CN109432399A - 用于乙型肝炎的环肽药物及其应用 - Google Patents

用于乙型肝炎的环肽药物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109432399A
CN109432399A CN201811615497.2A CN201811615497A CN109432399A CN 109432399 A CN109432399 A CN 109432399A CN 201811615497 A CN201811615497 A CN 201811615497A CN 109432399 A CN109432399 A CN 109432399A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptide
drug
cyclic peptide
hepatitis
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811615497.2A
Other languages
English (en)
Inventor
张华堂
赵中华
唐雨微
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chongqing Academy of Science and Technology
Original Assignee
Chongqing Academy of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chongqing Academy of Science and Technology filed Critical Chongqing Academy of Science and Technology
Priority to CN201811615497.2A priority Critical patent/CN109432399A/zh
Publication of CN109432399A publication Critical patent/CN109432399A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/12—Cyclic peptides, e.g. bacitracins; Polymyxins; Gramicidins S, C; Tyrocidins A, B or C
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于乙型肝炎的环肽药物及其在制备治疗乙型肝炎的药物中的应用，所述环肽为C‑peptide‑1或者C‑peptide‑2或者C‑peptide‑3，C‑peptide‑1的氨基酸序列为KRRRRRRRAAAA，其中K采用FITC修饰；C‑peptide‑2的氨基酸序列为KRRRRD/RRRAAAA，其中K采用FITC修饰；C‑peptide‑3的氨基酸序列为KRRRRRRPAAAA，其中K采用FITC修饰；三个环肽药物是首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环得到的。本发明环肽药物具有一定的抑制HBsAg、HBeAg、HBV rcDNA和HBV cccDNA的效果。

Description

用于乙型肝炎的环肽药物及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种用于乙型肝炎的环肽药物及其应用。
背景技术
据世界卫生组织统计，目前，全球约有2.4亿人患有由乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染导致的慢性乙肝，其中绝大部分分布在低、中收入国家，每年约有65万人死于慢性乙型肝炎感染所导致的肝纤维化，肝硬化和肝癌。在我国，慢性乙型肝炎是威胁人民身体健康的主要疾病之一，乙肝表面抗原携带率约占人口总数的7.18％，据此推算，有慢性乙肝感染者约9300万人，其中慢性乙肝患者约2000万人，有约700万慢性乙型肝炎患者已经进展至肝纤维化和肝硬化阶段。虽然在HBV预防性疫苗广泛使用后，乙肝病毒新发感染率有了显著下降，但是针对已经建立慢性感染的乙肝患者，目前为止，仍旧缺乏有效的治疗策略。
目前美国食品和药品监督管理局(FDA)已经批准用于慢性乙肝病毒治疗的药物分为两类：一类是免疫调节剂，包括干扰素α(IFN-α)和聚乙二醇干扰素α(Peg-IFN-α)；另一类是核苷类似物和核苷酸类似物前体药。治疗乙肝的最终目的是消除核内cccDNA，或者抑制cccDNA的转录活性。干扰素治疗效果持久并且有较高的病毒表面抗原清除率，最近研究表明其具有降解cccDNA的作用，但其应答率低且副作用大，例如有流行性感冒症状出现、易疲劳、嗜中性白血球减少症、血小板减少症和精神不振。核苷类似物直接作用于病毒逆转录酶，阻断乙肝病毒复制，缺点是疗程漫长，需要终身治疗，因为核苷类似物是在胞质环境中抑制乙肝病毒复制，对核内cccDNA库没有影响。
多肽药物具有适应证广、安全性高、疗效显著、易于合成改造和优化组合、用药量更少、特异性更好、作用效果更好、一般没有副作用或者副作用很小等特点，且生物技术与多肽合成技术的日臻成熟，以及新药研发的不断深入，多肽类药物从如鲑鱼降钙素、生长抑素、人高血糖素、缩宫素等为主的多肽类激素已经发展到疾病防治的各个领域，越来越多的用于肿瘤、肝炎、糖尿病、艾滋病、代谢紊乱等疾病的预防、诊断和治疗。目前，总的来说，全球药物市场上有大约60～70种多肽药物，有200～300种多肽药物在临床试验中，有500～600种正在临床前试验中，更多的多肽药物在实验室研究阶段。但由于多肽半衰期一般很短，不稳定，因为易被降解和难穿越肠黏膜而不能口服。
发明内容
本发明的目的针对上述问题提供一种用于乙型肝炎的环肽药物。
本发明实现其目的采用的技术方案是：
一种用于乙型肝炎的环肽药物，所述环肽为C-peptide-1或者C-peptide-2或者C-peptide-3，C-peptide-1的氨基酸序列为KRRRRRRRAAAA，其中K采用FITC修饰；C-peptide-2的氨基酸序列为KRRRRD/RRRAAAA，其中K采用FITC修饰；C-peptide-3的氨基酸序列为KRRRRRRPAAAA，其中K采用FITC修饰；三个环肽药物是首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环得到的。
所述环肽药物包括上述的环肽及药学上可接受的辅料。
该多肽药物为任何药物治疗学上可接受的的剂型。
本发明还提供上述环肽药物在制备治疗乙型肝炎的药物中的应用。
本发明的有益效果是：本发明环肽具有较大的表面积，从而使其与靶点蛋白间具有高度亲和力及识别特异性；大环结构构象灵活性的限制也降低了药物与靶点结合的熵值，提高了结合的稳定性；氨基酸组成特点据定了环肽类化合物往往具有极低的、甚至没有细胞毒性；本发明环肽很容易通过自动化的化学合成流程实现生产，并且便于进行各项修饰、处理及监控。检测结果显示，环肽药物具有一定的抑制HBsAg、HBeAg、HBV rcDNA和HBVcccDNA的效果。
附图说明
图1为C-peptide-3的质谱图。
图2为C-peptide-3的色谱图。
图3是本发明环肽药物的10min、2h、20h的高内涵荧光图像。
图4是不同浓度的环肽药物C-peptide-3处理HepG2.2.15细胞6d后的HBsAg、HBeAg表达情况。
图5是不同浓度的环肽药物C-peptide-3处理HepG2.2.15细胞6d后的HBV rcDNA和cccDNA表达情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
主要试剂及生产者：
fmoc-Ala-oh(Sigma-Aldrich公司，美国)
dde-lys(fmoc)-oh(吉尔生化(上海)有限公司，中国)
实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1环肽药物的设计和制备
首先，由于环状结构导致的构象变化限制，环肽类化合物一般具有较大的表面积，从而使其与靶点蛋白间具有高度亲和力及识别特异性，大环结构构象灵活性的限制也降低了药物与靶点结合的熵值，提高了结合的稳定性；其次，氨基酸组成特点决定了环肽类化合物往往具有极低的、甚至没有细胞毒性；第三，环肽类化合物很容易通过自动化的化学合成流程实现生产，并且便于进行各项修饰、处理及监控。
设计研发的三个环肽药物C-peptide-1、C-peptide-2、C-peptide-3，序列如下：
C-peptide-1：KRRRRRRRAAAA，其中K采用FITC修饰，
C-peptide-2：KRRRRD/RRRAAAA，其中K采用FITC修饰，其中D/R是D型氨基酸，比L型的R更容易折叠。
C-peptide-3：KRRRRRRPAAAA，其中K采用FITC修饰。
三个环肽药物是首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环得到的。
在上述环肽序列中，氨基酸采用的是单字母缩写，本发明中氨基酸缩写如表1所示：
表1氨基酸三字母和单字母缩写表
设计原理：
1)一般多肽合成有固相合成和液相合成，本申请采用固液结合的方法来做，只用一种方法技术上行不通；多肽序列：C-peptide-11mg>95％；
2)r是D型氨基酸，比L型的R更容易折叠，所以我们把其中一个R换成r；多肽序列：C-peptide-21mg>95％；
3)P是刚性氨基酸可以使肽链转变方向，可以更容易形成环，所以我们把其中一个R换成P；多肽序列：C-peptide-31mg>95％。
树脂:0.5g，取代度sd＝0.3，反应器：20cm*15mm
氨基酸量：0.5g*0.3mmol/g*＝0.15mmol
第一个氨基酸1.3倍投料，第一个氨基酸之后三倍投料，具体步骤为：
(1)称取2-cl树脂0.5g，加入反应器中用DCM(4ml)浸泡5min，用DMF(4ml)洗涤2次，第三次用DCM洗涤一次(勿抽太干)，加入46.65mg fmoc-Ala-oh，加入6ml DCM，0.2ml DIEA，反应90min，DCM易挥发，反应的时候可补加DCM。
(2)90min后补加0.5ml分析甲醇，1ml DCM，封闭反应20min。
(3)用DMF洗涤4次，加入哌啶(20％哌啶+80％DMF)，脱除fmoc，20min。用DMF洗涤树脂5次，取少量树脂(10-20粒)加入检测管中，加入茚三酮(5g/100ml分析乙醇)2滴，吡啶2滴,100℃加热2min，显色即可。
(4)称取下一个氨基酸fmoc-Ala-oh(3倍)+HOBT(3倍)，加入反应器中，倒入5mlDMF，在加入0.2mml DIC反应1h之后用DMF洗涤4次，取少量树脂检测，无色即可。
(5)最后一个氨基酸采用dde-lys(fmoc)-oh,重复步骤(3)、(4)直到肽链偶联结束，脱除fmoc，偶联FITC后再脱除DDE(2％水合肼)，然后甲醇抽干。
(6)把树脂放在50ml离心管中，加20ml切割液(20％TFE+80％DCM)，切割4小时。然后过滤得到切割液，旋蒸之后用冻干机冻干得到全保护肽。
(7)用DCM溶解50mg多肽(1mg/5ml)，加入用1ML DMF溶解的HOBT(多肽三倍量)摇匀，再逐滴加入3倍量DIC，过夜环化后旋蒸冻干得到粗品肽。
(8)把粗品肽用HPLC纯化到95％纯度，然后把液体冻干就得到粗品肽，并进行MS检测。
检测结果显示，C-peptide-1的产物纯度达到98％，C-peptide-2的产物纯度达到97％，C-peptide-3的纯度达到98％。C-peptide-3的质谱图如图1所示，其色谱图如图2所示。
实施例2环肽药物可穿透进入细胞实验
按照如下步骤操作：
(1)将培养瓶中培养的HepG2.2.15细胞，倒掉培养基，用PBS洗涤1-2遍，加入胰酶进行消化1-2min，加入含10％血清的1640培养基2mL终止反应，收集细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清，溶于1mL培养基，取20ul于血球计数板进行计数。
(2)将2D4细胞稀释至5×104个/mL，在96孔板中分别铺板6孔，200uL/孔(即1×104/孔)，置于37度、5％CO2培养箱中进行培养。
(3)1d后加入含10ug/mL Hoechst33342染色液的100uL培养基进行细胞核染色处理，置于培养箱染色20-30min，弃染色液，用PBS或培养液洗涤2-3次。
(4)进行加药处理，加入浓度为1mM的FITC-AAAA、FITC-RRRRRRR、FITC-RRRRRRRAAAA、C-peptide-1、C-peptide-2、C-peptide-36种多肽药物处理，对照(control)是不加药物为对照。
(5)用MD观察荧光标记药物进入细胞情况，加药后10min，2h，20h进行高内涵图像采集。检测结果如图3所示，图中，FITC-T4即FITC-AAAA，FITC-R7即FITC-RRRRRRR，FITC-R7-T4即FITC-RRRRRRRAAAA，从图3可见环化后的环肽药物仍然能够作为载体穿透进入肝癌细胞系HepG2.2.15，其中C-peptide-2和C-peptide-3的穿透效果更好。
实施例3环肽药物的效果实验
按照如下步骤操作：
(1)将培养瓶中培养的HepG2.2.15细胞，倒掉培养基，用PBS洗涤1-2遍，加入胰酶进行消化1-2min，加入含血清的培养基2mL终止反应，收集细胞悬液，1000rpm离心5min，弃上清，溶于1mL培养基，取20ul与血球计数板进行计数。
(2)将2D4细胞稀释至5×104个/mL，在96孔板中铺板18孔，200uL/孔(即1×104/孔)，置于37度、5％CO2培养箱中进行培养。
(3)1d后分别加入10um、5um、2um、1um、0.2um和0um浓度的C-peptide-3药物进行处理，每个药物浓度3个复孔。
(4)在加药处理后3d换液，在加药处理后6d收集上清和细胞。
(5)用乙型肝炎表面抗原、e抗原ELISA检测试剂盒进行HBsAg、HBeAg检测，用直接定量PCR试剂盒对第6天的细胞样本进行HBV DNA、cccDNA检测，评价不同浓度药物的处理效果。
检测结果如图4、5所示：说明C-peptide-3具有一定的抑制HBsAg、HBeAg、HBVrcDNA和HBV cccDNA的效果。

Claims (4)

1.一种用于乙型肝炎的环肽药物，其特征在于：所述环肽为C-peptide-1或者C-peptide-2或者C-peptide-3，C-peptide-1的氨基酸序列为KRRRRRRRAAAA，其中K采用FITC修饰；C-peptide-2的氨基酸序列为KRRRRD/RRRAAAA，其中K采用FITC修饰；C-peptide-3的氨基酸序列为KRRRRRRPAAAA，其中K采用FITC修饰；三个环肽药物是首尾氨基酸的氨基与羧基形成酰胺键成环得到的。
2.如权利要求1所述的用于乙型肝炎的环肽药物，其特征在于：包括权利要求1所述的环肽及药学上可接受的辅料。
3.如权利要求1所述的用于乙型肝炎的环肽药物，其特征在于：该多肽药物为任何药物治疗学上可接受的的剂型。
4.如权利要求1所述的环肽药物在制备治疗乙型肝炎的药物中的应用。
CN201811615497.2A 2018-12-27 2018-12-27 用于乙型肝炎的环肽药物及其应用 Pending CN109432399A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811615497.2A CN109432399A (zh) 2018-12-27 2018-12-27 用于乙型肝炎的环肽药物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811615497.2A CN109432399A (zh) 2018-12-27 2018-12-27 用于乙型肝炎的环肽药物及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN109432399A true CN109432399A (zh) 2019-03-08

Family

ID=65540349

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811615497.2A Pending CN109432399A (zh) 2018-12-27 2018-12-27 用于乙型肝炎的环肽药物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109432399A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023061487A1 (zh) * 2021-10-14 2023-04-20 浙江大学 一种抑制trpm8的多肽及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102775470A (zh) * 2011-05-12 2012-11-14 复旦大学 一种抑制人乙型肝炎病毒感染的短肽及其应用
CN103980348A (zh) * 2014-05-26 2014-08-13 重庆市科学技术研究院 一种用于诊断和治疗乙型肝炎的短肽及其应用
CN107109403A (zh) * 2014-12-22 2017-08-29 莫佛塞斯公司 在噬菌体颗粒上展示环肽的新方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102775470A (zh) * 2011-05-12 2012-11-14 复旦大学 一种抑制人乙型肝炎病毒感染的短肽及其应用
CN103980348A (zh) * 2014-05-26 2014-08-13 重庆市科学技术研究院 一种用于诊断和治疗乙型肝炎的短肽及其应用
CN107109403A (zh) * 2014-12-22 2017-08-29 莫佛塞斯公司 在噬菌体颗粒上展示环肽的新方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023061487A1 (zh) * 2021-10-14 2023-04-20 浙江大学 一种抑制trpm8的多肽及其用途

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107335049B (zh) 菊科类型环肽化合物作为cGAS-STING信号通路抑制剂的应用
US20080260820A1 (en) Oral dosage formulations of protease-resistant polypeptides
US20050037430A1 (en) Methods and uses for protein breakdown products
CN113929761B (zh) 新型生长激素释放激素类似肽改构和二聚体化制备及其应用
CN114644683B (zh) 促进肝细胞增殖和/或抑制肝细胞凋亡的多肽及其用途
US20090227505A1 (en) Methods and uses for protein breakdown products
CN111303245B (zh) 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂
CN109432399A (zh) 用于乙型肝炎的环肽药物及其应用
CN102816215B (zh) 抑制hiv的短小多肽及药物用途
CN110713521B (zh) 多肽cak18n及其促进肝再生和抑制肝细胞凋亡的用途
CN112430588B (zh) 一种抗新型冠状病毒感染的短肽及其制备方法和应用
CN101280012B (zh) Exendin-4新活性异构体及其应用
RU2317097C2 (ru) Гетерокарпин, белок растительного происхождения, обладающий противораковыми свойствами
CN117069796A (zh) 一种用于降低血糖的多肽
CN100417662C (zh) 无指盘臭蛙胰岛素释放促进肽和在制药中的应用
CN110063960B (zh) 3-氢化松苓酸b氰甲酯的制药用途
WO2007054030A1 (fr) Modifications polyethylene glycole de thymosine alpha-1
CN113304165A (zh) 单体化合物Ciliatoside A在制备乙型肝炎治疗药物中的用途
RU2305683C2 (ru) Протеин из растения pilocarpus heterophyllus - антагонист действия человеческого рилизинг-фактора гормона роста (ghrh), применение протеина для получения лекарственного средства (варианты), лекарственное средство (варианты), фармацевтическая композиция для противодействия эффектам ghrh, моноклональное антитело и способ выделения протеина (варианты)
CN101618211A (zh) 一种乙肝多肽疫苗及其应用
CN111105845A (zh) 一种基于蛋白折叠指纹条形码设计降血压肽的制备
CN115960258B (zh) 一类GLP-1/glucagon/Y2受体三重激动剂及其应用
CN108101960A (zh) 一种具有ace抑制活性和抗肿瘤的多肽分子及其制备方法
CN113388025B (zh) 多肽、组合物及其应用
CN115572321A (zh) 一种酵母肽及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190308

RJ01 Rejection of invention patent application after publication