CN106366168B - 羊毛硫肽类抗菌肽及其脱氢衍生物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种羊毛硫肽类抗菌肽及其脱氢衍生物的制备方法。通过解析羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide的生物合成基因簇的功能，对该抗菌肽生物合成基因簇进行基因工程改造，包括删除冗余基因和敲除特定的功能基因，然后将基因工程改造后的最小基因簇在优选的异源宿主中表达，分别发酵基因重组菌株即可以生产羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide及其脱氢衍生物Lexapeptide Z。Lexapeptide和Lexapeptide Z均具有抑制细菌生长的作用，可以用作抗革兰氏阳性菌制剂，对临床普遍遇到的耐药性问题提供解决方案。

Description

羊毛硫肽类抗菌肽及其脱氢衍生物的制备方法
技术领域
本发明属于微生物基因工程领域及肽类抗生素的应用领域，具体涉及一种羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide及其脱氢衍生物Lexapeptide Z的制备方法。
背景技术
羊毛硫肽类抗菌肽是一类主要由革兰氏阳性菌产生的活性肽，是由核糖体合成而后经过一系列翻译后修饰进而生成的高度修饰的肽类抗生素。结构上以羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸以及脱氢氨基丁酸为特征，同时也因羊毛硫氨酸的存在而得名。羊毛硫肽类抗菌肽一般大小在10-50个氨基酸，结构上存在由半胱氨酸与脱氢丙氨酸/脱氢氨基丁酸形成的含硫羊毛硫氨酸和甲基羊毛硫氨酸环状结构。正是这些结构上的显著特征，赋予了羊毛硫肽类抗菌肽很强的抗菌活性。
由于传统抗生素的滥用，耐药菌已经越来越频繁的被报道，对人类的生命健康带来了巨大的威胁。羊毛硫肽类抗菌肽由于其独特的抗菌机制，极少存在耐药性的报道，羊毛硫肽抗菌肽家族里的代表乳酸链球菌素(Nisin)，在作为常用的食品防腐剂应用了40余年之久仍未出现大范围的耐药性报道。羊毛硫肽类抗菌肽在作为新的抗菌类药物以替代传统抗生素方面吸引了越来越多研究人员的关注。目前已经报道的约50种羊毛硫肽类抗菌肽中，已经有NVB302，mutacin1140，duramycin，gallidermin，lacticin 3147及microbisporicin进入了临床研究。羊毛硫肽类抗菌肽将在未来抗菌应用中，尤其是针对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌、耐万古霉素的粪肠球菌及其他耐药菌株的治疗中扮演愈来愈重要的角色。
羊毛硫肽类抗菌肽往往由于其抗菌谱较窄(抑菌活性主要针对革兰氏阳性菌)，结构上的稳定性不足(对温度、pH及蛋白酶不稳定)等原因限制了它们的应用。因此开发更高效的、广谱抗菌的以及抗逆性强的羊毛硫肽类抗菌肽具有重大的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide及其脱氢衍生物Lexapeptide Z的制备方法。本发明采用克隆自微生物基因组的抗菌肽生物合成基因簇为蓝本，在对基因簇的功能进行解析的基础上，利用基因工程方法对特定基因进行改造，然后通过在异源宿主变铅青链霉菌中表达改造后的生物合成基因簇，发酵生产，获得了抗菌肽Lexapeptide及其脱氢衍生物Lexapeptide Z。Lexapeptide及Lexapeptide Z均对革兰氏阳性细菌的生长有抑制作用。
本发明中，所述变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18/pJLXM已于2016年7月11日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101)，菌种保藏编号为CGMCC No.12752。
本发明中，所述变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18/pJLXMΔJ已于2016年7月11日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101)，菌种保藏编号为CGMCCNo.12754。CGMCC No.12754中，抗菌肽生物合成基因簇中的还原酶编码基因1xmJ被敲除，以用于生产Lexapeptide Z。
本发明中，所述变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18/pJLXMΔA已于2016年7月11日递交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101)，菌种保藏编号为CGMCCNo.12753。CGMCC 12753中，抗菌肽生物合成基因簇中的前体肽编码基因1xmA被敲除。
本发明用一株变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)作为异源表达宿主，将来源于娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)Sal35菌株的细菌人工染色体(BAC，BacterialArtificial Chromosome)文库在其中进行异源表达，筛选得到一个可以抑制细菌生长的阳性BAC克隆SAL35-6A8。采用DNA测序法，对BAC SAL35-6A8中的插入片段进行测序，获得外源DNA的核苷酸序列；对所获得的DNA核苷酸序列进行生物信息学分析，推测其中的21个开放阅读框(ORF，Open Reading Frame)可能和Lexapeptide的生物合成密切相关；这21个ORF中包括负责抗菌肽合成的前体肽基因、后修饰基因、调控基因和转运相关基因等。SAL35-6A8中包含的外源DNA片段长度约为110kb。
其中，用于筛选娄彻氏链霉菌Sal35菌株细菌人工染色体文库的异源表达宿主为变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT5。在异源表达宿主中呈现生物活性的SAL35-6A8抑制生长的细菌是革兰氏阳性细菌，例如：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌以及耐甲氧西林粪肠球菌等。
通过对SAL35-6A8中DNA序列的生物信息学分析，发现这段DNA上有很多基因与Lexapeptide的生物合成无关。在本发明中对该细菌人工染色体进行大片段DNA缺失，删除与Lexapeptide生物合成无关的序列，得到包含Lexapeptide生物合成基因簇的最小表达载体pJLXM。pJLXM在SAL35-6A8的基础上删除了87902bp的冗余DNA序列，得到了包含22984bp外源片段的Lexapeptide的最小生物合成基因簇，该最小生物合成基因簇囊括了负责抗菌肽合成的前体肽基因、后修饰基因、调控基因和转运相关基因等21个基因，如附图2a所示；该最小生物合成基因簇的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。将pJLXM通过大肠杆菌-链霉菌三亲本接合转移导入异源表达宿主变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18中，获得基因重组菌株变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18/pJLXM CGMCC No.12752。对所述重组的变铅青链霉菌CGMCC No.12752发酵培养，获得羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide。
生物信息学分析显示最小生物合成基因簇中1xmJ编码一个还原酶基因，负责把脱氢丙氨酸还原成D-丙氨酸。分析Lexapeptide的生物合成过程，可知脱氢Lexapeptide为Lexapeptide合成所需前体，可经过一步还原反应将其28位的脱氢丙氨酸还原成D构型的丙氨酸即可生成Lexapeptide。选择从最小生物合成基因簇中敲除1xmJ基因，获得1xmJ缺失的基因工程改造基因簇pJLXMΔJ，将改造后的基因簇通过接合转移导入异源表达宿主变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18中，获得基因重组菌株变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18/pJLXMΔJ CGMCC No.12754。对所述重组的变铅青链霉菌CGMCC No.12754发酵培养，获得羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide Z。进一步对新型羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide Z进行抗菌实验，对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌进行抑菌实验，与万古霉素抑菌效果相当，显著优于Nisin。对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌的MIC值分别为0.52μM及1.03μM；万古霉素相应的MIC值为0.61μM及1.21μM；Nisin相应的MIC值为4.8μM及2.4μM。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide Z，其分子结构式如下：
Figure BDA0001094324410000041
第二方面，本发明涉及一种前述的羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide Z的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1、敲除还原酶基因1xmJ的抗菌肽生物合成基因簇在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18中异源表达，获得重组的变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)SBT18/pJLXMΔJ CGMCC No.12754；
S2、所述重组的变铅青链霉菌发酵培养，获得所述羊毛硫肽类抗菌肽LexapeptideZ。
优选的，所述抗菌肽生物合成基因簇包括如SEQ ID NO.1所示的碱基序列。
更优选的，所述抗菌肽生物合成基因簇的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，发酵培养后还包括分离纯化Lexapeptide Z的步骤。
优选的，分离纯化Lexapeptide Z的步骤包括：
A1、重组的变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18/pJLXMΔJ CGMCCNo.12754在发酵培养基YBP上发酵5～7天，收集固体发酵产物；
A2、等体积甲醇浸提固体发酵物若干遍，真空浓缩旋干；
A3、甲醇浸提物用水溶解后，等体积正丁醇萃取若干遍，真空浓缩旋干；
A4、正丁醇萃取物经大孔吸附树脂CHP20P，凝胶色谱LH20纯化后经液相色谱分离到纯品Lexapeptide Z。
优选的，步骤S2中，发酵生产后还包括分离纯化的步骤；所述分离纯化中采用的高效液相色谱制备条件为：
流动相为：A相为添加1‰[体积比]三氟乙酸的水相，B相为乙腈；
洗脱条件为：40％B相[体积比]等度洗脱15min，流速为0.6ml/min，Lexapeptide Z在10min左右洗脱。使用的液相色谱柱为Agilent Zorbax 300SB-C18(5μm，4.6×250mm)。
第三方面，本发明还涉及一种变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18/pJLXMΔJ CGMCC No.12754。
第四方面，本发明还涉及一种前述的羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide Z在制备抗革兰氏阳性菌制剂，动物饲料或用于治疗细菌、真菌或病毒感染药物中的用途。
优选的，所述治疗细菌、真菌或病毒感染药物为治疗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌感染的药物。
第五方面，本发明还涉及一种羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide的制备方法，所述方法包括如下步骤：
B1、从细菌人工染色体(BAC)SAL35-6A8的DNA核苷酸序列中删除冗余基因获得抗菌肽生物合成最小基因簇；所述抗菌肽生物合成最小基因簇在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18中异源表达，获得变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)SBT18/pJLXM CGMCC No.12752；
B2、所述重组的变铅青链霉菌发酵生产，获得所述羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide。
优选的，所述抗菌肽生物合成最小基因簇的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
所述羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide的分子结构式为：
Figure BDA0001094324410000051
优选的，发酵培养后还包括分离纯化Lexapeptide的步骤。
优选的，分离纯化Lexapeptide的步骤包括：
A1、重组的变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18/pJLXM CGMCCNo.12752在发酵培养基YBP上发酵5～7天，收集固体发酵产物；
A2、等体积甲醇浸提固体发酵物若干遍，真空浓缩旋干；
A3、甲醇浸提物用水溶解后，等体积正丁醇萃取若干遍，真空浓缩旋干；
A4、正丁醇萃取物经大孔吸附树脂CHP20P、凝胶色谱LH20纯化后经液相色谱分离到纯品Lexapeptide。
优选的，所述分离纯化中采用的高效液相色谱制备条件为：
流动相为：A相为水相(添加1‰三氟乙酸[体积比])，B相为乙腈；
洗脱条件为：40％B相[体积比]等度洗脱15min，流速为0.6ml/min，Lexapeptide在10min左右洗脱。
第六方面，本发明还涉及一种变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18/pJLXM CGMCC No.12752。
第七方面，本发明还涉及一种变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18/pJLXM CGMCC No.12752在制备抗革兰氏阳性菌制剂，动物饲料或用于治疗细菌、真菌或病毒感染药物中的用途。
优选的，所述治疗细菌、真菌或病毒感染药物为治疗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌感染的药物。
第八方面，本发明还涉及一种抗菌肽Lexapeptide的生物合成基因簇，所述基因簇包括如SEQ ID NO.2所示的碱基序列。
优选的，所述基因簇的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
第九方面，本发明还涉及一种变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18/pJLXMΔA CGMCC No.12753。
进一步对新型羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide Z进行抗菌实验，对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌进行抑菌实验，与万古霉素抑菌效果相当，显著优于Nisin。对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌及表皮葡萄球菌的MIC值分别为0.52μM及1.03μM；万古霉素相应的MIC值为0.61μM及1.21μM；Nisin相应的MIC值为4.8μM及2.4μM。
本发明的原理在于：Lexapeptide是一类新型的羊毛硫肽类抗菌肽。是通过对来自神农架山区的链霉菌娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)Sal35进行功能基因组挖掘，并在异源表达宿主变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT5中进行表达后，分离纯化并鉴定的一类新型高度修饰的羊毛硫肽类抗菌肽。除去羊毛硫肽类抗菌肽所共有的脱氢丙氨酸、脱氢氨基丁酸以及甲基羊毛硫氨酸结构单元外，Lexapeptide还具有氮端苯丙氨酸上氨基的甲基化修饰，D构型丙氨酸以及羧基端2-氨基烯基-3-甲基-半胱氨酸(AviMeCys)的稀有结构。Lexapeptide具有良好的生物活性，对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌以及耐甲氧西林粪肠球菌均显示出了极好的抑菌活性，显示出Lexapeptide在药物开发替代现有传统抗生素上具有很大的潜力。Lexapeptide的生物合成基因簇已经被定位于细菌人工染色体SAL35-6A8上一段大小为54300bp的DNA片段上。本发明通过异源表达的方法，结合基因测序技术，分子生物学及生物化学等技术来研究Lexapeptide的最小生物合成基因簇并阐明其生物合成机制。在此基础上，可以通过代谢工程手段对Lexapeptide生物合成途径进行改造以得到Lexapeptide的高产菌株，同时也可以通过合理的合成生物学技术手段对Lexapeptide进行结构修饰获得更高效稳定的Lexapeptide衍生物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益成果：
1、本发明确定了一种新型高效的羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide的最小生物合成基因簇，碱基序列如SEQ ID NO.2所示，全长22984个碱基；所述基因簇来源于娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)Sa135菌株。通过异源表达，测序分析及功能研究，确定了Lexapeptide的前体肽合成基因1xmA以及脱氢丙氨酸的还原酶基因1xmJ。
2、本发明确定了新型羊毛硫肽Lexapeptide的最小生物合成基因簇，在异源表达宿主变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18中实现了高效表达，并获得了一系列基因失活重组菌株。为发酵生产Lexapeptide及Lexapeptide的衍生物脱氢Lexapeptide提供了菌种来源。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为Lexapeptide和脱氢Lexapeptide的化学结构示意图；
图2为Lexapeptide的最小基因簇异源表达载体示意图及其异源表达检测图谱；其中，a为Lexapeptide的最小基因簇异源表达载体pJLXM构建示意图；b为pJLXM在异源表达宿主变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18中表达的HPLC检测图谱；
图3为Lexapeptide的最小生物合成基因簇示意图；
图4为Lexapeptide前体肽生物合成基因1xmA中断示意图及HPLC检测图谱；其中，a为Lexapeptide前体肽生物合成基因1xmA基因中断示意图；b为PCR验证基因中断质粒胶图；c为1xmA基因中断后的突变质粒pJLXM_ΔA在异源表达宿主变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)SBT18中表达的HPLC检测图谱；
图5为Lexapeptide还原酶编码基因1xmJ中断示意图、HPLC及MS检测图谱；其中，a为Lexapeptide还原酶编码基因1xmJ基因中断示意图；b为PCR验证基因中断质粒胶图；c为1xmJ基因中断后的突变质粒pJLXM_ΔJ在异源表达宿主变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)SBT18中表达的HPLC检测图谱；d为Lexapeptide Z的质谱分子量检测图谱；e为Lexapeptide质谱分子量检测图谱；Lexapeptide Z与Lexapeptide的相对分子质量相差2Da；
图6为Lexapeptide丙氨酸构型检测谱图；
图7为Lexapeptide的生物合成途径示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，以下实例将有助于本领域从业人员更深入地理解本发明。以下实施例中未特殊说明的实验方法均为常规方法，未特殊说明的材料、试剂均可从商业途径获取。
LB培养基：用于大肠杆菌的培养；
胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g，去离子水定容至1,000ml，pH 7.0。
2×YT培养基：大肠杆菌-链霉菌属间接合转移；
胰蛋白胨16g，酵母提取物10g，氯化钠5g，去离子水定容至1,000ml，pH 7.0。
SFM培养基：链霉菌培养产孢；
黄豆饼粉20g，甘露醇20g，自来水定容至1,000ml，pH 7.2～7.4。
黄豆饼粉20g先用1,000ml自来水浸泡，121℃灭菌20min，然后过滤收集黄豆饼粉浸提液配制培养基。
YBP培养基：链霉菌发酵；
葡萄糖10g，酵母提取物2g，牛肉提取物2g，蛋白胨4g，MgSO4 1g，NaCl 15g，pH 7.2～7.4。
相应固体培养基需要添加15g琼脂粉，SFM固体培养基添加20g琼脂粉。
本发明所涉及的娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)Sal35，系中国典型培养物保藏中心(cctcc)的AA97007暗黑链霉菌，分离自湖北神农架山区；在文献“Min Xu，YeminWang，Zhilong Zhao，Guixi Gao，Sheng-Xiong Huang，Qianjin Kang，Xinyi He，ShuangjunLin，Xiuhua Pang，Zixin Deng，and Meifeng Tao；Functional Genome Mining forMetabolites Encoded by Large Gene Clusters through Heterologous Expression ofa Whole-Genome Bacterial Artificial Chromosome Library in Streptomyces spp.，2016，Appl Environ Microbiol”中也公开过，公众可以从中国典型培养物保藏中心和上海交通大学微生物代谢国家重点实验室获得。
本发明所涉及的异源表达宿主Streptomyces lividans SBT5在文献“白亭丽，俞燕飞，徐钟，陶美凤；变铅青链霉菌高效异源表达宿主SBT5的构建，2014，华中农业大学学报”中公开过，公众可以从上海交通大学微生物代谢国家重点实验室获得。
本发明所涉及的异源表达宿主Streptomyces lividans SBT18在文献“ZhilongZhao，Ting Shi，Min Xu，Nelson L.Brock，Yi-Lei Zhao，Yemin Wang，Zixin Deng，XiuhuaPang，and Meifeng Tao；Hybrubins：Bipyrrole Tetramic Acids Obtained by Crosstalkbetween a Truncated Undecylprodigiosin Pathway and Heterologous Tetramic AcidBiosynthetic Genes，Org.Lett.，2016，18(3)，pp 572-575”中公开过，公众可以从上海交通大学微生物代谢国家重点实验室获得。
本发明所涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)ET12567菌株在文献“MacNeil DJ，et al.(1992)Analysis of Streptomyces avermitilis genes required foravermectin biosynthesis utilizing a novel integration vector.Gene 111：61-68.”中公开过，公众可以从D.J.MacNeil教授处获得。
本发明所涉及的接合转移辅助菌株大肠杆菌(Escherichia coli)ET12567/pUB307在文献“Flett F，Mersinias V，Smith CP；High efficiency intergenericconjugal transfer of plasmid DNA from Escherichia coli to methyl DNA-restricting streptomycetes.1997，FEMS Microbiol Lett 155(2)：223-229.”中公开过，公众可以从Colin P Smith教授处获得。
本发明所涉及的基因敲除大肠杆菌(Escherichia coli)BT340在文献“Cherepanov PP，Wackernagel W(1995)Gene disruption in Escherichia coli：TcR andKmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant.Gene 158：9-14.”中公开过，公众可以从Wilfried Wackernagel教授处获得。
本发明所涉及的抗菌肽Lexapeptide及Lexapeptide Z均属于一种高度修饰的新型羊毛硫肽类抗菌物质，是一类由核糖体合成的天然产物，结构如附图1a所示。脱氢Lexapeptide为Lexapeptide的前体，经过一步还原反应将其28位的脱氢丙氨酸还原成D构型的丙氨酸即可生成Lexapeptide。脱氢Lexapeptide的结构如图1b所示。由图1a、1b可知，Lexapeptide结构中第28位为D构型的丙氨酸，脱氢Lexapeptide结构中第28位为脱氢丙氨酸。Lexapeptide及脱氢Lexapeptide均包含两个硫醚键桥连的环状结构(A、B环)。
实施例1、包含Lexapeptide生物合成基因簇的最小表达载体pJLXM的构建及其异 源表达。
Lexapeptide是本研究小组通过对娄彻氏链霉菌Sal35菌株进行功能基因组挖掘，在变铅青链霉菌SBT5中实现异源表达并纯化得到的新型羊毛硫肽类抗菌肽。其中我们获得了包含Lexapeptide生物合成基因簇的一组阳性的细菌人工染色体，3C1，5C3，5G5，6A8，以及8C6。通过限制性内切酶酶切以及测序分析，我们将Lexapeptide的生物合成基因簇定位到BAC SAL35-6A8上的一段54300bp的DNA片段上。通过进一步的生物信息学分析，我们发现这段DNA上大多数基因与Lexapeptide的生物合成无关。在本发明中对该细菌人工染色体进行大片段的缺失，删除与Lexapeptide生物合成无关的序列，得到包含Lexapeptide生物合成基因簇的最小表达载体pJLXM。pJLXM在BAC SAL35-6A8的基础上删除了87902bp的冗余序列，得到了包含22984bp外源片段的Lexapeptide的最小生物合成基因簇(碱基序列如SEQID NO.2所示)，如附图2a所示。将pJLXM通过大肠杆菌-链霉菌三亲本接合转移导入异源表达宿主变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)SBT18中实现了Lexapeptide的异源表达生产。
(1)对细菌人工染色体SAL35-6A8用限制性内切酶ScaI进行酶切(37℃，2小时)，然后沉淀回收酶切产物，用T4DNA连接酶16℃进行过夜自连接，并将酶连产物脱盐后电转化大肠杆菌E.coli DH10B感受态细胞。最后涂布到含有50μg/ml阿泊拉霉素的LB琼脂抗性平板上，筛选抗性菌落即可得到含有pJLXM质粒的大肠杆菌重组菌株。图2a为Lexapeptide的最小基因簇异源表达载体pJLXM构建示意图，由图可知pJLXM是细菌人工染色体SAL35-6A8通过限制性内切酶ScaI酶切自连后得到的质粒，大小为36044个碱基，包含Lexapeptide生物合成所需的21个基因。
(2)提取pJLXM质粒重转化大肠杆菌E.coli ET12567菌株，在含氯霉素(25μg/ml)和阿泊拉霉素(50μg/ml)抗性LB琼脂平板上筛选得到E.coli ET12567/pJLXM重组菌株。
(3)将E.coli ET12567/pJLXM过夜培养物接种至含有氯霉素(25μg/ml)和阿泊拉霉素(50μg/ml)新鲜5ml LB液体培养基中，37℃，220rpm培养4-6小时至OD6000.4-0.6。与此同时，将E.coli ET12567/pUB307过夜培养物接种至含有卡那霉素(50μg/ml)新鲜5ml LB液体培养基中，37℃，220rpm培养4-6小时至OD600 0.4-0.6。(4)分别取1ml E.coli ET12567/pJLXM和E.coli ET12567/pUB307培养液，12，000rpm离心1min收集菌体，用新鲜LB液体培养基洗涤3遍，用50μl LB液体培养基重悬待用。
(5)将一块SFM平板上产孢完全的变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18的孢子收集于3ml 20％甘油中保存。取出50μl孢子悬液，用2×YT培养基洗涤3遍，而后用等体积2×YT培养基悬浮，于50℃热激10min。
(6)室温冷却热激后的孢子，加入洗涤后的E.coli ET12567/pJLXM和E.coliET12567/pUB307菌株，利用移液器轻轻吹打均匀，将大肠杆菌与链霉菌孢子混合液均匀涂布在SFM培养基上(添加20mM MgSO4)，30℃培养12-16小时。
(7)在SFM平板上覆盖三甲氧苄啶和阿泊拉霉素至终浓度为50μg/ml，在生物安全柜中吹干，30℃培养4-6天至接合转移子长出。
(8)将长出的接合转移子挑至含有萘啶酮酸(25μg/ml)和阿泊拉霉素(50μg/ml)的抗性SFM平板上进行筛选，30℃培养5-7天至产孢完全。
(9)挑取正确的接合转移子Streptomyces lividans SBT18/pJLXM接种至固体发酵培养基YBP上，发酵3块平板，每块含35ml培养基，30℃发酵4-6天至产素完全。
(10)发酵结束后，收集固体发酵物，用等体积(约100m1)甲醇浸提3遍，真空浓缩旋干得到甲醇粗提物。
(11)将甲醇粗提物用10ml无菌水溶解，用等体积正丁醇萃取3遍，真空浓缩旋干得到正丁醇粗提物，用2ml甲醇重溶解样品。
(12)12,000rpm离心10min，用0.22μm滤膜过滤甲醇样品后，进行高效液相色谱分析，进样量为10μl。液相分析色谱柱型号为：Agilent Zorbax 300SB-C18(5μm，4.6×250mm)。
流动相为：
A相为水相(添加1‰三氟乙酸)，
B相为乙腈。
分析条件为：0-5min，5％B；5-20min，B相由5％浓度升至50％；20-30min，B相由50％浓度升至100％；30-35min，B相100％浓度维持5min；35-36min，B相由100％浓度降至5％；36-45min，B相5％浓度平衡9min。流速为0.6ml/min，室温。Lexapeptide在21 min洗脱出来。图2b为pJLXM在异源表达宿主变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18中表达的HPLC检测图谱，图中星号标注的色谱峰即为Lexapeptide。
实施例2、Lexapeptide最小生物合成基因簇的功能分析
Streptomyces lividans SBT18/pJLXM能够产生Lexapeptide，显示其染色体上携带有所有Lexapeptide的生物合成基因。pJLXM大小为36044bp，携带有22984bp的外源片段，对这22984bp的外源片段序列进行基因功能分析，发现其中包含21个开放阅读框，包括Lexapeptide生物合成的前体肽基因、后修饰基因以及调控和转运相关基因。各基因编码的蛋白质及其功能分析见表1；基因组织排布，即pJLXM包含的Lexapeptide生物合成所需的基因及相应的功能注释如附图3所示。
表1 Lexapeptide最小生物合成基因簇功能注释。
Figure BDA0001094324410000121
Figure BDA0001094324410000131
实施例3、Lexapeptide前体肽合成基因1xmA的敲除。
为验证1xmA是负责Lexapeptide前体肽合成的基因，通过PCR-Targeting技术对pJLXM上的1xmA基因进行敲除。PCR-Targeting技术可参考文献“Bertolt Gust，GregL.Challis，Kay Fowler，Tobias Kieser，and Keith F.Chater；PCR-targetedStreptomyces gene replacement identifies a protein domain needed forbiosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin，PNAS 2003，vol.100，no.4，1541-1546”。
用于1xmA基因敲除的引物序列如下：
SEQ ID NO.3(ΔA-F)：
5’-AGCGAACGGCGGCGGACACCTTTCACAAGGGAGAGAAAAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’
SEQ ID NO.4(ΔA-R)：
5’-CTGCGAGGAGCGGGCCGTGATGATGGTCGCGCGGATCGCCCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
1xmA基因敲除验证引物序列如下：
SEQ ID NO.5(Ver-ΔA-F)：5’-GTGGTTGATGAGTCAGGTGTCT-3’
SEQ ID NO.6(Ver-ΔA-R)：5’-GGGAATCAGGTGGTGTGTTG-3’
(1)利用eryB(红霉素抗性基因)基因插入待敲除的基因1xmA内部进行敲除。eryB基因插入1xmA基因后，再将pJLXM(ΔA：：eryB)质粒转入BT340菌株中，在FLP重组酶的介导下将外源插入的eryB基因抹掉，留下81bp碱基的Scar片段，从而得到1xmA基因缺失的质粒pJLXM_ΔA。1xmA基因敲除示意图及验证的琼脂糖凝胶电泳图如附图4a及4b所示。其中，图4a为Lexapeptide前体肽生物合成基因1xmA基因中断示意图；图4b为PCR验证基因中断质粒凝胶电泳图，1xmA基因中断前野生型质粒pJLXM上可以扩增出533bp大小的DNA片段，1xmA基因中断后的突变质粒上可以扩增出497bp大小的DNA片段。
(2)将1xmA基因缺失的质粒pJLXM_ΔA通过大肠杆菌-链霉菌属间三亲本接合转移导入异源表达宿主变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18中即可获得1xmA基因缺失的突变异源表达菌株，即Streptomyces lividans SBT18/pJLXM_ΔA。
(3)将突变株Streptomyces lividans SBT18/pJLXM_ΔA接种至YBP发酵培养基上，30℃发酵4-6天后提取发酵产物进行检测，原来21min处洗脱的Lexapeptide峰消失，证明1xmA的确负责Lexapeptide前体肽的合成。而且Lexapeptide的氨基酸序列与LxmA蛋白的羧基端38个氨基酸的序列高度吻合。突变株发酵检测如附图4c所示，图4c为1xmA基因中断后的突变质粒pJLXM_ΔA在异源表达宿主变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18中表达的HPLC检测图谱，由图可知1xmA基因中断后Lexapeptide对应的洗脱峰也消失了，证明1xmA基因即为编码Lexapeptide前体肽合成的基因。
实施例4、Lexapeptide后修饰基因1xmT的敲除。
Lexapeptide的氨基酸序列与1xmA所编码蛋白的羧基端38个氨基酸的序列高度吻合，但是Lexapeptide中第28位对应的丙氨酸在1xmA中对应的密码子编码的为丝氨酸。这意味着Lexapeptide中28位的丙氨酸可能来源于丝氨酸经一步脱水反应生成脱氢丙氨酸，而后再经一步加氢还原反应生成。在基因簇中我们定位到编码N5，N10-methylenetetrahydromethanopterin还原酶的基因1xmJ，该基因可能参与了28位的丙氨酸的合成。为验证这一假想，对1xmJ也进行了敲除。
用于1xmJ基因敲除的引物序列如下：
SEQ ID NO.7(ΔJ-F)：
5’-CCCGAACTCGTCGCCCCCTTCGCCGCGCTGGTGGCCCGCACCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’
SEQ ID N0.8(ΔJ-R)：
5’-GCGTCTCCGGCCAACGCGGCGGGGGCCGGTGACGATCGGTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
1xmJ基因敲除验证引物序列如下：
SEQ ID NO.9(Vet-ΔJ-F)：5’-GACCAGGACACGAAGGAA-3’
SEQ ID N0.10(Ver-ΔJ-R)：5’-GCGTCAAGGGATACCACT-3’
具体操作同实施例3中所述。
(1)利用eryB(红霉素抗性基因)基因插入待敲除的基因1xmJ内部进行敲除。eryB基因插入1xmJ基因后，再将pJLXM(ΔJ：：eryB)质粒转入BT340菌株中，在FLP重组酶的介导下将外源插入的eryB基因抹掉，留下81bp碱基的Scar片段，从而得到1xmJ基因缺失的质粒pJLXM_ΔJ。1xmJ基因敲除示意图及验证的琼脂糖凝胶电泳图如附图5a及图5b所示，其中，图5a为Lexapeptide还原酶编码基因1xmJ基因中断示意图；图5b为PCR验证基因中断质粒凝胶电泳图。1xmJ基因中断前野生型质粒pJLXM上可以扩增出1292bp大小的DNA片段，1xmJ基因中断后的突变质粒上可以扩增出491 bp大小的DNA片段。
(2)将1xmJ基因缺失的质粒pJLXM_ΔJ通过大肠杆菌-链霉菌属间三亲本接合转移导入异源表达宿主变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18中即可获得1xmJ基因缺失的突变异源表达菌株，即Streptomyces lividans SBT18/pJLXM_ΔJ。
(3)将突变株Streptomyces lividans SBT18/pJLXM_ΔJ接种至YBP发酵培养基上，30℃发酵4-6天后提取发酵产物进行检测。在HPLC色谱检测中，在原Lexapeptide洗脱的位置同样出现一个洗脱峰；经ESI-MS质谱验证，该洗脱峰的分子量与Lexapeptide相比少2Da，即两个氢。这就证实28位的丙氨酸的确源于LxmJ蛋白催化28位的脱氢丙氨酸还原得到的。突变株发酵产物色谱、质谱检测如附图5c、5d及5e所示，其中，图5c为1xmJ基因中断后的突变质粒pJLXM_ΔJ在异源表达宿主变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18中表达的HPLC检测图谱，由图可知1xmJ基因中断后Lexapeptide对应的洗脱峰处出现了一个新的洗脱峰，图中以星号标注，其对应的分子量如图5d所示，Lexapeptide的质谱检测分子量如图5e所示。图5d中显示的为其带多电荷的分子量，其真实的分子量应该为3870Da，较之于Lexapeptide少2Da，对应于2个氢原子的分子量，即脱氢Lexapeptide在28位为脱氢丙氨酸(Dha)，而Lexapeptide在28位为D-Ala。lxmJ基因编码的还原酶即负责28位脱氢丙氨酸到D-Ala的还原。
实施例5、Lexapeptide中第28位丙氨酸构型的确定。
羊毛硫肽抗菌肽中由脱氢丙氨酸经过还原生成丙氨酸往往会伴随着氨基酸构型的改变，本发明中通过构型确定28位的丙氨酸的构型为D构型。为了测定Lexapeptide中D构型的丙氨酸的存在，对Lexapeptide进行酸水解，再利用(2，4-二硝基-5-氟苯基)-L-丙氨酰胺(FDAA)进行衍生，经质谱分析确定了D构型的丙氨酸的存在。如附图6所示，图6为Lexapeptide丙氨酸构型检测谱图；Lexapeptide酸水解液中检测到了D构型的丙氨酸，证明Lexapeptide中的确存在D构型丙氨酸。
(1)Lexapeptide酸水解条件如下：
取0.1mg Lexapeptide纯品，溶于2ml 6mol/L HCl中，密封置于120℃烘箱反应12～24小时。将水解液于50℃真空浓缩旋干，重新溶于20μl无菌水中并转移至1.5mleppendorf管中。
(2)Lexapeptide水解产物衍生如下：
向eppendorf管中加入40μl 1％浓度丙酮溶解的FDAA溶液和8μl的1M NaHCO3溶液。混合均匀后，置于40℃加热板振荡反应1小时。将eppendorf管取下冷却至室温，加入4μl2mol/L HCl终止反应，同时加入200μl甲醇稀释样品。
取2μl样品进行LC-MS分析。
(3)LC-MS分析条件如下：
分析色谱柱型号为Agilent Zorbax SB-C18(3.5μm，2.1×150mm)。
流动相为：
A相为水相添加1‰甲酸。
B相为乙腈。
色谱条件为0-20min，B相浓度由10％升至80％；20-25min，B相浓度由80％升至100％；26min，B相浓度降至10％；26-35min，B相浓度10％维持9min。流速为0.2ml/min。ESI-QTOF以正离子模式操作，记录的分子量范围为50-1700Da，提取FDAA-Ala的分子量342.1±0.2Da进行分析。
实施例6、Lexapeptide的生物合成途径
通过生物信息学分析Lexapeptide生物合成基因簇上每个基因编码的蛋白质的功能，结合本发明中的实施例结果与已经报道的羊毛硫肽类抗菌肽的合成途径，本发明推测Lexapeptide的生物合成途径可能经历如下几步过程。前体肽合成基因1xmA编码前体肽LxmA的合成，然后在1xmW，1xmY和1xmZ蛋白的作用下负责Lexapeptide中脱氢丙氨酸、脱氢氨基丁酸以及环A的合成。在1xmD编码的黄素蛋白酶作用下对前体肽LxmA上羧基末端的半胱氨酸进行脱羧生成2-氨基乙烯硫醇，然后羧基端的2-氨基乙烯硫醇的巯基在未知功能蛋白(1xmW，1xmY或1xmZ蛋白)的催化下与30位的脱氢氨基丁酸缩合生成B环。进一步在1xmP1/1xmP2编码的蛋白酶的催化下将氨基端34肽信号肽切割，并在1xmM编码的甲基转移酶催化下将Lexapeptide氨基端的苯丙氨酸的氨基进行两步甲基化修饰。最后在1xmJ编码的还原酶的作用下将28位的脱氢丙氨酸还原生成D构型的丙氨酸，从而生成成熟的Lexapeptide。推测的Lexapeptide的生物合成途径如附图7所示。
实施例7、Lexapeptide Z的生物活性测定
Lexapeptide Z的最低抑菌浓度(MIC)值依据微孔板法测定，待测试的菌株为金黄色葡萄球菌ATCC25923，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)以及粪肠球菌ATCC29212。MIC值定义为抑制超过90％浓度菌株生长的最低抗生素浓度。以氨苄青霉素、卡那霉素、万古霉素及Nisin为对照，每个样品3个平行。
(一)选用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基培养实验菌，37℃过夜培养12-16小时。在实验菌长好之前准备好待测样品溶液。
(二)配制样品溶液，以DMSO溶解样品(氨苄青霉素Ampicillin、卡那霉素Kanamycin、万古霉素Vancomycin、乳酸链球菌素Nisin及Lexapeptide Z)，分别制成浓度为32mg/ml、32mg/ml、3.2mg/ml、3.2mg/ml及0.8mg/ml的母液。
(三)在96孔板中加入无菌MH肉汤培养基，第1列加入184μl无菌MH肉汤，其余各列分别加入100μl无菌MH肉汤。第11列和第12列分别作为阳性对照和阴性对照。
(四)吸取16μl配制好的母液加入第1列96孔板中，利用移液器轻轻吹打混匀。
(五)从第1列中吸取100μl混有抗生素的培养液至第2列中，用移液器轻轻吹打混匀后再吸出100μl至第3列中，依此类推稀释至第10列。第10列混匀后吸出多余的100μl培养液弃去。
(六)将过夜培养的菌体用新鲜的MH肉汤培养基稀释1000倍，取100μl稀释的菌液加入第1列至第11列的孔中，第12列加入100μl新鲜的MH肉汤培养基作为空白对照。如此得到氨苄青霉素和卡那霉素的药物浓度梯度为：1280，640，320，160，80，40，20，10，5，2.5μg/ml；万古霉素的药物浓度梯度为：128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25μg/ml；Nisin的药物浓度梯度为：128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25μg/ml；Lexapeptide Z的药物浓度梯度为：32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.13，0.063μ g/ml。
(七)盖上96孔板盖，于37℃培养箱过夜培养16-24小时。
(八)以第11列为阳性对照，第12列为空白对照，利用酶标仪在OD600下读取菌浓，确定每个样品的MIC值，如下表1所示。
Figure BDA0001094324410000171
Figure BDA0001094324410000181
表1中MIC数据系以质量浓度表示，其中万古霉素标准品为万古霉素盐酸盐，含量为＞0.9mg/mg。由表1可知，换算成摩尔浓度，万古霉素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌以及耐甲氧西林表皮葡萄球菌的MIC浓度分别为0.61μM以及1.21μM；Nisin对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌以及耐甲氧西林表皮葡萄球菌的MIC浓度分别为4.8μM以及2.4μM；Lexapeptide Z对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌以及耐甲氧西林表皮葡萄球菌的MIC浓度分别为0.52μM以及1.03μM。
本发明中所提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考一样。此处应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域的技术人员可以对本发明做各种修改或优化，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure IDA0001094324520000011
Figure IDA0001094324520000021
Figure IDA0001094324520000031
Figure IDA0001094324520000041
Figure IDA0001094324520000051
Figure IDA0001094324520000061
Figure IDA0001094324520000071
Figure IDA0001094324520000081
Figure IDA0001094324520000091
Figure IDA0001094324520000101
Figure IDA0001094324520000111
Figure IDA0001094324520000121
Figure IDA0001094324520000131
Figure IDA0001094324520000141
Figure IDA0001094324520000151
Figure IDA0001094324520000161
Figure IDA0001094324520000171

Claims (10)

1.一种羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide Z，其特征在于，其分子结构式如下：
Figure FDA0002565074870000011
2.一种如权利要求1所述的羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide Z的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、敲除还原酶基因lxmJ的抗菌肽生物合成基因簇在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18中异源表达，获得重组的变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18/pJLXMΔJ，保藏编号：CGMCC No.12754；
S2、所述重组的变铅青链霉菌发酵培养，获得所述羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide Z。
3.如权利要求2所述的羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide Z的制备方法，其特征在于，所述抗菌肽生物合成基因簇为如SEQ ID NO.1所示的碱基序列。
4.一种变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18/pJLXMΔJ，其特征在于，其分类命名为变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.12754。
5.一种如权利要求1所述的羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide Z在制备抗革兰氏阳性菌制剂，动物饲料或用于治疗耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌感染的药物中的用途。
6.一种羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
B1、从细菌人工染色体SAL35-6A8的DNA核苷酸序列中删除冗余基因获得抗菌肽生物合成最小基因簇；所述抗菌肽生物合成最小基因簇在变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)SBT18中异源表达，获得变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18/pJLXM，保藏编号：CGMCC No.12752；
B2、所述重组的变铅青链霉菌发酵生产，获得所述羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide。
7.如权利要求6所述的羊毛硫肽类抗菌肽Lexapeptide的制备方法，其特征在于，所述抗菌肽生物合成最小基因簇的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。
8.一种变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18/pJLXM，其特征在于，其分类命名为变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.12752。
9.一种抗菌肽Lexapeptide的生物合成基因簇，其特征在于，所述基因簇为如SEQ IDNO.2所示的碱基序列。
10.一种变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)SBT18/pJLXMΔA，其特征在于，其分类命名为变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.12753。
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