CN116348479A - 用于产生丝状噬菌体的细菌菌毛蛋白质复合物FimGt-DsF稳定蛋白质复合物 - Google Patents

用于产生丝状噬菌体的细菌菌毛蛋白质复合物FimGt-DsF稳定蛋白质复合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于产生噬菌粒或丝状噬菌体的细菌菌毛蛋白质复合物FimGt‑DsF稳定蛋白质复合物，以及它们的使用方法。

Description

用于产生丝状噬菌体的细菌菌毛蛋白质复合物FimGt-DsF稳 定蛋白质复合物
本发明涉及用于产生噬菌粒或丝状噬菌体的细菌菌毛蛋白质复合物FimGt-DsF稳定蛋白质复合物，以及它们的使用方法。
背景技术
噬菌体展示是一种用于选择改进的结合物的有效方法。噬菌体展示工作通常涉及使用感染大肠杆菌的丝状噬菌体M13，因为与其他噬菌体相比，使用M13相对容易。像M13这样的丝状噬菌体不会裂解宿主细胞，而是通过分泌来释放。这允许从潜在干扰细胞质蛋白中更简单和更有效地纯化噬菌体颗粒。最常见地，M13上的目的多肽(POI)的展示是通过与次要外壳蛋白pIII的N末端融合来实现，但也使用了与其他外壳蛋白(pVI、pVII、pVIII和pIX)的融合。
噬菌体展示已被广泛用于抗体和肽文库的成功选择。然而，传统的噬菌体展示存在一些限制，阻碍了其更广泛的使用。一个缺点是缺乏稳健的N末端展示(定义为通过连接POI的N末端进行展示)，以用于不适合C末端展示(诸如需要游离C末端进行相互作用的蛋白质的展示、cDNA文库和不耐受C末端融合的蛋白质的展示)的应用。
WO 2018/041740公开了一种利用在细胞表面上固定蛋白质的非共价展示系统，其包含与第一结合部分融合的目标蛋白(POI)，其中第一结合部分包含FimGT/DsF相互作用对的一个配偶体。
WO 2012/028697公开了一种基于供体链(Ds)互补的系统，其包含Ds标签和Ds标签的同源配体作为蛋白质标签和亲和配体，用于固定和/或亲和纯化程序。
Giese等人(在：″The Most Stable Protein-Ligand Complex：Applications forOne-Step Affinity Purification and Identification of Protein Assemblies″，ANGEWANDTE CHEMIE INTERNATIONAL EDITION，vol.51，no.18，27April 2012，pages 4474-4478中)公开了使用FimGT/DsF系统进行一步亲和纯化和蛋白质装配的识别。
已显示蛋白质的N末端与pIII、pVI、pVIII和pIX的C末端的融合，但导致了展示水平低(Jespers等人Bio/Technology 1995，13，378；Velappan等人，Nucleic AcidRes.2010，38，4，e22)，并且是成功的或者仅使用肽或小蛋白质成功地展示(Fuh等人FEBSLetters 2000，480，231；Fuh，Germaine and Sidhu，Sachdev S.(2000)，Efficient phagedisplay of polypeptides fused to the carboxy-terminus of the M13gene-3minorcoat protein，FEBS Letters，480，doi：10.1016/S0014-5793(00)01946-3；25Velappan等人Nucleic Acid Res.2010，38，4，e22)，和/或需要定制优化(Held等人，J Mol Biol.2004，340(3)，587)。
因此，本发明的一个目的是提供用于产生噬菌粒或丝状噬菌体的改进的稳定蛋白质复合物，以及这些的生产和使用方法。
当研究本发明的当前描述时，其他目的和优点对于本领域技术人员将变得显而易见。
在本发明的第一方面，上述目的通过提供一种蛋白质复合物来解决，该蛋白质复合物包含
a)在N末端至C末端方向上具有通式(I)的第一多肽链
X-DsF-Y-POI (I)，
和
b)在N末端至C末端方向上具有通式(II)的第二多肽链
X-FimGt-Y-CPF (II)，
其中
X不存在或者表示细菌前导序列或易位序列，
DsF表示与FimGt或其细菌同源物结合所需的细菌DsF-多肽，
Y不存在或者表示接头序列、可检测的肽序列和/或用于纯化所述多肽链的肽序列中的至少一者，
POI表示目的蛋白，
FimGt表示与DsF或其细菌同源物结合所需的细菌FimGt-多肽，并且
CPF表示丝状噬菌体的外壳蛋白。
在本发明的第二方面，上述目的通过提供一种蛋白质复合物来解决，该蛋白质复合物包含
a)在N末端至C末端方向上具有通式(III)的第一多肽链
X-SUB-DsF-Y (III)，
和
b)包含至少一个POI并且在N末端至C末端方向上具有通式(IV)的第二多肽链
X-FimGt(POI)-Y(POI)-CPF (IV)，
其中
X不存在或者表示细菌前导序列或易位序列，
DsF表示与FimGt或其细菌同源物结合所需的细菌DsF-多肽，
Y(POI)不存在或者表示其上连接有POI的分支接头序列、可检测的肽序列和/或用于纯化所述多肽链的肽序列中的至少一者，
POI表示目的蛋白，
FimGt(POI)表示与DsF或其细菌同源物结合所需的细菌FimGt-多肽，
任选地其上连接有POI，
SUB表示底物或配体，并且
CPF表示丝状噬菌体的外壳蛋白。
有利地，根据本发明的蛋白质复合物通过式I和II以及式III和IV各自的独立连续多肽序列之间的供体链互补而稳定或基本稳定。
在本发明的第三方面，上述目的通过提供一种展示至少一种目的蛋白(POI)的丝状噬菌体来解决，该丝状噬菌体包含根据本发明的蛋白质复合物。优选的是根据本发明的丝状噬菌体文库，展示POI和/或底物和/或配体(SUB)的变体。
在本发明的第四方面，上述目的通过提供编码根据本发明的蛋白质复合物的第一多肽链或第二多肽链的核酸，或编码根据本发明的蛋白质复合物的第一多肽链或第二多肽链的核酸来解决。优选的是一种双顺反子核酸，其编码根据本发明的蛋白质复合物的第一多肽链和第二多肽链，或一种双顺反子核酸，其编码根据本发明的蛋白质复合物的第一多肽链和第二多肽链。进一步优选的是根据本发明的核酸文库。
在本发明的第五方面，上述目的通过提供包含根据本发明的核酸的噬菌粒或包含根据本发明的核酸的噬菌粒文库来解决。
在本发明的第六方面，上述目的通过提供如本文所公开的用于产生根据本发明的噬菌粒或用于产生根据本发明的噬菌粒文库的方法来解决。
在本发明的第七方面，上述目的通过提供如本文所公开的用于产生根据本发明的丝状噬菌体或用于产生根据本发明的丝状噬菌体文库的方法来解决。
在本发明的第八方面，上述目的通过提供一种用于筛选与底物或配体特异性相互作用的目的蛋白(POI)的方法，其包括a)提供根据本发明的噬菌体文库，b)使所述底物或配体与a)的所述文库接触，c)确定所述底物或配体与所述文库的相互作用、优选特异性相互作用，以及d)基于所述相互作用、优选所述特异性相互作用来识别POI。优选地，所述POI是抗体或其片段，并且所述方法包括生物淘选，或者所述POI为聚合酶或其截短形式。
在本发明的第九方面，上述目的通过使用根据本发明的蛋白质复合物、根据本发明的核酸或根据本发明的核酸文库产生如本文所公开的噬菌粒或丝状噬菌体来解决。
如上所述，在其第一方面，本发明涉及一种蛋白质复合物，其包含在N末端至C末端方向上具有通式(I)的第一多肽链
X-DsF-Y-POI(I)，
以及在N末端至C末端方向上具有通式(II)的第二多肽链
X-FimGt-Y-CPF(II)。
令人惊奇地发现，POI(例如DNA聚合酶)的合适功能性噬菌体展示取决于其与噬菌体的连接。当在其C末端处融合时，POI会大大失去活性；当使用N末端融合时没有观察到这种情况。
在式I和II中，X不存在或者表示细菌前导序列或易位序列。优选地，所述细菌前导序列或易位序列选自通过分泌途径分泌的前导序列或通过易位系统易位的易位序列，例如PelB、DsbA、TorA和PhoA，以及一般分泌(Sec)途径、双精氨酸易位(Tat)途径、T2SS途径、T3SS途径、T5SS途径和SecA2途径。合适的信号序列及其设计可以基于各自的文献和本领域技术人员的知识，例如，Sec和Tat信号肽具有相似的三联整体结构，由带正电荷的n区、中心疏水性h区和含有信号肽酶(SPase；切割位点用箭头表示)的识别位点(共有序列：A-X-A)的极性c区组成。在Tat信号肽中，包括两个高度保守的精氨酸残基(带下划线)的特征性氨基酸共有基序存在于通常显著更长的n区与h区之间的边界处。此外，Tat信号肽的h区大部分疏水性低于Sec信号肽中发现的那些，而在Tat信号肽的c区中，经常存在带正电荷的氨基酸(所谓的Sec回避基序)，其防止Tat底物错误定位到Sec途径(参见，例如，Freudl，R.Signalpeptides for recombinant protein secretion in bacterial expressionsystems.Microb Cell Fact 17，52(2018).https：//doi.org/10.1186/s12934-018-0901-3，和Green ER，Mecsas J.Bacterial Secretion Systems：An Overview.MicrobiolSpectr.2016；4(1)：10.1128/microbiolspec.VMBF-0012-2015.doi：10.1128/microbiolspec.VMBF-0012-2015)。信号肽也可以针对宿主进行沉默和优化(参见，例如，Han S，Machhi S，Berge M，Xi G，Linke T，Schoner R.Novel signal peptides improvethe secretion of recombinant StaphylococcuS aureus Alpha toxinH35L inEscherichia coli.AMB Express.2017；7(1)：93.doi.10.1186/s13568-017-0394-1)。
本发明利用细菌菌毛蛋白质复合物FimGt-DsF的无限动力学稳定性，其显示出3x109年的外推解离半衰期(Puorger等人，Structure 2008，16，631)。在该实施方案中使用FimGt-DsF进行噬菌体展示通过以下方式克服了本文所述的常规噬菌体展示的局限性：提供一种极其稳定和特异性连接，这种连接能够使POI通过其N末端连接，并使具有信号序列的组合的POI和噬菌体蛋白针对不同分泌途径进行独立移位。
在式I和II中，FimGt指定与DsF或其细菌同源物结合所需的细菌FimG-多肽(细菌1型菌毛亚基FimG)，且DsF(配偶体亚基FimF的N末端延伸(称为供体链，Ds)表示结合FimG、FimGt或其细菌同源物所需的细菌DsF-多肽。优选地，所述细菌DsF多肽和细菌FimGt多肽来源于大肠杆菌或者选自来源于革兰氏阴性细菌，特别是肠杆菌科的革兰氏阴性细菌的DsF和/或FimGt的同源物。
术语FimGt应包括FimG或其细菌同源物的全长序列，以及FimG变体，特别是表现出结合改善的变体(见下文)，诸如截短的残基1-12的N末端缺失变体，任选地具有取代Q134E。FimG(大肠杆菌)的序列可见于UniProtKB，Acc No：P08190中。
术语DsF应包括FimF或其细菌同源物的全长序列，以及FimF变体，特别是表现出结合改善的变体(见下文)，诸如肽SRIRIRGYVR(SEQ ID NO：1，氨基酸25至34，T到R交换以下划线标出)。FimF(大肠杆菌)的序列可见于UniProtKB，Acc No：P08189中。
细菌1型菌毛亚基FimG与对应于配偶体亚基FimF的N末端延伸(称为供体链，Ds)(DsF)对应的肽之间的复合物表现出330m-1s-1的缓慢结合速率，这限制了技术应用，诸如它在亲和纯化中的应用。基于结构的方法可用于设计成对的FimGt(一种缺乏自身N末端延伸的FimG变体)和DsF变体，它们具有增强的静电表面互补性。最佳突变体FimGt/DsF对的关联因此加速了多于两个数量级，而改进复合物的解离速率和3D结构基本上保持不变。对于最佳突变体复合物，获得了KD值为8.8×10-22m，这是迄今为止报道的蛋白质/配体复合物的最低值(C.Giese，J.Eras，A.Kern，M.A.
Figure BDA0004149058100000061
G.Capitani，R.Glockshuber，Acceleratingthe Association of the Most Stable Protein-Ligand Complex by More than TwoOrders of Magnitude.Angew.Chem.Int.Ed.2016，55，9350)。
在本发明的上下文中，多肽的“同源物”应意指与初始多肽(例如，功能性FimG或FimGt和/或DsF或彼此结合的其长度变体)相比，表现出相同或基本上相同功能、优选地结合功能，并表现出至少80％、优选至少90％且更优选至少95％的氨基酸序列同一性的多肽。
在式I和II中，Y不存在或者表示接头序列、可检测的肽序列和/或用于纯化所述多肽链的肽序列中的至少一者。
接头是出现在蛋白质结构域，例如融合结构域之间的短肽序列。优选的是分支或未分支的肽接头序列，诸如含有分支或未分支的甘氨酸或甘氨酸/丝氨酸的肽接头序列。通常，引入接头序列以连接和/或提供多肽构建体的功能元件之间的空间。接头常常由甘氨酸和丝氨酸等柔性残基组成，使得相邻的蛋白质结构域可以相对于彼此自由移动。当需要确保两个相邻结构域不会在空间上相互干扰时，使用较长的接头。肽接头序列还可以包括可切割的(例如肽酶或化学可切割的)接头。合适的接头可以基于文献和本领域技术人员的技能来设计(参见，例如，Chen X，Zaro JL，Shen WC.Fusion protein linkers：property，design and functionality.Adv Drug Deliv Rev.2013；65(10)：1357-1369.doi：10.1016/j.addr.2012.09.039；Joshua S.Klein，Siduo Jiang，Rachel P.Galimidi，Jennifer R.Keeffe，Pamela J.Bjorkman，Design and characterization of structuredprotein linkers with differing flexibilities，Protein Engineering，Design andSelection，Volume 27，Issue 10，October 2014，Pages 325-330，https：//doi.org/10.1093/protein/gzu043)。作为如下所述的示例，聚合酶基因通过23个氨基酸长的接头与截短的pIII蛋白融合。WO/1998/019705公开了分支肽接头。类似地，合适的分支接头也可以基于文献和本领域技术人员的技能来设计(参见例如Brunetti，J，Falciani，C，Bracci，L，Pini，A.Branched peptides as bioactive molecules for drug design.PeptSci.2018；110：e24089.https：//doi.org/10.1002/pep2.24089)。
可检测的肽序列(也称为标签或标记)允许识别所述肽序列，并且因此识别整个融合构建体或其包含所述序列的部分。一些可检测序列也可用于(亲和)纯化所述融合构建体或其包含所述序列的部分。示例是要用各自的抗体检测的myc标签或Tie2标签，其他抗原标志物(参见，例如，Hopp，T.，Prickett，K.，Price，V.et al.A Short Polypeptide MarkerSequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification.NatBiotechnol6，1204-1210(1988).https：//doi.org/10.1038/nbt1088-1204)、螯合剂基团(金属、放射性核素)或荧光团基团。
用于纯化完整融合构建体或其包含所述序列的部分的多肽链的肽序列在文献中有所描述，并且是本领域技术人员已知的。示例是可用于(亲和)纯化所述多肽链的序列(参见，例如，Kimple ME，Brill AL，Pasker RL.Overview of affinity tags for proteinpurification.Curr Protoc Protein Sci.2013；73：9.9.1-9.9.23.Published 2013Sep24.doi：10.1002/0471140864.ps0909s73)、钙调蛋白结合肽、His标签诸如6His标签和/或麦芽糖结合蛋白序列。
在式II中，POI表示目的蛋白。在根据本发明的多肽链中，POI可以选自由以下项组成的组：酶、抗体及其片段诸如scFvs、Fab、聚合酶诸如核酸聚合酶、细胞因子及其功能片段以及其文库或组。优选的是抗体及其片段、核酸聚合酶或者单独或与其他蛋白质(例如待筛选的蛋白质(另见下文))一起切割或修饰底物或配体、优选SUB(见下文)的酶。可以进一步检测裂解或修饰的底物。
最后，在式II中，CPF表示丝状噬菌体的外壳蛋白，优选次要外壳蛋白。示例选自噬菌体fd、M13、f1和Pf1的次要外壳蛋白，诸如pIII、pVI、pVII、pVIII、pIX，及其能够在功能上替代丝状噬菌体的相应外壳蛋白的截短形式。
在其第二方面，本发明涉及一种蛋白质复合物，其包含在N末端至C末端方向上具有通式(III)的第一多肽链
X-SUB-DsF-Y (III)，
和
包含至少一个POI并且在N末端至C末端方向上具有通式(IV)的第二多肽链
X-FimGt(POI)-Y(POI)-CPF (IV)。
在式III和IV中，X不存在或者表示细菌前导序列或易位序列。优选地，所述细菌前导序列或易位序列选自通过分泌途径分泌的前导序列或通过易位系统易位的易位序列，例如PelB、DsbA、TorA和PhoA，以及一般分泌(Sec)途径、双精氨酸易位(Tat)途径、T2SS途径、T3SS途径、T5SS途径和SecA2途径。合适的信号序列及其设计可以基于各自的文献和本领域技术人员的知识，例如，Sec和Tat信号肽具有相似的三联整体结构，由带正电荷的n区、中心疏水性h区和含有信号肽酶(SPase；切割位点用箭头表示)的识别位点(共有序列：A-X-A)的极性c区组成。在Tat信号肽中，包括两个高度保守的精氨酸残基(带下划线)的特征性氨基酸共有基序存在于通常显著更长的n区与h区之间的边界处。此外，Tat信号肽的h区大部分疏水性低于Sec信号肽中发现的那些，而在Tat信号肽的c区中，经常存在带正电荷的氨基酸(所谓的Sec回避基序)，其防止Tat底物错误定位到Sec途径(参见，例如，Freudl，R.Signalpeptides for recombinant protein secretion in bacterial expressionsystems.Microb CellFact 17，52(2018).https：//doi.org/10.1186/s12934-018-0901-3，和Green ER，Mecsas J.Bacterial Secretion Systems：An Overview.MicrobiolSpectr.2016；4(1)：10.1128/microbio lspec.VMBF-0012-2015.doi：10.1128/microbiolspec.VMBF-0012-2015)。信号肽也可以针对宿主进行沉默和优化(参见，例如，Han S，Machhi S，Berge M，Xi G，Linke T，Schoner R.Novel signal peptides improvethe secretion of recombinant StaphylococcuS aureus A1pha toxinH35L inEscherichia coli.AMExpress.2017；7(1)：93.doi：10.1186/s13568-017-0394-1)。
同样地在此方面，本发明利用细菌菌毛蛋白质复合物FimGt-DsF的无限动力学稳定性，其显示出3x109年的外推解离半衰期(Puorger等人，Structure 2008，16，631)。在此实施方案中，使用FimGt-DsF进行噬菌体展示通过以下方式克服了上述常规噬菌体展示的局限性：提供极其稳定和特异性连接，该连接令人惊讶地能够使得具有信号序列的组合的POI和噬菌体蛋白针对不同分泌途径进行独立易位，并连接底物用于键形成和键断裂酶的定向进化。
在式III和IV中，FimGt指定与DsF或其细菌同源物结合所需的细菌FimG-多肽(细菌1型菌毛亚基FimG)，且DsF(配偶体亚基FimF的N末端延伸(称为供体链，Ds)表示结合FimG、FimGt或其细菌同源物所需的细菌DsF-多肽。优选地，所述细菌DsF多肽和细菌FimGt多肽来源于大肠杆菌或者选自来源于革兰氏阴性细菌，特别是肠杆菌科的革兰氏阴性细菌的DsF和/或FimGt的同源物。
术语FimGt应包括FimG或其细菌同源物的全长序列，以及FimG变体，特别是表现出结合改善的变体(见下文)，诸如截短的残基1-12的N末端缺失变体，任选地具有取代Q134E。FimG(大肠杆菌)的序列可见于UniProtKB，Acc No：P08190中。
FimGt(POI)表示与DsF或其细菌同源物结合所需的细菌FimGt-多肽，任选地其上连接有POI。连接可直接或间接通过如本文所述的两个多肽之间的分支或非分支接头例如FimGt-Y-(POI)进行。
术语DsF应包括FimF或其细菌同源物的全长序列，以及FimF变体，特别是表现出结合改善的变体(见下文)，诸如肽SRIRIRGYVR(SEQ ID NO：1，氨基酸25至34，T到R交换以下划线标出)。FimF(大肠杆菌)的序列可见于UniProtKB，Acc No：P08189中。
细菌1型菌毛亚基FimG与对应于配偶体亚基FimF的N末端延伸(称为供体链，Ds)(DsF)对应的肽之间的复合物表现出330m-1s-1的缓慢结合速率，这限制了技术应用，诸如它在亲和纯化中的应用。基于结构的方法可用于设计成对的FimGt(一种缺乏自身N末端延伸的FimG变体)和DsF变体，它们具有增强的静电表面互补性。最佳突变体FimGt/DsF对的关联因此加速了多于两个数量级，而改进复合物的解离速率和3D结构基本上保持不变。对于最佳突变体复合物，获得了KD值为8.8×10-22m，这是迄今为止报道的蛋白质/配体复合物的最低值(C.Giese，J.Eras，A.Kern，M.A.
Figure BDA0004149058100000101
G.Capitani，R.Glockshuber，Acceleratingthe Association of the Most Stable Protein-Ligand Complex by More than TwoOrders of Magnitude.Angew.Chem.Iht.Ed.2016，55，9350)。
同样地，在本发明的此上下文中，多肽的“同源物”应意指与初始多肽(例如，功能性FimG或FimGt和/或DsF或彼此结合的其长度变体)相比，表现出相同或基本上相同功能、优选地结合功能，并表现出至少80％、优选至少90％且更优选至少95％的氨基酸序列同一性的多肽。
在式III中，Y不存在或者表示接头序列、可检测的肽序列和/或用于纯化所述多肽链的肽序列中的至少一者。在式IV中，Y(POI)不存在或者表示其上连接有POI的分支接头序列、可检测的肽序列和/或用于纯化所述多肽链的肽序列中的至少一者。
接头是出现在蛋白质结构域，例如融合结构域之间的短肽序列。优选的是分支或未分支的肽接头序列，诸如含有分支或未分支的甘氨酸或甘氨酸/丝氨酸的肽接头序列。通常，引入接头序列以连接和/或提供多肽构建体的功能元件之间的空间。接头常常由甘氨酸和丝氨酸等柔性残基组成，使得相邻的蛋白质结构域可以相对于彼此自由移动。当需要确保两个相邻结构域不会在空间上相互干扰时，使用较长的接头。肽接头序列还可以包括可切割的(例如肽酶或化学可切割的)接头。合适的接头可以基于文献和本领域技术人员的技能来设计(参见，例如，Chen X，Zaro JL，Shen WC.Fusion protein linkers：property，design and functionality.Adv Drug Deliv Rev.2013；65(10)：1357-1369.doi：10.1016/j.addr.2012.09.039；Joshua S.Klein，Siduo Jiang，Rachel P.Galimidi，Jennifer R.Keeffe，Pamela J.Bjorkman，Design and characterization of structuredprotein linkers with differing flexibilities，Protein Engineering，Design andSelection，Volume27，Issue10，October2014，Pages325-330，https：//doi.org/10.1093/protein/gzu043)。作为如下所述的示例，聚合酶基因通过23个氨基酸长的接头与截短的pIII蛋白融合。WO/1998/019705公开了分支肽接头。类似地，合适的分支接头也可以基于文献和本领域技术人员的技能来设计(参见例如Brunetti，J，Falciani，C，Bracci，L，Pini，A.Branched peptides as bioactive molecules for drug design.PeptSci.2018；110：e24089.https：//doi.org/10.1002/pep2.24089)。
可检测的肽序列(也称为标签或标记)允许识别所述肽序列，并且因此识别整个融合构建体或其包含所述序列的部分。一些可检测序列也可用于(亲和)纯化所述融合构建体或其包含所述序列的部分。示例是要用各自的抗体检测的myc标签或Tie2标签，其他抗原标志物(参见，例如，Hopp，T.，Prickett，K.，Price，V.et al.A Short Polypeptide MarkerSequence Useful for Recombinant Protein Identification and Purification.NatBiotechnol 6，1204-1210(1988).https：//doi.org/10.1038/nbt1088-1204)、螯合剂基团(金属、放射性核素)或荧光团基团。
用于纯化完整融合构建体或其包含所述序列的部分的多肽链的肽序列在文献中有所描述，并且是本领域技术人员已知的。示例是可用于(亲和)纯化所述多肽链的序列(参见，例如，Kimple ME，Brill AL，Pasker RL.Overview of affinity tags for proteinpurification.Curr Protoc Protein Sci.2013；73：9.9.1-9.9.23.Published 2013Sep24.doi：10.1002/0471140864.ps0909s73)、钙调蛋白结合肽、His标签诸如6His标签和/或麦芽糖结合蛋白序列。
在式IV中，POI表示目的蛋白。在根据本发明的多肽链中，POI可以选自由以下项组成的组：酶、抗体及其片段诸如scFvs、Fab、聚合酶诸如核酸聚合酶、细胞因子及其功能片段以及其文库或组。优选的是抗体及其片段、核酸聚合酶或者单独或与其他蛋白质(例如待筛选的蛋白质(另见下文))一起切割或修饰底物或配体、优选SUB(见下文)的酶。可以进一步检测裂解或修饰的底物。
在式IV中，CPF表示丝状噬菌体的外壳蛋白，优选次要外壳蛋白。示例选自噬菌体fd、M13、fl和Pf1的次要外壳蛋白，诸如pIII、pVI、pVII、pVIII、pIX，及其能够在功能上替代丝状噬菌体的相应外壳蛋白的截短形式。
最后，在式III中，SUB表示可被POI单独切割或修饰的底物，或者与其他蛋白质，例如待筛选的蛋白质(也见下文)或配体一起切割或修饰的底物。可以进一步检测裂解或修饰的底物。SUB可以选自由酶的底物、配体(例如POI的配体)、可切割的可检测标志物)包括金属、荧光团、猝灭剂)、抗原标志物及其文库组成的组。
优选的是根据本发明的蛋白质复合物，其中所述复合物通过式I和II以及式III和IV各自的独立连续多肽序列之间的供体链互补其中而稳定或基本稳定。
本发明的又一方面涉及展示至少一种如本文所公开的目的蛋白(POI)的丝状噬菌体，其包含根据本发明的蛋白质复合物。优选地，所述丝状噬菌体选自fd、M13、f1和Pf1。更优选地，在所述丝状噬菌体中，CPF替代或至少部分地替代所述丝状噬菌体的外壳蛋白，优选其次要外壳蛋白，更优选相应的天然次要外壳蛋白，并且最优选地能够在功能上替代所述丝状噬菌体的相应外壳蛋白。
本发明的另一方面涉及根据本发明的丝状噬菌体文库，展示POI和/或底物或配体(SUB)的变体。
本发明的另一方面涉及包含根据本发明的丝状噬菌体的细菌宿主细胞或包含根据本发明的丝状噬菌体的文库的细菌宿主细胞。优选的宿主细胞是大肠杆菌或铜绿假单胞菌。
本发明的另一个方面涉及编码根据本发明的蛋白质复合物的第一(式I)或第二(式II)多肽链的核酸，或编码根据本发明的第一(式III)或第二(式IV)多肽链的核酸。核酸可以是DNA、RNA、PNA或其混合物。本发明的另一方面涉及编码根据本发明的蛋白质复合物的第一(式I)和第二(式II)多肽链的双顺反子核酸，或者编码根据本发明的蛋白质复合物的第一(式III)和第二(式IV)多肽链的双顺反子核酸。优选的是根据本发明的核酸，其包含并编码POI和/或SUB的变体。本发明的另一方面涉及根据本发明的核酸文库。还包括包含并表达根据本发明的一种或多种核酸的表达构建体和载体。
本发明的另一个方面涉及噬菌粒(参见例如Qi H，Lu H，Qiu HJ，Petrenko V，LiuA.Phagemid vectors for phage display：properties，characteristics andconstruction.J Mol Biol.2012；417(3)：129-143.Doi：10.1016/j.jmb.2012.01.038)，其包含编码根据本发明的蛋白质复合物的第一(式I)和第二(式II)多肽链的核酸或编码第一(式III)和第二(式IV)多肽链的核酸。本发明的另一方面涉及包含根据本发明的核酸的噬菌粒文库。更优选地，在所述噬菌粒中，CPF替代或至少部分地替代丝状噬菌体的外壳蛋白，优选其次要外壳蛋白，更优选相应的天然次要外壳蛋白，并且最优选地能够在功能上替代所述丝状噬菌体的相应外壳蛋白。
本发明的另一方面涉及包含根据本发明的噬菌粒的细菌宿主细胞或包含根据本发明的噬菌粒的文库的细菌宿主细胞。优选的宿主细胞是大肠杆菌或铜绿假单胞菌。在一个实施方案中，噬菌粒转化的细菌细胞产生丝状噬菌体的结构蛋白。在进一步的实施方案中，噬菌粒转化的细菌细胞复制单链噬菌粒DNA。在又一个实施方案中，噬菌粒转化的细菌细胞分泌具有噬菌粒DNA的丝状噬菌体。
本发明的又一方面涉及用于产生根据本发明的噬菌粒的方法，其包括提供合适的噬菌粒载体，并将根据本发明的核酸插入所述载体中。本发明的又一方面涉及用于产生根据本发明的噬菌粒文库的方法，其包括提供合适的噬菌粒载体，并将根据本发明的核酸文库插入所述噬菌粒载体中。
本发明的又一方面涉及用于产生根据本发明的丝状噬菌体的方法，其包括将根据本发明的核酸适当地插入合适的丝状噬菌体的基因组中，并且任选地在合适的宿主细菌中表达所述基因组。本发明的又一方面涉及用于产生根据本发明的丝状噬菌体文库的方法，其包括将根据本发明的核酸文库插入合适的丝状噬菌体的基因组中，并且任选地在合适的宿主细菌中表达所述基因组。优选地，在所述丝状噬菌体或丝状噬菌体文库中，CPF替代或至少部分地替代所述丝状噬菌体的外壳蛋白，优选其次要外壳蛋白，更优选相应的/对应的天然次要外壳蛋白，并且最优选地能够在功能上替代所述丝状噬菌体的相应外壳蛋白。
本发明的另一个重要方面涉及一种用于筛选与至少一种底物或配体(SUB)特异性相互作用的目的蛋白(POI)的方法，其包括
a)提供根据本发明的丝状噬菌体文库，
b)使所述至少一种底物或配体与a)的所述文库接触，
c)确定所述底物或配体与所述文库的相互作用、优选特异性相互作用，以及
d)基于所述相互作用、优选所述特异性相互作用来识别POI。
优选的是根据本发明的方法，其中所述POI是如本文所述的抗体或其片段。优选的是根据本发明的方法，其中所述POI是如本文所述的聚合酶或其截短形式。
噬菌体展示是一种用于研究蛋白质-配体相互作用的强大技术，最常应用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-肽和蛋白质-核酸相互作用。目的蛋白/肽的遗传密码被插入噬菌体的基因组中，且随后作为与天然外壳蛋白的融合体“展示”在病毒颗粒的表面上。针对目的配体测试蛋白质/肽变体的文库。与特异性靶标结合的蛋白质/肽通过3至5轮亲和力驱动的生物淘选来选择，且随后通过对展示它们的噬菌体的基因组进行测序来识别。噬菌体展示广泛用于选择具有所需结合特性的蛋白质/肽，以用于广泛的治疗、研究和纳米技术相关的应用(参见，例如，Boriana Marintcheva，Harnessing the Power of Viruses，AcademicPress，2018，Chapter 5，Pages 133-160，ISBN 9780128105146，https：//doi.org/10.1016/B978-0-12-810514-6.00005-2)。
优选地，用于筛选的方法包括生物淘选。简单来说，在一个优选的实施方案中，生物淘选是一种亲和力选择技术，它选择与给定靶标结合的肽。该技术通常用于选择抗体。生物淘选涉及用于肽选择的四个主要步骤。第一步是提供噬菌体展示文库。下一步是捕获步骤。它涉及将噬菌体文库与所需靶标缀合。此程序称为淘选。它利用结合相互作用，以便只有由细菌噬菌体呈递的特异性肽才能与靶标结合。例如，在微量滴定板中选择由具有包被抗原的细菌噬菌体呈递的抗体。洗涤步骤在捕获步骤之后进行，以从固体表面洗掉未结合的噬菌体。仅保留亲和力强的结合的噬菌体。最后一步涉及洗脱步骤，其中通过改变pH或其他环境条件来洗脱结合的噬菌体。最终结果是细菌噬菌体产生的肽是特异性的。由此产生的丝状噬菌体可以再次感染革兰氏阴性细菌以产生噬菌体文库。该循环可以发生多次，使得肽与靶标的结合具有强亲和力。该过程可以至少部分地自动化，例如使用机器人。
本发明的另一个方面涉及根据本发明的蛋白质复合物、根据本发明的核酸或根据本发明的核酸文库用于产生噬菌粒或丝状噬菌体的用途。
本发明利用细菌菌毛蛋白质复合物FimGt-DsF的无限动力学稳定性，其显示出3x109年的外推解离半衰期(Puorger等人，Structure 2008，16，631)。使用FimGt-DsF进行噬菌体展示通过提供极其稳定的和特异性连接克服了上述常规噬菌体展示的局限性，该连接能够1)通过其N末端连接POI，2)使具有信号序列的组合的POI和噬菌体蛋白针对不同分泌途径进行独立易位，和3)连接底物用于键形成和键断裂酶的定向进化。
本发明进一步涉及以下项：
项1.一种蛋白质复合物，其包含a)在N末端至C末端方向上具有通式(I)的第一多肽链
X-DsF-Y-POI (I)，
和b)在N末端至C末端方向上具有通式(II)的第二多肽链
X-FimGt-Y-CPF (II)，
其中X不存在或者表示细菌前导序列或易位序列，DsF表示与FimGt或其细菌同源物结合所需的细菌DsF-多肽，Y不存在或者表示接头序列、可检测的肽序列和/或用于纯化所述多肽链的肽序列中的至少一者，POI表示目的蛋白，FimGt表示与DsF或其细菌同源物结合所需的细菌FimGt-多肽，并且CPF表示丝状噬菌体的外壳蛋白。
项2.一种蛋白质复合物，其包含a)在N末端至C末端方向上具有通式(III)的第一多肽链
X-SUB-DsF-Y (III)，
和b)包含至少一个POI并且在N末端至C末端方向上具有通式(IV)的第二多肽链
X-FimGt(POI)-Y(POI)-CPF (IV)，
其中X不存在或者表示细菌前导序列或易位序列，DsF表示与FimGt或其细菌同源物结合所需的细菌DsF-多肽，Y(POI)不存在或者表示连接有POI的分支接头序列、可检测的肽序列和/或用于纯化所述多肽链的肽序列中的至少一者，POI表示目的蛋白，FimGt(POI)表示与DsF或其细菌同源物结合所需的，任选地连接有POI的细菌FimGt-多肽，SUB表示底物，并且CPF表示丝状噬菌体的外壳蛋白。
项3.根据项1或2所述的蛋白质复合物，其中所述细菌前导序列或易位序列选自通过分泌途径分泌的前导序列或通过易位系统易位的易位序列，例如PelB、DsbA、TorA和PhoA，以及一般分泌(Sec)途径、双精氨酸易位(Tat)途径、T2SS途径、T3SS途径、T5SS途径和SecA2途径。
项4.根据项1至3中任一项所述的蛋白质复合物，其中所述细菌DsF多肽和细菌FimGt多肽来源于大肠杆菌或者选自来源于革兰氏阴性细菌，特别是肠杆菌科的革兰氏阴性细菌的DsF和/或FimGt的同源物。
项5.根据项1至4中任一项所述的蛋白质复合物，其中Y选自分支或未分支的肽接头序列诸如分支或未分支的甘氨酸或甘氨酸/丝氨酸肽接头序列、作为可检测的肽序列的myc-标签和Tie2-标签和/或用于纯化所述多肽链的钙调蛋白结合肽、His-标签或麦芽糖蛋白质结合序列。
项6.根据项1至5中任一项所述的蛋白质复合物，其中所述复合物通过式I和II以及式III和IV各自的独立连续多肽序列之间的供体链互补而稳定或基本稳定。
项7.根据项1至6中任一项所述的蛋白质复合物，其中CPF选自噬菌体fd、M13、f1和Pf1的次要外壳蛋白，诸如pIII、pVI、pVII、pVIII、pIX，及其能够在功能上替代丝状噬菌体的相应外壳蛋白的截短形式。
项8.根据项1至7中任一项所述的蛋白质复合物，其中POI选自由酶、抗体和核酸聚合酶及其功能片段和其文库组成的组。
项9.根据项1至8中任一项所述的蛋白质复合物，其中SUB选自由酶的底物、可切割的可检测标志物、抗原标志物及其文库组成的组。
项10.一种展示至少一种目的蛋白(POI)的丝状噬菌体，其包含根据项1至9中任一项所述的蛋白质复合物。
项11.根据项10所述的丝状噬菌体，其中所述丝状噬菌体选自fd、M13、f1和Pfl。
项12.根据项10或11所述的丝状噬菌体文库，任选地展示POI和/或底物(SUB)的变体。
项13.一种核酸，其编码根据项1至9中任一项所述的蛋白质复合物的第一多肽链或第二多肽链，或一种核酸，其编码根据项2至9中任一项所述的蛋白质复合物的第一多肽链或第二多肽链。
项14.一种双顺反子核酸，其编码根据项1至9中任一项所述的蛋白质复合物的第一多肽链和第二多肽链，或一种双顺反子核酸，其编码根据项2至9中任一项所述的蛋白质复合物的第一多肽链和第二多肽链。
项15.根据项13和/或14所述的核酸，其包含POI和/或SUB的变体。
项16.一种根据项13至15中任一项所述的核酸文库。
项17.一种包含根据项13至15中任一项所述的核酸的噬菌粒或一种包含根据项16所述的核酸的噬菌粒文库。
项18.一种产生根据项17所述的噬菌粒的方法，其包括提供合适的噬菌粒载体，以及将根据项13至15中任一项所述的核酸插入所述载体中。
项19.一种产生根据项17所述的噬菌粒文库的方法，其包括提供合适的噬菌粒载体，并将根据项16所述的核酸文库插入所述载体中。
项20.一种产生根据项10或11所述的丝状噬菌体的方法，其包括将根据项13至15中任一项所述的核酸插入合适的丝状噬菌体的基因组中，并且任选地在合适的宿主细菌中表达所述基因组。
项21.一种产生根据项12所述的丝状噬菌体文库的方法，其包括将根据项16所述的核酸文库插入合适的丝状噬菌体的基因组中，并且任选地在合适的宿主细菌中表达所述基因组。
项22.一种用于筛选与底物或配体特异性相互作用的目的蛋白(POI)的方法，其包括a)提供根据项12所述的文库，b)使所述底物或配体与a)的所述文库接触，c)确定所述底物或配体与所述文库的相互作用、优选特异性相互作用，以及d)基于所述相互作用、优选所述特异性相互作用来识别POI。
项23.根据项22所述的方法，其中所述POI是抗体或其片段，并且所述方法包括生物淘选。
项24.根据项22所述的方法，其中所述POI是聚合酶或其截短形式。
项25.根据项1至9中任一项所述的蛋白质复合物、根据项13至15中任一项所述的核酸或根据权利要求16所述的核酸文库用于产生噬菌粒或丝状噬菌体的用途。
现在将参考附图在以下示例中进一步描述本发明，但不限于此。出于本发明的目的，本文引用的所有参考文献均通过引用整体并入。
图1显示了使用FimGt-DsF进行噬菌体展示的示意性示例。(A)FimGt-DsF使POI通过其N末端连接到噬菌体，并通过分泌途径的不同组合从噬菌体外壳蛋白独立地易位。(B)FimGt进一步为DsF标记的底物的连接提供了锚，允许键形成和键断裂酶的进化。
图2显示了噬菌体展示构建体。(上图)用于通过N末端连接展示来自梭菌噬菌体phiCPV4(Pol)的DNA聚合酶的Fim噬菌粒构建体含有聚合酶基因(在其N末端与DsF肽融合)和FimGt基因(与截短的pIII(pIIIt，残基250至406)的N末端融合)的双顺反子排列。在Pol的N末端处插入His6标签用于纯化，且插入Tie2标签用于检测。FimGt-pIII融合在FimGt与截短的pIII之间含有myc标签用于检测。构建了具有六种不同信号序列组合的形式：对于聚合酶，克隆胡萝卜软腐欧文氏菌果胶酸裂解酶B的PelB信号序列以促进通过Sec途径的易位，克隆大肠杆菌硫代二硫化物交换蛋白DsbA的DsbA信号序列以促进通过SRP途径的易位，以及克隆大肠杆菌三甲胺-N-氧化物还原酶的TorA信号序列以促进通过Tat途径的易位，并与PelB或DsbA信号序列组合用于FimGt-pIII融合蛋白的易位。(下图)对于经典的噬菌粒构建体，聚合酶基因通过23个氨基酸的长接头与截短的pIII融合。与Fim构建体一样，在Pol的N末端处插入His6标签用于纯化，且插入Tie2标签用于检测。构建了具有三个信号序列PelB、DsbA和TorA的形式，用于使Pol-pIII融合蛋白通过三种不同途径易位。
图3显示聚合酶展示噬菌体的噬菌体ELISA。比较了具有通过FimGt-DsF(深灰色，Fim)或直接融合(灰色，无Fim)连接的聚合酶并在不同条件下表达的噬菌体样品的展示水平。指示了用于Pol融合和FimGt融合蛋白的信号序列，以及宿主菌株Xl1-Blue(XL1)或TG1和表达温度。对于每种制剂，确定滴度并且每孔使用109个噬菌体。从所有样品的信号中减去辅助噬菌体M13KO7的信号(652nm处的吸光度)。Fab展示噬菌体在减去后没有表现出任何信号，表明该噬菌体ELISA中的信号对聚合酶展示噬菌体具有特异性。
图4显示了用于DNA结合的聚合酶展示噬菌体的模型选择。将来自表1中所列制剂的通过FimGt-DsF(Fim)或直接融合(无Fim)展示聚合酶的噬菌体等量混合，并加入估计量的60％至75％的展示噬菌体的抗体Fab。选择噬菌体混合物用于DNA与引物模板复合物的结合，该引物模板复合物通过生物素固定在链霉亲和素磁珠上。使用未结合DNA的链霉亲和素珠进行对照选择。通过TG1细胞的感染和噬菌粒的序列分析来确定选择前(左)、选择后(中)或对照选择后(右)的20个噬菌体的身份。
实例
材料和方法
材料
缓冲液和盐购自商业供应商。寡核苷酸来自IDT。限制酶和DNA聚合酶来自Roche(罗氏公司)、New England Biolabs或Agilent(Sffatagen)。抗体得自以下供应商：小鼠抗M13 pIII(NEB)、兔抗小鼠HRP(Invitrogen)、山羊抗兔HR(Invitrogen)、小鼠抗M13-HR(GEHealthcare)。兔抗Tie2单克隆抗体是罗氏公司内部的研究工具(非市售)。大肠杆菌菌株Xl1-Blue和Xl10-Gold来自Agilent(Stratagene)，且TG1来自Lucigen。辅助噬菌体M13KO7来自GE Healthcare。除非另有说明，否则微生物学和分子生物学方法是根据标准程序进行的(J.Sambrook，D.Roulland，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，2001)。
克隆
通过重叠延伸PCR，使用含有接头和标签的引物以及来自梭菌噬菌体phiCPV4(Po16，参见WO 2017/148862)、FimGt和M13次要外壳蛋白pIII的DNA聚合酶基因作为模板来装配噬菌粒pETR-DsF-HisPol6_FimGt-pIII和pETR-HisPol6-pIII的插入物。将PCR产物克隆到pETR噬菌粒(来自Roche Glycart的载体)中。将PelB信号序列通过PCR与含有DsbA或TorA序列的引物交换，且随后克隆到pETR噬菌粒中。
噬菌体产生和纯化
用噬菌粒转化XL1-Blue和TG1细胞。使用单菌落在补充有1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基(5ml)中接种预培养物，并在30℃下振荡孵育过夜。使用预培养物在含有1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素(比例为1∶100)的50ml新鲜2xYT培养基中接种培养物。使培养物在37℃下生长至OD600为0.5至0.7，然后用50μl辅助噬菌体M13KO7(1013pfu/ml)感染并在37℃下轻微搅拌孵育45分钟。通过在3320g和4℃下离心10分钟收获细胞并将沉淀重新悬浮在含有100μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml卡那霉素和对于+IPTG样品含有0.1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的50ml 2xYT培养基中来改变培养基。在28℃下生长16小时或在20℃和250rpm下生长24小时后，通过在4800g和4℃下离心30分钟去除细胞。将上清液与四分之一体积的冰冷PEG/NaCl溶液(20％聚乙二醇(PEG)6000，2.5M NaCl)混合，并在冰上孵育1小时。通过在7164g和4℃下离心30分钟来沉淀沉淀的噬菌体颗粒。将每个沉淀重新悬浮在40ml洗涤缓冲液(50mM Tris，pH 7.5，200mM NaCl，5mM DTT)中，并加入10ml冰冷的PEG/NaCl溶液(20％PEG 6000，2.5M NaCl)。在冰上孵育1、时后，通过在7164g和4℃下离心30分钟收集噬菌体，并将沉淀各自重新悬浮在1.6ml pol储存缓冲液(50mM Tris，pH7.5，200mM NaCl，0.5％Tween 20，25％甘油，5mM DTT)中。为了丢弃任何细菌碎片，将噬菌体在16100g和4℃下离心3分钟。通过感染大肠杆菌TGl细胞并在含有1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2xYT琼脂板上进行滴定，确定噬菌体样品的感染滴度。
蛋白质印迹分析
纯化的噬菌体样品补充有SDS负载染料和还原剂。将SDS-PAGE在4％至12％Bis-Tris凝胶(Invitrogen)上进行，且然后使用iBlot干式印迹系统(Invitrogen)转移到硝酸纤维素膜上。使用1∶10000稀释的小鼠抗M13pIII作为一抗且使用1：2000稀释的辣根过氧化物酶缀合的兔抗小鼠IgG抗体作为二抗检测噬菌体次要外壳蛋白pIII及其融合体。使用1：2500稀释的兔抗Tie2抗体作为一抗且使用1∶2000稀释的辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG抗体作为二抗，通过Tie2标签检测聚合酶。使用来自Roche的Lumi-Light底物显影印迹。
噬菌体ELISA
将兔抗Tie 2以2.5μg/ml的浓度包被到Immunomaxi 96孔板(Thermo Fisher)上作为捕获抗体。封闭和洗涤后，将每孔109个噬菌体颗粒(通过滴定来确定)加入孔中，并在室温下孵育1小时。洗涤后，用1∶2500稀释的辣根过氧化物酶缀合的小鼠抗M13抗体(GEHealthcare)检测结合的噬菌体。使用PierceTM TMB(3，3′，5，5′四甲基联苯胺)底物试剂盒(Thermo Fisher)并检测370和652nm处的吸收，对板进行显影。
模型选择
将来自九个噬菌粒构建体的噬菌体颗粒以等体积混合，该等构建体含有和不含在表1中列出的不同条件下产生的FimGt-DsF(72种制剂)。将展示抗体Fab片段的噬菌体加入到展示噬菌体混合物的聚合酶中，其量通过蛋白质印迹估计占混合物中总噬菌体的60％至75％。将噬菌体混合物经过PEG沉淀(参见噬菌体产生和纯化部分)一次并重新悬浮在pol结合缓冲液(50mM Tris，pH 7.5，55mM谷氨酸，0.1％Tween 20，1％BSA，5mM DTT)中。将新鲜离心的噬菌体加入到链霉亲和素磁珠(Dynabeads M2-80链霉亲和素，Invitrogen)中，该磁珠已经用BSA封闭，用生物素化的引物模板复合物包被，然后与生物素一起孵育以使剩余的游离链霉亲和素结合位点饱和。对照珠未用生物素化引物模板复合物包被，但在其他方面进行了相同的处理。将噬菌体在珠子上在室温孵育20分钟，将未结合的噬菌体洗掉，且将结合的噬菌体通过与DNA酶(20U/100μl珠子)在室温一起孵育1小时来洗脱。在选择之前，用回收的噬菌体和等分的噬菌体混合物感染指数生长的TG1细胞。在轻微搅拌下在37℃孵育30分钟后，将细胞稀释液铺板在含有1％葡萄糖和100μg/ml氨苄青霉素的2xYT琼脂板上，以测定滴度并获得用于确定噬菌体身份的菌落。20个噬菌粒的身份分别通过测序来确定。
通过FimGt-DsF连接DNA聚合酶的N末端使得能够在丝状噬菌体M13上进行功能展示
噬菌体展示构建体的设计和克隆
在该示例中，发明人使用FimGt-DsF以通过与噬菌体的N末端连接展示来自梭菌噬菌体phiCPV4的DNA聚合酶。当在其C末端处融合时，这种聚合酶会大大失去活性。因此，N末端融合对于活性聚合酶的展示应该是至关重要的。
对于聚合酶与噬菌体的N末端连接，将聚合酶双顺反子克隆到FimGt-pIII融合蛋白前面的噬菌粒载体中(图2，上图)。然后将DsF肽连接到聚合酶的N末端，并包含用于纯化的his标签和用于用抗Tie2抗体检测的Tie2标签。将FimGt与截短的次要外壳蛋白pIII融合，并添加了myc标签用于检测。除了用于通过Sec途径分泌的标准PelB前导序列之外，还分别克隆了具有DsbA和TorA信号序列的构建体用于通过SRP和Tat途径使聚合酶易位，并与PelB或DsbA组合，用于使FimGtDsF融合体易位(由于FimGt天然分泌到周质中，并在那里折叠和装配，因此不考虑Tat途径)。为了比较，设计并克隆了不含FimGt-DsF但聚合酶通过其C末端与pIII外壳蛋白直接融合的经典噬菌体展示构建体(图2，下图)。至于FimGt-DsF构建体，构建了具有信号序列PelB、DsbA和TorA的形式，用于使聚合酶-pIII融合体通过不同分泌途径易位。
几种大肠杆菌菌株和不同条件下的噬菌体产生
为了找到产生两种展示聚合酶的噬菌体构建体的最佳条件，测试了大肠杆菌菌株TG1和Xl1-Blue，以及28℃和20℃的表达温度，以及在辅助噬菌体感染后使用含和不含IPTG的培养基。
通过蛋白质印迹评定噬菌体的产生和展示
通过蛋白质印迹评估了在上述各种条件下噬菌体产生的结果(表1)。总噬菌体产量通过pIII蛋白的量来反映，该量通过单克隆抗pIII抗体来检测。展示水平可以通过由相同的单克隆抗pIII抗体检测的pIII融合蛋白(FimGt-pIII或聚合酶-pIII)的量，以及通过使用Tie2标签和抗Tie2抗体检测DsF-聚合酶或聚合酶-pIII蛋白来评估。目测评估蛋白质印迹中不同蛋白质的量，并从检测不到(-)到强条带(++)进行评级。结果总结在表1中，且结果表明，虽然Fim构建体和经典构建体都产生噬菌体，但是通过其N末端连接有聚合酶的Fim构建体通常表现出更高的展示水平。向生长培养基中添加IPTG倾向于产生较低的噬菌体数量和展示水平，这表明聚合酶和pIII融合的强烈诱导是不利的。最佳宿主菌株和表达温度因构建体而异。聚合酶构建体没有表现出对特定信号序列组合的偏好。
表1.通过蛋白质印迹测定噬菌体的产生和展示
Figure BDA0004149058100000231
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Figure BDA0004149058100000241
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Figure BDA0004149058100000251
通过噬菌体ELISA证明聚合酶展示
在Fim构建体的情况下，两个独立的融合蛋白，DsF-聚合酶和FimGt-pIII，独立地易位到周质并在那里装配。因此，两种融合蛋白的蛋白质印迹检测不能证明它们的连接以及因此聚合酶在噬菌体表面上的展示。因此，进行了通过蛋白质印迹显示最高展示的噬菌体样品的噬菌体ELISA(图3)。确定不同样品的噬菌体滴度，且范围从5x1011至3x1013(cfu/ml)。将等量的噬菌体加入ELISA板的孔中，且展示聚合酶的噬菌体用抗Tie2抗体捕获，该抗体对聚合酶上的Tie2标签具有特异性。洗涤后，用辣根过氧化物酶偶联的抗M13抗体检测结合的噬菌体，该抗体与噬菌体的主要外壳蛋白pVIII结合。辅助噬菌体和展示抗体Fab片段的噬菌体用作阴性对照。Fim构建体的高ELISA信号表明聚合酶确实展示在噬菌体表面上。ELISA结果与蛋白质印迹结果非常一致，且没有Fim的经典构建体的低ELISA信号证实这些构建体显示明显更少的聚合酶，表明聚合酶的N末端连接对于噬菌体表面的展示是至关重要的。如在蛋白质印迹中所见，信号序列似乎对我们聚合酶的展示水平没有影响。
序列表
<110> F. HOFFMANN-LA ROCHE AG
<110> Roche Diagnostics GmbH
<110> Roche Diagnostics Operations, Inc.
<120> 用于产生丝状噬菌体的细菌菌毛蛋白质复合物 FimGt-DsF 稳定蛋白质复合物
<130> R75101WO
<150> EP20199192.4
<151> 2020-09-30
<160> 1
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 大肠杆菌 FimF 蛋白变体肽
<400> 1
Ser Arg Ile Arg Ile Arg Gly Tyr Val Arg
1 5 10

Claims (16)

1.一种蛋白质复合物，其包含
a)在N末端至C末端方向上具有通式(I)的第一多肽链
X-DsF-Y-POI(I)，
和
b)在N末端至C末端方向上具有通式(II)的第二多肽链
X-FimGt-Y-CPF(II)，
其中
X不存在或者表示细菌前导序列或易位序列，
DsF表示与FimGt或其细菌同源物结合所需的细菌DsF-多肽，
Y不存在或者表示接头序列、可检测的肽序列和/或用于纯化所述多肽链的肽序列中的至少一者，
POI表示目的蛋白，
FimGt表示与DsF或其细菌同源物结合所需的细菌FimGt-多肽，并且
CPF表示丝状噬菌体的外壳蛋白。
2.一种蛋白质复合物，其包含
a)在N末端至C末端方向上具有通式(III)的第一多肽链
X-SUB-DsF-Y(III)，
和
b)包含至少一个POI并且在N末端至C末端方向上具有通式(IV)的第二多肽链
X-FimGt(POI)-Y(POI)-CPF(IV)，
其中
X不存在或者表示细菌前导序列或易位序列，
DsF表示与FimGt或其细菌同源物结合所需的细菌DsF-多肽，
Y(POI)不存在或者表示其上连接有POI的分支接头序列、可检测的肽序列和/或用于纯化所述多肽链的肽序列中的至少一者，
POI表示目的蛋白，
FimGt(POI)表示与DsF或其细菌同源物结合所需的细菌FimGt-多肽，任选地其上连接有POI，
SUB表示底物，并且
CPF表示丝状噬菌体的外壳蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质复合物，其中所述细菌前导序列或易位序列选自通过分泌途径分泌的前导序列或通过易位系统易位的易位序列，例如PelB、DsbA、TorA和PhoA，以及一般分泌(Sec)途径、双精氨酸易位(Tat)途径、T2SS途径、T3SS途径、T5SS途径和SecA2途径。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白质复合物，其中所述细菌DsF多肽和细菌FimGt多肽来源于大肠杆菌或者选自来源于革兰氏阴性细菌，特别是肠杆菌科的革兰氏阴性细菌的DsF和/或FimGt的同源物。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的蛋白质复合物，其中Y选自分支或未分支的肽接头序列诸如分支或未分支的甘氨酸或甘氨酸/丝氨酸肽接头序列、作为可检测的肽序列的myc-标签和Tie2-标签和/或用于纯化所述多肽链的钙调蛋白结合肽、His-标签或麦芽糖蛋白质结合序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的蛋白质复合物，其中所述复合物通过式I和II以及式III和IV各自的独立连续多肽序列之间的供体链互补而稳定或基本稳定。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的蛋白质复合物，其中CPF选自噬菌体fd、M13、f1和Pf1的次要外壳蛋白，诸如pIII、pVI、pVII、pVIII、pIX，及其能够在功能上替代丝状噬菌体的相应外壳蛋白的截短形式。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白质复合物，其中POI选自由酶、抗体和核酸聚合酶及其功能片段和其文库组成的组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的蛋白质复合物，其中SUB选自由酶的底物、可切割的可检测标志物、抗原标志物及其文库组成的组。
10.一种展示至少一种目的蛋白(POI)的丝状噬菌体，其包含根据权利要求1至9中任一项所述的蛋白质复合物，其中所述丝状噬菌体优选地选自fd、M13、f1和Pf1，或者所述丝状噬菌体的文库，任选地展示POI和/或底物(SUB)的变体。
11.一种核酸，其编码根据权利要求1至9中任一项所述的蛋白质复合物的第一多肽链或第二多肽链，或一种核酸，其编码根据权利要求2至9中任一项所述的蛋白质复合物的第一多肽链或第二多肽链。
12.一种双顺反子核酸，其编码根据权利要求1至9中任一项所述的蛋白质复合物的第一多肽链和第二多肽链，或一种双顺反子核酸，其编码根据权利要求2至9中任一项所述的蛋白质复合物的第一多肽链和第二多肽链。
13.根据权利要求11和/或12所述的核酸，其包含POI和/或SUB的变体。
14.一种根据权利要求11至13中任一项所述的核酸的文库，一种包含根据权利要求11至13中任一项所述的核酸的噬菌粒，或一种包含所述核酸的噬菌粒的文库。
15.一种用于筛选与底物或配体特异性相互作用的目的蛋白(POI)的方法，其包括
a)提供根据权利要求10的文库，
b)使所述底物或配体与a)的所述文库接触，
c)确定所述底物或配体与所述文库的相互作用、优选特异性相互作用，以及
d)基于所述相互作用、优选所述特异性相互作用来识别POI。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述POI是抗体或其片段，并且所述方法包括生物淘选，或者其中所述POI为聚合酶或其截短形式。
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