed Critical Third Military Medical University TMMU
Priority to CN202011356758.0A priority Critical patent/CN112430588B/zh
Publication of CN112430588A publication Critical patent/CN112430588A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112430588B publication Critical patent/CN112430588B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/485—Exopeptidases (3.4.11-3.4.19)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/17—Metallocarboxypeptidases (3.4.17)
    • C12Y304/17023—Angiotensin-converting enzyme 2 (3.4.17.23)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本申请公开了一种抗新型冠状病毒感染的GK‑7短肽，氨基酸序列为GKGDFRI。本发明还公开了GK‑7短肽的制备方法和应用。本发明的GK‑7短肽来源于人体蛋白，含有病毒结合细胞受体的关键残基，制备简易，临床应用前景好。

Description

一种抗新型冠状病毒感染的短肽及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及生物制药和多肽合成技术领域，具体涉及一种抗新型冠状病毒感染的短肽及其制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒引起的肺炎疫情严重威胁人类健康。新冠肺炎患者的临床症状与2003年暴发的非典肺炎相似，主要表现为发热、乏力、干咳，严重患者发病后一周出现呼吸困难，并快速发展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒血症休克、难以纠正的代谢性酸中毒、凝血功能障碍以及多器官功能衰竭。
新冠病毒有外壳包裹的单股正链RNA，编码棘突蛋白(下称S蛋白)、包膜蛋白、膜蛋白以及核蛋白。S蛋白由S1和S2两个亚单位组成。S1蛋白含有与细胞接触的受体结合结构域(RBD)，介导病毒黏附宿主细胞。新冠病毒和非典病毒的S1蛋白序列同源性达76.47％，均利用血管紧张素转化酶2(ACE2)作为细胞受体(Xu,X.et al.Science China Life sciences，2020，63(3):457-460)。新冠病毒主要通过呼吸道进入人体，在人鼻腔定植、复制若干天后才会传播到下呼吸道(Y.J.Hou.et al,Cell,2020,182,429-446)。通过鼻腔给药、雾化、气溶胶等形式局部给予阻断病毒黏附宿主细胞的抑制剂可有效预防、治疗新冠病毒感染。多肽抑制剂制备简易、稳定、副作用小，适合局部使用，是理想的候选药物(L.Cao，et al，Science,2020,eabd9909)。
申请人前期实验证实ACE2受体结合S1蛋白的亲和力高达8.02nM(Wang C.et al,Gastroenterology,2020,159(3):1145-1147)，并据此提出基于ACE2的氨基酸序列进行多肽抑制剂设计和筛选的方案。分析RBD-ACE2复合物的晶体结构可知，ACE2共有20个氨基酸残基参与形成稳定复合物的界面(Jun L.et al,Nature,2020,581(7807):215-220)。这些结合位点具体是：Gln24、Thr27、Phe28、Asp30、Lys31、His34、Glu35、Glu37、Asp38、Tyr41、Gln42、Leu45、Met82、Tyr83、Asn330、Lys353、Gly354、Asp355、Arg357、Arg393，其中有17个位点集中在蛋白的N端螺旋区域。申请人利用固相化学合成法制备了N端螺旋肽(Glu23-Ala46+Gly352-Ile358)，发现具有全长序列的螺旋肽水溶性差、制备成本高，不利于药物开发。利用结构效应关系研究筛选出水溶性好、制备成本低、抗毒效果强的短肽抑制剂有望推进螺旋肽的应用。
综上所述，新冠病毒感染严重威胁人类健康，新型抗病毒药物的研发迫在眉睫。新冠病毒主要通过呼吸道进入人体，鼻腔、肺部局部给予抑制剂可防治病毒感染。鉴于宿主ACE2受体结合病毒的关键位点集中在蛋白的N端螺旋区域，由该区域衍生出的螺旋肽是理想的多肽抑制剂。然而，全长螺旋肽水溶性差、制备成本高。保留关键位点、缩短氨基酸序列长度有望推进ACE2衍生多肽抑制剂的药用开发。
发明内容
本申请的目的在于提供一种便于人工合成、有利于工业化制备生产的抗新冠病毒多肽抑制剂，用以解决现有药物短缺、治疗效果有限的缺陷。
为实现上述目的，本申请提供一种抗新型冠状病毒感染的线性短肽GK-7，该短肽的序列为SEQ ID NO:1GKGDFRI。
本发明还提供了上述GK-7短肽的制备方法，包括以下步骤：
1)树脂活化：
取1g 2-Cl(Trt)-Cl树脂，用二氯甲烷(DCM)浸泡至膨胀，用二甲基甲酰胺(DMF)洗涤；再用DCM洗涤2次；
2)首位氨基酸连接：
加入0.4mmol N-芴甲氧羰基-L-异亮氨酸和16mL DCM、1mL N,N-二异丙基乙胺，反应90-120min；
3)树脂未结合位点封闭：
加入0.5-0.7mL甲醇和1-1.5mL DCM，封闭反应20-30min后，用DMF洗涤2-3次；
4)氨基酸Fmoc基团脱除：
加入8-10mL浓度为20％的哌啶脱除剂脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc)，脱保护时间为20min，然后用DMF洗涤树脂5-6次；取5-10颗2-Cl(Trt)-Cl树脂，加入2-3滴茚三酮溶液，100℃加热至树脂显蓝色，则Fmoc脱除成功；
5)次位氨基酸缩合：
将1.2mmol N-芴甲氧羰基-(2,2,4,6,7-五甲基苯并二氢呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸和1.2mmol 1-羟基苯并三唑溶解在3mL、浓度在0.020～0.24mmol/mL的DMF溶液中，加入1.2mmol N,N’-二异丙基碳二亚胺，活化2-3min后，加入反应器中反应1h；
用工业纯DMF洗涤树脂4次，取5-10颗2-Cl(Trt)-Cl树脂加入茚三酮溶液中，100℃加热2min至树脂显无色，氨基酸缩合完毕；
6)氨基酸依次缩合：
按4)步骤脱除精氨酸Fmoc基团，重复5)步骤，缩合N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸；按照氨基酸顺序再依次缩合N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸、N-芴甲氧羰基-甘氨酸、N-芴甲氧羰基-N'-叔丁氧羰基-L-赖氨酸、N-芴甲氧羰基-甘氨酸；
7)树脂干燥：
最后一个氨基酸N-芴甲氧羰基-甘氨酸缩合完成后，按4)步骤脱除Fmoc基团；用DMF洗涤4-5次,再用甲醇洗涤2-3次，抽干，得到干燥的2-Cl(Trt)-Cl树脂；
8)多肽切割：
将干燥的2-Cl(Trt)-Cl树脂倒入离心管，加入切割液，室温切割1.5h；
9)粗品收集：过滤除去树脂得到滤液，在滤液中加入冰乙醚洗涤离心，得到粗品GK-7肽链沉淀；
10)多肽纯化：液相色谱法纯化步骤9)所得粗品，得到纯品GK-7多肽。
所述茚三酮溶液的浓度为2.5g茚三酮+50mL无水乙醇。
步骤4)所述20％哌啶脱除剂由哌啶和DMF以1：4的体积比混合而成。
步骤8)所述切割液由三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷、1,2-乙二硫醇和超纯水以95：2：2：1的体积比混合而成；优选地，所述切割液：树脂＝10mL：1g。
步骤9)所述冰乙醚的加入量是切割液体积的10倍。
步骤10)中所述液相色谱法中，色谱柱为daisogel色谱填料；流动相A为体积分数为0.1％的TFA水溶液；流动相B由TFA与乙腈混合而成，其中TFA的体积分数为0.1％。
抗新冠病毒组合物，包含上述的GK-7短肽。
所述组合物为GK-7短肽与具有抗新冠性能的多肽或药物组合。
上述的GK-7短肽在制备抗新冠病毒药物中的应用。
本发明具有如下优点：
本发明所述GK-7短肽能够抑制新冠病毒棘突蛋白黏附到敏感细胞表面，以2.96μg/mL的半抑制浓度(IC50)减弱新冠假病毒对高表达病毒受体人胚胎肾细胞(HKE-293T-hACE2)的感染。
本发明所述GK-7短肽含有结合新冠病毒RBD的关键残基Lys353、Gly354、Asp355以及Arg357，能抑制新冠病毒S1蛋白黏附到敏感细胞表面，降低感染率。
本发明所述GK-7短肽仅由7个氨基酸组成，其中4个位点是人ACE2受体结合新冠病毒RBD的关键位点。GK-7能阻断病毒S1蛋白黏附宿主细胞，抗新冠假病毒IC50值低。相比于ACE2的配体结合区域全长螺旋肽，GK-7水溶性好，合成难度和成本大幅降低，药用价值好。
本发明所述GK-7短肽来源于人体蛋白，含有病毒结合细胞受体的关键残基，制备简易，临床应用前景好。
附图说明
图1为GK-7短肽抑制新冠病毒S1蛋白黏附敏感细胞免疫印迹结果。
图2为GK-7短肽抑制新冠病毒S蛋白假病毒感染细胞的结果。
图3为GK-7短肽溶血和细胞毒性结果。
图4为GK-7短肽化学合成纯化后液相色谱和质谱结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本申请，但不用来限制本申请的范围。
下面将更详细地描述本申请的具体实施例。提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本申请，并且能够将本申请的范围完整的传达给本领域的技术人员。
如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
实施例1制备GK-7短肽
1)树脂活化：取1g 2-Cl(Trt)-Cl树脂(康龙生物，常州)放入反应器中，用工业纯二氯甲烷(DCM，天权化工，成都)浸泡至膨胀，工业纯二甲基甲酰胺(DMF，宇硕化工，山东)洗涤1min；再用工业纯DCM洗涤2次，每次1-2min；
2)首位氨基酸连接：向步骤1)所述反应器中加入0.4mmol N-芴甲氧羰基-L-异亮氨酸(吉尔生化，上海)和16mL工业纯DCM、1mL分析纯N,N-二异丙基乙胺(DIEA，阿拉丁生化，上海)，反应90-120min；
3)树脂未结合位点封闭：加入0.5-0.7mL分析纯甲醇(阿拉丁生化)和1-1.5mL工业纯DCM，封闭反应20-30min后，用工业纯DMF洗涤2-3次，每次1-2min；
4)氨基酸Fmoc基团脱除：加入8-10mL浓度为20％的哌啶脱除剂脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc)，脱保护时间为20min，然后用工业纯DMF洗涤树脂5-6次，每次1-2min；取5-10颗2-Cl(Trt)-Cl树脂，加入2-3滴茚三酮溶液(2.5g+50mL无水乙醇，下同；茚三酮购于阿拉丁生化)，100℃加热至树脂显蓝色，则提示Fmoc脱除成功；
所述20％哌啶脱除剂由分析纯哌啶(国药试剂，上海)和工业纯DMF以1：4的体积比混合而成；
5)次位氨基酸缩合：将1.2mmol N-芴甲氧羰基-(2,2,4,6,7-五甲基苯并二氢呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸(吉尔生化)和1.2mmol 1-羟基苯并三唑(HoBt，阿拉丁生化)溶解在3mL、浓度在0.020～0.24mmol/mL的DMF溶液中，加入1.2mmol N,N’-二异丙基碳二亚胺(DIC,阿拉丁生化)，活化2-3min后，加入反应器中反应1h；
用工业纯DMF洗涤树脂4次，取5-10颗2-Cl(Trt)-Cl树脂加入茚三酮溶液中，100℃加热2min至树脂显无色，则提示氨基酸缩合完毕；
6)氨基酸依次缩合：按4)步骤脱除精氨酸Fmoc基团，重复5)步骤，缩合1.2mmol N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸(吉尔生化)。按照氨基酸顺序依次缩合1.2mmol N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸(吉尔生化)、N-芴甲氧羰基-甘氨酸(吉尔生化)、N-芴甲氧羰基-N'-叔丁氧羰基-L-赖氨酸(吉尔生化)、N-芴甲氧羰基-甘氨酸(吉尔生化)。
7)树脂干燥：最后一个氨基酸N-芴甲氧羰基-甘氨酸缩合完成后，按4)步骤脱除Fmoc基团；用DMF洗涤4-5次,再用甲醇洗涤2-3次，每次1-2min，抽干，得到干燥的2-Cl(Trt)-Cl树脂；
8)多肽切割：将干燥的2-Cl(Trt)-Cl树脂倒入离心管，加入切割液，室温切割1.5h；所述切割液由分析纯三氟乙酸(TFA,阿拉丁生化)、分析纯三异丙基硅烷(TIS,阿拉丁生化)、分析纯1,2-乙二硫醇(EDT,阿拉丁生化)和超纯水以95：2：2：1的体积比混合而成；其中切割液：树脂＝10mL：1g。
9)粗品收集：过滤除去树脂得到滤液，在滤液中加入分析纯冰乙醚(川东化工，重庆)洗涤离心，所述冰乙醚的加入量是切割液体积的10倍，得到粗品GK-7肽链沉淀；
10)多肽纯化：液相色谱法纯化步骤9)所得粗品，得到纯品GK-7多肽；
所述液相色谱法中，色谱柱为daisogel色谱填料；流动相A为体积分数为0.1％的TFA水溶液；流动相B由TFA与分析纯乙腈(阿拉丁生化)混合而成，其中TFA的体积分数为0.1％。
实施例2 GK-7短肽抑制新冠病毒S1蛋白免疫印迹实验
(1)细胞培养：人肺泡上皮细胞株A549购自中科院上海细胞库。细胞以含10％胎牛血清(Gibco，ThermoFisher Scientific,上海)的DMEM细胞培养基(Gibco)在37℃、5％CO2条件下培养。
(2)细胞接种：弃培养基，灭菌PBS漂洗两次，加入1mL 0.25％胰酶(Gibco)消化细胞至脱壁。加入5mL培养基，终止胰酶反应，吹打混匀。常温离心，1000rpm，3min，弃上清，去除细胞碎片。以5mL培养基重悬细胞，计数细胞浓度。将细胞接种至灭菌6孔板，每孔1×106CFU。37℃、5％CO2条件下培养细胞至贴壁。
(3)新冠病毒S1蛋白黏附细胞：弃培养基，灭菌PBS漂洗细胞两次，每孔加入2mL不含血清的培养基。分五组进行实验：
1，空白对照；
2，20μg/mL新冠病毒S1蛋白(40591-V08H，义翘神州，北京)；
3-5,20μg/mL S1蛋白+1/10/100μg/mL GK-7(加样前混匀，37℃孵育15min)。细胞与S1蛋白在37℃、5％CO2条件下共孵育1h。
(4)提取总蛋白：弃培养基，灭菌PBS漂洗细胞3次。按(2)方法收集细胞，加入RIPA(P0013B，碧云天，上海)细胞裂解液，获取细胞总蛋白。用BCA试剂盒(P0010，碧云天)测定蛋白浓度。
(5)免疫蛋白印迹：
①SDS-PAGE电泳。
使用碧云天凝胶配制试剂盒(P0012A)，具体步骤如下：
Figure BDA0002802823830000091
②蛋白热变性，PAGE胶每孔加入20μg总蛋白。60V电泳30min，100V电泳1.5h。取出凝胶，裁剪与胶等大小的PVDF膜(0.22μm)，甲醇活化30s，5％醋酸溶液浸泡，平衡15min。
③将转印好的PVDF膜浸泡于5％脱脂奶粉中，37℃恒温摇床内封闭1h。取出PVDF膜，PBST轻轻漂洗1次。膜转移到抗体孵育盒内，与1:200稀释的兔抗S1多抗(40591-T62，义翘神州)共孵育，4℃冰箱过夜。
④取出PVDF膜，用PBST室温条件下漂洗3次，每次30min。按1:2000稀释山羊抗兔WB二抗，转移到杂交袋中。将PVDF膜放置到杂交袋内，于37℃恒温摇床内共孵育1h。碧云天(P0018S)BeyoECL Plus超敏ECL化学发光试剂盒显影，BIO-RAD(加州，美国)ChemiDoc XRS凝胶成像系统采集结果。
如图1所示，GK-7在100μg/mL浓度下明显抑制新冠病毒S1蛋白黏附在A549细胞(富含ACE2受体)表面，是潜在的病毒抑制剂。
实施例3 GK-7短肽抑制新冠病毒假病毒感染实验
(1)按实施例1步骤培养并接种高表达病毒受体的人胚肾细胞株HEK-293T-hACE2(云舟生物，广州)。细胞接种到96孔板，密度为1×104CFU/孔。37℃、5％CO2条件下培养细胞至贴壁。
(2)弃培养基，加入无血清培养基和GK-7，多肽终浓度为100、75、50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39μg/mL。加入装配有psPAX2和荧光素酶报告基因的新冠病毒S蛋白假病毒(擎科生物，北京)，滴度为1×107CFU。阴性对照组不含假病毒，阳性对照组不含GK-7。
(3)GK-7和假病毒在37℃、5％CO2条件下共孵育12h，弃培养基，灭菌PBS洗涤3次，去除未黏附细胞的病毒。换成含10％胎牛血清的培养基继续培养48h。
(4)弃培养基，收集细胞。利用Progema(北京)荧光素酶检测试剂盒(E1910)和Varioskan LUX多功能酶标仪(ThermoFisher Scientific)获取细胞内容物荧光信号。
(5)数据处理：阴性对照组荧光值记FInega，阳性对照组荧光值记FIposi，样本检测荧光值记FIsamp。病毒中和率＝(FIposi-FIsamp)/(FIposi-FInega)×100％。各浓度中和率以Origin8.0作非线性回归分析，计算IC50。
如图2所示，GK-7呈浓度依赖性抑制病毒感染，IC50值为2.96μg/mL。
实施例4 GK-7短肽细胞毒性和溶血实验
(1)细胞毒性评估：按实施例1(1)步骤培养人血管内皮细胞株HUVEC(ATCC，美国)和大鼠肠上皮细胞株IEC-6(购自上海弘顺生物)。按4×104CFU/mL密度将细胞接种于无菌96孔板中，每孔100μL。细胞再次贴壁后，弃上清，更换100μL新鲜培养基，加入GK-7短肽，终浓度为200-3.125μg/mL(两倍倍比稀释)，混匀，继续培养24h。弃上清，每孔加入100μL无血清培养基和10μL CCK-8试剂(Dojindo，上海)。37℃、5％CO2条件下培养1h。酶标仪检测悬液OD450吸光度值。多肽孵育后细胞吸光度计为Apep，对照无处理组吸光度计为Atot。细胞存活率按Apep/Atot×100计算。
(2)溶血性评估：自陆军军医大学实验动物中心购买8周龄雄性BALB/c小鼠，摘眼球取血，快速收集血液至抗凝管。PBS配制多肽浓度至25-200μg/mL(两倍倍比稀释)，吸取100μL多肽或超纯水与100μL全血至灭菌EP管内，移液器吹打混匀，37℃恒温培养箱1h。以3500rpm转速常温离心5min,吸取100μL上清至96孔板内，用酶标仪测定OD405吸光度值。
多肽与红细胞共孵育后的吸光度计为Apep，无药物处理阴性对照组吸光度计为Ablank,超纯水100％溶血吸光度计为Atot。多肽溶血性按(Apep-Ablank)/(Atot-Ablank)×100计算。
如图3所示，作为人体内源性分子ACE2的衍生短肽，GK-7在200μg/mL浓度下溶血率低于1％，不影响测试细胞的存活率；结构简化的GK-7具有优异的生物安全性。
实施例5 GK-7的质检
SHIMADZU高效液相色谱分析纯品GK-7的纯度，分析柱为Inertsil ODS-SP(4.6×250mm×5μm)，进样体积为30μL，流动相A为0.1％TFA/水，B为0.1％TFA/乙腈，流速1mL/min，检测波长220nm。如图4所示，GK-7在16.828min处出峰，纯度达97.023％。SHIMADZU LC-MS2010液相色谱质谱联用仪分析出峰产物的分子量为791.4D，与理论分子量791.9D接近。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本申请作了详尽的描述，但在本申请基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本申请精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本申请要求保护的范围。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学
<120> 一种抗新型冠状病毒感染的短肽及其制备方法和应用
<141> 2020-11-27
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 假单胞菌(Pseudomonas psedomallei)
<400> 1
Gly Lys Gly Asp Phe Arg Ile
1 5

Claims (11)

1.一种抗新型冠状病毒感染的线性短肽GK-7，其特征在于，该短肽的序列如SEQ IDNO:1所述。
2.如权利要求1中所述的短肽的制备方法，其特征在于，包括：
1)树脂活化：
取1g 2-Cl(Trt)-Cl树脂，用二氯甲烷(DCM)浸泡至膨胀，用二甲基甲酰胺(DMF)洗涤；再用DCM洗涤2次；
2)首位氨基酸连接：
加入0.4mmol N-芴甲氧羰基-L-异亮氨酸和16mL DCM、1mL N,N-二异丙基乙胺，反应90-120min；
3)树脂未结合位点封闭：
加入0.5-0.7mL甲醇和1-1.5mL DCM，封闭反应20-30min后，用DMF洗涤2-3次；
4)氨基酸Fmoc基团脱除：
加入8-10mL浓度为20％的哌啶脱除剂脱除9-芴甲氧羰基(Fmoc)，脱保护时间为20min，然后用DMF洗涤树脂5-6次；取5-10颗2-Cl(Trt)-Cl树脂，加入2-3滴茚三酮溶液，100℃加热至树脂显蓝色，则Fmoc脱除成功；
5)次位氨基酸缩合：
将1.2mmol N-芴甲氧羰基-(2,2,4,6,7-五甲基苯并二氢呋喃-5-磺酰基)-L-精氨酸和1.2mmol 1-羟基苯并三唑溶解在3mL、浓度在0.020～0.24mmol/mL的DMF溶液中，加入1.2mmol N,N，-二异丙基碳二亚胺，活化2-3min后，加入反应器中反应1h；
用工业纯DMF洗涤树脂4次，取5-10颗2-Cl(Trt)-Cl树脂加入茚三酮溶液中，100℃加热2min至树脂显无色，氨基酸缩合完毕；
6)氨基酸依次缩合：
按4)步骤脱除精氨酸Fmoc基团，重复5)步骤，缩合N-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸；按照氨基酸顺序再依次缩合N-芴甲氧羰基-L-天冬氨酸、N-芴甲氧羰基-甘氨酸、N-芴甲氧羰基-N'-叔丁氧羰基-L-赖氨酸、N-芴甲氧羰基-甘氨酸；
7)树脂干燥：
最后一个氨基酸N-芴甲氧羰基-甘氨酸缩合完成后，按4)步骤脱除Fmoc基团；用DMF洗涤4-5次,再用甲醇洗涤2-3次，抽干，得到干燥的2-Cl(Trt)-Cl树脂；
8)多肽切割：
将干燥的2-Cl(Trt)-Cl树脂倒入离心管，加入切割液，室温切割1.5h；
9)粗品收集：过滤除去树脂得到滤液，在滤液中加入冰乙醚洗涤离心，得到粗品GK-7肽链沉淀；
10)多肽纯化：液相色谱法纯化步骤9)所得粗品，得到纯品GK-7多肽。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述茚三酮溶液的浓度为2.5g茚三酮+50mL无水乙醇。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤4)所述20％哌啶脱除剂由哌啶和DMF以1：4的体积比混合而成。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤8)所述切割液由三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷、1,2-乙二硫醇和超纯水以95：2：2：1的体积比混合而成。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述切割液：树脂＝10mL：1g。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤9)所述冰乙醚的加入量是切割液体积的10倍。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤10)中所述液相色谱法中，色谱柱为daisogel色谱填料；流动相A为体积分数为0.1％的TFA水溶液；流动相B由TFA与乙腈混合而成，其中TFA的体积分数为0.1％。
9.一种抗新冠病毒组合物，其特征在于，所述抗新冠病毒组合物包含如权利要求1所述的短肽GK-7。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于：所述组合物为短肽GK-7与具有抗新冠性能的多肽或药物组合。
11.如权利要求1所述的短肽GK-7在制备抗新冠病毒药物中的应用。
CN202011356758.0A 2020-11-27 2020-11-27 一种抗新型冠状病毒感染的短肽及其制备方法和应用 Active CN112430588B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011356758.0A CN112430588B (zh) 2020-11-27 2020-11-27 一种抗新型冠状病毒感染的短肽及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011356758.0A CN112430588B (zh) 2020-11-27 2020-11-27 一种抗新型冠状病毒感染的短肽及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112430588A CN112430588A (zh) 2021-03-02
CN112430588B true CN112430588B (zh) 2022-12-30

Family

ID=74698978

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011356758.0A Active CN112430588B (zh) 2020-11-27 2020-11-27 一种抗新型冠状病毒感染的短肽及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112430588B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113755475B (zh) * 2021-10-12 2024-06-11 西南医科大学附属中医医院 一种ace2环肽模拟物及其在抑制新冠假病毒中的用途

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110804091B (zh) * 2019-10-18 2022-07-12 中国人民解放军陆军军医大学 一种人肠道防御素5衍生线性多肽及其制备方法和应用
CN111825750A (zh) * 2020-05-21 2020-10-27 谭骏 Ace2受体保护性合成短肽在新型冠状病毒感染的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112430588A (zh) 2021-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109627293B (zh) 塞尼卡谷病毒结构蛋白抗原表位多肽及其应用
CN111647048B (zh) 干扰多肽在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用
CN112625094B (zh) 一种广谱冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途
WO2021164677A1 (zh) 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂
DK2447367T3 (en) PREVENTED UNTIL PREPARATIONS FOR TREATMENT AND PREVENTION OF IMMUNRATED DISEASES, INCLUDING TREATMENT AND PREVENTION OF INFECTION BY MODULATING NATURAL IMMUNITY
CN111675752A (zh) 一种冠状病毒膜融合抑制剂及其药物用途
CN111647055B (zh) 一种用于新型冠状病毒检测的n蛋白及其制备与应用
CN112430588B (zh) 一种抗新型冠状病毒感染的短肽及其制备方法和应用
CN113599536A (zh) 阻断冠状病毒感染靶细胞的纳米颗粒-rhACE-2复合物、制备方法及其应用
CN106749524B (zh) 一种抗肥胖七肽npvwkrk
CN1285003A (zh) 检测和诊断流感病毒的筛选方法
CN104136455B (zh) 抗hiv‑1多肽及其用途
Axén et al. Small potent ligands to the insulin‐regulated aminopeptidase (IRAP)/AT4 receptor
CN116693622A (zh) 基于Ascaphin的芳香硫醚订书肽类抗肿瘤活性化合物、制备方法及应用
WO2012000459A1 (zh) 抗hiv感染的多肽、组合物以及用途
WO2004094465A2 (en) Synthetic molecules that mimic chemokines
CN113817026A (zh) 靶向刺突蛋白hr1的订书肽、制备方法及抗新型冠状病毒应用
JP7302795B2 (ja) コロナウイルスの感染防御方法
CN106399319B (zh) 一种泽陆蛙基因及其编码的多肽和该多肽的用途
Yuan et al. Identification of Litopenaeus vannamei BiP as a novel cellular attachment protein for white spot syndrome virus by using a biotinylation based affinity chromatography method
CN113621598A (zh) 钙蛋白酶-1在抵抗猪流行性腹泻病毒感染中的应用
CN113444154A (zh) 一种多肽及其在新型冠状病毒检测、抗体或疫苗筛选中的应用
CN109432399A (zh) 用于乙型肝炎的环肽药物及其应用
CN114249799B (zh) 一种抗冠状病毒多肽及其应用
CN111693716B (zh) Spink6在作为检测艾滋病的标志物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant