JP2021527411A - 進化したプロテアーゼとプロテアーゼ切断部位の選択システム - Google Patents
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Abstract
Description
本開示は、分子生物学の分野に関する。より具体的には、本開示は、直交性のプロテアーゼ/プロテアーゼ切断部位を開発するために使用され得る融合タンパク質、前記融合タンパク質を使用する方法、ならびにbdSUMOの変異プロテアーゼ切断部位およびbdSENP1の変異プロテアーゼを提供する。
組み換えタンパク質の発現と精製は、現代の生化学および構造生物学、ならびに実用用途のためタンパク質およびタンパク質複合体の製造の基本である。
最も利用されるタンパク質発現系は、細菌E.コリであり、なぜなら、遺伝操作の容易性、生体生産の低価格、および速い成長動態のためである。しかしながら、E.コリは、典型的な真核性翻訳後修飾を導入できないため、多くの場合、適切に真核性タンパク質を折り畳むこともできない。その結果、真核宿主における発現は代替手段である。
マルトース結合タンパク質(MBP)、チオレドキシン(TRX)、またはNusAは、タグ、すなわち、特に、E.コリが発現宿主として使用される場合、融合標的タンパク質の発現、溶解性および良好な折り畳みのレベルを高めるものの別のカテゴリを例示する。
より一般的な表現では、本発明は、以下の構造:
N−PCSY−degSigN−M−PCSX−degSigC−C;
{式中、
Nは、N末端を表し;
PCSYとPCSXはそれぞれ、プロテアーゼ切断部位(PCS)を表すが、それは少なくとも1つのアミノ酸残基が互いに異なり;
degSigNは、分解シグナルを表すが、それは、degSigNの第一残基が残った融合の新しいN末端になるようにPCSYがプロテアーゼによって切断される場合、宿主細胞において融合タンパク質の分解を促進し;
Mは、細胞質選択マーカーを表し;
degSigCは、第二の分解シグナルを表すが、それは、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、宿主細胞において融合タンパク質の分解を促進し;および
Cは、C末端を表す}を含む融合タンパク質に関する。
本開示の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸構築物が更に提供される。
本開示の複数の多様化された核酸発現構築物を含む核酸発現構築物ライブラリもまた提供され、ここで、融合タンパク質のPCSYをコードする核酸は、コードされるPCSYにおいて、少なくとも1つのアミノ酸位置が多様化するような多様性を含む。
(i)本開示による第一の(多様化されていない)核酸構築物と、着目のプロテアーゼの発現のための第二の発現構築物を含む宿主細胞を準備し;ここで、該宿主細胞は、該融合タンパク質と前記着目のプロテアーゼとを同時に発現することができ、およびここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して該融合タンパク質の分解を促進し;かつ、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して該融合タンパク質の分解を促進し;
(ii)該融合タンパク質と該着目のプロテアーゼとが同時に発現されるような条件下、ステップ(i)の宿主細胞を培養し;そして
(iii)ステップ(ii)の宿主細胞を、該第一の核酸構築物によってコードされる融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒すこと;
を含み、
ここで、ステップ(iii)で適用された選択条件の存在下での宿主細胞の成長は、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYが前記着目のプロテアーゼによって切断されないで、かつ、前記第二のプロテアーゼ切断部位PCSXが前記第二の核酸発現構築物の前記着目のプロテアーゼによって切断されることを示し;好ましくは、ここで、該選択マーカーは該宿主細胞に抗生物質耐性を与える、方法を提供する。
(i)複数の宿主細胞を準備し、ここで、前記複数の宿主細胞の各メンバーは、本開示による複数の第一の核酸構築物のメンバー(それは、第一のプロテアーゼ切断部位PCSXの多様化された変異体PCSYをコードする)と、着目のプロテアーゼの発現のための第二の発現構築物とを含み、ここで、前記着目のプロテアーゼは、PCSXを切断することができ、それによって、複数の宿主細胞が、第一の核酸構築物によってコードされるタンパク質と前記着目のプロテアーゼとを同時に発現することができ、およびここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し;かつ、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進し;
(ii)該融合タンパク質と該着目のプロテアーゼが同時に発現されるような条件下、ステップ(i)の複数の宿主細胞を培養し;そして
(iii)ステップ(ii)の複数の宿主細胞を、該複数の第一の核酸構築物によってコードされる融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒し;
(iv)(ステップ(iii)で陽性として選択された)宿主細胞を同定し、および同定された宿主細胞の第一の核酸構築物のPCSYの配列を同定すること、ここで、PCSYは、第一のプロテアーゼ切断部位PCSXのプロテアーゼ切断部位変異体であり、およびここで、PCSYは、第二の発現構築物の前記着目のプロテアーゼによって切断されない、
を含む方法を提供する。
(i)複数の宿主細胞を準備し、ここで、各メンバーは、本開示による多様化されていない第一の核酸発現構築物(そこで、PCSXは、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYのプロテアーゼ切断部位変異体であり)を含み、ここで、PCSYは、着目の第一のプロテアーゼによって切断され、かつ、PCSXは、前記第一のプロテアーゼによって切断されず;およびここで、前記複数の宿主細胞の各メンバーは、前記第一のプロテアーゼのプロテアーゼ変異体を発現する複数の第二の発現構築物のメンバーを更に含み、ここで、前記複数の第二の核酸発現構築物は、前記第一のPCSYと相互作用するプロテアーゼ界面にて少なくとも1つのアミノ酸位置における多様性を含み、それにより、複数の宿主細胞が、融合タンパク質と前記着目のプロテアーゼを同時に発現することができ、およびここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し;かつ、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進し;
(ii)該融合タンパク質と着目のプロテアーゼとが同時に発現されるような条件下、ステップ(i)の複数の宿主細胞を培養し;そして
(iii)ステップ(ii)の複数の宿主細胞を、該第一の核酸発現構築物によってコードされる融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒し;そして
(iv)(ステップ(iii)で陽性として選択された)宿主細胞を同定し、および同定された宿主細胞の第二の核酸構築物によってコードされるプロテアーゼ変異体の配列を同定すること、ここで、前記プロテアーゼ変異体は、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYのプロテアーゼ切断部位変異体PCSXを切断することができるが、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYを切断することができない、
を含む方法に更に関連する。
(i)複数の宿主細胞を準備し、ここで、前記複数の宿主細胞の各メンバーは、本開示による複数の第一の核酸構築物のメンバー(それは、第一のプロテアーゼ切断部位PCSXの多様化された変異体PCSYをコードする)と、着目の第一のプロテアーゼPXの発現のための第二の発現構築物(それは、PCSXを切断することができ、それにより、複数の宿主細胞が、融合タンパク質と前記着目の第一のプロテアーゼとを同時に発現することができる)とを含み、およびここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し;かつ、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進し;
(ii)該融合タンパク質と第一のプロテアーゼPXが同時に発現されるような条件下、ステップ(i)の複数の宿主細胞を培養し;そして
(iii)ステップ(ii)の複数の宿主細胞を、該複数の第一の核酸構築物によってコードされる融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒し;
(iv)(ステップ(iii)で陽性として選択された)宿主細胞を同定し、およびPCS#を同定し、ここで、PCS#は、同定された宿主細胞の第一の核酸構築物からのPCSYの配列であり、ここで、PCS#は、第一のプロテアーゼ切断部位PCSXのプロテアーゼ切断部位変異体であり、およびここで、PCS#は、前記第一のプロテアーゼPXによって切断されない一方で、PCSXは、PXによって切断され;
N−PCS*−degSigN−M−PCS#−degSigC−C;
{式中、Nは、N末端を表し、PCS#は、ステップ(iv)で同定されたPCSYの配列であり、PCS*は、第二のプロテアーゼ切断部位(それは、PCSXと同一であっても、もしくは同一でなくてもよく、かつ、それは、少なくとも1つのアミノ酸残基でPCS#と異なる)であり、degSigNは、分解シグナル(それは、degSigNの第一の残基が残った融合の新しいN末端になるように、PCS*がプロテアーゼによって切断される場合、宿主細胞における融合タンパク質の分解を促進する)を表し、Mは、細胞質選択マーカーを表し、およびdegSigCは、第二の分解シグナル(それは、PCS#がプロテアーゼによって切断されない場合、宿主細胞において融合タンパク質の分解を促進する)を表し、ならびにCは、C末端を表す}を含む多様化されていない融合タンパク質をコードする、第三の核酸発現構築物を含み;
かつ、ここで、前記第二の複数の宿主細胞の各メンバーは、プロテアーゼP*のプロテアーゼ変異体を発現する複数の第四の発現構築物のメンバーを更に含み、ここで、前記プロテアーゼP*は、degSigNの第一の残基が残った融合の新しいN末端になるように、PCS*を切断することができ、ここで、前記複数の第四の核酸発現構築物は、前記第一のプロテアーゼ切断部位PCS*と相互作用する前記プロテアーゼP*のプロテアーゼ界面にて少なくとも1つのアミノ酸位置における多様性を更に含み、それにより、複数の宿主細胞が、多様化されていない融合タンパク質と前記プロテアーゼ変異体を同時に発現することができ、およびここで、該宿主細胞は、PCSXがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し;かつ、PCS#がプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進し;
(vi)該融合タンパク質とプロテアーゼPXの変異体が同時に発現されるような条件下、ステップ(v)の複数の宿主細胞を培養し;
(vii)ステップ(vi)の複数の宿主細胞を、該第三の核酸発現構築物によってコードされた融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒し;そして
(viii)(ステップ(vii)で陽性として選択された)細胞を同定し、およびP#を同定し、ここで、P#は、同定された宿主細胞の第四の核酸構築物によってコードされるプロテアーゼP*のプロテアーゼ変異体の配列であり、そしてそのプロテアーゼ変異体P#は、プロテアーゼ切断部位変異体PCS#を切断することができ、そしてそれは、第一の切断部位PCS*を切断することができず;
を含む方法を提供する。
(i)精製されるべき着目のタンパク質を準備し、ここで、前記タンパク質は、本開示による変異プロテアーゼ切断部位を介して前記タンパク質に融合されたアフィニティータグを含み;
(ii)前記アフィニティータグを介して、ステップ(i)のタンパク質をアフィニティーマトリックスに結合させ;そして
(iii)本開示の変異プロテアーゼを使用して該アフィニティーマトリックスから該タンパク質を溶出させ;それによって、タンパク質を精製すること、
を含むプロセスを提供する。
直交特異性を有する新しいタンパク質切断部位とプロテアーゼを選択するためのインビボにおけるシステム
本願発明の第一の部分は、基準SUMO−プロテアーゼ/基質対と比較した場合に、SUMO特異的プロテアーゼ/SUMOタンパク質対を直交特異性に進化させるためのE.コリにおけるインビボ選択システムを作製することであった。このシステムは、あるSUMO変異体「X」の切断「のため」のもの、および別のSUMO変異体「Y」の切断「に抵抗する」ものを同時に選択できる。そのために、我々は、ssrA分解シグナル(Keiler 2008; Himeno et al. 2014に概説)、N末端則デグロン(DegronNER)(Bachmair et al. 1986)、およびハイグロマイシンBの存在下でE.コリ細胞が生き残れるようにするハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ(HygB)(Rao et al. 1983)を使用した。選択の間、HygBは、SUMOY−DegronNER−HygB−SUMOX−ssrA融合タンパク質と表される(図1)。
N−PCSY−degSigN−M−PCSX−degSigC−C;
{式中、
Nは、N末端を表し;
PCSYとPCSXはそれぞれ、プロテアーゼ切断部位(PCS)を表すが、それは少なくとも1つのアミノ酸残基が互いに異なり;
degSigNは、分解シグナルを表すが、それは、degSigNの第一のアミノ酸が残った融合の新しいN末端になるようにPCSYがプロテアーゼによって切断される場合、宿主細胞において融合タンパク質の分解を促進し;
Mは、細胞質選択マーカーを表し;
degSigCは、第二の分解シグナルを表すが、それは、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、宿主細胞において融合タンパク質の分解を促進し;および
Cは、C末端を表す}を有する融合タンパク質を提供する。
(i)本開示による第一の核酸構築物と、着目のプロテアーゼの発現のための第二の発現構築物を含む宿主細胞を準備し;ここで、該宿主細胞は、該融合タンパク質と前記着目のプロテアーゼとを同時に発現することができ、およびここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して該融合タンパク質の分解を促進し;かつ、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して該融合タンパク質の分解を促進し;
(ii)該融合タンパク質と該着目のプロテアーゼとが同時に発現されるような条件下、ステップ(i)の宿主細胞を培養し;そして
(iii)ステップ(ii)の宿主細胞を、該第一の核酸構築物によってコードされる融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒すこと;
を含み、
ここで、ステップ(iii)で適用された選択条件の存在下での宿主細胞の成長は、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYが前記着目のプロテアーゼによって切断されないで、かつ、前記第二のプロテアーゼ切断部位PCSXが前記第二の核酸発現構築物の前記着目のプロテアーゼによって切断されることを示す、方法を提供する。先に示したとおり、細胞質選択マーカーは、有利なことに、宿主細胞に抗生物質耐性を付与し、それによって、そこで着目のプロテアーゼがPCSXを切断するが、PCSYを切断しない細胞を陽性として選択し得る。
(i)複数の宿主細胞を準備し、ここで、前記複数の宿主細胞の各メンバーは、第一のプロテアーゼ切断部位PCSXの多様化された変異体PCSYをコードする複数の第一の核酸構築物を伴う、本開示による複数の第一の核酸構築物のメンバーと、着目のプロテアーゼの発現のための第二の発現構築物とを含み、ここで、前記着目のプロテアーゼは、PCSXを切断することができ、それによって、複数の宿主細胞が、第一の核酸構築物によってコードされるタンパク質と前記着目のプロテアーゼとを同時に発現することができ、およびここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し;かつ、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進し;
(ii)該融合タンパク質と該着目のプロテアーゼが同時に発現されるような条件下、ステップ(i)の複数の宿主細胞を培養し;そして
(iii)ステップ(ii)の複数の宿主細胞を、該複数の第一の核酸構築物によってコードされる融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒し;そして、
(iv)(ステップ(iii)で陽性として選択された)宿主細胞を同定し、および同定された宿主細胞の第一の核酸構築物のPCSY(そのPCSYは、第一のプロテアーゼ切断部位PCSXのプロテアーゼ切断部位変異体であり、およびそのPCSYは、第二の発現構築物の前記着目のプロテアーゼによって切断されない)の配列を同定すること、
を含む方法を提供する。
(i)複数の宿主細胞を準備し、ここで、各メンバーは、本開示による多様化されていない第一の核酸発現構築物(そこで、PCSXは、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYのプロテアーゼ切断部位変異体であり)を含み、ここで、PCSYは、着目の第一のプロテアーゼによって切断され、かつ、PCSXは、前記第一のプロテアーゼによって切断されず;およびここで、前記複数の宿主細胞の各メンバーは、前記着目の第一のプロテアーゼのプロテアーゼ変異体を発現する複数の第二の発現構築物のメンバーを更に含み、ここで、前記複数の第二の核酸発現構築物は、前記第一のPCSYと相互作用するプロテアーゼ界面にて少なくとも1つのアミノ酸位置における多様性を含み、それにより、複数の宿主細胞が、融合タンパク質と前記着目のプロテアーゼを同時に発現することができ、およびここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し;かつ、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進し;
(ii)該融合タンパク質と着目のプロテアーゼとが同時に発現されるような条件下、ステップ(i)の複数の宿主細胞を培養し;そして
(iii)ステップ(ii)の複数の宿主細胞を、該第一の核酸発現構築物によってコードされる融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒し;
(iv)(ステップ(iii)で陽性として選択された)宿主細胞を同定し、および同定された宿主細胞の第二の核酸構築物によってコードされるプロテアーゼ変異体の配列を同定すること、ここで、該プロテアーゼ変異体は、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYのプロテアーゼ切断部位変異体PCSXを切断することができるが、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYを切断することができない、
を含む方法を提供する。
(i)複数の宿主細胞を準備し、ここで、前記複数の宿主細胞の各メンバーは、本開示による複数の第一の核酸構築物のメンバー(それは、第一のプロテアーゼ切断部位PCSXの多様化された変異体PCSYをコードする)と、着目の第一のプロテアーゼPXの発現のための第二の発現構築物(それは、PCSXを切断することができ、それにより、複数の宿主細胞が、融合タンパク質と前記着目の第一のプロテアーゼとを同時に発現することができる)とを含み、およびここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し;かつ、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進し;
(ii)該融合タンパク質と第一のプロテアーゼPXが同時に発現されるような条件下、ステップ(i)の複数の宿主細胞を培養し;そして
(iii)ステップ(ii)の複数の宿主細胞を、該複数の第一の核酸構築物によってコードされる融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒し;
(iv)(ステップ(iii)で陽性として選択された)宿主細胞を同定し、およびPCS#を同定し、ここで、PCS#は、同定された宿主細胞の第一の核酸構築物からのPCSYの配列であり、ここで、PCS#は、第一のプロテアーゼ切断部位PCSXのプロテアーゼ切断部位変異体であり、およびここで、PCS#は、前記第一のプロテアーゼPXによって切断されない一方で、PCSXは、PXによって切断され;
N−PCS*−degSigN−M−PCS#−degSigC−C;
{式中、Nは、N末端を表し、PCS#は、ステップ(iv)で同定されたPCSYの配列であり、PCS*は、第二のプロテアーゼ切断部位(それは、PCSXと同一であっても、もしくは同一でなくてもよく、かつ、それは、少なくとも1つのアミノ酸残基でPCS#と異なる)であり、degSigNは、分解シグナル(それは、degSigNの第一のアミノ酸が残った融合の新しいN末端になるように、PCS*がプロテアーゼによって切断される場合、宿主細胞における融合タンパク質の分解を促進する)を表し、Mは、細胞質選択マーカーを表し、およびdegSigCは、第二の分解シグナル(それは、PCS#がプロテアーゼによって切断されない場合、宿主細胞において融合タンパク質の分解を促進する)を表し、ならびにCは、C末端を表す}を含む多様化されていない融合タンパク質をコードする、第三の核酸発現構築物を含み;
かつ、ここで、前記第二の複数の宿主細胞の各メンバーは、プロテアーゼP*のプロテアーゼ変異体を発現する複数の第四の発現構築物のメンバーを更に含み、ここで、前記プロテアーゼP*は、degSigNの第一のアミノ酸が残った融合の新しいN末端になるように、PCS*を切断することができ、ここで、前記複数の第四の核酸発現構築物は、前記第一のプロテアーゼ切断部位PCS*と相互作用する前記プロテアーゼP*のプロテアーゼ界面にて少なくとも1つのアミノ酸位置における多様性を含み、それにより、複数の宿主細胞が、多様化されていない融合タンパク質と前記プロテアーゼ変異体を同時に発現することができ、およびここで、該宿主細胞は、PCS*がプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し;かつ、PCS#がプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進し;
(vi)該融合タンパク質とプロテアーゼP*の変異体が同時に発現されるような条件下、ステップ(v)の複数の宿主細胞を培養し;
(vii)ステップ(vi)の複数の宿主細胞を、該第三の核酸発現構築物によってコードされた融合タンパク質の細胞質選択マーカーMのための同族選択剤を使用した選択条件に晒し;そして
(viii)(ステップ(vii)で陽性として選択された)細胞を同定し、およびP#を同定し、ここで、P#は、同定された宿主細胞の第四の核酸構築物によってコードされるプロテアーゼP*のプロテアーゼ変異体の配列であり、そしてそのプロテアーゼ変異体P#は、プロテアーゼ切断部位変異体PCS#を切断することができ、そしてそれは、第一の切断部位PCSXを切断することができず;
その結果、PCS*とプロテアーゼP*、および変異体PCS#と変異プロテアーゼP#から成る直交性プロテアーゼ/プロテアーゼ切断部位システムを得ること、
を含む方法を更に提供する。
先に開示した方法を適用して、我々の作業の第二の成果は、SUMOstarプロテアーゼによって切断されない新しいSUMO変異体を進化させたことであった。我々は基準プロテアーゼとしてSUMOstarを選択したが、なぜなら、それがこれまで最も雑多なSUMOプロテアーゼであり、そして、すべてのこれまでに試験された野生型SUMOだけではなく、基質としてのSUMOstar変異体もまた受け入れるからである(表1、図14および図15を参照のこと)。そのため、SUMOstarプロテアーゼ抵抗性の選択は、進化した広範囲直交性SUMO変異体に関する最もストリンジェントな評価基準であると思われる。
この変異体がUlp1によって切断され、かつ、SUMOstarプロテアーゼがS.セレビシエSUMO融合(Frey & Gorlich 2014b)のそれと比べて既に約10倍低い効率なので、我々はbdSUMOを出発点として選択した。
先に記載したように、我々の発明はまた、SUMOstarではなく、bdSUMOMut1を切断するbdSENP1プロテアーゼ変異体の新規作製を含む。斯かる変異体を得るために、bdSENP1の4つの残基(R269、N280、R346およびK350)がランダムに突然変異誘発された。これらの4つの残基は、それらが(先に記載の多重配列整列に基づいて)bdSUMOで変異した残基と相互作用する可能性があるので、選択された。所望のbdSENP1変異体を選択するために、我々は、我々が設計したインビボ選択方法を使用した。該スクリーン中に使用した構築物は、SUMOstar−DegronNER−HygB−bdSUMOMut1−ssrA融合体であった(図4−A)。SUMOstarは、プロテアーゼ切断に対して選択するためにHygBのN末端に配置され、それに対して、bdSUMOMut1は、有望なbdSENP1変異体による効果的なタンパク質切断について選択するためにC末端にてクローン化された。
本願発明の別の態様は、真核宿主におけるSUMOveraシステムの有用性である。E.コリと異なって、真核生物は内因性SUMO特異的プロテアーゼを有し、それによって、真核宿主におけるSUMOタグ付与タンパク質の発現は、SUMO融合の時期尚早な切断をもたらす。scSUMOやbdSUMOと対照的に、bdSUMOMut1は、S.セレビシエにおいて過剰発現される場合(実施例3)または様々な真核細胞溶解物における何時間ものインキュベーション後でさえ(植物、カエルの卵、ヒトまたは昆虫細胞由来、実施例4を参照のこと)、融合タンパク質として安定した状態を保つ。実際には、bdSUMOMut1融合物はSUMOstar融合物より安定している。
我々は、bdSUMOおよびbdSENP1における突然変異の特定の群が二成分SUMOveraシステムの新しい特徴をどのようにもたらしたか、広く特徴づけした。しかしながら、選択後にbdSUMOおよびbdSENP1変異体の非常に小さい集団しか分析および特徴づけしなかったので、同じ位置における様々なセットの突然変異が同じ結果につながる場合もあるかどうかわからなかった。そのため、我々は、bdSUMOMut1と同じであるかまたは類似した特性を有する、より多くのbdSUMO変異体を単離することが可能であるかどうか調査することに決めた。
(i)精製されるべき着目のタンパク質を準備し、ここで、前記タンパク質は、本開示による変異プロテアーゼ切断部位と一緒に前記タンパク質に融合されたアフィニティータグを含み;
(ii)前記アフィニティータグを介して、ステップ(i)のタンパク質をアフィニティーマトリックスに結合させ;そして
(iii)本開示の(同族)変異プロテアーゼを使用して該アフィニティーマトリックスから該タンパク質を溶出させ、それによって、タンパク質を精製すること、
を含むプロセスを提供する。好適なアフィニティータグおよび対応するアフィニティーマトリックスは、当業者に公知であり、そしてアフィニティー精製プロセスは、所定の手順だけを使用して実施できる。
1.
以下の構造:
N−PCSY−degSigN−M−PCSX−degSigC−C;
{式中、
Nは、N末端を表し;
PCSYとPCSXはそれぞれ、プロテアーゼ切断部位(PCS)を表すが、それは、degSigNの第一アミノ酸が残った融合の新しいN末端になるように、少なくとも1つのアミノ酸残基が互いに異なり;
degSigNは、分解シグナルを表すが、それは、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、宿主細胞において融合タンパク質の分解を促進し;
Mは、細胞質選択マーカーを表し;
degSigCは、第二の分解シグナルを表すが、それは、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、宿主細胞において融合タンパク質の分解を促進し;および
Cは、C末端を表す}を含む融合タンパク質。
前記PCSYおよび/またはPCSXが、配列番号3に示されたbdSUMO、bdSUMOのパラログもしくはオルソログ、または配列番号3(bdSUMO)の完全長に対して少なくとも80%の配列同一性を有する機能的に同等な変異体から選択されるプロテアーゼ切断部位;任意選択で、前記PCSYおよび/またはPCSXが、bdSUMOのパラログもしくはオルソログ、または配列番号3(bdSUMO)の完全長に対して少なくとも80%の配列同一性を有するbdSUMOの機能的に同等な変異体から選択される、実施形態1に記載の融合タンパク質。
前記PCSYとPCSXが、少なくとも1つのアミノ酸残基(それは、PCSXの同族プロテアーゼと相互作用するPCS界面に存在する)で;好ましくは少なくとも2のアミノ酸残基(それは、PCSXの同族プロテアーゼと相互作用するPCS界面に存在する)で;より好ましくは少なくとも3つのアミノ酸残基(それは、PCSXの同族プロテアーゼと相互作用するPCS界面に存在する)で互いに異なる、実施形態1または2に記載の融合タンパク質。
前記degSigNが、アミノ酸配列FLFVQ(DegronNER;配列番号1)を含む、実施形態1〜3のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
前記Mが抗生物質選択剤に対する抵抗性を提供する、好ましくは前記MがハイグロマイシンBに対する抵抗性を提供する細胞質選択マーカーである、実施形態1〜4のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
前記degSigCが、アミノ酸配列AADENYALAA(ssrA;配列番号2)を含む、実施形態1〜5のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
実施形態1〜6のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸構築物。
前記核酸構築物が発現構築物であり、ここで、融合タンパク質をコードする核酸配列が構成的プロモーターの制御下にある、実施形態7に記載の核酸構築物。
前記融合タンパク質のPCSYをコードする核酸が、コードされるPCSYにおいて、少なくとも1つのコードされたアミノ酸位置、好ましくは少なくとも2つのコードされたアミノ酸位置、より好ましくは少なくとも3つのコードされたアミノ酸位置が多様化するような多様性を含む、実施形態7に記載の複数の多様化された核酸発現構築物を含む、核酸発現構築物ライブラリ。
(単数もしくは複数の)多様性を含む前記アミノ酸位置が、無修飾の、多様化されていないPCSYを切断することができる着目のプロテアーゼと相互作用するPCSY界面内の(単数もしくは複数の)位置である、実施形態9に記載の核酸発現構築物ライブラリ。
複数の宿主細胞であって、ここで、該複数の宿主細胞の各メンバーが、実施形態7に記載の核酸発現構築物(それは、多様化していない)または実施形態9または10に記載の複数の核酸発現構築物のメンバーを含み;好ましくはここで、該宿主細胞はE.コリ宿主細胞であり;ここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し、およびPCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進する、複数の宿主細胞。
前記宿主細胞が、着目のプロテアーゼと核酸発現構築物によってコードされる融合タンパク質を同時に発現することができ、ここで、前記着目のプロテアーゼがPCSXを切断することができ;好ましくはここで、プロテアーゼが誘導性プロモーターの制御下にある、実施形態11に記載の複数の宿主細胞。
前記宿主細胞が、実施形態7に記載の第一の多様化されていない核酸発現構築物、および着目の多様化されたプロテアーゼをコードする複数の第二の発現構築物を含み、
ここで、該宿主細胞は、前記第一の発現構築物によってコードされる融合タンパク質と一緒に、着目の前記の多様化されたプロテアーゼを同時に、発現することができ、
ここで、前記複数の第二の発現構築物は、第一の発現構築物の融合タンパク質のPCSYを切断することができるプロテアーゼに由来し、および
ここで、前記の複数の第二の発現構築物は、前記PCSYと相互作用するプロテアーゼ界面にて少なくとも1つのアミノ酸位置、
好ましくは前記PCSYと相互作用するプロテアーゼ界面の少なくとも2つのアミノ酸位置、
より好ましくは前記PCSYと相互作用するプロテアーゼ界面の少なくとも3つのアミノ酸位置、
より好ましくは、前記PCSYと相互作用するプロテアーゼ界面の少なくとも4つのアミノ酸位置、および
最も好ましくは前記PCSYと相互作用するプロテアーゼ界面の少なくとも5つのアミノ酸位置に多様性を含む、実施形態11に記載の複数の宿主細胞。
(a)第一のプロテアーゼ切断部位PCSYが、着目のプロテアーゼによって切断されないかどうか、および(b)第二のプロテアーゼ切断部位PCSXが、前記着目のプロテアーゼによって切断されるかどうか同時に試験する方法であって、以下のステップ:
(i)実施形態7に記載の第一の核酸構築物と、着目のプロテアーゼの発現のための第二の発現構築物を含む宿主細胞を準備し;ここで、該宿主細胞は、該融合タンパク質と前記着目のプロテアーゼとを同時に発現することができ、およびここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して該融合タンパク質の分解を促進し、かつ、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して該融合タンパク質の分解を促進し;
(ii)該融合タンパク質と該着目のプロテアーゼとが同時に発現されるような条件下、ステップ(i)の宿主細胞を培養し;そして
(iii)ステップ(ii)の宿主細胞を、該第一の核酸構築物によってコードされる融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒すこと;
を含み、
ここで、ステップ(iii)で適用された選択条件の存在下での宿主細胞の成長は、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYが前記着目のプロテアーゼによって切断されないで、かつ、前記第二のプロテアーゼ切断部位PCSXが前記第二の核酸発現構築物の前記着目のプロテアーゼによって切断されることを示し;好ましくは、ここで、該選択マーカーは該宿主細胞に抗生物質耐性を与える方法。
第一のプロテアーゼ切断部位PCSXのプロテアーゼ切断部位変異体PCSY(ここで、PCSYは、着目のプロテアーゼによって切断されない)を同定する方法であって、以下のステップ:
(i)複数の宿主細胞を準備し、ここで、前記複数の宿主細胞の各メンバーは、実施形態10に記載の複数の第一の核酸構築物のメンバー(ここで、該複数の第一の核酸構築物は、第一のプロテアーゼ切断部位PCSXの多様化された変異体PCSYをコードする)と、着目のプロテアーゼの発現のための第二の発現構築物とを含み、ここで、前記着目のプロテアーゼは、PCSXを切断することができ、それによって、複数の宿主細胞が、第一の核酸構築物によってコードされるタンパク質と前記着目のプロテアーゼとを同時に発現することができ、およびここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し、かつ、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進し;
(ii)該融合タンパク質と該着目のプロテアーゼが同時に発現されるような条件下、ステップ(i)の複数の宿主細胞を培養し;そして
(iii)ステップ(ii)の複数の宿主細胞を、該複数の第一の核酸構築物によってコードされる融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒し;
(iv)(ステップ(iii)で陽性として選択された)宿主細胞を同定し、および同定された宿主細胞の第一の核酸構築物のPCSYの配列を同定すること、ここで、PCSYは、第一のプロテアーゼ切断部位PCSXのプロテアーゼ切断部位変異体であり、およびここで、PCSYは、第二の発現構築物の前記着目のプロテアーゼによって切断されない、
を含む方法。
(第一のプロテアーゼ切断部位PCSYのプロテアーゼ切断部位変異体PCSXを切断することができるが、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYを切断することができない)プロテアーゼ変異体を同定する方法であって、ここで、前記プロテアーゼ変異体は第一のプロテアーゼ(それは、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYを切断することができるが、プロテアーゼ切断部位変異体PCSXを切断することができない)由来であり、以下のステップ:
(i)複数の宿主細胞を準備し、ここで、各メンバーは、実施形態7に記載の多様化されていない第一の核酸発現構築物(そこで、PCSXは、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYのプロテアーゼ切断部位変異体であり)を含み、ここで、PCSYは、着目の第一のプロテアーゼによって切断され、かつ、PCSXは、前記親プロテアーゼによって切断されず;およびここで、前記複数の宿主細胞の各メンバーは、前記第一のプロテアーゼのプロテアーゼ変異体を発現する複数の第二の発現構築物のメンバーを更に含み、ここで、前記複数の第二の核酸発現構築物は、前記第一のPCSYと相互作用するプロテアーゼ界面にて少なくとも1つのアミノ酸位置における多様性を含み、それにより、複数の宿主細胞が、融合タンパク質と前記着目のプロテアーゼを同時に発現することができ、およびここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し、かつ、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進し;
(ii)該融合タンパク質と着目のプロテアーゼとが同時に発現されるような条件下、ステップ(i)の複数の宿主細胞を培養し;そして
(iii)ステップ(ii)の複数の宿主細胞を、該第一の核酸発現構築物によってコードされる融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒し;
(iv)(ステップ(iii)で陽性として選択された)宿主細胞を同定し、および同定された宿主細胞の第二の核酸構築物によってコードされるプロテアーゼ変異体の配列を同定すること、ここで、前記プロテアーゼ変異体は、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYのプロテアーゼ切断部位変異体PCSXを切断することができるが、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYを切断することができない、
を含む方法。
直交性プロテアーゼ(P)/プロテアーゼ切断部位(PCS)システムを調製する方法であって、以下のステップ:
(i)複数の宿主細胞を準備し、ここで、前記複数の宿主細胞の各メンバーは、実施形態10に記載の複数の第一の核酸構築物のメンバー(それは、第一のプロテアーゼ切断部位PCSXの多様化された変異体PCSYをコードする)と、着目の第一のプロテアーゼPXの発現のための第二の発現構築物(それは、PCSXを切断することができ、それにより、複数の宿主細胞が、融合タンパク質と前記着目の第一のプロテアーゼとを同時に発現することができる)とを含み、およびここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し、かつ、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進し;
(ii)該融合タンパク質と第一のプロテアーゼPXが同時に発現されるような条件下、ステップ(i)の複数の宿主細胞を培養し;そして
(iii)ステップ(ii)の複数の宿主細胞を、該複数の第一の核酸構築物によってコードされる融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒し;
(iv)(ステップ(iii)で陽性として選択された)宿主細胞を同定し、およびPCS#を同定し、ここで、PCS#は、同定された宿主細胞の第一の核酸構築物のPCSYの配列であり、ここで、PCS#は、第一のプロテアーゼ切断部位PCSX由来のプロテアーゼ切断部位変異体であり、およびここで、PCS#は、前記第一のプロテアーゼPXによって切断されない一方で、PCSXは、PXによって切断され;
(v)第二の複数の宿主細胞を調製し、そしてそれは、以下の構造:
N−PCS*−degSigN−M−PCS#−degSigC−C;
{式中、Nは、N末端を表し、PCS#は、ステップ(iv)で同定されたPCSYの配列であり、PCS*は、第二のプロテアーゼ切断部位(それは、PCSXと同一であっても、もしくは同一でなくてもよく、かつ、それは、少なくとも1つのアミノ酸残基でPCS#と異なる)であり、degSigNは、分解シグナル(それは、degSigNの第一のアミノ酸が残った融合の新しいN末端になるように、PCS*がプロテアーゼによって切断される場合、宿主細胞における融合タンパク質の分解を促進する)を表し、Mは、細胞質選択マーカーを表し、およびdegSigCは、第二の分解シグナル(それは、PCS#がプロテアーゼによって切断されない場合、宿主細胞において融合タンパク質の分解を促進する)を表し、ならびにCは、C末端を表す}を含む多様化されていない融合タンパク質をコードする、第三の核酸発現構築物を含み;
かつ、ここで、前記第二の複数の宿主細胞の各メンバーは、プロテアーゼP*のプロテアーゼ変異体を発現する複数の第四の発現構築物のメンバーを更に含み、ここで、前記プロテアーゼP*は、degSigNの第一のアミノ酸が残った融合の新しいN末端になるように、PCS*を切断することができ、ここで、前記複数の第四の核酸発現構築物は、前記第一のプロテアーゼ切断部位PCS*と相互作用する前記プロテアーゼP*のプロテアーゼ界面にて少なくとも1つのアミノ酸位置における多様性を含み、それにより、複数の宿主細胞が、多様化されていない融合タンパク質と前記プロテアーゼ変異体を同時に発現することができ、およびここで、該宿主細胞は、PCS*がプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し;かつ、PCS#がプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進し;
(vi)該融合タンパク質とプロテアーゼP*の変異体が同時に発現されるような条件下、ステップ(v)の複数の宿主細胞を培養し;
(vii)ステップ(vi)の複数の宿主細胞を、該第三の核酸発現構築物によってコードされた融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒し;そして
(viii)(ステップ(vii)で陽性として選択された)細胞を同定し、およびP#を同定し、ここで、P#は、同定された宿主細胞の第四の核酸構築物によってコードされるプロテアーゼ変異体PXの配列であり、そしてそのプロテアーゼ変異体P#は、プロテアーゼ切断部位変異体PCS#を切断することができ、そしてそれは、第一の切断部位PCSXを切断することができず;
その結果、PCS*とプロテアーゼP*、および変異PCS#と変異プロテアーゼP#から成る直交性プロテアーゼ/プロテアーゼ切断部位システムを得ること、
を含む方法。
変異SUMOプロテアーゼ切断部位(PCS)であって、ここで、前記変異SUMOのPCSはC末端Gly−Glyを含み、かつ、21℃にて1時間のインキュベーション、45mMのTris/HCl pH7.5、250mM NaCl、2mMのMgCl2、250mMのスクロース、10mMのDTTから成るバッファー中に100μMのPCS−MBP融合物の初期濃度から成る標準的な条件下で同じ濃度にて試験されたとき、配列番号71のアミノ酸配列を有するMBPのN末端に融合されると、配列番号7(scUlp1)または配列番号8(hsSENP2)のアミノ酸配列を有するプロテアーゼによる切断と比較して、配列番号57(MutB bdSENP1)のアミノ酸配列を有するプロテアーゼによって、C末端Gly−Glyの後でより効率的に切断され;任意選択で、ここで、配列番号57(MutB bdSENP1)のアミノ酸配列を有するプロテアーゼは、上記の標準的な条件にて、少なくとも500倍モル過剰の前記SUMO PCS−MBP融合物を切断する、変異SUMOプロテアーゼ切断部位(PCS)。
前記変異プロテアーゼ切断部位が、配列番号3(bdSUMO)の完全長に対して少なくとも80%の配列同一性を有するか、または配列番号3に示されたbdSUMOプロテアーゼ切断部位のホモログであり、ここで、前記変異プロテアーゼ切断部位は、配列番号3の完全長配列とアラインされるとき、アラインされた配列番号3のD67に対応する位置に置換を含み、ここで、前記位置のアミノ酸は、K、R、N、AおよびHから成る群から選択される;好ましくはここで、前記アミノ酸はKおよびRから成る群から選択される;特にここで、前記アミノ酸はKである、別のアミノ酸によって置換される、実施形態18に記載の変異プロテアーゼ切断部位。
前記変異プロテアーゼ切断位置が、配列番号3の完全長配列に対してアラインされるとき、アラインされた配列番号3のQ75に対応する位置に置換を更に含み、ここで、前記位置のアミノ酸が、R、W、A、H、M、I、PおよびFから成る群から選択される別のアミノ酸によって置換され;好ましくはここで、前記アミノ酸が、R、W、AおよびHから成る群から選択され;および/または
前記変異プロテアーゼ切断部位が、配列番号3の完全長配列に対してアラインされるとき、アラインされた配列番号3のT60に対応する位置に置換を更に含み、ここで、前記位置のアミノ酸が、S、N、K、P、H、R、およびQから成る群から選択される別のアミノ酸によって置換され;好ましくはここで、前記アミノ酸が、S、N、K、およびPから成る群から選択される、実施形態19に記載の変異プロテアーゼ切断部位。
前記変異プロテアーゼ切断部位が、以下の:
(i)67K、60K、75R(Mut1);
(ii)67K、60P、75W(Mut8);
(iii)67K、75R(Mut10);
(iv)67K、60S、75H(Mut11);
(v)67K、60S、75W(Mut12);
(vi)67K、60S、75A(Mut13);
(vii)67K、60N、75W(Mut14);および
(viii)67K、60N、75A(Mut15)、
から成る群から選択される置換の組み合わせを含む、実施形態19〜20のいずれか一項に記載の変異プロテアーゼ切断部位。
任意選択で、存在する場合、位置T60および/またはQ75の追加置換と組み合わせて、置換D67Kを除いた配列番号3(bdSUMO)のアミノ酸配列を有し;好ましくはここで、該変異プロテアーゼ切断部位が、配列番号41〜配列番号55のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を有する、実施形態19〜21のいずれか一項に記載の変異プロテアーゼ切断部位。
変異プロテアーゼであって、ここで、前記変異プロテアーゼが、21℃にて1時間のインキュベーション、45mMのTris/HCl pH7.5、250mM NaCl、2mMのMgCl2、250mMのスクロース、10mMのDTTから成るバッファー中に100μMのPCS−MBP融合物の初期濃度から成る標準的な条件下で同じ濃度にて試験されるとき、配列番号71のアミノ酸配列を有するMBPのN末端に融合されると、配列番号71のN末端に融合された配列番号4(scSUMO)のアミノ酸配列を有するプロテアーゼ切断部位または配列番号71のN末端に融合された配列番号3(hsSUMO)のアミノ酸配列を有するプロテアーゼ切断部位に比べて、C末端Gly−Glyの後でより効率的に、配列番号41(Mut1 bdSUMO)のアミノ酸配列を有するプロテアーゼ切断部位(PCS)を切断し;
任意選択で、ここで、前記変異プロテアーゼが、上記の標準的な条件下、少なくとも500倍モル過剰のMut1 bdSUMO−MBP融合物を切断する、変異プロテアーゼ。
前記変異プロテアーゼが、配列番号6(bdSENP1)の完全長配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有し、ここで、前記変異プロテアーゼが、配列番号6の完全長配列に対してアラインされるとき、アラインされた配列番号6のN280に対応する位置での置換を含み、ここで、前記位置のアミノ酸がS、H、Q、A、GおよびCから成る群から選択される別のアミノ酸で置換され;好ましくはここで、前記アミノ酸がS、H、QおよびAから成る群から選択される、実施形態23に記載の変異プロテアーゼ。
実施形態24に記載の変異プロテアーゼであって、前記変異プロテアーゼが、配列番号6の完全長配列に対してアラインされるとき、アラインされた配列番号6のR356に対応する位置での置換を更に含み、ここで、前記位置のアミノ酸がE、S、V、YおよびLから成る群から選択される別のアミノ酸によって置換され;好ましくはここで、前記置換がE、SおよびVから成る群から選択され;および/または
前記変異プロテアーゼが、配列番号6の完全長配列に対してアラインされるとき、アラインされた配列番号6のR269に対応する位置に置換を更に含み、ここで、前記位置のアミノ酸がE、S、P、K、Vから成る群から選択される別のアミノ酸によって置換され;および/または
前記変異プロテアーゼが、配列番号6の完全長配列に対してアラインされるとき、アラインされた配列番号6のK350に対応する位置に置換を更に含み、ここで、前記位置のアミノ酸がM、E、V、G、TおよびRから成る群から選択される別のアミノ酸によって置換され;好ましくはここで、前記置換がM、E、V、GおよびTから成る群から選択される、変異プロテアーゼ。
前記変異プロテアーゼが、以下の:
(i)280S、346E(MutB);
(ii)280H、269S、K350V(MutG);
(iii)269P、280A、346E、350M(MutH);
(iv)269K、280H、346E、350E(Muti);
(v)269E、280S、346S、350T(MutJ);および
(vi)269V、280Q、346V、350G(MutK)、
から成る群から選択される置換の組み合わせを含む、実施形態24〜25のいずれか一項に記載の変異プロテアーゼ。
任意選択で、存在する場合、位置R269、R346、および/またはK350の追加置換と組み合わせて、位置N280の置換を除いた配列番号6(bdSENP1)のアミノ酸配列を有する変異プロテアーゼであって;好ましくはここで、該変異プロテアーゼが、配列番号56〜配列番号70のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を有する、実施形態24〜26のいずれか一項に記載の変異プロテアーゼ。
前記プロテアーゼが、実施形態18〜22のいずれか一項に記載のプロテアーゼ切断部位を切断することができる、実施形態23〜27のいずれか一項に記載の変異プロテアーゼ。
実施形態18〜22のいずれか一項に記載の変異プロテアーゼ切断部位を含む、融合タンパク質。
着目のタンパク質を精製するプロセスであって、以下のステップ:
(i)精製されるべき着目のタンパク質を準備し、ここで、前記タンパク質は、実施形態18〜22のいずれか一項に記載の変異プロテアーゼ切断部位と一緒に前記タンパク質に融合されたアフィニティータグを含み;
(ii)前記アフィニティータグを介して、ステップ(i)のタンパク質をアフィニティーマトリックスに結合させ;そして
(iii)実施形態23〜27のいずれか一項に記載の変異プロテアーゼを使用して該アフィニティーマトリックスから該タンパク質を溶出させ、それによって、タンパク質を精製すること、
を含むプロセス。
配列番号1(DegronNER)
FLFVQ
配列番号2(ssrA)
AADENYALAA
配列番号3(WT bdSUMOの第1〜97アミノ酸)
MSAAGGEEDKKPAGGEGGGAHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMT AIAFLFDGRRLRAEQTPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG
MSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEM DSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG
配列番号5(WT hsSUMO2;ヒトSUMO2、第1〜93アミノ酸)
MADEKPKEGVKTENNDHINLKVAGQDGSVVQFKIKRHTPLSKLMKAYCERQGLSMRQIRF RFDGQPINETDTPAQLEMEDEDTIDVFQQQTGG
配列番号6(WT bdSENP1の第248〜491アミノ酸)
PFVPLTDEDEDNVRHALGGRKRSETLSVHEASNIVITREILQCLNDKEWLNDE VINLYLELLKERELREPNKFLKCHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVRRWTTKRKLGYNLIDC DKIFVPIHKDVHWCLAVINIKEKKFQYLDSLGYMDMKALRILAKYLVDEVKDKSGKQIDV HAWKQEGVQNLPLQENGWDCGMFMLKYIDFYSRDMELVFGQKHMSYFRRRTAKEILDLKA G
LVPELNEKDDDQVQKALA SRENTQLMNRDNIEITVRDFKTLAPRRWLNDTIIEFFMKYIEKSTPNTVAFNSFFYTNLS ERGYQGVRRWMKRKKTQIDKLDKIFTPINLNQSHWALGIIDLKKKTIGYVDSLSNGPNAM SFAILTDLQKYVMEESKHTIGEDFDLIHLDCPQQPNGYDCGIYVCMNTLYGSADAPLDFD YKDAIRMRRFIAHLILTDALK
配列番号8(hsSENP2;ヒトSENP2、第419〜644アミノ酸)
EFPEITEEMEKEIKNVFRNGNQDEVLSEAFRLTITRKDIQTLNHLNWLNDEIINFYMNMLME RSKEKGLPSVHAFNTFFFTKLKTAGYQAVKRWTKKVDVFSVDILLVPIHLGVHWCLAVVD FRKKNITYYDSMGGINNEACRILLQYLKQESIDKKRKEFDTNGWQLFSKKSQEIPQQMNG SDCGMFACKYADCITKDRPINFTQQHMPYFRKRMVWEILHRKLL
SVDMTAIAFLFDGRRLRAEQTPDE
配列番号10(Mut1 bdSUMO;第56〜79アミノ酸)
SVDMKAIAFLFKGRRLRAERTPDE
配列番号11(Mut2 bdSUMO;第56〜79アミノ酸)
SVDMTAIAFLFKGRRLRAECTPDE
配列番号12(Mut3 bdSUMO;第56〜79アミノ酸)
SVDMHAIAFLFKGRRLRAEKTPDE
配列番号13(Mut4 bdSUMO;第56〜79アミノ酸)
SVDMRAIAFLFRGRRLRAEVTPDE
配列番号14(Mut5 bdSUMO;第56〜79アミノ酸)
SVDMTAIAFLFKGRRLRAEFTPDE
配列番号15(Mut6 bdSUMO;第56〜79アミノ酸)
SVDMHAIAFLFKGRRLRAEQTPDE
配列番号16(Mut7 bdSUMO;第56〜79アミノ酸)
SVDMDAIAFLFRGRRLRAECTPDE
SVDMPAIAFLFKGRRLRAEWTPDE
配列番号18(Mut9 bdSUMO;第56〜79アミノ酸)
SVDMAAIAFLFKGRRLRAEYTPDE
配列番号19(Mut10 bdSUMO;第56〜79アミノ酸)
SVDMTAIAFLFKGRRLRAERTPDE
配列番号20(Mut11 bdSUMO;第56〜79アミノ酸)
SVDMSAIAFLFKGRRLRAEWTPDE
配列番号21(Mut12 bdSUMO;第56〜79アミノ酸)
SVDMSAIAFLFKGRRLRAEHTPDE
配列番号22(Mut13 bdSUMO;第56〜79アミノ酸)
SVDMSAIAFLFKGRRLRAEATPDE
配列番号23(Mut14 bdSUMO;第56〜79アミノ酸)
SVDMNAIAFLFKGRRLRAEWTPDE
配列番号24(Mut15 bdSUMO;第56〜79アミノ酸)
SVDMNAIAFLFKGRRLRAEATPDE
GGRKRSETLSVHEASNIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLKCHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVRRWTTKRKLG
配列番号26(MutA bdSENP1の第265〜354アミノ酸)
GGRKPSETLSVHEASGIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLKCHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVREWTTPRKLG
配列番号27(MutB bdSENP1の第265〜354アミノ酸)
GGRKRSETLSVHEASSIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLKCHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVREWTTKRKLG
配列番号28(MutC bdSENP1の第265〜354アミノ酸)
GGRKSSETLSVHEASAIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLKCHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVRGWTTVRKLG
配列番号29(MutD bdSENP1の第265〜354アミノ酸)
GGRKPSETLSVHEASEIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLKCHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVREWTTQRKLG
配列番号30(MutE bdSENP1の第265〜354アミノ酸)
GGRKRSETLSVHEASGIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLK CHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVRYWTTARKLG
配列番号31(MutF bdSENP1の第265〜354アミノ酸)
GGRKPSETLSVHEASCIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLK CHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVRLWTTRRKLG
GGRKSSETLSVHEASHIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLK CHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVRRWTTV−KLG
配列番号33(MutH bdSENP1の第265〜354アミノ酸)
GGRKPSETLSVHEASAIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLK CHFFNTFFYKKLIN−GYDYKSVREWTTMRKLG
配列番号34(Muti bdSENP1の第265〜354アミノ酸)
GGRKKSETLSVHEASHIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLK CHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVREWTTRRKLG
配列番号35(MutJ bdSENP1の第265〜354アミノ酸)
GGRKESETLSVHEASSIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLK CHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVRSWTTTRKLG
配列番号36(MutK bdSENP1の第265〜354アミノ酸)
GGRKVSETLSVHEASQIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLK CHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVRVWTTGRKLG
配列番号37(MutL bdSENP1の第265〜354アミノ酸)
GGRKLSETLSVHEASVIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLK CHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVRPWTTARKLG
配列番号38(MutM bdSENP1の第265〜354アミノ酸)
GGRKASETLSVHEASWIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLK CHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVRRWTTERKLG
配列番号39(MutN bdSENP1の第265〜354アミノ酸)
GGRKSSETLSVHEASPIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLK CHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVRRWTTRRKLG
GGRKRSETLSVHEASRIVITREILQCLNDKEWLNDEVINLYLELLKERELREPNKFLK CHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVRGWTTLRKLG
配列番号41(Mut1 bdSUMOの第1〜97残基)
MSAAGGEEDKKPAGGEGGGAHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMK AIAFLFKGRRLRAERTPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG
配列番号42(Mut2 bdSUMOの第1〜97残基)
MSAAGGEEDKKPAGGEGGGAHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMT AIAFLFKGRRLRAECTPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG
配列番号43(Mut3 bdSUMOの第1〜97残基)
MSAAGGEEDKKPAGGEGGGAHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMH AIAFLFKGRRLRAEKTPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG
配列番号44(Mut4 bdSUMOの第1〜97残基)
MSAAGGEEDKKPAGGEGGGAHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMR AIAFLFRGRRLRAEVTPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG
配列番号45(Mut5 bdSUMOの第1〜97残基)
MSAAGGEEDKKPAGGEGGGAHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMT AIAFLFKGRRLRAEFTPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG
配列番号46(Mut6 bdSUMOの第1〜97残基)
MSAAGGEEDKKPAGGEGGGAHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMH AIAFLFKGRRLRAEQTPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG
配列番号47(Mut7 bdSUMOの第1〜97残基)
MSAAGGEEDKKPAGGEGGGAHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMD AIAFLFRGRRLRAECTPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG
MSAAGGEEDKKPAGGEGGGAHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMP AIAFLFKGRRLRAEQTPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG
配列番号49(Mut9 bdSUMOの第1〜97残基)
MSAAGGEEDKKPAGGEGGGAHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMA AIAFLFKGRRLRAEYTPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG
配列番号50(Mut10 bdSUMOの第1〜97残基)
MSAAGGEEDKKPAGGEGGGAHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMT AIAFLFKGRRLRAERTPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG
配列番号51(Mut11 bdSUMOの第1〜97残基)
MSAAGGEEDKKPAGGEGGGAHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMS AIAFLFKGRRLRAEWTPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG
配列番号52(Mut12 bdSUMOの第1〜97残基)
MSAAGGEEDKKPAGGEGGGAHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMS AIAFLFKGRRLRAEHTPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG
配列番号53(Mut13 bdSUMOの第1〜97残基)
MSAAGGEEDKKPAGGEGGGAHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMS AIAFLFKGRRLRAEATPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG
配列番号54(Mut14 bdSUMOの第1〜97残基)
MSAAGGEEDKKPAGGEGGGAHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMN AIAFLFKGRRLRAEWTPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG
配列番号55(Mut15 bdSUMOの第1〜97残基)
MSAAGGEEDKKPAGGEGGGAHINLKVKGQDGNEVFFRIKRSTQLKKLMNAYCDRQSVDMN AIAFLFKGRRLRAEATPDELEMEDGDEIDAMLHQTGG
PFVPLTDEDEDNVRHALGGRKPSETLSVHEASGIVITREILQCLNDKEWLNDE VINLYLELLKERELREPNKFLKCHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVREWTTPRKLGYNLIDC DKIFVPIHKDVHWCLAVINIKEKKFQYLDSLGYMDMKALRILAKYLVDEVKDKSGKQIDV HAWKQEGVQNLPLQENGWDCGMFMLKYIDFYSRDMELVFGQKHMSYFRRRTAKEILDLKA G
配列番号57(MutB bdSENP1の第248〜481残基)
PFVPLTDEDEDNVRHALGGRKRSETLSVHEASSIVITREILQCLNDKEWLNDE VINLYLELLKERELREPNKFLKCHFFNTFFYKKLINGGYDYKSVREWTTKRKLGYNLIDC DKIFVPIHKDVHWCLAVINIKEKKFQYLDSLGYMDMKALRILAKYLVDEVKDKSGKQIDV HAWKQEGVQNLPLQENGWDCGMFMLKYIDFYSRDMELVFGQKHMSYFRRRTAKEILDLKA G
配列番号58(MutC bdSENP1の第248〜481残基)
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配列番号60(MutE bdSENP1の第248〜481残基)
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配列番号61(MutF bdSENP1の第248〜481残基)
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配列番号62(MutG bdSENP1の第248〜481残基)
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配列番号64(Muti bdSENP1の第248〜481残基)
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配列番号65(MutJ bdSENP1の第248〜481残基)
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配列番号66(MutK bdSENP1の第248〜481残基)
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配列番号68(MutM bdSENP1の第248〜481残基)
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配列番号69(MutN bdSENP1の第248〜481残基)
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配列番号70(MutO bdSENP1の第248〜481残基)
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AGTGTSKTEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATG DGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALS LIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENG KYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSN IDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVN KDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGR QTVDEALKDAQTN
今までのところ、bdSENP1とUlp1は、公知の最も活性なUbl特異的プロテアーゼである(Frey & Gorlich 2014a)。約15〜50nMのこれらの2つのプロテアーゼは、0℃にて1時間で同族基質を効率的に切断しなければならなかった(図6)。他の一般的に使用されるUbl特異的プロテアーゼ(すなわち、xlAtg4、xlSub2およびbdNEDP1)は、bdSENP1やUlp1に比べて15〜150倍低い効果である。ここで、我々は、bdSENP1MutBプロテアーゼがbdSENP1またはUlp1と比較してたった5倍低い効率であることを示した。そのため、bdSENP1MutBプロテアーゼは、いくつかの野性型Ubl特異的プロテアーゼに対してより魅力的な選択肢である。
切断反応を、20μlの全容積に切断バッファー(45mMのTris/HCl pH7.5、250mMのNaCl、2mMのMgCl2、250mMのスクロース、10mMのDTT)を使用して実施した。反応の前に、基質とプロテアーゼを反応に必要である濃度の2倍に切断バッファーで希釈した。等量の希釈基質とプロテアーゼを、反応を始めるために混合した。あらゆる反応のために、100μMのそれぞれのMBPタグ付与基質を、所定のプロテアーゼ(10nM〜10μM)の様々な量で、氷上、1時間インキュベートした。
SUMOveraとSUMOstarシステムとの間の直交性を試験するために、bdSUMOMut1−およびSUMOstar−MBP融合物を、高濃度のbdSENP1MutBまたはSUMOstarプロテアーゼのいずれかと共に0℃にて1時間インキュベートした(図7)。一方で、bdSENP1MutBプロテアーゼは200nMの濃度にて同族基質を切断しただけであるが、それに対して、SUMOstar−MBP融合物は10μMの最高プロテアーゼ濃度でさえ完全なままである。その一方、SUMOstarプロテアーゼは、SUMOstar−MBPのみを認識し、そして、10μMの最高濃度のSUMOstarプロテアーゼでさえ、bdSUMOMut1−MBP融合物タンパク質を完全なまま残した。10μMのいずれかのプロテアーゼが、プロテアーゼ交差性が全く観察されなかったとしても、同族基質の完全な切断のために必要とされるより最大1000倍高いプロテアーゼを表すことに留意するのこと。そのため、SUMOveraとSUMOstarシステムは、実際には本当に直交特異性を有する。
切断反応を、実施例1に記載のとおり実施し、停止させ、そして、分析した。唯一の例外は、bdSUMOMut1およびSUMOstar融合タンパク質を、高濃度のそれぞれのプロテアーゼと共にインキュベートしたことである。
実際上、野性型SUMOタンパク質でタグ付与した任意のタンパク質は、真核宿主において発現される場合、すぐに切断される。SUMOstarは、今までのところ、異なる真核細胞系において安定したタグであるSUMOタンパク質の唯一の例である(Liu et al. 2008; Peroutka et al. 2008)。我々は、bdSUMOMut1がインビボにおいてUlp1による切断に抵抗性であり、そのため、酵母細胞において安定しているかどうか試験した。
融合タグとしてSUMOstarに比べてより良い選択肢をまさに表すことを示唆する。
SUMO−シトリン融合タンパク質の過剰発現のために、それぞれの発現プラスミドを、(Gietz&Schiestl2007)に記載のPEG/LiAcプロトコールを使用して、S.セレビシエ株SFY123(MATα、ADE2、his3−11、15leu2−3、112LYS2、trp1−1、ura3 can1−100、H2B−CFP::Trp1)において形質転換した。次に、単一形質転換コロニーを、2%(w/v)のグルコースを補ったSD培地の開始前培養への植え付けのために採取した。30℃にて一晩のインキュベーション後に、細胞を、2,000rpmにて5分間の遠心分離によってペレット化し、そして、2%(w/v)のグルコースおよび2%(w/v)のラフィノースを補った新しい培地を使用して更に再懸濁した。この持続プロセスを二度繰り返した。2%(w/v)のグルコースと2%(w/v)のラフィノースを補った新しい培地を用いた細胞の遠心分離とその後の再懸濁を二度繰り返した。次に、再懸濁した細胞を、OD600約0.2の初期濃度まで、2%(w/v)のラフィノースを補った250mlのSD培地への植え付けに使用した。その培養物を、指数増殖期に達するまで(OD600約0.8〜1.0)振盪しながら30℃にてインキュベートした。SUMO−シトリン融合タンパク質の過剰発現を、振盪しながら30℃にて6時間、2%(w/v)のガラクトースの添加によって誘発した。タンパク質過剰発現後に、酵母細胞を、2,000rpmおよび25℃にて10分間の遠心分離によってペレット化し、そして、再懸濁バッファー(45mMのTris/HCl pH7.5、250mMのNaCl、20mMのイミダゾール、5mMのDTT)で更に再懸濁した。
我々はまた、様々な真核生物の抽出物質におけるscSUMO−、SUMOstar−、bdSUMO−およびbdSUMOMut1−MBP融合物タンパク質の安定性も分析した。それぞれのMBP融合物タンパク質を、高濃縮抽出物の状態で25℃にて2時間インキュベートし、そして、ウエスタンブロット法で更に分析した(図9)。SUMOstarやbdSUMOMut1を用いてタグ付与したタンパク質はすべてのサンプルで切断されなかったが、それに対して、scSUMOならびにbdSUMO融合タンパク質は様々な程度で切断された。「プロテアーゼミックス」(Ulp1、SUMOstarプロテアーゼ、bdSENP1およびbdSENP1MutBプロテアーゼ、それぞれ1μM)を含むサンプルは、内因性SUMO特異的タンパク質がSUMOstarまたはbdSUMOMut1融合タンパク質のいずれかを切断することを妨げることができるいずれの阻害物質も存在しなかったことを示した。そのため、これらの結果は、bdSUMOMut1もまた、事実上あらゆる真核宿主において使用できる好適な融合タグであることを裏付ける。
様々なSUMOタグ付与MBP融合物タンパク質の安定性を、様々な真核生物抽出物(麦芽抽出、アフリカツメガエル卵抽出物、ウサギ網状赤血球抽出、HeLa細胞抽出物およびドロソフィラS2細胞抽出物)において試験した。溶解物の調製を(Mureev et al. 2009; Kovtun et al. 2010; Blow & Laskey 1986; Crevel & Cotterill 1991; Endo et al. 2010; Jackson & Hunt 1983)に記載のとおり実施した。12.5μlの反応体積に関して、1μMのSUMOタグ付与基質を、1μMの様々なSUMO特異的プロテアーゼ(Ulp1、SUMOstar、bdSENP1およびbdSENP1MutBプロテアーゼ)を含有するプロテアーゼ混合物の存在下、または不存在下、10μlのそれぞれの溶解物と共に、25℃にて2時間インキュベートした。最後に、反応を、100μlの終量までSDSサンプルバッファー(3%のSDS、125mMのTris/HCl、(pH6.8)、50mMのDTT、1MのスクロースおよびクマシーブリリアントブルーG250)を加えることによって停止させた。基質の安定性は、抗MBP一次抗体を使用したウエスタンブロット法によって分析した。
2以上の部位選択的プロテアーゼを使用して、定義されたサブユニット化学量論性(Frey & Gorlich 2014b)を用いてタンパク質複合体を精製するのに使用した。この技術は簡単であり、かつ、互いに基質特異性を有するプロテアーゼを要求するだけであるが、これまでのところ、それはE.コリなどの原核細胞系で適用された。ここで、我々は、SUMOveraシステムをSUMOstarシステムと一緒にS.セレビシエで発現される二量体タンパク質複合体を精製するのに使用できることを示す。原理証明として、我々は、抗GFPナノボディ(Nb)(Kirchhofer et al. 2010)およびシトリンと称するGFP様タンパク質(Heikal et al. 2000)で構成された高アフィニティーヘテロ二量体複合体を選択した。NbをH14−bdSUMOMut1融合タンパク質としてクローン化したが、その一方で、シトリンをN末端ZZ−SUMOstarタグに融合させた(図10−A)。
Nb・シトリン複合体の形質転換を、S.セレビシエ株SFY123(MATα、ADE2、his3−11、15leu2−3、112LYS2、trp1−1、ura3、can1−100)において実施した。1つのプラスミドは融合タンパク質H14−bdSUMOMut1−Nbを体系化し、および第2のものはZZ−SUMOstar−シトリンタンパク質を体系化した。発現を、実施例3に記載のとおり実施した。発現後に、酵母ペレットを、20〜50/mlの最終的なOD600まで、再懸濁バッファー(50mMのTris/HCl pH7.5、150mMのNaCl、20mMのイミダゾール、5mMのDTT)で再懸濁した。様々なプロテアーゼ阻害剤のカクテルを、1×の終濃度まで再懸濁した細胞に追加した。プロテアーゼ阻害剤の原液(500×)は、以下の化合物:5mg/mlのアプロチニン、5mg/mlのロイペプチン、2.5mg/mlのエラスタチナール、2.5mg/mlのキモスタチンおよび0.5mg/mlのペプスタチンAを含有した。細胞を、液体窒素中で急速冷凍し、そして、10〜15分間、湯浴中ですぐに解凍した。ガラスビーズと一定のボルテックスを使用して細胞膜を破壊して、細胞溶解物を作製した。細胞破片と不溶性物質を、38,000rpmおよび4℃にて1.5時間の超遠心分離によって溶解細胞から取り除いた。
SUMO特異的プロテアーゼは、最適なタンパク質からのアフィニティータグの除去のための最も効果的なプロテアーゼである(Frey & Gorlich 2014a; Malakhov et al. 2004)。残念ながら、インビボにおけるあらゆる外来SUMO特異的プロテアーゼの使用もあらゆる真核細胞の生存率を落とすので、このプロセスはビトロにおいて実施できない。インビボにおける部位選択的タンパク質分解およびSUMO特異的プロテアーゼの特別な使用は高い関連性があるものなので、我々は、bdSENP1MutBプロテアーゼの過剰発現が酵母細胞の生存率に影響せずに達成できるかどうか試験することを決めた。酵母細胞を、Ulp1、bdSENP1、SUMOstarプロテアーゼまたはbdSENP1MutBプロテアーゼをコードする高コピーベクターを用いて形質転換した(図11)。陰性対照として、我々は、完全に不活性であり、そのためscSUMOを加水分解することができないbdSENP1突然変異体(C440S)を体系化したプラスミドを用いて細胞を形質転換した。プロテアーゼの発現がグルコースの存在によって抑制されるとき、すべての形質転換細胞が増殖できた。ガラクトースの添加による30℃にて72時間のプロテアーゼ過剰発現の誘発後に、bdSENP1MutBプロテアーゼまたはbdSENP1(C440S)のいずれかを発現する酵母細胞だけが、よく似たところまで増殖した。対照的に、Ulp1、bdSENP1およびSUMOstarプロテアーゼの過剰発現は、ガラクトースの存在下で完全な細胞死につながった。そのため、bdSENP1MutBプロテアーゼは、生きた酵母細胞における部位特異的タンパク質分解を実施するために使用できる唯一のSUMO特異的プロテアーゼである。
S.セレビシエ細胞菌株SFY123(MATα、ADE2、his3−11、15leu2−3、112LYS2、trp1−1、ura3、can1−100)を、SUMO特異的プロテアーゼの過剰発現後のそれらの生存率を試験するために使用した。最初に、細胞を、(Gietz & Schiestl 2007)に記載のプロトコールを使用して、ガラクトース誘導性発現プラスミドを用いて形質転換した。形質転換細胞を、2%(w/v)のグルコースを補ったSD培地に植え付け、そして、30℃にて16時間更に植え付けた。次に、細胞を、ペレット化し、そして、2%(w/v)のグルコースおよび2%(w/v)のラフィノースを補った新しいSD培地を使用して再懸濁した。再懸濁した細胞を、指数増殖期(OD600約1.0)に達するまで、2%(w/v)のラフィノースを含有するSD培地中でインキュベートした。次に、細胞を、10倍ステップで連続希釈し、そして、5μlのそれぞれの希釈物を、ガラクトース(0.02%および0.2%)またはグルコース(2%)のいずれかを含有する平板培地にスポットした。平板培地を30℃にて72時間インキュベートし、そして、更にスキャンした。
Claims (24)
- 以下の構造:
N−PCSY−degSigN−M−PCSX−degSigC−C;
{式中、
Nは、N末端を表し;
PCSYとPCSXはそれぞれ、プロテアーゼ切断部位(PCS)を表すが、それは、少なくとも1つのアミノ酸残基が互いに異なり;
degSigNは、分解シグナルを表すが、それは、PCSYがプロテアーゼによって、degSigNの第一アミノ酸が残った融合の新しいN末端になるように切断される場合、宿主細胞において融合タンパク質の分解を促進し;
Mは、細胞質選択マーカーを表し;
degSigCは、第二の分解シグナルを表すが、それは、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、宿主細胞において融合タンパク質の分解を促進し;および
Cは、C末端を表す}を含む融合タンパク質。 - 前記PCSYおよび/またはPCSXが、配列番号3に示されたbdSUMOプロテアーゼ切断部位、bdSUMOのパラログもしくはオルソログ、または配列番号3(bdSUMO)の完全長に対して少なくとも80%の配列同一性を有するbdSUMOの機能的に同等な変異体から選択される、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記degSigNが、アミノ酸配列FLFVQ(DegronNER;配列番号1)を含み;および/または
前記Mが、抗生物質選択剤に対する抵抗性を提供する、好ましくは前記Mが、ハイグロマイシンBに対する抵抗性を提供する細胞質選択マーカーであり;および/または
前記degSigCが、アミノ酸配列AADENYALAA(ssrA;配列番号2)を含む、
請求項1または請求項2に記載の融合タンパク質。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、核酸構築物。
- 請求項4に記載の複数の多様化された核酸発現構築物を含む核酸発現構築物ライブラリであって、ここで、前記融合タンパク質のPCSYをコードする核酸が、コードされるPCSYにおいて、少なくとも1つのコードされたアミノ酸位置が多様化するような多様性を含み、
ここで、(単数もしくは複数の)多様性を含む前記アミノ酸位置が、無修飾の、多様化されていないPCSYを切断することができる着目のプロテアーゼと相互作用するPCSY界面内の(単数もしくは複数の)位置である、核酸発現構築物ライブラリ - 複数の宿主細胞であって、ここで、該複数の宿主細胞の各メンバーが、請求項4に記載の核酸発現構築物(それは、多様化していない)または請求項59または10に記載の複数の核酸発現構築物のメンバーを含み;ここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し、およびPCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進する、複数の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、着目のプロテアーゼと核酸発現構築物によってコードされる融合タンパク質を同時に発現することができ、ここで、前記着目のプロテアーゼがPCSXを切断することができ;好ましくはここで、プロテアーゼが誘導性プロモーターの制御下にある、請求項6に記載の複数の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、請求項4に記載の第一の多様化されていない核酸発現構築物を含み、および前記複数の宿主細胞の各メンバーが、着目の多様化されたプロテアーゼをコードする複数の第二の発現構築物のメンバーを含み、
ここで、該宿主細胞が、前記第一の発現構築物によってコードされる融合タンパク質と一緒に、着目の前記の多様化されたプロテアーゼを同時に、発現することができ、
ここで、前記複数の第二の発現構築物が、第一の発現構築物の融合タンパク質のPCSYを切断することができるプロテアーゼに由来し、および
それにより、複数の第二の発現構築物が、前記PCSYと相互作用するプロテアーゼ界面にて少なくとも1つのアミノ酸位置に多様性を含む、請求項6に記載の複数の宿主細胞。 - (a)第一のプロテアーゼ切断部位PCSYが、着目のプロテアーゼによって切断されないかどうか、および(b)第二のプロテアーゼ切断部位PCSXが、前記着目のプロテアーゼによって切断されるかどうか同時に試験する方法であって、以下のステップ:
(i)請求項4に記載の第一の核酸構築物と、着目のプロテアーゼの発現のための第二の発現構築物を含む宿主細胞を準備し;ここで、該宿主細胞は、該融合タンパク質と前記着目のプロテアーゼとを同時に発現することができ、およびここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して該融合タンパク質の分解を促進し、かつ、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して該融合タンパク質の分解を促進し;
(ii)該融合タンパク質と該着目のプロテアーゼとが同時に発現されるような条件下、ステップ(i)の宿主細胞を培養し;そして
(iii)ステップ(ii)の宿主細胞を、該第一の核酸構築物によってコードされる融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒すこと;
を含み、
ここで、ステップ(iii)で適用された選択条件の存在下での宿主細胞の成長は、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYが前記着目のプロテアーゼによって切断されないで、かつ、前記第二のプロテアーゼ切断部位PCSXが前記第二の核酸発現構築物の前記着目のプロテアーゼによって切断されることを示し;好ましくは、ここで、該選択マーカーは該宿主細胞に抗生物質耐性を与える方法。 - 第一のプロテアーゼ切断部位PCSXのプロテアーゼ切断部位変異体PCSY(ここで、PCSYは、着目のプロテアーゼによって切断されない)を同定する方法であって、以下のステップ:
(i)複数の宿主細胞を準備し、ここで、前記複数の宿主細胞の各メンバーは、請求項5に記載の複数の第一の核酸構築物のメンバー(ここで、該複数の第一の核酸構築物は、第一のプロテアーゼ切断部位PCSXの多様化された変異体PCSYをコードする)と、着目のプロテアーゼの発現のための第二の発現構築物とを含み、ここで、前記着目のプロテアーゼは、PCSXを切断することができ、それによって、複数の宿主細胞が、第一の核酸構築物によってコードされるタンパク質と前記着目のプロテアーゼとを同時に発現することができ、およびここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し;かつ、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進し;
(ii)該融合タンパク質と該着目のプロテアーゼが同時に発現されるような条件下、ステップ(i)の複数の宿主細胞を培養し;そして
(iii)ステップ(ii)の複数の宿主細胞を、該複数の第一の核酸構築物によってコードされる融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒し;
(iv)(ステップ(iii)で陽性として選択された)宿主細胞を同定し、および同定された宿主細胞の第一の核酸構築物のPCSY(PCSYは、第一のプロテアーゼ切断部位PCSXのプロテアーゼ切断部位変異体であり、かつここで、PCSYは、第二の発現構築物の前記着目のプロテアーゼによって切断されない)の配列を同定すること、
を含む方法。 - (第一のプロテアーゼ切断部位PCSYのプロテアーゼ切断部位変異体PCSXを切断することができるが、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYを切断することができない)プロテアーゼ変異体を同定する方法であって、ここで、前記プロテアーゼ変異体は第一のプロテアーゼ(それは、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYを切断することができるが、プロテアーゼ切断部位変異体PCSXを切断することができない)由来であり、以下のステップ:
(i)複数の宿主細胞を準備し、ここで、各メンバーは、請求項4に記載の多様化されていない第一の核酸発現構築物(そこで、PCSXは、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYのプロテアーゼ切断部位変異体であり)を含み、ここで、PCSYは、着目の第一のプロテアーゼによって切断され、かつ、PCSXは、前記第一のプロテアーゼによって切断されず;およびここで、前記複数の宿主細胞の各メンバーは、前記第一のプロテアーゼのプロテアーゼ変異体を発現する複数の第二の発現構築物のメンバーを更に含み、ここで、前記複数の第二の核酸発現構築物は、前記第一のPCSYと相互作用するプロテアーゼ界面にて少なくとも1つのアミノ酸位置における多様性を含み、それにより、複数の宿主細胞が、融合タンパク質と前記着目のプロテアーゼを同時に発現することができ、およびここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し;かつ、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進し;
(ii)該融合タンパク質と着目のプロテアーゼとが同時に発現されるような条件下、ステップ(i)の複数の宿主細胞を培養し;そして
(iii)ステップ(ii)の複数の宿主細胞を、該第一の核酸発現構築物によってコードされる融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒し;
(iv)(ステップ(iii)で陽性として選択された)宿主細胞を同定し、および同定された宿主細胞の第二の核酸構築物によってコードされるプロテアーゼ変異体の配列を同定すること、ここで、前記プロテアーゼ変異体は、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYのプロテアーゼ切断部位変異体PCSXを切断することができるが、第一のプロテアーゼ切断部位PCSYを切断することができない、
を含む方法。 - 直交性プロテアーゼ(P)/プロテアーゼ切断部位(PCS)システムを調製する方法であって、以下のステップ:
(i)複数の宿主細胞を準備し、ここで、各メンバーは、請求項6に記載の複数の第一の核酸構築物のメンバー(それは、第一のプロテアーゼ切断部位PCSXの多様化された変異体PCSYをコードする)と、着目の第一のプロテアーゼPXの発現のための第二の発現構築物(それは、PCSXを切断することができ、それにより、複数の宿主細胞が、融合タンパク質と前記着目の第一のプロテアーゼとを同時に発現することができる)とを含み、およびここで、該宿主細胞は、PCSYがプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し;かつ、PCSXがプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進し;
(ii)該融合タンパク質と第一のプロテアーゼPXが同時に発現されるような条件下、ステップ(i)の複数の宿主細胞を培養し;そして
(iii)ステップ(ii)の複数の宿主細胞を、該複数の第一の核酸構築物によってコードされる融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒し;
(iv)(ステップ(iii)で陽性として選択された)宿主細胞を同定し、およびPCS#を同定し、ここで、PCS#は、同定された宿主細胞の第一の核酸構築物由来のPCSYの配列であり、ここで、PCS#は、第一のプロテアーゼ切断部位PCSXのプロテアーゼ切断部位変異体であり、およびここで、PCS#は、前記第一のプロテアーゼPXによって切断されない一方で、PCSXは、PXによって切断され;
(v)第二の複数の宿主細胞を調製し、そしてそれは、以下の構造:
N−PCS*−degSigN−M−PCS#−degSigC−C;
{式中、Nは、N末端を表し、PCS#は、ステップ(iv)で同定されたPCSYの配列であり、PCS*は、第二のプロテアーゼ切断部位(それは、PCSXと同一であっても、もしくは同一でなくてもよく、かつ、それは、少なくとも1つのアミノ酸残基でPCS#と異なる)であり、degSigNは、分解シグナル(それは、degSigNの第一のアミノ酸が残った融合の新しいN末端になるように、PCS*がプロテアーゼによって切断される場合、宿主細胞における融合タンパク質の分解を促進する)を表し、Mは、細胞質選択マーカーを表し、およびdegSigCは、第二の分解シグナル(それは、PCS#がプロテアーゼによって切断されない場合、宿主細胞において融合タンパク質の分解を促進する)を表し、ならびにCは、C末端を表す}を含む多様化されていない融合タンパク質をコードする、第三の核酸発現構築物を含み;
かつ、ここで、前記第二の複数の宿主細胞の各メンバーは、プロテアーゼP*のプロテアーゼ変異体を発現する複数の第四の発現構築物のメンバーを更に含み、ここで、前記プロテアーゼP*は、degSigNの第一のアミノ酸が残った融合の新しいN末端になるように、PCS*を切断することができ、ここで、前記複数の第四の核酸発現構築物は、前記第一のプロテアーゼ切断部位PCS*と相互作用する前記プロテアーゼP*のプロテアーゼ界面にて少なくとも1つのアミノ酸位置における多様性を含み、それにより、複数の宿主細胞が、多様化されていない融合タンパク質と前記プロテアーゼ変異体を同時に発現することができ、およびここで、該宿主細胞は、PCS*がプロテアーゼによって切断される場合、degSigNを介して融合タンパク質の分解を促進し;かつ、PCS#がプロテアーゼによって切断されない場合、degSigCを介して融合タンパク質の分解を促進し;
(vi)該融合タンパク質とプロテアーゼP*の変異体が同時に発現されるような条件下、ステップ(v)の複数の宿主細胞を培養し;
(vii)ステップ(vi)の複数の宿主細胞を、該第三の核酸発現構築物によってコードされた融合タンパク質の選択マーカーのための同族選択剤を使用した選択条件に晒し;そして
(viii)(ステップ(vii)で陽性として選択された)細胞を同定し、およびP#を同定し、ここで、P#は、同定された宿主細胞の第四の核酸構築物によってコードされるプロテアーゼ変異体P*の配列であり、そしてそのプロテアーゼ変異体P#は、プロテアーゼ切断部位変異体PCS#を切断することができ、そしてそれは、第一の切断部位PCSXを切断することができず;
その結果、PCS*とプロテアーゼP*、および変異PCS#と変異プロテアーゼP#から成る直交性プロテアーゼ/プロテアーゼ切断部位システムを得ること、
を含む方法。 - 変異SUMOプロテアーゼ切断部位(PCS)であって、ここで、前記変異SUMOのPCSはC末端Gly−Gly SUMOモチーフを含み、かつ、21℃にて1時間のインキュベーション、45mMのTris/HCl pH7.5、250mM NaCl、2mMのMgCl2、250mMのスクロース、10mMのDTTから成るバッファー中に100μMのSUMO PCS−MBP融合物の初期濃度から成る標準的な条件下で同じ濃度にて試験されたとき、配列番号71のアミノ酸配列を有するMBPのN末端に融合されると、配列番号7(scUlp1)または配列番号8(hsSENP2)のアミノ酸配列を有するプロテアーゼによる切断と比較して、配列番号57(MutB bdSENP1)のアミノ酸配列を有するプロテアーゼによって、C末端Gly−Gly SUMOモチーフの後でより効率的に切断され;任意選択で、ここで、配列番号57(MutB bdSENP1)のアミノ酸配列を有するプロテアーゼは、上記の標準的な条件にて、少なくとも500倍モル過剰の前記SUMO PCS−MBP融合物を切断する、変異SUMOプロテアーゼ切断部位(PCS)。
- 前記変異プロテアーゼ切断部位が、配列番号3(bdSUMO)の完全長に対して少なくとも80%の配列同一性を有するか、または配列番号3に示されたbdSUMOプロテアーゼ切断部位のホモログであり、ここで、前記変異プロテアーゼ切断部位は、配列番号3の完全長配列とアラインされるとき、アラインされた配列番号3のD67に対応する位置に置換を含み、ここで、前記位置のアミノ酸は、K、R、N、AおよびHから成る群から選択される;好ましくはここで、前記アミノ酸はKおよびRから成る群から選択される;特にここで、前記アミノ酸はKである、別のアミノ酸によって置換される、請求項13に記載の変異プロテアーゼ切断部位。
- 前記変異プロテアーゼ切断位置が、配列番号3の完全長配列に対してアラインされるとき、アラインされた配列番号3のQ75に対応する位置に置換を更に含み、ここで、前記位置のアミノ酸が、R、W、A、H、M、I、PおよびFから成る群から選択される別のアミノ酸によって置換され;好ましくはここで、前記置換が、R、W、AおよびHから成る群から選択され;および/または
前記変異プロテアーゼ切断部位が、配列番号3の完全長配列に対してアラインされるとき、アラインされた配列番号3のT60に対応する位置に置換を更に含み、ここで、前記位置のアミノ酸が、S、N、K、P、H、R、およびQから成る群から選択される別のアミノ酸によって置換され;好ましくはここで、前記アミノ酸が、S、N、K、およびPから成る群から選択される、請求項14に記載の変異プロテアーゼ切断部位。 - 前記変異プロテアーゼ切断部位が、以下の:
(i)67K、60K、75R(Mut1);
(ii)67K、60P、75W(Mut8);
(iii)67K、75R(Mut10);
(iv)67K、60S、75H(Mut11);
(v)67K、60S、75W(Mut12);
(vi)67K、60S、75A(Mut13);
(vii)67K、60N、75W(Mut14);および
(viii)67K、60N、75A(Mut15)、
から成る群から選択される置換の組み合わせを含む、請求項14〜15のいずれか一項に記載の変異プロテアーゼ切断部位。 - 任意選択で、存在する場合、位置T60および/またはQ75の追加置換と組み合わせて、置換D67Kを除いた配列番号3(bdSUMO)のアミノ酸配列を有し;好ましくはここで、該変異プロテアーゼ切断部位が、配列番号41〜配列番号55のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を有する、請求項14〜15のいずれか一項に記載の変異プロテアーゼ切断部位。
- 変異プロテアーゼであって、ここで、前記変異プロテアーゼが、21℃にて1時間のインキュベーション、45mMのTris/HCl pH7.5、250mM NaCl、2mMのMgCl2、250mMのスクロース、10mMのDTTから成るバッファー中に100μMのPCS−MBP融合物の初期濃度から成る標準的な条件下で同じ濃度にて試験されるとき、配列番号71のN末端に融合された配列番号4(scSUMO)のアミノ酸配列を有するプロテアーゼ切断部位または配列番号71のN末端に融合された配列番号3(hsSUMO2)のアミノ酸配列を有するプロテアーゼ切断部位に比べて、C末端Gly−Glyモチーフの後でより効率的に、配列番号41(Mut1 bdSUMO)のアミノ酸配列を有し、かつ、配列番号71のアミノ酸配列を有するMBPのN末端に融合されるプロテアーゼ切断部位(PCS)を切断し;
任意選択で、ここで、前記変異プロテアーゼが、上記の標準的な条件下、少なくとも500倍モル過剰のMut1 bdSUMO−MBP融合物を切断する、変異プロテアーゼ。 - 前記変異プロテアーゼが、配列番号6(bdSENP1)の完全長配列に対して少なくとも80%の配列同一性を有し、ここで、前記変異プロテアーゼが、配列番号6の完全長配列に対してアラインされるとき、アラインされた配列番号6のN280に対応する位置での置換を含み、ここで、前記位置のアミノ酸がS、H、Q、A、GおよびCから成る群から選択されるアミノ酸で置換され;好ましくはここで、前記アミノ酸がS、H、QおよびAから成る群から選択される、請求項18に記載の変異プロテアーゼ。
- 請求項19に記載の変異プロテアーゼであって、前記変異プロテアーゼが、配列番号6の完全長配列に対してアラインされるとき、アラインされた配列番号6のR356に対応する位置での置換を更に含み、ここで、前記位置のアミノ酸がE、S、V、YおよびLから成る群から選択される別のアミノ酸によって置換され;好ましくはここで、前記置換がE、SおよびVから成る群から選択され;および/または
前記変異プロテアーゼが、配列番号6の完全長配列に対してアラインされるとき、アラインされた配列番号6のR269に対応する位置に置換を更に含み、ここで、前記位置のアミノ酸がE、S、P、K、Vから成る群から選択される別のアミノ酸によって置換され;および/または
前記変異プロテアーゼが、配列番号6の完全長配列に対してアラインされるとき、アラインされた配列番号6のK350に対応する位置に置換を更に含み、ここで、前記位置のアミノ酸がM、E、V、G、TおよびRから成る群から選択される別のアミノ酸によって置換され;好ましくはここで、前記置換がM、E、V、GおよびTから成る群から選択される、変異プロテアーゼ。 - 前記変異プロテアーゼが、以下の:
(i)280S、346E(MutB);
(ii)280H、269S、K350V(MutG);
(iii)269P、280A、346E、350M(MutH);
(iv)269K、280H、346E、350E(Muti);
(v)269E、280S、346S、350T(MutJ);および
(vi)269V、280Q、346V、350G(MutK)、
から成る群から選択される置換の組み合わせを含む、請求項19〜20のいずれか一項に記載の変異プロテアーゼ。 - 任意選択で、存在する場合、位置R269、R346、および/またはK350の追加置換と組み合わせて、位置N280の置換を除いた配列番号6(bdSENP1)のアミノ酸配列を有する変異プロテアーゼであって;好ましくはここで、該変異プロテアーゼが、配列番号56〜配列番号70のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を有する、請求項19〜21のいずれか一項に記載の変異プロテアーゼ。
- 請求項13〜17のいずれか一項に記載の変異プロテアーゼ切断部位を含む、融合タンパク質。
- 着目のタンパク質を精製するプロセスであって、以下のステップ:
(i)精製されるべき着目のタンパク質を準備し、ここで、前記タンパク質は、請求項13〜17のいずれか一項に記載の変異プロテアーゼ切断部位を介して前記タンパク質に融合されたアフィニティータグを含み;
(ii)前記アフィニティータグを介して、ステップ(i)のタンパク質をアフィニティーマトリックスに結合させ;そして
(iii)請求項18〜22のいずれか一項に記載の変異プロテアーゼを使用して該アフィニティーマトリックスから該タンパク質を溶出させ、それによって、タンパク質を精製すること、
を含むプロセス。
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"Novel export and import pathways in S. cerevisiaeidentified by an engineered SUMO system", GOTTINGEN STATE AND UNIVERSITY LIBRARY HP, JPN6023020736, pages 1 - 2, ISSN: 0005070928 * |
DOCTORAL DEGREE REGULATIONS OF THE MATHEMATICS AND NATURAL SCIENCES GRADUATE SCHOOL OF THE GEORG-AUG, JPN6023020734, 2018, pages 1 - 5, ISSN: 0005070929 * |
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