CN107629112A - 一种高亲和性lc3蛋白靶向肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种LC3蛋白特异性的靶向短肽X1，其氨基酸序列为CNWMINKEC。本发明所述靶向短肽X1能特异性识别原核或真核来源的LC3蛋白，对LC3蛋白亲和力高，能够携带功能性分子结合到LC3蛋白上，发挥诊断或治疗作用。

Description

一种高亲和性LC3蛋白靶向肽及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学技术领域，具体涉及噬菌体展示肽库技术和重组表达技术，特别是涉及一种高亲和性LC3蛋白靶向肽的筛选、鉴定、制备及应用。

背景技术

自噬(autophagy)是细胞内的一种常见的生理代谢情况，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬在机体的生理和病理过程中都能见到，然而，自噬对肿瘤等疾病起积极作用还是消极作用至今尚未完全阐明，因此现有技术中迫切需要阐明自噬现象与肿瘤发生发展的关系。

LC3蛋白是自噬小体上一个标志蛋白，是一个细胞内蛋白，虽然现在市面上有一些多克隆抗体能检测LC3蛋白，然而由于抗体分子较大、结构复杂难以穿过细胞膜，因此仅限于细胞外分子水平的检测，目前还没有有效的标记细胞内LC3动向的工具。筛选LC3蛋白的自噬探针对追踪自噬流，可望为研究自噬现象提供一个强有力工具。

噬菌体展示技术是一种快速高通量的蛋白多肽展示技术，利用噬菌体展示技术，能快速高通量的筛选高亲和的靶向抗体及功能性多肽。目前利用随机合成的方法，可以将多达10⁹的不同多肽序列展示到噬菌体表面，建立起一个大库容的多肽库，通过优化筛选方法有可能筛选出不同需求的短肽分子。短肽分子较小易于穿膜，但通常亲和力较低，特别是当携带其它分子时经常发生脱靶现象。能否获得高亲和力的靶向多肽，除了受到筛选方法的条件和参数影响以外，很大程度上取决于随机因素。

发明内容

为解决上述问题，本发明通过多次对噬菌体随机肽库进行反复筛选，获得了一条对LC3蛋白具有特异靶向性、高度亲和力的九肽，并验证了其携带活性成分特异靶向LC3蛋白的功能。

一方面，本发明提供一种LC3蛋白靶向肽X1，所述靶向肽X1序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明所述LC3蛋白靶向肽还可以在SEQ ID NO:1的基础上进一步通过氨基酸的取代、缺失、添加衍生，优选在SEQ ID NO:1的基础上进行1、2、3个氨基酸的取代、缺失、添加，例如在1个位点上进行氨基酸保守性取代。

第二方面，本发明提供一种缀合物，包含靶向部分和功能性部分，其特征在于所述靶向部分为权利要求1所述靶向肽X1。

本发明所述的缀合物，其特征在于所述缀合物中含有一个或多个拷贝的靶向肽X1。

本发明所述的缀合物，其特征在于所述功能性部分包括选自由诊断标记、化疗药物、活性蛋白组成的组。

本发明所述的缀合物，其特征在于所述缀合物的各组件之间可直接连接或通过接头连接，例如所述功能性部分与所述靶向部分之间、所述多个功能性部分之间、所述多个靶向部分之间直接连接或通过接头连接。

所述直接连接优选为肽键直接连接；所述接头连接的接头例如(GGS)n、(GGGS)n、(GGGGS)n，其中n为2-6。

第三方面，本发明提供一种核酸，其编码：

(1)权利要求1所述LC3蛋白靶向肽X1；或

(2)权利要求2至5任一所述缀合物。

本发明所述核酸既包括适应于原核表达的核酸(例如使用大肠杆菌密码子等)、也包括适应于真核细胞表达的核酸(例如使用酵母密码子、哺乳动物细胞密码子等)。

本发明所述核酸可为核糖核酸(RNA)，也可为脱氧核糖核酸(DNA)。

第四方面，本发明提供一种核酸构建体，其包含本发明所述的编码核酸。

本发明所述核酸构建体中，所述编码核酸可操作的连接至启动子下游，并且含有原核和/或真核复制起始序列。

本发明所述核酸构建体可以为表达盒、操纵子、质粒、粘粒、病毒/噬菌体载体等。

第五方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含本发明所述编码基因、或包含本发明所述核酸构建体；

本发明所述宿主能够表达本发明所述靶向肽X1或本发明所述包含靶向肽X1的缀合物。

本发明所述宿主，可以为基因工程领域常用的宿主，包括原核宿主、真核宿主。所述原核宿主包括但不限于大肠杆菌，所述真核宿主包括但不限于酵母(毕赤酵母、酿酒酵母)、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞等。

第六方面，本发明提供一种生产所述靶向肽X1或所述包含靶向肽X1的缀合物的方法，包括：

(1)制备本发明所述重组宿主细胞；

(2)在适合的条件下培养步骤(1)的宿主细胞，使其增殖；

(3)宿主细胞的状态和数量达到满足生产需求时，在适合生产靶向肽X1或包含靶向肽X1的缀合物的条件下培养宿主细胞；

(4)从宿主细胞产物中分离纯化靶向肽X1或包含靶向肽X1的缀合物的级份。

第七方面，本发明提供所述靶向肽X1或包含靶向肽X1的缀合物的用途，其用于制备检测或诊断LC3蛋白的试剂盒，或用于制备治疗与细胞自噬相关疾病的药物。

与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：

(1)分子较小，利于穿膜。本发明所述LC3蛋白靶向肽仅有9个氨基酸的长度，容易穿过细胞膜结合细胞内的自噬相关蛋白LC3，从而能够对细胞内的LC3变化进行检测和追踪。克服了现有技术以抗体分子作为靶向剂无法穿透细胞膜的技术问题。

(2)亲和力高，不易脱靶。本发明所述LC3蛋白靶向肽X1是通过多次对噬菌体随机肽库进行反复筛选获得的对LC3蛋白具有特异靶向性、高度亲和力的九肽。经测定，含有所述靶向肽X1的融合表达产物对LC3蛋白的结合能力达到甚至超过了LC3抗体，动力学实验结果表明，EGFP-X1与LC3的KD值达到了44.6nM。

(3)耐受性好，不易失活。本发明所述LC3蛋白靶向肽X1通过线性结构实现对LC3的结合，对空间构象的依赖较低，从而能耐受其他功能活性分子的缀合，可位于缀合物的任意位置如N端、C端、中间。另外，本发明的LC3蛋白靶向肽X1还可以多拷贝串联使用，从而进一步增加靶向性和可靠性。

(4)能识别并结合天然LC3。本发明通过噬菌体随机展示肽库筛选到的LC3蛋白靶向肽X1不仅能识别原核表达的LC3蛋白，也能成功识别并结合Hela细胞表达的LC3蛋白，从而对检测细胞内自噬相关蛋白LC3具有良好的应用前景。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：

图1：经GST纯化的GST-LC3蛋白SDS-PAGE电泳图：

泳道1为蛋白分子量marker，泳道2为纯化的重组GST-LC3蛋白。

图2：经过5轮淘筛后阳性克隆PHAGE-ELISA实验结果图：

横坐标为克隆编号，纵坐标为TMB显色测定OD₄₅₀值。

“+”为加入LC3的sigma商业化多抗作为一抗的阳性对照；

“-”为加入M13空白噬菌体作为一抗的阴性对照。

图3：EGFP-X1的重组表达：

A为EGFP-X1的原核表达质粒示意图；

B为重组表达的EGFP-X1蛋白纯化后SDS-PAGE图。

图4：EGFP-X1与原核表达LC3蛋白结合的ELISA检测：

纵坐标为TMB显色测定OD₄₅₀值；横坐标为不同浓度的重组EGFP-X1，阳性对照以Sigma LC3抗体为一抗，阴性对照以EGFP作为一抗。

图5：ForteBio测定EGFP-X1与LC3结合的动力学数据：

经过检测和计算，EGFP-X1与LC3结合的KD＝44.6nM。

图6：EGFP-X1与真核LC3的结合：

M为蛋白分子量marker；

1000*、5000*、10000*为EGFP-X1的稀释倍数；

STD为商业和LC3抗体。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例一、LC3蛋白靶向肽的筛选

本方法利用Pierce链亲和素磁珠(货号:88816)将生物素化的B-GST-LC3蛋白固定，与九肽库(Ph.D.phage Display Peptide Library购自NEB公司)混合进行筛选，步骤如下：

1.原核表达纯化LC3蛋白

将构建好的pGEX-4T-3-LC3的质粒转入到BL21的表达菌株中，IPTG 16度诱导表达蛋白，GST柱纯化蛋白，得到纯度大于90％的LC3蛋白(图1)。

2.LC3蛋白生物素化标记

为了筛选高亲和结合的短肽，本实验将靶标LC3蛋白标上生物素，将蛋白固定到链霉亲合素偶联的磁珠上进行高亲和筛选。因为生物素链亲合素结合特异性好，结合能力强，接近于共价结合，所以在后续筛选高亲和结合短肽中，在高强度的洗涤过程中，靶标蛋白不易与磁珠脱离。本实验采用Thermo Scientific的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin andBiotinylation Kits生物素化试剂盒对LC3蛋白进行生物素化。最后测定每个LC3蛋白标上2个生物素。

3.LC3蛋白结合短肽筛选

采用磁珠淘选的方法，将带生物素化的LC3蛋白用PBS稀释到10ug/ml，取500ul的LC3稀释液与5ul的活化的链霉亲合素偶联的磁珠37度孵育1h，将蛋白固定到磁珠上。

500ul PBS洗涤磁珠1遍。将固定蛋白的磁珠与NEB噬菌体展示库(约有1x10¹¹cfu)37℃孵育1小时。吸出未结合的噬菌体，加入PBS洗3遍(逐轮增加洗涤次数)，再PBST洗三遍。加入100ul的PH＝2.2的甘氨酸-盐酸溶液，快速冲洗磁珠，将结合到磁珠上LC3蛋白的展示了短肽的噬菌体洗脱下来。然后加入Tris-HCl溶液(PH＝8.8)，将洗脱液pH调到7。取100ul洗脱液感染100ml OD₆₀₀nm为0.6的ER2738菌，扩增噬菌体。扩增后产生下一级短肽库，用于下一轮短肽筛选淘选，如此重复5次淘选。

每次扩增噬菌体库时，取已感染噬菌体的菌10ul进行梯度稀释测定出噬菌体库的滴度，并随机挑取克隆进行phage-ELISA鉴定对LC3蛋白的结合(图2)，将编号为3的阳性克隆送样测序，根据测序结果确定噬菌体中插入的外源9肽序列为NH2-CNWMINKEC-COOH(SEQID NO:1)，将其命名为X1。

实施例二、LC3蛋白靶向肽的重组表达

将编码X1所述九肽的核酸序列插入到PET28a质粒上，与EGFP编码序列融合，构建重组表达载体(图3A)，测序确定融合蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示。取1ul构建好的PET28a质粒加入到50ul的BL21感受态中，冰上放置30分钟然后放入到42℃水浴中热激90秒，冰上放置5分钟，然后加入600ul的LB培养基放入37℃恒温箱中培养1小时。取100ul上述培养液涂到卡纳抗性平板上，放入37℃恒温培养箱中过夜培养。第二天从平板上挑取单克隆接种到1L培养基中培养，37℃，200rmp/min培养，当菌液OD＝0.5时加入终浓度为0.1mM的IPTG，16℃，180rmp/min，过夜诱导。第二天将菌液离心收集用50mlPBS重悬菌体后进行超声破碎，条件为200w，破碎3秒，间歇3秒。然后4℃，8000g离心收集上清，过镍柱纯化，咪唑洗脱后，透析换缓冲液，得到的融合肽蛋白溶解于PBS中进行SDS-PAGE电泳分析(图3B)，测定浓度后加入20％的甘油-80℃保存备用。

实施例三、间接ELISA检测EGFP-X1与重组LC3的结合

按表1进行操作，通过间接ELISA检测EGFP-X1与重组LC3的结合，实验组设置三个LC3蛋白浓度梯度分别为2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL，每个浓度设置三个重复孔。

表1：间接ELISA试验方法

TMB显色后，对实验组的每个浓度计算三个重复孔OD₄₅₀的平均值，结果如图4所示。

实施例四、EGFP-X1与LC3结合常数的测定

利用ForteBio OCTET RED 96仪器测定EGFP-X1与LC3蛋白的结合能力。将LC3蛋白固定到探针上，将EGFP-X1短肽溶液PBST稀释到50ug/ml作流动相，解离在PBS溶液中。

结果如图5所示，经计算，EGFP-X1与LC3结合常数KD＝44.6nM。

实施例五、Western blot检测EGFP-X1与天然LC3的结合

为进一步验证EGFP-X1是否能结合真核海拉(HeLa)细胞表达的LC3。培养海拉细胞到10⁶个细胞/mL，加入细胞裂解液裂解细胞。将细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜进行western blot检测。X1-EGFP作为一抗，Anti-HIS tag-HRP，ECL发光检测。可以在15KD左右有明显条带，分子量大小与LC3蛋白相吻合，证明X1序列也能特异的识别并结合真核细胞天然产生的LC3蛋白(图6)。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 申请人名称:北京大学

<120> 一种高亲和性LC3蛋白靶向肽及其应用

<130> 无

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> LC3靶向肽

<400> 1

Cys Asn Trp Met Ile Asn Lys Glu Cys

1 5

<210> 2

<211> 267

<212> PRT

<213> EGFP-X1融合肽

<400> 2

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly

20 25 30

Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile

35 40 45

Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

50 55 60

Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys

65 70 75 80

Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu

85 90 95

Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu

100 105 110

Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly

115 120 125

Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr

130 135 140

Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn

145 150 155 160

Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser

165 170 175

Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly

180 185 190

Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu

195 200 205

Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe

210 215 220

Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ala

225 230 235 240

Cys Asn Trp Met Ile Asn Lys Glu Cys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

245 250 255

Ser Ala Cys Asn Trp Met Ile Asn Lys Glu Cys

260 265

Claims (10)

1.一种LC3蛋白靶向肽X1，其序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种缀合物，包含靶向部分和功能性部分，其特征在于所述靶向部分为权利要求1所述靶向肽X1。

3.如权利要求2所述的缀合物，其特征在于所述缀合物中含有一个或多个拷贝的靶向肽X1。

4.如权利要求2所述的缀合物，其特征在于所述功能性部分包括选自由诊断标记、化疗药物、活性蛋白组成的组。

5.如权利要求2至4任一所述的缀合物，其特征在于所述缀合物的各组件之间可直接连接或通过接头连接，例如所述功能性部分与所述靶向部分之间、所述多个功能性部分之间、所述多个靶向部分之间直接连接或通过接头连接，所述直接连接优选肽键直接连接。

6.一种核酸，其编码：

(1)权利要求1所述LC3蛋白靶向肽X1；或

(2)权利要求2至5任一所述缀合物。

7.一种核酸构建体，其包含权利要求6所述核酸。

8.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述核酸、或包含权利要求7所述核酸构建体；所述宿主为原核细胞或真核细胞，能够表达权利要求1所述靶向肽X1或权利要求2至5所述缀合物。

9.一种生产权利要求1所述靶向肽X1或权利要求2至5所述缀合物的方法，包括：

(1)制备权利要求8的宿主细胞；

(2)在适合的条件下培养步骤(1)的宿主细胞，使其增殖；

(3)宿主细胞的状态和数量达到满足生产需求时，在适合生产权利要求1所述靶向肽X1或权利要求2至5所述缀合物的条件下培养宿主细胞；

(4)从宿主细胞产物中分离纯化含权利要求1所述靶向肽X1或权利要求2至5所述缀合物的级份。

10.权利要求1所述靶向肽X1或权利要求2至5所述缀合物的用途，其用于制备检测或诊断LC3蛋白的试剂盒，或用于制备治疗与细胞自噬相关疾病的药物。