KR20080106545A - 란티바이오틱의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 란티바이오틱(lantibiotic)으로 공지된 계열의 항생제 화합물의 제조에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 이러한 란티바이오틱의 정제에 관한 것이다.
란티바이오틱(lantibiotic), 에피더민, 갈리더민, 항생제, 정제
Description
본 발명은 생물분자의 제조에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 란티바이오틱(lantibiotic)으로 공지된 계열의 항생제 화합물의 제조에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명은 이러한 란티바이오틱의 정제에 관한 것이다.
란티바이오틱은 일반적이지 않은, 가교된 티오에테르 아미노산, 즉 란티온 및 3-메틸란티온이 존재하는 것이 특징인 작은 펩티드 항생제의 계열이다. 당해 계열의 일원에는 서브틸린, 니신, 에피더민, 갈리더민 (이는 에피더민의 leu-6 변이체임), pep5, 안코베닌, Ro 09-0198, 신나마이신 및 듀라마이신이 포함된다. pep5, 에피더민 및 갈리더민은 모두 스타필로코커스(Staphylococcus) 속(屬)의 미생물에 의해 천연적으로 생산된다.
갈리더민 생산 균주 에스.갈리나리움(S. gallinarium) Tu3928 (DSM4616)의 발효는 문헌[참조: 유럽특허 제342 486호, Kellner et al., Eur. J. Biochem. 177:53-59 (1988), Horner et al., Appl. Microbiol. Biotech. 30, 219-225, 및 Ungermann et al., 1st Proc. Int. Workshop Lantibiotics, Tubingen 1991, p. 410-421]에 상세히 기술되어 있다. 간략히 설명하면, 갈리더민의 발효에 사용되는 배지는 적어도 고기 추출물, 염화칼슘 및 염화나트륨을 포함한다. 공급 용액(feeding solution)은 고기 추출물 및 글루코스를 포함한다. 따라서, 란티바이오틱의 발효에 사용되는 배지는 매우 복합적이고, 아미노산 공급원으로서 다량의 올리고- 또는 폴리펩티드를 갖는다.
유럽특허 제508 371 A호에는 크로마토그래피 방법을 기본으로 한 란티바이오틱의 정제 방법이 기술되어 있다. 당해 방법은 시간, 재료 및 비용이 많이 드는 다수의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 간략히 설명하면, 유럽특허 제508 371호는, 란티바이오틱-함유 발효 배지를 수득하고, 상기 배지 또는 이로부터 유래된 란티바이오틱-함유 배지를 다음 단계에서 스티렌 디비닐 공중합체 매트릭스, 양이온 교환 크로마토그래피 (예: Amberlite XAD-1180®), 소수성 상호작용 크로마토그래피, 임의로, 하지만 바람직하게는, 음이온 교환 크로마토그래피에 흡착시키고, 한외여과(ultrafiltration) 및/또는 투석여과(diafiltration)에 의해 탈염시키고, 임의로, 동결건조시킴을 포함하여, 란티바이오틱을 정제하는 방법을 제공한다. 경우에 따라 물론, 별도의 정제 단계를 사용할 수 있다. 공개된 정제 방법에 의해 약 50%의 수율이 달성되었다. 본원에서 기술된 공급 배치(fed-batch) 방법의 용적 수율은 840 mg/L이다.
미국특허원 제2004/0072333 A1호에는, 예로서 니신을 사용하여 란티바이오틱 을 단백질분해 정제하는 방법이 기술되어 있다. 니신에는 영향을 주지 않으면서 조심스러운 미세 조정된 프로테아제 처리를 사용하여, 조정제된 산물로부터 제거하기 어려운 오염 펩티드를 제거한다.
요약하면, 당업계에 공지된 란티바이오틱 제조 방법은 매우 복잡하고 다수의 정제 단계를 필요로 한다. 따라서, 당업계에서는 란티바이오틱을 간단하고 저렴하게 제조하는 방법이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 간단하고 시간이 절약되는 란티바이오틱 제조 방법에 관한 것이다. 본원에서 기술된 제조 방법은, 당업계에서 기술된 것과 비교하여 덜 복합적인 배지를 사용하고, 무기염을 사용한 초기 침전 단계를 포함하는 간단한 1단계 또는 2단계의 정제 방법을 사용하는 새로운 발효 개념을 토대로 한다. 따라서, 본 발명은 발효 및 정제 단계를 포함하고, 이때 정제 단계는 (i) 무기염을 첨가하여 세포 배양 상청액으로부터 란티바이오틱 펩티드를 침전시키는 단계를 포함하는, 란티바이오틱 펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 바람직한 양태에 있어서, 정제 단계는 (ii) (i) 단계의 침전물로부터 수득된 펩티드를 세척, 단일 크로마토그래피 정제, 건조 또는 결정화시키는 정제 단계를 추가로 포함한다. 보다 더 바람직한 양태에 있어서, 발효는 말토스, 염화칼슘, 및 다량의 유리 아미노산 및 간단한 올리고펩티드를 함유하는 가수분해된 효모 추출물을 포함하는 배지 중에서 수행하고, 바람직하게는 상기 효모 추출물의 단백질성 성분의 50% 이상은 유리 아미노산이다. 보다 바람직하게는, 발효 배지는 고기 추출물 또는 펩톤 추출물을 포함하지 않는다.
본 발명의 양태에 앞서, 본원 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수 형태 "하나" 및 "상기"는 문맥에서 달리 명확하게 명시되지 않으면 복수의 언급을 포함한다는 점을 유의하여야 한다. 따라서, 예를 들면, "란티바이오틱"에 대한 언급에는 다수의 이러한 란티바이오틱이 포함되고, "세균"에 대한 언급은 하나 이상의 세균(들) 및 당업자에게 공지된 이의 동등물을 언급하는 것이고 기타도 마찬가지이다. 달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술용어 및 과학용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기술된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 검사에 사용할 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료를 곧 기술한다. 본원에서 언급된 모든 문헌은 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 문헌에 보고된 세포주, 유전 물질 및 방법론을 기술하고 공개하기 위한 목적으로 본원에 참조로서 인용된다. 본원에서 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 이러한 문헌보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 본원에 기술되어 있고 일반에 공지되지 않은 모든 방법은 본 발명에 따른 방법인 것으로 간주된다.
본 발명은 란티바이오틱의 제조 방법에 관한 것이다. 란티바이오틱은 란티오닌을 함유하는 펩티드 항생제이다. 통상적으로, 란티바이오틱은 불포화 아미노산 (데하이드로알라닌, 데하이드로부티린) 및 티오에테르 아미노산 (메소-란티오닌, (2S,3S,6R)-3-메틸란티오닌)의 함량이 높은 폴리사이클릭 폴리펩티드 항생제이다. 또한, 리시노알라닌, 3-하이드록시아스파르트산 및 S-(2-아미노비닐)-D-시스테인이 일부 란티바이오틱 일원에서 발견되었다. 대표적으로, 다음의 란티바이오틱이 당업계에 공지되어 있다: 니신, 서브틸린, 듀라마이신, 신나마이신, 안코베닌, 에피더민, Ro09-0198, pep5, 락티신 481 및 3147, 머사시딘, 악타가딘, 뮤타신 1140, 갈리더민. 이러한 란티바이오틱은, 예를 들면 문헌[참조: Kellner et al, (supra), 또는 Current Protein and Peptide Science 2005, no. 6, pp.61-75 (Cotter at al.,)]에 요약되어 있다. 본원에서 기술된 제조 방법은 바람직하게는 에피더민 및 갈리더민의 제조에, 보다 바람직하게는 갈리더민의 제조에, 및 가장 바람직하게는 적어도 화학식 I의 구조 모티프를 포함하는 갈리더민의 제조에 적용가능하다:
이로써 본원에서 기술된 란티바이오틱의 제조 방법은 발효 단계 및 정제 단계를 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 명확하게 하기 위하여, 두 단계를 각각 보다 상세히 기술한다. 하지만, 발효 방법에 대하여 기술된 각각의 양태는 정제 단계에 대하여 기술된 임의의 양태와 결합되어 최종 제조 방법이 될 수 있다.
발효 방법:
란티바이오틱의 최적화된 제조 방법에 관한 선행 기술에 존재하는 일반적인 지식은 발효 단계에서 란티바이오틱의 총량을 최대로 하는 방법에 관한 것이다. 그 결과, 고기 추출물 또는 펩톤 추출물을 포함하는, 영양분이 풍부하고 복합적인 배지가 발효 과정에 사용되었다. 이와 달리, 본 발명은 란티바이오틱, 바람직하게는 갈리더민의 보다 제어된 발효 방법은 란티바이오틱 펩티드의 정제를 용이하게 하여, 보다 효율적이고 경제적인 제조 방법이 된다는 발견을 토대로 한다. 본원에서 기술된 발효 방법은 무기염을 사용한 초기 침전 단계를 포함하는 간단한 1단계 또는 2단계의 정제 방법에 의해 배양 상청액으로부터 "높은 순도"의 란티바이오틱의 정제를 가능하게 한다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다.
본 발명에 있어서 "높은 순도"는 약물 제품과 관련하여 90% (w/w) 이상, 바람직하게는 92% 이상, 보다 바람직하게는 94% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 보다 바람직하게는 99% 이상의 제품 순도를 의미한다.
란티바이오틱은 당업계에 공지된 그람 (+) 세균에서 쉽게 생산할 수 있다. 예를 들면, 에피더민 및 갈리더민은 에피더민 및/또는 갈리더민 생산과 관련된 유전자를 암호화하고 발현하는 스타필로코커스 종에서 쉽게 생산될 수 있다. 예를 들면, 갈리더민은 스타필로코커스 갈리나리움 균주 Tu3928에서 효율적으로 생산될 수 있다는 것이 선행 기술에 공개되어 있다. 당해 균주는 유럽특허 제A-342 486호에 상세히 기술되어 있다. 이는 DSMZ (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany)에 수탁번호 4616번으로 기탁되었다. 따라서, 당업계에 공지된 임의의 세균 균주는 본원에서 기술된 란티바이오틱의 제조에 사용될 수 있다. 본원에서 기술된 갈리더민의 제조를 위하여, 스타필로코커스 갈리나리움 균주 Tu3928 (DSM 4616)을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
란티바이오틱을 생산할 수 있는 미생물의 발효는 당업계에 공지되어 있다. 미생물은 배치, 공급 배치 또는 연속 방식에서, 당해 특정 미생물에 적당한 상태 하에서 적당한 접종물로 접종한 후 액체 배지 중에 발효시킬 수 있다. 스타필로코커스 속의 미생물은 호기 상태 하에서, 바람직하게는 24 내지 37℃의 온도에서, 및 보다 바람직하게는 약 5.6 내지 8.5의 pH에서, 바람직하게는 약 6.0 내지 8.0의 pH에서, 가장 바람직하게는 약 pH 7.3에서 발효시킬 수 있다.
란티바이오틱, 바람직하게는 갈리더민의 발효에 적당한 기본 배양 배지는 말토스, 칼슘 공급원 및 효모 추출물을 함유한다. 바람직하게는, 이러한 기본 배양 배지는 발효 과정 동안 거품 형성을 방지하는 첨가제(들)을 포함할 수 있다. 보다 바람직한 이러한 배지는 고기 추출물 또는 펩톤 추출물을 포함하지 않는다. 당업계에서 사용되는 고기 추출물/펩톤 추출물은 란티바이오틱, 바람직하게는 갈리더민의 제조 과정에 부정적인 영향을 미치는 다량의 단백질성 성분을 함유한다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 따라서, 다른 양태에 있어서, 본원에서 제공되는 배양 배지는 탈염수, 말토스, 칼슘 공급원, 효모 추출물 및 하나 이상의 소포제로 이루어진다.
칼슘 공급원으로서, 바람직하게는 CaCl2가 사용된다. 보다 바람직하게는, CaCl2는 약 10 내지 200 mg/L 배양 배지, 보다 바람직하게는 약 10 내지 100 mg/L, 보다 바람직하게는 약 20 내지 80 mg/L, 보다 바람직하게는 약 30 내지 60 mg/L, 보다 더 바람직하게는 약 40 내지 50 mg/L, 가장 바람직하게는 약 42 내지 48 mg/L의 양으로 사용된다. 하지만, Ca2 +가 배지 중에 등가 농도 (약 90 μM 내지 1.8 mM)로 사용되도록 기본 배지 내의 CaCl2의 양을 다른 적당한 칼슘 공급원으로 대체하거나 적어도 부분적으로 대체하는 것도 당업자의 지식 내에 있다. 또한, 기본 배지 중의 CaCl2 또는 임의의 동등한 칼슘 공급원의 양을 감소시키고 이를 발효 과정 동안 연속적 또는 불연속적으로 공급하는 것도 당업자의 지식 내에 있다.
말토스, 바람직하게는 말토스 모노하이드레이트로서 사용되는 말토스를 바람직하게는 약 0.5 내지 20 g/L 배지의 양으로 (약 1.39 내지 55.5 mM의 말토스 모노하이드레이트에 상응함) 기본 배지에 첨가한다. 보다 바람직하게는, 기본 배지 중의 말토스의 양은 약 1 내지 5 g/L, 보다 바람직하게는 약 2.5 내지 7.5 g/L, 가장 바람직하게는 약 5 g/L이다. 하지만, 말토스를 생산자에 의해 마찬가지로 소모될 수 있는 말토스의 임의의 대사 전구체, 또는 임의의 동등한 탄소 공급원으로 대체하거나 적어도 부분적으로 대체하는 것도 당업자의 지식 내에 있다. 하지만, 발효 과정의 초기 성장기의 경우, "간접적인 탄소 공급원"을 사용하는 것이 바람직하다. 간접적인 탄소 공급원은, 예를 들면, 말토스와 같은 이당류, 올리고당류 또는 다당류이지만, 글루코스는 아니다. 또한, 기본 배지 중의 말토스, 임의의 대사 전구체 또는 적당한 동등물의 양을 감소시키고 이를 발효 과정 동안 연속적 또는 불연속적으로 공급하는 것도 당업자의 지식 내에 있다.
적어도, 본원에서 기술되는 발효와 정제의 병행 방법과 관련하여, 단백질 공급원의 기원 및 질은 란티바이오틱의 제조 과정에 있어서 중요한 것으로 보인다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 선행 기술에 공개된 발효 방법 (이들은 모두 펩톤 또는 고기 추출물을 사용함)과 달리, 본원에서 기술된 란티바이오틱의 발효에 사용되는 배지는 바람직하게는 유일한 단백질 및 아미노산 공급원으로서, 바람직하게는 효모 추출물을 포함한다. 하지만, 미량의 첨가는 본원에서 기술되는 란티바이오틱의 제조 방법에 부정적인 영향을 미치지 않는다.
바람직하게는, 효모 추출물은 약 10 내지 200 mg/L 배양 배지, 보다 바람직하게는 약 10 내지 100 mg/L, 보다 바람직하게는 약 20 내지 80 mg/L, 보다 바람직하게는 약 30 내지 70 mg/L, 보다 더 바람직하게는 약 40 내지 60 mg/L, 가장 바람직하게는 약 50 mg/L의 양으로 기본 배지에 첨가된다. 하지만, 기본 배지 중의 효모 추출물의 양을 감소시키고 이를 발효 과정 동안 연속적 또는 불연속적으로 공급하는 것도 당업자의 지식 내에 있다.
바람직하게는, 효모 추출물의 아미노산의 총 약 50% 이상이 유리 아미노산 및/또는 디펩티드이다. 보다 바람직하게는, 효모 추출물의 아미노산의 총 약 55% 이상, 보다 바람직하게는 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 65% 이상, 보다 바람 직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약 75% 이상, 보다 바람직하게는 약 80%이상, 보다 더 바람직하게는 약 85% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 90% 이상이 유리 아미노산 또는 디펩티드이다.
다른 양태에 있어서, 본원에서 기술되는 란티바이오틱 (예: 갈리더민)의 발효에 사용되는 효모 추출물의 아미노산 Asp, Glu, Asn, Gly, Ser, Thr, Ala 및 Arg의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 55% 이상, 보다 바람직하게는 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 65% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 이상, 보다 바람직하게는 약75% 이상, 보다 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 더 바람직하게는 약 85% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 90% 이상이 유리 아미노산이거나 디펩티드의 형태로 존재한다.
기본 배지는 또한 발효 과정 동안 거품 형성을 방지하거나 감소시키는 소포제를 포함할 수 있다. 이러한 "소포제"는 당업자에게 공지된 기본 배지에 적당량으로 첨가될 수 있다. 예를 들면, 소포제로는 이온성 또는 비-이온성 계면활성제, 예를 들면, 플루론산, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐-피롤리돈 (PVP), 폴리비닐 알콜 (PVA), 알콜성 EO/PO 부가물, 예를 들면, Genapol EP 등이 있다. 바람직하게는, 폴리에틸렌 글리콜 600 및 Genapol® EP00244 [판매원: Clariant, Germany]의 혼합물이 사용된다.
발효 과정은 바람직하게는 약 24 내지 37℃, 바람직하게는 약 28 내지 37℃, 보다 바람직하게는 약 32 내지 37℃, 보다 더 바람직하게는 약 35 내지 37℃, 가장 바람직하게는 약 37℃에서 수행한다.
pH 값은 약 pH 5.6 내지 8.0으로 조절한다. 보다 바람직한 방식에 있어서, 발효 시작시 pH 값은 약 pH 5.6 내지 8.0, 보다 바람직하게는 약 pH 6.5 내지 7.5, 보다 더 바람직하게는 약 6.8 내지 7.5, 가장 바람직하게는 약 7.0 내지 7.5로 조절한다.
발효 과정은 바람직하게는 공급 배치 방식으로 수행한다. 세균의 발효를 위한 공급 배치 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 간략히 설명하면, 생물발효기를 기본 배지로 채우고, 바람직하게는 2.0 내지 20 mL (OD600=10)의 세균 배양물 / L 발효기 브로쓰의 세균으로 접종한다. 발효 과정 동안, 적당한 영양분을 포함하는 공급 혼합물을 불연속적 또는 연속적으로 첨가한다. 따라서, 추가의 양태에 있어서, 본원에서 기술되는 란티바이오틱의 제조를 위한 발효 과정은 공급 배치 방식으로 수행한다.
바람직하게는, 본원에서 기술되는 발효 방법에 사용되는 공급 혼합물은 바람직하게는 발효 과정 동안 생산자에 의해 소모되는 하나 이상의 에너지원 및 추가적인 영양분을 포함한다. 예를 들면, 공급 혼합물은 바람직하게는 당, 당알콜, 아미노당, 우론산, 아미노산, 글리세린, 글리세롤 에스테르의 그룹으로부터 선택되는 탄소 공급원을 포함할 수 있다. 본원에서 기술되는 방법의 추가적인 양태에 있어서, 공급 혼합물은 하나 이상의 단당류, 예를 들면, 글루코스, 프럭토스, 만노스, 갈락토스 등 또는 이의 혼합물을 포함한다. 본원에서 기술되는 방법의 추가적인 양태에 있어서, 공급 혼합물은 당, 바람직하게는 단당류, 및 바람직하게는 Asp, Glu, Asn, Gly, Ser, Thr, Ala 및/또는 Arg의 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 본원에서 기술되는 방법의 추가적인 양태에 있어서, 공급 혼합물은 글루코스를 포함하거나 글루코스로 이루어진다.
공급 배치 방식에서, 란티바이오틱, 바람직하게는 갈리더민의 제조에 적용될 수 있는 다수의 공급 방법이 선행 기술에 공지되어 있다. 바람직하게는, 배지 내의 pO2가 80 mbar 미만, 바람직하게는 60 mbar 미만, 보다 바람직하게는 40 mbar 미만으로 변화된 후 공급을 시작한다. 바람직하게는 공급 속도를 약 3 내지 10 kg/(m3 h), 보다 바람직하게는 약 4 내지 8 kg/(m3 h), 보다 더 바람직하게는 약 5 내지 7 kg/(m3 h), 가장 바람직하게는 약 6.5 kg/(m3 h)로 증가시킨다. 본원에서 기술된 발효 방법의 추가적인 양태에 있어서, 기본 공급 속도는 발효 동안 연속적으로 및/또는 단계적으로 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 속도를 연속적으로 약 0.01 내지 0.5 kg/(m3 h), 바람직하게는 약 0.05 내지 0.3 kg/(m3 h), 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 0.25 kg/(m3 h), 보다 더 바람직하게는 약 0.15 kg/(m3 h) 증가시킬 수 있다.
또한, 본원에서 기술되는 방법에 관한 보다 상세한 공급 방법이 도 1에 제시되어 있다. 간략히 설명하면, 배지 내의 pO2가 80 mbar 미만, 바람직하게는 60 mbar 미만, 보다 더 바람직하게는 40 mbar 미만으로 변화된 후, 공급 혼합물을 약 3 내지 10 kg/(m3 h), 보다 바람직하게는 약 4 내지 8 kg/(m3 h), 보다 더 바람직하게는 약 5 내지 7 kg/(m3 h), 가장 바람직하게는 약 6.5 kg/(m3 h)의 초기 속도로 첨가한다. 초기 공급 속도를, 약 0.01 내지 0.5 kg/(m3 h), 바람직하게는 약 0.05 내지 0.3 kg/(m3 h), 보다 바람직하게는 약 0.1 내지 0.25 kg/(m3 h), 보다 더 바람직하게는 약 0.15 kg/(m3 h)의 증가하는 속도로 연속적으로 증가시킨다. 바람직하게는, pO2가 약 100 mbar로 돌아온 후, (이때 존재하는) 공급 속도를 약 1 내지 2 kg/(m3 h), 바람직하게는 약 1 kg/(m3 h) 만큼 1회 증가시킨다.
대안으로, 배지 내의 pO2가 80 mbar 미만, 바람직하게는 60 mbar 미만, 보다 더 바람직하게는 40 mbar 미만으로 변화된 후, 공급 혼합물을 약 3 내지 10 kg/(m3 h), 보다 바람직하게는 약 4 내지 8 kg/(m3 h), 보다 더 바람직하게는 약 5 내지 7 kg/(m3 h), 가장 바람직하게는 약 6.5 kg/(m3 h)의 초기 속도로 첨가한다. 초기 공급 속도를 발효 과정에 걸쳐 두 단계로 증가시키는데, 각 단계에서 약 0.5 내지 2 kg/(m3 h), 바람직하게는 약 1 kg/(m3 h) 증가시킨다.
형성의 종결은 본원에서 기술되는 전체 제조 방법에서 중요한 것 같다. 가정체기(pseudo stationary phase)의 시작 전에 발효 과정을 종결시키는 경우, 본원 에서 기술되는 단일 정제 방법을 적용하여, 고도로 정제된 란티바이오틱 (예: 갈리더민)을 얻을 수 있다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 달리 말하면, 본원에서 기술되는 방법에 따른 란티바이오틱의 제조의 경우, 세포 배양물을 정체기의 시작 전까지 성장시킨다. "정체기의 시작 전까지"라는 말은 pH가 < 5.6, 바람직하게는 6.0이 되기 전에 발효 과정을 중지시킨다는 것을 의미한다. 대안으로, "정체기의 시작 전까지"라는 말은 발효 과정에서 발효기 내의 생존 세포의 총 수가 더 이상 증가하지 않는 것을 의미한다. 또한, "정체기의 시작 전까지"라는 말은 또한 pH가 < 6.0이 되기 전에 발효를 중지시키고 생존 세포의 총 수가 더 이상 증가하지 않는 것을 의미한다. 세포의 총 수는 직접적으로 또는 간접적인 방법을 사용하여, 예를 들면 배양 브로쓰의 탁도 측정에 의해 추정할 수 있다. 일반적으로, 세포의 수가 증가하면 세포 배양물의 탁도가 증가한다. "탁도"는, 예를 들면 ml 배양 브로쓰 및 시간 당 600 nm의 파장에서 측정된 흡광도(O.D.600)로서 측정할 수 있다. 따라서, "정체기의 시작 전까지"라는 말은 또한 ml 발효기 브로쓰 당 ΔO.D.600 값이 발효 10분 동안 0.1 미만으로 감소하는 것을 의미한다. 바람직하게는, ml 발효기 브로쓰 및 발효 시간 10분 당 ΔO.D.600 값은 0.05 미만, 보다 바람직하게는 0.01 미만으로 감소된다. 따라서, 대안으로 "정체기의 시작 전까지"라는 말은 또한 pH가 < 5.6, 바람직하게는 < 6.0이 되기 전에 발효를 중단시키는 것 및/또는 ml 발효기 브로쓰 당 ΔO.D.600 값이 발효 10분 동안 0.1 미만으로 감소하는 것을 의미한다. 바람직 하게는, ml 발효기 브로쓰 및 발효 시간 10분 당 ΔO.D.600 값은 0.05 미만, 보다 바람직하게는 0.01 초과로 감소된다.
정제 방법:
란티바이오틱은 생산자 (세균) 자체에 유해하고, 생산 균주로부터 분비되는 프로테아제의 활성의 대상이기 때문에, 란티바이오틱 (예: 에피더민 및 갈리더민)의 증가된 제조를 위하여, 발효 과정 동안 이러한 산물을 제거하는 것이 중요하다는 것이 통상적인 지식이었다. 그 결과, 배양 브로쓰로부터 란티바이오틱의 연속적인 분리를 가능하게 하는 투석 또는 불연속 흡착 크로마토그래피 단계를 발효 과정에 통합시킨다 [참조: Ungermann et al, (supra)]. 본원에서 기술되는 제조 방법의 추가적인 양태에 있어서는 이러한 분리 단계가 사용될 수 있지만, 본원에서 기술되는 발효 방법은 이러한 과정을 필요로 하지 않는다.
란티바이오틱 펩티드, 특히 갈리더민을 배양 브로쓰(배양 상청액)로부터 초기 염 침전 단계에 의해 고수율 및 고순도로 정제할 수 있다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. "초기 염 침전 단계"라는 말은 배양 브로쓰가 염 침전 전에 어떠한 다른 정제 단계도 거치지 않는다는 것을 의미한다. 하지만, 세포 분리 또는 pH의 조절은 정제 단계로 간주되지 않는다.
따라서, 본 발명은 또한 발효 및 정제 단계를 포함하고, 이때 정제 단계는 (i) 염, 바람직하게는 무기염을 첨가하여 세포 배양 상청액으로부터 란티바이오틱 펩티드를 침전시키는 단계를 포함하는, 란티바이오틱 펩티드, 바람직하게는 갈리더민의 제조 방법에 관한 것이다. 란티바이오틱을 염, 바람직하게는 무기염에 노출시키면, 예상외의 침전 특성을 나타낸다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다. 바람직하게는, 이러한 침전 특성은 본원에서 기술되는 발효 방법과 함께 밝혀졌다 (상기 참조). 달리 말하면, 본원에서 기술되는 방법에 따라 란티바이오틱을 발효시키는 경우, 염 침전 단계의 효율이 증가될 수 있다. 예를 들면, 알칼리성 할로겐염 또는 황산암모늄염을 사용한 침전 실험 결과, 산물 수율은 총 약 80 내지 90%였고 순도는 총 약 90 내지 94%였다.
염 침전 방법 또는 염석 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있고, 추가적인 정제 단계와 함께 종종 사용되었다. 예를 들면, 염석은 문헌[참조: Harris and Angal (eds.) in protein purification methods - a practical approach, Oxford University Press 1995]에 기술되어 있다. 하지만, 단일 침전 단계에 의해 이러한 높은 산물 순도 및 수율이 나타난다는 것은 기술된 적이 없다. 본원에서 기술되는 침전 단계를 수행하는데 적당한 염은 무기염이다.
사용되는 염의 다수의 양상이 고려되어야 한다. 염의 효과는 음이온의 성질에 의해 주로 결정되고, 다가 음이온이 가장 효과적이다. 효과의 순서는 포스페이트 > 설페이트 > 아세테이트 > 클로라이드 > (이고, 다음은 호프마이스터 계열 (Hofmeister series))이다. 포스페이트가 설페이트보다 더 효과적이지만, 중성 pH에서 사실상 포스페이트는 보다 효과적인 PO43 -보다는 주로 HPO4 2 - 또는 H2PO4 -로 이 루어진다. 1가 양이온이 가장 효과적이고, 효과의 순서는 NH4 + > K+ > N+ 이다. 몰농도가 수 몰 농도 이하여야 하므로, 용해도도 중요한 고려사항이다. 따라서, 많은 칼륨염은 이러한 면에서 적당하지 않다. 가능한 변성 또는 용해도의 변화의 위험성 때문에, 염 용해에 의해 발생하는 열이 거의 증가해서는 안된다. 마지막 고려사항은 생성되는 용액의 밀도인데, 그 이유는 응집물과 용액의 밀도 차이가 원심분리에 의한 분리의 용이함을 결정하기 때문이다.
바람직하게는, 다음 식의 염을 본원에서 기술되는 방법에 따른 란티바이오틱의 침전에 사용한다:
Mn Xm
상기 식에서, n = +1, +2이고 m = -1, -2, -3이다. X는 할로겐, 포스페이트, 포스포네이트, 설페이트, 설포닐, 아세테이트를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, M은 알칼리성 금속, 알칼리성 토금속 및 암모늄을 포함하는 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 무기염이 보다 바람직하다. X는 할로겐 또는 설페이트를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, M은 알칼리성 금속, 알칼리성 토금속 및 암모늄을 포함하는 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 무기염이 보다 바람직하다. X가 할로겐인 경우, M은 알칼리성 금속 또는 알칼리성 토금속을 포함하는 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 무기염이 보다 바람직하지만, 알칼리성 금속이 할로겐과의 배합시 가장 바람직하다. 바람직한 할로겐은 클로라이드이고, 바람직한 알칼리성 금속은 나트륨 및 칼륨이지만, 나트륨이 가장 바람직하다. 그 결과, 염화나트륨 및 염화 칼륨의 사용이 가장 바람직하지만, 염화칼륨과 비교하여 염화나트륨이 보다 바람직하다. 란티바이오틱 (예: 갈리더민)의 침전에 염화칼륨 및 염화나트륨, 바람직하게는 염화나트륨이 적당하다는 것은 본원에 기술된 또 다른 예상외의 발견이었다. 염화나트륨을 사용하면 더 강한 황산암모늄과 비교하여 수율 및 순도가 더 높다는 것이 실시예 2에서 밝혀졌다. 하지만, 대안으로 암모늄염, 바람직하게는 황산암모늄도 본원에서 기술되는 침전 단계에 적당한 것으로 밝혀졌다.
바람직하게는, 무기염을 사용한 침전은 적어도 1.6 M 이상의 염 농도에서 수행한다. 바람직하게는, 본원에서 기술되는 방법에 따라 사용되는 염 농도는 약 1.6 내지 10 M, 보다 바람직하게는 약 1.6 내지 5 M, 보다 바람직하게는 약 2.5 내지 4 M, 보다 바람직하게는 약 3 내지 4 M이다. 하지만, 상기한 바와 같이, 몰농도의 상한값이 사용되는 온도에서의 염의 용해도에 의해 정해진다는 것은 당업자의 지식 내에 있다. 예를 들면, 염화나트륨은 실온에서 4.2 내지 4.4 M까지 물에 용해된다. 따라서, 알칼리성 할로겐염 (예: 염화나트륨)은 바람직하게는 약 2.6 M 내지 4.5 M, 보다 바람직하게는 약 3.1 M 내지 4.2 M, 보다 더 바람직하게는 약 3.2 내지 3.5 M, 가장 바람직하게는 약 3.4 M의 농도에서 사용된다.
본원에서 기술되는 침전 단계의 추가적인 양태에 있어서, 침전 전에 발효 브로쓰를 중성 및/또는 약한 알칼리성 pH로 조절한다. 따라서, 침전 단계는 바람직하게는 약 7 내지 10의 pH, 보다 바람직하게는 약 7.5 내지 9의 pH, 보다 더 바람직하게는 약 7.8 내지 8.8의 pH, 가장 바람직하게는 약 8.0의 pH에서 수행한다. 약한 알칼리성 pH, 바람직하게는 상기한 범위 내의 pH에서 침전시키는 것은 할로겐 염, 바람직하게는 알칼리성 할로겐염, 가장 바람직하게는 염화나트륨의 사용과 함께 가장 바람직하다.
본원에서 기술되는 침전 단계의 추가적인 양태에 있어서, 염 침전은 실온 (약 20 내지 25℃)에서 또는 실온 미만에서 수행한다. 하지만, 실온보다 (약간) 높은 온도에서 침전 단계를 수행할 수도 있다는 것도 당업자의 지식 내에 있다. 일반적으로, 온도가 높아질수록 산물에 부정적인 영향을 미칠 위험이 높아진다. 경제적인 관점에서, 일반적으로 모든 과정 단계를 실온 근처에서 수행하는 것을 목표로 한다. 이는 란티바이오틱, 바람직하게는 갈리더민의 경우 충분히 적용된다는 것이 놀랍게도 밝혀졌다.
본원에서 기술된 방법의 경우, (교반 하에서) 30분의 침전 후, 총 80% 이상의 산물이 염석된다는 것이 밝혀졌다. 순도는 총 약 90% 이상이었다. 바람직하게는, 침전은 30분 이상 동안, 바람직하게는 교반하면서 수행한다. 보다 바람직하게는, 침전은 30분 이상 동안 수행하지만, 순도가 약 75% 미만, 바람직하게는 약 78% 미만, 보다 바람직하게는 약 80% 미만, 보다 바람직하게는 약 82% 미만, 보다 바람직하게는 약 84% 미만, 보다 바람직하게는 약 86% 미만, 보다 더 바람직하게는 약 88% 미만, 가장 바람직하게는 약 90% 미만으로 감소하기 전에 중지시킨다. 산물 수율은 표준 정량 HPLC 분석으로 측정할 수 있다.
추가의 양태에 있어서, 침전은 산물의 총 약 70% 이상, 바람직하게는 약 75%, 보다 바람직하게는 최대 75%, 보다 바람직하게는 최대 80%, 보다 바람직하게는 최대 82%, 보다 바람직하게는 최대 85%, 보다 더 바람직하게는 최대 90%가 염석 될 때까지 수행하지만, 순도가 약 75% 이하, 바람직하게는 약 78% 이하, 보다 바람직하게는 약 80% 이하, 보다 바람직하게는 약 82% 이하, 보다 바람직하게는 약 84% 이하, 보다 바람직하게는 약 86% 이하, 보다 더 바람직하게는 약 88% 이하, 가장 바람직하게는 약 90% 이하로 감소하기 전에 중지시킨다.
추가의 양태에 있어서, 침전 단계는 약 30분 내지 2시간 동안, 바람직하게는 약 30분 내지 1시간 동안, 바람직하게는 약 30분 동안 수행한다. 바람직하게는, 침전 혼합물을 30분 이상 동안, 보다 바람직하게는 30분 동안 초기 교반한다. 따라서, 본원에서 기술되는 본 란티바이오틱 제조 방법은 초기 정제 단계로서 약 1시간 동안의 염 침전을 포함하고, 이때 처음 30분은 교반하면서 수행한다. 바람직하게는, 교반하면서 염을 30분에 걸쳐 첨가하고 나서, 30분 동안 교반을 계속한다.
본원에서 기술된 방법은, 특정한 변수의 조합이 명백하게 언급되지 않더라도, 각각의 변수에 대해 기술된 임의의 변화를 포함할 수 있다는 것을 또한 이해하여야 한다. 예를 들면, 본원에서 기술되는 란티바이오틱의 제조 방법은 또한 침전 단계 전에 발효 브로쓰를 pH 8.0 내지 8.5으로 조절하고, 교반하면서 3 내지 4 M의 할로겐염, 바람직하게는 염화나트륨으로 실온에서 30분 이상 동안 침전시키고 나서, 추가로 30분 동안 교반함을 포함한다. 본원에서 기술된 방법은 또한 본원에서 기술되는 란티바이오틱의 제조 방법을 포함하고, 여기서 상기 방법은 침전 전에 발효 브로쓰를 pH 7.5 내지 9.0으로 조절하고, 80% 이상의 란티바이오틱이 염석되기 전까지 약 3.4 M의 할로겐염, 바람직하게는 염화나트륨으로 실온에서 란티바이오틱을 침전시킴을 포함하지만, 이때 전체 순도가 90% 이하로 감소하기 전에 침전 단계 를 중지시킨다.
추가의 양태에 있어서, 본원에서 기술되는 란티바이오틱의 제조 방법은, 정제 과정이, 침전 단계로부터 수득된 펩티드를 세척, 단일 크로마토그래피 정제, 건조 또는 결정화시키는 정제 단계를 추가로 포함함을 특징으로 한다.
최초의 침전물, 바람직하게는 원심분리 또는 여과에 의해 분리된 (이때, 여과가 가장 바람직하다) 최초의 침전물을, 침전에 사용되는 것과 동일한 염 및 동일한 염 농도를 포함하는 용액으로 세척하는 경우, 정제가 추가로 증가될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 임의로, 세척 용액 내의 염 농도를 침전 용액과 비교하여 약간 증가시킬 수 있다. 바람직하게는, 세척 용적은 초기 산물 용액의 용적의 1/10 내지 1/2, 또는 1/10 내지 3/4과 동등하였다. 세척 단계 후, 침전물을 함유하는 산물을, 바람직하게는 원심분리 또는 여과 단계에 의해 분리한다. 원심분리 및 여과 단계는 모두 당업자에게 익히 공지되어 있다. 따라서, 본원에서 기술된 방법은 발효 및 정제 단계를 포함하고, 이때 정제 단계는 (i) 무기염을 첨가하여 세포 배양 상청액으로부터 란티바이오틱 펩티드를 침전시켜 침전물을 수득하는 단계, (ii) 침전에 사용되는 것과 동일한 염을 포함하는 용액으로 침전물을 세척하여 침전물을 수득하는 단계를 포함하는, 란티바이오틱 펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 침전 단계 전에, 세포를 제거하고 pH를 상기한 바와 같이 조절한다.
본원에서 기술되는 란티바이오틱, 바람직하게는 갈리더민의 제조 방법의 추가의 양태에 있어서, 침전 단계로부터 직접 수득되거나 대안으로 동일한 염을 사용한 세척 단계로부터 수득된 침전물 (둘 모두 상기되어 있음)을 바람직하게는 초기 용적의 1/20의 물에 세척한다. 바람직하게는, 물을 사용한 세척 단계를 반복한다. 각각의 세척 단계 후 원심분리 또는 여과에 의해 (하지만, 여과가 가장 바람직하다), 침전물을 함유하는 산물을 수득한다. 따라서, 본원에서 기술된 방법은 발효 및 정제 단계를 포함하고, 이때 정제 단계는 (i) 무기염을 첨가하여 세포 배양 상청액으로부터 란티바이오틱 펩티드를 침전시켜 침전물을 수득하는 단계, (ii) 임의로, 침전에 사용되는 것과 동일한 염을 포함하는 용액으로 침전물을 세척하여 침전물을 수득하는 단계, (iii) 임의로 (i) 또는 (ii) 단계의 침전물을 물로 세척하여 침전물을 수득하는 단계, (iv) 임의로 (iii) 단계를 반복하는 단계를 포함하는, 란티바이오틱 펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 침전 단계 전에, 세포를 제거하고 pH를 상기한 바와 같이 조절한다.
본원에서 기술되는 란티바이오틱, 바람직하게는 갈리더민의 제조 방법의 추가의 양태에 있어서, 침전 단계로부터 직접 수득되거나 대안으로 세척 단계로부터 수득된 침전물 (모두 상기되어 있음)을 적당한 완충액 중에, 바람직하게는 아세트산 완충액 중에, 보다 바람직하게는 1% (v/v) 아세트산 중에 용해시킨다. 따라서, (i) 초기 침전 단계의 침전물, 또는 (ii) 동일한 염을 사용한 세척 단계의 침전물, 또는 (iii) 물을 사용한 제1, 제2 또는 그 이상의 세척 단계의 침전물을 함유하는 산물을 적당한 완충액 중에, 바람직하게는 아세트산 완충액 중에, 보다 바람직하게는 약 1% 내지 2% (v/v) 아세트산 중에, 가장 바람직하게는 약 1% 아세트산 중에 용해시킨다. 보다 바람직한 양태에 있어서, 상기 완충액은 25 내지 50% (v/v)의 알콜, 바람직하게는 에탄올도 포함한다. 따라서, 바람직한 아세트산 완충액은 약 1 내지 2% 아세트산 및 약 15 내지 50%, 바람직하게는 20 내지 40% (v/v), 가장 바람직하게는 40% (v/v) 알콜, 바람직하게는 에탄올을 포함한다. 이어서, 용해된 산물을 바람직한 pH로 적정하여 최종적으로 여과시키고 동결 또는 동결건조 또는 결정화시킬 수 있다. 동결, 동결 건조 또는 결정화 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있고, 란티바이오틱, 바람직하게는 갈리더민을 추가로 처리하는데 적용될 수 있다. 이러한 처리의 예는 문헌[참조: Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice. Springer, 1993]에 기술되어 있다. 따라서, 본원에서 기술된 방법은 발효 및 정제 단계를 포함하고, 이때 정제 단계는 (i) 무기염을 첨가하여 세포 배양 상청액으로부터 란티바이오틱 펩티드를 침전시켜 침전물을 수득하는 단계, (ii) 임의로, 침전에 사용되는 것과 동일한 염을 포함하는 용액으로 침전물을 세척하여 침전물을 수득하는 단계, (iii) 임의로 (i) 또는 (ii) 단계의 침전물을 물로 세척하여 침전물을 수득하는 단계, (iv) 임의로 (iii) 단계를 반복하는 단계, (v) (ii) 내지 (iv) 단계의 침전물을 아세트산 완충액, 바람직하게는 1% 아세트산 중에 용해시키는 단계, 및 (vi) 용해된 산물을 목적하는 pH로 적정하여 최종적으로 여과시키고 동결 또는 동결건조 또는 결정화시키는 단계를 포함하는, 란티바이오틱 펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 침전 단계 전에, 세포를 제거하고 pH를 상기한 바와 같이 조절한다.
산물의 순도는 분취용 HPLC 또는 LPLC에 의해, 바람직하게는 역상 크로마토그래피에 의해 > 98 면적 %로 추가로 개선될 수 있다. 역상 크로마토그래피를 사용하여 산물을 탈염시키고/시키거나 정제하는 방법은 당업자에게 익히 공지되어 있 고, 예를 들면 문헌[참조: Scopes, R.K., Protein Purification: Principles and Practice. Springer, 1993]에 기술되어 있다. 예를 들면, 사용될 수 있는 적당한 크로마토그래피 매질로는 Amberchrom HPR10, XT20, cg300c 및 cg161c [판매원: Rohm and Haas, Philadelphia USA] 등이 있다. 따라서, 본원에서 기술된 방법은 발효 및 정제 단계를 포함하고, 이때 정제 단계는 (i) 무기염을 첨가하여 세포 배양 상청액으로부터 란티바이오틱 펩티드를 침전시켜 침전물을 수득하는 단계, (ii) 임의로, 침전에 사용되는 것과 동일한 염을 포함하는 용액으로 침전물을 세척하여 침전물을 수득하는 단계, (iii) 임의로 (i) 또는 (ii) 단계의 침전물을 물로 세척하여 침전물을 수득하는 단계, (iv) 임의로 (iii) 단계를 반복하는 단계, (v) 임의의 앞선 (i) 내지 (iv) 단계로부터 수득된 란티바이오틱 펩티드를 단일 크로마토그래피 정제하는 단계 (바람직하게는, 여기서, 상기 크로마토그래피 정제 단계는 역상 크로마토그래피이다)를 포함하는, 란티바이오틱 펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 침전 단계 전에, 세포를 제거하고 pH를 상기한 바와 같이 조절한다.
추가의 양태에 있어서, 상기한 바와 같이 (i) 침전 단계로부터 직접 수득된 침전물, (ii) 동일한 염을 사용한 세척 단계로부터 수득된 침전물, (iii) 물을 사용한 제1, 제2 또는 그 이상의 세척 단계로부터 수득된 침전물을, 역상 크로마토그래피 칼럼 상에 로딩하고 나서, 이를 수용액 (예: 16% (v/v) 아세토니트릴)을 사용하여, 바람직하게는 수중의 0.1% (v/v) 트리플루오로아세트산 등과 함께 세척할 수 있다. 이어서, 수중의 아세토니트릴의 구배, 바람직하게는 20 내지 40% (v/v), 예 를 들면 24 내지 36% (v/v) 아세토니트릴 등의 구배를 사용하여 산물을 칼럼으로부터 용출시킬 수 있다. 바람직하게는, 용출 완충액은 바람직하게는 약 0.01 내지 0.5% (v/v), 보다 바람직하게는 약 0.1% (v/v)의 트리플루오로아세트산 등을 또한 포함할 수 있다. 이어서, 유기 용매를 저압 증류에 의해 산물 용액으로부터 제거하고, 산물을 바람직한 pH로 적정하여 최종적으로 여과시키고 동결 또는 동결건조 또는 결정화시킨다. HPLC 칼럼으로부터 산물의 수거를 조절하여 순도를 추가로 증가시킬 수 있지만, 그 결과로 수율은 감소된다.
대안으로, 상기한 바와 같이 (i) 침전 단계로부터 직접 수득된 침전물, (ii) 동일한 염을 사용한 세척 단계로부터 수득된 침전물, (iii) 물을 사용한 제1, 제2 또는 그 이상의 세척 단계로부터 수득된 침전물을, 에탄올 및 아세트산을 포함하는 수성 완충액 중에 현탁시킨다. 바람직하게는, 에탄올 농도는 약 5 내지 50% (v/v), 보다 바람직하게는 20 내지 45% (v/v), 가장 바람직하게는 약 40% (v/v)이고, 아세트산 농도는 약 0.1 내지 10% (v/v), 바람직하게는 약 0.5 내지 5% (v/v), 가장 바람직하게는 약 1.0% (v/v)이다. 생성된 산물 용액을 임의로 여과시키고 (하지만, 바람직하게는 여과 단계를 사용한다), 저압 역상 크로마토그래피용 칼럼, 예를 들면 Amberchrom cg300c [판매원: Rohm and Haas, Philadelphia USA] 상에 로딩하였다. 유사한 역상 크로마토그래피 매질 (예: Amberchrom cg161c 등)도 적당할 것이다. 본원에서 기술되는 방법을 실현하는데 적당한 역상 크로마토그래피 매질을 선택하는 것은 당업자의 일반적인 지식 내에 있다. 이어서, 예를 들면 수중의 아세토니트릴 및 바람직하게는 트리플루오로아세트산, 바람직하게는 수중의 약 16% 아세토니트릴 및 약 0.1% 트리플루오로아세트산을 포함하는 적당한 완충액으로 칼럼을 세척한다. 하지만, 유기 용매 및 산 물질을 함유하는 임의의 다른 적당한 수성 완충액을 사용하여 역상 크로마토그래피를 수행할 수 있다. 산물 용출은 바람직하게는 강한 유기 용매, 예를 들면 수중의 약 60 내지 90% (v/v) 아세토니트릴, 바람직하게는 수중의 약 80% 아세토니트릴을 사용하여 수행한다. 이어서, 유기 용매를 저압 증류에 의해 산물 용액으로부터 제거하고, 산물을 바람직한 pH로 적정하여 최종적으로 여과시키고 동결 또는 동결건조 또는 결정화시킨다.
트리플루오로아세트산을 정제 과정 동안 사용하는 경우에는, 임의로 이를 트리플루오로아세트산 함유 물질로부터 당업계에 익히 공지된 표준 방법에 의해 제거할 수 있다. 예를 들면, 대부분의 트리플루오로아세트산, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 99.9% 이상의 트리플루오로아세트산이 이온 교환 매트릭스에 결합될 때까지, 트리플루오로아세트산 함유 물질을 이온 교환 매트릭스, 바람직하게는 음이온 교환 매트릭스 (예: SAX 반대이온(counterion) 탄산수소염)와 함께 항온처리하여 트리플루오로아세트산 비함유 물질을 수득할 수 있다. 필요한 이온 교환 매트릭스의 양은 트리플루오로아세트산의 결합 능력 및 총 함량에 따라 달라지지만, 최대 결합 능력을 최소 10% 초과하였다. 30분 이상의 항온처리 후, 용액을 이온 교환체로부터 분리한다. 바람직하게는 수중의 10 내지 20% 아세토니트릴을 함유하는 수중의 아세토니트릴의 세척 완충액의 시작 용적의 1/10 내지 2/10를 사용하여 이온 교환 매트릭스를 세척하고 나서, 합한 용액을 저압 증류시켜 용액이 약간 탁해질 때까지 아세토니트릴을 제거한다. 트리플루오로아세트산을 제거하거나 트리플루오로염을 다른 반대이온으로 교환하는 다른 익히 공지된 방법을 사용하여, 유리 염기 또는 다른 염, 예를 들면 하이드로클로라이드 또는 아세테이트를 생성할 수도 있다.
추가의 양태에 있어서, 본원에서 기술된 방법은 발효 및 정제 단계를 포함하고, 이때 정제 단계는 (i) 무기염을 첨가하여 세포 배양 상청액으로부터 란티바이오틱 펩티드를 침전시켜 침전물을 수득하는 단계, (ii) 침전에 사용되는 것과 동일한 염을 포함하는 용액으로 침전물을 세척하여 침전물을 수득하는 단계, (iii) 세척 단계 (ii)로부터 수득된 란티바이오틱 펩티드를 단일 크로마토그래피 정제하는 단계 (바람직하게는, 여기서, 상기 크로마토그래피 정제 단계는 역상 크로마토그래피이다), (iv) 저압 증류에 의해 산물 용액으로부터 유기 용매를 제거하는 단계, (v) 이를 바람직한 pH로 적정하여 최종적으로 이를 동결건조시키는 단계를 포함하는, 란티바이오틱 펩티드의 제조 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 침전 단계 전에, 세포를 제거하고 pH를 상기한 바와 같이 조절한다.
다음의 실시예는 본 발명을 추가로 설명하는 역할을 하지만, 실시예는 본원에서 공개된 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 또한, 다음의 실시예는 본원에서 기술되는 본 발명의 방법의 일반적인 개념을 설명할 것이다.
실시예
1
갈리더민의
발효
동결 배양 (
WCC
)
스타필로코커스 갈리나룸(Staphylococcus gallinarum) (Tu 3928; DSM 4616)의 동결 스톡(frozen stock) (Zellbank BO-002; Kampagne 1940122004033, 참조번호 35/3/18)의 하나의 바이알을 사용하여 한천 플레이트를 무균 접종하였다. 한천 배양물을 37℃에서 1일 동안 항온배양하고 나서, 4℃에서 1일 동안 항온배양하였다 (파라필름을 사용함 - 하지만, 당해 단계는 필수적이지 않다). 당해 배양물을 제1 시드(seed)의 접종에 사용하였다. 매 생산마다, 새로운 바이알을 사용해야 한다.
플레이트 배양 배지:
| 효모 추출물 Hy-Yest 455 | 5 g/L | Kerry Bioscience |
| 글루코스 x H2O | 1 g/L | Cerestar 또는 Merck |
| NaCl | 5 g/L | Fluka 또는 Merck |
| 박토(Bacto) 한천 | 12 g/L | Bekton Dickinson |
| H2O | 탈이온수 | |
| pH | 7.3 | (멸균 전) |
예비 배양물 또는 제1 시드 (2개의 진탕 플라스크; 500
ml
)
배양된 플레이트 (약 0.5 x 0.5 cm)의 일부분을 100 ml의 멸균된 시드 배지를 함유하는 2개의 500 ml 배플(baffled) 진탕 플라스크(하나의 배플)에 무균적으로 옮겼다. 시딩(seeding)된 플라스크를 회전 진탕기에서 (140 내지 180 rpm) 37℃에서 16 내지 18시간 동안 항온배양한다. 최종 산물 역가는 = 100 mg/L의 범위에 있어야 한다.
배지:
| 효모 추출물 Ohly Kat | 50 g/L | Deutsche Hefewerke |
| CaCl2 x H2O | 45 g/L | Merck |
| 말토스 x H2O | 5 g/L | Merck |
| PEG600 / Genapol EP 0244(1:1) | 0.5 ml/L | Fluka / Clariant |
| H2O | 탈이온수 | |
| pH | 7.3 | 멸균 전 |
제2 시드 (또는 실험실 발효기)
제2 시드 배지:
| 효모 추출물 Ohly Kat | 50 g/L | Deutsche Hefewerke |
| CaCl2 x H2O | 45 g/L | Merck |
| 말토스 x H2O | 5 g/L | Merck |
| PEG600 / Genapol EP 0244(1:1) | 0.5 ml/L | Fluka / Clariant |
| 공급: 글루코스 모노하이드레이트 (40%, w/w) | Cerestar | |
| H2O | 탈이온수 | |
| pH | 7.3 | 멸균 전 |
제1 시드(2.0%)를 예비 배양물(= 시드 배지)에서와 동일한 배지가 있는 20L 생물반응기에 무균적으로 옮겼다. 생물반응기 내의 접종된 병 또는 플라스크 또는 배양물을 37℃에서 최대 24시간 동안 항온배양한다. 5 내지 6시간 후 pO2 변화가 일어나고, 이때에 글루코스 공급을 시작한다 (공급 프로파일은 아래의 생산 발효를 참조한다). 거품 형성을 방지하기 위하여, 0.05ml/L의 Genapol EP 0244 및 PEG 600의 1:1 혼합물을 멸균 전에 첨가한다. 생산 발효를 위한 접종물로서 발효기를 사용한 경우, 배양물을 16 내지 18시간 동안만 항온배양하고 나서, 생산 생물반응기로 옮긴다 (이유: 옮겼을 때, 산물 역가가 < 200 mg/L이어야 한다).
생산 발효
작업 용적(working volume)이 1000 L인 1500L 탱크에서 생산 발효를 수행하였다 (주의: 현재까지 20 L 발효기 규모 (10 L 작업 용적, 1.5 m3가 계획된다). 멸균된 배지를 37℃로 냉각시키고, 제2 시드로 접종하였다. 접종물의 양은 0.5%였다. 발효 조건은 다음과 같았다.
배지: 시드 배양의 경우와 동일
항온배양 온도: 37℃
pH: 제어하지 않음, 하지만 접종시 pH 는 6.3으로 고정되어야 한다
거품 방지: Genapol 및 PEG 600의 0.5 mL/L의 1:1 혼합물을 사용하였다
교반기 속도: 300 rpm에서 시작
통기 속도: 0.5 vvm
두 가지의 상이한 공급 프로파일을 검사하였다.
공급 A: pO2 변화 후 (5 내지 6시간 후) 0.15 kg/(m3 h)의 일정한 기울기에서 6.5 kg/(m3 h)의 공급 속도로 공급을 시작한다 (A).
공급 B: 5시간의 공급 후 위와 동일한 기울기에서 공급 속도를 1 kg/(m3 h) 증가시킨다 (B).
상기와 같은 갈리더민 생산을 위한 통상적인 발효 프로파일은 도 1에 제시되 어 있다.
모든 발견을 토대로 하여, 동일한 조건 하에서 다수의 발효를 수행하여 (위를 참조) 본 방법이 강력하고 재현가능한지 확인하였다. 도 2는 본원에서 기술되는 갈리더민을 생산하는 두가지 표준 발효의 통상적인 프로파일을 보여준다.
실시예
2
갈리더민의
정제
실시예 1에 기술된 발효 방법의 배양 상청액으로부터 시작하여, 갈리더민을 다음의 방법으로 정제하였다.
방법 A:
황산암모늄을
사용한 침전
발효 후, 원심분리에 의해 세포를 제거하고, 30분에 걸쳐 실온에서 서서히 교반하면서 50% 포화도와 동등한 314 g/l의 황산암모늄을 첨가하여 무세포 상청액(pH 6.7)으로부터 산물을 침전시켰다.
별도의 실험에서 다양한 농도(포화도)의 황산암모늄을 사용한 침전을 검사하였다.
| 황산암모늄의 % 포화도 | 수율 (%) |
| 20 | 9 |
| 30 | 31 |
| 40 | 69 |
| 50 | 76 |
| 60 | 74 |
현탁액을 추가로 30분 동안 서서히 교반하고 나서, 침전물을 여과에 의해 수 거하였다. 침전물을 40% 에탄올, 1% 아세트산 수용액 (시작 용적의 1/4) 중에 용해시켰다. 산물의 수율은 87%였고, 분석용 HPLC에 의해 측정된 바에 의하면 순도는 93.6 면적 %였다.
산물의 순도는 분취용 HPLC에 의해 > 98 면적 %로 추가로 개선될 수 있었다. 크로마토그래피 매질은 Amberchrom HPR10 이었다 (XT20도 성공적으로 검사되었다). 산물을 칼럼 상에 로딩하고 나서, 이를 16% 아세토니트릴, 0.1% 트리플루오로아세트산의 수용액으로 세척하였다. 24 내지 36% 아세토니트릴의 구배를 사용하여 칼럼으로부터 산물을 용출시켰다.
방법 B:
NaCl
을 사용한 침전
변형 A:
1. 발효 후, 세포를 원심분리에 의해 제거하고, 30분에 걸쳐 실온에서 서서히 교반하면서 200 g/L NaCl을 첨가하여 무세포 상청액으로부터 산물을 침전시켰다. 침전을 30분 동안 계속하였다.
1a). 별도의 실험에서 산물의 수율 및 순도에 미치는 침전 시간의 영향을 검사하였다 (200 g/L NaCl, pH 6.7, 실온).
1b). 추가적인 실험에서, 산물 수율 및 순도에 미치는 NaCl 농도의 영향을 검사하였다 (침전 시간 30분, pH 6.7, 실온).
1c). 추가적인 실험에서, 산물의 수율 및 순도에 미치는 침전 전 산물 용액의 pH의 영향을 검사하였다 (침전 시간 30분, 200 g/L NaCl, 실온).
2. 산물 침전물을 원심분리하고 200 g/L NaCl 용액으로 세척하였다. 세척 용적은 초기 산물 용액의 용적의 절반과 동등하였다.
3. 침전물을 다시 원심분리하고 초기 용적의 1/20의 물에 현탁시켰다.
4. 원심분리 후, 침전물을 초기 용적의 1/20의 물에 현탁시키고 다시 원심분리하였다.
5. 산물 침전물을 1% 아세트산 중에 용해시키고 나서, NaOH 용액을 사용하여 바람직한 pH로 적정하고, 최종적으로 이를 여과시키고 동결시킬 수 있었다.
변형 B:
1. 발효 후, 세포를 원심분리에 의해 제거하고, 30분에 걸쳐 실온에서 서서히 교반하면서 200 g/L NaCl을 첨가하여 무세포 상청액으로부터 산물을 침전시켰다. 침전을 30분 동안 계속하였다.
2. 산물 침전물을 원심분리하고 200 g/L NaCl 용액으로 세척하였다. 세척 용적은 초기 산물 용액의 용적의 절반과 동등하였다.
3. 침전물을 다시 원심분리하고 초기 용적의 1/20의 물에 현탁시켰다.
4. 수중의 20% 에탄올, 2% 아세트산 용액을 첨가하여 최종 용적이 초기 용적의 1/4이 되게 하였다. 더 많은 용적도 가능하다.
5. 산물 용액을 여과시켜, Amberchrom cg300c의 칼럼 상에 로딩하였다 (저압 역상 크로마토그래피). 유사한 역상 크로마토그래피 매질도 적당할 것이다 (예: Amberchrom cg161c). 칼럼을 수중의 16% 아세토니트릴, 0.1% 트리플루오로아세트산으로 세척하고 나서, 산물을 수중의 80% 아세토니트릴로 용출시켰다.
6. 아세토니트릴을 저압 증류에 의해 산물 용액으로부터 제거하였다.
7. 산물을 동결건조시켰다. 전체 수율은 57%였고, HPLC에 의한 순도는 95%였으며, 함량은 68%였다.
변형 C:
1. 발효 후, 세포를 원심분리에 의해 제거하고, 무세포 상청액을 0.5 M NaOH를 사용하여 pH 8.0으로 조절하였다. 30분에 걸쳐 실온에서 서서히 교반하면서 200 g/L NaCl 및 17 g/L 셀라이트(Celite)를 첨가하여 무세포 상청액으로부터 산물을 침전시켰다. 침전을 30분 동안 계속하였다.
2. 산물 침전물을 여과시키고 200 g/L NaCl 용액의 3분획으로 세척하였다. 총 염 세척 용적은 초기 산물 용액의 용적의 3/4과 동등하였다.
3. 침전물을 초기 산물 용액의 용적의 1/20과 동등한 물의 1분획으로 세척하였다.
4. 침전물을 40% 에탄올, 1% 아세트산의 3분획으로 용해시켰다. 총 용적은 초기 산물 용액의 용적의 1/4이었다.
5. 산물 용액을 여과시켜, Amberchrom HPR10 역상 HPLC 수지의 칼럼 상에 로딩하였다. Amberchrom XT20 또는 Kromasil 100A-10-C18과 같은 다른 역상 HPLC 수지도 적당할 것이다. 이어서, 칼럼을 16% 아세토니트릴, 0.1% 트리플루오로아세트산의 수용액으로 세척하였다. 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 수중의 24 내지 36% 아세토니트릴의 구배를 사용하여 칼럼으로부터 산물을 용출시켰다.
6. 아세토니트릴을 저압 증류에 의해 산물 용액으로부터 제거하였다.
7. 산물을 동결건조시켰다. 통상적으로, > 98 면적%의 순도가 얻어졌다. HPLC 칼럼으로부터 산물의 수거를 조절하여 순도를 증가시킬 수 있다 (그 결과, 수율은 감소된다).
변형 D:
1. 발효 후, 세포를 원심분리에 의해 제거하고, 무세포 상청액을 0.5 M NaOH를 사용하여 pH 8.0으로 조절하였다. 30분에 걸쳐 실온에서 서서히 교반하면서 200 g/L NaCl 및 17 g/L 셀라이트를 첨가하여 무세포 상청액으로부터 산물을 침전시켰다. 침전을 30분 동안 계속하였다.
2. 산물 침전물을 여과시키고 200 g/L NaCl 용액의 3분획으로 세척하였다. 총 염 세척 용적은 초기 산물 용액의 용적의 3/4과 동등하였다.
3. 침전물을 초기 산물 용액의 용적의 1/20과 동등한 물의 1분획으로 세척하였다.
4. 침전물을 40% 에탄올, 1% 아세트산의 3분획으로 용해시켰다. 총 용적은 초기 산물 용액의 용적의 1/4이었다.
5. 산물 용액을 여과시켜, Amberchrom HPR10 역상 HPLC 수지의 칼럼 상에 로딩하였다. Amberchrom XT20 또는 Kromasil 100A-10-C18과 같은 다른 역상 HPLC 수지도 적당할 것이다. 이어서, 칼럼을 16% 아세토니트릴, 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)의 수용액으로 세척하였다. 0.1% 트리플루오로아세트산을 함유하는 수중의 24 내지 36% 아세토니트릴의 구배를 사용하여 칼럼으로부터 산물을 용출시켰다.
6. 99.9%의 TFA가 이온 교환체에 결합할 때까지, HPLC 칼럼으로부터 나오는 분획을 이온 교환체, 바람직하게는 음이온 교환체 (예: SAX 반대이온 탄산수소염)로 직접 1회 또는 2회 처리하여 TFA를 제거한다. 필요한 양은 결합 능력 (TFA의 총 함량)에 따라 달라지지만, 최대 결합 능력을 최소 10% 초과하였다. 이온 교환체를 사용한 30분의 반응 시간 후, 완전한 현탁액을 큰 유리 프릿(fritt)에 붓고, 용액을 이온 교환체로부터 분리하였다. 시작 용적의 1/10 내지 2/10의 수중의 10 내지 20% 아세토니트릴 (wfi 유사 품질)로 이온 교환 칼럼 IEC 수지를 세척하고 나서, 합한 용액을 저압 증류시켜 용액이 약간 탁해질 때까지 아세토니트릴을 제거한다. TFA를 제거하거나 트리플루오로아세테이트를 다른 반대이온으로 교환하는 다른 익히 공지된 방법을 사용하여, 유리 염기 또는 다른 염, 예를 들면 하이드로클로라이드 또는 아세테이트를 생성할 수도 있다.
7. 산물을 동결건조시켰다. 통상적으로, > 98 면적%의 순도가 얻어졌다. HPLC 칼럼으로부터 산물의 수거를 조절하여 순도를 증가시킬 수 있다 (그 결과, 수율은 감소된다).
Claims (10)
- 발효 및 정제 단계를 포함하고, 이때 정제 단계는(i) 무기염을 첨가하여 세포 배양 상청액으로부터 란티바이오틱(lantibiotic) 펩티드를 침전시키는 단계를 포함하는, 란티바이오틱 펩티드의 제조 방법.
- 제1항에 있어서,(ii) 침전 단계 i)로부터 수득된 펩티드를 세척, 단일 크로마토그래피 정제, 건조 또는 결정화시키는 정제 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 무기염이 Mn Xm (여기서, n = +1, +2이고 m = -1, -2, -3이다)의 조성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, X는 할로겐, 포스페이트, 포스포네이트, 설페이트, 설포닐, 아세테이트를 포함하는 그룹으로부터 선택되고, M은 알칼리성 금속, 알칼리성 토금속 및 암모늄을 포함하는 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
- 제4항에 있어서, 염은 바람직하게는 알칼리 할로겐, 바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 무기염을 사용한 침전을 적어도 1.6 M 이상의 염 농도에서 수행함을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 발효 단계로부터 생성된 세포 배양 상청액을 정체기(stationary phase)의 시작 전까지 성장시킨 세균 배치(bacterial batch) 또는 공급 배치(fed-batch) 세포 배양물로부터 회수하거나, 연속 세균 세포 배양물로부터 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 발효 단계에 사용되는 배지를 효모 추출물로 보충하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제9항에 있어서, 세균 세포 배양물이 스타필로코커스(Staphylococcus) 배양물, 바람직하게는 에스.갈리나리움(S. gallinarium)의 배양물인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 란티바이오틱 펩티드가 적어도 화학식 I의 구조 모티프를 포함하는 에피더민, pep 5 또는 갈리더민 또는 이의 변이체를 포함하는 그룹으로부 터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
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