CN107109403A - 在噬菌体颗粒上展示环肽的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在噬菌体颗粒及其收集物的表面上展示环肽的方法。
Description
发明领域
本发明涉及在噬菌体外被蛋白的C-端处在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的方法。
背景技术
环肽是采取环状环结构的多肽，已知其具有多种生物活性，例如抗菌活性、免疫抑制活性或抗肿瘤活性。若干种在天然界发现的环肽被用于临床，例如抗菌剂短杆菌肽S、短杆菌酪肽和万古霉素，或者具有免疫抑制活性的环孢霉素A。受具有生物活性的天然环肽的启发，已经着力于用遗传和合成方法开发人工环肽。
一类新兴的具有环状结构的生物分子是核糖体合成的肽，其要求广泛的翻译后修饰来形成生物活性肽。大部分核糖体合成的天然肽被翻译成由前导肽和核心肽组成的前体。前导用作识别序列，并募集酶体系(enzymatic machinery)，以在核心肽的特定残基处安装翻译后修饰(PTM)。
因此，翻译后修饰例如杂环化或大环化、脱水、乙酰化、糖基化、卤化、异戊烯化和差向异构化，不仅使这些肽形成生物活性，而且直接有助于该类肽的许多代表性成员中发现的优异稳定性，因此使其成为药物开发有吸引力的候选物。
羊毛硫肽(lanthipeptides)和羊毛硫抗生素形成一类独特的核糖体合成的翻译后修饰抗生素肽，其由革兰氏阳性细菌产生，并主要对其发挥作用(综述参见Knerr和vander Donk,Annu.Rev.Biochem.2012.81:479-505)。天然羊毛硫抗生素例如乳酸链球菌素(nisin)或枯草菌素(stbtilin)已经深入研究，并在商业上用于食品工业用于制造并存储乳制品例如奶酪。
作为具有抗微生物活性的肽的子类，羊毛硫肽和羊毛硫抗生素含有由硫醚氨基酸羊毛硫氨酸(Lan)和3-甲基羊毛硫氨酸(MeLan)形成的分子内硫醚-桥或环，其保护这些肽不受蛋白水解降解，并使其热稳定性增加。硫醚-桥的安装始于丝氨酸或苏氨酸分别酶脱水成不饱和脱氢丙氨酸(Dha)和脱氢氨基丁酸(Dhb)，之后进行半胱氨酸硫醇的分子内迈克尔加成，并通过羊毛硫肽合成酶介导(I类为LanB和LanC，II类为LanM，III类为LanKC，IV类为LanL)。在I类羊毛硫肽中，丝氨酸/苏氨酸脱水和随后的环化分别通过LanB型脱水酶和LanC型环化酶进行，而在II类羊毛硫肽中，单一的双功能LanM型酶进行两种反应。有趣的是，不饱和Dha具有很高的化学反应性，可以在弱碱性条件下很容易与半胱氨酸或赖氨酸的侧基反应，分别产生非立体选择性硫醚-桥和赖丙氨酸-桥。III类和IV类羊毛硫肽的生物合成分别由多功能LanKC和LanL型酶支持，其特征在于氨基端的磷-Ser/磷-Thr裂解酶结构域、中心的类似于激酶的结构域和羧基端的类似于LanC的结构域(环化酶)(van der Don等人2014Current Opinion in Structural Biology 2014,29:58-66)。
过去数年间，羊毛硫肽生物合成的原理越来越多地适应于具有环状结构的人工生物活性肽的发现和产生。
在2004年首次提出羊毛硫肽合成酶可以有利地用于将PTM(例如硫醚-桥)引入到正常未修饰的肽中，以提高肽的稳定性和/或改变其活性(Kuipers等人2004.J.Biol.Chem.279,22176-22182)。在WO2006/062398中，已经显示所关注的肽可以在宿主细胞中通过并非常规羊毛硫抗生素酶复合物一部分的分离的羊毛硫抗生素脱水酶(例如LanB)得以脱水。经进一步说明，经修饰的含有硫醚-桥的肽可以被其天然宿主中除专用羊毛硫抗生素转运蛋白以外的蛋白质输出系统分泌。
后来，在WO2012/005578中，说明含有硫醚-桥的多肽可以很容易地由表达羊毛硫抗生素的生物合成和输出机制的宿主细胞(例如乳酸链球菌Lactococcus lactis)的表面产生，并在其上展示。
更具体地，WO2012/005578提供了一种表达载体，其编码包括N-端羊毛硫抗生素前导序列、受关注的要被翻译后修饰成含有脱氢残基或硫醚的多肽和C-端带电膜锚定结构域的融合肽。另外提出了筛选具有所需活性的环肽的展示文库。但是，仅能够在天然地能够产生羊毛硫抗生素的革兰氏阳性宿主细胞特别是乳酸细菌上展示。
其他本领域已知的展示系统例如要求蛋白质输出机制不同的革兰氏阴性细菌的噬菌体展示并不视作是可供选择者，因此在现有技术中不可行。
噬菌体展示的历史基于以下论证始于1985年：丝状噬菌体耐受插入到其基因III蛋白质(pIII)中的外来蛋白质片段，并且还在噬菌体表面上呈现蛋白质片段(Smith,1985)。Ladner将该概念扩展至噬菌体表面上展示的(多)肽和/或蛋白质所有组成成分(repertoires)的筛选(WO1988/06630；WO1990/02809)，自此以后，噬菌体展示经历了迅猛发展，并导致大量成就。已经开发出许多种构建并筛选(多)肽/蛋白质噬菌体-展示库的形式，大量的综述性文章和专著涉及并总结了这些发展(例如，Kay等人,1996；Dunn,1996；McGregor,1996)。为了将肽或蛋白质锚定在丝状噬菌体表面上，主要使用与噬菌体外被蛋白的基因融合。优选与基因III蛋白质(Parmley&Smith,1988)或其片段(Bass等人,1990)和基因VIII蛋白质(Greenwood等人,1991)融合。在一情形中，使用基因VI(Jespers等人,1995)，最近，使用基因VII和基因IX的组合用于展示Fv片段(Gao等人,1999)。
迄今，仅有线性(多)肽和经过二硫键稳定化的环肽在噬菌体上得以成功展示(参见WO2000/077194、WO2009/098450)。最近地，在WO2012/019928中，在噬菌体上展示了与pIII的N-端融合的Microvividrin K的线性前体。展示的线性前体的翻译后修饰通过随后将噬菌体与含有同源(cognate)修饰酶的细胞溶解产物一起孵育实现。但是，WO2012/019928没有提供羊毛硫肽展示的充分公开，并且也没有教导在噬菌体组装之前经历翻译后修饰的肽的展示。
因此，对于将翻译后修饰的环肽的展示从细菌翻译为经典的噬菌体展示存在需求。
发明内容
在现有技术中，含有硫醚-桥的肽的展示已经成功阐释。但是，使用细菌用于展示伴随有显著缺点。例如，就电穿孔而言，革兰氏阳性细菌例如乳酸乳球菌(L.lactis)的转化效率降低，并具有凝集倾向，这使其难以处理并导致不稳定。因此，通过乳酸乳球菌展示的文库多样性不能超过超过～106，而典型的噬菌体展示文库已知具有大于1012个不同的克隆。
因此，本公开内容的技术问题是要开发能够使环肽在噬菌体颗粒上呈现的简单、可靠的系统。通过提供特征如本文所述的实施方式，实现该技术问题的解决方案。本公开内容将环肽与噬菌体外被蛋白的C-端连接，使得能够在噬菌体颗粒上展示所述环肽。因此，C-端噬菌体展示显示用于在pVIII上(Held等人,2004&Weiss等人,2000)以及另外在pIII外被蛋白上(Fuh等人,2000)的线性肽，但没有论及或提出环肽或经过噬菌体外被蛋白C-端翻译后修饰的肽的展示。通常，常规的噬菌体展示使用噬菌体外被蛋白的N-端用于展示，并且没有预计环肽可以仅通过噬菌体外被蛋白的C-端得以有效展示。
更具体地，本公开内容包括一种在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的方法，其包括以下步骤：
(a)提供带有编码前体环肽的核酸序列的宿主细胞；
(b)引起或允许所述前体环肽的表达；
(c)使前体环肽内的一个或多个氨基酸残基酶脱水；
(d)通过使一个或多个脱水的残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联，形成一个或多个分子内键，从而形成环肽；和
(e)在所述宿主细胞中产生噬菌体颗粒，其中所述噬菌体颗粒在表面上展示所述环肽，并且其中所述环肽与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接。
一方面，环肽包括通过将一个或多个脱水的残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联形成的分子内键。另一方面，环肽包括通过将一个或多个脱水的残基与半胱氨酸残基或赖氨酸残基偶联形成的分子内键。另一方面，环肽包括通过将一个或多个脱水的氨基酸残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联形成的分子内键。
因此，本公开内容使得可以在噬菌体上呈现环肽。本公开内容的技术方法，即将环肽与噬菌体外被蛋白的C-端连接在现有技术中没有提供或提出。
因此，本公开内容涉及用于在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的方法，其中所述环肽与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接。此外，本公开方法使得可以产生并筛选展示在噬菌体颗粒表面上的环肽的大的文库。
在许多情形中，使用该方法呈现环肽是有利的。要求保护的展示包括环肽的文库的方法具有实用性。
而且，包括通过使用要求保护的方法展示的环肽的文库具有实用性。这样的文库包括范围很广的环肽，其可以针对所关注的靶标进行筛选。
使用所公开的方法使得可以在肽中基本上任意所需的位置处引入分子内键。特别关注的是具有生物活性的肽，例如意在用于治疗用途的肽，因为引入一个或多个分子内键通常增加了肽的生物稳定性。而且，可以使用环结构改变肽的生物活性，例如，抗原特异性、受体结合亲合力、抗微生物活性或酶特异性。例如，所关注的肽是激动性肽(agonisticpeptide)、拮抗性肽、酰胺化肽、激素、酶抑制剂、酶激活剂、受体配体、抑制性肽、羊毛硫抗生素蛋白质、病毒蛋白质、真核生物蛋白质、其突变体(例如，具体设计成可以在某一位点处进行修饰)、模拟物、同源物或与其相当的功能片段。该方法可以用于识别治疗相关和治疗活性的基于环肽的分子，或者可以用于表征这些分子。
附图说明
图1：Xa因子-切割报道基因检验证实了大肠杆菌(E.coli)中表达的环肽的修饰状态
使用基于ELISA的Xa因子-切割报道基因检验，在存在或不存在修饰NisB/NisC酶的共表达的情况下，在大肠杆菌细胞溶解产物中评价带有NisA-前导序列的可溶表达肽的修饰状态。尽管在不存在NisB/NisC共表达的情况下(无Lan-酶)，产生的含有ASWIEGRWCN-基序的肽(SEQ-ID.:1；加下划线的Xa因子识别序列)几乎被Xa因子完全切割，NisB/NisC的共表达导致酶促将硫醚-桥从脱氢丙氨酸(脱水丝氨酸)引入到半胱氨酸以及Xa因子-切割抗性(左图)。即使在NisB/NisC共表达的存在下，将丝氨酸(中图)或半胱氨酸(右图)残基突变成丙氨酸防止了硫醚-桥的酶形成，并使得肽对Xa因子敏感。从三组独立产生的细胞溶解产物，计算相对于未处理样品(w/o Xa)的Xa因子抗性(信号保留[％])。
图2.含有NisA-前导的前体肽与pIII C-端的融合物是酶环化(形成硫醚-桥)的底物，并随后展示在噬菌体颗粒上
(A)使用将具有ASWIEGRWCN-基序的含有NisA-前导序列的相同肽(SEQ-ID.:1)与pIII的C-端或N-端融合的噬菌粒，产生噬菌体颗粒，并进行Xa因子-切割报道基因检验。在NisB/NisC共表达的存在下产生、并在噬菌体上展示的C-端融合物对Xa因子-切割具有很大的抗性，表明了生产细胞中的酶修饰以及随后并入到噬菌体颗粒中(左图)。相反地，即使在NisB/NisC共表达的存在下产生，噬菌体上展示的相同肽的N-端融合物也对Xa因子敏感(右图)。(B)即使在NisB/NisC共表达的存在下，在C-端pIII融合物中心肽中将丝氨酸(左图)或半胱氨酸(右图)残基突变成丙氨酸，也防止了酶促硫醚-桥的形成，并使展示的肽对Xa因子敏感。从三组独立产生的噬菌体样品，计算相对于未处理样品(w/o Xa)的Xa因子抗性(信号保留[％])。(C)产生与麦芽糖结合蛋白(MBP)的C-端或N-端融合的表达含有(A)中所示的NisA-前导序列的相同前体肽的大肠杆菌菌株的细胞溶解产物，并对其进行Xa因子-切割报道基因检验。当在NisB/NisC共表达的存在下产生时，前体肽与MBP C-端的融合物对Xa因子-切割的抗性很大，证实了酶修饰。在不存在NisB/NisC共表达的情况下，检测不到相同的肽融合物(n.d.)，这可能说明有迅速的转换(左图)。无论有没有NisB/NisC共表达，前体肽与MBP的N-端融合物累积至高的水平，但不能被酶修饰，如Xa因子-切割检验所判断(右图)。结果表明，前体肽与载体蛋白C-端的融合是广泛适用的，并与N-端融合相反，其通过酶机制支持有效的修饰。
图3.含有ProcA-前导的前体肽与pIII C-端的融合物是酶环化(形成硫醚-桥)的底物，并随后在噬菌体颗粒上展示
使用将具有ASWIEGRWCN-基序的含有ProcA-前导的肽(SEQ-ID.:1；S/C；或关联物T/C和S/A衍生物)与pIII C-端融合的噬菌粒产生噬菌体颗粒，并对其进行Xa因子-切割报道基因检验。在ProcM酶共表达的存在下产生的含有S/C(左图)或T/C(右图)残基的C-端肽融合物表现出对Xa因子-切割的抗性，表明分别由脱氢丙氨酸(S/C)和脱氢氨基丁酸(T/C)酶促形成硫醚-桥，并且随后并入到噬菌体颗粒中。相反地，具有S/A残基的融合物不是形成硫醚的底物，即使在ProcM的存在下产生也保持对Xa敏感(右图)。从三组独立产生的噬菌体样品，计算相对于未处理样品(w/o Xa)的Xa因子抗性(信号保留[％])。
图4：肠杆菌(Enterobacteria)噬菌体M13g3p(pIII)和g8p(pVIII)蛋白质的野生型氨基酸序列
提供pIII(SEQ-ID.:2；UniProt-ID:P69168)和pVIII(SEQ-ID.:3；UniProt-ID:P69541)蛋白质的序列，信号肽(黑体)和跨膜结构域序列(黑体，下划线)突出显示。
图5：在pIII C端上含有NisA-和ProcA-前导序列并且环大小可变的肽融合物的酶环化(形成硫醚-桥)和噬菌体展示
(A)使用将分别具有ASWIEGRECN-(SEQ-ID.:11)、ASWAAIEGRAECN-(SEQ-ID.:12)、ASWAAAIEGRAAAECN-(SEQ-ID.:13)或ASWAAGAAIEGRAAGAAECN-基序(SEQ-ID.:14)的含有NisA-前导的肽(分别为构建物i,i+7、I,i+10、i,i+13和i,i+17；Xa因子切割位点加下划线)与pIII C-端融合的噬菌粒，产生噬菌体颗粒，并进行Xa因子-切割报道基因检验。不在NisB/C酶共表达的存在下产生的C-端肽融合物表现出对独立于环大小的Xa因子-切割的抗性，其由丝氨酸/半胱氨酸间隔控制。从三组独立产生的噬菌体样品，计算相对于未处理样品(w/o Xa)的Xa因子抗性(信号保留[％])。
(B)与(A)相同，但使用含有ProcA-前导序列的pIII-肽融合物，在存在或不存在ProcM酶共表达下产生。
具体实施方式
定义
术语“噬菌体”是指形成由含有噬菌体复制所需核酸的蛋白质外被组成的包装的细菌病毒。核酸可以是DNA或RNA，双链的或单链的，线性的或环状的。例如噬菌体λ或丝状噬菌体(例如Ml3、fd或fl)的噬菌体是本领域普通技术人员公知的。术语“噬菌体颗粒”是指根据本发明的颗粒，即展示环肽的颗粒。在噬菌体组装过程中，外被蛋白可以包装不同的核酸序列，只要其包括包装信号即可。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语包括含有已知的核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键的核酸，其是合成的、天然的和非天然的，具有与参考核酸类似的结合特性，并且以与参考核苷酸类似的方式被代谢。除非另外指出，特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子置换物)和互补序列，以及明确指出的序列。具体地，如下文所详述，通过产生其中第三位置的一个或多个所选(或全部)密码子被混合-碱基和/或脱氧肌苷碱基取代的序列，可以实现简并密码子置换(Batzer等人(1991)Nucleic Acid Res.19:5081；Ohtsuka等人(1985)J.Biol.Chem.260:2605-2608；和Rossolini等人(1994)Mol.Cell.Probes8:91-98)。本文公开的特定核酸序列或载体具有在噬菌体或噬菌体颗粒的组装过程中被噬菌体外被蛋白包装的能力。优选地，所述核酸序列或载体源自噬菌体的天然基因组，例如，在丝状噬菌体的情况下，包括噬菌体和噬菌粒载体。后者是除质粒特征以外还含有包装信号和噬菌体复制起源的质粒。
术语“肽”是指具有少于或等于50个氨基酸的分子。
术语“(多)肽”是指具有多于50个氨基酸的分子，其由一种或多种经由肽键连接的多个(即2个或更多个)氨基酸链组成。
术语“蛋白质”是指如下(多)肽：其中至少一部分(多)肽通过在(多)肽链内和/或其之间形成二级、三级或四级结构具有或能够取得确定的三维排列。该定义包括多种蛋白质，例如天然的或至少部分人工的蛋白质，以及全蛋白质的片段或结构域，只要这些片段或结构域能够取得上述的确定三维排列即可。
术语“硫醚”或“硫醚-桥”是指在各个分子中硫原子与两个不同的碳原子或杂原子结合。在一实施方式中，硫醚-桥在一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基的翻译后脱水以及将所述脱水残基与半胱氨酸偶联之后形成。在一实施方式中，硫醚-桥是羊毛硫氨酸-或甲基羊毛硫氨酸-桥。羊毛硫氨酸是化学式为(HOOC-CH(NH2)-CH2-S-CH2-CH(NH2)-COOH)的非蛋白原氨基酸，其由两个在其β-碳原子上通过硫醚-桥交联的丙氨酸残基组成。甲基羊毛硫氨酸是化学式为HOOC-CH(NH2)-CH(CH3)-S-CH2-CH(NH2)-COOH的非蛋白原氨基酸。
术语“赖丙氨酸-桥”是指脱氢丙氨酸与赖氨酸残基之间的相互作用。在本文中，通过酶法或非酶法(例如，通过调节pH)引起赖丙氨酸-桥。“赖丙氨酸”是指修饰的氨基酸N6-(DL-2-氨基-2-羧基乙基l)-L-赖氨酸。
如本文所用，术语“分子内键”是指肽序列内氨基酸侧链之间的共价键，不包括分子外(外源性)结构，并排除化学处理，例如形成二硫桥(例如通过还原反应)、环加成或Staudinger反应。在此，分子内键可以通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联形成。在一实施方式中，所述一个或多个脱水残基是脱氢丙氨酸(Dha)或脱氢氨基丁酸(Dhb)。在此，分子内键可以通过赖丙氨酸-桥或硫醚-桥形成。在本公开内容的一个实施方式中，分子内键通过羊毛硫氨酸-桥形成。在本公开内容的另一实施方式中，分子内键通过甲基羊毛硫氨酸-桥形成。在本公开内容的实施方式中，一个或多个分子内键在肽序列内形成。在本公开内容的实施方式中，肽序列内的分子内键形成稳定化环结构。在一实施方式中，所述一个或多个分子内键通过酶法形成。在一实施方式中，所述一个或多个分子内键通过羊毛硫肽合成酶形成。所述一个或多个分子内键通过环化酶形成。在一实施方式中，所述环化酶是LanC型环化酶或双功能LanM型酶或多功能LanKC或LanL型酶。在另一实施方式中，所述LanC型环化酶是NisC(Uniprot编号：Q03202)、SpaC、MibC、PepC、EpiC或其功能等同物。在另一实施方式中，所述双功能LanM型酶是ProcM(编号NP_894083)、LctM、MutM、BovM、LanM1/2、CinM、HalMl/2、CyanMl-4或其功能等同物。在另一实施方式中，所述一个或多个分子内键通过非酶法形成。在另一实施方式中，所述一个或多个分子内键在碱性条件下形成。在另一实施方式中，所述一个或多个分子内键在弱碱性条件下进行。在另一实施方式中，所述一个或多个分子内键在碱性条件下形成。在另一实施方式中，所述碱性条件为pH 7.5、pH8、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH 10.5、pH 11、pH 11.5、pH 12、pH 12.5、pH 13、pH 13.5或pH 14。在另一实施方式中，所述一个或多个分子内键在碱性条件下通过酶法形成，例如通过羊毛硫肽合成酶。
在本文中，术语“环肽”是指具有通过一个或多个分子内键形成的二级结构的一段氨基酸、肽或多肽。并不需要整段氨基酸或肽或多肽是环状的。在本公开内容的实施方式中，环肽是单环或多环的肽。在另一实施方式中，环肽包括例如天然或人工肽的肽，以及作为全蛋白质片段或结构域的肽。在另一实施方式中，环肽是酰胺化环肽。
术语“多环”或“多环结构”是指具有至少2、3、4或5个分子内键的结构。取决于所用肽的长度，根据本公开内容，可以实现更加复杂的二级肽结构。
术语“前体环肽”是指能够形成根据本公开内容的环肽的一段氨基酸、肽或多肽。更具体地，根据本公开内容的前体环肽包括至少一个或多个丝氨酸或苏氨酸和至少一个或多个半胱氨酸或赖氨酸，以形成分子内键。
术语“脱水残基”是指经历包括从反应分子上失去水分子的化学反应的修饰的氨基酸残基。在一实施方式中，“脱水残基”是脱水丝氨酸或脱水苏氨酸。在另一实施方式中，“脱水残基”是脱氢丙氨酸(Dha)或脱氢氨基丁酸(Dhb)。在一实施方式中，一个或多个丝氨酸或苏氨酸的脱水通过羊毛硫肽合成酶进行。在一实施方式中，一个或多个丝氨酸或苏氨酸的脱水通过脱水酶进行。在一实施方式中，所述酶脱水通过LanB型脱水酶或者通过双功能LanM型酶或多功能LanKC或LanL型酶进行。在一实施方式中，所述LanB型脱水酶是NisB(Uniprot编号：P20103)、EpiB、SpaB、MibB、PepB或其功能等同物。在另一实施方式中，所述双功能LanM型酶是ProcM(编号NP_894083)、LctM、MutM、BovM、LanMl/2、CinM、HalMl/2、CyanMl-4或其功能等同物。
如本文所述，术语“前导”或“前导序列”是指翻译后修饰(PTM)酶的识别基序。在本公开内容一实施方式中，前导序列由翻译后修饰(PTM)酶识别。在本公开内容一实施方式中，前导序列是羊毛硫肽合成酶识别的序列。在另一实施方式中，前导序列具有可以源自由翻译后修饰(PTM)酶识别的前导序列的共有基序。在本公开内容另一实施方式中，前导序列是源自LanA前体肽的序列。在本公开内容另一实施方式中，前导序列具有可以源自LanA前体肽的共有基序。在本公开内容另一实施方式中，前导序列是由LanB型脱水酶、LanC型环化酶和/或双功能LanM型酶或多功能LanKC或LanL型酶识别的序列。
如本文所用，术语“翻译后修饰酶”或“PTM酶”是指引发翻译的肽(特别是在生物活性肽的生物合成中作为处理机制一部分的修饰天然核糖体肽)的结构变化的酶。该类别包括多种类型的酶，包括羧酸-胺连接酶、环化酶、脱氢酶、环化脱水酶、脱羧酶、差向异构酶、羟化酶、肽酶、脱水酶、裂解酶、激酶、转移酶、酯化酶、加氧酶和异构酶，特别是形成羊毛硫氨酸键的酶、形成细胞溶素的酶、形成cyanobactin的酶、形成硫肽的酶、形成芋螺肽(conopeptide)肽的酶、形成microviridin的酶、形成大环寡肽(cyclotide)的酶、形成细菌素的酶和形成subtilosin的酶。优选地，本文使用的PTM酶是羊毛硫肽合成酶。优选地，本文使用的PTM酶是脱水酶、环化酶或包括脱水酶或裂解酶/激酶和环化酶活性的双-或多功能酶。更优选地，本文使用的PTM酶是LanB型脱水酶、LanC型环化酶、双功能LanM型酶或多功能LanKC或LanL型酶或其功能等同物。
术语肽或蛋白质的“功能等同物”是指共享该肽或蛋白质一种或多种、优选全部功能者。优选地，这些功能是生物功能，优选酶功能，例如脱水酶和/或环化酶活性。
术语“噬菌体颗粒表面”是指噬菌体颗粒与颗粒包含于其中并可接近的介质接触的部分。该表面通过作为噬菌体外被部分的蛋白质(颗粒蛋白质外被的膜)确定，其在适当的宿主细胞中在噬菌体产生过程中组装。
噬菌体展示描述了如下选择技术：其中肽或蛋白质变体文库在噬菌体病毒子的外部表达，而编码各变体的遗传材料位于内部。这在各变体蛋白质序列和编码其的DNA之间建立了物理连接，使得可以通过称作淘选的体外选择方法基于对指定目标分子(抗体、酶、细胞-表面受体等)的结合亲合力进行迅速区分。淘选以其最简单的方式进行：在覆有靶标的板(或珠)上孵育噬菌体-展示的肽文库，洗去未结合的噬菌体，并洗脱特异性结合的噬菌体。然后将洗脱的噬菌体进行扩增，采取额外的结合/扩增循环，以富集有利于结合序列的库。若干轮之后，通过DNA测序或ELISA对单个克隆进行表征。
术语“噬菌粒”是指具有细菌复制起源例如CoIE 1和一拷贝噬菌体基因间区域的质粒载体。噬菌粒可以基于任何已知的噬菌体，包括丝状噬菌体。质粒通常会含有用于抗生素抗性的选择标记物。克隆到这些载体中的DNA片段可以作为质粒繁殖。当提供具有产生噬菌体颗粒所必需的所有基因的带有这些载体的细胞时，质粒复制的方式变化成滚环复制，以产生一链质粒DNA链的多个拷贝以及包装噬菌体颗粒。噬菌粒可以形成感染性或非感染性噬菌体颗粒。该术语包括含有作为基因融合物的与异源性多肽基因连接的噬菌体外被蛋白基因或其片段的噬菌粒，使得异源性多肽在噬菌体颗粒的表面上得以展示(Sambrook等人417)。
术语“噬菌体载体”是指含有异源性基因并能够复制的噬菌体的双链可复制形式。噬菌体载体具有允许噬菌体复制并形成噬菌体颗粒的噬菌体复制源。优选地，噬菌体是丝状噬菌体，例如M 13、fl、fd、Pf3噬菌体或其衍生物，λ-型噬菌体，例如λ、21、phi80、phi81.82、424.434等或其衍生物，杆状病毒或其衍生物，T4噬菌体或其衍生物，T7噬菌体病毒或其衍生物。由细胞制备DNA意味着从宿主细胞的分培养物分离质粒DNA。常用的DNA制备方法为Sambrook等人的125-133部分中所述的大规模和小规模质粒制备。制备DNA之后，可以通过本领域公知的方法对其进行提纯，例如Sambrook等人的140部分中所述的。
术语“外被蛋白”是指存在于噬菌体颗粒表面上的蛋白质或其至少一部分。就功能性而言，外被蛋白是在宿主细胞中的噬菌体组装过程中与噬菌体颗粒缔合、并且保持与组装的噬菌体缔合直至其感染另一宿主细胞的任意蛋白。在丝状噬菌体的情形中，所述野生型蛋白质是基因III蛋白质(pIII)、基因VI蛋白质(pVI)、基因VII蛋白质(pVII)、基因VIII蛋白质(pVIII)和基因IX蛋白质(pIX)。外被蛋白可以是主要外被蛋白，或者可以是次要外被蛋白。“主要”外被蛋白是以10个蛋白质拷贝或更多地存在于噬菌体外被中的外被蛋白，例如，主要外被蛋白pVIII。主要外被蛋白可以每噬菌体数十、数百甚至数千个拷贝存在。次要外被蛋白以每噬菌体少于10个蛋白质拷贝存在，例如，次要外被蛋白pIII。
术语“野生型外被蛋白”是指形成天然存在的噬菌体的外被的外被蛋白。包括密切相关的丝状噬菌体成员例如fl、fd和Ml3的序列是本领域普通技术人员公知的(参见，例如，Kay等人,1996)。在丝状噬菌体的情形中，所述野生型蛋白质是，例如，基因III蛋白质(pIII)、基因VI蛋白质(pVI)、基因VII蛋白质(pVII)、基因VIII蛋白质(pVIII)和基因IX蛋白质(pIX)。在一实施方式中，本公开内容涉及一种方法，其中所述外被蛋白是噬菌体的野生型外被蛋白。
在进一步优选的实施方式中，所述外被蛋白是噬菌体野生型外被蛋白的截短变体，其中所述截短变体包括所述野生型外被蛋白的至少一部分，所述部分引起所述外被蛋白结合到噬菌体颗粒蛋白质外被中的至少该部分。
术语“截短变体”是指源自上文所称的野生型蛋白质的蛋白质，其通过删除至少一部分野生型序列而修饰。这包括多种变体，例如截短的基因III(pIII)或基因VIII(pVIII)蛋白质变体，其已经发现于噬菌体突变体中(Crissman&Smith,1984)，或者已经在标准噬菌体展示方法中产生(例如，Bass等人,1990；Krebber,1996)。例如，所述截短的变体可以包括基因III蛋白质(pIII)或基因VIII蛋白质(pVIII)的CT结构域或者由其组成。为了识别根据本发明的截短变体，可以将检测标记与变体融合，并设立检验，以确定变体是否结合到在变体的存在下形成的噬菌体颗粒的噬菌体外被中。
在再进一步优选的实施方式中，所述外被蛋白是噬菌体野生型外被蛋白的修饰变体，其中所述修饰变体能够结合到噬菌体颗粒的蛋白质外被中。
用于实现根据本公开内容的野生型蛋白质的修饰的方法是本领域普通技术人员公知的，其包括标准克隆和/或诱变技术。用于构建编码根据本公开内容的方法中使用的野生型蛋白质修饰变体的核酸分子的方法，用于构建包括所述核酸分子的载体、包括构建噬菌体和/或噬菌粒载体的方法，用于将所述载体引入到适当选择的宿主细胞中，用于引起或允许所述修饰蛋白质表达的方法，均是本领域公知的(参见，例如，Sambrook等人,1989；Ausubel等人,1999；Kay等人,1996)。为了识别根据本公开内容的修饰变体，可以将检测标记与变体融合，并设立检验，以确定变体是否结合到在变体的存在下形成的噬菌体颗粒的噬菌体外被中。
在再进一步优选的方法中，所述噬菌体是丝状噬菌体。丝状噬菌体例如M13、fd或f1是本领域普通技术人员公知的。
在丝状噬菌体的情形中，特别优选的方法是其中噬菌体的所述外被蛋白是野生型外被蛋白pIII或源自于此。
进一步优选的方法其中噬菌体颗粒的所述外被蛋白是野生型外被蛋白pIII或源自于此。优选地，与对应的野生型序列相比较，对应于野生型蛋白质的修饰蛋白质的这些部分表现出的氨基酸同一性超过大约40％，优选大约50％，优选大约60％，优选大约70％，优选大约80％，最优选大约90％。
术语指定多肽序列的“N-端”是始于指定多肽序列N-端残基处或其附近的连续长度的指定多肽序列。指定多肽的N-端可以通过长度定义。类似地，术语指定多肽序列的“C-端”是始于指定多肽序列C-端残基处或其附近的连续长度的指定多肽序列。指定多肽的C-端可以通过长度定义。在本公开内容一实施方式中，是指外被蛋白的C-端。在优选的实施方式中，外被蛋白的C端是位于所述外被蛋白跨膜结构域C-端的氨基酸或氨基酸序列。在另一实施方式中，外被蛋白的C-端是位于所述外被蛋白跨膜结构域C-端的氨基酸或氨基酸序列，其中所述外被蛋白是基因III蛋白质(pIII，SEQ-ID.:2；Uniprot:P69168)或基因VIII蛋白质(pVIII；SEQ-ID.:3；Uniprot:P69541)。在一实施方式中，基因III蛋白质(pIII)的C-端是氨基酸序列LRNKES(SEQ-ID.:4)或其衍生物或修饰变体。在另一实施方式中，基因III蛋白质(pIII)的C-端位于跨膜结构域的C-端，并包括氨基酸序列LRNKES(SEQ-ID.:4)的一个或多个氨基酸。在另一实施方式中，基因VIII蛋白质(pVIII)的C-端是氨基酸序列TSKAS(SEQ-ID.:5)或其衍生物或修饰变体。在另一实施方式中，基因VIII蛋白质(pVIII)的C-端位于跨膜结构域的C-端，并包括氨基酸序列TSKAS(SEQ-ID.:5)的一个或多个氨基酸。图4显示了基因III蛋白质(pIII)和基因VIII蛋白质(pVIII)的示意图。
在本公开内容一实施方式中，蛋白质外被部件的C-端与环肽连接，并在噬菌体颗粒的表面上展示所述环肽。
在优选的实施方式中，展示(多)肽/蛋白质的噬菌体颗粒含有编码(多)肽/蛋白质的核酸序列。
在本公开内容上下文中，术语“造成或允许表达”描述的是在使得核酸序列得以表达的条件下培养宿主细胞。用于构建编码根据本公开内容的(多)肽/蛋白质的核酸分子的方法，用于构建包括所述核酸分子的载体的方法，用于将所述载体引入到适当选择的宿主细胞中，用于造成或允许(多)肽/蛋白质表达的方法是本领域公知的(参见，例如，Sambrook等人,1989；Ausubel等人1999)。进一步公知的有用于在适当宿主细胞中引入产生子代噬菌体或噬菌体颗粒所需的遗传材料的方法，用于造成或者允许所述子代噬菌体或噬菌体颗粒产生的方法(参见，例如，Kay等人,1996)。造成或允许噬菌体颗粒产生的步骤可以要求使用适当的辅助噬菌体，例如，在用噬菌粒工作的情形中。
在另一实施方式中，本公开内容涉及包括根据本公开内容的核酸序列的载体。
在另一实施方式中，本公开内容涉及含有根据本公开内容的核酸序列或根据本公开内容的载体的宿主细胞。
在本公开内容上下文中，术语“宿主细胞”可以是若干在异源性蛋白质的产生中常用的任意一种，包括，但不限于，细菌，例如大肠杆菌(Escherichia coli)(Ge等人,1995)或枯草杆菌(Bacillus subtilis)(Wu等人,1993)，真菌，例如酵母(Horwitz等人,1988；Ridder et al.,1995)或丝状真菌(Nyyssonen等人,1993)，植物细胞(Hiatt&Ma,1993；Whitelam等人,1994)，昆虫细胞(Potter等人,1993；Ward等人,1995)，或哺乳动物细胞(Trill等人,1995)。
在再进一步优选的实施方式中，本公开内容涉及根据本公开内容的核酸序列编码的、根据本公开内容的载体编码的、或者根据本公开内容的宿主细胞产生的野生型噬菌体外被蛋白的修饰变体。修饰变体可以进一步包括用于克隆、用于表达或蛋白质转运所需的氨基酸残基。克隆所需的蛋白质残基可以包括由具有限制性内切酶用识别序列的核酸序列编码的残基，引入其是为了能够将核酸序列克隆到合适的载体中。表达所需的氨基酸序列可以包括导致(多)肽/蛋白质的溶解性或稳定性增加的残基。蛋白质转运所需的氨基酸残基可以包括负责将修饰变体转运至大肠杆菌周质的信号传导序列，和/或有利于所述信号传导序列的有效切割的氨基酸残基。其他以上所称的用于克隆、表达、蛋白质转运、提纯和/或检测目的的氨基酸残基为众多本领域普通技术人员公知的部分。
“噬菌体颗粒的多样收集物”也可以称作“文库”或“多元化”。在本公开内容上下文中，该文库中的每个成员展示文库的不同成员。在本公开内容上下文中，术语“多样收集物”是指至少两种在其组成、特性和/或序列方面至少部分不同的颗粒或分子的收集物。例如，环肽的多样收集物是一组在其序列上至少一个氨基酸位置上不同的环肽。这样的多样收集物可以许多种方式得到，例如，通过编码起始(多)肽/蛋白质的核酸序列的至少一个密码子的随机诱变，通过使用易错PCR，以扩增编码起始(多)肽/蛋白质的核酸序列，或者通过在根据本公开内容的方法中使用突变体菌株作为宿主细胞。这些以及另外的或可选的产生肽多样收集物的方法是本领域普通技术人员公知的。
在本公开内容上下文中，术语“所需特性”是指多样收集物中一成员应当具有并形成筛选和/或选择多样收集物基础的预定特性。这些特性包括如下特性，例如，与靶标结合，阻断靶标，激活靶标介导的反应，酶活性，以及本领域普通技术人员已知的其他特性。取决于所需特性的类型，本领域普通技术人员将能够识别出进行筛选和/或选择的形式和必要步骤。
最优选的方法是其中所述所需特性是与所关注的靶标结合。
所述的所关注靶标可以通过本领域普通技术人员公知的许多种方式呈现于噬菌体颗粒上展示的环肽的所述多样收集物，例如，涂覆在用于固相生物淘选的表面上，与例如磁珠的颗粒连接用于在溶液中淘选，或者展示在细胞表面上用于全细胞生物淘选或在组织切片上进行生物淘选。已经与所述靶标结合的噬菌体颗粒可以通过许多种本领域普通技术人员公知的方法回收，例如，通过用适当的缓冲液洗脱，通过pH-或盐梯度，或者通过使用可溶性靶标的特异性洗脱。
术语“在附近”是指从所述(多)肽/蛋白质的N-或C-端开始计数至多15个或更优选至多10个氨基酸的一段。
详述和实施方式
本公开内容涉及一种在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的方法，其中所述环肽与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接，并且其中所述环肽包括通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联而形成的分子内键。
在一实施方式中，本公开内容涉及一种在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的方法，其包括以下步骤：
(a)提供带有包括编码前体环肽的核酸序列的核酸序列的宿主细胞；
(b)引起或允许所述前体环肽的表达；
(c)使前体环肽内的一个或多个氨基酸残基酶脱水；
(d)通过使一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联，形成一个或多个分子内键，从而形成环肽；和
(e)在所述宿主细胞中产生噬菌体颗粒，其中所述噬菌体颗粒在表面上展示所述环肽，并且其中所述环肽与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接。
在一实施方式中，本公开内容涉及一种在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的方法，其包括以下步骤：
(a)提供带有编码前体环肽的核酸序列的宿主细胞；
(b)引起或允许所述前体环肽的表达；
(c)使前体环肽内的一个或多个氨基酸残基酶脱水；
(d)通过使一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联，引起或允许形成一个或多个分子内键，从而形成环肽；和
(e)在所述宿主细胞中产生噬菌体颗粒，其中所述噬菌体颗粒在表面上展示所述环肽，并且其中所述环肽与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接。
在本公开内容一实施方式中，所述核酸序列进一步编码噬菌体颗粒的外被蛋白和由翻译后修饰(PTM)酶识别的前导序列。
在本公开内容一实施方式中，宿主细胞进一步具有一个或多个编码翻译后修饰(PTM)酶的核酸序列。在本公开内容另一实施方式中，宿主细胞进一步具有一个或多个编码翻译后修饰(PTM)酶的核酸序列，其中所述一个或多个核酸序列被人工引入到细胞中。
在一实施方式中，本公开内容涉及一种在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的方法，其包括以下步骤：
(a)提供具有编码前体环肽的核酸序列、并具有一个或多个编码翻译后修饰(PTM)酶的核酸序列的宿主细胞；
(b)引起或允许所述前体环肽和所述一种或多种翻译后修饰(PTM)酶的表达；
(c)使前体环肽内的一个或多个氨基酸残基酶脱水；
(d)通过使一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联，形成一个或多个分子内键，从而形成环肽；和
(e)在所述宿主细胞中产生噬菌体颗粒，其中所述噬菌体颗粒在表面上展示所述环肽，并且其中所述环肽与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接。
在一实施方式中，本公开内容涉及一种在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的方法，其包括以下步骤：
(a)提供具有编码前体环肽的核酸序列的具有一个或多个编码翻译后修饰(PTM)酶的核酸序列的宿主细胞；
(b)引起或允许所述前体环肽和所述一种或多种翻译后修饰(PTM)酶的表达；
(c)引起或允许前体环肽内的一个或多个氨基酸残基的酶脱水；
(d)通过使一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联，引起或允许形成一个或多个分子内键，从而形成环肽；和
(e)在所述宿主细胞中产生噬菌体颗粒，其中所述噬菌体颗粒在表面上展示所述环肽，并且其中所述环肽与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接。
在一实施方式中，步骤c)中的酶脱水由翻译后修饰(PTM)酶引起。在一实施方式中，步骤d)中一个或多个分子内键的形成由翻译后修饰(PTM)酶引起。在一实施方式中，步骤c)中的酶脱水和步骤d)中一个或多个分子内键的形成由翻译后修饰(PTM)酶引起。在一实施方式中，步骤c)中的酶脱水和步骤d)中一个或多个分子内键的形成由一种翻译后修饰(PTM)酶引起。在另一实施方式中，步骤c)中的酶脱水和步骤d)中一个或多个分子内键的形成通过不同的翻译后修饰(PTM)酶引起。在另一实施方式中，步骤c)中的酶脱水由翻译后修饰(PTM)酶引起，在步骤d)中一个或多个分子内键在碱性条件下形成。另再一实施方式中，步骤c)中的酶脱水由翻译后修饰(PTM)酶引起，在宿主细胞中产生噬菌体颗粒之后，一个或多个分子内键在碱性条件下形成。
在本公开内容一实施方式中，所述翻译后修饰(PTM)酶是羊毛硫肽合成酶。在本公开内容另一实施方式中，所述翻译后修饰(PTM)酶是脱水酶、环化酶或包括脱水酶或裂解酶/激酶和环化酶活性的双功能或多功能酶。在优选的实施方式中，本文使用的PTM酶是LanB型脱水酶、LanC型环化酶和/或双功能LanM型酶或多功能LanKC或LanL型酶或其功能等同物。在本公开内容另一实施方式中，所述翻译后修饰(PTM)酶是脱水酶或裂解酶/激酶和/或环化酶。
在本公开内容一实施方式中，所述一种或多种脱水残基是脱氢丙氨酸(Dha)或脱氢氨基丁酸(Dhb)。
在本公开内容一实施方式中，一个或多个分子内键通过羊毛硫肽合成酶或者在弱碱性条件下形成。在本公开内容另一实施方式中，一个或多个分子内键通过LanC型环化酶、双功能LanM型酶或多功能LanKC或LanL型酶或者在弱碱性条件下形成。在本公开内容一实施方式中，氨基酸残基的脱水和分子内键的形成通过羊毛硫氨酸-或甲基羊毛硫氨酸-桥形成酶介导。
在本公开内容一实施方式中，一种或多种分子内键在肽或多肽序列内形成。在本公开内容一实施方式中，肽或多肽序列内的分子内键形成稳定化环结构。在本公开内容一实施方式中，一个或多个分子内键在翻译后修饰的肽或多肽内形成。在本公开内容一实施方式中，一个或多个分子内键在包括一个或多个脱水残基的肽或多肽内形成。在另一实施方式中，一个或多个分子内键在通过羊毛硫氨酸合成酶修饰的肽或多肽内形成。在另一实施方式中，一个或多个分子内键在通过脱水酶、环化酶或包括脱水酶或裂解酶/激酶和环化活性的双功能或多功能酶修饰的肽或多肽内形成。在另一实施方式中，一个或多个分子内键在通过LanB型脱水酶、LanC型环化酶、双功能LanM型酶或多功能LanKC或LanL型酶修饰的肽或多肽内形成。在另一实施方式中，LanB型脱水酶是NisB(Uniprot编号：P20103)、EpiB、SpaB、MibB、PepB或其功能等同物。在另一实施方式中，所述双功能LanM型酶是来自原绿球藻(Prochlorococcus)MIT 9313的ProcM(编号NP_894083)或其密切相关的来自原绿球藻MIT 9303的ProcM(编号YP_001018107)的类似物、CyanMl-4(编号YP_002485891、YP_002483601、YP_002484655、YP_002483742；来自蓝丝菌属(Cyanothece sp.)PCC 7425)、LctM、MutM、BovM、LanMl/2、CinM、HalMl/2或其功能等同物。
在一实施方式中，所述一个或多个分子内键通过羊毛硫氨酸-或甲基羊毛硫氨酸-桥形成酶形成。在一实施方式中，所述一个或多个分子内键通过环化酶形成。在一实施方式中，所述环化酶是LanC型环化酶、双功能LanM型酶或多功能LanKC或LanL型酶。
在另一实施方式中，LanC型环化酶是NisC(Uniprot编号：Q03202)、SpaC、MibC、PepC、EpiC或其功能等同物。在另一实施方式中，所述双功能LanM型酶是来自原绿球藻MIT9313的ProcM(编号NP_894083)或其密切相关的来自原绿球藻MIT 9303的ProcM(编号YP_001018107)的类似物、CyanMl-4(编号YP_002485891、YP_002483601、YP_002484655、YP_002483742；来自蓝丝菌属PCC7425)、LctM、MutM、BovM、LanMl/2、CinM、HalMl/2或其功能等同物。
在另一实施方式中，所述一个或多个分子内键在弱碱性条件下形成。在另一实施方式中，所述弱碱性条件是pH 7.5-11、pH 8-11、pH9-11、pH 10-11、pH 7.5-9、pH 8-9或pH9-10。在另一实施方式中，所述弱碱性条件为pH 7.5、pH 8、pH 8.5、pH 9、pH 9.5、pH 10、pH10.5、或pH 11或其各自之间的范围。
在本公开内容另一实施方式中，一个或多个分子内键是硫醚-桥。在本公开内容另一实施方式中，一个或多个分子内键是羊毛硫氨酸-桥或甲基羊毛硫氨酸-桥。在本公开内容另一实施方式中，一个或多个分子内键是赖丙氨酸-桥。
在本公开内容一实施方式中，环肽是翻译后修饰的肽或多肽。在另一实施方式中，环肽是含有硫醚-桥的肽或多肽。在另一实施方式中，环肽是含有羊毛硫氨酸-桥的肽或多肽、含有甲基羊毛硫氨酸-桥的肽或多肽或者含有赖丙氨酸-桥的肽或多肽。在本公开内容另一实施方式中，环肽是单环的或多环的。
在一实施方式中，本公开内容涉及一种在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的方法，其中所述环肽与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接，并且其中所述环肽包括通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联而形成的分子内键，该方法包括以下步骤：
(a)提供带有包括编码前体环肽的核酸序列的核酸序列的宿主细胞；
(b)引起或允许所述前体环肽的表达；
(c)形成一个或多个分子内键；和
(d)在所述宿主细胞中产生噬菌体颗粒。
在本公开内容一实施方式中，所述外被蛋白是噬菌体的野生型外被蛋白。在另一实施方式中，噬菌体颗粒的所述外被蛋白是或者源自于野生型外被蛋白pIII或野生型外被蛋白pVIII。
在本公开内容一实施方式中，所述环肽与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接。在另一实施方式中，所述环肽和所述噬菌体外被蛋白的C-端物理缔合。在另一实施方式中，所述环肽经由基因融合或者经由通过一个或多个人工引入的半胱氨酸形成的二硫键与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接。
在本公开内容一实施方式中，所述环肽经由基因融合或者经由通过一个或多个人工引入的半胱氨酸形成的二硫键与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接。在另一实施方式中，所述环肽经由基因融合与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接。在本公开内容另一实施方式中，所述环肽经由通过一个或多个人工引入的半胱氨酸形成的二硫键与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接。
在本公开内容一实施方式中，所述噬菌体是丝状噬菌体。
在本公开内容一实施方式中，所述环肽包括至多500、至多400、至多300、至多200、至多100、至多90、至多80、至多70、至多60、至多50、至多40、至多30、至多20或至多10个氨基酸。
在本公开内容另一实施方式中，所述环肽是酰胺化环肽。在另一实施方式中，所述酰胺化环肽在所述环肽的C-端包括酰胺部分。在本公开内容另一实施方式中，所述环肽通过C-端酰胺化进行翻译后修饰。在另一实施方式中，要酰胺化修饰的氨基酸在提供酰胺基的甘氨酸之后。酰胺化包括，例如，第一反应步骤，其中将甘氨酸氧化形成α-羟基-甘氨酸。氧化的甘氨酸切割成C-端酰胺化的肽和N-乙醛酸化肽。C-端酰胺化对于许多肽例如神经肽和激素来说可能是至关重要的。
在一实施方式中，本公开内容涉及一种能够在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的核酸序列，其中核酸编码：
(a)所述噬菌体颗粒的外被蛋白，
(b)由翻译后修饰(PTM)酶识别的前导序列，和
(c)前体环肽，
其中前体环肽位于所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端处，并且
其中所述前体环肽能够通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联而形成分子内键。
在本公开内容一实施方式中，能够在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的所述核酸序列还编码信号序列。
在一实施方式中，本公开内容涉及一种载体，其包括能够在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的核酸序列，其中核酸编码：
(a)所述噬菌体颗粒的外被蛋白，
(b)由翻译后修饰(PTM)酶识别的前导序列，和
(c)前体环肽，
其中前体环肽位于所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端处，并且
其中所述前体环肽能够通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联而形成分子内键。
在一实施方式中，本公开内容涉及一种能够在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的核酸序列，其中核酸序列从N-端到C-端具有以下排列：
N-(噬菌体外被蛋白)-(由翻译后修饰(PTM)酶识别的前导序列)-(前体环肽)-C。
在一实施方式中，本公开内容涉及一种载体，其包括能够在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的核酸序列，其中核酸从N-端到C-端具有以下排列：
N-(噬菌体外被蛋白)-(由翻译后修饰(PTM)酶识别的前导序列)-(前体环肽)-C，其中N是N-端，C是C-端。
在一实施方式中，本公开内容涉及一种能够在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的核酸序列，其中核酸从N-端到C-端具有以下排列：
N-(信号序列)-(噬菌体外被蛋白)-(由翻译后修饰(PTM)酶识别的前导序列)-(前体环肽)-C。
在一实施方式中，本公开内容涉及一种载体，其包括能够在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的核酸序列，其中核酸从N-端到C-端具有以下排列：
N-(信号序列)-(噬菌体外被蛋白)-(由翻译后修饰(PTM)酶识别的前导序列)-(前体环肽)-C，其中N是N-端，C是C-端。
在本公开内容另一实施方式中，载体还包括一个或多个编码输出信号的核酸序列。在本公开内容另一实施方式中，载体还包括一个或多个编码诱导型启动子的核酸序列。在一实施方式中，本公开内容涉及一种包括本文所公开的核酸序列或载体的宿主细胞。
在另一实施方式中，本公开内容涉及一种载体，其包括能够在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的核酸序列，其中核酸编码噬菌体外被蛋白，其中所述噬菌体外被蛋白在由翻译后修饰(PTM)酶识别的前导序列附近编码。
在另一实施方式中，本公开内容涉及一种载体，其包括能够在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的核酸序列，其中由翻译后修饰(PTM)酶识别的前导序列在前体环肽附近编码。
在另一实施方式中，本公开内容涉及一种包括核酸序列的载体，其中在所述核酸序列上，噬菌体外被蛋白在由翻译后修饰(PTM)酶识别的前导序列附近编码，并且所述前导序列在前体环肽附近编码。在本公开内容一实施方式中，在附近是指由对应的核酸三联体编码的15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸。
在另一实施方式中，所述前体环肽包括至少一个或多个丝氨酸或苏氨酸和一个或多个半胱氨酸或赖氨酸，以形成一个或多个分子内键。在另一实施方式中，噬菌体颗粒的所述外被蛋白被作为野生型外被蛋白pIII或野生型外被蛋白pVIII的或由其衍生的核酸编码。
在一实施方式中，本公开内容涉及通过本文所公开的方法得到的在其表面上展示环肽的噬菌体颗粒。在一实施方式中，本公开内容涉及在其表面上展示环肽的噬菌体颗粒，其中所述环肽与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接，并且其中所述环肽包括分子内键。在一实施方式中，本公开内容涉及在其表面上展示环肽的噬菌体颗粒，其中所述环肽与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接，并且其中所述环肽包括通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联而形成的分子内键。
在另一实施方式中，所述噬菌体颗粒还包括载体，该载体包括一个或多个编码能够形成所述环肽的前体环肽的核酸序列。在另一实施方式中，所述噬菌体颗粒包括本文所公开的载体。
在一实施方式中，本公开内容涉及本文所公开的噬菌体颗粒的多样收集物。在一实施方式中，本公开内容涉及噬菌体颗粒的多样收集物，其中所述噬菌体颗粒展示与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接的环肽，并且其中所述多肽包括分子内键。在另一实施方式中，所述噬菌体颗粒中的每一个展示环肽多样收集物中的环肽，其中所述环肽包括分子内键。在一实施方式中，本公开内容涉及噬菌体颗粒的多样收集物，其中所述噬菌体颗粒展示与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接的环肽，并且其中所述多肽包括通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联而形成的分子内键。在另一实施方式中，所述噬菌体颗粒中的每一个展示环肽多样收集物中的环肽，其中所述环肽包括通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联而形成的分子内键。
在一实施方式中，本公开内容涉及一种获得具有所需特性的环肽的方法，其包括：
(a)提供本文公开的噬菌体颗粒的多样收集物；和
(b)筛选所述多样收集物和/或从所述多样收集物中选择，以得到至少一种展示具有所述所需特性的环肽的噬菌体颗粒。
在一实施方式中，本公开内容涉及一种获得具有所需特性的环肽的方法，其包括：
(a)提供噬菌体颗粒的多样收集物，其中所述噬菌体颗粒展示与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接的环肽，并且其中所述多肽包括通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联而形成的分子内键；和
(b)筛选所述多样收集物和/或从所述多样收集物中选择，以得到至少一种展示具有所述所需特性的环肽的噬菌体颗粒。
在本公开内容一实施方式中，所述的所需特性是与所关注的靶标结合。
在另一实施方式中，本公开内容涉及一种获得具有所需特性的环肽的方法，其包括：
(a)提供噬菌体颗粒的多样收集物，其中所述噬菌体颗粒展示与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接的环肽，并且其中所述多肽包括通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联而形成的分子内键；和
(b)筛选所述多样收集物和/或从所述多样收集物中选择，以得到至少一种展示具有所述所需特性的环肽的噬菌体颗粒，其中步骤(b)还包括：
(ba)使噬菌体颗粒的所述多样收集物与所关注的靶标接触；
(bb)洗脱没有与所关注的靶标结合的噬菌体颗粒；和
(bc)洗脱与所关注的靶标结合的噬菌体颗粒。
在一实施方式中，本公开内容涉及一种获得具有所需特性的环肽的方法，其包括：
(a)提供噬菌体颗粒的多样收集物，其中所述噬菌体颗粒展示与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接的环肽多样收集物中的环肽，并且其中所述多肽包括通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联而形成的分子内键；和
(b)筛选所述多样收集物和/或从所述多样收集物中选择，以得到至少一种展示具有所述所需特性的环肽的噬菌体颗粒。
在本公开内容一实施方式中，所述的所需特性是与所关注的靶标结合。
在另一实施方式中，本公开内容涉及一种获得具有所需特性的环肽的方法，其包括：
(a)提供噬菌体颗粒的多样收集物，其中所述噬菌体颗粒展示与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接的环肽多样收集物中的环肽，并且其中所述多肽包括通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联而形成的分子内键；和
(b)筛选所述多样收集物和/或从所述多样收集物中选择，以得到至少一种展示具有所述所需特性的环肽的噬菌体颗粒，其中步骤(b)还包括：
(ba)使噬菌体颗粒的所述多样收集物与所关注的靶标接触；
(bb)洗脱没有与所关注的靶标结合的噬菌体颗粒；和
(bc)洗脱与所关注的靶标结合的噬菌体颗粒。
Lan-酶
目前，若干羊毛硫氨酸-或甲基羊毛硫氨酸-桥形成酶及其基因是已知的：
1.LanB型脱水酶显示出构成设计为催化丝氨酸和苏氨酸脱水步骤的酶的C-端。
2.LanC型环化酶催化半胱氨酸硫醇的加成。环化酶组分LanC是锌金属蛋白，其结合的金属设计为激活亲和加成的硫醇底物。
3.LanM型酶是双功能的脱水酶和环化酶。它在羊毛硫抗生素合成的过程中负责前体肽的脱水和环化。
4.LanD氧化性脱羧酶型酶催化从表皮纤维的C-端内消旋羊毛硫氨酸的半胱氨酸残基上除去两个还原当量，以形成-C＝C-双键。
5.LanKC型多功能酶含有裂解酶、激酶和环化酶结构域，但在环化酶结构域中缺少标记锌-配体。
6.LanL型多功能酶含有裂解酶、激酶和含有金属配体的环化酶结构域。
7.LanP型肽酶从羊毛硫抗生素上切割前导肽。
8.LanT型肽酶，与ABC转运体融合；前体肽的切割由作为分泌过程一部分的转运体介导。
9.LtnM和LtnJ型脱水酶和脱氢酶涉及D-丙氨酸的形成。
10.CinX在肉桂霉素的生物合成过程中使天冬酰胺羟基化。
例如，在羊毛硫抗生素(包括羊毛硫氨酸-桥或甲基羊毛硫氨酸-桥的抗微生物肽)的形成中，经描述羊毛硫抗生素-合成酶组装在膜结合复合物中(Siegers等人1996.J.Biol.Chem.271,12294-12301；Kiesau等人1997.J.Bacteriol.179,1475-1481；Sahl等人1998.Annu.Rev.Microbiol.52:41-7)。该复合物由羊毛硫抗生素转运体(LanT)、脱水酶(LanB；也称作脱水酶)和环化酶(LanC)组成。在一些羊毛硫抗生素的情形中，双功能酶(LanM)进行脱水和环化两个步骤。在核糖体合成的前体肽中N-端羊毛硫抗生素前导肽是用于羊毛硫抗生素酶的识别信号，其始于脱水酶或既进行脱水也进行成环的酶。前导肽被认为与羊毛硫抗生素复合物结合，以使前体肽密切接近于羊毛硫抗生素酶。现有文献(参见，例如，WO2006/062398)公开了若干羊毛硫抗生素前导肽及其用途，例如，用于融合蛋白中，以产生要通过脱水酶进行翻译后脱水的所关注的肽。根据WO2006/062398，要修饰的前导肽或肽前面是非羊毛硫抗生素输出信号，如SEC输出信号。输出信号或前导肽可以通过细胞锚定序列(例如LPTX-分选酶识别基序)隔开。
本领域技术人员可以使用基因组挖掘策略识别新的前导肽及其相关的修饰Lan-酶，如最近所详述(Qi Zhang,Xiao Yang,Huan Wang,Wilfred A.van der Donk(2014)ACSChem.Biol.,2014,9,2686-2694)。Lan-酶的特征在于序列相似性、类似的结构域结构和高度保守的基序。例如，迄今已知若干Lan-酶在环化酶结构域含有“CHG”基序，其支持活性位点锌离子的结合。识别出其他者含有“CCG”基序，其支持Zn2+配位。使用Lan-酶序列和保守基序作为查询，可以通过BlastP搜索在其他有机体中识别出新的Lan-酶。一旦识别出新的Lan-酶，其相关的底物LanA前体肽很容易检测，因为它们通常在相同基因簇中在附近编码，并且特征在于短的开放阅读框和与其他LanA的序列相似性。
前导序列
可以使用任意类型的前导序列用于实施本公开内容，只要其可以被脱水酶识别即可。在另一实施方式中，该前导序列也可以被可以形成羊毛硫氨酸-或甲基羊毛硫氨酸-桥的环化酶识别。前导序列的氨基酸序列可获自公开数据库和出版物，包括以下文献中所述的前导序列和前导共有序列：Plat A.等人2013Curr Protein Pept Sci.2013Mar；14(2):85-96和Plat A.等人；Appl Environ Microbiol.2011Jan；77(2):604-11。
在一实施方式中，所述前导序列是由LanB型脱水酶、LanC型环化酶、双功能LanM型酶或多功能LanKC或LanL型酶识别的前导序列或者具有其共有基序。
在另一实施方式中，本公开内容的前导序列具有来自LanA前体肽的前导序列或其共有基序，其可以自衍生自源自LanA前体肽的已知前导序列的氨基酸序列对比。在另一实施方式中，所述前导序列是来自LanA前体肽的前导序列，或者是衍生自LanA前体肽的前导序列，或者是带有来自LanA前体肽的共有基序的前导序列，并且其中所述前导序列由羊毛硫肽合成酶识别。在另一实施方式中，所述前导序列是来自LanA前体肽的前导序列，或者是衍生自LanA前体肽的前导序列，或者是带有来自LanA前体肽的共有基序的前导序列，并且其中所述前导序列由LanB型脱水酶、LanC型环化酶、双功能LanM型酶或多功能LanKC或LanL型酶识别。
LanA前体肽的氨基酸序列可获自公开数据库，其包括以下LanA前体肽：
NisA(乳酸链球菌素，乳酸乳球菌)
ProcA(Prochlorosin，原绿球藻MIT9313；原绿球藻MIT9303)
SpaS(枯草菌素；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ATCC 6633)
LctA(乳链球菌素(Lacticin)481；乳酸乳球菌乳酸亚种)
MutA(变链素(Mutacin)II，链球菌突变体)
MibA(Microbisporicin，Microbispora corallina)
BovA(羊毛硫细菌素(Bovicin)HJ50；牛链球菌(Streptococcus bovis)HJ50)
LanA1/2(Lichenicidin，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis))
CinA(肉桂霉素，Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM40005)
HalA1/2(Haloduracin，嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans))
CyanA(未命名，蓝丝菌属PCC 7425)
Pep5(表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))
EpiA(表皮纤维，表皮葡萄球菌)
WO2006/062398的表1A和1B显示了这些前导肽的示例性对比。本领域技术人员将能够从对比的序列得到共有基序，例如，使用公开或市售的对比软件，例如AlignX或VectorNTI。优选地，前导序列共有基序源自至少5个、更优选至少10个、最优选至少15个已知前导肽序列的对比。由此得到的共有基序随后可以使用本领域已知的方法进行前导肽活性的验证，即被脱水酶和丝氨酸或苏氨酸脱水用本领域已知的方法进行识别。指定目标序列的脱水可以使用Maldi-TOF MS监测。
前导肽共有序列可以包括多种共有基序，例如，共有基序X1-D/E-E-V/L-S/T-D/E-X2-E-L-D/E，其中X1是任意疏水氨基酸，其中X2是任意氨基酸。例如，其包括序列LEEVSEQELD(SEQ-ID.:7)。在另一实施方式中，前导序列包括共有基序F-D/E/N-L-D/E/N-X3，其中X3是L、I或V。例如，其包括序列LFDLDL(SEQ-ID.:8)或FNLDV(SEQ-ID.:9)。例如，前导序列还可以含有共有I/L-L/F-D/E/N-L-Q-D/N/A/S/T-L/M-D/E，其包括ILELQNLD(SEQ-ID.:10)。前导序列可以由共有序列例如FNLDV(SEQ-ID.:9)、之后在共有序列和要修饰的前体肽之间的间隔序列组成。该间隔序列使得要修饰的部分处于各个酶的催化中心所及范围以内(Annechien Plat,Leon D.Kluskens,Anneke Kuipers,Rick Rink,Gert N.Moll(2010))，N-端结构域和间隔区对于乳酸链球菌素前导肽的功能性是充分的(The N-terminal domain and a spacer are sufficient for functionality of the nisinleader peptide).Appl.Environ.Microbiol.77,604-611)。
基于序列相似性将许多II类LanA前导肽归为N11P、TIGR03898和N11P族，而其他目前缺乏族分类。在另一实施方式中，前导序列源自于ProcA前导，其目前包括29个在原绿球藻MIT 9313中编码的高度保守的成员和另外15个在原绿球藻MIT 9303中编码的成员，其均被归为前导肽的N11P族并且是在关联菌株中编码的单修饰ProcM酶的底物。大多数ProcA前导序列显著地长(超过60个氨基酸)，并且由于总体的高保守性，不具有清晰的最小共有基序。但是，将ProcA2.8的亲本63个残基前导序列N-端截短成23个残基的版本充分支持ProcM-介导的前体肽的酶修饰，这说明前导序列的大部分是非必要的，并且可以很容易地得到功能性最小序列。
在另一实施方式中，前导序列是NisA(乳酸链球菌肽，乳酸乳球菌)或ProcA(Prochlorosin，原绿球藻MIT9313或原绿球藻MIT9303)前导序列，或者具有可以源自于NisA或ProcA前导序列的共有基序。
本文公开的其他实施方式
本文公开的其他实施方式：
1.一种在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的方法，其包括以下步骤：
(a)提供带有编码前体环肽的核酸序列的宿主细胞；
(b)引起或允许所述前体环肽的表达；
(c)使前体环肽内的一个或多个氨基酸残基酶脱水；
(d)通过使一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联，形成一个或多个分子内键，从而形成环肽；和
(e)在所述宿主细胞中产生噬菌体颗粒，其中所述噬菌体颗粒在表面上展示所述环肽，并且其中所述环肽与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接。
2.根据实施方式1所述的方法，其中所述核酸序列进一步编码噬菌体颗粒的外被蛋白和由翻译后修饰(PTM)酶识别的前导序列。
3.根据前述实施方式之一所述的方法，其中宿主细胞进一步具有一个或多个编码翻译后修饰(PTM)酶的核酸序列。
4.根据实施方式2-3之一所述的方法，其中所述翻译后修饰(PTM)酶是羊毛硫肽合成酶。
5.根据实施方式2-4之一所述的方法，其中所述翻译后修饰(PTM)酶是LanB型脱水酶、LanC型环化酶和/或双功能LanM型酶或多功能LanKC或LanL型酶。
6.根据实施方式2-5之一所述的方法，其中所述前导序列是来自LanA前体肽的前导序列，或者是衍生自LanA前体肽的前导序列，或者是带有来自LanA前体肽的共有基序的前导序列。
7.根据实施方式6所述的方法，其中所述前导序列由LanB型脱水酶、LanC型环化酶、双功能LanM型酶或多功能LanKC或LanL型酶识别。
8.根据实施方式2-7之一所述的方法，其中所述前导序列是NisA或ProcA前导序列或者具有其共有基序。
9.根据前述实施方式之一所述的方法，其中一种或多种分子内键通过环化酶或者在弱碱性条件下形成。
10.根据前述实施方式之一所述的方法，其中脱水残基是脱氢丙氨酸(Dha)或脱氢氨基丁酸(Dhb)。
11.根据前述实施方式之一所述的方法，其中分子内键是硫醚-或赖丙氨酸-桥。
12.根据前述实施方式之一所述的方法，其中所述外被蛋白是野生型噬菌体外被蛋白。
13.根据实施方式12所述的方法，其中所述噬菌体外被蛋白是或者源自于野生型外被蛋白pIII或野生型外被蛋白pVIII。
14.根据前述实施方式之一所述的方法，其中所述环肽经由基因融合或者经由通过一个或多个人工引入的半胱氨酸形成的二硫键与所述噬菌体颗粒的外被蛋白的C-端连接。
15.一种能够在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的核酸序列，其中核酸序列编码：
(a)所述噬菌体颗粒的外被蛋白；
(b)由翻译后修饰(PTM)酶识别的前导序列；和
(c)前体环肽，
其中编码前体环肽的核酸位于所述噬菌体颗粒的外被蛋白的C-端，
并且其中所述前体环肽能够通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联而形成分子内键。
16.根据实施方式15所述的核酸序列，其从N-端到C-端具有以下排列：
N-(噬菌体外被蛋白)-(由翻译后修饰(PTM)酶识别的前导序列)-(前体环肽)-C。
17.根据实施方式15-17所述的核酸序列，其中所述前导序列是来自LanA前体肽的前导序列，或者是衍生自LanA前体肽的前导序列，或者是带有来自LanA前体肽的共有基序的前导序列。
18.根据实施方式15-17之一所述的核酸序列，其中前体环肽包括至少一个或多个丝氨酸或苏氨酸和一个或多个半胱氨酸或赖氨酸。
19.一种载体，其包括根据实施方式15-18所述的核酸。
20.一种宿主细胞，其包括根据实施方式15-18所述的核酸或根据实施方式19所述的载体。
21.一种在其表面上展示环肽的噬菌体颗粒，其通过根据实施方式1-14之一所述的方法得到。
22.一种在其表面上展示环肽的噬菌体颗粒，其中所述环肽与所述噬菌体颗粒的外被蛋白的C-端连接，并且其中所述多肽包括通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联而形成的分子内键。
23.根据实施方式21或22所述的噬菌体颗粒，其还包括载体，该载体包括一个或多个编码能够形成所述环肽的前体环肽的核酸序列。
24.根据实施方式23所述的噬菌体颗粒，其中所述载体是实施方式19的载体。
25.一种实施方式21-24中任一个所述的噬菌体颗粒的多样收集物，其中所述噬菌体颗粒的每一个展示环肽多样收集物中的环肽，其中所述环肽包括通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联而形成的分子内键。
26.一种获得具有所需特性的环肽的方法，其包括：
(a)提供根据实施方式25所述的噬菌体颗粒的多样收集物；和
(b)筛选所述多样收集物和/或从所述多样收集物选择，以得到至少一种展示具有所需特性的环肽的噬菌体颗粒。
27.根据实施方式26所述的方法，其中所述的所需特性是与所关注的靶标结合。
工作实施例
实施例1：使用Xa因子-切割报道基因检验的大肠杆菌(E.coli)中可溶性硫醚-桥接肽的异源性表达和修饰状态的确认
在以下实施例中，所有分子生物学实验均根据标准方案进行(Ausubel等人,1999)。
载体的构建和模型肽(包括Xa因子-切割位点的肽)的可溶性表达：
大肠杆菌中硫醚-桥接羊毛硫抗生素的异源性表达最近已得以说明，其通过前体肽与相关修饰肽一起的共表达实现(Shi等人,J Am Chem Soc.2011Mar 2；133(8):2338-41)。我们开发出能够对其在复杂生物样品中的修饰状态进行迅速评价并且仅需要微量材料的报道基因肽。这些肽由与人工中心肽融合的前导肽(例如，源自NisA、ProcA和其他)组成，其包括侧面被用于酶促硫醚-桥部分的底物残基相接的Xa因子蛋白酶切割位点和两个用于检测的亲合力标记(例如His6-和FLAG-标记)。
将编码这些肽的DNA序列在IPTG-诱导型Lac-启动子的控制下克隆到具有氨苄青霉素抗性基因和ColE1复制源的大肠杆菌表达质粒中。将产生的质粒与相容性第二质粒(氯霉素抗性，RSF1030复制源)合并，所述相容性第二质粒编码用于在IPTG诱导的PL1acO1-启动子的控制下进行翻译后修饰(例如NisB/NisC、ProcM和其他)的相关酶(羊毛硫肽合成酶)并在相同的大肠杆菌株细胞中共保持。在大肠杆菌株中IPTG共诱导时，产生线性前体肽，随后对其进行酶介导的PTM修饰，其导致底物残基在侧翼与Xa因子-切割位点共价连接，并形成稳定的硫醚-桥。
表达之后，将用Xa因子蛋白酶处理肽导致识别位点的精氨酸与相邻残基之间的肽键水解。但是，并没有得到两种分别含有切割位点侧翼的亲合力标记之一的单独多肽，稳定的硫醚-桥保持了包括两个亲合力标签的两种多肽的连接。
因此，在夹心式酶联免疫吸附测定(ELISA)中在Xa因子切割之后对两种亲合力标记的共检测可以因此用于确认模型肽的所需修饰(环化)，而对于未修饰的肽(线性)，两个标记中仅有一种可检测。
对这种Xa因子-切割报道基因检验在检测模型肽修饰状态中的可靠性进行了如下说明(图1)。含有与NisA-前导肽融合的ompA信号序列、和由位于ASWIEGRWCN(SEQ-ID.:1)序列(S和C是酶介导的硫醚-桥部分的底物；IEGR：Xa因子识别基序)侧翼的His6-和FLAG-标记组成的中心肽的模型肽，在存在或不存在NisB和NisC修饰酶共表达的情况下在大肠杆菌MC1061F'中表达。
最为对照修饰，在存在或不存在NisB和NisC的情况下表达其他序列相同的无能力突变肽(S突变成A，或者C突变成A)。
所有菌株均在37℃、220rpm条件下生长，直至早期对数期，通过加入0.25mM IPTG诱导肽和酶的表达，培养物生长在22℃下持续过夜。建立起细胞溶解产物，将每个菌株的可溶性蛋白质部分分为四份转移至抗-His IgG涂覆的384孔板，以经由His6-标记捕获表达的模型肽。洗涤(4x TBS，lx Xa因子反应缓冲液)之后，每个样品的复制之一用500nM Xa因子蛋白酶消化过夜，而另一份不予处理。将板用TBST洗涤之后，加入生物酰化的抗-FLAG IgG，使用链霉亲和素:SULFO-标记缀合物(使用Meso Scale Discovery SECTOR Imager6000测量电化学发光)检测完整的肽。将不经Xa因子处理得到的信号设定成100％(输入)，计算Xa因子处理之后相同样品的信号比(Xa-处理之后保留的信号[％])。因此，得到的值反映了Xa-切割抗性肽的百分比，其为硫醚-桥形成效率的直接度量。
如图1所示，在NisB和NisC酶共表达时，得到大约60％切割抗性肽，而在不存在修饰酶的情况下产生的肽几乎完全切割(左图)。相反地，含有S至A(中图)或C至A(右图)突变的肽变体不是硫醚-桥酶形成的底物，当在NisB和NisC共表达的存在下产生时，完全被Xa因子切割。
实施例2：含有NisA-前导的前体肽与pIII的C-端融合支持生产细胞中硫醚-桥的酶形成和噬菌体上的展示
在大多数噬菌体展示应用中，所关注的蛋白质或肽与g3p(次要外被蛋白pIII)或g8p(主要外被蛋白pVIII)的N-端基因融合，分别导致单价和多价展示。pIII和pVIII的N-端被导向远离噬菌体颗粒体，据信其支持展示的蛋白质或肽与假定的所关注配体相结合的可及性。
但是，除广泛应用的所关注的蛋白在N-端上的展示以外，极少有对在pIII和pVIII对应的C-端上的噬菌体展示的例子(Fuh等人,FEBS Lett.2000Sep l；480(2-3):231-4；Held等人,J Mol Biol.2004Jul9；340(3):587-97)的描述。
对于环状模型肽在噬菌体上的展示，将含有图1所示的模型前体肽序列的相同NisA-前导序列克隆到噬菌粒载体中，作为噬菌体g3p N-端和C-端的基因融合物(N-端截短的变体pIII-CT)，以测试酶法肽修饰和与噬菌体颗粒上展示的相容性。
我们在存在或不存在关联修饰肽共表达的情况下产生了编码这些融合物的噬菌体颗粒，并对其进行Xa因子-切割报道基因检验。
简言之，在存在或不存在编码修饰NisB和NisC酶的第二表达质粒的存在下，将用于N-端或C-端模型前体肽(含有NisA-前导序列)与pIII的融合物的带有表达质粒的大肠杆菌MC1061F'细胞分三份生长。将培养物在37℃、220rpm下在24孔板中生长至早期对数期，并在～10个的感染重数下用VCSM13辅助噬菌体感染。通过离心收获感染细胞之后，通过含有IPTG的培养基诱导pIII-融合物和修饰酶的表达，使噬菌体产生在22℃下进行16h。通过离心除去生产细胞之后，将含有噬菌体的上清液分四份转移至涂有抗-M13(Santa Cruz)IgG的384孔板中，以经由主要外被蛋白pVIII捕获噬菌体颗粒。
洗涤(4x TBS，lx Xa因子反应缓冲液)之后，样品双份之一用500nM Xa因子蛋白酶消化过夜，而另一份不予处理。
将板用TBST洗涤之后，加入生物素化抗-FLAG IgG(Sigma；对于N-端pIII-融合物)或生物素化抗-His IgG(R&D Systems；对于C-端pIII-融合物)，使用链霉亲和素:SULFO-TAG缀合物(电化学发光使用Meso Scale Discovery SECTOR Imager 6000测量)检测完整的肽。将不经Xa因子处理得到的信号设定成100％(输入)，计算Xa因子处理之后相同样品的信号比(Xa-处理之后保留的信号[％])。因此，得到的值反映了Xa-切割抗性肽的百分比，其为硫醚-桥形成效率的直接度量。
如图2A所示，噬菌体产生过程中NisB和NisC酶的共表达导致与pIII C-端融合的前体肽的硫醚-桥酶修饰，以及随后的环肽在噬菌体表面上的展示(左图)。相反地，相同前体肽与pIII N-端的融合物不产生NisB/NisC-介导的修饰，噬菌体上检测不到环肽(右图)。这一结果进一步通过使用可溶性表达的麦芽糖-结合蛋白质(MBP)作为前体肽融合载体得到的结果支持，其中C-端的肽融合物被酶修饰(图2C，左图)，而NisB/NisC不能修饰N-端融合物(图2C，右图；样品制备和检验设置如实施例1所述)。在C-端前体肽与pIII融合物的上下文中，残基的突变涉及到硫醚-桥的形成，例如，丝氨酸至丙氨酸(pIII-NisA-Pep_A/C；图2B，左图)或半胱氨酸至丙氨酸(pIII-NisA-Pep_S/A；图2B，右图)消除了环肽的形成和展示，这进一步强调了定制的肽修饰实现的精度。
实施例3：翻译后修饰肽的C-端pIII噬菌体展示是广泛适用的，并可以转移至其他酶系统
所述在噬菌体结构蛋白质的C-端上展示翻译后修饰肽的方法可以很容易地适用于其他酶或半酶修饰系统，如下文概述。在另一实施例中，将模型前体肽与pIII的C-端融合(质粒：pL3C_P3.3_mut10-His)，其含有Prochlorosin3.3(ProcA3.3)前导肽和核心肽序列GDAGIOAVLASWIEGRECNAAAGP(SEQ-ID.:6；Xa因子切割位点和用于翻译后修饰的侧翼S和C残基加以下划线)，之后是His6-标记。除对照构建物以外，还将亲本核心肽的丝氨酸突变成苏氨酸(以测试经由脱氢氨基丁酸的甲基羊毛硫氨酸形成)，或者将半胱氨酸突变成丙氨酸(以防止硫醚-桥的酶形成)。
将已知修饰若干天然存在的Prochlorosin(包括ProcA3.3)前体的编码双功能脱水酶/环化酶的来自原绿球藻MIT9313的procM基因由染色体DNA扩增，并克隆到大肠杆菌表达质粒中。在存在或不存在ProcM酶共表达的情况下产生展示模型前体肽的噬菌体，并如上所述进行Xa因子-切割报道基因检验。当在双特异性修饰ProcM酶的存在下产生时，检测到Xa-切割抗性肽融合物具有含有丝氨酸/半胱氨酸-(ProcA-Pep_S/C-pIII；图3，左图)和苏氨酸/半胱氨酸-(ProcA-Pep_T/C-pIII；图3，中图)的核心序列的变体，其分别表明包括羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸的环肽的形成和展示。再次，当参与形成硫醚-桥的半胱氨酸被突变成丙氨酸时，环肽的形成/展示被取消(ProcA-Pep_S/A-pIII；图3，右图)。
实施例4：环大小灵活的翻译后修饰的肽的C-端pIII噬菌体展示
通过调节酶修饰要求的丝氨酸和苏氨酸残基相对于半胱氨酸的间隔，可以在噬菌体上展示环大小合适的C-端pIII-肽融合物。在另一实施方式中，建立丝氨酸与半胱氨酸间隔增加的编码模型前体肽序列，并与pIII的C-端融合。在此，将FLAG-标记和ASWIEGRECN-(SEQ-ID.:11)、ASWAAIEGRAECN-(SEQ-ID.:12)、ASWAAAIEGRAAAECN-(SEQ-ID.:13)或ASWAAGAAIEGRAAGAAECN-基序(SEQ-ID.:14；分别能够实现环大小i,i+7、i,i+10、i,i+13和i,i+17；Xa因子切割位点加下划线)之后以及His6-标记之后的NisA-前导肽与pIII的C-端融合。类似地，将HA-标记和ASWIEGRECN-(SEQ-ID.:11)、ASWAAIEGRAECN-(SEQ-ID.:12)、ASWAAAIEGRAAAECN-(SEQ-ID.:13)或ASWAAGAAIEGRAAGAAECN-基序(SEQ-ID.:14)之后，以及His6-标记之后的ProcA3.3-前导肽与pIII的C-端融合。分别在存在或不存在关联修饰NisB/NisC或ProcM酶的情况下，产生具有NisA-或ProcA-前导序列的展示模型前体肽的噬菌体，并如上所述进行Xa因子-切割报道基因检验。使用NisB/NisC(图5A)和ProcM(图5B)酶系统观察噬菌体上展示的Xa因子-切割抗性(硫醚-桥接)肽融合物。如通过切割抗性肽融合物百分比判断，所测试肽的修饰效率大大独立于环的大小。
工作实施例说明了与噬菌体pIII C端融合的含有前导序列的肽在大肠杆菌中的酶促翻译后修饰，以及随后在噬菌体颗粒上的展示。对于与噬菌体主要外被蛋白pVIII的C-端前体肽融合物，预期具有类似的结果。
本文所述方法广泛的应用性很容易是显而易见的，因为源自于关系甚远的物种例如乳酸-和蓝藻细菌的不同的酶机制/前导肽对均可以有效地用于安装翻译后修饰。类似地，该概念可以扩展至其他功能等同的前体肽/酶系统。
总之，经证实，通过脱水酶(例如NisB或双功能酶例如ProcM)将丝氨酸和苏氨酸残基分别翻译后脱水成具有高度化学反应性的脱氢丙氨酸和脱氢氨基丁酸，以及通过环化酶(例如NisC或双功能酶例如ProcM)形成环肽，与噬菌体展示是相容的。
另外可选地，在弱碱性条件下，含有脱氢丙氨酸的噬菌体展示的肽可以很容易地与相邻的半胱氨酸或赖氨酸残基反应，分别形成硫醚-和赖丙氨酸-桥，以形成许多种在噬菌体颗粒上展示的受限多肽结构。
序列表
<110> 莫佛塞斯公司
<120> 在噬菌体颗粒上展示环肽的新方法
<130> MS225/PCT
<150> EP14199588.6
<151> 2014-12-22
<160> 14
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
Ala Ser Trp Ile Glu Gly Arg Trp Cys Asn
1 5 10
<210> 2
<211> 424
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
Met Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser
1 5 10 15
His Ser Ala Glu Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu
20 25 30
Asn Ser Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr
35 40 45
Ala Asn Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys
50 55 60
Thr Gly Asp Glu Thr Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu
65 70 75 80
Ala Ile Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu
85 90 95
Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp
100 105 110
Thr Pro Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr
115 120 125
Pro Pro Gly Thr Glu Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu
130 135 140
Glu Ser Gln Pro Leu Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg
145 150 155 160
Asn Arg Gln Gly Ala Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Val Thr Gln Gly
165 170 175
Thr Asp Pro Val Lys Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys
180 185 190
Ala Met Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe
195 200 205
His Ser Gly Phe Asn Glu Asp Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln
210 215 220
Ser Ser Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
260 265 270
Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala
275 280 285
Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly
290 295 300
Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe
305 310 315 320
Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp
325 330 335
Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val Gly Asp Gly Asp Asn
340 345 350
Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln
355 360 365
Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe Ser Ala Gly Lys Pro Tyr Glu
370 375 380
Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala
385 390 395 400
Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala
405 410 415
Asn Ile Leu Arg Asn Lys Glu Ser
420
<210> 3
<211> 73
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr Leu
1 5 10 15
Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Gly Asp Asp Pro Ala Lys Ala
20 25 30
Ala Phe Asn Ser Leu Gln Ala Ser Ala Thr Glu Tyr Ile Gly Tyr Ala
35 40 45
Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly Ala Thr Ile Gly Ile Lys Leu
50 55 60
Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys Ala Ser
65 70
<210> 4
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
Leu Arg Asn Lys Glu Ser
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 5
Thr Ser Lys Ala Ser
1 5
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<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 6
Gly Asp Ala Gly Ile Gln Ala Val Leu Ala Ser Trp Ile Glu Gly Arg
1 5 10 15
Glu Cys Asn Ala Ala Ala Gly Pro
20
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 7
Leu Glu Glu Val Ser Glu Gln Glu Leu Asp
1 5 10
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 8
Leu Phe Asp Leu Asp Leu
1 5
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 9
Phe Asn Leu Asp Val
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 10
Ile Leu Glu Leu Gln Asn Leu Asp
1 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 11
Ala Ser Trp Ile Glu Gly Arg Glu Cys Asn
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 12
Ala Ser Trp Ala Ala Ile Glu Gly Arg Ala Glu Cys Asn
1 5 10
<210> 13
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 13
Ala Ser Trp Ala Ala Ala Ile Glu Gly Arg Ala Ala Ala Glu Cys Asn
1 5 10 15
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 14
Ala Ser Trp Ala Ala Gly Ala Ala Ile Glu Gly Arg Ala Ala Gly Ala
1 5 10 15
Ala Glu Cys Asn
20
Claims (15)
1.一种在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的方法，其包括以下步骤：
(a)提供带有编码前体环肽的核酸序列的宿主细胞；
(b)引起或允许所述前体环肽的表达；
(c)使所述前体环肽内的一个或多个氨基酸残基酶脱水；
(d)通过使所述一个或多个脱水的残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联，形成一个或多个分子内键，从而形成环肽；和
(e)在所述宿主细胞中产生噬菌体颗粒，其中所述噬菌体颗粒在表面上展示所述环肽，并且其中所述环肽与所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端连接。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸序列还编码噬菌体颗粒的外被蛋白和由翻译后修饰(PTM)酶识别的前导序列。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中宿主细胞还带有一个或多个编码翻译后修饰(PTM)酶的核酸序列。
4.根据权利要求2-3中任一项所述的方法，其中所述翻译后修饰(PTM)酶是羊毛硫肽合成酶。
5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中所述翻译后修饰(PTM)酶是LanB型脱水酶、LanC型环化酶和/或双功能LanM型酶或多功能LanKC或LanL型酶。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其中所述前导序列是来自LanA前体肽的前导序列，或者是衍生自LanA前体肽的前导序列，或者是带有来自LanA前体肽的共有基序的前导序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述前导序列由LanB型脱水酶、LanC型环化酶、双功能LanM型酶或多功能LanKC或LanL型酶识别。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一个或多个脱水的氨基酸残基是脱氢丙氨酸(Dha)或脱氢氨基丁酸(Dhb)。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分子内键是硫醚-或赖丙氨酸-桥。
10.一种能够在噬菌体颗粒的表面上展示环肽的核酸序列，其中核酸编码：
(a)所述噬菌体颗粒的外被蛋白；
(b)由翻译后修饰(PTM)酶识别的前导序列；和
(c)前体环肽，
其中编码所述前体环肽的核酸位于所述噬菌体颗粒外被蛋白的C-端，
并且其中所述前体环肽能够通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联而形成分子内键。
11.根据权利要求10所述的核酸序列，其中所述前导序列是来自LanA前体肽的前导序列，或者是衍生自LanA前体肽的前导序列，或者是带有来自LanA前体肽的共有基序的前导序列。
12.一种载体，其包括根据权利要求10-11所述的核酸。
13.一种在其表面上展示环肽的噬菌体颗粒，其通过根据权利要求1-9中任一项所述的方法获得。
14.一种根据权利要求21-24中任一项所述噬菌体颗粒的多样收集物，其中所述噬菌体颗粒中的每一种展示环肽多样收集物中的环肽，其中所述环肽包括通过将一个或多个脱水残基与半胱氨酸或赖氨酸偶联而形成的分子内键。
15.一种获得具有所需特性的环肽的方法，其包括：
(a)提供根据权利要求25所述的噬菌体颗粒的多样收集物；和
(b)筛选所述多样收集物和/或从所述多样收集物中选择，以得到至少一种展示具有所述所需特性的环肽的噬菌体颗粒。
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